Actividad Práctica 2.

Preparación de frotis y tinción simple

positiva

Objetivos de aprendizaje
1. Preparar un frotis de células microbianas y teñirlo con una tinción simple positiva.
2. Comparar la morfología y agrupación de las células microbianas en la tinción simple positiva.

Introducción
La visualización de los microorganismos vivos puede resultar complicada, debido a su tamaño
pequeño, transparencia y prácticamente la carencia de color cuando están suspendidos en un medio
acuoso. Los colorantes biológicos y los procedimientos de tinción en conjunto con la microscopía
de luz constituyen las principales herramientas en microbiología para estudiar las propiedades y
dividir a los microorganismos en grupos específicos con propósitos de diagnóstico.

El éxito de la mayoría de los procedimientos de tinción depende de la preparación de un

buen frotis. Existen diversos propósitos en la preparación de un frotis. El primero es causar que las
células se adhieran al portaobjetos, de manera que no puedan ser desprendidas durante los pasos de
la tinción y lavados subsecuentes. El segundo propósito es importante para garantizar que no ocurra
la contracción de las células durante la tinción, de otra manera podrían presentarse distorsión y
artefactos. Finalmente, el tercer propósito es preparar un frotis delgado, ya que el grosor del mismo
determinará la facilidad para visualizar células individuales, su agrupación o detalles de la
estructura celular. Cuando existen grupos densos de células pueden aparecer manchas oscuras,
como resultado de que atraparon más colorante, que debió ser removido durante el procedimiento
de lavado, lo que puede conducir a resultados erróneos. El procedimiento para preparar un frotis se
ilustra en la Figura 2.1.

El primer paso en la preparación de un frotis bacteriano depende de la fuente de los

microorganismos. Cuando la bacteria se encuentra en un medio líquido (caldos, leche, saliva, entre
otros), se coloca una o dos gotas del líquido con un asa directamente en la superficie del
portaobjetos limpio.

En un medio sólido como el agar o alguna parte del cuerpo, se inicia con el depósito de una
o dos gotas de solución salina fisiológica (SSF) en el portaobjetos y se usa el asa de inoculación
para dispersar a los microorganismos en la SSF. Cuando las bacterias crecen en medios sólidos
tienden a adherirse entre sí y deben ser dispersadas por dilución en un medio líquido, de lo contrario
solo se obtendrá una mancha gruesa de bacterias.

El procedimiento para fijar los frotis se fundamenta básicamente en la coagulación de

proteínas de las bacterias lo que causará que éstas se adhieran a la superficie del portaobjetos. Por
tanto, durante la fijación se detienen los procesos enzimáticos que provocan autolisis y se inactiva
una gran parte de los microorganismos. La fijación conserva a los microorganismos con cambios o
distorsión mínimos cuando son teñidos. El frotis debe secarse a temperatura ambiente, después

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pasarlo varias veces por la llama de un mechero Bunsen o mantenido encima de la parte alta de la
misma, a una altura en la cual usted toleraría esta temperatura. De manera alternativa, el frotis
podría ser fijado con calor a 60°C por 10 min o con compuestos químicos como el metanol al 95%
por 1 min.

Tinción simple
La mayoría de las tinciones en microbiología utilizan colorantes de anilina sintética derivados del
benceno. Un colorante es usualmente una sal, aunque algunos son ácidos o bases, compuesta de
iones coloreados cargados. El ion coloreado es referido como un cromóforo, por ejemplo:

Cloruro de azul de metileno Azul de metileno + + Cl-

Cromóforo

Si el cromóforo es un ion positivo, como el azul de metileno, se considera un colorante

básico; si el ion es negativo, entonces es un colorante ácido. La mayoría de las bacterias son teñidas
cuando un colorante básico atraviesa su pared celular y se adhiere a la misma con uniones iónicas
débiles, debido a su carga negativa. El azul de metileno, fucsina básica y el cristal violeta son
ejemplos de colorantes básicos usados comúnmente en las tinciones simples. La tinta china,
nigrosina y la eosina son considerados colorantes ácidos, los cuales no tiñen a la bacteria debido a
las fuerzas de repulsión electrostáticas entre la carga del colorante y la superficie celular.

Los procedimientos de tinción que emplean un colorante se denominan tinciones simples.

Cuando el colorante tiñe a la célula se le llama tinción directa o positiva. En tanto, si se colorea
solamente el medio que la rodea es una tinción indirecta o negativa. En ésta, la célula aparecerá
como un objeto transparente contra un medio coloreado. En la tinción negativa, las células no
suelen fijarse con calor o químicos, por lo que las bacterias presentan menor distorsión y puede
apreciarse su tamaño y forma natural. Por tanto, es posible observar bacterias que son difíciles de
teñir como los espirilos. En ocasiones, puede combinarse con la tinción positiva para observar
estructuras como las cápsulas. En este caso, la cápsula será vista como un halo que rodea una célula
teñida contra un medio oscuro. Las tinciones simples pueden usarse para determinar la morfología,
tamaño y agrupación celular (Figura 2.2).

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 Medio líquido Medio sólido

Depositar dos asadas del medio que contenga Depositar una asada de solución salina fisiológica
los microorganismos

Distribuir con movimientos circulares para Distribuir el inóculo en la solución salina, con
formar una película delgada movimientos circulares

Dejar secar a temperatura ambiente

Colocar el portaobjetos en la parte superior del mechero Bunsen para fijar

con calor y permitir que los microorganismos se adhieran a la superficie

Figura 2.1. Preparación de un frotis bacteriano.

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Cocos, con forma esférica

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 a. Diplococos diplo = par

b. Estreptococos estrepto = cadena

c. Estafilococos estafilo = racimo

d. Tétradas tétrada = paquetes de 4

e. Sarcina sarcina = paquetes de 8

Bacilos, con forma de varilla

a. Diplobacilos diplo = par

b. Estreptobacilos estrepto = cadena

a)
c) Espora:
a. central
b c. Bacilos esporulados
b. subterminal
) c. terminal

Espirilos, rígidos o flexibles

a. Vibrio Bacilo curveado

b. Espirilo Helicoidales y rígidos

c. Espiroqueta Helicoidales y flexibles

Figura 2.2. Morfología y agrupación bacteriana.

Materiales

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Cultivos
Cepa hijo

Reactivos
Aceite de inmersión
Azul de metileno
Cristal violeta
Solución salina fisiológica

Equipo
Microscopio de luz compuesto

Otros materiales
Asa de inoculación redonda
Marcador de cera
Mechero Bunsen
Portaobjetos
Papel seda para limpieza de lentes

Procedimiento
Preparación de frotis a partir de un medio sólido (Figura 2.1.)
1. Obtener los cultivos de los microorganismos y la solución salina fisiológica (SSF).
2. Lavar un portaobjetos con jabón y agua para remover la suciedad y grasa. Limpiarlo con papel
para eliminar el exceso de humedad y tomarlo por los bordes.
3. Escribir las iniciales del microorganismo en el lado superior izquierdo del portaobjetos con un
marcador de cera.
4. Flamear un asa de inoculación redonda y dejarla enfriar. Transferir una gota de SSF mediante
una asada en la parte central del lado izquierdo del portaobjetos. Si los cultivos están
suspendidos en caldo, no es necesario adicionar SSF para preparar el frotis.
5. Flamear el asa de inoculación y dejarla enfriar. Tomar una cantidad pequeña del cultivo con
un asa de picadura a partir de una colonia aislada, y depositarla en el centro de la gota de SSF.
Dispersar el organismo sobre el área del portaobjetos mediante movimientos circulares para
formar una película delgada. Flamear el asa de inoculación antes de guardar.
6. Dejar secar por evaporación del agua a temperatura ambiente. Evite aplicar calor.
7. Pasar el frotis por la parte alta de la llama del mechero Bunsen cuatro veces. Evite el
calentamiento prolongado del portaobjetos porque se puede romper y el calor excesivo puede
ejercer un efecto en la morfología de las células. La parte inferior del portaobjetos debe
sentirse cálida al tacto con la piel de su mano.

Tinción simple positiva

1. Colocar el frotis en la barra de tinción y cubrirlo con azul de metileno o cristal violeta durante
1 min.
2. Lavar con agua destilada o agua de la red municipal, escurrir y dejar secar.

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3. Remover cuidadosamente el exceso de agua con papel absorbente.
4. Repetir el procedimiento con el resto de las cepas.
5. Añadir una gota de aceite de inmersión en el centro de la preparación. Observar el frotis teñido
con la lente del objetivo de inmersión (100X) del microscopio compuesto.
6. Registrar sus observaciones (Figura 2.2.) en la sección de resultados.
7. Desechar sus preparaciones teñidas por inmersión en solución desinfectante, puede utilizar
hipoclorito de sodio al 10% (1:9) por 15 min. Lave sus portaobjetos.
8. Al concluir sus observaciones microscópicas, limpie la lente del objetivo de inmersión con
papel seda. El microscopio debe almacenarse con el objetivo acomodado en su lugar, coloque
su funda y regréselo al sitio de almacén.
9. Desinfectar el área de trabajo.

Ejercicios previos a la práctica en el laboratorio

Definiciones Conocimiento y comprensión

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1. ¿Cómo define un frotis?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
2. Nombre tres colorantes básicos
a.______________________________________________________________________________
b. ______________________________________________________________________________
c. ______________________________________________________________________________
3. a. ¿Cuál es el propósito (s) de fijar un frotis con calor?, b. ¿Cuáles son las causas de que un
colorante se adhiera a la célula bacteriana?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
4. Enliste las características de los microorganismos que pueden identificarse con el uso de una
técnica de tinción simple
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

Pensamiento crítico Aplicación y análisis

5. Durante la realización de un procedimiento de tinción simple positiva, usted olvidó fijar su frotis
de Escherichia coli con calor. En el examen microscópico, ¿Cómo esperaría diferenciar esta
preparación de un frotis que fue fijado con calor?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
6. Durante el receso para el café, sus amigos derraman café en su bata de laboratorio y la tela tomó
el color del café. Lo anterior ¿es resultado de una tinción biológica o simplemente es un compuesto
capaz de impartir color? Explique su razonamiento.
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

7. Dibuje las características microscópicas de diplobacilos gruesos cuando emplea los siguientes
colorantes en una tinción simple:

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 a. Cristal violeta b. Safranina c. Rojo Congo d. Tinta china

8. Suponga que usó un portaobjetos limpio para esta actividad práctica, y al observar su frotis teñido
apreció bacterias diferentes a las que usted depositó para hacer el frotis. ¿Cuál podría ser la fuente
de lo sucedido?
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________

Esquema de conceptos Síntesis

9. Construya un esquema usando las siguientes palabras para integrar el conocimiento de la tinción
bacteriana. Puede emplear algunas palabras más de una vez.
Cocos Morfología
Tétradas Agrupación
Básico Separación en grupos
Cadenas Cromóforo
Tinción Espirilos
Visualización de estructuras Pares
Colorante Ácido
Diferencial
Bacilos
Simple

Bibliografía consultada para las actividades

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Resultados
1. Dibuje las características de las células observadas con la lente del objetivo de inmersión.
Coloree las células microbianas, de acuerdo al colorante empleado.
2. Describa la morfología y agrupación celular. Recuerde guardar la proporción y forma entre los
tipos de células microbianas.

Amplificación total de las lentes del microscopio compuesto__________________________

Aspecto Cepa # Cepa # Cepa #

Características
microscópicas de
las células

Morfología celular
a. Forma

b. Agrupación a

a
Solo aplica para las células bacterianas.

CONCLUSIONES:

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