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REVISIÓN

Superar el cuello de botella de las pruebas generalizadas: una revisión rápida de

los enfoques de las pruebas de ácido nucleico para la detección de COVID-19

MEAGAN N. ESBIN, 1 OSCAR N. WHITNEY, 1 SHASHA CHONG, 1,2 ANNA MAURER, 1 XAVIER DARZACQ, 1
y ROBERT TJIAN 1,2
1 Departamento de Biología Molecular y Celular, Universidad de California Berkeley, Berkeley, California 94720, EE. UU.

2 Instituto Médico Howard Hughes, Universidad de California Berkeley, Berkeley, California 94720, EE. UU.

RESUMEN

La pandemia actual de COVID-19 presenta una grave crisis de salud pública, y una mejor comprensión del alcance y la propagación del virus se vería favorecida por más
pruebas generalizadas. Las pruebas basadas en ácidos nucleicos ofrecen actualmente la detección más sensible y temprana de COVID-19. sin embargo, el " Estándar
dorado " La prueba iniciada por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. UU. tarda varias horas en completarse y requiere una gran cantidad
de trabajo humano, materiales como kits de extracción de ARN que podrían escasear y máquinas qPCR relativamente escasas. Está claro que se debe hacer un gran
esfuerzo para ampliar las pruebas actuales de COVID-19 en órdenes de magnitud. Por lo tanto, existe una necesidad imperiosa de evaluar protocolos, reactivos y
enfoques alternativos para permitir que las pruebas de ácidos nucleicos continúen frente a esta posible escasez. Ha habido una tremenda explosión en la cantidad de
artículos escritos durante las primeras semanas de la pandemia que evalúan avances potenciales, reactivos comparables y alternativas a la " Estándar dorado " Prueba de
RT-PCR de los CDC. Aquí presentamos una colección de estos avances recientes en las pruebas de ácido nucleico COVID-19, incluidos artículos revisados por pares y
preimpresos. Debido a los rápidos desarrollos durante esta crisis, hemos incluido tantas publicaciones como sea posible, pero muchas de las fuentes citadas aún no han
sido revisadas por pares, por lo que instamos a los investigadores a validar los resultados en sus propios laboratorios. Esperamos que esta revisión pueda consolidar y
difundir información urgentemente para ayudar a los investigadores a diseñar e implementar protocolos de prueba COVID-19 optimizados para aumentar la disponibilidad,
precisión y velocidad de las pruebas COVID-19 generalizadas.

Palabras llave: CRISPR; LÁMPARA; RT-PCR; COVID-19; SARS-CoV-2

VISIÓN GENERAL las pruebas por órdenes de magnitudes pueden ser ayudadas por una combinación
innovadora de las herramientas moleculares que se presentan aquí. Los enfoques de
El 11 de marzo de 2020, la Organización Mundial de la Salud consideró al COVID-19
prueba actuales se dividen en dos categorías - ácido nucleico o serológico. Las
como una pandemia global (Organización Mundial de la Salud 2020). Hasta el 26 de
pruebas de ácido nucleico sondean directamente el ARN de los virus extraídos de un
abril, las infecciones por SARS-CoV-2 se han confirmado en casi 3 millones de
paciente ' s garganta o pasaje nasal (Fig.1), mientras que las pruebas serológicas
personas en todo el mundo, sin embargo, es probable que incluso esta asombrosa
detectan anticuerpos presentes en el paciente ' s suero. Durante los primeros días de
cifra sea una subestimación (Elflein 2020). Para tener algún impacto procesable en
infección, los títulos virales de los pacientes son altos y un hisopo nasofaríngeo de un
nuestro control de la propagación de la pandemia, las pruebas deben realizarse
solo paciente puede albergar cerca de 1 millón de partículas virales del SARS-COV-2
repetidamente en una gran fracción de la población para detectar brotes antes de
(Wölfel et al. 2020). Sin embargo, la producción de anticuerpos IgG e IgM del
que se propaguen. Las estimaciones actuales de la capacidad de prueba necesaria
paciente, denominada seroconversión, suele ocurrir 5 - 10 d después del inicio de los
para poner fin a la pandemia se encuentran en el rango de decenas de millones de
síntomas iniciales (Wölfel et al. 2020). Por lo tanto, las pruebas de ácido nucleico
pruebas por día en los EE. UU., Muy por encima del ∼ 145.000 pruebas se realizan
ofrecen la detección más temprana y sensible para la presencia de SARS-COV-2 y
actualmente a nivel nacional (Goodnough et al. 2020; Irfan 2020). Una solución para
serán el tema de esta revisión. La prueba de RT-PCR iniciada por los CDC se ha
escalar masivamente COVID-19
considerado

Autor para correspondencia: jmlim@berkeley.edu

El artículo está en línea en http://www.rnajournal.org/cgi/doi/10.1261/rna. © 2020 Esbin et al. Este artículo, publicado en ARN, está disponible bajo una licencia Creative
076232.120. Disponible gratuitamente en línea a través del ARN Opción de acceso abierto. Commons (Attribution 4.0 International), como se describe en
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

ARN ( 2020) 26: 771 - 783; Publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press para la Sociedad de ARN 771
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Esbin y col.

descargar). Se requerirá una plataforma escalable y

de alto rendimiento para realizar millones de
pruebas por día. Aquí investigamos los avances y
enfoques recientes para las pruebas de ácido
nucleico para COVID-19. Destacamos algunos
hallazgos de grupos de investigación que han
comparado reactivos comerciales o creado
soluciones caseras para disminuir el costo o la
dependencia de reactivos comerciales particulares.
También describimos varias pruebas alternativas de
ácido nucleico que involucran amplificación
isotérmica o detección basada en CRISPR.
Finalmente, examinamos algunas aplicaciones
recientes de técnicas especializadas como
secuenciación, PCR digital y nanointerruptores de
ADN como herramientas para la detección de
COVID-19. Hemos tratado de ser lo más
exhaustivos posible a lo largo de esta revisión, pero
debido a los rápidos avances diarios en las
pruebas, es posible que, sin saberlo, hayamos
excluido algunos trabajos publicados. Otra revisión
de Shen et al. (2020) publicado a finales de febrero
puede ser útil para los lectores. En esta revisión,
ampliamos enormemente el alcance para evaluar y
comparar muchos artículos publicados más
recientemente, abordar los avances en la lisis de
muestras, la adición directa y los métodos de
detección novedosos, e incluimos una comparación
cuantitativa de estos métodos, incluido el tiempo de
flujo de trabajo, el costo y el límite de detección.

FIGURA 1. Una descripción general de las pruebas de ácido nucleico COVID-19. Las muestras recolectadas a través de un hisopo
nasofaríngeo se lisan e inactivan, y se realiza una reacción de amplificación utilizando una muestra de hisopo en bruto o ARN purificado.
La amplificación de secuencias virales específicas mediante RT-PCR, LAMP o RPA se detecta utilizando tintes fluorescentes o El flujo de trabajo general para las pruebas de
colorimétricos, escisión de nucleasa CRISPRCas específica de secuencia de un indicador o separación de productos de reacción en una RT-PCR, como el aprobado por los CDC, incluye
tira reactiva de flujo lateral.
tres pasos principales: recolección y transporte de
muestras, lisis y purificación de ARN, y
amplificación.
la " Estándar dorado " para el diagnóstico clínico, pero lleva horas realizarlo y (Figura 2). Por lo general, un médico toma un hisopo nasofaríngeo y lo transfiere
requiere reactivos, equipos y capacitación especializados (Centros para el a un vial que contiene algunos mililitros de medio de transporte viral (VTM), que
Control y la Prevención de Enfermedades se transporta a un laboratorio para su análisis. Pueden usarse tampones de lisis
2020). En las primeras semanas de la pandemia mundial de SARS-CoV-2, los química o calentamiento para lisar e inactivar partículas virales. Luego, el ARN
reactivos necesarios ya escaseaban, y los investigadores y los centros de pruebas viral se purifica a partir de una fracción de la muestra del hisopo (típicamente
informaron problemas para adquirir casi todos los reactivos necesarios de 1/20 del hisopo) utilizando kits de purificación de ARN basados en columna o
proveedores comerciales. - desde hisopos nasofaríngeos del paciente hasta tampón perlas magnéticas. El ARN purificado eluido se amplifica luego usando una
de lisis y kits de extracción de ARN (Akst 2020; Baird 2020). Algunos centros de mezcla maestra de un paso que contiene transcriptasa inversa y enzimas ADN
pruebas incluso han estado ejecutando múltiples protocolos de prueba en paralelo polimerasa con tres cebadores que se dirigen a regiones específicas del genoma
para aumentar el rendimiento y permitir una menor dependencia de un solo viral. Cebadores dirigidos a un gen humano, como RNaseP,
reactivo (Soucheray 2020). Existen algunos sistemas de prueba comerciales, pero
están diseñados principalmente para brindar resultados en un solo paciente (Abbott
2020; Xpert Xpress SARS-CoV-2, https://www.fda.gov/media/136314/ también se incluyen como control positivo para la recolección de hisopos,
extracción de ARN y amplificación. Un ARN de control de aumento, como MS2 ARN
genómico bacteriófago, puede

772 ARN (2020) Vol. 26, núm. 7

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FIGURA 2. Una descripción general del procesamiento de muestras. Los hisopos nasofaríngeos del paciente se recogen y se transportan para su
análisis. Las partículas virales se inactivan y lisan mediante calor y / o adición de tampón de lisis. Luego, la muestra de hisopo se agrega
directamente a las reacciones de amplificación o el ARN se purifica de la muestra y luego se amplifica.
alternativamente se puede utilizar. Los productos amplificados se pueden detectar
usando fluorescencia de sonda TaqMan o tintes intercaladores de ADN, y se establece
un ciclo de amplificación umbral para distinguir los resultados positivos de los
negativos. El resultado de una prueba generalmente se considera positivo si se
observa amplificación para dos o más dianas virales, mientras que se considera
negativo si se observa amplificación para el ARN de control pero para ninguna de las
dianas virales (Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades 2020).
La prueba estándar de CDC RT-PCR tarda aproximadamente 3 horas en realizarse y
cuesta ∼ $ 10 por prueba ( Tabla complementaria S1 ). Los reactivos o equipos
especializados pueden generar altos costos de prueba y pueden limitar la cantidad de
pruebas que se pueden realizar, lo que en algunos casos da como resultado un retraso
de varios días antes de que el paciente reciba un diagnóstico. La variedad de enfoques
presentados aquí abarcan una amplia gama de costos y tiempos de procesamiento, con
varios protocolos publicados que alcanzan resultados en menos de 1 h (Fig. 3). Algunos
investigadores han encontrado soluciones caseras que reducen drásticamente el costo
del reactivo requerido, lo que permite realizar pruebas por solo unos pocos dólares ( Tabla
complementaria S2 ). Otros han propuesto soluciones completamente novedosas que
pueden reducir el tiempo de prueba a decenas de minutos, pero aún pueden requerir
reactivos costosos para su ejecución. Si bien las pruebas generalizadas necesariamente
requerirán enfoques de alto rendimiento, otras pruebas pueden ofrecer una mayor
sensibilidad para los casos de títulos bajos o una respuesta rápida para el diagnóstico en
el punto de atención. El ingenio reciente en las pruebas de ácido nucleico COVID-19
ofrece una amplia gama de soluciones y es posible que se requiera más innovación para
maximizar la precisión de las pruebas al tiempo que se proporciona una solución de bajo
costo y rápida respuesta.
LISIS MUESTRA Y ADICION DIRECTA
La prueba de la presencia de ARN viral del SARS-CoV-2 generalmente comienza
con la recolección de una muestra de hisopo del paciente que se almacena y se
transporta a una instalación de prueba en un medio de transporte viral (VTM).
Estas muestras se lisan y el ARN viral se purifica típicamente utilizando columnas
de extracción de ARN o perlas magnéticas (Fig.2; Centros para el Control y la
Prevención de Enfermedades 2020). Una ventaja de la pu-
Revisión de los enfoques de prueba de ácido nucleico COVID-19
rificación es que el ARN viral presente en la
muestra de hisopo más diluido se puede
concentrar y eluir en un tampón compatible con
RT-PCR. Sin embargo, para disminuir la
dependencia de tampones de lisis comerciales y
kits de extracción de ARN viral y simplificar las
pruebas de COVID-19, ha habido un gran interés
en encontrar estrategias alternativas o eliminar la
purificación de ARN por completo.
er agregando muestras de hisopos del paciente
directamente a la reacción de RT-PCR. Además, la
eliminación de ARN purifi-
catión puede acelerar drásticamente el tiempo total del flujo de trabajo por prueba y
puede ser una solución ideal para agilizar los tiempos de prueba (Fig. 4).
Las muestras de hisopos deben lisarse para liberar el ARN viral en una
solución para su purificación y para neutralizar el virus para un manejo seguro.
Muchos protocolos utilizan reactivos comerciales para la lisis, incluidos DNA /
RNA Shield (Zymo Research), Buffer RLT (Qiagen) y MagNA Pure External
Lysis Buffer (Roche). Sin embargo, varios investigadores han descubierto
recientemente que, en comparación con las soluciones comerciales, las
soluciones caseras que contienen tiocianato de guanidinio 4M (Scallan et
al.2020; Sridhar et al.2020) o 5M (Aitken et al.2020) funcionan igualmente bien
para lisar muestras y recuperar ARN viral después de la purificación. Sin
embargo, estas soluciones contienen desnaturalizantes fuertes y, por lo tanto,
no son compatibles con la adición directa en reacciones de amplificación. Otros
laboratorios han evaluado las condiciones de lisis que son compatibles con la
adición directa para agilizar la preparación de muestras y reducir el tiempo total
de la prueba. Preliminar
FIGURA 3. Un análisis del tiempo total del flujo de trabajo y el costo calculado (en dólares
estadounidenses) de las pruebas de ácido nucleico COVID-19 publicadas. Los costos calculados se
estiman a partir de los precios en línea disponibles para los consumibles y no incluyen mano de obra ni
equipo. No se incluyen los protocolos que requerían que los reactivos clave se sintetizaran o crearan en
un laboratorio, pero es probable que sean incluso más baratos que los reactivos a precio comercial.
Todos los datos brutos disponibles en Tablas complementarias S1, S2 .
www.rnajournal.org 773
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Esbin y col.
Los estudios informan que la adición directa a la prueba de muestras de hisopos sin
procesar generalmente permite la detección del SARS-CoV-2, pero puede disminuir
la sensibilidad de la prueba. La estabilidad del ARN viral y la compatibilidad con las
reacciones posteriores dependerán en gran medida del tampón utilizado para la
recolección y el transporte de los hisopos. Arumugam y Wong han demostrado que
se puede detectar ARN a partir de partículas de virus recombinantes no replicativos
(SeraCare AccuPlex) en VTM añadidas directamente a la mezcla maestra de
RT-PCR sin un paso de extracción de ARN (Arumugam y Wong 2020). Merindol y col.
(2020) compararon algunos tampones de recolección de hisopos comunes para la
compatibilidad con la adición directa de PCR. Muestras de hisopos almacenadas en
Hank ' s medio o solución salina y se agrega directamente a las reacciones de
RT-PCR amplificadas de manera deficiente con el kit RealStar SARS-CoV-2 RT-PCR
(Altona Diagnostics) o el kit Allplex 2019-nCoV RT-QPCR (Seegene) en comparación
con el ARN purificado de los mismos hisopos. Curiosamente, sin embargo, el ARN
viral agregado directamente de hisopos almacenados en agua o UTM (Remel) a 4 ° C
mostró una amplificación por RT-PCR equivalente al ARN purificado de los mismos
hisopos. En presencia de un inhibidor de la RNasa, el ARN viral podría amplificarse
con una eficacia similar a partir de hisopos almacenados en agua a 4 ° C durante un
máximo de 5 días (Merindol et al. 2020).
Muchos grupos están optimizando aún más la adición directa a la prueba
calentando y / o lisando muestras de hisopos antes de la prueba. En un estudio, la
adición directa de muestras de hisopos en medios de transporte viral a la mezcla
maestra de qPCR Luna Universal ProbeOne Step RT (New England Biolabs) identificó
con precisión el 92% de 155 casos de COVID-19, pero alcanzó el umbral de detección
cuatro ciclos más tarde (correspondiente a un 16 veces la pérdida en la detección de
material de partida) que una prueba que utiliza ARN extraído de una muestra de hisopo
utilizando el mini kit de ARN viral QIAamp (Qiagen) (Bruce et al. 2020). Este
procedimiento podría identificar correctamente los casos a través de cargas de copia
de ARN de SARS-CoV-2 bajas, medias o altas (según lo definido por los ciclos para la
detección de las pruebas de las mismas muestras después de la purificación de ARN).
Calentar la muestra de hisopo a 95 ° C durante 10 minutos antes de la adición directa a
la prueba mejoró la detección de muestras de baja carga de copias (Bruce et al. 2020).
Otro grupo informó que las muestras agregadas directamente se detectaron 3.5 ciclos
más tarde que el ARN aislado con el kit MagNA Pure (Roche), pero calentar la muestra
a 95 ° C durante 5 minutos antes de la adición directa a la prueba resultó en la
detección solo un ciclo después, con
97,4% de precisión en comparación con las pruebas que utilizan ARN purificado
(Fomsgaard y Rosenstierne 2020). Sin embargo, Grant et al. (2020) encontró lo
contrario - Calentar las muestras directas a la prueba en VTM a 95 ° C durante 10
min retrasó la detección del ARN viral en comparación con las muestras
agregadas directamente no calentadas antes de la amplificación. Además,
encontraron que la adición directa de muestras en VTM sin calentar a la reacción
TaqMan Fast Virus 1-stepMasterMix (ThermoFisher) RT-qPCR permitió la
detección 3.77 ciclos antes que la misma prueba realizada con ARN purificado
usando el kit EZ1 Qiagen. En general, su prueba que utilizó una muestra directa
sin calentar tuvo una precisión diagnóstica del 98,8% en comparación con el
coche.
774 ARN (2020) Vol. 26, núm. 7
Purificación de ARN basada en tridge y RT-qPCR utilizando el sistema Panther
Fusion (Grant et al. 2020). Las temperaturas de inactivación intermedia parecen
funcionar peor que las altas temperaturas o que no se calientan en absoluto. Un
grupo informó que el tratamiento térmico de la muestra de hisopo a 75 ° C durante
10 minutos antes de la adición directa a la prueba retrasó la detección en 6.1 ciclos
(Alcoba-Florez et al. 2020). Varios grupos han informado hallazgos contradictorios
sobre las ventajas de calentar las muestras antes de la adición directa a las mezclas
RT-PCR. Es probable que las ARNasas presentes en el frotis nasal estén activas
incluso a altas temperaturas y, por lo tanto, la degradación del ARN puede ser
particularmente sensible a la temperatura y las condiciones de tampón de
inactivación.
Enfoques un poco más complejos utilizan tampones de lisis para ayudar
a la recuperación del ARN y mejorar la sensibilidad de la prueba RT-qPCR.
En un informe, las muestras de frotis de pacientes positivas diluidas 1: 1 en
una solución de extracción de ADN Quick Extract (un tampón que contiene
detergentes y proteinasa K), inactivadas por calor y agregadas
directamente a la mezcla de reacción de RT-PCR se detectaron en el
mismo ciclo de amplificación que, o incluso un poco antes, muestras
procesadas con el kit QIAmp Viral RNA Miniprep (Qiagen) (Ladha et al.
2020). Otro grupo informó que las muestras de hisopo agregadas a la
solución de extracción de ADN Quick Extract se detectaron con la misma
sensibilidad que el ARN purificado en columna (Sentmanat et al. 2020).
Finalmente,
La discrepancia entre las sensibilidades de los procedimientos de adición de
prueba directa puede deberse a diferencias en los protocolos y kits utilizados
para la prueba RT-qPCR y el aislamiento del ARN de control, los tipos de
tampones de lisis, los parámetros de calentamiento y las cargas variables de
ARN viral en las muestras de hisopos. de cada estudio. A pesar de estas
discrepancias, parece que la adición directa a la prueba de un pequeño
volumen de muestra de hisopo tratada con tampón de lisis o proteinasa K
permite una detección robusta del ARN del SARS-CoV-2. La adición directa a la
prueba de muestras de hisopos del paciente puede resultar útil en entornos
donde hay una falta de reactivos de purificación de ARN o limitaciones de
tiempo que hacen inviables los laboriosos aislamientos de ARN. Se requiere
más trabajo para determinar las condiciones óptimas de lisis, calentamiento y
almacenamiento de la muestra de hisopo antes de la adición directa a la
prueba.
PURIFICACIÓN DE ARN
Como lo descubrieron múltiples grupos, puede ser posible eliminar por completo el
aislamiento de ARN antes de la RT-PCR. Sin embargo, un paso de aislamiento de ARN
dedicado puede mejorar la sensibilidad de detección o ser necesario para eliminar
tampones de muestras incompatibles antes de la amplificación para algunos protocolos.
Sin embargo, los kits basados en columnas que se utilizan para purificar el ARN
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Revisión de los enfoques de prueba de ácido nucleico COVID-19

FIGURA 4. Examen del flujo de trabajo total para los métodos de prueba COVID-19 publicados. Cada paso del flujo de trabajo se muestra con barras de colores. Se incluyen cuatro kits comerciales de
RT-PCR de ejemplo como referencia (azul) y se compararon directamente en una sola publicación. La prueba CDC RT-PCR se muestra en rojo. ( ∗) La secuenciación suele tardar 4 - 12 h, pero puede
variar significativamente según la preparación de la biblioteca y la plataforma utilizada, y no se indicó específicamente en los protocolos citados. Datos brutos disponibles en Tabla complementaria S1 .

de la muestra de hisopo del paciente también puede ocasionar un arrastre
involuntario de etanol o la retención de algo de ARN, que puede ser específico del
kit. En nuestro laboratorio, hemos descubierto que el kit RNeasyMini (Qiagen)
conduce a aproximadamente
imatelyeightfold (3 C t) pérdida de virus SARS-CoV-2 sintetizado
norte ARN del gen después de la purificación en columna. Encontramos problemas similares
resultados con muestras de frotis de pacientes positivas inactivadas; C t Los valores fueron
consistentemente más bajos cuando el ARN se purificó a través de
precipitación con isopropanol o usando el kit Direct-zol RNA Miniprep Plus
(Zymo Research) en comparación con el kit RNeasyMini (Qiagen). Sin
embargo, no hemos comparado directamente con el kit Qiagen QIAmp Viral
RNA recomendado por los CDC (C Dugast-Darzacq, T Graham, GM Dailey, et
al., No publicado). Varios artículos recientes han investigado métodos
alternativos para la purificación de ARN, incluidos enfoques únicos y técnicas
de laboratorio tradicionales. Zhao y col. (2020) presentan un protocolo de
síntesis de nanopartículas magnéticas que pueden combinar la lisis de
muestras y la unión de ARN en un solo paso. El poliaminoéster con
nanopartículas magnéticas recubiertas de grupos carboxilo (pcMNP) también
son directamente compatibles con la reacción de RT-PCR, en gran medida
simplificando el protocolo desde la lisis hasta la purificación de ARN, y los
pcMNP se pueden sintetizar in situ. Kalikiri y col. (2020) encuentran que las
perlas AmpureXP (Beckman Coulter) producen la misma sensibilidad que
la plataforma de extracción automática NucliSENS easyMAG (bioMérieux).
Los reactivos de laboratorio para la purificación de ARN incluyen TRIzol, que
incluye tiocianato de guandinio y fenol-cloroformo para extraer ARN de muestras
celulares. Won y sus compañeros de trabajo describen un flujo de trabajo
completo para las pruebas de COVID-19 que incluye extracción con TRIzol y
precipitación con isopropanol del ARN de muestras de hisopos. Los autores no
encontraron diferencias entre TRIzol y el mini kit de ARN viral QIAamp de
Qiagen aprobado en la eficiencia de extracción de ARN de células HEK293
infectadas con Lentivirus, pero no se compararon directamente con ARN de
SARS-CoV-2 (Won et al.
2020). En nuestro laboratorio, precipitación con isopropanol del virus
SARS-CoV-2 sintetizado norte El ARN del gen resultó en casi ninguna pérdida
de ARN, con o sin la presencia de ARN humano adicional como portador
(CDugast-Darzacq, TGraham, GM Dailey, et al., no publicado). Los métodos de
purificación de ARN de laboratorio estándar ofrecen una alternativa atractiva a
los

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Esbin y col.

kits, ya que generalmente utilizan materiales económicos y abundantes. Sin

embargo, para las pruebas clínicas, estas soluciones pueden ser difíciles de escalar
a tuberías de alto rendimiento y pueden requerir un manejo especial de materiales
peligrosos. Puede ser útil evaluar dónde se puede eliminar la extracción de ARN
mientras se mantiene la sensibilidad y precisión necesarias de la prueba. Sin
embargo, si no es posible eliminar la purificación de ARN, estos procedimientos
podrían ser útiles como soluciones caseras y baratas para operaciones de prueba a
pequeña escala.

RT-PCR

Las mezclas de RT-PCRmaster utilizan una mezcla de enzimas de transcriptasa

inversa, como la MMLV RT termoestable, y una ADN polimerasa, como Taq. Los
cebadores que se aparean específicamente con el genoma viral SARS-COV-2 se
incluyen para la amplificación primaria. El protocolo de los CDC de EE. UU.
Utiliza cebadores que se dirigen al virus norte gen, mientras que el CDC de China
utiliza cebadores que coinciden tanto con el norte gen y el ORF1ab región, y los
cebadores de Charité Alemania se dirigen a la RdRp y mi genes (para una
revisión, consulte Udugama et al. 2020). Para la detección de amplificación, la
qPCR se puede realizar usando colorantes intercalados como SybrGreen. Debido
a que estos tintes no son específicos para los productos de ADN, cualquier
amplificación (específica o no) conducirá a una mayor lectura de fluorescencia.
Se puede lograr una mayor especificidad de secuencia en la detección de
amplicones utilizando sondas Taqman. Estos oligonucleótidos cortos contienen
un 5 ′ fluoróforo y 3 ′ extintor y hibridación con secuencias dentro de la plantilla de
ADN. La polimerasa Taq degrada la sonda recocida por sus 5 ′ to3 ′ actividad
exonucleasa y escinde el fluoróforo, liberándolo de su extinción. Esta
fluorescencia es proporcional al número de moléculas de producto amplificadas,
es específica de secuencia para el producto amplificado correcto y se puede
medir en tiempo real en una máquina de qPCR (Fig. 5).

FIGURA 5. Resumen molecular de la reacción de RT-PCR. Las sondas Taqman se utilizan para
visualizar una mayor fluorescencia durante cada ciclo.

RT-PCR se ha considerado el " Estándar dorado " para el diagnóstico de
COVID-19 porque ha demostrado ser muy sensible para detectar con precisión los
genomas virales presentes, hasta solo una molécula de ARN (Fig. 6). Existen
múltiples mezclas maestras comerciales que permiten una RT-PCR sensible en un
solo paso. El protocolo original de los CDC aprobó cuatro mezclas maestras
comerciales para la prueba RT-PCR de Quantabio, Promega y ThermoFisher
(Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades).
2020). Sin embargo, los protocolos de RT-PCR publicados también han
utilizado con éxito mezclas de RT-PCRmaster de un solo paso de una variedad
de compañías, incluidasNEB, Applied Biosciences, Qiagen, Roche, Takara y
otras, y se puede encontrar una lista creciente de reactivos comerciales
alternativos aprobados en el sitio web de la FDAEUA (Alcoba-Florez et al.2020;
Chandler-Brown et al.2020; Administración de Alimentos y Medicamentos
2020; Kalikiri et al.2020; Marzinotto et al.2020; Merindol et al.2020; Won et
al.2020; Xu et al.2020; Zhao et al.2020). Muchas mezclas maestras
comerciales parecen funcionar bien en la detección de SARS-CoV-2, aunque
falta una comparación detallada de los numerosos reactivos comerciales.
marrón
de amplificación. La amplificación se cuantifica mediante C q lectura y se establece un umbral para
la detección positiva del amplicón objetivo.
et al. (2020) compararon cuatro populares kits de RT-PCR de un paso (kit
TakaraOne Step PrimeScript III, QiagenQuantifast Multiplex RT-PCR +
RMasterMix, ThermoFisher TaqPath1-step RT-qPCR Master Mix y Thermo
Fisher Taqman Fast Virus 1-step Master Mix ) en 74 pacientes con hisopos de
nariz y / o garganta. La comparación de las cuatro mezclas maestras mostró que
tres de las cuatro mezclas funcionaron de manera óptima con los cebadores N2
para la detección del SARS-CoV-2 - el Takara, Qiagen y TaqPath. Sin embargo,
lo mejor parecía ser la mezcla maestra de Takara, que podía detectar una sola
copia del genoma viral utilizando los cebadores N1. De acuerdo con que la
mezcla de Takara es la más sensible, ninguna de las muestras de pacientes que
dieron negativo con el Takaramix dio positivo con el Qiagenkit, mientras que la
mezcla inversa no se mantuvo (Brownet al.
2020).
Además, con el fin de disminuir la dependencia de una empresa en particular para
generar reactivos de mezcla maestra para pruebas,

776 ARN (2020) Vol. 26, núm. 7

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Revisión de los enfoques de prueba de ácido nucleico COVID-19

son amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) y amplificación de

polimerasa recombinasa (RPA) (Fig. 7). LAMP utiliza una ADN polimerasa de
desplazamiento de cadena junto con cuatro cebadores especialmente diseñados
que contienen regiones de complementariedad con seis secuencias diana. Los 3 ′
El final del cebador interno directo (FIP) ceba la síntesis de una hebra de ADN
inicial, que posteriormente se desplaza mediante la síntesis cebada por el
cebador externo directo (FOP). Una secuencia complementaria inversa en el 5 ′ El
extremo del FIP se hibrida con una secuencia corriente abajo en la hebra de
ssDNA desplazada, formando un bucle. El mismo proceso se repite con los
cebadores internos y externos hacia atrás (BIP y BOP) en el extremo opuesto
del amplicón. Las rondas repetidas de imprimación y extensión de la hebra
generan una mezcla de tallo - bucle y " coliflor " productos estructurados. Debido a
que LAMP incluye cebadores que se hibridan con seis regiones diana únicas, es
altamente específico de secuencia (Notomi et al. 2000). La liberación de iones
de hidrógeno tras la incorporación de dNTP en la cadena de ADN naciente se
puede detectar usando pH colorimétrico
FIGURA 6. El límite de detección para las pruebas publicadas equivale al menor número de
moléculas analizadas con precisión en una sola reacción. Para algunos controles spike-in, los
autores utilizaron ADN viral, ADN plasmídico o un pseudovirus en lugar de ARN viral (que se
muestra como diamantes abiertos), que puede tener una eficiencia de amplificación diferente a la
del ARN del SARS-CoV-2 y, por lo tanto, alterar su límite calculado de detección. Datos brutos
disponibles en Tabla complementaria S1 .

que en el curso de la pandemia podría experimentar interrupciones o retrasos en la

cadena de suministro, al menos un laboratorio ha desarrollado un maestro de
código abierto completamente casero
mezcla. Bhadra y col. han desarrollado mezclas maestras utilizando la transcriptasa
inversa evolucionada / ADN polimerasa RTX que son compatibles tanto con la
qPCR basada en colorantes como con TaqMan. La enzima RTX se puede expresar
en E. coli y purificado usando columnas de agarosa y heparina Ni-NTA, y los
tampones de mezcla maestra se pueden fabricar de manera fácil y económica en
un laboratorio. Los autores demostraron la detección de tan solo 100 moléculas de
ARN del gen SARS-CoV-2 N transcrito in vitro, utilizando la enzima RTX sola en
una reacción basada en colorante o una mezcla de RTX y Taq en una reacción
TaqMan. Las reacciones de TaqMan con RTX y Taq mostraron valores de Cq
comparables a los del kit comercial TaqPath (Bhadra et al. 2020). Los estudios
futuros deben evaluar las mezclas maestras caseras utilizando muestras de
pacientes, para proporcionar opciones económicas y de código abierto para las
pruebas. Si bien existe una variedad de opciones comerciales y de laboratorio para
las mezclas maestras de RT-PCR, las enzimas activas generalmente requieren una
refrigeración cuidadosa para su almacenamiento y transporte. Xu y col. (2020) han
demostrado que la mezcla Takara RT-PCR mantiene su actividad después de ser
liofilizada y almacenada a temperatura ambiente durante 28 d. Una mayor
innovación en reactivos estables caseros o a temperatura ambiente puede mejorar
las capacidades de prueba en ubicaciones remotas o en el punto de atención.

AMPLIFICACIÓN ISOTÉRMICA
Una alternativa prometedora a la RT-PCR es la amplificación isotérmica,
que no requiere termociclado. Dos técnicas isotérmicas utilizadas para
diagnósticos rápidos y sensibles
FIGURA 7. Descripción molecular de las técnicas de amplificación isotérmica. LAMP utiliza cebadores
anidados especialmente diseñados con regiones complementarias que forman horquillas para permitir
el cebado de rondas posteriores de amplificación. RPA utiliza la invasión de cadena catalizada por
recombinasa para cebar la amplificación. Se pueden usar indicadores colorimétricos de pH para
detectar la liberación de iones de hidrógeno durante la incorporación de dNTP.

www.rnajournal.org 777
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Esbin y col.
tintes indicadores (Tanner et al. 2015). RT-LAMP se ha validado para la
detección de una multitud de virus de ARN, incluidos la influenza, el Zika, el
Ébola y el MERS (para una revisión, consulte Wong et al.2018).
Una adición un poco más reciente al conjunto de herramientas de amplificación
isotérmica es RPA. RPA utiliza una recombinasa para catalizar la invasión de la
cadena de un cebador en dsDNA. Se incluyen proteínas de unión monocatenarias
para estabilizar la estructura dúplex abierta y una ADN polimerasa que desplaza la
hebra extiende el cebador (Piepenburg et al. 2006). Algunos grupos han
demostrado una sensibilidad y especificidad muy altas de la amplificación de la
diana mediante la combinación de RPA y LAMP en un protocolo de amplificación
de dos etapas, denominado RAMP. Los cebadores LAMP externos pueden usarse
para la amplificación de RPA y luego combinarse con los cebadores LAMP
adicionales para una mayor amplificación en un solo tubo o dispositivo de
microfluidos. El enfoque de RAMP combinado exhibe la especificidad
extremadamente alta de LAMP, junto con una mayor sensibilidad de la
amplificación dual y una mayor tolerancia a los inhibidores (Song et al. 2017).
Song y col. (2017) demostraron el enorme potencial del enfoque RAMP para el
diagnóstico mediante la multiplexación de 16 objetivos patógenos, incluido el
VIH-1 y múltiples cepas del VPH ZIKV. Estos métodos isotérmicos son
relativamente rápidos y se pueden leer colorimétricamente, con una varilla de flujo
lateral, o incluso con biosensores basados en nanopartículas (Zhu et al. 2020), lo
que los hace fáciles de usar en el hogar o en puntos de atención remotos.
Varios grupos han desarrollado nuevos protocolos isotérmicos para la
detección del ARN del SARS-COV-2. Lu y col. (2020b) probaron su método de
detección basado en LAMP con ARN de SARS-COV-2 enriquecido y pudieron
detectar un cambio colorimétrico que indica un resultado positivo después de
solo 40 minutos de amplificación, con una sensibilidad de hasta 30 copias de
ARN viral por reacción. Ellos y otros han demostrado que la detección LAMP del
SARS-CoV-2 es específica al no mostrar reactividad cruzada con otros
patógenos respiratorios, incluidas las cepas de coronavirus humanos
HCoV-OC43 y HCoV-229E (Lu et al. 2020b; Park et al. 2020) . Zhang y col. han
demostrado que su estrategia LAMP da resultados que coinciden con la prueba
estándar de RT-PCR en muestras de pacientes positivas para COVID-19,
informando una sensibilidad y especificidad del 100%. También encuentran que
el protocolo LAMP puede ser compatible con lisados celulares, potencialmente
eliminando la necesidad de purificación de ARN de muestras de pacientes
(Zhang et al. 2020a). Utilizando 130 muestras, Yan et al. pudieron comparar
directamente RT-PCR con RT-LAMP. El ensayo LAMP dio diagnósticos clínicos
idénticos a la prueba de RT-PCR, con una sensibilidad similar, y fue más rápida
y fácil de leer (Yan et al. 2020). Otros han informado de un éxito similar, con la
amplificación de LAMP produciendo un 90% - 100% de sensibilidad y 95% - 99%
de especificidad en muestras de pacientes con precisión mejorada para la
amplificación de múltiples objetivos genéticos (Jiang et al. 2020; Mehmood Butt
et al. 2020; Yang et al. 2020; Yu et al. 2020). Un estudio de cohorte más
pequeño encontró que su prueba RT-LAMP tenía una sensibilidad del 80%, en
comparación con
778 ARN (2020) Vol. 26, núm. 7
Hisopos consecutivos de RT-PCR, que podrían ser adecuados clínicamente,
sugieren, si se usaran pruebas repetidas (Österdahl et al. 2020). Al combinar dos
técnicas isotérmicas comunes, LAMP y RPA, en una reacción de RAMP de un solo
tubo, El-Tholoth y sus colegas pudieron mejorar la detección 100 veces más que la
RT-PCR en muestras de pacientes mímicos, proporcionando una prueba de
concepto temprana para un método extremadamente sensible que puede detectar
hasta unas pocas copias de ARN viral, pero que hasta la fecha aún no se ha
probado en muestras de pacientes (ElTholoth et al. 2020). A partir de estas
primeras demostraciones, en condiciones optimizadas, las técnicas de
amplificación isotérmica pueden proporcionar la misma sensibilidad y especificidad
a la prueba de RT-PCR para la detección del SARS-CoV-2. Estos métodos
permiten una amplificación más rápida, equipos menos especializados y una
lectura fácil. Los métodos LAMP también se benefician de la capacidad de
multiplexar objetivos en una sola reacción y se pueden combinar con otros
métodos isotérmicos, como RPA en la técnica RAMP, para aumentar aún más la
precisión de la prueba. Estas técnicas pueden ser particularmente útiles para
diagnósticos rápidos en el punto de atención o para pruebas clínicas remotas sin la
necesidad de equipo de laboratorio.
DETECCIÓN BASADA EN CRISPR
Recientemente se descubrió que un grupo único de nucleasas Cas, incluidas
Cas12 y Cas13, tienen actividades promiscuas de escisión de ADN o ARN
(Gootenberg et al.2017; Chen et al.2018; Li et al.2018), que se han aprovechado
para la detección de ácidos nucleicos . Recientemente han surgido múltiples
ensayos que combinan amplificación isotérmica y CRISPR como herramientas de
diagnóstico para la detección rápida del ARN viral del SARS-CoV-2 (Fig. 8).
Cas13a es una ARNasa inespecífica que permanece inactiva hasta que se
une a su ARN objetivo programado. Se ha aprovechado para la detección de
ADN o ARN sensible en un método denominado SHERLOCK (Gootenberg et al.
2017) En SHERLOCK, el ARN objetivo se amplifica primero mediante una
combinación de transcripción RT-RPA y T7. El producto ARN amplificado activa
Cas13a, que a su vez escinde un ARN informador, liberando un tinte fluorescente
de un inhibidor. Este método detecta consistentemente el ARN viral sintético del
SARS-CoV-2 en el rango entre 10 y 100 copias por µL de entrada, solo requiere
una varilla de medición de flujo lateral para la lectura visual del resultado de la
detección y se puede completar en 40 minutos (Hou et al. . 2020) o 57 min
(Metsky et al. 2020; Zhang et al. 2020b) después del paso de extracción de ARN.
SHERLOCK (denominado " CRISPRnCoV " en Hou et al. 2020) también demostró
su potencial diagnóstico al detectar ARN del SARS-CoV-2 con una sensibilidad
del 100% en 52 muestras de pacientes (Hou et al. 2020).
Cas12 es otro miembro de la familia de efectores CRISPR-Cas. Es una
ADNasa guiada por ARN que escinde indiscriminadamente el ADNss al
unirse a su secuencia diana. En un método denominado " DETECTR, " La
activación de Cas12a ssDNase se combina con la amplificación isotérmica
para lograr una detección de ADN sensible y específica (Chen et al. 2018).
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FIGURA 8. Resumen molecular de la detección CRISPR de productos amplificados. La unión a
secuencias diana específicas en el ARN o ADN amplificado activa las nucleasas Cas, que
escinden las moléculas informadoras. La escisión del indicador se puede ensayar luego usando
una tira reactiva lateral.
Varios grupos han utilizado recientemente DETECTR para la detección de ARN
del SARSCoV-2. El ARN viral se convierte primero en ADN y se amplifica
isotérmicamente. Las secuencias diana específicas en el ADN amplificado
activan Cas12a, que a su vez escinde un informador de ADNss para desactivar
un fluoróforo. Usando RT-RPA para amplificación en DETECTR, Lucia et al.
(2020) detectaron 10 copias de ARN de SARS-CoV-2 por µL de entrada en 60
minutos (después de la preparación de la muestra de ARN). Ding y col. mejoró el
protocolo al combinar la detección basada en RT-RPA y CRISPR en una
reacción en un solo recipiente e incubando a una sola temperatura. Esta " Todo
en uno Dual CRISPR-Cas12a "( El ensayo AIOD-CRISPR) detectó tan solo 4,6
copias de ARN del SARS-CoV-2 por µL de entrada en 40 min (Ding et al. 2020).
Del mismo modo, Guo et al. desarrolló otro protocolo de temperatura constante y
de un solo tubo ( " Detección ”), en el que utilizaron amplificación asistida por
recombinasa (RAA) en lugar de RPA para la amplificación de ácidos nucleicos.
Demostraron que Cas12b se comporta de manera similar a Cas12a para la
escisión del informador de ssDNA y puede alcanzar un límite de detección de
cinco copias / µL en 40 - 60 min (Guo et al.
Revisión de los enfoques de prueba de ácido nucleico COVID-19
2020). Además, Broughton et al. usó LAMP en lugar de RPA en DETECTR y
redujo aún más el tiempo de prueba para el ARN del SARS-CoV-2 a 30 - 32
min mientras se mantiene un límite de detección bajo (10 copias / µL)
(Broughton et al. 2020).
En combinación con la amplificación isotérmica rápida, las técnicas basadas en
CRISPR pueden aprovechar nucleasas altamente específicas para lograr lecturas
rápidas y sensibilidad hasta unas pocas copias de ARN viral. La detección CRISPR
se puede acoplar a lecturas de flujo lateral, que son una opción atractiva para
escenarios de prueba fáciles en el hogar.
SECUENCIACIÓN PARA EL DIAGNÓSTICO
Los métodos de detección basados en secuenciación brindan el beneficio de
recopilar información a nivel de pares de bases de las cepas de pacientes, lo que
permite el rastreo de mutaciones virales, pero tiene el costo de costosas
plataformas de secuenciación y largos tiempos de procesamiento de muestras. Sin
embargo, varios laboratorios han investigado enfoques de alto rendimiento o
secuenciación rápida y portátil para utilizar esta tecnología como herramienta de
diagnóstico para COVID-19. La secuenciación de objetivos de nanoporos (NTS) es
una opción atractiva para las pruebas clínicas porque es rápida, altamente portátil
y sensible. Wang y col. han desarrollado un enfoque de NTS dirigido a 11 regiones
virales que es capaz de detectar tan solo 10 copias virales / ml con 1 h de
secuenciación. Al confiar en un enfoque basado en la secuenciación, este grupo
también demostró que las mutaciones del genoma viral se pueden identificar
dentro de las regiones objetivo, y que se puede incluir un panel adicional de
objetivos contra virus respiratorios comunes para detectar la coinfección (Wang et
al. 2020). Además, los enfoques comerciales de secuenciación también se han
adaptado para las pruebas de SARS-CoV-2 de alto rendimiento. BillionToOne Inc.
busca utilizar la extensa infraestructura nacional para la secuenciación de Sanger,
que proponen podría
" desbloquear más de 1.000.000 de pruebas por día en los EE. UU. "( Chandler-Brown y
col. 2020). BillionToOne utiliza una mezcla de RTPCR de un solo paso para amplificar el
ARN viral directamente de muestras de hisopos, que se recogen en un medio de
transporte viral en lugar de un tampón de lisis personalizado. Luego, la secuenciación de
Sanger procede con la inclusión de una secuencia sintética abreviada de SARS-CoV-2
como control de aumento que permite una cuantificación cuidadosa de la abundancia
viral hasta ∼ 10 equivalentes genómicos (Chandler-Brown et al. 2020). Mientras que los
enfoques de secuenciación tradicionales
típicamente exigir sustancial costo y
Los enfoques de especialización, portátiles reutilizados o de secuenciación
cuantitativa pueden ofrecer diagnósticos de alto rendimiento extremadamente
precisos durante la pandemia.
OTROS NAT ( " PENSAR MÁS ALLÁ ")
Más allá de los enfoques descritos anteriormente, se están desarrollando métodos
ingeniosos para el diagnóstico de COVID-19 generalizado, en el hogar o en el lugar de
atención. La mayoría de los pasos de amplificación isotérmica requieren incubación a
temperaturas elevadas de alrededor de 60 ° C. Para facilitar la amplificación isotérmica a
distancia
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Esbin y col.
instalaciones de prueba, González-González et al. (2020) desarrollaron un circulador de
agua impreso en 3D que puede actuar como un bloque de calor para la amplificación
LAMP y han demostrado la capacidad de detectar tan solo 62 moléculas de ARN viral
después de 1 h de incubación. Para hacer que la RT-PCR sea más accesible para las
pruebas remotas, Wee et al. (2020) han demostrado un protocolo de PCR rápido y sin
extracción que puede detectar seis copias de ARN del SARS-CoV-2 utilizando un
termociclador portátil.
Si bien las muestras recolectadas de pacientes con síntomas o que han sido
hospitalizados parecen presentar títulos virales relativamente altos que
probablemente sean más fáciles de detectar (Wölfel et al. 2020), las pruebas de
pacientes asintomáticos o las pruebas antes de la liberación de cuarentena
pueden requerir pruebas extremadamente sensibles. . Si bien se requieren
reactivos y equipos especializados, la PCR digital y de gotas digitales puede
permitir pruebas aún más sensibles que la RT-PCR. Lu y col. (2020a) informan
una precisión del 96,3% para las pruebas de muestras clínicas mediante PCR
digital y pudieron detectar virus en cuatro muestras de pacientes que RTPCR
consideró negativas. Además, se ha demostrado que los métodos de gotitas
digitales son capaces de detectar hasta 0,4 copias de ARN viral / μ L en muestras
de pacientes (Suo et al. 2020). Debido a que la PCR digital permite una
cuantificación más cuidadosa del número de copias de ARN viral durante el curso
de la enfermedad, esta prueba altamente sensible también puede ser útil para
evaluar el progreso del tratamiento o evaluar la liberación del paciente después
de la cuarentena.
Particularmente a medida que las pruebas se generalizan, las pruebas de la población general y
de personas asintomáticas pueden dar lugar a una gran cantidad de muestras negativas y a un gran
aumento en la demanda de suministros de prueba. En un esfuerzo innovador para conservar aún
más los recursos utilizando las metodologías de prueba existentes, algunos grupos han investigado
la combinación de muchas muestras de pacientes para disminuir la cantidad de pruebas necesarias
para poblaciones más grandes. Los enfoques de agrupación propuestos pueden ser adaptativos, en
los que las muestras se agrupan y analizan primero y las agrupaciones positivas se vuelven a
analizar individualmente. Esta es una solución relativamente simple que reduce los recursos de
prueba generales utilizados, pero puede introducir varias desventajas, incluidos tiempos de espera
más prolongados para obtener los resultados, ya que las muestras positivas deben probarse
iterativamente y una ligera pérdida de sensibilidad al diluir las muestras de pacientes positivas con
las negativas. Varios grupos han modelado la combinación de pacientes y han propuesto algoritmos
que optimizan la detección de muestras positivas y la eficiencia de las pruebas (Noriega y Samore
2020; SinnottArmstrong et al. 2020). Algunos enfoques simples, como agrupar las filas y columnas
de una placa de 96 pocillos durante la prueba, pueden aumentar la eficiencia de cuatro a ocho
veces para poblaciones de baja prevalencia (Sinnott-Armstrong et al. 2020). También se ha
demostrado que la combinación aleatoria es útil para estimar la prevalencia y la transmisión de
enfermedades dentro de un área local (Hogan et al. 2020). Se han propuesto asignaciones de
agrupación más complicadas y enfoques no adaptativos que pueden aumentar significativamente la
eficiencia y la Varios grupos han modelado la combinación de pacientes y han propuesto algoritmos
que optimizan la detección de muestras positivas y la eficiencia de las pruebas (Noriega y Samore
2020; SinnottArmstrong et al. 2020). Algunos enfoques simples, como agrupar las filas y columnas
de una placa de 96 pocillos durante la prueba, pueden aumentar la eficiencia de cuatro a ocho
veces para poblaciones de baja prevalencia (Sinnott-Armstrong et al. 2020). También se ha
demostrado que la combinación aleatoria es útil para estimar la prevalencia y la transmisión de
enfermedades dentro de un área local (Hogan et al. 2020). Se han propuesto asignaciones de
agrupación más complicadas y enfoques no adaptativos que pueden aumentar significativamente la
eficiencia y la Varios grupos han modelado la combinación de pacientes y han propuesto algoritmos que optimizan la detección de muestras positivas y la eficiencia de las pruebas (Noriega y Samore 2020; SinnottArmstrong et al. 202
780 ARN (2020) Vol. 26, núm. 7
baja para pruebas agrupadas de iteración única, pero puede ser más difícil de
implementar con flujos de trabajo clínicos comunes y pipeteo robótico (Täufer
2020). Es probable que la solución a las pruebas generalizadas requiera un
enfoque adaptativo y de múltiples frentes. Si bien la combinación de muestras
puede no ser la solución más adecuada para pruebas muy sensibles, la
combinación puede mejorar drásticamente nuestra capacidad para detectar
grandes poblaciones y, al mismo tiempo, conservar recursos de prueba limitados.
Por último, es importante tener en cuenta que las pruebas basadas en enzimas no
siempre son factibles en escenarios de recursos limitados. Una alternativa potencial
radica en el uso de ADN " nanointerruptor ”- pruebas basadas en el desarrollo que se han
desarrollado para la detección del virus del Zika. Basado en un diseño de origami de
ADN, estos oligómeros de ADN de nanoconmutador se unen al ARN viral para
experimentar un cambio conformacional que se puede visualizar en un gel de agarosa.
Los nanointerruptores de ADN que se dirigen a diferentes especies de virus de ARN
también se pueden combinar en una prueba, lo que permite la detección de
coinfecciones. Desafortunadamente, la prueba del nanointerruptor del Zika requiere ∼ 5,2
× 10 5 Genomas de ARN de Zika por prueba para una detección confiable y, por lo tanto,
es mucho menos sensible que la RT-PCR (Zhou et al. 2020). Debido a que es un
método basado en gel, el rendimiento de las pruebas de nanointerruptores de ADN
también está muy limitado. Para evitar la detección de gel de bajo rendimiento, el grupo
Godin desarrolló un sensor de nanoporos capaz de detectar estos cambios
conformacionales y podría detectar tan solo ∼ 500 moléculas diana (Beamish et al.
2019). Una mayor innovación en la detección de nanointerruptores de ADN del
SARS-CoV-2 y los desarrollos en la generación de salidas fluorescentes o
colorimétricas podrían mejorar significativamente la prueba ' s y facilitar su uso
para la detección de COVID-19 en áreas de bajos recursos.
PANORAMA
En respuesta al tremendo costo global de COVID-19, los investigadores se han
movilizado rápidamente para investigar soluciones para pruebas, diagnóstico y
tratamiento. Los artículos preimpresos y publicados de los últimos meses
describen una variedad de opciones para pruebas de ácido nucleico rápidas,
asequibles, sensibles y de alto rendimiento, que actualmente es el enfoque más
confiable para la detección temprana del SARS-CoV-
2. Para abordar la urgente necesidad de aumentar las pruebas, los investigadores
de todas las disciplinas han comparado rápidamente productos comerciales
ampliamente disponibles, propusieron reutilizar los reactivos y la infraestructura
existentes y crearon soluciones de laboratorio novedosas para optimizar la línea
de pruebas COVID-19. Investigadores académicos de algunas instituciones de
todo el mundo han publicado planos detallados para el establecimiento de centros
de pruebas emergentes locales, y es probable que otros los sigan (Aitken et
al.2020; Innovative Genomics Institute SARSCoV-2 Testing Consortium y Doudna
2020; Sridhar et al. .2020). Una combinación de enfoques de prueba puede ser la
forma más eficiente de llenar los vacíos actuales en las pruebas.
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Tenemos la esperanza de que la explosión de enfoques creativos y multifacéticos
para las pruebas de ácido nucleico de COVID-19 continúe generando soluciones a
medida que la sociedad aborde la pandemia de COVID-19.
GLOSARIO
RT-PCR - reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa;
amplificación de ARN en una reacción de un paso que contiene una enzima
transcriptasa inversa, ADN polimerasa y un cebador específico complementario
a una región diana.
LÁMPARA - Amplificación isotérmica mediada por bucle que utiliza cuatro
cebadores que reconocen seis regiones complementarias dentro de la diana. La
amplificación se produce a partir de una polimerasa que desplaza la hebra y el
alargamiento de los cebadores con regiones autocomplementarias para
horquillas que ceban más rondas de amplificación formando grandes " coliflor "
estructuras de productos amplificados.
RPA - amplificación rápida; La amplificación de la polimerasa recombinasa
utiliza un complejo recombinasa-cebador que encuentra coincidencias en la
plantilla de ADN o ARN y permite el intercambio de cadenas para formar un
complejo abierto. Las proteínas de unión monocatenarias estabilizan el dúplex
abierto y la ADN polimerasa que desplaza la hebra amplifica la plantilla.
RAMPA - una técnica de amplificación isotérmica de dos etapas que combina una
reacción de RPA primaria utilizando los cebadores LAMP externos con una reacción
LAMP secundaria que incluye cebadores internos autocomplementarios.
C t o C q valor - en qPCR, el ciclo de amplificación donde la curva de
fluorescencia exhibe la mayor curvatura
y supera el umbral de fluorescencia de fondo.
Sensibilidad (Baratloo et al. 2015) - la habilidad de un
prueba para detectar un verdadero positivo =
verdadero positivo
∗ 100.
verdadero positivo + falso negativo
Especificidad (Baratloo et al.2015) - la capacidad de una prueba para detectar un
verdadero negativo =
verdadero negativo
∗ 100.
falso positivo + verdadero negativo
Precisión (Baratloo et al. 2015) - la capacidad de una prueba para diferenciar
correctamente los resultados verdaderos positivos y negativos del total de las pruebas =
verdadero positivo + verdadero negativo
∗ 100.
verdadero positivo + falso positivo + verdadero negativo + falso negativo
MATERIAL SUPLEMENTARIO
El material suplementario está disponible para este artículo.
Revisión de los enfoques de prueba de ácido nucleico COVID-19
EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradecemos a todos los miembros del laboratorio de Tjian y Darzacq por sus lecturas,
conocimientos y discusiones útiles sobre esta revisión. Nos gustaría agradecer
expresamente al equipo de respuesta de Tjian y DarzacqCOVID-19 por sus hallazgos no
publicados relevantes para las pruebas de COVID19 que se presentan aquí. Los autores
agradecen la financiación del Instituto Médico Howard Hughes (subvención CC34430 a
RT y MNE) y los Institutos Nacionales de Salud (subvención del programa de formación
del NIH T32GM098218 a la MNE y la subvención del programa de formación del NIH
T32GM007232 a la ONW).
Contribuciones de autor: MNE desarrolló el concepto; MNE,
ONW y SC contribuyeron al diseño y redacción de la revisión; y AM preparó las
cifras. Todos los autores contribuyeron a la lectura, recopilación y análisis de las
fuentes para esta revisión.
REFERENCIAS
Abbott. 2020. ID AHORA TM COVID-19 . IDENTIFICAR AHORA TM Producto COVID-19
Inser. https://www.alere.com/en/home/product-details/id-nowcovid-19.html [consultado el 23
de abril de 2020].
Aitken J, Ambrose K, Barrell S, Beale R, Bineva-Todd G, Biswas D,
Byrne R, Caidan S, Cherepanov P, Churchward L, et al. 2020. Prueba escalable y resistente
de SARS-CoV2 en un centro académico. medRxiv doi: 10.1101 / 2020.04.19.20071373.
Akst J. 2020. Los kits de extracción de ARN para las pruebas de COVID-19 se encuentran en breve
ply en Estados Unidos. Revista científica. https://www.the-scientist.com/ news-opinion /
rna-extract-kits-for-covid-19-tests-are-in-shortsupply-in-us-67250 [consultado el 23 de abril
de 2020].
Alcoba-Florez J, Gonzalez-Montelongo R, Inigo-Campos A, de
Artola DGM, Gil-Campesino H, Team TMTS, Ciuffreda L, Valenzuela-Fernandez A, Flores
C. 2020. Detección rápida de SARS-CoV-2 por RT-qPCR en muestras de hisopos
nasofaríngeos precalentados. medRxiv doi: 10.1101 / 2020.04.08.20058495.
ArumugamA, Wong SS. 2020. El uso potencial de muestras sin procesar
ple para la detección RT-qPCR de COVID-19 sin un paso de extracción de ARN. bioRxiv
doi: 10.1101 / 2020.04.06.028811
Baird R. 2020. ¿Por qué las pruebas de coronavirus generalizadas no se ' no viene nada
tiempo pronto. El neoyorquino, 24 de marzo. Https: //www.newyorker
. com / news / news-desk / why-extended-coronavirus-testing-isntcoming-anytime-soon
[consultado el 23 de abril de 2020].
BaratlooA, Hosseini M, NegidaA, El Ashal G. 2015. Parte 1: def-
inición y cálculo de precisión, sensibilidad y especificidad.
Emerg (Teherán, Irán) 3: 48 - 49.
Beamish E, Tabard-Cossa V, Godin M. 2019. ADN programable
Detección de nanointerruptores con nanoporos de estado sólido. Sensores ACS 4:
2458 - 2464. doi: 10.1021 / acssensors.9b01053
Bhadra S, Maranhao AC, Ellington AD. 2020. Una RT-qPCR de una enzima
ensayo para SARS-CoV-2 y procedimientos para la producción de reactivos. bioRxiv doi:
10.1101 / 2020.03.29.013342.
Broughton JP, Deng X, Yu G, Fasching CL, Servellita V, Singh J,
Miao X, Streithorst JA, Granados A, Sotomayor-Gonzalez A, et al. 2020. Detección de
SARS-CoV-2 basada en CRISPR-Cas12. Nat Biotechnol doi: 10.1038 / s41587-020-0513-4.
Marrón JR, O ' Sullivan D, Pereira RP, Whale AS, Busby E, Huggett J,
Harris K. 2020. Comparación de objetivos RTPCR en tiempo real del gen SARS-CoV2 N y
mezclas maestras disponibles comercialmente. bioRxiv doi: 10.1101 / 2020.04.17.047118
Bruce EA, Tighe S, Hoffman JJ, Laaguiby P, Gerrard DL, Diehl SA,
Leonard DGB, Huston CD, Kirkpatrick BD, Crothers JW, et al.
2020. Detección RT-qPCR del ARN del SARS-CoV-2 a partir de un hisopo nasofaríngeo del
paciente utilizando kits Qiagen RNeasy o directamente por omisión
www.rnajournal.org 781
 Descargado de rnajournal.cshlp.org el 22 de junio de 2020 - Publicado por Prensa de laboratorio Cold Spring Harbor
Esbin y col.
de un paso de extracción de ARN. bioRxiv doi: 10.1101 / 2020.03.20
. 001008
Centros de Control y Prevención de Enfermedades. 2020. CDC 2019-novel
Panel de diagnóstico de RT-PCR en tiempo real de coronavirus (2019-nCoV) para uso de
emergencia solo instrucciones de uso. CDC, Atlanta. Chandler-Brown D, Bueno AM, Atay O,
Tsao D. 2020. Un
ensayo COVID-19 sin extracción de ARN capaz y rápidamente desplegable mediante
secuenciación cuantitativa de Sanger. bioRxiv doi: 10.1101 / 2020.04
. 07.029199.
Chen JS, Ma E, Harrington LB, Da Costa M, Tian X, Palefsky JM,
Doudna JA. 2018. La unión al objetivo CRISPR-Cas12a desencadena una actividad
indiscriminada de ADNasa monocatenaria. Ciencias 360: 436 - 439. doi: 10.1126 /
science.aar6245
DingX, Yin K, Li Z, LiuC. 2020. Todo en uno dual CRISPR-Cas12a (AIOD-
Ensayo CRISPR): un caso para la detección rápida, ultrasensible y visual del nuevo
coronavirus SARS-CoV-2 y el virus del VIH. bioRxiv doi: 10
. 1101 / 2020.03.19.998724.
Elflein J. 2020. Casos de coronavirus en todo el mundo 2020. Statista. https
: //www.statista.com/statistics/1043366/novel-coronavirus2019ncov-cases-worldwide-by-country [consultado
el 26 de abril de 2020]. El-Tholoth M, Bau HH, Song J. 2020. Una sola y dos etapas, cerrada-
tubo, prueba molecular para el nuevo coronavirus de 2019 (COVID-19) en el hogar, la clínica
y los puntos de entrada. ChemRxiv doi: 10.26434 / chemrxiv.11860137.v1.
Fomsgaard AS, Rosenstierne MW. 2020. Un flujo de trabajo alternativo para
Detección molecular de SARS-CoV-2: escape de la escasez de kits de extracción de NA.
medRxiv doi: 10.1101 / 2020.03.27.20044495. Administración de Alimentos y Medicamentos.
2020. Autorizaciones de uso de emergencia.
2. Virol Sin. doi: 10.1007 / s12250-020-00223-4
https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situationsmedical-devices/emergency-use-authorizations#covid19ivd
Lucia C, Federico PB, Alejandra GC. 2020. Un ultrasensible, rápido,
[consultado el 23 de abril de 2020].
y método portátil de detección de secuencia de coronavirus SARS-CoV-2 basado en
González-González E, Montserrat Lara-Mayorga I, García-Rubio A,
Ezio Garciaméndez-Mijares C, Emilio-Guerra-Alvarez
García G, Aguayo J, Shrike Zhang Y, Omar Martínez-Chapa S, Santiago T, et al. 2020.
Diagnóstico de escala en tiempos de COVID19: creación rápida de prototipos de circuladores
de agua impresos en 3D-1 para amplificación isotérmica 2 mediada por bucle (LAMP) y
detección del virus SARS-CoV-2. medRxiv doi: 10.1101 / 2020.04.09.20058651 Goodnough
A, Thomas K, Kaplan S. 2020. Las pruebas de coronavirus caen
lamentablemente corto ya que Trump busca reabrir EE. UU. New York Times.
https://www.nytimes.com/2020/04/15/us/coronavirus-testingtrump.html [consultado el
23 de abril de 2020].
Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, Essletzbichler P, Dy AJ,
Joung J, Verdine V, Donghia N, Daringer NM, Freije CA, et al.
2017. Detección de ácidos nucleicos con CRISPR-Cas13a / C2c2. Ciencias
356: 438 - 442. doi: 10.1126 / science.aam9321
Grant PR, Turner MA, Shin GY, Nastouli E, Levett LJ. 2020. Extracción-
diagnóstico gratuito de COVID-19 (SARS-CoV-2) mediante RT-PCR para aumentar la capacidad
de los programas nacionales de pruebas durante una pandemia. bioRxiv 10.1101 /
2020.04.06.028316.
Guo L, Sun X, Wang X, Liang C, Jiang H, Gao Q, Dai M, Qu B, Fang S,
Mao Y y col. 2020. Detección de SARS-CoV-2 con diagnóstico CRISPR. bioRxiv doi:
10.1101 / 2020.04.10.023358.
Hogan CA, Sahoo MK, Pinsky BA. 2020. La agrupación de muestras como estrategia
para detectar la transmisión comunitaria del SARS-CoV-2. JAMA. doi: 10
. 1001 / jama.2020.5445.
Hou T, ZengW, YangM, ChenW, Ren L, Ai J, Wu J, Liao Y, Gou X, Li Y,
et al. 2020. Desarrollo y evaluación de un diagnóstico basado en CRISPR para el nuevo
coronavirus de 2019. medRxiv doi: 10.1101 / 2020.02
. 22.20025460.
Instituto de Genómica Innovadora Consorcio de Pruebas de SARS-CoV-2,
Doudna JA. 2020. Proyecto para un laboratorio emergente de pruebas de SARS-CoV-2.
medRxiv doi: 10.1101 / 2020.04.11.20061424.
Irfan U. 2020. Pruebas de coronavirus: por qué EE. UU. Necesita millones de
pruebas por día. Vox. https://www.vox.com/2020/4/13/21215133/
782 ARN (2020) Vol. 26, núm. 7
coronavirus-testing-covid-19-tests-screening [consultado el 23 de abril de
2020).
Jiang M, Pan W, Aratehfar A, Fang W, Ling L, Fang H, Daneshnia F,
Yu J, Liao W, Pei H y col. 2020.Desarrollo y validación de un sistema rápido de
amplificación isotérmica mediada por bucle de transcriptasa inversa (RT-LAMP) de un solo
paso que potencialmente se utilizará para el cribado confiable y de alto rendimiento de
COVID-19. medRxiv doi: 10.1101 / 2020.03.15.20036376.
Kalikiri MKR, HasanMR, Mirza F, Xaba T, TangP, Lorenz S. 2020. Alto-
Extracción de rendimiento de ARN de SARS-CoV-2 de hisopos nasofaríngeos utilizando
perlas de inmovilización inversa en fase sólida. medRxiv doi: 10.1101 /
2020.04.08.20055731.
Ladha A, Joung J, Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Zhang F. 2020. A
Método de preparación de ARN de 5 min para la detección de COVID-19 con RTqPCR.
https://static1.squarespace.com/static/5b7c640be2ccd170 3a3da4d3 / t /
5e8bcd0923fb224b2f3b1356 / 1586220297644 / Ladha
+ et + al + - + RNA + QE + Extraction.pdf [consultado el 23 de abril de 2020].
Li SY, Cheng QX, Li XY, Zhang ZL, Gao S, Cao RB, Zhao GP, Wang J,
Wang JM. 2018. Detección de ácidos nucleicos asistida por CRISPR-Cas12a.
Cell Discov 4: 1 - 4.
Lu R, Wang J, Li M, Wang Y, Dong J, Cai W. 2020a. SARS-CoV-2
detección mediante PCR digital para el diagnóstico de COVID-19, seguimiento del
tratamiento y criterios de alta. medRxiv doi: 10.1101 / 2020
. 24.03.20042689.
Lu R, Wu X, Wan Z, Li Y, Zuo L, Qin J, Jin X, Zhang C. 2020b.
Desarrollo de un nuevo método de amplificación isotérmica mediada por bucle de
transcripción inversa para la detección rápida de SARS-CoV-
CRISPR-Cas12. bioRxiv doi: 10.1101 / 2020.02.29
. 971127.
GRAMO,
Marzinotto S, Mio C, Cifù A, Verardo R, Pipan C, Schneider C,
Curcio F. 2020. Un enfoque optimizado para detectar rápidamente la infección por
SARSCoV-2, evitando la purificación del ARN. medRxiv doi: 10
. 1101 / 2020.04.06.20054114.
Mehmood Butt A, Siddique S, An X, Tong Y.2020.Desarrollo de un
Ensayo de detección de amplificación isotérmica mediada por bucle de doble gen (LAMP)
para el SARS-CoV-2: un estudio preliminar. medRxiv doi: 10
. 1101 / 2020.04.08.20056986.
Merindol N, Pépin G, Marchand C, Rheault M, Poirier A, Germain H,
Danylo A. 2020. Optimización de la detección de SARS-CoV-2 por RTQPCR sin extracción
de ARN. bioRxiv doi: 10.1101 / 2020.04.06
. 028902.
Metsky HC, Freije CA, Kosoko-Thoroddsen T-SF, Sabeti PC,
Myhrvold C. 2020. Vigilancia basada en CRISPR para COVID-19 utilizando un diseño de
aprendizaje automático genómicamente completo. bioRxiv doi: 10.1101 /
2020.02.26.967026.
Noriega R, SamoreMH. 2020. Aumento del rendimiento de las pruebas y el caso
detección con un enfoque bayesiano de muestras agrupadas en el contexto de COVID-19.
bioRxiv doi: 10.1101 / 2020.04.03.024216. Notomi
T, Okayama H Masubuchi H Yonekawa T,
Watanabe K, Amino N, Hase T. 2000. Amplificación isotérmica de ADN mediada por bucle. Res
de ácidos nucleicos 28: 63. doi: 10.1093 / nar / 28.12.e63
Österdahl MF, Lee KA, Lochlainn MN, Wilson S, Douthwaite S,
Horsfall R, Sheedy A, Goldenberg SD, Stanley CJ, Spector TD, et al. 2020. Detección de
SARS-CoV-2 en el punto de atención: datos preliminares que comparan la amplificación
isotérmica mediada por bucle (LAMP) con la PCR. medRxiv doi: 10.1101 /
2020.04.01.20047357.
Park GS, Ku K, Baek SH, Kim SJ, Il KS, Kim BT, Maeng JS. 2020.
Desarrollo de ensayos de amplificación isotérmica mediada por bucles de transcripción
inversa dirigidos al SARS-CoV-2. Diagnóstico de J Mol
doi: 10.1016 / j.jmoldx.2020.03.006.
 Descargado de rnajournal.cshlp.org el 22 de junio de 2020 - Publicado por Prensa de laboratorio Cold Spring Harbor
Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA. 2006. ADN
detección usando proteínas de recombinación. PLoS Biol 4: 1115 -
1121. doi: 10.1371 / journal.pbio.0040204
Scallan MF, Dempsey C, Macsharry J, O ' Callaghan I, O ' Connor PM,
Horgan CP, Durack E, Cotter PD, Hudson S, Moynihan HA, et al.
2020. Validación de un tampón de lisis que contiene tiocianato de guanidinio 4 M (GITC) /
Triton X-100 para la extracción de ARN del SARS-CoV-2 para pruebas de COVID-19:
comparación de tampones de lisis formulados que contienen 4 a 6MGITC, tampón de lisis
externo Roche y Qiagen Tampón de lisis RTL. bioRxiv doi: 10.1101 / 2020.04.05.026435.
Sentmanat M, Kouranova E, Cui X. 2020. Extracción de ARN en un solo paso para
Detección RT-qPCR de 2019-nCoV. bioRxiv doi: 10.1101 / 2020.04
. 02.022384.
Shen M, Zhou Y, Ye J, Abdullah AL-maskri AA, Kang Y, Zeng S, Cai S.
2020. Avances recientes y perspectivas de la detección de ácidos nucleicos por
coronavirus. J Pharm Anal. doi: 10.1016 / j.jpha.2020.02.010 Sinnott-Armstrong N, Klein D,
Hickey B. 2020. Evaluación del grupo
pruebas de ARN del SARS-CoV-2. medRxiv doi: 10.1101 / 2020.03.27
. 20043968.
Song J, Liu C, Mauk MG, Rankin SC, Lok JB, Greenberg RM, Bau HH.
2017. Amplificación enzimática isotérmica de dos etapas para detección molecular multiplex
concurrente. Clin Chem 63: 714 - 722. doi: 10.1373 / clinchem.2016.263665
Soucheray S. 2020. Expertos cuestionan la viabilidad de las pruebas en COVID-
19 respuesta. CIDRAPNoticias, 1 de abril. Https://www.cidrap.umn.edu/ news-perspectiva /
2020/04 / expert-question-practicity-testingcovid-19-response [consultado el 23 de abril de
2020].
Sridhar S, Forrest S, Kean I, Young J, Scott JB, Maes M, Pereira-Dias J,
Parmar S, RoutledgeM, Rivett L, et al. 2020. Un plan para la implementación de un enfoque
validado para la detección de SARSCov2 en muestras clínicas en instalaciones académicas
que ejecutan PCR de diagnóstico de título para COVID-19. bioRxiv doi: 10.1101 /
2020.04.14
. 041319.
Suo T, Liu X, GuoM, Feng J, HuW, YangY, ZhangQ, WangX, SajidM,
Guo D y col. 2020. ddPCR: una herramienta más sensible y precisa para la detección del
SARS-CoV-2 en muestras de baja carga viral. medRxiv doi: 10.1101 /
2020.02.29.20029439.
Tanner NA, Zhang Y, Evans TC. 2015. Detección visual de isotermas
nucleico ácido amplificación usando sensible al pH tintes.
BioTécnicas 58: 59 - 68. doi: 10.2144 / 000114253
Täufer M. 2020. Detección rápida, a gran escala y eficaz de COVID-
19 mediante pruebas no adaptativas. bioRxiv doi: 10.1101 / 2020.04.06
. 028431.
Udugama B, Kadhiresan P, Kozlowski HN, Malekjahani A, OsborneM,
Li VYC, Chen H, Mubareka S, Gubbay J, Chan WCW. 2020. Diagnóstico de COVID-19: la
enfermedad y herramientas para su detección. ACS Nano. doi: 10.1021 / acsnano.0c02624
Wang M, Fu A, Hu B, Tong Y, Liu R, Gu J, Liu J, Jiang W, Shen G,
Zhao W y col. 2020. Secuenciación de objetivos de nanoporos para una detección precisa y
completa del SARS-CoV-2 y otros virus respiratorios. medRxiv doi: 10.1101 /
2020.03.04.20029538.
Wee SK, SivalingamSP, PengE, YapH. 2020. Ácido nucleico directo rápido.
prueba de amplificación sin extracción de ARN para SARS-CoV-2 utilizando un
termociclador de PCR portátil. bioRxiv doi: 10.1101 / 2020.04.17
. 042366.
Revisión de los enfoques de prueba de ácido nucleico COVID-19
Wölfel R, Corman VM, Guggemos W, Seilmaier M, Zange S,
Müller MA, Niemeyer D, Jones TC, Vollmar P, Rothe C, et al.
2020. Valoración virológica de pacientes hospitalizados con COVID-2019. Naturaleza doi:
10.1038 / s41586-020-2196-x
Won J, Lee S, Park M, Kim TY, Park MG, Choi BY, Kim D, Chang H,
Kim VN, Lee CJ. 2020. Desarrollo de un protocolo de detección de laboratorio seguro y de
bajo costo para el SARS-CoV-2 de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). Exp
Neurobiol doi: 10.5607 / en20009 Wong YP, Othman S, Lau YL, Radu S, Chee HY. 2018.
Loop-medi-
amplificación isotérmica atenuada (LAMP): una técnica versátil para la detección de
microorganismos. J Appl Microbiol 124: 626 - 643. doi: 10.1111 / jam.13647
Organización Mundial de la Salud. 2020. Director General de la OMS ' s apertura
declaraciones en la rueda de prensa sobre COVID-19 - 11 de marzo de 2020. Organización
Mundial de la Salud. https://www.who.int/dg/speeches/ detail /
who-director-general-s-opening-remarks-at-the-mediabriefing-on-covid-19 - 11 de marzo de
2020 [consultado el 23 de abril de 2020]. Xu J, Wang J, Zhong Z, Su X, Yang K, Chen Z,
Zhang D, Li T, Wang Y,
Zhang S y col. 2020. Mezclas de PCR almacenables a temperatura ambiente para la
detección del SARS-CoV-2. bioRxiv doi: 10.1101 / 2020.04.07.029934. Yan C, Cui J, Huang L,
Du B, Chen L, Xue G, Li S, Zhang W, Zhao L,
Sun Y y col. 2020. Detección rápida y visual del nuevo coronavirus de 2019 (SARS-CoV-2)
mediante un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa. Clin
Microbiol Infect doi: 10.1016 /
j.cmi.2020.04.001
Yang W, Dang X, Wang Q, Xu M, Zhao Q, Zhou Y, Zhao H, Wang L,
Xu Y, Wang J y col. 2020. Detección rápida de SARS-CoV-2 mediante el método RT-LAMP
de transcripción inversa. medRxiv doi: 10.1101 /
2020.03.02.20030130.
Yu L, Wu S, Hao X, Li X, Liu X, Ye S, Han H, Dong X, Li X, Li J, et al.
2020. Detección colorimétrica rápida del coronavirus COVID-19 utilizando una plataforma de
diagnóstico de amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa
(RT-LAMP): iLACO. medRxiv. https://doi.org/
10.1101 / 2020.02.20.20025874.
Zhang F, Abudayyeh OO, Gootenberg JS. 2020a. Un protocolo para
detección de COVID-19 usando diagnósticos CRISPR. Página web del Broad Institute.
https://www.broadinstitute.org/files/publications/special/ COVID-19% 20detection% 20
(actualizado) .pdf [consultado el 23 de abril de 2020].
ZhangY, Odiwuor N, Xiong J, Sun L, Nyaruaba RO, Wei H, Tanner NA.
2020b. Detección molecular rápida del ARN del virus SARS-CoV-2 (COVID-19) utilizando
LAMP colorimétrico. medRxiv doi: 10.1101 / 2020.02
. 26.20028373.
Zhao Z, Cui H, SongW, Ru X, Zhou W, Yu X.2020. Un simple imán
Método de extracción de ARN viral basado en nanopartículas para una detección eficiente
de SARS-CoV-2. bioRxiv doi: 10.1101 /
2020.02.22.961268.
Zhou L, Chandrasekaran AR, Punnoose JA, Bonenfant G, Charles S,
Levchenko O, Badu P, Cavaliere C, Pager CT, Halvorsen K.
2020. Plataforma programable de bajo costo basada en ADN para la detección de ARN viral.
bioRxiv doi: 10.1101 / 2020.01.12.902452.
Zhu X, Wang X, Han L, Chen T, Wang L, Li H, Li S, He L, Fu X, Chen S,
et al. 2020. Amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa combinada
con biosensor basado en nanopartículas para el diagnóstico de COVID-19. medRxiv doi:
10.1101 / 2020.03.17.20037796.
www.rnajournal.org 783
 Descargado de rnajournal.cshlp.org el 22 de junio de 2020 - Publicado por Prensa de laboratorio Cold Spring Harbor

Superar el cuello de botella de las pruebas generalizadas: una revisión rápida de los enfoques de las
pruebas de ácido nucleico para la detección de COVID-19

Meagan N. Esbin, Oscar N. Whitney, Shasha Chong y col.

ARN 2020 26: 771-783 publicado originalmente en línea el 1 de mayo de 2020 Acceda a la
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