Título: La fosfo-regulación de Tau modula la inhibición de la motilidad de la kinesina-1

Autores: Jamie L. Stern *, †, Dominique V. Lessard *, †, Gregory J. Hoeprich †, Gerardo A. Morfini ‡,

Christopher L. Berger *, †

Afiliaciones: * Programa de Ciencias Celulares, Moleculares y Biomédicas y † Departamento de Fisiología Molecular

Y Biofísica, Universidad de Vermont, Burlington, VT EE. UU. ‡ Departamento de Anatomía y Biología Celular,
Universidad de Illinois en Chicago, Chicago, IL EE. UU.

Título consecutivo: Phospho-Tau regula la motilidad de la kinesina-1

Autor correspondiente: Christopher Berger Ph.D., Departamento de Fisiología Molecular y Biofísica,

Universidad de Vermont, E217G Given Bldg, 89 Beaumont Avenue, Burlington, Vermont 05405,
Teléfono: (802) 656-5707; Fax: (802) 656-0747; Correo electrónico: cberger@uvm.edu

Abreviaturas: proteína asociada a microtúbulos (MAP), tirosina 18 (Y18), dominio activador de fosfatasa (PAD), transporte axonal
(AT), proteína fosfatasa 1 (PP1), tampón de reensamblaje 80 de Brinkley (BRB80),
BRB80 y captadores de oxígeno (BRB80 + OS)

Resumen

El transporte axonal basado en microtúbulos está estrictamente regulado por numerosas vías que garantizan la entrega adecuada de cargas de orgánulos

específicos a dominios subcelulares seleccionados. Destacando la importancia de este proceso, la evidencia patológica ha relacionado las alteraciones en estas

vías con la patogenia de varias enfermedades neurodegenerativas. Un regulador importante de este sistema, la proteína Tau asociada a microtúbulos, ha

demostrado participar en cascadas de señalización, modular la dinámica de los microtúbulos e inhibir preferentemente la motilidad de la quinesina-1. Sin

embargo, se desconocen los medios celulares para regular la inhibición de la motilidad de la kinesina-1 por parte de Tau. Tau está sujeto a varias

modificaciones postraduccionales, incluida la fosforilación, pero no se ha abordado si la fosforilación regula Tau en la superficie de los microtúbulos. Se ha

demostrado que la Tau fosforilada en tirosina 18 regula la inhibición del transporte axonal en el estado patológico. La tirosina 18 es tanto una modificación del

estado patológico como no patológico y, por lo tanto, es un punto de partida atractivo para comprender el control de la inhibición de la motilidad de la kinesina-1

por Tau. Mostramos que la pseudofosforilación de la tirosina 18 reduce la inhibición de la motilidad de la cinesina-1 por 3RS-Tau. Además, mostramos que la

introducción de carga negativa en la tirosina 18 desplaza el equilibrio de unión del estado estáticodinámico previamente descrito de Tau hacia el estado

dinámico. También presentamos la primera evidencia del establecimiento del equilibrio de estado estático-dinámico de Tau en condiciones fisiológicas. La

tirosina 18 es tanto una modificación del estado patológico como no patológico y, por lo tanto, es un punto de partida atractivo para comprender el control de la

inhibición de la motilidad de la kinesina-1 por Tau. Mostramos que la pseudofosforilación de la tirosina 18 reduce la inhibición de la motilidad de la cinesina-1 por

3RS-Tau. Además, mostramos que la introducción de carga negativa en la tirosina 18 desplaza el equilibrio de unión del estado estáticodinámico previamente

descrito de Tau hacia el estado dinámico. También presentamos la primera evidencia del establecimiento del equilibrio de estado estático-dinámico de Tau en condiciones fisiológicas. L

Popa 1
El material complementario se puede encontrar en:
http://www.molbiolcell.org/content/suppl/2017/02/27/mbc.E16-10-0728v1.DC1
Introducción

La proteína asociada a microtúbulos neuronales (MAP) Tau participa en el desarrollo axonal desde sus primeras etapas en adelante
(Andreadis, 2005). Tau se ha implicado en muchos procesos dentro de la neurona, la mayoría de los cuales están asociados con su
participación en el transporte axonal (AT). El sistema AT abarca la pista de microtúbulos, motores moleculares que incluyen kinesin-1 y -2,
numerosos MAP, incluido Tau, y muchas cascadas de señalización (Maday et al., 2014). El papel de Tau en la AT es multifacético, ya que se ha
demostrado que estabiliza los microtúbulos (Panda et al., 2003), participar en cascadas de señalización (Kanaan et al., 2012) e inhiben la
motilidad de la kinesina-1 (Vershinin et al., 2007; Dixit et al., 2008; McVicker et al., 2011). En el estado no patológico, la capacidad de Tau para
inhibir preferentemente la motilidad de la kinesina-1 es de particular interés cuando se yuxtapone con el fracaso de esta inhibición para
interrumpir la entrega normal de carga, lo que sugiere que Tau tiene un papel en la modulación de la entrega de carga mediada por kinesina
durante la AT (Kanaan et al., 2012). Esto resalta la importancia de la regulación celular de la función inhibidora de Tau del transporte de
kinesina-1 durante la AT, pero actualmente se desconoce cómo se logra este control.

La comprensión de la función de Tau y la regulación correspondiente se ve agravada por su diversidad de secuencia. Hay seis
isoformas Tau que surgen de una estricta regulación del desarrollo del empalme alternativo de la MAPT gen en el cromosoma 17
(Andreadis, 2005; Ballatore et al., 2007). Si bien las seis isoformas tienen una región central rica en prolina (PRR) y un dominio activador
de fosfatasa N-terminal (PAD) (Ballatore et al., 2007; Kanaan et al., 2012), se diferencian por el número de repeticiones de unión de
microtúbulos C-terminales (tres a cuatro) e insertos ácidos N-terminales (cero a dos) (Goode et al., 2000; Ballatore et al.,

2007). El papel de Tau en la señalización está parcialmente mediado por su PAD, que se ha demostrado que activa la proteína fosfatasa 1
(PP1) (LaPointe et al., 2009; Kanaan et al., 2011). En el estado patológico, se ha demostrado que un fosfomimético de tirosina 18 (Y18), el
último residuo de la PAD, previene la inhibición del transporte axonal cuando se incorpora a los ovillos neurofibrilares (Kanaan et al., 2012).
Y18 es fosforilada predominantemente por la quinasa Fyn de la familia Src tanto en estados patológicos como no patológicos (Lee et al., 1998;
Kanaan et al., 2012; Larson et al., 2012).

Además de esta diversidad de isoformas, recientemente se ha demostrado que Tau puede unir el microtúbulo en un equilibrio entre
estados dinámicos estáticos e independientes de ATP (Vershinin et al., 2007; Dixit et al.,
2008; Hinrichs et al., 2012). Hemos demostrado que el equilibrio de estado estático-dinámico difiere con la isoforma Tau y la estructura reticular de
microtúbulos con la isoforma más corta, 3RS-Tau, siendo más estática en los microtúbulos estabilizados con paclitaxel que la isoforma más larga,
4RL-Tau (McVicker et al., 2014). La capacidad de Tau para inhibir la motilidad de la kinesina-1 también difiere con la isoforma. 3RS-Tau, que
favorece el estado estático, es más inhibidor de la kinesina-1 que 4RL-Tau (Dixit et al., 2008; McVicker et al., 2011). Esta correlación indica que el
estado estático es más inhibidor de la motilidad de la kinesina-1 que el estado dinámico. Dadas estas diferencias de comportamiento específicas
de isoformas, un mecanismo común para regular múltiples isoformas de Tau y sus equilibrios de estado estático-dinámico sigue sin estar claro.

Todas las isoformas de Tau están sujetas a una variedad de modificaciones postraduccionales (Watanabe et al.,
1993; Canguelo et al., 2014; Kamah et al., 2014) que pueden tener un papel importante en muchos aspectos de la regulación Tau. Postulamos que las
modificaciones postraduccionales (especialmente la fosforilación) son el vínculo entre el control del equilibrio estático-dinámico de Tau y la inhibición
de la motilidad de la kinesina-1 de Tau. Como se indicó anteriormente, la Tau estática es más inhibitoria de la motilidad de la kinesina-1 que la Tau
dinámica (McVicker et al., 2011), mientras que se ha demostrado que la fosforilación / un fosfomimético de Y18 previene la inhibición del transporte
axonal en el estado patológico (Kanaan et al., 2012). Planteamos la hipótesis de que la carga negativa proporcionada por la fosforilación de Y18
estabiliza el estado dinámico / desestabiliza el estado estático, cambiando así el estado estático.

Popa 2
equilibrio dinámico hacia el estado dinámico menos inhibitorio. Para probar esta hipótesis, generamos construcciones 3RS-Tau
fosfomiméticas y de control mutando Y18 en ácido glutámico (Y18E 3RS-Tau) y alanina (Y18A 3RS-Tau). Para estudiar el efecto de
aumentar la carga negativa en / alrededor de Y18, se generó un doble fosfomimético mutando la treonina 17 e Y18 a ácido glutámico (dE
3RS-Tau). Usando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), observamos interacciones de una sola molécula
3RS-Tau con microtúbulos estabilizados con paclitaxel. Nuestros resultados proporcionan la primera evidencia de control directo por
fosforilación del comportamiento dinámico de Tau, y por lo tanto su función, en la superficie de los microtúbulos.

Resultados

La introducción de carga negativa en Y18 reduce la inhibición por 3RS-Tau de la motilidad de la quinesina-1. Se utilizó microscopía TIRF
para visualizar la motilidad de la kinesina-1 (Figura 1) en microtúbulos estabilizados con paclitaxel en presencia de WT sin marcar y con etiqueta
Alexa 488 200 nM y Y18E 3RS-Tau (1: 5; Tau: tubulina) (Figura 2A). En ausencia de Tau, la kinesina-1 tuvo una duración de ejecución de 1,64
0.50 µm (Figura 2B) que fue
disminuyó significativamente en presencia de WT 3RS-Tau tanto sin etiquetar como etiquetado (0,99 0,23 µm y
0,99 0,24 µm; Figura 2, C y D, Tabla complementaria S2; Figura suplementaria S1) como tenemos
previamente demostrado (McVicker et al., 2011). Curiosamente, sin embargo, la duración del ciclo de kinesina-1 aumentó significativamente
en presencia de Y18E 3RS-Tau (sin etiquetar = 1.37 0,39 µm, etiquetado = 1,35

0,39 µm; Figura 2, E y F) en comparación con la condición WT 3RS-Tau (Figura 2, C y D). Kinesina-1
la velocidad no difirió en ninguna de las condiciones probadas (Tabla complementaria S2). Estos resultados indican que la introducción de carga negativa
en Y18 reduce la inhibición de 3RS-Tau de la duración del ciclo de kinesina-1 sin afectar su velocidad. La capacidad de WT Tau para inhibir la duración de
la carrera de kinesina-1 sin afectar la velocidad se ha informado anteriormente (Dixit et al., 2008). Esta es la primera evidencia de la regulación mediada
por fosforilación de la capacidad de 3RS-Tau para inhibir la motilidad de la quinesina-1.

Un fosfomimético Y18 de 3RS-Tau exhibe un cambio significativo hacia el estado dinámico in vitro.
Dados los resultados de nuestros ensayos de motilidad, queríamos saber si la introducción de carga negativa en Y18 afecta el equilibrio
estático-dinámico de Tau en la superficie de los microtúbulos. Se utilizó microscopía TIRF para visualizar las interacciones de las
construcciones utilizadas en los ensayos de motilidad (WT y Y18E 3RS-Tau) (Figura 3A) con microtúbulos estabilizados con paclitaxel
marcado con rodamina TRITC a 200 nM de Tau (1: 5, Tau: tubulina). Observamos eventos predominantemente estáticos para WT 3RS-Tau
(77,1 ± 4,2%, Figura 3B; Tabla complementaria S3), un resultado que hemos demostrado previamente (McVicker et al., 2014). Por el
contrario, observamos una disminución significativa (p <0,05) en el número de eventos estáticos para Y18E 3RSTau (47,7 ± 5,0%, Figura 3B;
Tabla complementaria S3).

Los tiempos de permanencia estática para WT 3RS-Tau se ajustaron mejor a una función exponencial de dos fases. Esto reveló una
población de tiempos de permanencia prolongados y una de tiempos de permanencia cortos (Figuras suplementarias S2A y S3; Tabla complementaria
S3), que muy probablemente corresponden a los pequeños complejos de múltiples proteínas (tiempos de permanencia largos) y las interacciones de
una sola molécula (tiempos de permanencia cortos) con la superficie de los microtúbulos que hemos observado previamente en el estado estático
(McVicker et al., Los tiempos de permanencia estática de Y18E 3RS-Tau se ajustaron mejor a una función exponencial de una fase (Figuras
complementarias S2B y S3; Tabla complementaria S3) con un promedio de 14.5 s que es comparable al tiempo de permanencia estático largo de WT
3RS-Tau de 15.7 s . Los tiempos de permanencia dinámicos para WT y Y18E 3RS-Tau se ajustaron mejor a las funciones exponenciales de una fase
(Figura suplementaria S2C y D; Figura suplementaria S3; Tabla suplementaria S3) y no difirieron entre sí. La capacidad de controlar el equilibrio entre
los estados estático y dinámico de Tau, y de regular específicamente ese control imitando la fosforilación en Y18, no se ha demostrado previamente.

Popa 3
 Las construcciones fosfomiméticas de Y18 3RS-Tau se unen con afinidad disminuida por el microtúbulo.
Dado el cambio observado hacia el estado dinámico, consideramos la posibilidad de que la introducción de carga negativa en Y18
redujera la afinidad de Tau por la superficie de los microtúbulos. Esto también conduciría a una disminución en la capacidad de
3RS-Tau para inhibir la motilidad de la kinesina-1. Para abordar esto, se utilizó microscopía TIRF para obtener imágenes de
concentraciones crecientes (50-650 nM) de unión de 3RS-Tau marcada con Alexa 532 a microtúbulos estabilizados con paclitaxel
marcados con HiLyte 488 (Figura 4A). Se observaron una construcción no fosforilable (Y18A 3RSTau) y una construcción con carga
negativa aumentada (dE 3RS-Tau) junto con WT y Y18E 3RS-Tau en un esfuerzo por comprender mejor el efecto de la introducción
de carga negativa. Se midió la intensidad media de Alexa 532 marcada con 3RS-Tau por unidad de longitud a lo largo del microtúbulo
y se representó frente a la concentración de Tau.

estaba determinado. Encontramos que WT 3RS-Tau une el microtúbulo con un de 150 ± 126 nM
mientras que Y18A 3RS-Tau tenía un de 331 ± 100 nM (Figura 4B; Tabla complementaria S3). Introducción de
El aumento de la carga negativa disminuyó la afinidad de Tau por el microtúbulo como lo demuestra un de 700
± 318 nM para Y18E 3RS-Tau con una disminución aún mayor para dE 3RS-Tau ( de 902 ± 266 nM)
(Figura 4B; Tabla complementaria S3).

El cambio mediado por fosfomiméticos hacia el estado dinámico se mantiene para fracciones unidas comparables de 3RS-Tau. Utilizando
la valores de nuestros ensayos de unión, determinamos que en un microtúbulo
concentración de 1 µM, WT 3RS-Tau tenía una fracción unida del 87% mientras que la fracción unida de Y18E 3RS-Tau era del 59%. A
la alta concentración utilizada en nuestros ensayos de motilidad de kinesina-1 (200 nM; 1: 5 (Tau: tubulina)), WT 3RS-Tau tendría una
concentración unida a microtúbulos de 174 nM mientras que Y18E 3RS-Tau tendría 118 nM unida. La inhibición de kinesina-1 por Y18E
3RS-Tau que observamos para esta alta concentración podría atribuirse entonces a esta diferencia en la fracción unida de Tau. Para
abordar esta posibilidad, observamos construcciones de WT, control (Y18A) y fosfomimético (Y18E, dE) de 3RS-Tau a 10 nM (1: 3000;
Tau: tubulina) donde las concentraciones unidas de WT (9 nM), Y18A (7 nM), Y18E (7 nM) y dE (5 nM) 3RS-Tau eran comparables. A
esta concentración, el porcentaje de eventos estáticos para Y18A (77,8 ± 4,2%) no fue significativamente diferente de WT 3RS-Tau
(81,4 ± 3. 9%) (Figura 5; Tabla complementaria S3). En estas condiciones, Y18E 3RS-Tau tenía una población estática de 67,4 ± 4,7%
(Figura 5; Tabla complementaria S3) que era una diferencia estadísticamente significativa de WT 3RS-Tau (p <

0.05) y Y18A 3RS-Tau (p <0.05) (Figura 5; Tabla complementaria S3). dE 3RS-Tau tenía una población estática de 51,4 ± 5,0% (Figura 5;
Tabla complementaria S3) que fue una disminución estadísticamente significativa en comparación con Y18E 3RS-Tau (p <0,05).

Los tiempos de permanencia del estado dinámico para WT, Y18A, Y18E y dE 3RS-Tau (Figuras complementarias S4, AD; Tabla
complementaria S3) se ajustaron mejor a las funciones exponenciales de una fase y no difirieron significativamente. Los tiempos de permanencia para
eventos estáticos de las poblaciones WT, Y18A, Y18E y dE 3RS-Tau se ajustaron mejor a las funciones exponenciales de dos fases (Figura
complementaria S5, AD). Aunque hubo una ligera disminución en los tiempos de permanencia largos y cortos para Y18E 3RS-Tau (Figura
suplementaria S5C; Tabla suplementaria S3) y un aumento en el tiempo de permanencia corto para dE 3RS-Tau (Figura suplementaria S5D; Tabla
suplementaria S3); los tiempos de permanencia (largos) de WT, Y18A y dE 3RS-Tau no fueron apreciablemente diferentes. Este resultado indica que
el cambio observado hacia el estado dinámico es independiente de la fracción de Tau unida al microtúbulo.

El cambio mediado por carga negativa hacia el estado dinámico se mantiene ex vivo. Todos in vitro
Los ensayos presentados aquí se realizaron a baja fuerza iónica. Por lo tanto, preguntamos si el efecto de la carga negativa en el comportamiento de
3RS-Tau todavía estaba presente en condiciones más fisiológicamente relevantes. Se utilizó microscopía TIRF para visualizar el comportamiento de
Tau (Figura 6) en ex vivo preparaciones de axoplasma extruido de los axones gigantes del calamar atlántico ( Loligopealei). Las muestras de axoplasma
extruidas se perfundieron con

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una mezcla de Alexa 568 etiquetada WT, Y18A o Y18E 3RS-Tau para visualizar microtúbulos y Alexa 488 etiquetada WT, Y18A o Y18E
3RS-Tau para observar eventos de una sola molécula (Película complementaria S4 y S5). Y18A 3RS-Tau no fosforilable tenía una
población estática de 82,0 ± 3,8% (Figura 7; Tabla complementaria S3). Esto fue estadísticamente significativo de poblaciones estáticas
para WT (74.0 ± 4.4%) y Y18E 3RS-Tau (73.2 ± 4.4%) (p <0.05) (Figura 7; Tabla complementaria S3) .Estos resultados resaltan la
importancia de usar un constructo no fosforilable para prevenir posibles ex vivo fosforilación en Y18. Con base en estos datos, concluimos
que el cambio Y18E mediado hacia el estado dinámico observado in vitro se mantiene dentro del axoplasma. A diferencia del in vitro tiempos
de permanencia, todos ex vivo los tiempos de permanencia para WT, Y18A y Y18E 3RS-Tau se ajustan mejor a una única función
exponencial. No hubo diferencia en el ex vivo

tiempos de permanencia estática (Figura complementaria S6, AF; Tabla complementaria S3) para WT, Y18A y Y18E 3RSTau. Nosotros observamos ex
vivo tiempos de permanencia que eran un orden de magnitud más cortos que los in vitro tiempos de permanencia (Figuras complementarias S2, S4 y S5).
Esta diferencia se ha observado previamente (Janning et al.,
2014) y lo más probable es que se pueda atribuir al aumento de la fuerza iónica que se encuentra en condiciones fisiológicas. Esta es la primera
evidencia que demuestra que el equilibrio estático-dinámico de Tau en la superficie de los microtúbulos observado in vitro está presente en las
condiciones que se encuentran dentro del axón.

Discusión

Recientemente, hemos demostrado que la capacidad establecida de Tau para inhibir la motilidad de la kinesina-1 difiere con la isoforma
(McVicker et al., 2014). Sin embargo, todavía no se conocen los medios celulares para regular la inhibición de la kinesina-1 por Tau. La fosforilación de
Y18 es de particular interés debido a su papel en la prevención de la inhibición del transporte axonal en el estado patológico (Kanaan et al., 2012) y su
posible participación en la estabilización de una conformación plegada dinámica de estado no patológico de Tau en solución (Jeganathan et al., 2006).
Nuestros resultados (Figura 2) son la primera evidencia de que la fosforilación regula la capacidad de Tau para inhibir la kinesina-

1.

Planteamos la hipótesis de dos posibles explicaciones para la inhibición reducida de la kinesina-1. La introducción
de carga negativa en Y18 podría cambiar el estado de equilibrio estático-dinámico hacia el estado dinámico menos
inhibitorio. Alternativamente, la carga negativa en Y18 podría disminuir la afinidad de Tau por la superficie de los
microtúbulos, reduciendo efectivamente el número de obstáculos de Tau para que la kinesina-1 circunnavegue.
Específicamente para nuestras condiciones de ensayo de motilidad de kinesina-1 (1: 5, Tau: tubulina) (Figura 2), se utilizó
una concentración final de Tau 200 nM para la cual WT 3RS-Tau tenía una fracción unida del 87% (174 nM) en comparación
a la fracción de Y18E 3RS-Tau unida del 59% (118 nM) (basado en los resultados del ensayo de unión; Figura 4). Pero
también encontramos que el cambio de Y18E 3RS-Tau hacia el estado dinámico se mantiene en fracciones comparables de
Tau unidas a la superficie de los microtúbulos (5-9 nM) (Figura 5).

Sin embargo, aún debe tenerse en cuenta la diferencia de afinidad por el microtúbulo entre WT y Y18E 3RS-Tau. Aunque los cambios
estructurales exactos que subyacen a la unión estática frente a la dinámica no se comprenden bien, la disminución de la afinidad mediada por la
carga negativa indica que las interacciones estructurales de largo alcance pueden afectar la unión y el comportamiento de las proteínas. Según el
comportamiento observado en los ensayos de dinámica de alta concentración (Figura 3), 134 nM del WT 3RS-Tau unido serían estáticos,
mientras que para Y18E 3RS-Tau 56 nM serían estáticos. Para 1 µM de microtúbulos, WT 3RS-Tau estáticamente unido ocuparía el 13% de los
sitios de unión de kinesina-1 disponibles, mientras que Y18E 3RS-Tau estático ocuparía el 5% de los sitios de unión disponibles. Esto indica que
la inhibición disminuida de la kinesina-1 de Y18E 3RS-Tau se debe a Una combinación de una fracción ligada disminuida y un cambio de equilibrio
hacia el estado dinámico. Por último

Popa 5
esto conduce a una reducción en el número de obstáculos Tau estáticos que encuentra la kinesina-1 en la superficie de los microtúbulos.

Anteriormente se ha demostrado que con una concentración creciente Tau forma parches de proteínas múltiples en la superficie de los

microtúbulos (Dixit et al., 2008) .Nuestros ensayos de comportamiento de alta concentración (Figura

3, Tabla complementaria 3) muestran dos poblaciones de tiempos de permanencia estática de WT 3RS-Tau. El tiempo de permanencia
prolongado (Tabla complementaria 3, Figuras complementarias S2 y S3) puede ser indicativo de complejos de múltiples proteínas formados por
interacciones Tau-Tau mediadas por la región N-terminal (Feinstein et al., 2016). La pérdida de un breve tiempo de permanencia estática para
Y18E 3RS-Tau (Tabla complementaria S3, Figura complementaria S2) indica que con la introducción de carga negativa a alta concentración, la
unión estática solo puede ocurrir cuando se forman complejos multiproteicos. Además, la introducción de carga negativa N-terminal puede
interrumpir la formación del complejo (Feinstein et al., 2016) que conduciría al cambio observado hacia la unión dinámica a alta concentración
(Tabla complementaria S3). De acuerdo con estos resultados, hemos demostrado previamente que 4RL-Tau, que tiene dos inserciones
N-terminales ácidas, forma complejos de múltiples proteínas más pequeñas y se desplaza más hacia la unión dinámica que 3RS-Tau, que no tiene
inserciones ácidas (McVicker et al.,

2014) A baja concentración (Figura 3), la unión estática no se rige por la formación de complejos impulsada por la concentración.

La inhibición de Tau de la motilidad de la kinesina-1 no afecta la velocidad (Tabla complementaria S2) (Dixit et al., 2008). Anteriormente hemos

demostrado que mientras la kinesina-1 se detiene tanto en presencia como en ausencia de Tau, la frecuencia de los pasos de pausa no cambia (Hoeprich et

al., 2014). Por lo tanto, el efecto de la pausa en la velocidad no es significativo. Un aumento en la terminación de la ejecución conduciría a la disminución
observada en la duración de la ejecución.

Anteriormente hemos informado de la importancia de la estructura reticular en la regulación de los equilibrios de estado
estático-dinámico de las isoformas Tau (McVicker et al., 2014). La capacidad de Tau para inhibir la motilidad de la kinesina-1 también está
regulada por la estructura reticular (McVicker et al., 2011). En microtúbulos estabilizados con GMPCPP, 3RS-Tau se une dinámicamente y no
inhibe la motilidad de la kinesina-1 (McVicker et al., 2011; McVicker et al., 2014). El efecto inhibidor de Tau se restablece en microtúbulos
estabilizados con paclitaxel donde el equilibrio de unión de 3RS-Tau se desplaza hacia el estado estático (McVicker et al., 2011; McVicker et al., 2014)
El presente estudio demuestra que la regulación reticular no es el único medio disponible para controlar el equilibrio de unión de Tau. Controlar
el equilibrio intrínseco de Tau a través de la fosforilación y la estructura de la red de microtúbulos a través de estados de unión de nucleótidos y
PTM (McVicker et al., 2014; Yu et al., 2015) le da a la celda una mayor flexibilidad para regular los obstáculos Tau y permite una AT continua.
Hemos demostrado que el equilibrio de estado estático-dinámico de Tau se mantiene en condiciones fisiológicas y que el cambio hacia el
estado dinámico que observamos in vitro ocurre ex vivo Figura 5). Como hemos mostrado y se ha informado anteriormente (Janning et al., 2014),
Tau se une de forma dinámica y transitoria a la superficie de los microtúbulos en condiciones fisiológicas, ampliando esta observación,
enfatizamos la importancia de regular estas interacciones dinámicas para controlar la función de Tau. Cabe señalar que los tiempos de
permanencia informados aquí son más largos que los informados anteriormente (Janning et al., 2014), que puede relacionarse con los
diferentes constructos de Tau y los sistemas neuronales utilizados, y resaltar la importancia de realizar más estudios para comprender mejor la
dinámica de Tau. en vivo.

Dentro de la fosforilación del axón de Y18, el último residuo del PAD, no solo protege el PAD (Kanaan et al., 2012), pero como
muestran nuestros resultados, la carga negativa proporcionada por la fosforilación facilita un cambio de estado dinámico independiente de la
fracción unida (Figuras 3 y 5). Esto le da a la célula dos niveles de regulación de la función de Tau al prevenir la señalización de Tau a través de
la PAD y la inhibición física de Tau de la motilidad de la kinesina-1. En este modelo, mientras Y18 está fosforilado, los motores individuales
continúan transportando carga (Figura 8). La desfosforilación de Y18 conduce a la activación de la señalización (Kanaan et al., 2012) y

Popa 6
aumento de la inhibición física de la motilidad de la kinesina-1 (Figura 8). Se ha demostrado que la exposición de la PAD de Tau activa
finalmente la glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK-3β) que, además de fosforilar a Tau (Lovestone et al., 1996; Martín et al., 2013) puede
fosforilar las cadenas ligeras de quinesina (Morfini et al., 2002) (Figura 8). Esto conduce a una mayor interrupción de las interacciones
carga-motor que conducen a la disociación de los motores de la carga, lo que permite la entrega de la carga (Morfini et al., 2002) (Figura 8).

Apantallamiento PAD por fosforilación de Y18 (Kanaan et al., 2012) puede depender en parte de
cambio. La mala regulación de la estructura de Tau (Elbaum-Garfinkle y Rhoades, 2012) y, por lo tanto, su función podría ser una vía
común por la cual ocurre la neurodegeneración en enfermedades donde los cambios en la expresión de isoformas y la fosforilación
aberrante conducen al mismo resultado (Qian et al., 2013; Gerson et al., 2014).

El control de la función de Tau se complica aún más por las modificaciones anormales que ocurren en el estado de la enfermedad (Morris et
al., 2015). Nuestro grupo y otros han demostrado previamente que la capacidad de Tau para inhibir la motilidad de la kinesina-1 difiere con la isoforma
(Vershinin et al., 2007; Dixit et al., 2008; McVicker et al.,
2011) al igual que el equilibrio de estado estático-dinámico (McVicker et al., 2014). Los resultados que presentamos aquí indican que la
fosforilación proporciona un medio común de regular las isoformas y sus equilibrios. La perturbación del equilibrio entre los estados
estático y dinámico conduciría a la interrupción del transporte de carga dentro del axón al interrumpir la inhibición de la motilidad de la
kinesina-1 y la liberación de la carga. Dados nuestros resultados, es muy probable que el equilibrio entre los estados estático y dinámico
esté regulado espacialmente para controlar eficazmente la entrega de carga local. Esta señalización localizada requeriría la
participación de múltiples vías de señalización y un patrón complejo de fosforilación de Tau. Hasta la fecha, no se sabe cómo estos
eventos de fosforilación afectan el comportamiento normal de la proteína o cómo la célula equilibra la fosforilación N- y C-terminal para
mantener un estado de equilibrio estático-dinámico de trabajo. et al., 2014) y metilación (Funk et al., 2014), cuyos propósitos en la
regulación de la función de Tau aún no se han entendido completamente. Es imperativo que se comprenda el equilibrio de las
modificaciones del estado no patológico, especialmente la fosforilación, dado que uno de los primeros pasos en la neurodegeneración
puede ser la interrupción de estas modificaciones normales. Hemos comenzado a dilucidar la importancia de regular la fosforilación en
sitios específicos para controlar la función de Tau. Aquí hemos destacado nuevas implicaciones para el control celular del equilibrio del
estado estático-dinámico de Tau en el transporte axonal tanto en condiciones normales como en estado patológico.

Materiales y métodos

Todo el trabajo y los experimentos con proteínas se realizaron en BRB80 (TUBOS 80 mM, EGTA 1 mM, MgCl 1 mM 2, pH 6,9 a temperatura

ambiente) a menos que se indique lo contrario.

Tau Mutant Generation, Purification and Labeling Se generaron construcciones 3RS-Tau de alanina / ácido glutámico usando el kit de
mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II XL (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Luego, las construcciones se expresaron en
BL21-CodonPlus (DE3) -RP Escherichia coli (Stratagene, La Jolla, CA) y se purificaron usando Q y SP Sepharose (Sigma-Aldrich, St. Lois,
MO) cromatografía en columna de afinidad (McVicker et al., 2011; McVicker et al., 2014). Después de la purificación, las muestras se
dializaron frente a BRB80 y se determinaron las concentraciones de proteína con el ensayo de ácido bicinconónico (BCA) (Pierce, Rockford,
IL) usando estándares WT 3RS-Tau. A continuación, las concentraciones se validaron con geles SDS PAGE (Bio-Rad, Hercules, CA). Para el
etiquetado, las muestras se incubaron con un exceso molar de 10 veces Ditiotreitol (DTT) a temperatura ambiente durante 2 h seguido de la
eliminación de DTT con 2 ml de 7K MWCO Zeba TM columna de desalación por centrifugación (Peirce, Rockford, IL). A continuación, las
muestras se incubaron con un exceso molar triple de Alexa Fluor. ® ( 488, 532 o 568) C5 Maleimida (sondas moleculares de Invitrogen,

Popa 7
Carlsbad, CA) durante 2 horas a temperatura ambiente. El exceso de flúor se eliminó con columnas de desalación. A 640 ®
Se usó un espectrofotómetro (Beckman, Pasadena, CA) para determinar la eficiencia de etiquetado usando los siguientes coeficientes de
extinción de Alexa: Alexa 488 - 71,000 cm- 1 METRO- 1 a 495 nm; Alexa 532 - 78.000 cm-
1 METRO- 1 a 532 nm; Alexa 568 - 88.000 cm- 1 METRO- 1 a 578 nm. La concentración de proteína se determinó usando el ensayo BCA y se calculó la

relación entre la concentración de flúor y la concentración de proteína. Todas las proteínas Tau tenían eficiencias de etiquetado del 30 al 86%

(detallado en la Tabla complementaria S1).

Purificación de tubulina y preparación de microtúbulos La tubulina se purificó de cerebro bovino obtenido de Vermont Livestock &
Slaughter (Ferrisburgh, VT) como se describió previamente (McVicker et al., 2014). La tubulina purificada se aclaró mediante
ultracentrifugación (20 min, 95.000 rpm, 4 o C) en un Optima TM Ultracentrífuga TLX (Beckman, Pasadena, CA). Después de la clarificación, se
mezcló tubulina con tubulina marcada con rodamina (Cytoskeleton Inc., Denver, CO) en una proporción de 1: 200 (marcada: no marcada) y
se complementó con GTP 1 mM (Sigma-Aldrich, St. Lois, MO). Esta mezcla se incubó durante 20 min a 37ºC. o C. Después de la
polimerización, los microtúbulos se estabilizaron con paclitaxel 20 µM (Sigma-Aldrich, St. Lois, MO). La concentración de tubulina posterior
a la clarificación se calculó con el espectrofotómetro utilizando el coeficiente de extinción de tubulina de 115,000 cm- 1 METRO- 1 a 280 nm.

Preparación del cubreobjetos y montaje de la cámara de flujo Para la silanización, se incubaron cubreobjetos de vidrio en metanol al
100% durante 2 h con agitación. Los cubreobjetos lavados con metanol se limpiaron con plasma (Harrick Plasma Cleaner, HarrickPlasma,
Ithaca, NY) durante 2-5 min y luego se incubaron en una mezcla de silano (97% de tolueno (Sigma-Aldrich, St. Lois, MO), 2% 2 -metoxi
(polietilenoxi) propiltrimetoxisilano (Gelest Inc., Morrisville, PA) y butilamina al 1% (Acros Organics, Nueva Jersey, EE. UU.)) con
nitrógeno gaseoso durante 90 min (Lowndes y Nelson, 2013). Luego, los cubreobjetos se lavaron en tolueno (Lowndes y Nelson, 2013) y
luego se secaron y curaron con nitrógeno gaseoso durante 30 min. Usando adhesivo óptico Norland (Norland Products, Cranbury, NJ), se
construyeron cámaras de flujo adhiriendo cuñas ARTUS (ARTUS, Eaglewood, NJ) a los cubreobjetos de vidrio silanizado antes de 15 min
de irradiación UV (McVicker et al.,

2011).

In vitro Ensayo de dinámica TIRF Los microtúbulos estabilizados con paclitaxel se incubaron con construcciones de WT, alanina (Y18A), ácido
glutámico simple (Y18E) o ácido glutámico doble (dE) 3RS-Tau a una proporción de 1: 3000 (Tau: tubulina) (10-12 nM) 30 minutos antes. a la
imagen. Para la obtención de imágenes, se realizaron lavados e incubaciones con BRB80 + OS (BRB80 complementado con un sistema de
captación de oxígeno previamente publicado (McVicker et al., 2011)). Las cámaras de flujo se incubaron con anticuerpos monoclonales anti-β III
(neuronales) de tubulina (Sigma-Aldrich, St. Lois, MO) a 33 µg / mL durante 5 min, seguido de un lavado de volumen de cámara 2X durante 5 min
con 2 mg / mL de BSA (Sigma -Aldrich, St. Lois, MO). Alternativamente, un Pluronic de 5 min al 2.5% ®

La incubación de F-127 (Sigma-Aldrich, St. Lois, MO) se realizó antes de lavar las cámaras (volumen de cámara 10X) con BSA durante 5 min para
eliminar el exceso de Pluronic ® F-127. A continuación, las cámaras se incubaron durante 12 min con mezclas de microtúbulos / Tau diluidas a 0,5-1 µM.
Finalmente, las cámaras se lavaron con 160333 pM de Tau (concentración de formación de imágenes 1: 3000) durante 2-4 min para eliminar los
microtúbulos no adherentes. Todas las diluciones de Tau y microtúbulos se realizaron en caliente (37 o C) BRB80 + OS.

Para observar el comportamiento de Tau en una relación de 1: 5 (Tau: tubulina), la concentración necesaria de WT sin marcar o Y18E
3RS-Tau (200 nM) se añadió con 500 pM de Alexa 488 marcada con WT o Y18E 3RS-Tau. Los microtúbulos se estabilizaron como se describió
anteriormente y se incubaron con la mezcla de picos WT o Y18E 3RSTau 30 minutos antes de la formación de imágenes. Como antes, los lavados
e incubaciones se realizaron con BRB80 + OS tibio. Las mezclas de microtúbulos / Tau se diluyeron hasta una concentración de formación de
imágenes final de 1 µM. Las cámaras se prepararon como se detalla previamente y luego se incubaron con mezclas de microtúbulos / Tau diluidas.
Las cámaras se lavaron con mezclas WT calientes o Y18E 3RS-Tau (véanse las concentraciones más arriba) para eliminar los microtúbulos no
adherentes y mantener constantes las concentraciones de Tau (2-4 min).

Popa 8
 Un microscopio Eclipse Ti-U invertido (Nikon, Melville, NY) con una lente objetivo PlanApo 100X (1.49 NA) y un aumento
auxiliar 1.5X y una cámara XR / Turbo-Z (Stanford Photonics, Palo Alto, CA) que ejecuta Piper Control v2 Se utilizó .3.39 o v2.6.09
(Stanford Photonics, Palo Alto, CA) para realizar microscopía TIRF como se describió anteriormente (Previs et al., 2012; Hoeprich et al., 2014;
Previs et al., 2015). Tau marcado con Alexa 488 y tubulina marcada con rodamina se excitaron y se tomaron imágenes como se describió
anteriormente con láseres de argón de 473 nm o 532 nm y filtros de emisión previamente informados (McVicker et al.,

2014). Las imágenes se recolectaron a temperatura ambiente a 10 cuadros / s, 95 o 93 nm / píxel, 50 cuadros para microtúbulos y 500 o
1000 cuadros para Tau.

Ensayo de unión TIRF La afinidad y la cooperatividad de la unión de 3RS-Tau a los microtúbulos se evaluaron usando un ensayo de unión basado en TIRF.

Los microtúbulos se prepararon como se describió anteriormente, con la expectativa de que el marcaje se llevó a cabo con tubulina porcina marcada con

HiLyte 488 (Cytoskeleton Inc., Denver, CO) en una proporción de 1: 400 (marcada: no marcada). Las construcciones Tau se marcaron con Alexa 532 como se

describió anteriormente. Como con el in vitro Ensayo de dinámica, todas las diluciones, lavados e incubaciones se realizaron en BRB80 + OS. Las diluciones

finales de Tau y microtúbulos se realizaron en BRB80 + OS caliente como se describe anteriormente. Los microtúbulos se polimerizaron como se describe

excepto que no se añadió Tau antes de la formación de imágenes. A continuación, los microtúbulos se hicieron fluir a las cámaras de flujo preparadas a 1,5

µM como se describe anteriormente. Inicialmente, las cámaras se lavaron para eliminar los microtúbulos no adherentes. Luego, se hizo fluir Tau 50 nM y se

obtuvieron imágenes. Después de esto, se introdujeron concentraciones crecientes de Tau y se tomaron imágenes hasta que se alcanzó una concentración

final de 650 nM. Se recogieron 20 fotogramas de Tau a 10 fotogramas / s para cada concentración. Las imágenes se realizaron en el mismo sistema con las

mismas condiciones utilizadas para la in vitro Ensayo de dinámica TIRF descrito anteriormente.

Ex vivo Ensayo de dinámica TIRF Para visualizar Tau en condiciones fisiológicas, el calamar del Atlántico ( Loligopealii; Laboratorio
de Biología Marina en Woods Hole, MA) se aislaron axones y se extruyeron sus axoplasmas siguiendo protocolos previamente
establecidos (Brady et al., 1993; Song y Brady,
2013). Brevemente, las cámaras de flujo se construyeron usando 25 x 75 x Portaobjetos de vidrio de 1 mm (VWR Scientific,

Radnor, PA) y tiras de 22 Cubreobjetos de 22 mm (VWR Scientific, Radnor, PA) cortados con un diamante
bolígrafo con punta y recubierto con grasa de silicio compuesto III (Dow Corning, Midland, MI). Los axoplasmas emparejados se extruyeron en
portaobjetos de cámara individuales. Las cámaras de flujo se completaron luego agregando un cubreobjetos superior que se silanizó como se
describió anteriormente. Luego, las cámaras se aseguraron con una mezcla de lanolina, vaselina y parafina 1: 1: 1 (Song y Brady, 2013).

Las construcciones de Tau se diluyeron inicialmente en HEPES 20 mM (pH 7,2) y todas las imágenes de axoplasma se realizaron en
Tampón X / 0,8 (aspartato de potasio 437,5 mM, taurina 162,5 mM, betaína 87,5 mM, 62,5 mM
glicina, HEPES 25 mM, MgCl 16,25 mM 2, EGTA 12,5 mM, CaCl 3,75 mM 2, Glucosa 1,25 mM, pH 7)
(Song y Brady, 2013) diluido a Buffer X / 2 con ddH 2 O.Se prepararon mezclas de perfusión con 200 nM Alexa 568 etiquetado
Y18A o Y18E 3RS-Tau, 500 pM Alexa 488 etiquetado Y18A o Y18E 3RS-Tau y un
concentración final de ATP de 1 mM. Después de la perfusión, los axoplasmas se incubaron a temperatura ambiente durante
20 minutos antes de que comenzaran las imágenes. Se utilizó un microscopio Eclipse Ti invertido (Nikon, Melville, NY) con un
objetivo apocromático 100x (1,49 NA) para realizar microscopía TIRF con 488 nm (combinador láser LU-NV, Nikon, Melville,
NY) y 561 nm (Agilent Combinador de láser monolítico MLC400, Santa Clara, CA) láseres y conjuntos de filtros de paso de
banda de emisión de 525/50 nm y 600/50 nm (Chroma Technology, Bellows Falls, VT). Se utilizó una cámara AndoriXon Ultra
897 (Belfast BT12 7AL, Reino Unido) con NIS-Elements AR v4.30.02 (Nikon, Melville, NY) para obtener imágenes de Tau en
el axoplasma. La concentración relativamente alta de Tau marcada con Alexa 568 (200 nM) permitió la visualización de
microtúbulos, mientras que la concentración baja de Tau marcada con Alexa 488 (500 pM) permitió la formación de imágenes
de moléculas de Tau individuales.

Popa 9
In vitro Ensayo de motilidad de kinesina-1 Los ensayos de motilidad se realizaron con un truncado (560 aa) Drosophila melanogaster construcción de
kinesina-1 marcada con biotina (obsequio del laboratorio Hancock). Los motores se marcaron con Qdot conjugado con estreptavidina ® 655 (Life
Technologies, Carlsbad, CA) en una relación de 1: 4 (motor: Qdot). Se prepararon microtúbulos estabilizados con paclitaxel como se describió
anteriormente, excepto que después de la polimerización los microtúbulos se centrifugaron a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de que el
sedimento se resuspendiera en tampón de ensayo de motilidad (MAB) (PIPAS 10 mM, pH 7,4 a temperatura ambiente, acetato de potasio 50 mM, 4
acetato de magnesio mM, EGTA 1 mM) a 37 o C complementado con un sistema de captación de oxígeno (MAB + OS) como se describió anteriormente
(Hoeprich et al., 2014). Antes de la obtención de imágenes, los microtúbulos se incubaron con Tau (WT o Y18E 3RS-Tau marcado o no marcado con
Alexa 488) en una proporción de 1: 5 (Tau: tubulina) durante 20 min a 37ºC. o Las cámaras de flujo se prepararon mediante incubación con anticuerpos
monoclonales anti-tubulina (detallados anteriormente) diluidos con MAB + OS. El bloqueo y el lavado se realizaron como se detalló anteriormente.
Brevemente, las cámaras se bloquearon con 0,5 mg / ml de BSA en MAB + OS antes de añadir 1 µM de microtúbulos o microtúbulos / Tau y se
incubaron como para los ensayos de comportamiento de Tau. Los microtúbulos no adherentes se eliminaron con un lavado MAB + OS. Se añadió una
concentración de trabajo de 20 pM - 50 pM de quinesina-1 junto con ATP 1 mM justo antes de la formación de imágenes. Las imágenes se realizaron en
el mismo sistema que el in vitro

Ensayos de Tau. Los Qdots se emocionaron con el láser de 473 nm y todas las películas se adquirieron a cinco fotogramas por segundo.

Análisis de los datos Ensayos de dinámica TIRF in vitro Se usó ImageJ 1.48v (NIH, Bethesda, MD) para crear quimógrafos de Tau interactuando con el

microtúbulo usando el complemento MultipleKymograph. Para determinar los tiempos de permanencia, se utilizó el complemento MTrackJ para medir la

duración de los eventos que eran claramente estáticos o dinámicos. El once por ciento de los eventos muestran cambios y no se incluyeron en un análisis

adicional. Solo se utilizaron los eventos que comenzaron, permanecieron y terminaron en el microtúbulo durante el período de obtención de imágenes. Los

tiempos de permanencia dinámicos y estáticos se exportaron a GraphPad Prism v6.00 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Se generaron gráficas de

distribución de frecuencias acumulativas para cada población y se ajustaron a funciones exponenciales de una o dos fases. Los tiempos de permanencia

promedio se calcularon como la constante de tiempo de la función exponencial. La bondad del ajuste (R 2) y también se informaron las bandas de confianza

del 95%. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para determinar la significación estadística de las poblaciones estáticas en comparación con las dinámicas

de conjuntos de datos de construcción 3RS-Tau. Todos los conjuntos de datos son compuestos de datos recopilados en diferentes días. Alta

concentración (pico): (WT, N = 8; Y18E, N = 8), fracción unida comparable: (WT, N = 12; Y18A, N = 5; Y18E , N = 4; dE, N = 5).

Ensayo de dinámica de TIRF ex vivo Los eventos se rastrearon utilizando el complemento MTrackJ para ImageJ. Los eventos se eligieron si duraban
más de un cuadro y si la señal permanecía dentro de un rango de captura de 13 x 13 píxeles de un cuadro al siguiente (rango de captura elegido en
función del rango de difusión máximo de una proteína Tau (Konzack et al., 2007)). Las pistas se exportaron a Excel y eventos con una distancia
máxima desde el inicio 0,5
µm fueron designados estáticos mientras que los eventos 0,5 µm se denominaron dinámicos. Se utilizó GraphPad Prism
como se describió anteriormente, para trazar la distribución de frecuencia acumulada de los tiempos de permanencia a los que se ajustaron las funciones

exponenciales de una fase. El tiempo de permanencia promedio se determinó a partir del ajuste de la función exponencial. Como arriba, la bondad del ajuste

(R 2) y se informaron las bandas de confianza del 95%. La significación estadística se determinó mediante Chi-cuadrado con corrección de Yates. Todos los

conjuntos de datos se componen de datos recopilados en diferentes días (WT, N = 4; Y18A, N = 5; Y18E, N = 5).

Ensayo de unión TIRF La intensidad media ( Avg I; Unidades arbitrarias) por unidad de longitud de Tau que une el microtúbulo se midió para
cada cuadro utilizando el complemento Multi Measure para ImageJ. En GraphPad

Prisma, el promedio por unidad de longitud se utilizó para trazar vs . Las curvas de unión se ajustaron

a un enlace específico del sitio con la pendiente de Hill, que se utilizó para determinar el coeficiente de Hill y utilizando la ecuación de Hill:

Popa 10
donde es el coeficiente de Hill y es el máximo . los reportado aquí

se normalizó a . Se determinó la fracción de Tau unida () para el ensayo de motilidad de kinesina-1

usando la ecuación:

dónde es la concentración de microtúbulos utilizados para la obtención de imágenes y es la afinidad de Tau por el
superficie de microtúbulos calculada en el ensayo de unión. Todos los conjuntos de datos se componen de datos recopilados en diferentes días (WT,
N = 4; Y18A, N = 3; Y18E, N = 3).

Ensayo de motilidad de kinesina-1 in vitro Los datos se analizaron como se informó anteriormente (Hoeprich et al., 2014). Brevemente, el complemento
MTrackJ para ImageJ se usó para medir la motilidad, mientras que la herramienta de línea segmentada se usó para medir la longitud de las pistas. La

velocidad media se trazó como un histograma y se ajustó a una distribución gaussiana. La media y la desviación estándar se informan aquí. Usando

métodos que hemos descrito previamente (Thompson et al., 2013), se generaron gráficos de frecuencia acumulativa para las longitudes de ejecución

corregidas por los efectos de la longitud de la pista de microtúbulos (mediante el remuestreo de los datos) y se informaron aquí (nivel de confianza del 99%

del remuestreo de datos repetido 10,000 veces). La significancia estadística se determinó como se describió previamente (Thompson et al., 2013). Todos los

conjuntos de datos se componen de datos recopilados en diferentes días (No Tau, N = 10; WT, N = 10; Y18E, N = 10).

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por NIGMS / NIH para el Dr. Christopher Berger (GM101066) y el Dr. Gerardo Morfini (NS066942A).
Agradecemos al Dr. David Warshaw y Guy Kennedy por la capacitación, uso y soporte técnico del microscopio TIRF utilizado en la
Universidad de Vermont. Un agradecimiento especial a Vermont Livestock & Slaughter (Ferrisburgh, VT) por su continuo apoyo a
nuestro trabajo. También nos gustaría agradecer al Laboratorio de Biología Marina por proporcionar un entorno de trabajo
extraordinario. Gracias a la Dra. Lynne Chang (Nikon; Melville, NY) por la provisión y el apoyo técnico del microscopio TIRF utilizado
en el Laboratorio de Biología Marina. Gracias al Dr. William Hancock por el uso de su construcción de kinesina-1. Un agradecimiento
adicional al Dr. Scott Brady, Dr. JasonStumpff, Lynn Chrin, PhillipeMouchati, Rehan Ali, Minsu Kang y Henry Thomsett por su apoyo
en las distintas etapas del desarrollo de este trabajo. Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses con el trabajo aquí
presentado. Este manuscrito fue escrito por JS y CB. JS, CB y GM participaron en la edición. Los experimentos fueron diseñados por
JS, GH, GM y CB y realizados por JS, DL y GH.

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Popa 13
Figuras legendarias

Figura 1 Quimógrafos representativos de la motilidad de la kinesina-1. Se utilizó microscopía TIRF para observar que la motilidad de la
quinesina-1 estaba en ausencia de Tau y en presencia de WT sin marcar o marcado con Alexa 488 y Y18E 3RS-Tau (200 nM (1: 5, Tau:
tubulina)). Se observaron eventos continuos (A), ejecución-pausa-ejecución (B) y pausa-terminación (C) en todas las condiciones.

Popa 14
Figura 2 Diagrama de ensayos de motilidad con gráficos de frecuencia acumulada de longitudes de ejecución (media ± DE) para
kinesina-1 en ausencia y presencia de 3RS-Tau. A) Las cámaras de flujo se pasivaron con PEG-silano (azul) antes de usar anticuerpos
de tubulina (negros) para adherir microtúbulos estabilizados con paclitaxel (verde). Se observó motilidad de kinesina-1 (púrpura / rojo)
marcada con Qdot en microtúbulos sin decorar o decorados con Tau (amarillo) marcados / sin marcar. B) En microtúbulos sin decorar,
la kinesina-1 tuvo una longitud de corrida de 1,64 ± 0,50 • metro. La introducción de WT 3RS-Tau tanto sin etiquetar (C) como etiquetado
(D), redujo significativamente la duración del ciclo de kinesina-1 a 0,99 ± 0,23 y 0,99 ±

0,24 • m (p <0,05). En presencia de Y18E 3RS-Tau sin etiquetar (E) y etiquetado (F), la duración del ciclo de kinesina-1 aumentó
significativamente a 1,37 ± 0,39 • m (p <0,05) y 1,35 ± 0,40 • m (p <0,05), respectivamente. La introducción de carga negativa redujo la capacidad
de Tau para inhibir la motilidad de la kinesina-1 y condujo a un aumento significativo en la duración del ciclo (Tabla complementaria S2).
Experimentos: 10.

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figura 3 Comparación del comportamiento de WT y Y18E 3RS-Tau en microtúbulos estabilizados con Taxol a alta concentración. A) Los quimógrafos
representativos muestran los diferentes tipos de comportamientos que se pueden observar. Tau puede unirse estáticamente (Estático: líneas
horizontales) mientras interactúa con el microtúbulo o exhibir una unión dinámica a lo largo de la superficie del microtúbulo (Dinámico: líneas
irregulares). Tau también puede cambiar entre estos estados (Switch). B) Gráfico de barras que compara el porcentaje (± DE) de eventos estáticos con
eventos dinámicos para WT y Y18E 3RS-Tau. Para WT 3RS-Tau, 77,1 ± 4,2% de los eventos fueron estáticos, mientras que el equilibrio de Y18E
3RS-Tau se desplazó hacia el estado dinámico (47,7 ± 5,0% de eventos estáticos). (**** denota una diferencia estadísticamente significativa de p
<0,05). Eventos: WT = 388, Y18E = 235 de ocho experimentos.

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Figura 4 Comparación de ensayos de unión a TIRF. Ensayos de unión a TIRF para WT (N = 4), Y18A (N = 3), Y18E (N = 3) y dE (N = 3)
3RS-Tau. WT 3RS-Tau tenía un (media ± DE) de 150 ± 126 nM, Y18A 3RS-Tau
tenía un de 331 ± 100 nM, Y18E 3RS-Tau tuvo un de 700 ± 318 nM y dE 3RS-Tau tuvo un de 902
± 266 nM. La afinidad de Tau por la superficie de los microtúbulos disminuye con la introducción de una carga negativa creciente en Y18.

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Figura 5 El comportamiento de fracciones unidas comparables de WT, Y18A, Y18E y dE 3RS-Tau en microtúbulos estabilizados con
paclitaxel. A) Los quimógrafos representativos muestran unión dinámica (línea irregular) y estática a lo largo de la superficie de los
microtúbulos (líneas horizontales). B) Gráfico de barras que compara el porcentaje de eventos estáticos con los dinámicos (porcentaje ± DE)
para cada construcción de Tau. La introducción de cargas negativas en Y18 y T17 desplazó el equilibrio entre los estados estático y dinámico
hacia el estado dinámico. (****) denota una diferencia estadísticamente significativa de p <0,05. Eventos: WT = 566 (N = 12), Y18A = 320 (N =
5), Y18E = 472 (N = 4) y dE = 220 (N = 5).

Popa 18
Figura 6 Eventos vinculantes estáticos y dinámicos (flecha) con el axoplasma. Se usaron muestras de axoplasma de axón gigante de calamar para
obtener imágenes de las interacciones WT, Y18A y Y18E 3RS-Tau (500 pM Alexa 488 etiquetado como Tau, verde) con microtúbulos axonales (200 nM
Alexa 568 etiquetado como Tau, rojo). Tau se une tanto estática como dinámicamente en condiciones fisiológicas.

Popa 19
Figura 7 Se mantiene el equilibrio de unión de Tau entre los estados estático y dinámico. ex vivo. Gráfico de barras que compara el
porcentaje (± DE) de eventos estáticos a dinámicos para Y18E y Y18A 3RS-Tau en la preparación de axoplasma. Como se observó in
vitro Figuras 3 y 5), se observó un cambio en el equilibrio de Tau hacia el estado dinámico tras la introducción de carga negativa en Y18.
****: p <0,05. Eventos: Y18A = 972 (N = 5), WT = 1129 (N = 4), Y18E = 757 (N = 5).

Popa 20
Figura 8 Modelo de regulación Tau. Los resultados de nuestro trabajo aquí indican que la fosforilación de Y18 (amarillo) no solo previene la
activación de PP1 inducida por PAD expuesta (azul claro) (Kanaan et al., 2012), pero también estabiliza Tau (azul) en el estado dinámico, lo
que permite el transporte continuo de carga mediado por kinesina-1 (rojo). Por otro lado, la desfosforilación de Y18 cambiaría el equilibrio de
Tau hacia el estado estático más inhibitorio al tiempo que permitiría la activación de PAD de PP1 (rosa) tras la exposición. Entonces, PP1
desfosforilaría y activaría GSK-3β (naranja), que a su vez fosforila las cadenas ligeras de kinesina-1 y promueve la disociación de sus
cargas transportadas. Por lo tanto, la mala regulación del equilibrio dinámico de Tau podría promover la degeneración neuronal al
comprometer la entrega localizada de cargas de kinesina-1.

Popa 21