UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL

“FRANCISCO DE MIRANDA”
ÁREA CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE MEDICINA
U.C. MICROBIOLOGÍA I

MANUAL DE TRABAJOS
PRÁCTICOS DE MICOLOGÍA
MÉDICA
REALIZADO POR: Profa. LEYLA HUMBRÍA DE HEYLIGER

SANTA ANA DE CORO, 2011

 NORMAS DE BIOSEGURIDAD E INDICACIONES A SEGUIR PARA EL TRABAJO
PRÁCTICO EN EL LABORATORIO DE MICOLOGÍA

Las técnicas de laboratorio realizadas para la identificación de los hongos, deben

llevarse a cabo cumpliendo con todas las normas de bioseguridad establecidas, para
evitar la contaminación tanto del ambiente como del personal encargado del
procesamiento. Es por ello que se deben cumplir las siguientes normas:

1. El uso de la bata es de carácter obligatorio.

2. Lavar las manos con agua y jabón antes y después de cada actividad práctica.

3. No se debe ingerir alimentos ni bebidas en el laboratorio.

4. Mantener apagado el mechero cuando no esté en uso, a fin de evitar

quemaduras o calor excesivo.

5. Los productos inflamables (alcohol, éter, etc.) deben mantenerse alejados de la

llama del mechero.

6. NUNCA se debe oler el cultivo de un hongo. Los hongos difieren de las bacterias
en que muchos de ellos producen gran número de esporas, que pueden
diseminarse en el aire y ser inhaladas. Los cultivos de hongos filamentosos
(sobre todo los agentes causales de micosis sistémicas cuya vía de transmisión
es la inhalatoria) han de ser manipulados en el interior de una cabina de
seguridad biológica clase II, sin excepciones.

7. Es permisible el manejo de los cultivos de levaduras en la mesa del laboratorio

pero deben ser tratados como material infeccioso.
Microscopio Óptico

8. Los cultivos de hongos deben ser sellados con cinta adhesiva para evitar la
contaminación del laboratorio y deben ser esterilizados en autoclave o bien

1
 eliminarlos en los recipientes adecuados para residuos sanitarios grupo III o de
riesgo.

9. Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del laboratorio.

10. Cualquier accidente como derrame de reactivos, cortes y quemaduras, deben

comunicarse inmediatamente al Profesor.

11. El orden y la limpieza son esenciales en todas las experiencias de laboratorio.

En consecuencia, al terminar cada práctica se procederá a limpiar
cuidadosamente el área de trabajo y descartar el material utilizado envases
dispuestos para tal fin. Todo material contaminado con material biológico
(láminas portaobjetos, puntas desechables) debe ser descartado en envases
adecuados que contengan hipoclorito de sodio al 0,5% u otro desinfectante
antes de ser lavado o eliminado.

Indicaciones:

1. Antes de cada práctica el profesor dará una breve introducción y una

demostración del trabajo a realizar.

2. Antes de realizar una actividad práctica, el alumno debe haber leído con
anterioridad el material correspondiente a la misma. No comience a trabajar
hasta que no haya entendido con claridad las instrucciones. Ante cualquier duda
consulte al profesor.

3. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y

microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus
Microscopio Óptico

mecanismos.

4. Los alumnos deberán asistir a la actividad práctica equipados con: la guía

práctica, fósforos, tirro y lápices de colores.

2
5. Los alumnos no podrán cambiarse de turno o grupo después de estructurada la
nómina de estudiantes para cada laboratorio e iniciado los trabajos prácticos.

6. Los alumnos deben asistir a la práctica en el horario que les corresponde

Microscopio Óptico

3
 El microscopio es un instrumento muy necesario para el microbiólogo, ya que
permite la observación de organismos que no pueden ser apreciados en detalle a
simple vista, es decir, los microorganismos. Existe una gran variedad de microscopios
que, según la fuente de iluminación utilizada, se agrupan en:

MICROSCOPIOS ÓPTICOS: La fuente de iluminación es la luz. Pueden ser:

- De campo claro: Permiten la observación de preparaciones en su color natural

ó contrastadas mediante tinciones, resaltadas sobre un fondo más brillante.
- De campo oscuro: Permiten la observación de formas celulares que se
destacan brillantes sobre un fondo oscuro. Este efecto se consigue utilizando
diafragmas especiales.
- De contraste de fases: Gracias a la utilización de diafragmas y objetivos
especiales, que consiguen aumentarlas diferencias en el índice de refracción de las
células y el medio que las rodea, permiten la observación de células vivas, ya que no
es necesario realizar ninguna tinción de las mismas.
- De interferencia: Permiten observar células vivas sin teñir, obteniéndose una
imagen en relieve de las mismas.
- De fluorescencia: La fuente de iluminación proporciona luz ultravioleta que
excita ciertas moléculas presentes en las células (bien de forma natural o añadidas a la
preparación) que emiten fluorescencia en el espectro visible.

MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS: La fuente de iluminación es un chorro de

electrones y las lentes son electroimanes. Pueden ser:

- De transmisión: Permiten la observación de muestras teñidas con sustancias

que son resistentes al paso de electrones y cortadas dando lugar a láminas finas,
Microscopio Óptico

denominadas cortes finos. Los electrones no son visibles directamente por lo que éstos
se envían a una pantalla que emite fluorescencia más o menos intensa según el
número de electrones que inciden en ella. Las estructuras celulares que se tiñan más
intensamente impedirán el paso de electrones y por lo tanto no permitirán la emisión de

4
fluorescencia, por lo que estas estructuras aparecerán oscuras en un fondo más
brillante. Se consiguen entre 10.000 y 100.000 aumentos.
- De barrido: Permiten la observación de células enteras, sin necesidad de cortes
finos, de modo que aparecen los relieves originales y las superficies externas. Alcanzan
entre 1.000 y 10.000 aumentos.

Durante las prácticas de micología y parasitología se empleará el microscopio

óptico de campo claro, cuyos componentes fundamentales (mecánicos, de iluminación
y ópticos) se muestran en la figura 1.

Figura 1: Partes de un microscopio óptico.

http://cienciasept.blogspot.com/2008/09/caza-de-tesoros-1.html

Parte Mecánica: Constituida por:

Microscopio Óptico

a. Tubo: Soporta la parte óptica, tiene una longitud variable, según el fabricante, en
su parte superior se encuentra el ocular y en la inferior el revólver con la serie de
objetivos.

5
 b. Columna o Brazo: Une el tubo con el pie, ésta es la parte por la que se debe
tomar el microscopio para transportarlo.
c. Revólver: Es el extremo inferior del tubo donde están colocados los objetivos
tienen movimientos de rotación alrededor de su eje.
d. Platina: Sobre ella son colocadas las preparaciones. Es plana y presenta un
orificio central que permite el paso de los rayos luminosos, posee pinzas que aseguran
la inmovilidad de las preparaciones y un carro provisto de dos tornillos para
desplazarlas en dirección lateral y antero-posterior, con lo cual se logra visualizar toda
la preparación.
e. Tornillo Macrométrico: Mueve la platina hacia arriba y hacia abajo.
f. Tornillo Micrométrico: Permite enfocar con precisión.
g. Pie: Sirve de base al microscopio y tiene el peso suficiente para dar estabilidad
al aparato.

Parte Óptica: Constituida por:

a. Fuente de luz: Puede ser un espejo móvil con dos caras: una plana que se
utiliza para la iluminación con luz solar y otra convexa para luz artificial. Su función es
dirigir los rayos luminosos hacia el eje óptico.
b. Condensador: Se encuentra colocado exactamente en el eje óptico del
microscopio, su finalidad es condensar la luz en un punto sobre la platina, donde va a
ser colocado la preparación. Está constituido por un diafragma-iris para controlar la
cantidad y el ángulo de los rayos luminosos y por un sistema de lentes. Posee un
aparato enfocador, que consiste en un piñón y una cremallera, que permiten bajar y
subir el condensador.
c. Objetivos: Son tubos que contienen en su interior un sistema de lentes de
diferentes aumentos, además genera una imagen real e invertida del objeto. Los
microscopios suelen tener 3 o 4 objetivos colocados en la parte inferior del tubo. Los
objetivos pueden ser:
Microscopio Óptico

- Secos: Son los que no necesitan interponer ninguna sustancia entre el

objetivo y la preparación. La preparación y la lente están separadas por aire
(lupa, 10x-40x).

6
 - Inmersión: En ellos se interpone un líquido entre la preparación y la lente
(aceite de inmersión, 100x).
d. Ocular: Es una lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del
objetivo. Su misión es captar y ampliar la imagen proporcionada por los objetivos. Un
microscopio puede tener uno o varios oculares: monocular, binocular o trilocular.
Actualmente se utilizan los binoculares porque son más cómodos y tienen mejor
calidad de imagen.

Manejo del Microscopio Óptico

1. Ajustar la iluminación del campo de tal forma que éste quede bien iluminado,
para lo cual se coloca el objetivo de menor aumento, se abre todo el diafragma-iris y se
sube totalmente el condensador.
2. Montar la preparación sobre la platina, fijarla de tal modo que el centro de la
preparación coincida con el orificio central de la platina por donde pasarán los rayos
luminosos.
3. Observar lateralmente y con el tornillo macrométrico, bajar el tubo hasta que el
objetivo de menor aumento quede muy cerca de la preparación.
4. Observar por el ocular, subir lentamente el tubo con el tornillo macrométrico
hasta que aparezca la preparación y aclarar la imagen con el tornillo micrométrico. Si
una vez obtenida la imagen, la iluminación es muy intensa, ésta puede disminuirse
cerrando el diafragma-iris del condensador hasta que su margen sea igual al tamaño
del lente posterior del objetivo. Con los objetivos secos, el condensador debe estar
abajo y el diafragma no muy abierto.
5. Al encontrar una parte del campo que merezca mayor análisis de detalles, se
cambiará para un aumento mayor de la siguiente manera:
a. Centrar en el campo la parte que desea estudiar, ya que al cambiar el
objetivo, el campo se reduce y se corre el riesgo de que el objeto quede fuera
del mismo.
Microscopio Óptico

b. Girar el revólver hasta que el objetivo de mayor aumento seleccionado quede

en la posición indicada.

7
 c. Enfocar la preparación con el micrométrico si no se ha movido el tubo y con
el macrométrico si este se movió, procediendo de la misma forma que para el
enfoque con menor aumento.
d. En la medida que se incrementan los aumentos, la cantidad de luz requerida
va siendo mayor por lo que debe corregirse el diafragma-iris y el
condensador.

Cuando se desea utilizar el objetivo de inmersión (100x), se procede de la

siguiente manera:

a. Abrir el diafragma-iris y subir al máximo el condensador.

b. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación.
c. Colocar el objetivo de inmersión en su posición efectiva, siguiendo el eje
óptico.
d. Bajar cuidadosamente el tubo por medio del tornilllo macrométrico, bajo
control visual lateral externo, hasta que el objetivo entre en contacto con el
aceite de inmersión, sin tocar la lámina.
e. Observar a través del ocular y enfocar con mucho cuidado con el tornillo
micrométrico hasta que sea posible ver bien la preparación.

Después de utilizar el microscopio óptico se deberá proceder de la siguiente

manera:

1. Apagar la lámpara
2. Quitar la lámina.
3. Bajar la platina.
4. Colocar el objetivo de menor aumento.
5. Mover el carro para que quede en la posición correcta.
6. Desconectar el cable que alimenta de corriente a la lámpara.
Microscopio Óptico

7. Limpiar los oculares y los objetivos.

8. Colocar el forro.

8
 PRACTICA NÚMERO 1: CULTIVOS FÚNGICOS

OBJETIVOS:
Al finalizar la práctica el estudiante estará en la capacidad de:

 Diferenciar los diferentes tipos de medios de cultivo.

 Diferenciar el crecimiento de levaduras y mohos en medios de cultivo en
placa y en tubo.
 Señalar los pasos para realizar un microcultivo.
 Realizar el aislamiento de hongos contaminantes del medio ambiente: aire
agua y tierra.

MEDIO DE CULTIVO

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos

es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. Al conjunto de estas soluciones líquidas o sólidas que contienen los
nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos se les conoce como
medio de cultivo.

El medio de cultivo es aquella solución que cuenta con los nutrientes necesarios
para recuperar, multiplicar, aislar e identificar los microorganismos (bajo condiciones
favorables de temperatura y pH, exento de todo microorganismo contaminante), así
como efectuar pruebas de susceptibilidad.

Los medios de cultivo pueden clasificarse:

 Según su consistencia:
a. Líquidos
Microscopio Óptico

b. Sólidos

9
 Los medios líquidos son infusiones preparadas bien sea colocando carne picada
en agua o disolviendo en esta un extracto de carne comercializado, no llevan ninguna
solución solidificante. Contienen proteínas, factores esenciales de crecimiento y
oligoelementos. A estos medios se les pueden añadir otros nutrientes como peptonas y
glucosa así como cloruro de sodio y un tampón de pH.

Los medios sólidos están constituidos por un medio líquido más una solución
gelificante, como el agar en polvo que se disuelve por ebullición, que los solidifica.
Pueden ser trasvasados en tubos o placas de Petri. Estas últimas son recipientes de
vidrio o plástico transparente con una tapa y ofrecen una gran superficie para la
siembra.

 Según su aporte nutritivo:

a. Básicos

b. Complejos

Los medios básicos contienen las sustancias mínimas para el crecimiento de

hongos metabólicamente no exigente. Pueden contener agar o no dependiendo si se
quieren sólidos o líquidos, respectivamente; peptonas, glucosa. Deben poseer un pH y
una osmolaridad adecuada para la multiplicación de los hongos. Estos medios también
pueden ser utilizados como base en la preparación de otros medios como los
enriquecidos, selectivos, entre otros.

Los medios enriquecidos pueden contener suero, sangre o factores esenciales

específicos como vitaminas o cofactores para el crecimiento de hongos exigentes en
requerimientos nutritivos y que no crecen bien en los medios básicos.

 Según su finalidad:
a. Medios de aislamiento: Utilizados para el aislamiento de levaduras por la
Microscopio Óptico

técnica de agotamiento, han de ser sólidos. Ejemplo: Agar Sabouraud, Agar

Lactrimel

10
 b. Medios selectivos: Son aquellos que permiten la recuperación de un
hongo en específico e inhiben el crecimiento de otro. Ejemplo, Sabouraud con
clicoheximida (inhibe hongos contaminantes como Aspergillus, etc).
c. Medios selectivos diferenciales: son aquellos medios utilizados para
recuperar o aislar un hongo en específico, por ello, para diferenciar las distintas
colonias, se les añade sustancias que confieren un color diferente a las colonias
según la distinta actividad metabólica. Para este propósito se utilizan azúcares
como el manitol, la lactosa, sorbitol y otros, junto a un indicador de pH como rojo
neutro, azul de bromotimol, etc. Ejemplo. CHROMagar Candida utilizado en la
identificación de Candida albicans, Candida krusei y Candida tropicalis.

Los medios de cultivo utilizados en micología contienen nutrientes suficientes

para asegurar el desarrollo de los hongos (carbono, nitrógeno, vitaminas,
oligoelementos, etc). El pH ligeramente ácido tiende a facilitar el crecimiento de los
hongos e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos.

A los medios de cultivo se les puede añadir antibióticos antibacterianos para

inhibir el crecimiento de las bacterias saprófitas que suelen contaminar las muestras.
Los más usados son el Cloranfenicol y la Gentamicina. Se añade también actidiona
(Cicloheximida) que inhibe el desarrollo de hongos saprófitos ambientales. Los medios
cuya composición contengan actidione no debe ser utilizados para el aislamiento de
Cryptococcus neoformans, ya que inhiben su crecimiento.

Entre los medios más empleados en la Micología se encuentran:

Medio Sabouraud Dextrosa (SAB):

Contiene un 2% de glucosa y es ligeramente ácido (pH=6.9), se considera el

medio estándar para recuperar y mantener una amplia variedad de hongos que pueden
aislarse en el laboratorio de micología clínica. Es el medio estándar para observar la
Microscopio Óptico

morfología típica de los hongos, pero no es el medio ideal de crecimiento o para

estudiar la esporulación. Permite el crecimiento de actinomicetos aerobios. Se utiliza
indistintamente en tubo o en placa.

11
 Medio Sabouraud con Cloranfenicol y Gentamicina:

Es el medio Sabouraud clásico con la incorporación de los antibióticos

Gentamicina y Cloranfenicol, que permiten el crecimiento de casi todos los hongos
filamentosos y levaduras al mismo tiempo que inhiben a una gran mayoría de bacterias.
Se utiliza en tubo o en placa.

Agar Lactrimel de Borelli:

Se emplea para favorecer la producción de pigmentos y la esporulación de la

mayoría de dermatofitos. Contiene harina de trigo, leche descremada en polvo, agar,
miel y antibiótico.

Los medios de cultivo pueden ser preparados en placa o en tubo. Los medios en
placa tienen la ventaja de ofrecer mayor superficie para el aislamiento pero, para
soportar la deshidratación durante el largo período de incubación a que van a ser
sometidos (un mes o más), has de contener una gruesa capa de medio (25 a 40 ml).
Son más peligrosos a la hora de su manipulación y fáciles de contaminar. Mientras que
los medios en tubo tienen una superficie de trabajo mucho más pequeña, pero ofrecen
máxima seguridad en su manipulación y buena resistencia a la deshidratación y a la
contaminación. (Figura 2 y 3)

Figura 2: Medio de cultivo en Figura 3: Medio de cultivo en tubo

placa de Petri.
Microscopio Óptico

A la hora de elegir un medio de cultivo adecuado se debe tener en cuenta el tipo

de muestra y los microorganismos fúngicos que requieren ser aislados. Si la muestra

12
procede de zonas presuntamente contaminadas, es fundamental incluir, junto a los
medios normales, medios que contengan sustancias inhibitorias de bacterias y hongos
saprofitos (cloranfenicol, gentamicina, cicloheximida).

Tanto la muestra como las placas y tubos que se van a sembrar deben
manipularse por medidas de seguridad y para evitar contaminaciones ambientales, los
cultivos con crecimiento micelial (temperatura ambiente) de Histoplasma capsulatum,
Paraccoccidioides brasiliensis y Coccidioides posadasii o C. immitis deben ser
manipulados en campana de flujo laminar. Han de rotularse adecuadamente, con el
número de la muestra y la fecha en que se realiza la siembra. Las placas se precintan
con cinta de parafilm, en la que se realizan un par de aberturas, y los tubos se dejan
con el tapón de rosca a medio cerrar (para mantener la aerobiosis).

Para realizar un cultivo fúngico, generalmente los especímenes se colocan sobre

la superficie del medio de cultivo y se conservan a temperatura ambiente (26 a 27 ºC);
en caso de micosis sistémicas, es mejor a 30-37 ºC. Las levaduras se siembran con
técnica de agotamiento en placa. Los pelos y escamas se disponen en fragmentos en
diferentes puntos de la superficie del medio. En líquidos, heces y pus se deben
sembrar aproximadamente 0,5 a 1,0 ml por tubo. Las levaduras se desarrollan en 24 a
48 horas, los contaminantes en dos a cuatro días y la mayoría de los hongos
patógenos requiere una a dos semanas o hasta un mes para su crecimiento.

La identificación de los hongos se basa en el examen macroscópico de la

colonia y en sus características microscópicas. Semejanzas macroscópicas como la
forma de la colonia, el color de la superficie, la textura y la producción de pigmentos
son muy útiles para la identificación (cuadro 1). En los medios de cultivo las levaduras
forman colonias húmedas, cremosas, opacas o pastosas, y los hongos filamentosos
producen colonias algodonosas, lanosas o pulverulentas.
Microscopio Óptico

En general, la morfología microscópica de los hongos es estable y presenta

pocas variaciones. La identificación definitiva se basa en la forma característica,
método de producción y ordenamiento de las esporas, siendo también importante

13
conocer el tamaño y la disposición de las hifas en el caso de los hongos filamentosos,
en los levaduriformes se observa la presencia de blastoconidias, seudohifas,
clamidosporas. (Cuadro 2)

CARACTERÍSTICAS
MACROSCÓPICAS HONGO FILAMENTOSO HONGO LEVADURIFORME
Colonia
COLOR Reverso
Pigmento del medio
TAMAÑO DE LA COLONIA
Diámetro
Aterciopelada,
ASPECTO algodonosa, Cremosa
pulverulenta
Cuadro 1. Descripción macroscópica de los hongos

CARACTERÍSTICAS
HONGO LEVADURIFORME
MICROSCÓPICAS HONGO FILAMENTOSO

SEPTADO
HIALINO ASEPTADO
SEPTADO
MICELIO DEMATIACEO ASEPTADO OBSERVACIÓN DE
BLASTOCONIDIAS,
GRUESO SEUDOHIFAS Y
CLAMIDOSPORAS

DELGADO
PRODUCCIÓN, TAMAÑOY
DISPOSICIÓN DE LAS DEPENDIENDO DE LA ESPECIE
CONIDIAS
Cuadro 2. Descripción microscópica de los hongos

La preparación del material para la observación microscópica puede realizarse

en fresco, con cinta de celofán adhesiva o mediante cultivo en lámina o microcultivo.

PREPARACIÓN EN FRESCO
Microscopio Óptico

Este procedimiento es el que se utiliza en la mayoría de los laboratorios, ya que

las muestras se preparan con facilidad y rapidez y además permite identificar muchas

14
de las especies de hongos más frecuentes. El mayor inconveniente de la observación
en fresco es que se puede alterar el ordenamiento característico de las esporas al
presionar con el cubreobjetos, por lo que este procedimiento no es válido en los casos
en que es necesario conocer la disposición de las esporas.

Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuación:

1. Seleccionar una colonia aislada.

2. Calentar el asa en aguja (al rojo vivo) para esterilizar, dejar enfriar.
3. Extraer un fragmento de la colonia que contenga además un poco de agar en
la parte inferior.
4. Depositar el fragmento extraído sobre un portaobjetos en el cual, previamente,
se ha depositado una gota de azul de lactofenol.
5. Cubrir con un portaobjeto y presionar suavemente para dispersar la colonia y
el agar; de esta forma, la muestra está disponible para su observación al
microscopio.

PREPARACIÓN CON CINTA DE CELOFÁN ADHESIVA

Es un método rápido para observar microscópicamente los mohos sin alterar el

arreglo de sus conidias.

Una de las desventajas es que si la cinta transparente no se presiona con

suficiente firmeza sobre la superficie de la colonia, la muestra no es adecuada, ya que
al no quedar bien adherida la cinta, las esporas o las hifas no se pueden identificar.

En los casos en que mediante este método no se observen esporas deberá

realizarse la preparación en fresco.

El procedimiento se lleva a cabo como sigue:

Microscopio Óptico

1. Colocar una gota de azul de lactofenol sobre una lámina portaobjeto.

2. Cortar un pedazo de cinta adhesiva transparente (2 a 3 cm) y fijarlo a un asa
en aguja.

15
 3. Colocar la cinta sobre la superficie de la colonia de moho, haciendo presión.
4. Colocar la cinta sobre la lámina, cubrir con una laminilla.
5. Observar al microscopio.

MÉTODO DE MICROCULTIVO (Método de Riddel):

También llamado cultivo en lámina. Este cultivo se realiza una vez recuperado el
hongo del espécimen clínico. Es útil para la identificación de especies de hongos
filamentosos (exclusivamente).

La técnica de microcultivo se realiza de la siguiente manera:

1. Introducir en una placa de Petri un papel absorbente, una varilla de vidrio en

forma de U y una lámina portaobjeto. Esterilizar con calor seco.
2. Tomar una placa de Petri con agar Sabouraud o Lactrimel y bajo condiciones
de esterilidad cortar con un bisturí cuadros de 1 cm. de lado y colocar uno de
ellos sobre la lámina portaobjeto previamente esterilizada en el paso 1.
3. Inocular en el centro de los cuatro lados del agar con el hongo en estudio y
colocar encima una laminilla o lámina cubreobjeto (Figura 4).
4. Humedecer el papel absorbente con aproximadamente 5 ml de agua destilada
estéril, para evitar desecación.
5. Incubar a temperatura ambiente. La colonia crecerá por debajo de la
superficie del cubreobjeto. Se examina el montaje periódicamente a simple
vista para determinar si la colonia ha crecido o se haya contaminado, se deja
por un lapso mínimo de 15 días.
6. Cuando es evidente el crecimiento, se retira cuidadosamente el cubreobjeto
con pinzas estériles y se coloca en un portaobjeto que contiene una gota de
azul de lactofenol. Si se desea un montaje permanente, se limpia la superficie
del portaobjeto e inmediatamente adyacente al borde del cubreobjeto se
Microscopio Óptico

aplica esmalte para uñas color claro.

7. Observar las dos láminas preparadas al microscopio óptico.

16
 Inóculo del hongo a los
cuatro lados del cubo de
Lámina
agar
cubreobjeto
Lámina Portaobjeto
Cubo de agar
Placa de Petri
Varilla de vidrio en
forma de “U”

Figura 4: Placa de microcultivo. Tomado de

Arenas. Micología Médica Ilustrada.
McGrawHill. México. 2003

HONGOS CONTAMINANTES

Los hongos filamentosos y levaduras son en su mayoría saprófitos, hallándose

libres en la naturaleza, especialmente en la materia orgánica en descomposición. Las
condiciones necesarias para que un hongo crezca en una superficie son: existencia de
esporas, base nutriente, humedad y temperatura entre 4 y 38 oC.

El crecimiento de hongos en sistemas de aire acondicionado y edificios puede

producir en sus habitantes determinadas patologías entre las que cabe destacar asma
y alveolitis alérgicas. La contaminación ambiental por hongos en el medio ambiente y
en interior de edificios, es debida básicamente a hongos filamentosos y levaduras.

Procedimiento para el aislamiento de hongos contaminantes

Aire:

Materiales: Placa de Petri con medio de cultivo Sabouraud o Lactrimel.

Las placas serán expuestas en diferentes ambientes (cerrados y externos),

mediante 2 procedimientos:
Microscopio Óptico

17
 a. Captura por sedimentación:
1. Rotular una placa de Petri con el número del equipo de trabajo, profesor,
turno, fecha y lugar.
2. Destapar la placa y dejarla abierta por 10 minutos.
3. Cerrar la placa e incubarla a temperatura ambiente hasta la próxima
actividad práctica.

b. Captura por choque sobre la superficie de agar:

1. Rotular una placa de Petri con el número del equipo de trabajo, profesor,
turno, fecha y lugar.
2. Destapar la placa y agitarla 10 veces.
3. Cerrar la placa e incubarla a temperatura ambiente hasta la próxima
actividad práctica.

Agua:

Materiales: Un tubo con tapa de baquelita, estéril; 1 placa de Petri con Agar
Sabouraud o Lactrimel, pipeta Pasteur, hisopo estéril o asa de siembra.

1. Recolectar aproximadamente 10 ml de agua (poceta, filtros, entre otros.

Según le indique el profesor), con la ayuda de la pipeta Pasteur y
colocarlos dentro del tubo con tapa de baquelita estéril.
2. Rotular el tubo con el número del equipo de trabajo, profesor, turno, fecha y
lugar.
3. Sembrar la muestra en una placa de Petri con medio Sabouraud o
Lactrimel según le indique el profesor.
4. Rotular la placa con el número del equipo de trabajo, profesor, turno, fecha
y lugar. Sellar la placa con papel parafilm o tirro alrededor de la misma.
5. Incubar la placa a temperatura ambiente hasta la próxima actividad
Microscopio Óptico

práctica.

18
 Tierra:

Materiales: 1 placa de Petri vacía y estéril, 1 placa de Petri con medio de cultivo
Sabouraud o Lactrimel, 1 baja lengua estéril, 1 tubo con tapa de baquelita que
contenga 1 ml de solución salina fisiológica (estéril).

1. Recolectar la tierra con baja lengua estéril y colocarla en la placa de Petri

estéril, vacía.
2. Llevar al laboratorio. Agregar una porción de tierra con la ayuda de un baja
lengua estéril dentro del tubo que contiene 1 ml de solución salina
fisiológica (SSF), mezclar para homogeneizar.
3. Agregar esta mezcla (Tierra+SSF) en la superficie de la placa de Petri con
agar Sabouraud o Lactrimel.
4. Rotular la placa con el número del equipo de trabajo, profesor, turno, fecha
y lugar. Sellar la placa con papel parafilm o tirro alrededor de la misma.
5. Incubar la placa a temperatura ambiente hasta la próxima actividad
práctica.

Luego de la incubación por una semana a temperatura ambiente, realizar el

estudio macroscópico de las colonias aisladas (a simple vista), anotando: color,
presencia de pigmento, textura, bordes de la colonia. Realizar también el estudio
microscópico a través del reconocimiento de las especies por medio de la
morfología de las esporas.

Microscopio Óptico

19
ACTIVIDAD PRÁCTICA:

1. Describa las características macroscópicas de un hongo filamentoso y de un

hongo levaduriforme en medio de cultivo preparado en tubo y en placa de Petri,
siguiendo el siguiente esquema:

CARACTERÍSTICAS
MACROSCÓPICAS HONGO FILAMENTOSO HONGO LEVADURIFORME

COLOR

TAMAÑO DE LA COLONIA

ASPECTO

2. Describa las características microscópicas de un crecimiento micelial y uno

levaduriforme en láminas proporcionadas por el profesor, siguiendo esquema.
Dibuje las estructuras observadas.

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS
HONGO
HONGO
FILAMENTOSO LEVADURIFORME

MICELIO

PRODUCCIÓN, TAMAÑOY DISPOSICIÓN DE LAS

CONIDIAS

3. Realizar el aislamiento de hongos contaminantes del medio ambiente: aire, agua y

tierra.
Microscopio Óptico

20
 PRÁCTICA NRO 2: INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS.

OBJETIVOS:

Al finalizar la práctica el estudiante estará en la capacidad de:

 Señalar la importancia de las pruebas inmunológicas en el diagnóstico de

las micosis que afectan al hombre en nuestro medio.
 Interpretar las pruebas de intradermorreacción (IDR) en el diagnóstico de las
micosis.
 Describir e interpretar la técnica de Inmunodifusión Doble (IDD) en el
diagnóstico de las micosis.
 Correlacionar los resultados obtenidos de la impresión clínica, el diagnóstico
epidemiológico, las pruebas intradérmicas y la serología para realizar un
diagnóstico adecuado de las micosis sistémicas.

INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS

El diagnóstico de las micosis se realiza mediante el estudio micológico, el cual

consiste en la realización del examen directo de muestras clínicas y el aislamiento e
identificación de los agentes etiológicos en los medios de cultivos. Sin embargo, en
ausencia de una muestra clínica representativa, como es el caso de algunos pacientes
con micosis sistémicas, es de gran ayuda los datos epidemiológicos y la aplicación de
otras técnicas diagnósticas, tales como estudios inmunológicos, los mismos evalúan
tanto la respuesta celular y humoral del paciente.

INMUNIDAD CELULAR

Se estudia mediante la reacción de la hipersensibilidad retarda de tipo IV; estas

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son reacciones inflamatorias las cuales se caracterizan por una infiltración

principalmente con fagocitos. Estas reacciones se estudian haciendo uso de las
pruebas intradérmicas (IDR) utilizando antígenos obtenidos a partir de diferentes

21
formas (micelial o levaduriforme) de los hongos causantes de las micosis. El antígeno
se inyecta en volumen de 0,1 c.c., por vía intradérmica, en la cara anterior del
antebrazo (Figura 5) y la reacción se observa a las 48 horas. Se considera positiva si
se obtiene una induración igual ó mayor de 5 mm. de diámetro. (Figura 6)

Figura 5: Colocación intradérmica de antígenos

fúngicos.

Figura 6: Lectura de prueba intradérmica.

Técnica de Sokal
Microscopio Óptico

La IDR se utiliza básicamente en estudios epidemiológicos, para investigar la

existencia de infección subclínica en una población y rara vez como orientación
diagnóstica, ya que una reacción positiva de 5 mm. de diámetro o más, significa que la

22
respuesta inmunitaria del paciente está intacta y sólo señala exposición al agente. Por
el contrario, una reacción negativa no necesariamente excluye infección y se puede
observar en pacientes con casos de micosis diseminadas, lo que indica un estado de
anergia de la respuesta inmunitaria celular. La IDR se considera una prueba auxiliar en
el diagnóstico, pronóstico y valoración del estado inmunitario de los pacientes con
micosis sistémicas.

Las pruebas intradérmicas más utilizadas en nuestro medio son las siguientes:

 Candidina:
Antígeno obtenido a partir de la levadura Candida albicans. Resulta positiva en
quienes han tenido contacto previo con el hongo; no indica enfermedad; en adultos la
positividad es de 60%. En casos diseminados puede ser negativa.

 Esporotriquina:
Antígeno obtenido a partir de la forma levaduriforme de Sporothrix schenckii. En
presencia de lesiones clínicas la esporotriquina es diagnóstica en un alto porcentaje de
los casos. Las pruebas positivas perduran por años en sujetos que viven en zonas
endémicas; un resultado positivo en personas sin antecedentes de enfermedad sugiere
contacto previo con el hongo, probablemente por vía pulmonar, por lo que es útil en
estudios epidemiológicos. Resulta negativa en ausencia de infección o en pacientes
anérgicos.

 Histoplasmina:
Glicoproteína que se prepara a partir de la forma micelial de Histoplasma
capsulatum. Una respuesta positiva indica infección presente o pasada. Es positiva en
50 a 80% en personas que habitan áreas endémicas. Una respuesta negativa a la
histoplasmina puede traducir una ausencia de infección o un estado anérgico del
Microscopio Óptico

paciente, ya sea por una histoplasmosis diseminada o por la presencia de alguna

enfermedad intercurrente.

23
  Paracoccidioidina:
Se prepara a partir de la forma micelial y levaduriforme de Paracoccidioides
brasiliensis. Se utiliza en estudios epidemiológicos y para evaluar la respuesta del
organismo al tratamiento sobre todo en aquellos casos en los cuales la respuesta a la
paracoccidioidina antes del tratamiento fue negativa.

 Coccidioidina:
Existen dos tipos de antígenos fabricados a partir de Coccidioides posadasii o C.
immitis utilizados en el estudio de hipersensibilidad retardada. La esferulina, fabricada a
partir de las esférulas y la coccidioidina a partir de la forma filamentosa o micelial del
hongo. Es positiva 2 a 3 semanas después del inicio de los síntomas y puede persistir
durante años. En pacientes sintomáticos la positividad a la IDR se considera de buen
pronostico; mientras que su negatividad se traduce en una inadecuada respuesta
celular, anergia y por lo tanto, mal pronóstico.

INMUNIDAD HUMORAL

La inmunidad humoral en las micosis se estudia mediante técnicas ideadas con

el fin de revelar “in vitro” las interacciones específicas que tienen lugar cuando se
mezclan antígenos y anticuerpos homólogos en proporciones adecuadas.

Las técnicas de laboratorio usadas en la sección de micología para el estudio de

la inmunidad humoral del paciente son: pruebas de inmunoprecipitación tales como
inmunodifusión doble (IDD), inmunoelectroforesis y contrainmunoelectroforesis;
pruebas de aglutinación de partículas de látex, fijación de complemento (FC) e
inmunoanálisis enzimático (IAE).

La técnica IDD se fundamenta en los principios de doble difusión descritos por

Microscopio Óptico

Oudin y Ouchterlony. Consiste en la determinación de anticuerpos específicos contra

extractos antigénicos de los hongos causantes de micosis, los cuales migran hasta un
punto, en el que interaccionan originando bandas de precipitación, que son

24
evidenciadas mediante tinción de proteínas. La especificidad de esta banda se
corrobora comparando la banda producida por el suero del paciente con la originada
por el suero de referencia; si ambas se fusionan formando un arco continuo, se
produce la llamada línea de identidad, que se traduce en un resultado positivo,
poniendo en evidencia que el paciente posee anticuerpos específicos contra el
antígeno en estudio. Si la banda del suero del paciente se continúa con la del suero
control pero sin fusionarse por completo, se denomina banda de identidad parcial,
originada porque los anticuerpos del suero de paciente reaccionan en una forma
incompleta con los antígenos fúngicos y puede deberse a reacciones cruzadas con
fracciones antigénicas comunes a varios hongos. La banda de identidad parcial no se
interpreta como positiva, pero debe considerarse realizar otras pruebas
complementarias como la fijación de complemento o inmunoanálisis enzimático para
evaluar la especificidad de los anticuerpos. Por otra parte, si no se produce banda de
precipitación en el suero del paciente o si esta se entrecruza con la del suero de
referencia (banda de no identidad), constituye un resultado negativo (Figura 7).

Líneas de identidad Líneas de identidad Líneas de no

parcial identidad

Figura 7. Reacciones de Identidad, identidad parcial y no identidad

usando suero control. Tomado de:
http://www.monografias.com/trabajos911/interaccion-antigeno-
anticuerpo/interaccion-antigeno-anticuerpo.shtml.

Procedimiento de la IDD:
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1.- Enumerar láminas portaobjetos limpias y secas (25x75mm) con lápiz de

diamante.

25
2.-Adicionar a cada lámina 3 ml de agarosa fundida al 1% (preparada con agua
destilada) y dejar solidificar a temperatura ambiente.

3.- Labrar en el gel el diagrama para IDD (Figura 8), orificio central de un (1) mm
de diámetro para el antígeno y seis orificios periféricos de cuatro (4) mm de
diámetro para los sueros a ensayar.

1 1 1
6 2 6 2 6 2

5 3 5 3 5 3
4 4 4

Figura 8. Diagrama para Inmunodifusión Doble con sueros de

referencia en el estudio de micosis subcutáneas y sistémicas. 1,4:
Suero control positivo para el antígeno a evaluar. 2,3,5 y 6: Suero de
paciente. O antígeno a evaluar.

4.-.Agregar 40 µl de los sueros controles y sueros de los pacientes a evaluar,

seguidamente agregar 10 µl de antígeno, en los pozos correspondientes.

5.- Colocar las láminas en cámara húmeda (placa de Petri con papel de filtro
humedecido con agua destilada), por 24 horas a temperatura ambiente y luego
por 24 horas a 4 ºC. Luego de transcurrido este tiempo realizar la lectura
preliminar.

6.- Sumergir las láminas en solución de Citrato Trisódico al 5% por 90 minutos.

7.- Lavar las láminas con agua de chorro y sumergirlas en placas de Petri
conteniendo Solución Salina Fisiológica 0,85% (volumen suficiente que cubra
por completo la lámina) durante 48 horas (cambiando la solución tres veces al
Microscopio Óptico

día).

26
 8.- Lavar las láminas con agua destilada y cubrirlas con papel de filtro
humedecido con agua destilada. Colocarlas en estufa a 50-60 ºC hasta obtener
una deshidratación total.

9.- Colorear las láminas con solución colorante de proteínas (Amidoschwarz)

durante 5 a 10 minutos y decolorarlas con Acido Acético Glacial al 4% hasta
obtener visualización de las bandas.

Lectura e interpretación de resultados:

Un resultado es considerado positivo al observar bandas de identidad. Las

muestras que resulten con bandas de identidad parcial deben ser verificadas mediante
otras pruebas complementarias como Inmunoanálisis enzimático o la técnica de fijación
de complemento. Si no se produce banda de precipitación en el suero del paciente o si
esta se entrecruza con la del suero de referencia (banda de no identidad), se interpreta
como negativo.

Al ser positivo el resultado es importante que el suero del paciente sea sometido
a la prueba semicuantitativa de la IDD para determinar el título de anticuerpos
presentes en ese suero.

En la IDD semicuantitativa se emplean los mismos antígenos que para la IDD y

la técnica es similar variando en lo siguiente: Se coloca en el pozo N° 1 el suero control
o de referencia, en el Nº 2 el suero del paciente sin diluir y en los Nº 3, 4, 5 y 6 el suero
diluido con solución salina a 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16, etc. En el hoyo central se coloca el
antígeno específico de la micosis a evaluar. El resto del procedimiento se continúa
igual al de la IDD (Figura 9). El título del suero del paciente va a ser la última dilución
donde se observe la línea de identidad.

C C C
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1/16 S 1/16 S 1/16 S

1/8 1/2 1/8 1/2 1/8 1/2

1/4 1/4 1/4

Figura 9: Diagrama para IDD semicuantitativa. Evaluación de títulos de anticuerpos. C:

Suero control. S: Suero problema sin diluir. 1/2…1/16 diluciones del suero. O: Antígeno

27
CORRELACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LA IDR E IDD EN EL
INMUNODIAGNÓSTICO MICOLÓGICO.
ESTUDIO IDR IDD RESULTADO
MICOLÓGICO
Directo y Positivo: Positivo:
cultivo: Estuvo en contacto con el Presenta anticuerpos Presenta la enfermedad
POSITIVO hongo precipitantes frente a
los antígenos fúngicos
Negativo: Positivo:
Directo y No estuvo en contacto con Presenta anticuerpos
cultivo: el hongo o se encuentra frente a los antígenos Presenta la enfermedad
Positivo en estado anérgico fúngicos
(inmunosuprimido).
Directo y Positivo: Negativo: Estuvo expuesto al
cultivo: Estuvo en contacto con el No presenta hongo. Presenta la
Positivo hogo anticuerpos frente a los micosis puesto que se
antígenos fúngicos hizo la observación
microscópica del hongo
y aislamiento del mismo
en el medio de cultivo
Directo y Positivo: Negativo: Estuvo expuesto al
cultivo: Estuvo en contacto con el No presenta hongo más no presenta
Negativo hogo anticuerpos frente a los la enfermedad.
antígenos fúngicos
Directo y Negativo: Negativo: El paciente puede:
cultivo: No estuvo en contacto con No presenta 1. No presentar
Negativo el hongo o se encuentra anticuerpos frente a los enfermedad micótica.
en estado anérgico antígenos fúngicos 2. Estar
(inmunosuprimido). inmunosuprimido y
presentar enfermedad
por otro agente.
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ACTIVIDAD PRÁCTICA:

1. Realización de la técnica de Inmunodifusión doble. (Demostrativa)

2. Discusión e interpretación de las pruebas inmunológicas.

28
 PRÁCTICA NÚMERO 3: DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES

OBJETIVOS:
Al finalizar la práctica el estudiante estará en la capacidad de:

 Establecer la importancia médica del diagnóstico micológico de las micosis

superficiales.
 Realizar el diagnóstico micológico de las micosis superficiales
 Describir las características macro y microscópicas de las especies de
dermatofitos.
 Describir las características macro y microscópicas de colonias de Candida
spp.

Ante la sospecha clínica de una micosis superficial, el clínico tiene que confirmar
la infección recurriendo a una serie de procedimientos de laboratorio que incluyen la
detección del agente causal en el tejido, por examen directo, y el aislamiento del
patógeno en el cultivo. Al conocer el agente etiológico se confirma la sospecha clínica
de la micosis, permitiendo así la elección del tratamiento específico y la valoración del
mismo.

DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO DE LAS TIÑAS:

RECOMENDACIONES PARA LA TOMA DE MUESTRA:

 La muestra debe ser tomada antes de instituido el tratamiento o cuando éste

se ha suspendido previamente (1-2 semanas, para piel o pelo; varios meses,
para las uñas).
Microscopio Óptico

 Explicarle al paciente que no se coloque el día de la toma de muestra cremas

ni talco porque pueden producir artefactos que obstaculicen la visualización
del hongo y dar resultados falsos negativos o positivos.

29
  Antes de realizar la toma de muestras de una micosis superficial es
aconsejable examinar las lesiones de la piel y cuero cabelludo, en una
habitación completamente oscura bajo la luz de Wood (luz ultravioleta de 365
nm. de longitud de onda, que pasa a través de un filtro de cristal que contiene
óxido de níquel). La piel normal muestra un color azul. Los pelos afectados
con tinea capitis de tipo ectothrix por Microsporum canis o M. gypseum
emiten fluorescencia de color verde brillante. Las infecciones bacterianas
como el eritrasma, emite fluorescencia rojo y las escamas parasitadas por
Malassezia sp fluorescentes de color amarillo oro.

 Antes de realizar la recolección de la muestra, la piel, pelos o uñas afectados

deben limpiarse con una gasa humedecida en alcohol o en agua destilada
estéril, con el fin de eliminar el polvo y los contaminantes ambientales
depositados en la piel. No se recomienda las torundas de algodón, ya que
sus fibras pueden interferir con el examen directo.

 En caso de toma de muestra en las uñas, se debe remover con anterioridad

el esmalte de uñas, si están pintadas y no deben ser cortadas.

 La obtención de la muestra, así como su transporte y procesamiento deberán

realizarse con estricta técnica estéril.

Una vez cumplidas estas indicaciones se procede a tomar la muestra.

TOMA DE MUESTRA PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA DERMATOFITOSIS:

Tinea capitis y barbae (tiña del cuero cabelludo o de la barba):

Realizar asepsia con alcohol. La muestra debe incluir tanto cabellos alterados
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como escamas del cuero cabelludo o de piel (Figura 10). Para la obtención de los
cabellos (cuero cabelludo) y vellos (de la barba), deben preferirse aquellos que estén
opacos, quebradizos y fracturados dando aspecto de puntos negros; igualmente

30
aquellos que se extraigan fácilmente con una pinza de depilación. Las escamas se
obtienen por raspado con bisturí estéril.

Las lesiones pueden ser examinadas con lámpara de Wood (luz ultravioleta, 365
nm), en busca de zonas fluorescentes que indicarán la presencia de cabellos y pelos
infectados por dermatofitos, lo cual permite recolectar muestras apropiadas con mayor
seguridad.

Figura 10. Lesiones de Tinea capitis. Foto cortesía Profa. Leyla Humbría

Remisión: Los cabellos o vellos pueden ser enviados al laboratorio en sobres,

tubos o cajas de Petri plásticas estériles, identificándolas adecuadamente con el
nombre y edad del paciente, así como del sitio donde fue tomada.

Tinea facie, corporis, cruris, pedis y manuum (tiña del cuerpo, crural,
del pie y de la mano):

MUESTRA: Escamas.
Microscopio Óptico

Las escamas son recolectadas con bisturí romo, raspando los bordes de la
lesión, donde está el crecimiento activo del hongo (Figura 11 y 12). Se recogen

31
directamente sobre la lámina portaobjeto. En caso de lesiones eritematosas, húmedas
o con exudados, la muestra debe tomarse también con bisturí y, si hay vesículas, éstas
pueden romperse y el material recolectado se transfiere a una lámina portaobjeto.

Figura 11: Borde (flecha) lesión de Tinea facie. Figura 12: Borde (flecha) lesión de Tinea
Foto cortesía Profa. Leyla Humbría. corporis. Foto cortesía Profa. Leyla Humbría.

Remisión: Si el examen directo y cultivo no va a ser realizado por la persona

que toma la muestra o que la misma no vaya a ser procesada de inmediato en el
laboratorio, las escamas pueden ser remitidas en un sobre nuevo, entre dos láminas
portaobjetos unidas con cinta adhesiva o en una caja de Petri plástica estéril,
acompañada de la identificación del paciente y de las descripción de la lesión y del
área donde fue tomada. Se debe enviar material suficiente para ser directo y cultivo.

Tinea ungium (tiña de la uña):

MUESTRA: Dependerá del tipo de lesión (figura 13):

 Lecho ungueal (Onicomicosis subungueal distal o proximal):

Microscopio Óptico

Previa limpieza con alcohol, la muestra debe ser tomada con bisturí
haciendo raspado profundo del lecho ungueal o de la lámina afectada partiendo del

32
extremo distal al proximal y recolectando el detritus el detrito subungueal de la parte
incolora, pigmentada, distrófica y más débil de la uña; si las uñas son distróficas
pueden cortarse con tijera o cortauñas estériles.

 En la uña misma (onicomicosis superficial blanca, endonixis):

Se raspan las áreas alteradas o se cortan pequeños fragmentos de las uñas

afectadas.

 Reborde ungueal (onicomicosis proximal subungueal o paroniquia):

La muestra debe tomarse por presión sobre el reborde ungueal, o por debajo de
este, tratando de recuperar el material caseoso.

A) Onicomicosis distal y lateral subungueal

B) Onicomicosis blanca superficial
C) Onicomicosis blanca proximal subungueal
D) Onicomicosis distrófica total

Figura 13: Formas clínicas de onicomicosis.

www.uv.es/derma/CLindex/CLdermatofit/onicomic.jpe

Remisión: El exudado proveniente del reborde ungueal debe ser tomado y

procesado de inmediato en el laboratorio. El detrito, los raspados ungueales y los
fragmentos de la uñas pueden enviarse en sobres o cas de Petri plásticas estériles,
acompañados de los datos del paciente.

Existe una técnica complementaria para la recolección de las escamas en las

Microscopio Óptico

tiñas o dermatofitosis. El método del cuadrado de moqueta de Mariat y Adan-Campos.

El cual consiste en frotar 5 veces con un cuadrado de alfombra de lana estéril la
totalidad de la superficie a examinar (piel glabra o cuero cabelludo); posteriormente, la

33
moqueta se guarda en un sobre de papel o en una caja de Petri y se envía al
laboratorio de Micología para su procesamiento.

Este procedimiento posee varias ventajas:

1. No es cruento para el paciente.
2. Es útil para realizar tomas de tinea capitis con fluorescencia negativa.
3. Permite estudiar a portadores asintomáticos de dermatofitos o pacientes ya
tratados, cuando la lesión clínica ha desaparecido.
4. Facilita los estudios epidemiológicos de las tineas o tiña.
5. Permite estudiar animales (gatos, perros, etc.) que pueden ser reservorio de
dermatofitos. Sin embargo, tiene el inconveniente de que no se puede realizar la
observación directa, solamente el cultivo.

EXAMEN DIRECTO
Una vez recolectadas las muestras de piel, pelos o uñas se procede a realizar el
examen directo. Este se realiza colocando la muestra entre lámina y laminilla con una o
dos gotas de KOH, solución aclarante de la queratina (10-40% dependiendo de la
muestra), se flamea para acelerar el aclaramiento (sin dejar hervir) y se observa al
microscopio con objetivos de 10x y 40x. Si el material es muy denso, se puede
disgregar presionando la laminilla con el borrador de un lápiz o con el dedo. Este
procedimiento también ayuda a separar las células y evitar artefactos como el “mosaico
del hongo”. Para favorecer la visualización, se puede agregar unas gotas de azul de
lactofenol o tinta Parker.

Tinea capitis (tiña de la cabeza):

Pueden presentar cinco tipos de parasitación, dos endothrix y tres ectoendothrix

(figura 14).
Microscopio Óptico

34
  Del tipo endothrix se distinguen:
1. Parasitación tricofítica (Trichophyton tonsurans), con una gran
cantidad de esporas agrupadas densamente en el interior del pelo.

2. Parasitación fávica (T. schoenleinii, poco frecuente en nuestro medio),

con escasa esporas y filamentos, así como con vesículas de aire en el interior
del pelo.

 Del tipo ectoendothrix se distinguen:

1. Parasitación microspórica (Microsporum canis), con esporas
pequeñas que forman un manguito alrededor del pelo.

2. Parasitación microide (Trichophyton mentagrophytes), con esporas

con disposición laxa alrededor del pelo.

3. Parasitación megasporada (T. verrucosum, poco frecuente en

Venezuela): con grandes esporas alrededor del pelo.

Figura 14: Tipos de parasitación del pelo. (Modificado de Segratain G.

Mariat F, Drouhet E. Diag Lab Muc Méd 1979).
Microscopio Óptico

Tinea corporis, cruris, pedís, manuum, barbae y ungium: Se observan hifas

hialinas (Figura 15), de 3 a 15 um de diámetro, septadas y ramificadas, con o sin
artroconidias.

35
Figura 15: Hifa hialina (Hh) con septos (S), sin
artroconidias, obtenida del estudio directo de una Tinea Dibujo
pedis, (KOH 10%), 1000 x. Tomado de Atlas de
Micología. Auristela Sánchez de Mirt.

CULTIVO
Para la identificación definitiva del agente causal es fundamental realizar cultivo
en tubos de ensayo o placa y, cultivo en lámina. El cultivo de la muestra se realiza
sobre agar Lactrimel, Sabouraud o DTM (medio para probar dermatofitos), el cual es un
medio con antibacteriano y rojo fenol como indicador; de esta manera se inhiben
bacterias y si crece un dermatofito hay viraje de color amarillo a rojo. Se incuban a
temperatura ambiente durante 7 a 15 días, después de lo cual crecen colonias
características para cada género y especie (cuadro 3, 4 y 5).

Microscopio Óptico

36
Actividad: Dibuje el crecimiento filamentoso de las principales especies de
dermatofitos (Anverso y reverso de la colonia).

Microsporum Microsporum Trichophyton Trichophyton Epidermophyton

canis gypseum mentagrophytes rubrum floccosum

Microscopio Óptico

37
 Género: Microsporum
Técnica: Microcultivo
Especie M. canis M. gypseum

Anverso de la colonia: Anverso de la colonia:

Características Color blanco amarillento, de
macroscópicas aspecto lanoso o algodonoso.
Reverso:
Pigmento amarillo anaranjado
característico.
Se observa un micelio septado,
con macro y microconidias. Las
macroconidias son en forma de
huso, con extremos afilados,
Características pared gruesa, con abundantes
microscópicas tabiques (6 o más). Permiten la
identificación de especie. Las
microconidias son alargadas en
forma de maza, sésiles, en
número variable, sin valor
diagnóstico.
Color canela, con superficie
pulverulenta, granulosa plana.
Reverso:
Pigmento de color café.
Se observa un micelio septado, con
macro y microconidias. Las
macroconidias son fusiformes con
puntas romas, paredes gruesas y
con menos de 6 tabiques. Permiten
la identificación de especie.

Cuadro 3: Cuadro comparativo Género Microsporum

Microscopio Óptico

Dibujo

38
 Género: Trichophyton
Técnica: Microcultivo
Especie T.rubrum T. T. interdigitale T. tonsurans
mentagrophytes

Características Anverso de la Anverso de la Anverso de la Anverso de la

macroscópicas colonia: colonia: colonia: colonia:
Color blanco, de Color blanco Puede presentar
aspecto Color blanco crema, de 4 variedades
algodonoso, crema, de aspecto aspecto velloso morfológicas:
pulverulento, con crateriforme,
granular, o algodonoso.
formación de cerebriforme,
pliegues en su pulverulenta con sulfúrea y
centro, algunas los márgenes acuminada, de
colonias se radiados. aspecto
observan algodonoso o
agrietadas, Reverso: pulverulento.
mientras que Reverso:
algunas cepas son Pigmento color Pigmento
menos vellosas. rojo (no siempre) o amarillo azufre,
Reverso: café. pardo-rojizo o
Pigmento rojo vino negruzco que
característico. puede ser
difusible.
Características Presenta un Presenta Presenta Se observa un
microscópicas micelio muy fino, abundantes abundantes micelio
septado; las microconidios microconidios ramificado en
microconidias son esféricos y nacen ángulo recto,
subesféricos o
piriformes en forma en acúmulos, así septado, y
de lágrima, sésiles como a lo largo de piriformes. Las microconidias
o pedunculadas y las hifas; las macroconidias grandes (2-5 x 3-
adoptan una macroconidias son son 7 um), piriformes
disposición cilíndricas y de multiseptadas y o en forma de
irregular en ambos paredes delgadas ocasionalmente maza, sésiles o
lados del filamento. y frecuentemente presentes. Se penducludas.
Las macroconidias se ven hifas en Las
observan
son muy escasas o espiral. macroconidias
ausentes, escasas hifas son escasas o
digitiformes, en en espiral. están ausentes.
forma de salchicha, Clamidosporas
de pared celular presentes en
delgada y lisa. cultivos viejos

Cuadro 4: Cuadro comparativo especies del género Trichophyton

Microscopio Óptico

39
 Dibujo

Microscopio Óptico

40
 Género: Epidermophyton
Especie: E. floccosum
Características Anverso de la colonia:
macroscópicas Colonias blancas, pulverulentas o algodonosas, formando
al principio una colonia plana que con el tiempo suele
presentar pliegues en su parte central.
Reverso:
Pigmento de color amarillo-verdoso, en ocasiones un
poco amarillo-parduzco.
Características Posee numerosas macroconidias, de paredes lisas,
microscópicas gruesas, con el extremo distal redondeado, fusiformes o
en forma de maza de 7-9 x 20-35 µm, generalmente con
2-5 tabiques. Ausencia de microconidias.

Cuadro 5: Cuadro descriptivo Epidermophyton floccosum

Dibujo Microscopio Óptico

41
 DIAGNÓSTICO DE PITIRIASIS VERSICOLOR

CARACTERISTICAS DE LAS LESIONES:

Presencia de maculas hipo o hiperpigmentadas y rara vez ligeramente

eritematosas; solitarias o confluentes, puntiformes, redondeadas a mapiformes y de
bordes bien definidos. Suelen estar acompañadas de descamación fina y el paciente
puede relatar prurito, especialmente cuando hay sudoración. Los lugares más
comúnmente afectados son: el tórax, los hombros y el cuello.

Figura 16. Lesiones en cara (flechas) de

Pitiriasis Versicolor. Foto tomada de:
atlasdemicologia.blogspot.com/2008/11/3-
pitiriasis versicolor.html

MUESTRA

Escamas obtenidas por raspado con bisturí o la técnica de la cinta adhesiva.

Microscopio Óptico

Técnica de la cinta adhesiva: Se corta un pedazo de cinta adhesiva, un poco

más largo que una lámina portaobjeto, se delimita la lesión con un bolígrafo y se
dispone a frotar, con la uña, la lesión con la cinta adhesiva (tratando que las escamas

42
se adhieran a la pega de la misma), una vez recolectada la muestra se coloca sobre
una lámina portaobjeto con una o dos gotas de azul de metileno al 0,05%.

ESTUDIO MICOLÓGICO

EXAMEN DIRECTO: Azul de metileno a 0,05%

Al microscopio se observan blastoconidias de Malassezia sp, de 3-8 µm de

diámetro, de paredes gruesas y refringentes, aisladas o dispuestas en acúmulos y
asociadas con hifas cortas y gruesas, poco ramificadas de 2,5 a 4 µm de diámetro. Con
estos hallazgos se establece el diagnóstico de pitiriasis versicolor.

H
B

Figura 17: Examen directo de Pitiriasis

versicolor. Se observan blastoconidias (B) de DIBUJO
Malassezia sp. en acúmulos e hifas (H)
cortas y gruesas. Técnica de cinta adhesiva.
Coloreada con Azul de metileno 0,05%. Foto
tomada por Profa. Leyla Humbría

CULTIVO
Microscopio Óptico

Generalmente no requiere cultivo, a menos que los resultados sean atípicos o

que se desee determinar la especie implicada.

43
 DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO DE LA CANDIDOSIS MUCOCUTÁNEA

MUESTRA

Escamas, detrito subungueal, fragmentos de uñas, exudado de mucosas,

secreciones, flujo vaginal. Las cuales pueden ser tomadas por raspado de bisturí o
haciendo uso de un hisopo estéril en el caso de exudados, secreciones o flujo vaginal.

Remisión:

 Las escamas pueden ser remitidas en un sobre nuevo, entre dos láminas
portaobjetos unidas con cinta adhesiva o en una caja de Petri plástica estéril,
acompañada de la identificación del paciente y de las descripción de la lesión y del
área donde fue tomada. Se debe enviar material suficiente para ser directo y cultivo.

 El exudado proveniente del reborde ungueal debe ser tomado y procesado

de inmediato en el laboratorio. El detrito, los raspados ungueales y los fragmentos de la
uñas pueden enviarse en sobres o cajas de Petri plásticas estériles, acompañados de
los datos del paciente.

 En el caso de la toma de muestra en mucosas, las mismas deben enviarse

en tubo con tapa de rosca que contenga 1 ml de solución salina o agua destilada
estéril. La muestra debe ser procesada en la hora siguiente a su recolección; por ello
debe anotarse en la orden de remisión la hora de toma de muestra. Si no es posible la
remisión inmediata al laboratorio de muestras de mucosa vaginal, genital masculina o
perianal, se recomienda realizar un extendido para su posterior coloración con Gram,
con el fin de controlar la cantidad de blastoconidias y seudohifas al momento de tomar
Microscopio Óptico

las muestras.

44
 ESTUDIO MICOLÓGICO

EXAMEN DIRECTO

Se realiza con la observación al microscópico del material colocado entre una

lámina portaobjeto y una laminilla con KOH al 10-20%. Se observan blastoconidias
ovaladas o redondeadas de diferentes tamaños dependiendo de la especie. Aunque la
presencia de seudohifas asociadas con blastoconidias, caracterizan el género Candida,
al examen directo no siempre se observan ambos elementos.

En candidosis cutánea la presencia de seudohifas e hifas es diagnóstico, debido

a que el hongo no es flora normal de la piel, con la excepción de la piel de las áreas
periorificiarias donde ocurre contaminación por proximidad con las mucosas. En la
candidiasis de membranas mucosas, es indispensable observar las blastoconidias y/o
seudohifas para establecer el diagnóstico (Figura 18).

Seudohifa
Blastoconidia

Clamidospora

Figura 18: Blastoconidia, seudohifa y clamidosporas de DIBUJO

Candida albicans.

CULTIVO
Microscopio Óptico

Es importante resaltar que el solo aislamiento en cultivo no es significativo

debido a que las levaduras constituyen parte de la flora normal de las mucosas. Una
vez aislada la levadura en el medio de cultivo (Sabouraud, Mycosel, Lactrimel), se

45
procede a la diferenciación de especies a través de la realización de diferentes pruebas
bioquímicas: como lo son la formación de tubo germinal, filamentación, producción de
clamidosporas, hidrólisis de la urea y asimiliación de azúcares o Auxonograma).
(Esquema 1)

En el informe de resultados se debe informar la cantidad de elementos micóticos

observados, de acuerdo a los siguientes datos:

Cantidad Uñas (cm x 40) Flujo (cm x 40)

Escasa 1-5 1-10
Moderada 6-10 10-20
Abundante >10 >20

Actividad: Describir las características macro y microscópicas del cultivo de

Candida albicans.

Microscopio Óptico

46
 MUESTRA CLÍNICA

LEVADURA AISLADA (SABOURAUD O LACTRIMEL)

BILIS AGAR (Clamidosporas)

Candida albicans, Candida dubliniensis

FILAMENTACIÓN (Corn Meal Tween 80)

+ -

UREASA UREASA

+ - - +
Trichosporum Candida spp Cryptococcus
Rodotorula (Anaranjada)

Auxonograma, crecimiento: 37 ºC y 42 ºC
Microscopio Óptico

Para identificación de especies de Candida no albicans

Esquema 1: Identificación de levaduras

47
 PRÁCTICA NÚMERO 4: DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SUBCUTÁNEAS

OBJETIVOS:
Al finalizar la práctica el estudiante estará en la capacidad de:

 Reconocer la importancia médica del diagnóstico micológico de las micosis

subcutáneas.
 Realizar el diagnóstico micológico de las micosis subcutáneas.
 Describir las características macro y microscópicas de los agentes causales
de las micosis subcutáneas.

DIAGNÓSTICO DE LA CROMOBLASTOMICOSIS

La cromoblastomicosis (CBM) es una enfermedad crónica, granulomatosa, que

afecta predominantemente a hombres, trabajadores del campo, en edades
comprendidas entre los 20 y 70 años, aunque también se han reportado casos en niños
y adolescentes. Es causada por varios hongos filamentosos con melanina, clasificados
en la familia Demateacea y denominados cromomicetos por Borelli Se adquiere por
inoculación accidental del hongo saprofito en la piel a través de traumatismos
ocasionados con espinas de plantas o restos vegetales que contienen el agente.

Para establecer el diagnóstico de la cromoblastomicosis se hace necesario

conocer la epidemiología, impresión clínica y recuperar el agente causal de las
muestras clínicas.

Estudio epidemiológico

La cromoblastomicosis se presenta especialmente en hombres adultos,

Microscopio Óptico

agricultores entre la tercera y cuarta década de la vida, quienes han estado

repetidamente expuestos a pequeños traumas. Los niños y adolescentes también
pueden ser afectados principalmente por Cladophialophora carrionii. La distribución

48
geográfica es mundial, pero el mayor número de casos se han informado en las
regiones tropicales y subtropicales de América y África.

En Venezuela las áreas endémicas más importantes se localizan en la región

noroccidental, en los estados Lara, Zulia y Falcón. Esta área endémica incluye dos
reservareas según el agente causal implicado.

Fonsecae pedrosoii se encuentra en regiones de clima cálido y húmedo

descritas como "Bosque deciduo montano".

Cladophialophora carrionii es el agente causal más frecuentemente asilado y es

considerado el responsable de la endemia de CBM en la zona semiárida del estado
Falcón. C. carrionii se encuentra en zonas áridas descritas como "bosque xerófilo de
espinar"

Impresión Clínica

La cromoblastomicosis se caracteriza clínicamente por la presencia de lesiones

pápulo postulosas o nódulo abcesado que evolucionan lenta y progresivamente a placa
verrugosa de superficie irregular con diminutas hemorragias, visibles como puntos
negros, escamo-costrosas, de bordes activos y zonas con tendencias a la cicatrización,
dejando áreas atróficas, acrómicas o hipocrómicas. Al cabo de varios años de
evolución, estas lesiones pueden llevar a deformaciones irreversibles e invalidez parcial
del miembro afectado. Las lesiones son generalmente únicas, se encuentran
principalmente en extremidades aunque también pueden ser observadas en manos,
espalda, tronco, región glútea y cara. (Figura 19).
Microscopio Óptico

49
 Figura 19: Diferentes lesiones clínicas de cromoblastomicosis. Fotos cortesía
Profa. Leyla Humbría.

Estudio Micológico

Muestra:
Previa asepsia con alcohol, las escamocostras son recolectadas con bisturí
romo, raspando la lesión, con preferencia donde se encuentran los puntos negros
dérmicos, los cuales contienen las estructuras del hongo. Se recogen directamente
sobre la lámina portaobjeto.

En algunos casos es necesario recurrir a la biopsia debido a la hiperqueratosis

que impide penetrar al lugar donde se encuentra el hongo.
Microscopio Óptico

Remisión: Las escamocostras pueden ser remitidas en un sobre nuevo, entre

dos láminas portaobjetos unidas con cinta adhesiva o en una caja de Petri plástica

50
estéril, acompañada de la identificación del paciente y de la descripción de la lesión y
del área donde fue tomada. Se debe enviar material suficiente para ser directo y cultivo.

Examen Directo:

Se realiza entre lámina y laminilla con KOH al 10-20%, sólo o adicionado con
tinta, Negro de clorazol E y haciendo uso de coloraciones histológicas como
Hematoxilina-Eosina (HE) o Ácido Peryódico de Schiff (PAS).

En un paciente con cromoblastomicosis se observan las células escleróticas,

células fumagoides o esclerotes de Medlar, las cuales son células redondeadas, de
color café o amarillo ocre, de 4 a 12 µm de diámetro, de pared gruesa, con inclusiones
citoplasmáticas y con particiones (Figura 20). Estas células pueden dividirse en varios
planos, con septos en diferente orientación. No son blastoconidias ni tienen
reproducción por gemación. En casos muy crónicos, se pueden observar también la
presencia de hifas cortas, septadas, de pared gruesa y dematiaceas.

En la biopsias teñidas con HE los cuerpos escleróticos conservan su color

característico. La respuesta tisular es mixta con una respuesta supurativa y predominio
de granulomas, con acúmulos de neutrófilos en el centro. Las células escleróticas se
localizan en los microabscesos dérmicos, mientras que las hifas pueden verse en la
epidermis.

S S Microscopio Óptico

Figura 20: Cuerpos escleróticos. (S) Septos. Escamocostras.

KOH, 40x. Foto cortesía Profa. Leyla Humbría
DIBUJO

51
 El examen directo es muy importante ya que la observación de las células
escleróticas establece el diagnóstico de enfermedad, pero el cultivo es indispensable
para determinar el género y la especie del agente etiológico y ulterior aplicación de
tratamiento.

Reporte: al examen directo se observan células escleróticas compatibles con

agentes de cromoblastomicosis.

Cultivo y microcultivo:

La siembra se realiza sobre agar Sabouraud o Lactrimel, en placa o tubo, se

incuba a temperatura ambiente por 8 ó 15 días.

Características macroscópicas: Todas las especies causantes de

cromoblastomicosis producen colonias de crecimiento lento, micelio aéreo corto, de
color variable entre pardo oscuro, verde oliva o negro; con aspecto aterciopelado,
superficie plana o ligeramente elevada y plegada; al reverso la colonia es de color
negro.

Características microscópicas: El estudio de los microcultivos facilita la

observación de la conidiogénesis, permitiendo la identificación por especie del agente
causal.

Cladophialophora carrionii:

Presenta fructificación tipo Cladophialophora con conidióforos simples, erectos,

de longitud variable, que dan origen en su extremo distal a cadenas de conidias
brotantes, de color pardo, unicelulares o bicelulares, ovoides, elípticos o cilíndricos de 2
a 4 µm, que se disponen en cortas cadenas acrópetas y ramificadas. En los puntos de
unión de las conidias, se observan zonas engrosadas de la pared celular que actúan
como disyuntores, favoreciendo su desprendimiento. (Figura 21)
Microscopio Óptico

52
 Cadena de
conidias

Hifa septada
Conidióforo
simple

Figura 21. Cladophialophora carrionii. Azul DIBUJO

de lactofenol. 40x. Foto cortesía Profa.
Leyla Humbría

Phialophora verrucosa:

Presenta fructificación Phialophora, la cual se caracteriza por la producción de

conidióforos terminales o dispuestos a los lados de las hifas vegetativas, en forma de
florero (fiálides), con una zona estrecha o cuello y una porción distal más ancha. Las
conidias son ovales, lisas, ligeramente pigmentadas y de 2 a 3 µm de diámetro; se
forman en el interior de la fiálide, salen del exterior acumulándose en pequeños
conglomerados en forma de cabezuela. (Figura 22).

Conidias

Fialide

Hifa septada
Microscopio Óptico

DIBUJO
Figura 22: Phialophora verrucosa.
http://overcomingcandida.com/mycology/phialop
hora.jpg

53
 Rhinocladiella aquaspersa:

Presenta la fructificación de tipo Rhinocladiella, exhibe un conidióforo poco

diferenciado, erecto, cilíndrico, ligeramente dilatado en su extremo distal, en forma de
clava o maza; en esta porción se ven cortas prolongaciones del conidióforo en forma
de dientes, donde se implantan las conidias con disposición acropleurogena. Las
conidias son ovales, unicelulares, de 2 a 5 µm de diámetro y forman brotes que dan
origen a cortas cadenas de 2 a 3 elementos. (Figura 23)

Conidioforo

Conidias
Hifa septada
Figura 23: Rhinocladiella aquaspersa. DIBUJO
www2.ac-lyon.fr/.../rhinocladiellaaquaspersa.gif

Fonsecaea pedrosoi:
Presenta los tres tipos de formación de conidias que exhiben los agentes
causales de esta enfermedad: Cladosporium, phialophora y Rhinocladiella,
generalmente predominan las dos primeras. (Figura 24)

Hifa Conidias
septada
Microscopio Óptico

Conidióforo

54
Figura 24. Fonsecaea pedrosoi.
www.doctorfungus.org/thefungi/img/fon1_l.jpg DIBUJO

DIAGNÓSTICO DE LA ESPOROTRICOSIS

La Esporotricosis es una micosis endémica, producida por la penetración del hongo

dimórfico Sporotrhrix schenckii. Ocasionando lesiones cutáneas y extracutáneas.

Para establecer el diagnostico de la esporotricosis se hace necesario conocer la

epidemiología, impresión clínica y recuperar el agente causal de las muestras clínicas.

Estudio epidemiológico

S. schenckii es de distribución mundial, aunque es más frecuente en aéreas

tropicales, tiene su hábitat más común en la tierra y en los vegetales.

La enfermedad se presenta en todas las edades y en ambos sexos, con mayor

incidencia en el sexo masculino, que por su ocupación están expuestos a cualquier tipo
de trauma.

Entre los factores de riesgos conocidos para las formas cutáneas se han descrito el
contacto traumático con material vegetal (plantas espinosas, helechos, paja, musgo).
En las formas sistémicas, el alcoholismo y la inmunosupresión han sido señalados
como factores de riesgos importantes.

Se recomienda realizar diagnóstico diferencial con leishmaniasis mucocutánea,

sífilis, tuberculosis, epitelioma, cromomicosis, acné, piodermitis, criptococosis cutánea,
sarcoidosis, lepra tuberculoide, lesiones queloideanas, dermatofitosis y enfermedades
malignas.
Microscopio Óptico

Impresión Clínica

Esporotricosis cutánea primaria: se describen dos formas.

55
  Cutánea primaria fija: se caracteriza por la presencia de una lesión ulcerada,
verrucosa o vegetante, solitaria o con lesiones satélites periféricas, contiguas, rojizas o
violáceas, que crecen por contigüidad.

 Cutánea primaria linfangítica: Se caracteriza por la presencia de un chancro

de inoculación, la cual es una lesión nodular, verrucosa o ulcerada, seguida de
múltiples lesiones nodulares a lo largo de los canales linfáticos adyacentes. En los
adultos se localiza principalmente en las extremidades superiores e inferiores, mientras
que en los niños predomina en la cara.

Figura 25: Lesión de Esporotricosis linfangítica.

http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/medicina/2010828/l
ecciones/cap6/cap6-3.htm

Esporotricosis pulmonar primaria o extracutánea: esta forma se adquiere por

inhalación del hongo. En los individuos normales es asintomática y puede estimular
inmunidad específica, pero en el hospedero inmunocomprometido, suele ocurrir
diseminación hematógena.
Microscopio Óptico

56
 Estudio Micológico

Muestra:
Se solicitan usualmente:
 Exudados
 Material purulento
 Biopsias

En las formas diseminadas se solicita:

 Esputo
 Liquido sinovial
 Liquido cefalorraquídeo

Examen Directo:

Se realiza haciendo uso de la coloración de Giemsa o histológicas (HE, PAS,

plata-metenamina), inmunofluorescencia directa y técnicas de inmunoperoxidasa.

Usualmente no se observan estructuras micóticas y ocasionalmente se observa

el cuerpo asteroide. Las blastoconidias son además, difíciles de diferenciar de otros
hongos, como Histoplasma capsulatum, especialmente en fresco o con la coloración de
plata metenamina.

En biopsias teñidas con HE o PAS, se observan blastoconidias rodeadas de

espículas eosinófilas en forma de estrella (reacción de Splendore-Hoeppli), conocida
con el nombre de cuerpo asteroide. Estas estructuras rara vez se observan al examen
en fresco.

Por inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa se observan blastoconidias de S.

schenckii.
Microscopio Óptico

57
 Figura 26: Cuerpo asteroide.
http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/medicina/20108
28/lecciones/cap6/cap6-3.htm

Cultivo:

Características macroscópicas: A temperatura ambiente los cultivos son de

crecimiento rápido (4 a 5 días), de aspecto micelial, de color gris claro que con el
tiempo se tornan más oscuros, de superficie vellosa, muy plegada y de consistencia
membranosa. A 37 ºC se observan colonias blancas, cremosas, de aspecto
levaduriforme.

Características microscópicas: el micelio está constituido por finos filamentos

hialinos, ramificados y septados. Las conidias tienen forma elíptica, de pared lisa y
delgada, se originan en forma simpodial, en el extremo distal de conidióforos simples,
erectos y finos, presentando en su conjunto el aspecto del tallo y pétalos de una flor de
margarita. El estado levaduriforme está constituido por blastoconidias esféricas, ovales
o en forma de cigarro, mono o multigemante de 1 a 3 µm por 3 a 10 µm. en algunos
casos se hace necesario demostrar el carácter dimórfico del hongo inoculando
animales de experimentación como ratas o cobayos.
Microscopio Óptico

58
 c

H
H
S

Figura 27: Cultivo en lámina de Sporotrhrix schenckii. Hifa DIBUJO

septada (H), Conidióforo simple (C) y conidias (c)
dispuestas en flor de margarita.
www.facmed.unam.mx/.../pages/sschenckii2_jpg.htm

Inmunodiagnóstico:

Inmunidad celular: Se estudia mediante la aplicación intradérmica de 0,1 c.c. de

esporotriquina, la cual es un antígeno que se prepara bien sea de la fase micelial o
levaduriforme del hongo, se realiza la lectura a las 48 horas. Una lectura mayor o igual
de 5 mm indica que la persona ha estado expuesta al hongo. A pesar de que la
intradermorreacción carece de valor diagnóstico, una prueba positiva ante un cuadro
clínico sugestivo de esporotricosis orienta hacia el diagnóstico de la enfermedad, el
cual debe ser confirmado con el aislamiento e identificación del agente causal.

Inmunidad humoral: La prueba de elección para el estudio de los casos de

esporotricosis cutánea linfática y la extracutánea es la ID. En los casos de
esporotricosis cutánea fija las pruebas de elección, usando un antígeno levaduriforme,
son la aglutinación, el látex y la electrosinéresis.
Microscopio Óptico

59
 DIAGNÓSTICO DE MICETOMA

El Micetoma es una infección crónica, supurativa de los tejidos cutáneo,

subcutáneo y óseo. Se caracteriza por la presencia de edema, fístulas y granos que
drenan a través de las fístulas, esta triada es usada en un sentido estricto para definir
el término Micetoma. Puede estar causado por bacterias (actinomicetos) u hongos
(eumicetos).

Estudio epidemiológico:

El Micetoma se produce por la implantación traumática o heridas en el tejido

subcutáneo, de ciertos hongos o bacterias, presentes en espinas o astillas de madera,
entre otros. Es frecuente en regiones tropicales y subtropicales, presentándose
esporádicamente en regiones templadas. La enfermedad es endémica en la India y en
algunos países del África y de Latinoamérica. En Venezuela, la enfermedad predomina
en la región Centrooccidental del país, en los estados Lara y Falcón. Así mismo, se
han reportado casos en las regiones: Central, Zuliana y de Guayana.

La enfermedad se ha observado en niños de 3 años de edad y en individuos de

80 años, pero predomina entre la 2a década de la vida. Es más común en hombres que
en mujeres, en una relación 2:1, y predomina en campesinos, por lo que esta entidad
es considerada una enfermedad ocupacional. Afecta principalmente los miembros
inferiores, pero también puede producirse en manos, rodillas, región glútea, brazos,
cabeza, cuello y tronco.

Agentes etiológicos:

El Micetoma puede ser ocasionado por bacterias aeróbicas (Micetoma

actinomicótico) los cuales producen granos claros a excepción de Actinomadura
pelletieri que es rojo, y por hongos verdaderos (Micetoma eumicótico), los cuales
producen granos de color negro, excepto Cephalosporium. (Tabla 1).
Microscopio Óptico

60
 Tabla 1. Agentes etiológicos del Micetoma

En Venezuela, los principales agentes de Micetoma son:

Actinomicetoma:

 A. madurae
 N. brasiliensis

Eumicetoma:

 Pyrenochaeta mackinonnii
 P. romeroi
 Madurella grisea
Microscopio Óptico

61
Impresión clínica:

La lesión inicial se localiza en el tejido celular subcutáneo. Se caracteriza por

ser una masa firme, indolora y no adherida a los planos superficiales. Luego se
extiende hasta el tejido subcutáneo donde forma áreas de tumefacción con producción
de abscesos que alcanzan la piel y drenan a través de múltiples fístulas. En el líquido
seropurulento que de allí drena, se encuentran los granos característicos de la
enfermedad. El progreso de la lesión lleva a compromiso óseo, el cual ocasiona
deformación marcada del miembro comprometido.

Diagnostico micológico:

Muestra:

 Granos
 Material purulento
 Liquido serohemático
 biopsias

Examen directo:

Se realiza con la observación directa de los granos entre lamina y laminilla con
KOH al 10%, también se puede realizar coloración de Gram. Como los granos pueden
ser producidos por bacterias u hongos, es importante estudiar sus características
macro y microscópicas de su tamaño, forma, consistencia y color, así como el diámetro
de los filamentos que lo conforman y la configuración interna son características
importantes.

Los granos producidos por actinomicetos se observan al microscopio como

filamentos delgados, ramificados, de aproximadamente 1 µm de diámetro y poseen
algunas formas cocoides y bacilares; se tiñen con Gram, Kinyoun, Giemsa, HE y plata-
metenamina; algunos son parcialmente ácido alcohol resistente.
Microscopio Óptico

Los granos producidos por hongos pueden ser duros o blandos. Sus filamentos
pueden ser delgados o gruesos, pero siempre mayores de 1 µm de diámetro,

62
ramificados y a veces tortuosos, poseen usualmente clamidoconidias de diferentes
diámetros.

Las biopsias se procesan y colorean con HE o con coloraciones especiales

como PAS. Alrededor del grano se observa un depósito de material eosinófilo
(reacción de Splendore-Hoeppli), polimorfonucleares, células gigantes multinucleadas,
células plasmáticas e histiocitos.

Cultivo:

Los granos constituyen la fuente fundamental del material para el cultivo; éstos
deben estar vivos y libres de contaminación. Así mismo, se pueden usar para el cultivo
las secreciones serosanguinolentas del área afectada. El cultivo se puede realizar en
medio de mycosel, medio de Sabouraud o medios nutrientes, tales como infusión
cerebro-corazón (en caldo o en agar), y esperar por lo general de 2 a 3 semanas de
cultivo, incubándose a 30 ó 37°C. También pueden incubarse en atmósfera de C0 2.

ACTIVIDAD: Describa los granos producidos por hongos y por bacterias.

Microscopio Óptico

63