9.

DESARROLLOS BIOTECNOLÓGICOS APLICADOS A LAS TÉCNICAS DE

REPRODUCCIÓN ASISTIDA

Las técnicas de reproducción asistidas se llevan a cabo cuando una pareja es declara infértil, lo cual según la OMS se
define como la “no obtención de un embarazo tras al menos 1 año de relaciones sexuales no protegidas ”. En estos casos
las personas afectadas acuden a una clínica o servicio de salud que tenga la especialidad de reproducción asistida, en
donde son sometidos a evaluación ginecológica y embriológica.

MANIPULACIÓN DE LA REPRODUCCIÓN

Cuando la pareja llega al centro, se les pide los análisis correspondientes (sobre todo
hormonales, de sangre), en donde existen una serie de exámenes específicos según el
sexo:

- Mujer: Evaluación de la permeabilidad de las trompas uterinas, de manera de estar

seguro de que cuando el ovocito es ovulado puede transcurrir por la trompa hasta el
útero. Profe desconoce si es examen de rutina o ante sospecha
- Hombre: Espermiograma o seminograma, que es un análisis del semen. Este busca
evaluar que los parámetros impuestos por la OMS den cuenta de una fertilidad normal, no obstante, hay muchas
personas que tienen estos parámetros normales y no logran un embarazo. Esto es una de las grandes lagunas que
tiene en la actualidad la fertilidad, ya que son muchos parámetros que influyen en ella y a pesar de que las pruebas
resulten normales se sigue sin poder obtener un embarazo.

Fotografía del microscopio óptico del espermatozoide humano:

- Cabeza: Tiene forma más o menos ovalada, casi elíptica en algunos casos.
- Acrosoma: zona un poco más clara en el espermatozoide. Existe una proporción que
debe haber entre el acrosoma y la cabeza.

ESPERMATOZOIDES – ESPECIES

Existe una gran diversidad de formas morfológicas especie-específicas. El de nuestro interés es el de humano.

Espermatozoide de mosca. Cuando la mosca macho está en fase

reproductiva todo su abdomen está ocupado por los espermatozoides
sobre empaquetados.

IZQ: espermatozoides de cobayas o cui

DER: espermatozoides de humano
 IZQ: espermatozoides de rata
DER: espermatozoides de ratón
ESPERMATOZOIDES – MANIPULACIÓN DE LA REPRODUCCIÓN

Túbulos seminíferos: En este lugar los

espermatozoides se desarrollan mediante un
proceso llamado espermatogénesis, el cual es el
paso desde la espermatogonia, pasando por todas
las fases de diferenciación, hasta el
espermatozoide.

Estos túbulos en el testículo humano se

encuentran dentro de compartimentos (lobulillos)
que tienen especies de tabiques.

Dentro de estos lobulillos, los túbulos seminíferos

están plegados en forma de “U” (los dos extremos
apuntan hacia como el centro) y terminan en el
túbulo recto.

Túbulo recto: Este sigue siendo parte del túbulo seminífero, pero es la región final que confluye la de todos los túbulos
seminíferos y forman la rete testis o red testicular.

Rete testis: se encuentra en el mediastino del testículo, bajo la cubierta que corresponde a una túnica albugínea normal
que envuelve todos estos compartimentos.

Una vez liberados a la luz del túbulo seminífero, todos los espermatocitos producidos en todos los túbulos seminíferos
migrarán y progresarán hacia la red testicular, esto gracias a los mov. de cilios y microvellosidades de las células que
recubren el conducto por su interior. A partir de esta red, surgen de 6 a 8 conductillos eferentes.

Los conductillos eferentes conectan la red testicular con el epidídimo, el cual se convierte en un
solo tubo que se encuentra muy contorneado. Los 6-8 conductillos eferentes confluyen todos en
el epidídimo que es uno solo.

El epidídimo es el que otorga la madurez funcional al espermatozoide. Los espermatozoides

cuando salen del testículo son inmaduros funcionalmente dado que son inmóviles al no poder
mover el flagelo, solo cuando pasan por el epidídimo adquieren la movilidad.

La cauda/cola del epidídimo (O) es uno de los puntos de almacenamiento de espermatozoides.

Una vez terminado el epidídimo, comienza un gran tubo microscópicamente que corresponde al
conducto deferente. Este recorre el aparato reproductor masculino hasta fusionarse con las vesículas seminales,
pasando por la próstata, la uretra y finalmente el exterior. Las capas musculares de este tubo que parten del epidídimo
van a ir engrosándose para permitir la eyaculación en el momento adecuado por la contracción de estos tubos.

Es importante el recordar que los espermatozoides obtenidos de los testículos son inmóviles y los obtenidos a través del
paso por el epidídimo son móviles. Esto porque cuando se accede a una punción testicular en una clínica de
reproducción asistida, no es lo mimo obtener el espermatozoide del testículo que obtenerlo de la cauda o del conducto
deferente ya que esta característica es importante.
ANATOMÍA DEL APARATO REPRODUCTOR MASCULINO

Se puede ver el testículo, el epidídimo y el conducto deferente (flecha negra), que

va a subir y juntarse con las vesículas seminales (circulo verde) y luego va a
atravesar la próstata (circulo rosado), en el interior de esta se va a juntar con la
uretra que viene desde la vejiga. A partir de ahí se convierte en la uretra que es la
que corre a lo largo del pene hasta el exterior.

Los testículos producen/secretan el componente celular. Mientras que las vesículas

seminales, la próstata y las glándulas bulbouretrales van a secretar el componente
liquido del semen que contiene los nutrientes y proteínas necesarias para que el
espermatozoide pueda fecundar exitosamente el oocito.

Entonces por un lado se tiene el análisis del espermatozoide que viene del testículo
y por otro lado se hace un análisis de los componentes del plasma seminal que es secretado por estas glándulas.

PARÁMETROS A MEDIR

Cuando llega el paciente a la clínica, tiene que entregar la muestra de semen, a la cual se le van a medir los siguientes
parámetros:

Parámetros Normal Anormal

Volumen ≥1,5 ml < 1,5 ml
pH ≥7,2 < 7,2
Concentración ≥15x106 esp/ml < 15x106 esp/ml
Movilidad ≥32% esp móviles prog <32% esp móviles prog
Morfología ≥4% formas normales <4% formas normales

Hay una serie de criterios que define la OMS que se han revisado frecuentemente los últimos años que dice que:
- El volumen normal se considera mayor o igual a 1,5 ml de semen, mientras que hace 15 años el valor era de 2 ml.
- El pH normal corresponde a 7,2 el cual es neutro.
- La concentración de espermatozoides que se considera normal para obtener un embarazo es de 15 millones de
espermatozoides por ml, en un volumen normal seria alrededor de 22,5 millones totales.
- La movilidad de los espermatozoides para que se considere normal tiene que ser igual o mayor al 32% de los
espermatozoides móviles progresivos.
- La morfología tiene que ser mayor al 4% de formas normales, es decir, con un 4% de los espermatozoides con
características normales se considera normal.

¿Estos parámetros se decidieron universalmente, o depende de cada centro/país?

- Estos parámetros los decidió la OMS a través de revisiones de datos de clínicas de reproducción a lo largo de todo el
mundo. Hace 15-20 años los parámetros eran más altos, el volumen era de 2 ml, el pH era el mismo, la concentración
eran 20 millones esp/ml, la movilidad era del 50% y las formas eran del 14%. Estos han ido bajando porque se ha ido
describiendo desde hace 30 años aprox que ha habido un descenso a nivel mundial del número de espermatozoides y su
movilidad por eyaculación.

Ha habido un descenso estadístico a nivel mundial del número de espermatozoides y su movilidad, producto de tóxicos
ambientales, estilos de vida, aumento de la temperatura, etc. A pesar de eso, se siguen obteniendo embarazos, por lo
que se han reducido los parámetros normales definidos por la OMS, los que las clínicas de fertilización asistida deben
utilizar
.

Recogida de la muestra

- Por masturbación (alternativas según creencias de la pareja).

- En un frasco de plástico estéril.
- 40 min máx transcurridos desde la toma de muestra hasta la llegada al laboratorio. Idealmente es que sea obtenida
en mismo laboratorio o alguna estructura anexa.
Tiene relación con el tiempo que tarda el semen en licuar por T°, las proteínas generadas por las vesículas
seminales son coagulantes (coagulan el semen: fluído a gel), como resultado de una adaptación evolutiva (ej ratón
macho al cruzarse con hembra deja un tapón físico vaginal con el semen tipo cemento, para evitar que otro macho
introduzca sus genes). Además, la próstata genera una proteína descoagulante. El tiempo entre coagulación –
descoagulación es app 30-40 min a 37°.
La muestra debe estar coagulada para asegurar que los procesos sean estándar, si no se licua el semen
naturalmente dentro del tiempo, puede que se tenga alguna patología de las proteínas de la próstata o su
secreción que puedan ser responsables de problemas de fertilidad.
- Abstinencia de 3 a 7 días (parámetro más real de la producción de espermatozoides, ni + ni -).

Anécdota del profe: Al trabajar en una clínica de fertilización asistida, una señora para mantener la temperatura
introdujo la muestra al microondas, destruyendo los espermatozoides de las muestras. Basta con una toalla o algodón
alrededor de la muestra.

- Situaciones especiales
 anticuerpos (recogida en split): se encuentra en espermiograma. En el conducto deferente los anticuerpos
tienen la capacidad de unirse a diversas estructuras del espermatozoide, pero luego aglutinan todos los
espermatozoides a través de sus regiones FC de los anticuerpos, impidiendo que progresen en el tracto
genital femenino y lleguen al punto de fecundación. Se realiza una obtención de espermatozoides especial.
 eyaculación retrógada: Alteración del conducto deferente, que genera que los espermatozoides en lugar de
progresar, se devuelven a la vejiga, por lo que hay una eyaculación sin espermatozoides y con poco volumen
seminal. Se obtiene de la orina de un periodo de tiempo post eyaculación (hasta 24h). A partir de estas se
cuentan de unaforma aproximada el n° de espermatozoides.

1) VOLUMEN EYACULADO

Lo primero que se mide es el volumen del eyaculado pasado los 30-40 min en estufa a 37°C.

 Se mide el volumen del eyaculado pasado 30-40 minutos en la estufa a 37°C.

 Se debe transferir del tubo de orina a un tubo graduado.

>1,5ml Normospermi
a
>6 ml Hiperespermia Igualmente es una alteración porque es sinónimo de una
hipersecreción de fluidos de la próstata o de las vesículas
seminales.
En este caso igualmente existe riesgo de infertilidad porque los
espermatozoides eyaculados pueden estar más diluidos.
< 1,5 ml Hipospermia
0 ml Aspermia Puede dar cuenta de una eyaculación retrograda.

2) EXAMEN MACROSCÓPICO:
  Licuefacción y viscosidad:
 Tiempo de licuefacción: 20-30 min.
 El semen debería ser mayoritariamente fluido, pero existen casos donde es más gelatinoso (como slime) y se
denomina semen filante.
 Semen filante: Puede ser producto de una falla de licuefacción y un aumento de viscosidad que impide la salida
de los espermatozoides del liquido seminal cuando son depositados en el fondo de la vagina. En este caso los
espermatozoides no pueden progresar a través del cérvix para entrar al útero.
 El plasma seminal nunca entra al útero porque produce contracciones, solo los espermatozoides salen del
plasma y progresan hasta el útero y las trompas uterinas.
 Si el semen no se licua bien existe una imposibilidad de salida de los espermatozoides por lo que se reducen las
posibilidades de fecundación.

 Aspecto:
 Hay que fijarse si el semen se ve gelatinoso o presenta sangre (se observa de un color anaranjado).
 Se debe mirar al microscopio para confirmar la presencia de glóbulos rojos.

 Olor:
 Los olores extremos llaman la atención y se debe registrar en la papeleta.

 Volumen:
 Lo ideal es no utilizar pipetas o jeringuillas pues se rompen las colas de los espermatozoides.
 Se prefiere traspasar la muestra a un tubo graduado para medir el volumen.

 pH:
 Se mide con un papel para medir pH y este debe ser entre 7.2 y 8.2.

3) EXAMEN MICROSCÓPICO:
 Concentración:
 Se utiliza una cámara de makler (similar a la cámara de
neubauer) que permite analizar la concentración y movilidad
al mismo tiempo ya que se utilizan los espermatozoides sin
fijar.
 La medida de la concentración no es tan exacta (a diferencia
de si se tuviesen las células fijadas) porque en esta cámara
no se fija la muestra y los espermatozoides se mueven
dentro de la cuadricula. Hay que tener un ojo especializado
para no volver a contar un espermatozoide que ya se contó
en otro cuadrito.
 La cámara esta formada por una estructura metálica con un
vidrio en el centro que contiene una cuadricula grabada de
10x10 cuadritos= 100 cuadritos totales.
 Se debe colocar una gota de semen en el centro y luego se coloca el cubre para visualizar con el microscópico.
 Igualmente se puede utilizar una cámara de neubauer cuando existen dudas con resultados que se encuentran
en el limite de lo definido por la OMS.
 De la cuadricula se cuentan 3 a 4 líneas, se hace un promedio para tener el número de células en 10 cuadritos y
luego se multiplican por 106 /ml. Nos da 2.000.000 ml que tiene la muestra.

Luego de cortar tres columnas seguidas o tres separadas por dos, como es el promedio, lo multiplicamos y sale
directamente la concentración de espermatozoides.
 Si es 15 millones hablamos de normozoospermia y si es menor a 15 millones hablamos de oligozoospermia.

4) MOVILIDAD

La movididad se mide y lo que se hace es contar 100 espermatozoides y registrar el tipo de movimiento que tiene cada
uno, los que son rapidos progresivos, es decir avanzan en línea recta y avanzan rápido se clasifican como A o +++. Los
que posee movilidad progresiva lenta, que se mueven, pero de forma lenta y tampoco rectilínea se clasifican como B o +
+. Luego están los móviles no progresivos que están fijos en un punto, mueven el flagelo pero no avanzan y se
clasificanon como C o + Y luego tenemos los inmóviles que se describen con una D o – Eso puede ser que estén vivos y
no se muevan o que estén muertos.

Lo normal es que los móviles progresivos junto con los no progresivos sean mayor a un 32%. Si es menor el diagnóstico
es astenozoospermia. Si además tiene pocos espermatozoides es oligoastenozoospermia, es decir se van combinando
las fallas que se vayan encontrando en el semen.

5) MORFOLOGÍA

Este es el parámetro más subjetivo y es el que menos se tiene en

concideracion a la hora de definir la causa de la infertilidad.

Hay multitud de defectos de cabeza, como las que aparecen en la imagen,

hay por ejemplo, el más llamativo ya que todos son redondos y no tienen
zona clara, y cuando todos o la gran mayoría, más del 80% se ven así, se
define como una globozoospermia, es decir espermatozoide en forma de
globos.

Hay que ver si tienen vacuolas como el diagrama, si tiene poco acromosoma
que debe ser al menor ¾ de la superficie de la cabeza. Se pueden encontrar
hartas alteraciones de cabeza de espermatozoide.

El otro parámetro que me mide en la morfología es la unión de la pieza

media a la cabeza, puede ser que este en un ángulo inferior a 90%, que este
desviada al centro, que sea muy gruesa o muy fina, el punto es que uno
debe definir porque lo está viendo en la preparación y eso lo da la
experiencia y comparar con las tablas, con el mismo aumento, ojala con la
misma tinción y definir que es normal y anormal.

El tercer parámetro que se mide es la cola, que sea corta, que esta doblada,
que tengan la cola enrollada da muestra de inmadurez de los
espermatozoides, o que tenga todavía la zona citoplasmica que se debe
perder en la espermatogénesis.

Por lo tanto son tres parámetros de normalidad o anormalidad que se miden, cabeza, pieza media y cola.

El acromosoma no va separado se mide con la cabeza y estas son las 3 anormalidades que se registran:

Formas anormales:

 Anormalidad de la cabeza.
 Anormalidad de pieza intermedia.
 Anormalidad de cola.
Y de la misma manera se cuentan 100 espermatozoides y a cada espermatozoide se le registra si es normal o anormal. Si
es anormal, cuantas anormalidades tiene (cabeza, pieza y/o cola), 2, 3 o solo 1, y de ahí se saca un porcentaje.

Al final uno tiene tantos porcentajes, por ejemplo, el 10% de formas normales, pero queda registrado que el otro 90%
que son anormales, cuantas anormalidades de cola, de pieza intermedia y/o de cabeza hay.

Estas imágenes que son con una tinción de espermatozoides, donde, las N son las que se clasificarían como normales
según la pautas que hay de la OMS.

El profesor discrepa del 4 y el 7 (imagen A), porque, el 4 tiene demasiado grande la cabeza y la pieza intermedia, y el 7
tiene muy angulada la zona baja de la cabeza (círculo rojo).

Imagen A:

 El 1 de la imagen A es claramente una anormalidad de cabeza, es bien

cabezón.
 El 3 tiene una forma rara y muy poco acrosoma.
 El 5 casi no tiene acrosoma.
 El 6 no tiene acrosoma y tiene la cabeza pequeña y redonda.
 El 8 tiene una vacuola y la cabeza es grande.

Imagen C:

 El 3 si pudiera considerarlo normal, aunque el acrosoma no está a ¾ de la cabeza, al igual que el 1.

 El 5 tiene una anormalidad evidente de pieza intermedia, la inserción no es longitudinal, sino que, hay un Angulo
de casi 90°.

Para eso hay que ver y hacer muchas preparaciones para hacer al ojo. Dos operarios
distintos viendo la misma muestra nunca van a tener exactamente el mismo % de
morfología.

Es por eso, por lo que es unos de los parámetros que menos peso tiene (cree el
profesor) a la hora de generar una causa de infertilidad. Esto no quiere decir que no se
tenga que hacer ni que no se tenga en cuenta.

Para medir la morfología hay dos criterios: al que llaman el estricto de Kruger y la
clasificación de la OMS.

1- Morfología de Kruger:
 > 4% esp normales: normal.

El que define que mas del 4% de los espermios tienen que ser normales, para que se considere normal la muestra desde,
el punto de vista morfológico.

 < 4% esp normales: teratozoospermia.

Este es el que el 90% de los laboratorios utilizan.

2- Morfología de OMS:

Es un poco más permisivo, pero que evidentemente levanta el % de normalidad al 30%. Los criterios son menos
estrictos que el de Kruger.

 > 30% esp normales: normal

  < 30% esp normales: teratozoospermia.

Este casi no se ocupa e incluso la OMS dice que, si se ocupa el de Kruger tiene que ser con el rango del 4%.

Con cualquiera de los dos que se ocupe, si es inferior el numero de espermatozoides normales a lo que dice ese rango,
es una teratozoospermia.

Si, además, tenía poco, se movían poco y son anormales se define como una oligoastenoteratozoospermia y esta es de
las patologías mas relevante para la infertilidad, evidentemente salvo la azoospermia que no hay forma de tener
fertilidad.

La azoospermia: se diagnostica cuando no hay espermatozoides, pero para diagnosticar un azoospermia hay que contar
3 veces, 3 gotas distintas de semen, y entre cada gota hay que hacer una centrifugación del semen. Es decir, uno toma la
muestra del semen, la ve al microscopio y no encuentra nada, se vuelve a tomar otra gota de semen, no encuentra nada
y ahí tiene que centrifugar para asegurarse, porque basta con 1 espermatozoide eyaculado para que ya no sea
azoospermia y sea otra la alteración. Entonces hay que centrifugar y tomar directamente del pellet, volver a medir 3
veces y si ahí no se encuentra espermatozoide recién ahí se diagnostica como azoospermia.

Las azoospermia pueden ser:

 Obstructivas: Hay alguna estructura que nos impide que los espermios lleguen al exterior. Por lo general el
tratamiento de estas es por cirugía para solucionar esa barrera.
 Secretoras: Hay alguna alteración que hace que el testículo no genere espermatozoide. Por lo general estas
están relacionadas con alteraciones hormonales del varón, eso ya hace un tratamiento específico.

Hasta acá es el análisis básico que se hace de rutina en el laboratorio, y se informa al ginecólogo o al urólogo que este
viendo a la pareja que tenga oligoastenoteratozoospermia, o normospermia y que todo esté bien.

Si se deciden que se van a hacer una inseminación artificial, que es el primer paso cuando no hay una causa clara que
indique otra técnica se hace lo que se llama, inseminación artificial.

Inseminación artificial  obtención de espermatozoides del paciente y luego se depositan a través de una canula en el
útero de la paciente.

Se debe comprobar la muestra con un espermiograma

Examen microscópico  morfología de Kruger

 > 4% esp normales: NORMAL

 < 4% esp normales: TERATOZOOSPERMIA

 Morfología de OMS

 > 30% esp normales: NORMAL

 < 30% esp normales: TERATOZOOSPERMIA
 RECUPERACIÓN ESPERMÁTICA

Para realizar la inseminación se debe hacer una recuperación espermática, es decir, recuperan los espermatozoides
normales, existen dos técnicas básicas:

 SWIM-UP
- Diluir el semen que queda del espermiograma
(para eso solo se necesitan 10 l solamente y
lo que queda se usa para la recuperación) en
un medio específico, en proporción 1:1.
- Centrifugación, para lavar los espermatozoides
del plasma seminal y luego se obtiene un pellet
que tiene todo el contenido celular del semen
- Eliminar sobrenadante
- Decantación (inclinación del tubo a 45º) y
adición de medio (fresco/nuevo) de manera
cuidadosa y por la pared del tubo
- Incubar durante 45 en incubador (el tubo se
debe mantener inclinado a 45º)
- Rescatar sobrenadante solo de la parte
superficial (no se debe introducir la punta hasta el final), es aproximadamente 1-1,5 l de sobrenadante

Esta técnica lo que logra es que, desde el fondo donde están todos los espermatozoides mezclados, los que estén en
mejores condiciones y tengan mejores características van a ser capaces de salir del pellet y avanzar por la superficie del
medio de cultivo hasta llegar a lo más alto, por eso cuando se rescata el sobrenadante se encuentran los
espermatozoides con mejores condiciones.

El medio de cultivo tiene las características y reactivos necesarios para que los espermatozoides se capaciten, simulando
la capacitación que tendrían en el tracto genital femenino, otorgándoles movilidad y de manera rectilínea que es como
se deben mover para poder fecundar.

Luego de realizar esta recuperación se debe volver a medir la concentración y movilidad para realizar la inseminación
artificial.

Cuando los espermatozoides y el semen no tienen

buenas características o los parámetros son bajos (se
observa en el espermiograma) se debe hacer la otra
técnica que es el gradiente de centrifugación y no el
swim-up

 GRADIENTE DE CENTRIFUGACIÓN
- En un tubo se deposita un producto que son
“bolitas de percoll” que generan un
gradiente, se diluyen al 90% y 45%
(generalmente, pero puede haber
variaciones) y sobre eso se pone el semen.
 - Centrifugación por 15-20 min a 300 g (RCF o fuerza centrífuga relativa  de RPM o revoluciones por minuto)
- Luego se obtiene el tubo con las mismas 3 fases (semen, gradiente 45% y 90%) y además un pellet, en este caso,
los espermatozoides que estaban en mejores condiciones son los que pueden atravesar los gradientes y llegar al
pellet, por el contrario, los que están con alteraciones quedan retenidos en la fase del semen y no son capaces de
atravesar el gradiente.
- El pellet se debe retirar y pasar a otro tubo con un medio de cultivo
- Centrifugar para lavar los espermatozoides por 5 minutos a 600 g (RCF o fuerza centrífuga relativa  de RPM o
revoluciones por minuto)
- Eliminar el sobrenadante
- Resuspender en 1 ml de medio

También se debe evaluar nuevamente la morfología, movilidad y concentración y luego se puede realizar la
inseminación artificial.

En cualquiera de las dos técnicas, la recuperación de espermatozoides se utiliza para llevar a cabo la inseminación
artificial que es el primer tratamiento para una pareja infértil cuando las causas de infertilidad no están claras.

Inseminación artificial
 Causas de infertilidad no claras
 Necesidad de un buen semen  lo más cercano a la normalidad posible (depende mucho del criterio del
ginecólogo/ga y de la clínica)
 Estudio hormonal de la pareja debe estar normal

Tratamiento hormonal (suave)  se debe hacer a la mujer

 Búsqueda de superovulación  lo que se busca es que haya una ovulación controlada y que no sea más de un
ovocito el que se ovule
 Control ecográfico
 Folículos > 18 mm

Tratamiento hormonal:

- Búsqueda de superovulación
Se busca que exista una ovulación controlada, en donde solo debe existir un ovocito ovulado.
- Control ecográfico
Se realiza durante el protocolo de estimulación
- Folículos >18 mm
Cuando el/los folículos que se van siguiendo presentan un diámetro >18 mm se programa la inseminación artificial y se
introducen los espermatozoides en la zona del cérvix para que puedan llegar al útero y luego a las trompas uterinas en
donde ha ocurrido la ovulación (zona de la ampolla del itsmo) para que así ocurra la fecundación.

Si a la segunda o tercera inseminación artificial no se produce un embarazo, se procede a realizar una inseminación in
vitro. Sin embargo, esto dependerá del criterio de cada centro de reproducción.

FECUNDACIÓN IN VITRO

La fecundación in vitro consiste en extraer los oocitos de la paciente.

Aquí el semen es procesado de la forma en que hemos visto con anterioridad y se realiza una recuperación espermática.
Y una vez que los oocitos ya están en condiciones de ser cultivados, estos y los espermatozoides son juntados en una
placa de cultivo, y se espera hasta el siguiente día para evaluar si ha ocurrido la fecundación.
 - Obtención artificial de oocitos
La obtención de los oocitos aquí si se realiza con un protocolo de superovulación, es
decir, se sobre-estimulan los ovarios con hormonas recombinantes u hormonas
obtenidas de otros organismos.

En el ciclo menstrual normal, solo es un oocito (pueden ser 2, pero generalmente es solo
1) el que llega a ser un folículo maduro que es ovulado).

Mediante ecografía se
mide el diámetro de los folículos maduros, y cuando
este diámetro es >18 mm se realiza la denominada
punción ovárica, que consiste en introducir una
aguja asociada a una sonda ecográfica a través de la
vagina. Aquí la aguja debe llegar hasta el ovario, y
cuando esta llega al folículo se aspira (puesto que la
aguja y la sonda se encuentran asociadas a una
jeringa), de esta manera se aspira todo el
contenido del folículo, en donde se encuentra el
oocito (con las células del cúmulo ooforo y la corona
radiata), todo lo aspirado es recogido en un
tubo (este es enviado al laboratorio de embriología).

En el laboratorio de embriología lo que se hace, es localizar los folículos y se

procede a realizar el pelado de los oocitos, que consiste en eliminar las células
foliculares [1] y dejar al oocito despejado [2], para así incubarlo junto a los
espermatozoides.

Estos productos se disponen mediante microgotas en un cultivo celular, y todos

los oocitos deben presentar un corpúsculo polar. Cuando estos últimos son
ovulados se progresa en la primera división meiótica y se produce un corpúsculo
polar, que es el que contiene algunos grupos de cromosomas y el resto queda en
el citoplasma del oocito.

La presencia del corpúsculo polar indica que el oocito es maduro, para esta primera fase de ovulación.

En la imagen [2] se representa un oocito que se encuentra detenido en la segunda etapa de división meiótica a la espera
de ser fecundado.

- Obtención de espermatozoides
En paralelo a la obtención de los oocitos, se realiza la recuperación espermática. Una vez
obtenidos, se adicionan a través de microgotas, tanto los espermatozoides como el
oocito a una placa de cultivo.
En cada gota solo hay un oocito con una cantidad de espermatozoides que va de 50 mil a
100 mil por ml, y en las microgotas hay alrededor de 15 µl como máximo.

Todo esto va recubierto en un … (se corta) ... (probablemente decía que se recubría en
una placa Petri), etc., hasta el día siguiente.

Al día siguiente hay que ver si se aprecian dos pro-núcleos [1] (uno corresponde al oocito y el otro al espermatozoide) o
bien, si se observan 2 corpúsculos polares (uno que correspondía a la ovulación y el otro es el que se produce tras la
fecundación), lo que representa que ya se completó la meiosis del oocito.
La presencia de estas estructuras es indicativo de un oocito fecundado, es decir, de un cigoto en estado de célula.

Nuevamente dependerá del criterio del centro de reproducción si se espera hasta que el cigoto se divida en dos células
(generalmente es lo que se hace).

A criterio del médico tratante se puede dejar el ovocito hasta que se divida en dos células (por norma se hace siempre) o
hasta que llegue al estado de blastocito (6 días de incubación) para que se trasfiera a la paciente.

Fecundación “in vitro” de erizos de mar

Link: https://www.youtube.com/watch?v=LbThw1Te35Y

- Con la inyección de un compuesto químico se induce

la ovulación de la hembra generando millones de
óvulos. De igual manera el macho libera los
espermatozoides.

- El medio de cultivo es agua de mar

- Cuando ocurre la fecundación se produce un engrosamiento de la cubierta gelatinosa
que es equivalente a la zona pelúcida (->). Eso da cuenta de que el ovocito ha sido
fecundado por un espermatozoide.

- Se ve la división de las blastómeras hasta que se forma las blastulación y grastulación

- Se observan las larvas llamadas plúteos del erizo de mar.

- Metamorfosis de la larva para formar el erizo joven

Inyección intracitoplásmica de espermatozoides (ICSI)

Cuando la inseminación artificial y la fecundación in vitro fallan y hay sospecha de que existe una alteración del semen o
que hay muy pocos espermatozoides se recurre a la inyección intracitoplásmica de espermatozoides o ICSI.

ICSI consiste en tomar un espermatozoide e inyectarlo en el citoplasma del ovocito.

Se recomienda en:

- Patologías masculinas
- Arrepentimiento de vasectomía: al ocurrir la recanalización por algún motivo no se produce un número
suficiente de espermatozoides.
- Problemas, por ejemplo, la movilidad de espermatozoides

Procedimiento según video:

- Se toma el ovocito con un solo

corpúsculo polar (O} y se succiona
con una pipeta de vidrio para
mantenerlo fijo (->).
- Se toma un espermatozoide con
una aguja de vidrio con bisel (->).
El espermatozoide debe cumplir
con algunos criterios, por
ejemplo, forma normal y sin
alteración en la cola y cabeza.
- Se pincha el ovocito con la aguja que contiene el espermatozoide. Generalmente se introduce la aguja lo más
alejado del corpúsculo polar, pues el contenido de cromosomas del ovocito se encuentra cercano a este y se
puede estropear con el pinchazo de la aguja.

Una vez que se ha pinchado, se aspira citoplasma del oocito y luego se vuelve a introducir. Junto con el citoplasma se
introduce el espermatozoide previamente cargado, el cual queda en el interior (O) y se retira la aguja.

El oocito con el espermatozoide en su interior se deja en condiciones de

cultivo hasta el día siguiente, a la espera de verificar que se produzca el
segundo corpúsculo polar y se desarrolle el pronúcleo del espermatozoide.

En este caso, siempre se lleva a un estado de blastocisto porque el solo

pinchazo puede activar el citoplasmo del oocito y provocar al menos la
primera división de las blastomeras hasta dos células. Si no hay
fecundación, esa división no debe progresar, por tanto, al tercer día
seguirán siendo dos y así.

Estas son las tres técnicas básicas que se ocupan para intentar solventar los problemas de fertilidad:

- Inseminación artificial
- Fecundación in vitro
- Inyección intracitoplásmica de espermatozoides (ICSI)

Si no hay posibilidad de obtener un semen óptimo, o si el paciente es azoospérmico o tiene alguna alteración
importante, se ofrece la posibilidad de utilizar semen de donante o en caso de que la calidad oocitaria sea muy mala,
también se ofrece la oportunidad de obtener oocitos de una donante.
Luego están las técnicas similares (en cuanto a obtención de material) para hacer el diagnóstico pre implantacional.
Obtener una blastómera para analizar algún gen o posible mutación de la cual se tenga sospecha.

Preguntas

1) ¿El análisis de la morfología se hace con los espermatozoides fijados?

R: Sí, lo que se hace es poner una gota de semen en un porta, un frotis, que se deja secar, se fija y se tiñe con un
colorante de hematoxilina y uno de eosina. Se venden como colorantes rápidos (No está seguro de que sean
hematoxilina y eosina, pero tiñen las mismas estructuras). Se sumerge la preparación 30 segundos en cada uno, se seca y
ya está.

2) En la recuperación espermática ¿Hay alguna razón especifica por la que el tubo tiene que estar inclinado?
R: Sí, esto se hace para aumentar la superficie del líquido y para que de algún
modo disminuya la distancia entre el pellet y la superficie. Esto permitiría que
lleguen más espermatozoides (si es que hay suficientes) en buenas condiciones.
La decisión de hacer un swim-up tiene que ver con el valor y el diagnóstico que se
obtenga del espermiograma previo. Si todo es normal, y los valores de movilidad y
concentración son altos, siempre se escoge esta técnica. Es más cómodo, rápido y
eficiente.

Si no son normales, pero están cercanos a la normalidad, o son normales pero no tan
abundantes se realiza un gradiente (elimina o impide que ciertos espermatozoides
progresen).