11: INTRODUCCIÓN A LA CITOMETRÍA DE FLUJO

La técnica de citometría de flujo lo que hace es analizar determinadas características de partículas

(no solo se pueden analizar células, si no también otro tipo de partículas con un determinado
tamaño).

¿QUÉ ES LA CITOMETRÍA DE FLUJO?

Método analítico por el que se mide la dispersión de luz y la emisión de múltiples fluorescencias
por parte de células o partículas microscópicas (0.2-150 µm), las cuales van a ser analizadas por su
paso secuencial mediante una corriente líquida laminar, en donde son presentadas de una en una
y a gran velocidad (hasta miles de células/segundo) frente a un haz de luz láser de longitud de
onda adecuada.

Un citómetro de flujo está formado por tres sistemas:

- SISTEMA DE FLUIDOS
- SISTEMA OPTICO
- SISTEMA ELECTRONICO

¿CÓMO FUNCIONA UN CITÓMETRO DE FLUJO?

El sistema de fluidos toma la muestra y la hace circular a través de un circuito. En esta circulación
secuencial de las partículas, estas van a incidir, en una determinada zona, sobre la luz de un láser
(El citómetro del ejemplo es más complejo y tiene 2, pero generalmente tienen 1). Esta incidencia
es la que generará una distorsión del láser y por tanto cambios en la luz del láser que permitirán
hacer unos análisis en concreto. Y en caso de que las partículas estén marcadas con fluorescencia,
además se puede generar la emisión de fluorescencia. Todo el fenómeno de dispersión de luz y la
posible generación de fluorescencia forman parte del sistema óptico. Toda la información
asociada al sistema óptico se va a transformar en información electrónica mediante el sistema
electrónico, la cual posteriormente se va a informatizar y va a permitir el procesamiento de la
señal y el análisis.

Resumen:

1) Fluidos: Enfoque hidrodinámico.

2) Óptica: Direccionamiento de luz láser y de señales luminosas, conversión
óptica/electrónica.
3) Electrónica: Amplificación de señales, conversión analógica/digital.
4) Informática: Procesamiento, presentación y análisis de datos.

Entonces, en el citómetro ocurre lo siguiente:

Primero, se tiene un conjunto de partículas de la muestra en el fluido, se tiene que conseguir que
pasen de manera secuencial de una en una. En este paso, en una determinada zona, inciden sobre
el rayo de luz del láser, lo cual puede generar unos cambios en ese rayo de luz. Estos cambios son
los que serán analizados y cuyos datos se obtendrán desde el citómetro. Los datos entonces
estarán relacionados con la dispersión de luz del rayo láser y con una posible emisión de
fluorescencia (no siempre la partícula está marcada con fluorocromos).

 Células en suspensión mono-dispersa.

 Flujo laminar mono celular.
 Intersección de un haz laser.
 Características ópticas:
- Dispersión lumínica
- Fluorescencia
 Colecta la señal y digitaliza.
 Separa (Cell sorter) y/o analiza (analizador) las
células.

SISTEMA DE FLUIDOS

Se tiene una muestra con un conjunto de células, estas serán tomadas desde la muestra, entrarán
en el circuito del sistema de fluidos y en una determinada área (sensing area) van a incidir sobre el
rayo de luz del láser, en este momento se genera la información de cada una de las partículas.

Los equipos permiten que uno regule la presión con la cual hacer fluir las partículas. A mayor
presión, se toman mas partículas en el mismo tiempo, pero la resolución es menor. Cuando la
presión es baja, el flujo de partículas es más lento pero la resolución es más alta.
SISTEMA ÓPTICO

Inyección de la muestra y cámara de flujo

Fenómeno que se produce en el momento en que la partícula incide sobre la luz del láser:

La partícula en un determinado momento y en su fluir a través del sistema líquido, incidirá sobre la
luz del láser, provocando diferentes efectos:

- Difracción de la luz: se produce una desviación pequeña de la luz del láser

- Reflexión/refracción de la luz: se produce una desviación mayor en cuanto al ángulo de
desviación.

Esquema:

El sistema de fluido atraviesa

verticalmente (Flow cell) y el láser de
manera horizontal.

Los efectos sobre la difracción de la luz

se determinan en un sensor (Fs sensor)
llamado Forward Scatter

La refracción y la reflexión de la luz se

determina mediante una serie de
detectores colocados
perpendicularmente respecto a la zona
de incidencia del láser, el primero de
los cuales corresponde al Side Scatter. Dispersión de la luz
Los otros detectores que le siguen
determinarán si la partícula a analizar generó, al incidir el láser sobre ella, fluorescencia o no en
diferentes longitudes de ondas.

- FSC (Forward Scatter): Este sensor determina, según los efectos provocados, la medida y la
superficie de la partícula o célula.
- SSC (Side Scatter): determina la complejidad o heterogeneidad de la partícula
Efecto de la incidencia del láser en la célula

Forward Scatter

- Difracción
- Detectada en dirección frontal en relación al láser
- Proporcional al tamaño celular
- La difracción entregará información sobre el
tamaño celular

Side Scatter

- Refracción/reflexión
- Detectada en un ángulo de 90° en relación al láser
- Proporcional a la granularidad, complejidad y tamaño
- La refracción/reflexión entregará información sobre la
granularidad, complejidad, heterogeneidad y, en parte,
del tamaño de la célula o partícula.
Complejidad hace referencia a la heterogeneidad de la
célula o partícula (+ heterogéneo + complejo).
En el fondo, la complejidad se relaciona con la cantidad
de componentes diferentes que pueda contener la
partícula o célula.

¿Por qué la reflexión/refracción refleja la complejidad?

Lo hace puesto que cada componente diferente generará un fenómeno de reflexión/refracción

diferente. Cuanto más se genere, indicará que hay mayor cantidad de componentes distintos.

Estos procesos determinarán los datos obtenidos en el análisis.

Tanto en el detector Forward Scatter como en el Side Scatter, se obtiene información solo por la
incidencia de la célula sobre el láser. En estos no se detecta nada relacionado con la fluorescencia,
por ende, esto significa que en el citómetro de flujo igualmente se puede obtener información
interesante en ausencia de marcaje con fluorocromos o uso de moléculas asociadas a la
generación de fluorescencia.

A veces se piensa que la citometría necesita del uso de marcadores fluorescentes, lo cual amplía
mucho la capacidad de análisis, pero no es excluyente.

Fluorescencia

La célula/partícula se puede encontrar:

 Marcada con algún anticuerpo asociado a fluorocromos

(no es la única manera de marcar)
  Marcada con alguna molécula que tenga la propiedad de emitir la fluorescencia cuando es
excitada por la luz del láser o por una determinada longitud de onda
 Que esta misma partícula/célula tenga la capacidad de generar fluorescencia a una
determinada longitud de onda, y por lo tanto, se pueda analizar dicha generación de
fluorescencia.

- Detecta en un ángulo de 90°

- Asociado a compuestos fluorescentes:
 Unidos a anticuerpos: (lo más habitual)
 Presentes en las células: puede haber una fluorescencia basal asociada a una molécula
presente en la célula.
 Específicos: DAPI, PI, CFSE. Estas son moléculas que tienen capacidad de unión específica
con moléculas presentes en las células, las cuales permitirán determinar
marcaje/presencia específica de algún componente. Esto en lugar del uso de Ac.
 Proteínas Fluorescentes (GFP, RFP)
- Proporcional al fluorocromo
- Detección simultánea de diversos fluoróforos.
- La fluorescencia es proporcional al fluorocromo
Esto permite medir/cuantificar el efecto que se está produciendo.

- Detección simultanea de diversos fluoróforos

Esta es una de las grandes ventajas del citómetro. Puede detectar diversas longitudes de onda de
fluorescencia emitida a la misma vez, mientras mas complejo es el citómetro, mayor cantidad de
detecciones simultaneas puede realizar en un mismo análisis.

FL1 – Verde

FL2 – Naranja

FL3 – Rojo

FL4 – Opcional

Emisión de fluorescencia y bancada

óptica

Un citómetro básico tiene esta estructura

El fluido (flecha azul) incide sobre el láser, generando distorsión sobre el laser en ese momento,
generando información tanto para el medidor forward scatter como el side scatter. Si la particula a
su vez esta unida a un tipo de fluorocromo puede generar diferentes tipos de fluorescencia,
generalmente asociada al verde, naranja y rojo más un cuarto filtro opcional. Los citómetros más
sencillos solo tienen estas cuatro posibilidades.

Estas fluorescencias se determinan mediante filtros y espejos dicroicos que permiten medir una
ventana discreta en cuanto a la longitud de onda de los distintos tipos de fluorescencia.

Parámetros a medir

En conjunto, a través de la citometría se pueden obtener información de:

- Tamaño relativo (forward scatter)
- Complejidad relativa (side scatter)
- Intensidad de fluorescencia relativa, asociada al marcaje que se puedan realizar respecto a las
células.
- Cuantificar la Frecuencia de eventos
- Recuentos Absolutos del total de eventos sumados por todas las características que se estén
analizando.

Todos los parámetros son detectados simultáneamente para cada una de las células o partículas
que se analicen.

El citómetro los analiza todos, otra cosa distinta es que el investigador solo este interesado en solo
algunos de ellos. Ej: Si se marca con un fluorocromo que se sabe que va a emitir fluorescencia
verde, después no se va a hacer el análisis de la fluorescencia naranja o roja porque se sabe que en
esos canales no debiesen generarse fluorescencia, haciendo solo el análisis de fluorescencia
asociada al verde (igual en el citómetro se genera la información del resto de las fluorescencias,
solo que se ignora).

Cuantificación de las señales

Amplificación de la señales de
fluorescencia

La fluorescencia va a incidir sobre el

sistema, sobre lo que se denomina
fotomultiplicador. En el interior de este lo
que se encuentran son electrones que van
a ser excitados por la fluorescencia y van a
generar un pulso de voltaje, este ultimo es
el que va a cuantificar cada una de las
características de las partículas/células que
inciden en el equipo.

Ejemplo
Se presenta un ejemplo básico en donde se demuestra que incluso en ausencia de fluorescencia se
puede obtener información importante a través del equipo.

Dispersión de luz

Lo que se ve es solo dispersión de

luz de las partículas que inciden,
pudiendo clasificar una población
heterogénea de células sanguíneas
según dos características:

1. Las determinadas por el forward

scatter – Tamaño.

2. Las determinadas por el side

scatter – Complejidad.

Cuando se representan ambas

informaciones, lo que se obtiene es
lo que se denomina una grafica de dot blot/gráfica de puntos.

En un eje se obtiene la información del forward scatter (tamaño de cada una de las partículas) y en
el eje y la información del side scatter. Cada puntito representa una partícula.

Se genera el gráfico Dot plot o gráfico de puntos.

- En el eje x se tiene el FSC, es

decir, el tamaño de cada una
de las partículas(cada punto).
- En el eje y se tiene el SSC, es
decir, la complejidad.
- El orden de los ejes se puede
cambiar en el equipo.
- Permite al tener una población heterogénea y en ausencia de fluorescencia hacer una
clasificación en base al tamaño y complejidad.

Este da una información general, para mayor especificad se pueden hacer otros análisis,
asociados fundamentalmente a marcajes específicos.

¿QUÉ ES LA FLUORESCENCIA?

La fluorescencia supone la incidencia de luz

sobre una molécula, partícula o célula, la
cual genera una excitación y posterior
retorno a un estado basal que produce la
emisión de luz fluorescente, esta depende
de las moléculas excitadas (espectro de
excitación y emisión).
 1. Un fotón de energía hvEx es absorbido por la molécula fluorescente, creando un estado
excitado con un electrón en singlete (S1').
2. El estado excitado tiene una duración de 1–10 × 10 -9 segundos.
3. Un fotón de energía hvEM es emitido, para devolver la molécula fluorescente su estado
basal S0.

Conceptos esenciales

 Fluorocromo: Molécula capaz de absorber fotones y emitir fotones de menor energía

asociada a fluorescencia (mayor longitud de onda).
 Marcador fluorescente o sonda fluorescente: Fluorocromo diseñado para unirse a una región
específica de una muestra biológica o responder a un determinado estímulo.
 Longitud de onda de excitación: Longitud de onda a la que un fluorocromo puede absorber
fotones y se excita.
 Longitud de onda de emisión: Longitud de onda a la que un fluorocromo emite fotones de
fluorescencia.

Fluorocrómos habituales asociados a Ac

La luz que genera la excitación

corresponde a la luz del o los láser del
citómetro. Los más sencillos tienen un
único laser de generalmente 488nm,
aumentado el n° de láser (3 a 4) según
complejidad del citómetro.

- FITC: isotiocianato de fluoresceína.

- PE: ficoeritrina
- Ficoeritrina + otros componentes.

El espectro de excitación tiene un

máximo cercano a la luz del láser
(488nm), mientras que los espectros
de emisión varían según la molécula.

- En gris se observan las ventanas de los diferentes filtros.

- Se busca generar la excitación y luego diferenciar los espectros de emisión de las diferentes
marcas realizadas. Si los espectros de emisión coinciden, no se podría diferenciar el origen de
la señal, lo que debe ser considerado al preparar los experimentos y análisis posteriores.
Variedad de fluorocromos a
utilizar

- Información más
detallada.
- Longitudes de onda
normal.
- Espectros de excitación en
gris y emisión en negro.
- En base a esto existe la
posibilidad de realizar
mezclas de fluorocromos,
que permitan diferenciar
entre espectros de
emisión.

En base a esto existe la posibilidad de realizar muchas mezclas para determinar diferencias entre
los espectros de emisión.

-Se busca evitar que los espectros de emisión se

solapen y asi evitar información confusa por no poder
determinar de que espectro es la fluorescencia
observada.

-De igual manera los equipos poseen unos correctores

o equilibradores para reducir al máximo el efecto de
solapamiento.

Propiedades de los marcadores fluorescentes

Si bien se suele asociar la fluorescencia a anticuerpos existe una serie de marcadores fluorescentes
que generan reacciones especificas con algunos tipos de moléculas a nivel celular y que pueden
ser utilizados en citometría.

Algunos de estos son:

 Queladores de iones fluorescentes.

 Indicadores de pH fluorescentes.
 Tinciones que permiten determinar
potencial de membrana
  Moléculas que se unen a ácidos nucleicos de manera específica.

Clasificación funcional de los marcadores fluorescentes

 Moléculas con reactividad química

-Anticuerpos conjugados con fluorocromos: Son los más típicos. Tienen una reactividad
especifica y van a marcar de la misma forma a lo que se unan.

 Moléculas con especificidad estructural

-Hoechst
-DAPI
-Yoduro propidio
-Naranja acridina

 Indicadores y quelantes de iones

-Fluo-3
-Fura-2
-Dihidrorodamina
-Diclorofluoresceina

 Sustratos de enzimas y transportadores

 Macromoléculas y polímeros sintéticos
 Fluorocromos intracelulares naturales

Mientras se tenga un marcador especifico que pueda ser excitado por los laser del citómetro y que
emita en longitudes de ondas que sean captados por el quipo podremos utilizar esta técnica para
realizar distintos análisis.

¿Cómo funciona un citómetro de flujo?

En los fotomultiplicadores la luz
fluorescente va a generar una corriente
que será amplificada a un voltaje que
posteriormente va a ser transformado en
un dato.

Esto supone una cuantificación del

voltaje por lo que:
  A mayor voltaje Mayor señal será graficada.

Este dato sirve tanto para los fenómenos asociados a la dispersión, refracción o reflexión de la
luz que están ligados al FSC y al SSC como para los fenómenos ligados a la fluorescencia.

Esto indica que el equipo puede cuantificar todos los fenómenos anteriormente mencionados
de manera exacta.

El profe se salta esta imagen.

Los diferentes pulsos de voltajes generados por cada una

de las señales se irán cuantificando para obtener un
histograma.

En este histograma se tendrán los distintos valores de

voltajes y en el Eje Y se tendrá el número de partículas que
han dado el valor de voltaje específico.

A partir de esto se puede tener una clasificación de la

distribución según la intensidad de la señal.

Esta es una de las maneras de representar los datos en forma de histograma, en ese caso lo único
que se analiza es un único análisis, un único paramento. Si uno quiere analizar dos parámetros a la
vez lo que se hace es obtener dos pruebas, con un gráfico de puntos, donde cada uno de los ejes
representa uno de esos análisis.

Como se puede ver en cada uno de los ejes uno puede hacer su respectivo histograma.
Los dos Plots que se observan se pueden hacer un poco más bonitos, representando en base a la
densidad de puntos, mayor o menor y dar este tipo de representación que es un poco más
intuitiva, ya que está diciendo donde hay mayor o menor densidad fundamentalmente,
información un poco más concreta, pero en el fondo sigue siendo una información basada en el
Plot, respecto de ambos marcadores.
La determinación de marcadores se determina en el equipo, si uno quiere ver por ejemplo el filtro
uno, o el filtro verde, rojo, etc. Eso lo determina uno dependiendo de la necesidad y del interés.

Además el equipo va a permitir generar lo que se denomina ventanas, como las que se ven en la
imagen, para analizar exclusivamente zonas dentro de los datos. Puede ser dentro del dot plot,
para tener datos específicos. Son ventanas o rangos, en el caso de los histogramas para obtener
datos específicos de esas subpoblaciones dentro del histograma.
Eso igual se va viendo cuando iniciemos el software y hagamos los análisis

Acá tenemos diferentes equipos, algunos más antiguos y otros más nuevos, el que está en rojo es
que el que en principio utilizamos, aunque en esta ocasión solo lo veremos en la imagen.
¿Qué se puede analizar por un citometro de flujo?

Ahora veremos que se puede

analizar en un citometro, lo
cual es todo aquello que
podamos marcar. Incluso sin
marcaje se pueden hacer
análisis, pero el marcaje
posibilita analizar una mayor
cantidad de cosas, entonces
todo aquello que podamos
marcar a diferentes niveles,
desde niveles moleculares,
subcelular, celular y
supracelular.

El tamaño esta entre 0,2 y

150mil aproximadamente.

Parámetros nucleares

Podemos analizar diferentes parámetros de ácidos nucleicos, bases del ciclo celular, apoptosis o
necrosis, expresión génica, regulación del ciclo, etc. Todo ello asociado a diferentes tipos de
estudios y diferentes moléculas sobre esas expresiones, cuantificaciones, procesos a estos niveles.

Parámetros citoplasmáticos

A nivel citoplasmático es similar, se pueden hacer procesos de biosíntesis, degradativos, muerte

celular etc.
Siempre y cuando tengamos la capacidad de marcar de manera específica un proceso o una
determinada molécula o proteína

A nivel de la superficie celular...

Parámetros de superficie:

A nivel desde la superficie celular a algo similar. Podemos ver diferentes procesos como: Adhesión
celular, Interacción célula-célula, Diferenciación celular. Y luego acción de fármaco, fenómenos de
lesión de membrana, activaciones celulares y todo tipo de proteínas de membrana. (el profe no
explico nada más de esta diapositiva...min 44).

Parámetros extracelular:
E incluso a nivel extracelular, podemos determinar parámetros. Determinar parámetros asociados
a la liberación de moléculas a un exterior como: Proteínas secretadas entre ellas diferentes
citoquinas, quimioquinas, etc. (lo mismo no explica nada mas en esta diapositiva)

En esta tabla tenemos un pequeño resumen de los distintos parámetros que nosotros podemos
analizar, tanto a nivel de superficie, citosólica, a nivel nuclear. Evidentemente no están todos, pero
se resume básicamente en todo aquello que se puede analizar en función, fundamentalmente, en
ensayo bioquímicos.

Cuando usamos anticuerpos el listado evidentemente se amplía a un libro completo, porque ahí
depende, simplemente de la posibilidad de disponer de un anticuerpo especifico contra una
determinada estructura.

Aplicaciones clínicas

A nivel clínico, estos equipos tienen bastante relevancia, pero desde el punto de vista de
investigación tienen un uso restringido asociado a que, solo se utilizan a nivel clínico
fundamentalmente para el análisis de células de origen hematopoyético. Porque, en el fondo ahí
existe un problema para el uso en tejidos, porque hay que disgregar los tejidos y eso genera una
serie de modificaciones a nivel de la célula que implican que la información obtenida tenga algún
parámetro modificado.

Pero a nivel de lo que estábamos viendo, a nivel de las células hematopoyéticas se pueden
estudiar todos los parámetros que hemos visto: tamaño, complejidad, función, activación, estado
proliferativo, estado de maduración, eso a nivel general.

Identificación y caracterización de células normales:

1. PARAMETROS ESTRUCTURALES:
 Tamaño
 Complejidad
2. ANTIGENOS DE SUPERFICIE:
 Identidad
 Linaje
 Función
 Activación
3. ADN, ARN Y PARAMETROS RELACIONADOS:
 Ploidía
 Estado proliferativo
 Estado de maduración
 Expresión génica
4. BIOQUIMICA INTRACELULAR:
 Condiciones basales
 Respuesta bioquímica a estímulos controlados

Identificación y caracterización de células anormales:

Entrando fundamentalmente a nivel oncológico, por ejemplo, identificación y caracterización de

células anormales asociado a la capacidad que tiene el equipo de cuantificar. Entonces se ha
utilizado mucho para estudiar poblaciones que tienen frecuencias muy bajas, pero que tienen
características anormales y genotipar esas poblaciones para detectar sobre todo células tumorales
circulantes.

1. ALTERACIONES EN LA MORFOLOGIA CELULAR:

 Cambios en tamaño
 Cambios en granularidad
2. ALTERACIONES EN EL INMUNOFENOTIPO:
 Inmunoproliferación/ Inmunodeficiencia
 Inmunodisfunción
3. ALTERACIONES EN EL GENOTIPO:
 Cambios en el contenido de ADN (ploidía)
 Cambios en la expresión de genes
4. ALTERACIONES EN LA BIOQUIMICA INTRACELULAR:
 Cambios en la síntesis y concentración de moléculas
 Cambios en la actividad de enzimas y en el flujo a través de rutas
  Alteraciones en el número y la función de orgánulos subcelulares
 Cambios en la respuesta bioquímica a estímulos controlados

5. DETECCION DE CELULAS INFRECUENTES (“CELULAS RARAS”)

 Detección de células tumorales circulantes
 Detección de células fetales en sangre materna
 Detección de células activadas o antígeno-específicas circulantes

Algo que nos quiere dejar claro el profesor (y que nos dijo al principio), es que, el equipo no solo
puede utilizarse o la técnica en sí, de la citometría de flujo, no solo puede utilizarse para el análisis
de células, puede utilizarse para el análisis también de otras partículas. De hecho, la citometría de
flujo es relevante en determinados análisis medio ambientales, ya puede ser desde partículas en el
aire y también a nivel de partículas en el agua. Además, no solo de partículas, sino también de
todo lo que seria los microorganismos.

Ejemplos de obtención y análisis de datos en citometría de flujo

Ahora vamos a ver una serie de

ejemplos y análisis concretos en los
que se usa habitualmente la
citometría de flujo.

La técnica en el fondo permite realizar

análisis para diferenciar poblaciones
heterogéneas celulares, siempre y
cuando, yo tenga la capacidad de usar
diferentes marcadores específicos para cada una de esas poblaciones celulares y, pueda marcar
cada una de las poblaciones con fluorocromos que luego no me coincidan en la emisión de
fluorescencia, esta puede ser un poco la mayor limitación, dependiendo sobre todo del equipo.

Ciclo celular

Vamos a empezar por análisis muchos más básicos como, por ejemplo, el citómetro me permite
analizar la frecuencia de una población celular, en que fase del ciclo se encuentra.

Primero la base de todo ello es que, el contenido del DNA en las diferentes fases del ciclo en una
célula es diferente. El contenido de DNA en una célula que está en fase:

 G0-G1 lo podemos determinar como 1.

 En la fase S tendríamos un contenido entre 1 – 2
 En la fase G2, antes que se produzca la división celular, tendremos
u contenido de 2

Por lo tanto, si pudiésemos marcar con una molécula el DNA, esto

mediante la excitación de estas moléculas y posterior emisión de
fluorescencia, se podría determinar en que etapa del ciclo se encuentra
cada una de las células.

En la imagen se observan diferentes células marcadas con un agente

intercalante fluorescente denominado yoduro de propidio, este identifica
y tiñe ácidos nucleicos en las células, por lo tanto, permite cuantificar la cantidad de DNA que hay
en cada una de las células.
Luego de ese análisis se obtiene un histograma como el de la imagen, en este caso, hay una parte
de la población celular en G1, S y G2. Además, es posible cuantificar las células que están en
apoptosis, como se ve en la imagen anterior, estas células generan unos cuerpos apoptóticos de
tamaño menor a una célula normal y, por lo tanto, en el grafico se observa una cantidad menor de
DNA (subG1 o G0). Por debajo de la cantidad de G0 y G1,
también se puede observar que hay células en apoptosis
(entre los picos de subG1 y G1).

Lo anterior también se puede observar en la comparación

entre el control y células tratadas con una concentración de
algún fármaco. Imagen de gráficos 

Muerte celular

Otro análisis que se puede realizar y es relativamente sencillo, pero implica un análisis de dos
parámetros, es la determinación de la muerte celular en una población. Para realizarla también se
ocupa el yoduro de propidio y un marcador de apoptosis que es la Anexina V.

La Anexina V es un marcador de apoptosis porque se une a los residuos de fosfatidilserina en la

membrana celular, estos residuos habitualmente se encuentran en la cara interna, sin embargo,
cuando la célula entra en apoptosis esos residuos son expuestos en la parte externa de la
membrana celular y por eso, cuando la célula entra en apoptosis la Anexina V puede identificarlos
y marcarlos. Esto ocurre cuando hay apoptosis temprana (imagen 2)

Célula normal Apoptosis temprana Apoptosis tardía

El yoduro de propidio (PI) se utiliza porque, cuando pasa el tiempo en la apoptosis ( apoptosis
tardía) o en los fenómenos de necrosis la membrana celular se permeabiliza y, por lo tanto, el
yoduro de propidio va a poder entrar a la célula y así marcar al DNA.

1 2 3
En el equipo se puede medir debido a la emisión de fluorescencia del yoduro de propidio (rojo) y la
de Anexina V (verde, porque tiene asociado el FITC). Entonces cuando se hace el marcaje se puede
generar una grafica donde se tiene, por un lado, la fluorescencia asociada a Anexina V-FITC y por
otro lado, la fluorescencia de PI (imagen).

Además, en la grafica, se pueden generar 4 regiones (3 importantes):

1- Células vivas (viables)  Presenta baja fluoresencia para Anexina V y para PI

2- Células con apoptosis temprana  Presenta elevada fluorescencia para Anexina V, pero
baja para PI
3- Células con apoptosis tardía o necrosis Presenta elevada fluorescencia para ambos
marcadores (Anexina V y PI)

Al romperse la membrana, la Annexina 5 también podría unirse a fosfatidilserina, aunque esta se

encuentre en la parte interna de la membrana.

De esta forma, con el doble marcaje se puede diferenciar en qué proceso se encuentra una
determinada población celular. Y en base a esto, ver el efecto que produce un determinado
compuesto/fármaco o una determinada acción sobre estas células, es decir, si induce la muerte
celular o no.
Hay que recordar que, solo viendo el marcaje con yoduro de propilo, también se podría
determinar la apoptosis, en base a la aparición de este peak (o), que se encuentra por debajo a lo
que correspondería al ciclo celular (G0, G1).

por debajo, con un tamaño menor, por debajo de la de lo que seria el ciclo celular g0 g1.

ESTRÉS OXIDATIVO / MITOCONDRIA

Otro tipo de análisis que puede realizarse con el equipo es analizar el estado oxidativo de las
células, y también analizar el fenómeno de estrés oxidativo asociado a la mitocondria. Para esto
existen diferentes tipos de
moléculas:

Tetrametillrodaminas

Fundamentalmente estas sondas tienden a atravesar la membrana

mitocondrial y almacenarse en la matriz mitocondrial. Esto cuando
el potencial de membrana mitocondrial está intacto, es decir, no ha
sido afectado por ningún tratamiento, o ningún proceso celular.
Entonces en base a esto, podemos analizar la fluorescencia asociada a estas sondas, y ver como los
cambios en la fluorescencia indican los cambios que ocurren en el potencial de membrana de la
membrana mitocondrial. Estos cambios generalmente suelen estar asociados a fenómenos de
estrés oxidativo.
Contro C6-cer
l 1h

C6-cer
C6-cer
4h
2h

C6-cer C6-cer
6h 16h

La ceramida reduce el potencial de la membrana mitocondrial

Esto es lo que se representa en los gráficos anteriores. En el eje “x” es la intensidad de

fluorescencia (IFF) de rodamina 123.

En este experimento se utilizó un control, que corresponderían a células que no fueron tratadas
con un determinado compuesto asociado a ceramida, y se utilizaron células que fueron tratadas
con este compuesto durante diferentes períodos de tiempo.

- CONTROL: Aquí podemos observar que el control presenta una determinada IFF asociada a la
presencia de rodamina 123 en la matriz mitocondrial.
- C6-cer 1h: Cuando las células fueron tratadas con el compuesto asociado a ceramida, se observa
que existe una disminución en la fluorescencia asociada a la mitocondria de células normales
 (peak más alto) no afectadas, y un aumento de la fluorescencia asociada a aquellas mitocondrias
en las que se afectó la permeabilidad de su membrana (peak más bajo).
Al modificarse la permeabilidad de la membrana mitocondrial, ocurre que la sonda que se
encontraba en la matriz de este organelo comienza a salir de este, quedando en el citoplasma de
las células. Y la presencia de la sonda en el citoplasma, genera que exista una disminución de la IFF
en estas células, ya que la sonda se encuentra repartida en un mayor espacio.

Esto indicaría que este compuesto asociado a la ceramida afecta la permeabilidad de la

membrana mitocondrial, afectando con ello, el estado oxidativo de las células.

ENSAYO MULTIPARAMÉTRICO

A través de la citometría de flujo se pueden

realizar análisis multiparamétricos, asociados a
un determinado número de marcajes.

Cuando podemos marcar dos parámetros, se

pueden obtener 4 poblaciones. Cuando se tienen
3 parámetros, se pueden obtener 8 poblaciones,
y así sucesivamente va a aumentar el número o la
cantidad de información que se puede obtener
respecto a una misma población de células

ENSAYO MULTIPARAMETRICO

Una de las dificultades, a medida que va aumentando el número de parámetros que se quiere
analizar, es conseguir que cada parámetro sea marcado con un fluorocromo cuya emisión de
fluorescencia se pueda identificar de manera específica.
Conforme aumenta el número de posibles parámetros, o en este caso posibles tipos celulares que
se quiere diferenciar, se va a necesitar que el equipo tenga mayor potencia, mayor número de
láseres y de filtros de fluorescencia.

MULTIPARAMETRIC ASSAY

Análisis potencialmente poderoso para el estudio de los efectos biológicos inducidos por
fármacos, etc. en células diana.

Dentro de una misma muestra no se podrán obtener gráficos de más de dos parámetros a la vez,
pero si se pueden obtener múltiples gráficos de dos parámetros para una misma muestra. Esto
permitirá obtener la información completa de una misma (única) muestra.
En la imagen inferior se muestra lo dicho anteriormente. Se observan los distintos análisis que se
realizaron a la vez en una misma muestra. Este citómetro tiene 4 láseres y 9 marcajes distintos.

El análisis de toda esta información no se puede realizar como un análisis de dos parámetros, por
lo que se utiliza un software para integrar todos los datos.

Este equipo de alto costo (500 millones aprox.) permite hacer análisis complejos para entregar una
gran cantidad de información respecto a una única muestra.

El valor de esto es que, al analizar múltiples parámetros dentro de una misma muestra, se pueden
hacer asociaciones entre ellos.

VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA EN APLICACIONES FUNCIONALES

- Acceso no invasivo a parámetros celulares (Análisis no invasivo).

- Múltiples procesos funcionales analizables.

- Análisis multiparamétrico.

- Integración de respuestas y mecanismos.

- Análisis de un gran número de células.

Analizan al menos 10.000 células, para que todos los datos obtenidos sean estadísticamente
significativos. Permite hacer una cuantificación significativa que no permite la microscopia.
Actualmente hay citómetros que muestran imágenes de cada una de las células que han sido
analizadas, con esto se convierten en unos mini microscopios.

- Resolución de heterogeneidad celular.

- Selección fenotípica de subpoblaciones.

PUNTOS CRÍTICOS (DESVENTAJAS)

- Preparación de suspensiones unicelulares a partir de poblaciones de células adherentes.

- Mantenimiento de la viabilidad celular a lo largo del período experimental.
- Aislamiento de elementos subcelulares de células y tejidos.
- Reajustar las condiciones para el análisis subcelular.
- Identificación de células pequeñas y partículas del ruido de fondo.
- Retención adecuada de sustratos y sondas.
- No interferencia de sondas con funciones celulares.
- Selección adecuada de ventanas de tiempo para ensayos cinéticos.
- Calibración del ensayo para la expresión de datos en unidades absolutas.

Las poblaciones de células adherentes deben ser despegadas para ser analizadas, lo que en una
ventana de tiempo muy larga puede provocar distorsiones en las funciones celulares de las células
adherentes.

Además, algunas ventanas de tiempo generan problemas en la viabilidad celular.

El análisis de tejidos va a significar una disgregación de estos y, por lo tanto, una pérdida del
contexto tisular que generará modificaciones en determinados parámetros.

En general las ventajas son mayores que las desventajas.