UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA

DATOS INFORMATIVOS:

• Facultad : Ciencias

• Curso : Bio Informática

• Ciclo de estudios :V

• Semestre Académico : 2021 - I

• Docente Responsable : Sandoval Peña Gustavo

DATOS DE LOS RESPONSABLES:

▪ Apellidos y Nombre :

✓ Basilio de la Cruz Cynthia Rosaline

✓ Meléndez Vargas Julio
✓ Otiniano Jiménez Patricia

Chimbote, 17 de Julio del 2021

 Práctica 10: Análisis Filogenético de Secuencias Nucleotídicas

1. Introducción

El conocimiento de la biodiversidad es un factor de gran importancia ya que

permite comprender su funcionamiento e integrarla en el uso y el desarrollo
sostenible de la humanidad. Además, la rápida disminución de especies en el
mundo, pone en riesgo las principales fuentes hídricas, alimenticias y
medicinales. La falta de información sobre el número exacto especies
mundialmente es debido a la falta de exploración en ciertas áreas del planeta, a
la escasez de estudios taxonómicos en algunos grupos biológicos, y a la
dificultad que representa la identificación morfológica de algunos organismos,
(Paz et al., 2011).

La filogenia estudia las relaciones evolutivas. Un análisis filogenético además de

indicar relaciones evolutivas entre secuencias o especies, los cuales descienden
de ancestros comunes, también indican cuales son las distancias entre ellas. Los
métodos de reconstrucción filogenética más habituales asumen que todas las
secuencias o especies provienen de partir un ancestro común mediante
bifurcaciones. (Catalán Rodríguez, 2001).

La filogenética es la ciencia de construir y evaluar hipótesis acerca de los

patrones históricos de descendencia en forma de árboles evolutivos que ha
dejado de ser exclusiva de la taxonomía. Desde hace unos años, se han utilizado
métodos de reconstrucción filogenética para localizar el origen de una
enfermedad en particular, determinar que cepas poseen mayor posibilidad de
propagación en el futuro, o para distinguir entre distintos tumores cancerígenos.
(Gregory, 2008)

Los árboles filogenéticos se pueden construir a partir de alineamientos múltiples

de secuencias. Asumiendo que cada posición en el alineamiento es homóloga.
Por lo tanto, construir un buen alineamiento es esencial para la resolución del
árbol. La edición manual de los alineamientos es habitual para conseguir el mejor
posible. La mayoría de los programas de alineamiento nos dan una solución
subóptima (la mejor posible utilizando pocos recursos del sistema), por lo tanto,
resulta conveniente revisar los alineamientos antes de realizar los árboles.
(Eguiarte E., Souza, Nuñez Farfán, & Hernánde Baños, 1997).
El gen mitocondrial citocromo oxidasa I (COI) es la subunidad principal del
complejo citocromo C oxidasa (complejo proteico transmembrana o complejo
respiratorio IV), se encuentra en bacterias y en la mitocondria de eucariotas, es
la última enzima en la cadena de transporte de electrones respiratorios y a
menudo se usa como un código de barras de ADN para identificar especies
animales debido a que tiene una alta tasa de sustitución, presentando variación
de la secuencia entre especies del mismo género (Hebert et al., 2003a; Hebert
et al., 2003b; Luo et al., 2011).

El gen COI se considera una región que está evolucionando relativamente rápido
a nivel nucleotídico (CATERINO , REED , KUO, & SPERLING , 2001)

El gen COI del mtDNA puede utilizarse con éxito para la identificación de
especies de aves de América del Norte (Hebert et al., 2004), y muchos otros
vertebrados (Vilaça et al, 2006; Clare et al, 2007

Los códigos de barras de ADN proporcionan un método estandarizado de

identificación de especies a través del uso de secuencias cortas de la región
citocromo oxidasa I del genoma mitocondrial, haciendo un trabajo importante en
los sectores económico, de salud, agropecuario y ambiental, ya que condiciona
las medidas de gestión asociadas a epidemias, plagas e invasiones biológicas.
(MONTENEGRO GOMEZ, 2018)

Con el desarrollo tecnológico y la acogida de técnicas de secuenciación, el ADN

se ha convertido en una nueva fuente de información para aclarar relaciones
evolutivas. Las huellas de un análisis comparativo de secuencias nucleotídicas
actualmente son comunes en todas las áreas de las ciencias biológicas.
Permitiendo evaluar relaciones biológicas utilizando secuencias de mtDNA.
(Tibayrenc, 2005)

El proyecto código de barras de la vida se presenta como una herramienta de

identificación taxonómica de especímenes para declarar especies crípticas,
busca una cobertura completa de las especies y ocupa una posición intermedia
entre los análisis de filogenia molecular y genética de poblaciones que se venían
realizando anteriormente. (Hajibabaei, Singer, Clare, & Hebert, 2007)

Las secuencias de códigos de barras de especímenes que no coincidan con

ninguna especie presente en la base de datos de referencia pueden indicar que
la base de datos está incompleta o que posiblemente se trata de una nueva
especie. Los códigos de barras pueden revelar divergencia genética muy alta
 dentro de una misma especie putativa sugiriendo la existencia de especies
crípticas.

Las técnicas de identificación por ADN y código de barras para la vida usando el
gen mitocondrial citocromo oxidasa I (COI) como secuencia base para la
identificación de especies animales, permiten lograr resultados en corto tiempo,
garantizan la identificación de especies. (Ratnasingham & Hebert, 2013)

2. Métodos

Los programas utilizados para el análisis filogenético de la práctica fueron:

- Chromas: Es un visor de seguimiento libre para proyectos de secuenciación de

ADN simples que no requieren el montaje de múltiples secuencias.

- BioEdit: es un editor de alineación de secuencias biológicas. Una interfaz de

múltiples documentos intuitiva con características convenientes hace que la
alineación y la manipulación de secuencias relativamente fácil en su ordenador de
sobremesa. Varias opciones de manipulación y análisis de secuencias y enlaces a
programas de análisis externos facilitan un entorno de trabajo que le permite ver y
manipular secuencias con simples operaciones. (Mejor Software, 2021)

- Mega: Software de Análisis de genética molecular evolutiva, es una herramienta

integrada para realizar alineaciones automáticas y manuales de secuencias, inferir
árboles filogenéticos, también extraer datos de la web.
 Figura 1. Diagrama con los pasos para hacer un Análisis Filogenético

La obtención de las secuencias nucleotídicas del gen que codifica el COI se

obtuvieron del programa de base de datos NCBI. Los organismos a buscar su
Árbol Filogenético son 18.

Dentro de estas 18 secuencias, 7 pertenecen al Género Engraulis; 10 son

pertenecientes a la Familia Engraulidae y 1 al género Odontesthes.

Estas secuencias fueron guardadas en un block de notas en formato Fasta.

- Las secuencias nucleotídicas serán saneadas en el software Bioedit en la
opción alineamiento múltiple Clustal y a la vez editamos las secuencias.
- Las secuencias alineadas se guardan dando click a la ventana
File>>Export>>Sequence Alignment, se guarda en formato Clustal (*.aln).
Esta secuencia se guardará en un block de notas y estará en formato
Clustal.
- Abrimos las nuevas secuencias nucleotídicas en el Software Mega.
Primero convertimos al formato del Programa: File>>Convert File Format
to Mega>>Seleccionamos nuestro archivo anterior y cambiamos el
formato a Clustal*aln>>OK
- En el mismo software Mega se abre la secuencia de formato Mega en la
opción Phylogeny >>Construct/Test Neighbor- Joining Tree. Y nos
aparece el siguiente cuadro. Al dar OK nos mostrará nuestro Árbol
Filogenético.

3. Resultados
Tabla 1. Código de Accesión de Especies y Géneros de Engraulis

Código de
Descripción Longitud
accesión
Engraulis japonicus voucher KTK1 cytochrome
JF952724.1 oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds; 652 bp
mitochondrial
Engraulis anchoita voucher Ea001 cytochrome
HQ167624.1 oxidase subunit I (COI) gene, partial cds; 627 bp
mitochondrial
Engraulis australis voucher BW-1582 cytochrome
EF609349.1 oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds; 655 bp
mitochondrial
Engraulis encrasicolus voucher ADC55.1-2
JF493422.1 cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial 648 bp
cds; mitochondrial
Engraulis eurystole cytochrome oxidase subunit I
FJ918906.1 828 bp
(COI) gene, partial cds; mitochondrial
Engraulis mordax voucher UW:048858
JQ354083.1 cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial 673 bp
cds; mitochondrial
Engraulis ringens voucher PE2016A8-9
KY572865.1 cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial 651 bp
cds; mitochondrial
Anchoa hepsetus voucher USNM:FISH:426143
MT455965.1 cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial 655 bp
cds; mitochondrial
 Engraulis anchoita isolate FARG026-06
EU074422.1 cytochrome oxidase subunit I (COI) gene, partial 627 bp
cds; mitochondrial
Anchovia macrolepidota isolate AAmac5
JQ398447.1 cytochrome oxidase subunit I (COI) gene, partial 580 bp
cds; mitochondrial
Cetengraulis mysticetus isolate ACm2
JQ398441.1
cytochrome oxidase subunit I (COI) gene, partial 580 bp
cds; mitochondrial
Coilia ramcarti isolate 11196 cytochrome c
MN083109.1 oxidase subunit I (COI) gene, partial cds; 634 bp
mitochondrial
Encrasicholina heteroloba voucher BW-A8560
HQ956380.1
cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial 648 bp
cds; mitochondrial
Lycengraulis grossidens voucher LBPV40507
JX124803.1
cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial 652 bp
cds; mitochondrial
Setipinna phasa from Bangladesh cytochrome
MK572592.1
oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds; 652 bp
mitochondrial
Stolephorus indicus voucher BW-A7236
GU674446.1
cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial 652 bp
cds; mitochondrial
Thryssa dussumieri voucher NF52 cytochrome
JX983289.1
oxidase subunit 1 (COI) gene, partial cds; 606 bp
mitochondrial
Odontesthes regia voucher PE2016A8-11
KY572878.1
cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene, partial 638 bp
cds; mitochondrial
Fuente: Elaboración propia
 Figura 2. Cuadro de nuestro Árbol Filogenético

A continuación, se muestra el Árbol Filogenético Engraulis.

 JF952724.1Ejaponicus
100%

EF609349.1Eaustralis
100%

JF493422.1Eencrasicolus
100%
100%
FJ918906.1Eeurystole

100%
JQ398447.1Amacrolepidota

JQ354083.1Emordax
100%
100%
MT455965.1Ahepsetus
100%
JQ398441.1Cmysticetus
100%
JX124803.1Lgrossidens

100% HQ956380.1Eheteroloba

KY572865.1Eringens

100% HQ167624.1Eanchoita
100%
100%
EU074422.1Eanchoita

MN083109.1Cramcarti
100%
100% MK572592.1Sphasa

100%
JX983289.1Tdussumieri

GU674446.1Sindicus

KY572878.1Oregia
4. Discusión
Científicos de la biodiversidad, especialistas en genómica y tecnólogos de más de 50
países están trabajando en conjunto para construir el código de barras de la vida de todas
las especies del planeta y establecer una biblioteca de referencia que será la base para
un sistema de identificación basado en el mtDNA de la vida multicelular (Park , Foottit ,
Maw , & Hebert , 2011)

La base de datos del proyecto Código de Barras de la Vida (BOLD Systems) es un banco
de trabajo internacional en línea que ayuda a la recopilación, gestión, análisis y uso de
códigos de barras de ADN, basado en la comparación de la secuencia que codifica para
la subunidad 1 del gen mitocondrial COI (Hebert, Cywinska, & Ball, 2003)

En la última década, estudios realizados en grupos animales como aves, peces,

mamíferos, lepidópteros, hemípteros y otros insectos han demostrado que el fragmento
COI presenta una variación interespecífica lo suficientemente amplia para permitir una
buena correspondencia entre la identificación molecular y la identificación basada en
caracteres morfológicos de las especies (Hebert et al., 2003c;Park et al., 2011)

La anchoveta peruana ( Engraulis ringens ) pertenece a Engraulidae. Se encuentran

principalmente en el Océano Pacífico sureste cerca de Perú y Chile. Tienen una gran
captura y pueden ser los peces más abundantes del mundo, principalmente para la
industria de harina de pescado. Considerando su valor económico, es necesario obtener
su información molecular, por lo cual se estudió la relación filogenética dentro de
Engraulidae para aporta nuevas ideas a la reproducción de esta. La secuencia completa
del ADN mitocondrial se determinó mediante PCR y secuenciación. La alineación de la
secuencia fue realizada por CodonCode Aligner. Se utilizó el software MEGA 6.0 para
calcular la composición de la base y construir el árbol filogenético. El árbol filogenético se
construyó utilizando el método de unión de vecinos (NJ) basado en los 12 genes
codificadores de proteínas codificados por la cadena pesada de 16 especies de
Engraulidae. El resultado mostró que E. ringens se agrupó primero con Engraulis
japonicus y Engraulis encrasicolus , lo que sugiere una relación muy estrecha de estas
tres especies. (Sun, 2019)
 5. Conclusiones

• Un análisis filogenético no sólo nos indica las relaciones evolutivas entre las secuencias
o especies, cuales descienden de ancestros comunes, también nos puede indicar cuales
son las distancias entre ellas, en esta práctica se aplicó un solo método que es Neighbor-
Joining.
• Los alineamientos múltiples constituyen el primer paso para una cuantificación precisa de
grados de parentesco, ya que permiten obtener una matriz de distancias entre cada par
de secuencias, medidas en número de sustituciones. A partir de la matriz de distancias
se obtienen las longitudes de las ramas que definen el árbol filogenético, por los métodos
de distancias.
• La información molecular permite calcular el flujo genético entre poblaciones, su
aislamiento o conectividad, su vulnerabilidad a la extinción, medir la diversidad
filogenética, la historia evolutiva del 24 conjunto de especies que hacen parte de la
comunidad, identificar especies cripticas y determinas especies a partir de muestras de
piel, carne o cualquier tejido obtenido de la incautación del tráfico ilegal de especies, entre
otros.

6. Referencias Bibliográficas

CATERINO , M. S., REED , R. D., KUO, M. M., & SPERLING , F. A. (2001). A Partitioned Likelihood Analysis
of Swallowtail Butterfly Phylogeny (Lepidoptera: Papilionidae). Syst Biol, 106-127.

Gregory, T. R. (2008). Understanding evolutionary trees. Evolution: Education and Outreach, 121-137.

Hajibabaei, M., Singer, G., Clare, E., & Hebert, P. (2007). Design and applicability of DNA arrays and DNA
barcodes in biodiversity monitoring. BMC Biology, 24.

Mejor Software. (18 de Julio de 2021). Obtenido de https://mejorsoftware.info/tools/bioedit

MONTENEGRO GOMEZ, S. P. (2018). USO DEL GEN CITOCROMO OXIDASA I (COI) Y CÓDIGO DE BARRAS
EN ESTUDIOS DE GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES
ANIMALES. FUSAGASUGÁ: UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA.

Ratnasingham, S., & Hebert, P. (2013). A DNA-Based Registry for All Animal Species: The Barcode Index
Number (BIN) System. Plos , 2-3.

Tibayrenc, M. (2005). Bridging the gap between molecular epidemiologists and evolutionists. Trends in
Microbiology, 575-580.