Manual Embriones Bovinos

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
PARA LA PRODUCCION Y VITRIFICACION
DE EMBRIONES
BOVINOS
EN LABORATORIOS DE REPRODUCCION ANIMAL
AUTORES:
Jorge Leonardo García Arévalo

Silvia Juliana Restrepo González
Nelson Gómez Sánchez
Edgar Ricardo Moreno Jerez
Diego Fernando Dubeibe Marín
Edgar Mauricio Mogollón Waltero
Bucaramanga 2017
Servicio Nacional de Aprendizaje – SENA

Regional Santander
Centro Agroturistico
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
PARA LA PRODUCCION Y VITRIFICACION
DE EMBRIONES
BOVINOS
EN LABORATORIOS DE REPRODUCCION ANIMAL
AUTORES:

Bucaramanga 2017
Servicio Nacional de Aprendizaje – SENA
Regional Santander
Jose Antonio Lizarazo Sarmiento Claudia Johanna Gomez Perez

Director General Subdirector Centro agroturistico
Emilio Eliecer Navia Zuñiga

Coordinador SENNOVA Sergio Iván Vargas Tangua
Líder SENNOVA
Albert Ferney Giraldo Varon
Director Regional Santander Grupo de investigación GITIP-MB
Regional Santander
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA PRODUCCIÓN Y VITRIFICACIÓN DE EMBRIONES BOVINOS

EN LABORATORIOS DE REPRODUCCIÓN ANIMAL
Autores: Editor:
Médico veterinario Zootecnista, MSc. Salud y Asesor editorial:
Producción Animal UCC (C) Clara Ines de la Roche
Médica Veterinaria Zootecnista UCC Bucaramanga Corrección de texto:
Nelson Gómez Sánchez Antonio Gómez Sánchez
Médico Veterinario, MSc. Gestor línea biotecnología
TECNOPARQUE. SENA Ilustración:
Edgar Ricardo Moreno Jerez Silvia Juliana Restrepo Gonzalez
Médico Veterinario, MSc (C), Docente Biotecnología
de la reproducción animal MVZ-UCC Diseño y diagramación:
Diego Fernando Dubeibe Marín Leidy Juliana Martinez Moreno
Médico Veterinario Zootecnista, MSc, PhD (C).
Investigador Corpoica Tibaitata
Médico Veterinario, Esp., MSc, PhD. Docente
Investigador MVZ-UCC
Servicio Nacional de Aprendizaje SENA
Universidad Cooperativa de Colombia UCC
Para citar este manual:

Garcia, J., Restrepo, S., Gòmez, N.,Moreno, E., Dubeibe, D., Mogollon, E,. (2017), Manual de procedimientos para
, San Gil,
Bucaramanga, Colombia. Servicio Nacional de Aprendizaje, Universidad Cooperativa de Colombia.
Hecho el depósito que exige la ley.
El manual es el resultado del trabajo llevado a cabo en docencia y formación por parte de los grupos GRICA – UCC,
GITIP – SENA en el marco del convenio 065 entre las dos entidades. Es un producto de distribución gratuita, por
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Universidad Cooperativa de Colombia - UCC
Sede Bucaramanga
Alfonso Prieto García Nancy Duarte Pabón

Director seccional Subdirectora Académica
Felipe Andrés Gómez Velásquez Julia Teresa Bedoya Mashut

Jefe regional de investigaciones Decana Nacional MVZ-UCC
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA PRODUCCIÓN Y VITRIFICACIÓN DE EMBRIONES BOVINOS

EN LABORATORIOS DE REPRODUCCIÓN ANIMAL
Autores:

Médico veterinario Zootecnista, MSc. Salud y Producción Animal UCC (C)
Médica Veterinaria Zootecnista UCC Bucaramanga
Médico Veterinario, MSc. Gestor línea biotecnología TECNOPARQUE. SENA
Médico Veterinario, MSc (C), Docente Biotecnología de la reproducción animal MVZ-UCC
Médico Veterinario Zootecnista, MSc, PhD (C). Investigador Corpoica Tibaitata
Médico Veterinario, Esp., MSc, PhD. Docente Investigador MVZ-UCC
CONTENIDO
Introducción 13
Glosario 15
1. Objetivo 17
1.1. Objetivo general 17

1.2. Objetivo específico 17
2.Generalidades 17
2.1 Producción In Vitro de Embriones Bovinos 17

2.1.1 Obtención de los Complejos Cúmulos Ovocitos (CCOs) 17
2.1.2 Criterios para la selección de los ovocitos 18
2.1.3 Maduración del ovocito 19
2.1.4 Fertilización In Vitro 20
2.1.5 Fecundación 21
2.1.6 Desarrollo Embrionario 21
2.1.7 Co-cultivo con células del cúmulus 21
2.1.8 Cultivo In Vitro (CIV) 21
2.2 Evaluación de embriones 23
2.2.1 Estado de desarrollo embrionario 23
2.2.2 Calidad embrionaria 24
2.3 Criopreservación de embriones 25
2.3.1 Vitrificación 25
2.3.2 OPS (Open pulled Straw- Pajilla abierta y estirada) 25
2.3.3 Desvitrificación 26
3.Procedimientos 27
3.1 Maduración In vitro (MIV) 27

3.1.1 Montaje de las microgotas 27
3.1.2 Transporte de ovarios de vacas faenadas 27
3.1.3 Obtención del Complejo Cúmulus Ovocitos (CCOs) 28
3.1.4 Recuperación y selección de ovocitos 29
3.2 Fertilización In vitro (FIV) 30
3.2.2 Gradientes de Percoll 30
3.2.3 Manejo y preparación del semen 30
3.3 Cultivo In Vitro (CIV) 33
3.3.2 Estado de desarrollo según la IETS (International Embryo Transfer 34
Society)
3.3.3 Grados de calidad según la IETS (International Embryo Transfer Society) 34
3.4 Co-cultivo con células del cúmulus. 36
4. Protocolo de Vitrificación por método OPS 37

4.1 Preparación del sistema OPS 37
4.2 Preparación de las soluciones 37
4.2.1 Preparación del medio de mantenimiento o medio holding 38
4.2.2 Preparación de la solución de vitrificación 1 38
4.2.3 Preparación de la solución de vitrificación 2 38
4.3 Procedimiento de vitrificación 38
5. Desvitrificación o calentamiento de los embriones vitrificados 40
5.1 Preparación de solución de Sucrosa 40

5.1.1 Procedimiento 40
6. ANEXO 41
Maduración In vitro de ovocitos 46

Medio de lavado de ovocitos 46
Medio de maduración de ovocitos 47
Fertilización In vitro de ovocitos 48
Medio de fertilización TALP-FEC ESTOQUE 48
Medio de fertilización Final 49
Cultivo In vitro 52
7. Bibliografía 53
LISTA DE
FIGURAS
Ilustración 1. Montaje de microgotas de medio de maduración, gasificación en incubadora ............27

Ilustración 2. Termo contenedor de ovarios-Debridación de tejidos adjuntos del ovario con
ayuda de tijeras- lavado de los ovarios en recipiente con NaCl. .............................................................................................28
Ilustración 3. Penetración de la aguja en el folículo- aspiración del folículo- retirada de la
aguja acoplada a la jeringa- liquido folicular depositado en tubo de centrifuga. ................................................28
Ilustración 4. Depósito de líquido folicular en placa Petri con ayuda de pipeta
Pasteur-búsqueda y recuperación de ovocitos-lavado de ovocitos en medio de
lavado y de maduración-ovocitos seleccionados ...................................................................................................................................29
Ilustración 5. Ovocitos seleccionados sumergidos en gotas de medio de
maduración - ovocitos colocados dentro de incubadora-Pasadas 20-22 horas
visualizamos ovocitos madurados. .........................................................................................................................................................................29
Ilustración 6. Montaje de microgotas con medio de fertilización. ......................................................................................30
Ilustración 7. Columnas de gradientes de Percoll en tubos de microcentrifuga puestos dentro

de la incubadora para darles temperatura. ....................................................................................................................................................31
Ilustración 8. Una vez terminada la 1 centrifugación del lavado del semen en las columnas de
Percoll, se observa- En el fondo del tubo se observa el pellet (espermatozoides vivos), en la
parte intermedia espermatozoides muertos y en la parte superior plasma seminal
y crioprotector. .............................................................................................................................................................................................................................31
Ilustración 9. Cámara de neubauer en la cual se señalan los 5 cuadros a tomar para el

conteo espermático................................................................................................................................................................................................................31
Ilustración 10. Ovocitos madurados lavados en gotas de medio de lavado y de fertilización-

imagen de micromanipulador donde se observa un ovocito con espermatozoides pegados
en la zona pelúcida..................................................................................................................................................................................................................33
Ilustración 11. Montaje de microgotas con medio de cultivo ..................................................................................................33
Ilustración 12. A: Ovocito no fecundado. B: Ovocito con división 2 células. C: Mórula

temprana. D: Mórula compacta. E: Blastocisto temprano. F: Blastocisto. G: Blastocisto
expandido 8 días. H: Blastocisto expandido eclosionando 8-9 días. I: Blastocisto
eclosionado y zona pelúcida 8-9 días. ................................................................................................................................................................35
Ilustración 13. Soluciones de vitrificación sobre plancha térmica. .....................................................................................38
Ilustración 14. OPS dentro de pajilla de 0.5, sumergida en nitrógeno liquido-termo de

nitrógeno donde se guardan los embriones vitrificados. ................................................................................................................39
LISTA DE
TABLAS
Tabla 1. Clasificación de los grados de calidad ovocitaria ..........................................................................................18

Tabla 2. Desarrollo y Clasificación embrionaria.....................................................................................................................23
Tabla 3. Clasificación y Grados de calidad embrionaria................................................................................................23
Tabla 4. Calidad Embrionaria ....................................................................................................................................................................24
Tabla 5. Estado de desarrollo y clasificación embrionaria .........................................................................................34
Tabla 6. Grados de Calidad y clasificación embrionaria. ..............................................................................................34
LISTA DE
ECUACIONES
Ecuación 1. *n= promedio del conteo de la cámara

superior e inferior de la cámara de Neubauer. .......................................................................................................... 32
Ecuación 2. Cálculo del volumen de semen para
cada gota de fertilización................................................................................................................................................................. 32
Ecuación 3. Cantidad de espermatozoides para
cada gota de FIV ....................................................................................................................................................................................... 32
Manual Procedimientos Producción y Vitrificación Embriones Bovinos
INTRODUCCIÓN
Latinoamérica está entrando a grandes pasos en la utilización de biotecnologías reproductivas, destacándose entre ellas las
que involucran la producción de embriones liderada por países como Brasil que, en la actualid ad, es considerado el principal
productor de embriones de FIV Fertilización in Vitro en el mundo. El interés por las biotecnologías reproductivas en esta
parte del mundo está cimentado en la ventaja de que nuestra producción ganadera será alimentada casi con exclusividad
basada en gramíneas sin los riesgos inherentes al uso de materias primas que puedan trasmitir enfermedades como la
encefalitis espongiforme bovina. En Colombia la producción de embriones aún es incipiente y se realiza principalmente
en grandes ganaderías, pero cada vez más las instituciones educativas y gubernamentales están intentando democratizar
dichas tecnologías para ponerlas al servicio de medianos y pequeños productores. Se pretende con este manual estable-
cer los procedimientos de la producción in vitro de embriones bovinos para su uso en laboratorios de biotecnología de la
reproducción animal, de manera que pueda convertirse en un documento apropiado para la realización de procedimientos
técnicos acordes con la normatividad vigente. A continuación se mencionan algunos de los temas que trataremos al interior
del presente libro. La producción in vitro de embriones (PIVE) es una herramienta biotecnológica asequible y aplicable a las
especies domésticas de interés económico, siendo una alternativa para el mejoramiento genético de animales y aceleración
de los procesos reproductivos de animales sobresalientes. A pesar del gran desarrollo que ha sufrido la PIVE, su eficiencia
todavía sigue siendo baja con una media de producción de embriones en torno al 35%, (Gottardi & Mingoti, 2009), llegando
sólo el 30% de las preñeces a término post-transferencia de los embriones a las receptoras (Park, Kim, Kim, Park, & Byun,
2005).
Gracias a esta técnica es posible obtener diversas ventajas productivas, como por ejemplo: determinación y control del sexo
de los productos, aumento de la eficiencia de los programas de producción, mayores posibilidades para ejecutar programas
de cruzamientos, adecuada estimación del efecto materno sobre la descendencia, rápida multiplicación de las razas, facilidad
de la importación y exportación del material genético o el estudio y desarrollo de otras biotécnicas reproductivas a partir de
la manipulación de gametos y embriones (Cromcomo, Wolf, Fernanda, & DB, 2012).
La PIVE comprende diferentes procesos: la maduración ovocitaria, la capacitación espermática, la fecundación y el cultivo
embrionario, ocurriendo diferentes modificaciones bioquímicas y estructurales en los gametos y los embriones a lo largo de
cada una de estas etapas (Garcia Diaz, Romero Aguirregomezcorta, Astiz blanco, & Ruiz Lopez, 2013).
Se ha demostrado que uno de los principales factores que actúa de manera negativa en el desarrollo inicial de los embriones
13
producidos en condiciones in vitro, es el estrés oxidativo debido a la producción excesiva de especies reactivas de oxígeno
(ROS, por su sigla en inglés).
Las ROS pueden causar pobre desarrollo embrionario y, en consecuencia, una baja eficiencia en la PIVE (Garcia Diaz, Romero
Aguirregomezcorta, Astiz blanco, & Ruiz Lopez, 2013). La búsqueda de alternativas para contrarrestar el estrés oxidativo ha
venido tomando gran relevancia con el propósito de aumentar el rendimiento de la técnica. La suplementación de los medios
de cultivo con cisteamina ha mostrado efectos benéficos, una vez que participa en la síntesis de glutationa (GSH), siendo este
el principal antioxidante natural, de esta manera su uso garantiza las condiciones micro ambientales adecuadas con bajo
estrés oxidativo, viéndose reflejado en el mejoramiento de la calidad y tasa de producción de embriones en el laboratorio
(Guérin P, 2001).
La implementación de sistemas de co-cultivo, hace referencia a una clase de alternativa metodológica, mediante la cual se
colocan diferentes tipos de células (oviductuales, Vero, granulosa, cúmulus, etc.) en cultivo con los presuntos embriones una
vez que ha sido demostrado que esta interacción celular tiene factores que presentan un efecto embríotrófico y una dismi-
nución importante en la producción de ROS (Lopez A, 2007).
La criopreservación de embriones bovinos producidos in vitro, simplifica el uso de programas de transferencia de embriones,
la instauración de bancos de material genético de un determinado individuo o raza, asimismo favorece las biotecnologías
asociadas como clonación y transgénesis (Albarracín, 2005).
La importancia de la criopreservación en la reproducción asistida en bovinos es manifiestamente ilustrada por el gran nú-
mero de embriones congelados y transferidos cada año (Thibier M, 2007). Sin embargo, la criopreservación de esta clase de
embriones por medio de métodos convencionales de congelamiento no ha alcanzado tasas de sobrevivencia satisfactorias
(Vajta G, 2000), lo que ha llevado a la utilización de otros métodos como la vitrificación.
Este método, con curvas de enfriamiento superiores a las de congelación lenta, permite la reducción del tiempo de exposi-
ción del embrión en los puntos críticos de temperatura, disminuyendo así los daños térmicos y mecánicos causados duran-
te la formación de cristales de hielo y aumentando la viabilidad de los embriones posterior a su desvitrificación (Cuello et al,
2007 y Guerra et al, 2011).
14
GLOSARIO
ANAFASE: CAPACITACIÓN
Tercera fase de la mitosis (división celular), en la cual los cromo- ESPERMÁTICA:
somas se separan formando dos grupos o estrellas, uno en cada Cambios bioquímicos y estructurales que permiten al espermato-
polo de la célula. zoide adquirir la capacidad de unirse a la zona pelúcida del ovoci-
to y de llevar a cabo la reacción acrosómica.
ATRESIA FOLICULAR:
Es un proceso de degeneración y reabsorción de folículos ováricos que
ocurre de manera normal en los ovarios de todos los vertebrados, inclui-
CENTRÓMERO:
es la zona más angosta de los cromosomas, cuya posición resulta
dos los peces. característica en cada uno de los pares.
BIOTECNOLOGIA: CIGOTO:
Rama de la tecnología que se ocupa de la aplicación de la biología
y la ingeniería para el estudio de animales. Se denomina cigoto a la célula que resulta de la fusión del gameto
femenino con el gameto masculino en el proceso de reproduc-
ción sexual Adicionalmente puede afirmarse que es un embrión
unicelular.
BLASTOCELE:
Cavidad de la blástula rellena de líquido que se forma con la sepa-
ración de los blastómeros. CINETOCORO:
Es una estructura proteica que permite a los cromosomas an-
clarse a los microtúbulos del huso mitótico.
BLASTOCISTO:
Fase del desarrollo del embrión de los mamíferos, equivalente a
la blástula, que constituye una estructura celular compleja deriva-
da de la mórula; está formada por una masa celular interna de la CLIVAJE:
que se origina el embrión y de una capa periférica de células que Se define como la serie de divisiones celulares mitóticas que ex-
formará la placenta. perimenta el cigoto.
BLASTÓMERO:
Cada una de las células que se originan de las divisiones de un COMPLEJO CUMULUS:
óvulo fecundado. Conjunto de células que rodean al ovocito.
CITOPLASMA: CORPÚSCULO POLAR:

Parte de la célula que rodea el núcleo y que contiene a las demás Célula haploide no funcional, producto de las divisiones meióticas
organelas. Está limitada por la membrana celular. que llevan a la formación del óvulo; tiene un núcleo pero poco
citoplasma.
15
CRIOPRESERVACIÓN: METAFASE:
es el proceso en el cual las células son congeladas a bajas tem- La metafase es la fase de la mitosis y meiosis que sucede después
peraturas para disminuir las funciones vitales de una célula o un de la profase (meta = más allá), en ella los cromosomas muestran
organismo y poderlo mantener en condiciones de vida suspendi- el máximo acortamiento y condensación, y son desplazados sobre
da por mucho tiempo. los microtúbulos hasta que los centrómeros quedan en el plano
ecuatorial formando la denominada placa metafásica.
OVARIO:
DIPLOTENO: Es la gónada u órgano reproductor femenino productor y secretor
Cuarto estadio de la profase de la primera división meiótica. de hormonas sexuales y óvulos.
EMBRIÓN:
El embrión es la etapa inicial del desarrollo de un ser vivo mientras OVOCITO:
se encuentra en el huevo o en el útero de la madre Los ovocitos son células germinales femeninas que se generan en
los ovarios. Se trata de una fase del desarrollo del óvulo, cuando
aún no ha madurado.
ESPACIO PERIVITELINO:
Espacio que queda entre la zona pelúcida y el ovocito o las células POLIESPERMIA:
que constituyen un embrión (blastómeros). Es la penetración de más de un espermatozoide dentro del óvulo
en un evento de fertilización
FECUNDACIÓN:
La fecundación o singamia, consiste en el proceso de unión de
dos gametos (masculino y femenino) en la ampolla de las trompas PROFASE:
uterinas durante la reproducción sexual para crear un nuevo indi- Primera fase de la mitosis (división celular), en la cual se vuelven
viduo con un genoma derivado de ambos progenitores distinguibles los cromosomas.
TELOFASE:
Cuarta y última fase de la mitosis (división celular), en la cual se
FOLÍCULO: forman los dos nuevos núcleos y el citoplasma se divide en dos.
Es un pequeño elemento en forma de bolsa en la cual el ovocito
es almacenado hasta su maduración y liberación. El folículo está
conformado por el ovocito, las células de la granulosa y las tecas.
ZONA PELÚCIDA:
se denomina a la capa externa que rodea el ovocito de los mamí-
feros, separándole del espacio perivitelino.
HORMONAS
GONADOTRÓFICAS:
Las gonadotropinas o gonadotrofinas son hormonas secretadas
por la glándula hipófisis o pituitaria, que regulan el ciclo estral en
los mamíferos vertebrados. Existen tres gonadotropinas: la hor-
mona luteinizante (abreviada HL o LH), la hormona estimulante
del folículo (abreviada HFE o FSH) y la gonadotropina coriónica
humana (abreviada GCH o HCG).
16
1. OBJETIVO
1.1. Objetivo general

Establecer los procedimientos de la producción in vitro de embriones bovinos para su uso en laboratorios de biotecnología
de la reproducción animal, de manera que pueda convertirse en un documento apropiado para la realización de procedi-
mientos técnicos acordes con la normatividad vigente.
1.2. Objetivo específico

Reconocer los procedimientos para incrementar rápidamente la ganancia genética realizando una mayor selección de las
hembras bovinas
Conocer las diferentes técnicas que se utilizan en la producción y vitrificación de embriones bovinos
Identificar las diferentes preparaciones para la producción y vitrificación de embriones
2. G E N E R A L I D A D E S
2.1 Producción In Vitro de Embriones Bovinos

La Producción in vitro de Embriones (PIVE), también conocida como fertilización in vitro (FIV), es una técnica para la mul-
tiplicación de material genético de forma más rápida, abarcando una combinación de los procesos de maduración de los
ovocitos, capacitación espermática, fertilización y cultivo in vitro.
La PIVE contribuye de una manera decisiva a una mayor eficiencia reproductiva como herramienta para la multiplicación
rápida del material genético de interés económico, acortando el intervalo de generaciones e intensificando la selección.
Además de su interés comercial, brinda una característica importante que es la producción a escala de ovocitos madurados
y fecundados y se constituye como una herramienta indispensable para otras biotecnologías como la clonación, la transgé-
nesis, la preservación de ovocitos, entre otras. La FIV permite un mayor aprovechamiento de células primordiales presentes
en los ovarios.
La PIVE es una tecnología que en su mayor parte se ejecuta en el laboratorio, como es el caso de la maduración, fecunda-
ción del ovocito y cultivo de embriones, mientras que en el animal son efectuadas la colecta de ovocitos en la donadora y la
transferencia del embrión producido fresco o congelado a la receptora. Según Peterson & Lee (2003) las tasas de partos para
embriones producidos in vitro está por debajo de los resultados obtenidos mediante monta natural o inseminación artificial.
Para Gutiérrez et al. (2004) los embriones producidos in vitro de 2 a 4 días de desarrollo tienen menor expresión de ARNm
para interferón, lo que puede ser uno de los motivos de mayor tasa de muerte embrionaria.
17
Tabla 1. Clasificación de los grados de calidad ovocitaria
2.1.1 Obtención de los Complejos Cúmulos

Ovocitos (CCOs)
GRADOS CALIDAD
Los ovocitos bovinos pueden ser obteni-
dos in vivo, a partir de vacas vivas median-
te aspiración folicular transvaginal guiada
por ultrasonografía (OPU Ovum Pick Up),
o de ovarios extraídos de vacas faena-
Cúmulus compacto presente,
das, siendo esta última la manera menos
costosa de obtener ovocitos de forma
numerosa y viable. Sin embargo, como lo
1 más de 3 capas de células, ci-
toplasma con gránulos finos y
homogéneos.
comentan Gonçalves et al. (2002), en este
caso no es posible controlar el estatus
de los animales donadores de las células,
pues en su gran mayoría, los ovocitos ob-
tenidos de esta fuente tienen la capacidad
de ser madurados, fecundados y cultiva-
dos in vitro hasta llegar a estado de blas-
tocisto. Cúmulus compacto, menos de
2
El aprovechamiento de animales con alto 3 capas de células, citoplasma
valor genético se puede generar con esta con gránulos distribuidos hete-
técnica en eventos tales como accidentes rogéneamente, concentrados
donde se encuentra comprometida la vida más hacia el centro y claros en
del animal o en hembras sacrificadas por la periferia.
motivos sanitarios o de reposición. Sin em-
bargo, de manera general, los ovocitos se
obtienen de animales con bajo valor ge-
nético, lo cual hace a la técnica adecuada
para propósitos de investigación. Depen- Cúmulus presente, expandido,
diendo de diversos factores de cada hem- citoplasma contraído con au-
bra sacrificada es posible obtener de 15 a
20 ovocitos.
3 mento del espacio previtelino,
presencia de vacuolas y/o frag-
mentación.
El transporte de los ovarios se debe reali-
zar en un recipiente que ayude a mantener
la temperatura para no afectar la viabilidad
de los ovocitos (Gustavo, 2001). Algunas
de las desventajas de esta técnica son que
no se tiene control total del manejo de los
ovarios previo a su recuperación, dado
4
que no siempre es posible tener acceso a
las instalaciones de la planta de beneficio Ovocito desnudo o con cito-
lo cual podría contar para la variabilidad plasma bastante irregular
en los resultados posteriores. Además de
lo anterior, no se tiene información de la
edad ni del estado sanitario, reproductivo
y fisiológico de los animales, parámetros
que podrían tener un efecto deletéreo en Fuente: autor
la producción de embriones in vitro.
18
Al momento de aspirar los folículos es importante tener en cidos en su totalidad. La maduración nuclear corresponde
cuenta el tamaño de los mismos, folículos mayores de 8mm al avance del ovocito desde el estado de profase I hasta la
se pueden encontrar en proceso de atresia y los ovocitos en metafase II (Gottardi & Mingoti, 2009). En condiciones in vivo
un estado de maduración, perjudicando así la viabilidad de mientras los ovocitos sean mantenidos en el ambiente foli-
estos para la PIVE (Bols, Van Soom, Ysebaert, Vandenheede, cular, estos irían a permanecer en estado de vesícula ger-
& de Kruif, 1996). minativa (VG) hasta que se presenta el pico preovulatorio
de gonadotropinas, que estimula su maduración e induce
cambios fisiológicos en la actividad de las células del cúmu-
2.1.2 Criterios para la selección de los ovocitos lus. Bajo la influencia de las hormonas gonadotrópicas, el
ovocito reanuda el ciclo celular a partir de la etapa de diplo-
La morfología del citoplasma y las células del cúmulus son teno de la profase I, pasa a través de las etapas de metafase
los primeros criterios para discriminar entre ovocitos com- I, anafase I, telofase I (final de la primera división meiótica) y
petentes e incompetentes para el desarrollo embrionario, progresa hasta la metafase de la segunda división meiótica.
la calidad del complejo cúmulus ovocitos (CCOs) y la apa-
riencia homogénea del núcleo y citoplasma son los mejores Al término de la profase I se produce la ruptura de la en-
indicadores para determinar si el ovocito posee potencial voltura nuclear -también conocida como ruptura de la ve-
para madurar y fecundar in vitro (Palma, 2008). En la Tabla sícula germinal- y los microtúbulos del huso se unen a los
N°1 está descrita la clasificación según los grados de calidad cinetocoros. En la metafase I, los cromosomas homólogos
ovocitaria. se hallan dispuestos en el plano ecuatorial, unidos entre sí
por los extremos, mientras que son halados hacia los polos
opuestos por los centrómeros.
2.1.3 Maduración del ovocito
La maduración ovocitaria es el proceso del cual se deriva la En la anafase I los cromosomas homólogos se separan di-
obtención de una aceptable tasa embrionaria, ya que es du- rigiéndose a los respectivos polos. Una vez que llegan a los
rante esta etapa donde se presentan todos los eventos ne- polos, en la telofase I, uno de los grupos de cromosomas
cesarios para que los ovocitos puedan expresar su máximo homólogos es expulsado del ovocito como corpúsculo polar
potencial para poder alcanzar su desarrollo hasta el estado mientras que el otro grupo continúa con la segunda división
de blastocisto. De esta manera, garantizar un proceso de meiótica. Al llegar al estadio de metafase II los cromosomas
maduración adecuado al ovocito, es requisito fundamental se encuentran dispuestos en el plano ecuatorial con cada
para adquirir la competencia celular necesaria para avanzar cromátida hermana unida por el centrómero a polos opues-
exitosamente en las subsiguientes fases del proceso de pro- tos del huso. En este punto la meiosis se detiene nuevamen-
ducción de embriones. te. Finalmente, la segunda división meiótica se completa
(metafase II hasta la telofase II y la extrusión del segundo
Durante la maduración, el ovocito presenta modificaciones cuerpo polar) con la fusión de membranas entre el ovocito y
bioquímicas y metabólicas que le permiten ser reconocido y el espermatozoide.
penetrado por el espermatozoide, asegurando la formación
de los pronúcleos masculino y femenino y crea reservas de En el proceso de maduración ovocitaria que ocurre dentro
(ARNm, ribosomas y proteínas necesarias) para dar inicio al del laboratorio, desde el momento en que los ovocitos son
desarrollo embrionario. Durante el crecimiento del folículo aspirados y por lo tanto retirados del ambiente folicular, es-
ovulatorio, además de la maduración del ovocito, también tos automáticamente reanudan la meiosis. En este caso, el
las células de la granulosa del cúmulus secretan ácido hia- proceso de maduración debe ocurrir bajo condiciones ade-
lurónico que, entre otras funciones, confieren mayor capaci- cuadas dadas mediante el uso de medios de cultivo apro-
dad de adhesión a estas células (Moraes, 2010) piados, influenciados por hormonas gonadotrópicas y un
ambiente controlado dentro de una incubadora, simulando
Si el ovocito no posee ARN suficiente, el embrión formado de esta manera las condiciones de maduración in vivo (Gallí,
se degenera o es de peor calidad. En bovinos, el embrión de et al., 2003).
8-16 células comienza a tener expresión de genes y produce
su propio material de subsistencia, pero antes de esto de- Finalmente, para que los ovocitos bovinos alcancen el es-
pende de la calidad del ovocito y de sus reservas almacena- tado de metafase II en condiciones in vitro, es necesario un
das. (Lonergan, Rizos, Ward, & Boland, 2001) periodo de 20-24 horas (Gottardi & Mingoti, 2009) y única-
mente después de este tiempo pueden ser fecundados. En
La maduración ovocitaria es un evento complejo donde el condiciones óptimas de cultivo in vitro, el 90% de los ovoci-
ovocito presenta diversos cambios, algunos aún no cono- tos podría llegar a la metafase II (Gallí, et al., 2003).
19
.
24
con la finalidad de garantizar la fusión de los núcleos de los
gametos para la formación del nuevo individuo (Gustavo,
2001 y Brucker & Lipford, 1995).
El tiempo para que ocurra este proceso es de aproximada-
1
mente 6 horas, en las cuales sucede la hiperactivación esper-
mática (movimientos más intensos del flagelo) y liberación
de hialuronidasa para romper la matriz de ácido hialuróni-
co que mantienen adheridas las células del cúmulus alre-
dedor del ovocito. Además, como lo demuestran Lawrence
& Fowler (2002), sin capacitación no ocurre la reacción del
acrosoma. Este procedimiento es inducido cuando el esper-
matozoide entra en contacto con las diferentes soluciones
utilizadas para la selección de gametos viables, potenciali-
1
zándose en el momento en el que el espermatozoide se su-
merge en medio de fertilización y se une a la membrana del
2
ovocito (Cabrera, Yoong & Gamarra, 2009).
En condiciones in vitro el proceso de fecundación se pue-

de llevar a cabo con semen congelado/descongelado. Sin
embargo, para este propósito, el semen debe ser sometido
a un procedimiento de selección y lavado mediante el cual
se logre obtener los espermatozoides de mayor viabilidad
(Palma, 2008 y Machatkova et al., 2008).
Las metodologías de mayor uso en los laboratorios para el

aislamiento y selección de los espermatozoides más aptos
son la técnica de Swim up y los gradientes de Percoll. La
La maduración citoplasmática y molecular se refiere a una técnica de Swim up consiste en la selección de los esperma-
serie de eventos simultáneos, entre los que se cuentan la tozoides por medio de su motilidad intrínseca. Para llevarla
síntesis de proteínas, cambios moleculares, reorganización a cabo, el semen es depositado en el fondo de un tubo para
de las organelas en el citoplasma, producción de proteínas centrífuga e incubado en condiciones adecuadas durante 1
específicas que desempeñan papeles cruciales en la regula- hora. Transcurrido este tiempo, en la parte superior del tubo
ción del ciclo celular, entre otros. se encuentran los espermatozoides vivos y de mayor mo-
tilidad rectilínea progresiva siendo estos los seleccionados
para la FIV (Parris, 2014).
2.1.4 Fertilización In Vitro
Por su parte, la técnica de los gradientes de Percoll: consis-
La fertilización es el proceso mediante el cual las células te en la selección de los espermatozoides por medio de su
espermáticas logran penetrar la zona pelúcida y unirse al densidad. El semen es colocado dentro de unas columnas
ovocito. Para esto, las células espermáticas previamente de gradientes de diferentes densidades y llevado a centrifu-
deben sufrir una serie de cambios bioquímicos, moleculares gación, donde finalmente en el gradiente más denso queden
y metabólicos. A esta serie de eventos se le conoce como los espermatozoides viables y en los gradientes menos den-
capacitación espermática. sos las células no espermáticas, espermatozoides no viables,
plasma seminal y diluyente (Machaty, Peippo, & Peter, 2012).
Los espermatozoides capacitados adquieren cambios que a
simple vista, a través del microscopio, el único evento obser- En la FIV la adición de sustancias como la heparina presenta
vado es el aumento en la motilidad y velocidad (hipermotili- efectos importantes en la modificación de la membrana del
dad). Hay que agregar que también ocurren alteraciones en espermatozoide, siendo utilizada para la producción comer-
la membrana, cambio en la composición lipídica y aumento cial de embriones bovinos, dado que esta aumenta la capa-
de la permeabilidad, siendo estos los que someten a la cé- cidad de fecundar los ovocitos in vitro (Parris, 2014).
lula espermática a proceso de reacción acrosómica para
lograr así la unión a la zona pelúcida y matriz del ovocito,
20
En el laboratorio, es necesario simular el ambiente in vivo, de tal manera que para el proceso de fecundación se
utilizan medios de cultivo suplementados con substancias tales como el calcio, el bicarbonato, la hipotaurina, epi-
nefrina, penicilamina, substancias que también ayudan al proceso de capacitación de los espermatozoides, pero
que además favorecen su motilidad (Hasler, 2000).
El cultivo de los ovocitos madurados con las células espermáticas es realizado por un período de 18 a 20 horas en
ambiente controlado con ayuda de incubadora (Ward, Enright, Rizos, Boland, & Lonergan, 2002). Los espermato-
zoides son colocados en cultivo a una concentración 1 a 5 X 106 /ml de medio (Gonçalves, Barreta, Sandri, Ferreira,
& Antoniazzi, 2007); sin embargo, para obtener resultados satisfactorios, es necesario ajustar la concentración de
heparina y la concentración espermática para muestra seminal a ser utilizada (Lu & Seidel Jr, 2004).
2.1.5 Fecundación
La penetración de la zona pelúcida por el espermatozoide ocurre dentro de 5 a 15 minutos, la reacción del acroso-
ma puede ocurrir antes o después de la fijación de la cabeza del espermatozoide a los receptores glicoproteicos
sobre la zona pelúcida. Este es un requisito indispensable para la fusión de los gametos, mediante la liberación de
enzimas que permiten al espermatozoide el movimiento por la zona pelúcida hasta el interior del ovocito (Hafez
E. S. E. & Hafez, B. 2000).
Inmediatamente es efectuada la fertilización, es producida la reacción cortical en la membrana plasmática del

ovocito impidiendo la poliespermia. Cuando se fusionan el ovocito con el espermatozoide se originan los pronú-
cleos masculino y femenino y estos migran hacia el centro del ovocito para formar el cigoto, proceso denominado
singamia, seguidamente es producida la primera división del embrión (Senger, 2003).
2.1.6 Desarrollo Embrionario

Después de la singamia el cigoto se convierte en un embrión, definido como un organismo en estado de desarrollo
temprano (Senger, 2003). Posterior a la fusión de los pronúcleos, la célula embrionaria sufre una serie de divisiones
mitóticas denominada clivaje, generando cada vez más blastómeros. En el clivaje, ocurre una división celular sin
crecimiento del tamaño celular -aumento sucesivo de células sin aumento del volumen (González, 2002).
El embrión pasa a ser denominado blastocisto cuando presenta una cavidad llena de fluido, denominada blasto-
cele. En esta fase, el embrión presenta también el botón germinal, que va a dar origen al nuevo organismo para
formar sus membranas fetales, además del trofoblasto, que forma la mayor parte de la placenta (Lawrence &
Fowler, 2002).
2.1.7 Co-cultivo con células del cúmulus
En la producción in vitro de embriones hay diversos factores que influyen en el desarrollo y calidad embrionaria.
El éxito en los procesos de maduración, fertilización y de cultivo dependen del microambiente en el que se desa-
rrollen, el cual es de vital importancia para que los futuros embriones sean aptos y viables para transferir (López
& Olivera, 2007).
Es ineludible incluir nuevas metodologías que ayuden al incremento de las tasas de blastocistos en la especie bovi-
na. Una de las técnicas empleadas para mejorar la producción embrionaria es el co-cultivo, el cual puede derivarse
de distintos tipos de células somáticas como: células oviductales, células de la granulosa y células del cúmulus; es-
tas contribuyen al desarrollo embrionario, ya que ayudan a disminuir la formación de especies reactivas de oxigeno
(EROs) y suministran sustancias ricas en carbohidratos, proteínas y factores embriotróficos (Bosch et al., 2006).
21
2.1.8 Cultivo In Vitro (CIV) Sin embargo, excesos en la suplementación de los medios
de cultivo pueden traer efectos contraproducentes. Por
La etapa de cultivo comprende el período de desarrollo de ejemplo ha sido determinado que la adición excesiva de SFB
los ovocitos ya fecundados hasta llegar al estado de blasto- al medio genera el fenómeno que recibe el nombre de “sín-
cisto. drome del becerro gigante”, que se caracteriza por el desa-
rrollo del feto de forma acelerada y exagerada. De la misma
La evaluación de la tasa de blastocisto es determinada apro- manera el exceso de SFB en los medios, baja la resistencia a
ximadamente el día 7, contando como día 0 el día de la fe- la Criopreservación de los embriones obtenidos (Farin, Cro-
cundación. Es en esta etapa que los embriones son implan- sier, & Farin, 2001).
tados en una hembra receptora para que puedan continuar
con su desarrollo. En caso de ser necesaria la estimación
de la tasa de eclosión, los embriones deben mantenerse en
cultivo hasta aproximadamente el día 9.
Dependiendo de su formulación, han sido clasificados tres

tipos de medios de cultivo: 1) Medios indefinidos, que hacen
referencia a aquellos de los cuales no se tiene certeza de
su composición exacta y consecuentemente de la concen-
tración de cada uno de sus componentes. Aquí se incluyen
todos aquellos que contienen suero fetal bovino (SFB) o cé-
lulas somáticas en co-cultivo; 2) Medios semidefinidos: son
aquellos en los cuales se reemplaza el SFB y el co-cultivo
con otros tipos de células por alguna proteína semipurifica-
da, como por ejemplo la albumina sérica bovina (ASB); y 3)
Medios definidos: son formulaciones de las cuales se tiene
pleno conocimiento de cada uno de los componentes y de
sus cantidades (Herradón, Quintela, Becerra, Rubial, & Fer-
nández, 2007).
Durante el período de cultivo los embriones presentan una

demanda exigente de nutrientes y fuentes energéticas ne-
cesarias para lograr su desarrollo hasta estados preimplan-
tatorios. Estos suplementos deben ser adicionados al medio
de cultivo para así garantizar la viabilidad de los presuntos
embriones (Gustavo, 2001).
Las principales fuentes de energía son la glucosa y el piru-

vato, siendo la glucosa en etapas iniciales de los embriones
no necesaria dado que a dicha edad el embrión no posee las
vías enzimáticas necesarias para desdoblarla y utilizarla, lle-
gando incluso a tener un efecto negativo para el desarrollo
embrionario.
En estados más avanzados del desarrollo embrionario, ha

sido demostrado que la glucosa juega un papel importan-
te como fuente primaria de energía para las células. Por su
parte los aminoácido esenciales y no esenciales hacen parte
de varias formulaciones de medios de cultivo, una vez que
actúan como precursores de proteínas, son fuente energía
y participan en la regulación del pH en los medios de culti-
vo, aumentando así la viabilidad de los embriones (Gustavo,
2001).
22
2.2 Evaluación de embriones

2.2.1 Estado de desarrollo embrionario
Según la propuesta de la International Embryo Transfer Society (IETS), deben ser usados códigos numéricos para determinar
el estado de desarrollo de los embriones, señalando de esta manera los días transcurridos desde el momento de la fecunda-
ción. La codificación de los diferentes estados de desarrollo embrionarios se muestran en la Tabla 2 (Stringfellow & Givens,
2010). Los embriones son clasificados según la morfología y estado de desarrollo, para ello existen unas categorías que se
describen a continuación:
Tabla 2. Desarrollo y Clasificación embrionaria
ESTADO DE DESARROLLO CLASIFICACION
No fecundado 1
1 a 2 células 2
Mórula temprana 3
Mórula 4
Blastocisto temprano 5
Blastocisto 6
Blastocisto expandido 7
Blastocisto eclosionado 8
Blastocisto eclosionado expandido 9
Adaptado de (Bó y Mapletoft, 2013)
Tabla 3. Clasificación y Grados de calidad embrionaria
CALIDAD CLASIFICACION
Excelente:
Ningún efecto visible, al menos más del 85% intacto 1
Regular:
Irregularidades moderadas, 50% debe permanecer intacto 2
Mala:
Irregularidades mayores, 25% permanece intacto 3
Degenerado:
No viables 4
Adaptado de (Palma, 2008)
23
2.2.2 Calidad embrionaria
Según lo propuesto por la IETS, los códigos para la evaluación de la calidad embrionaria están basados en la integridad mor-
fológica de los embriones y clasificados en escala de 1 a 4, siendo estas descritas en la Tabla 4 (Stringfellow & Givens, 2010
y Bó & Mapletof, 2013) .
Tabla 4. Calidad Embrionaria
CÓDIGO ESTADO CARACTERÍSTICAS
Masa embrionaria esférica y simétrica, con blastómeros uniformes en

cuanto a tamaño, color y densidad, Las irregularidades deberían ser relati-
1 Excelente o bueno.
vamente menores, y al menos el 85% del material celular debería ser una
masa embrionaria intacta y viable.
Irregularidades moderadas en cuanto al aspecto, forma, tamaño, color y
2 Regular. densidad de las células. Al menos el 50% del material celular deberá en-
contrarse intacto y correspondería con una masa embrionaria viable.
Irregularidades mayores en la forma y tamaño de la masa embrionaria. Al
3 Malo. menos el 25% del material celular deberá encontrarse intacto y correspon-
dería con una masa embrionaria viable.
Masa embrionaria con blastómeros en desorden, las irregularidades son
Muerto o en degenera-
4 relativamente mayores, y al menos el 85% del material celular es una masa
ción.
embrionaria degenerada y no viable.
24
2.3 Criopreservación de embrio- hasta 14000ºC/min), permaneciendo en este estado du-

rante todo el proceso de cambio de temperatura (Albarra-
nes cín M, 2005 y Molina et al, 2004).
La vitrificación al ser una técnica que consiste en la
La criopreservación de embriones se ha dado como el criopreservación a través del aumento de la viscosidad
resultado del incremento en la productividad de animales de las soluciones crioprotectoras, necesita de concentra-
de alto valor genético, así como la necesidad de conser- ciones de crioprotectores mayor (4- 8 M) a las utilizadas
vación y comercialización de este material alrededor del normalmente en el congelamiento (1-2 M) (Woods et al,
mundo (Vajta G, 2000b). El número de embriones pro- 2004). Por lo tanto, la disminución de estos efectos de-
ducidos ha aumentado de forma considerable, creando letéreos, va a ser obtenida a través de la utilización de
la necesidad de guardar los embriones excedentes por crioprotectores menos tóxicos y el establecimiento de
tiempo prolongado manteniendo su viabilidad. De igual volúmenes y niveles de concentración menores, así como
forma, la oportunidad de crear bancos genéticos, ha per- su temperatura y tiempos de exposición (Liebermann et
mitido no sólo el almacenamiento, sino también facilitar al, 2003).
el transporte y la programación de actividades para la uti- El uso de soluciones crioprotectoras con bajo peso mo-
lización de dichas estructuras (Luster SM, 2004). lecular es una de estas estrategias. Los crioprotectores al
tener una mayor permeabilidad, van a permitir la reduc-
Uno de los principios más importantes de la criopreserva- ción de los tiempos de exposición, y la minimización de
ción de embriones es poder conservar a bajas temperatu- los niveles de concentración, previniendo el daño osmóti-
ras (-196°C), procurando mantener su integridad, a través co causado en las células (Kasai & Mukaida, 2004).
de la remoción del volumen máximo de agua antes de su En la vitrificación de ovocitos, algunos autores reportan
congelamiento, evitando así la formación de cristales de que las tasas de supervivencia para bovinos (Lazar L,
hielo (Wowk B, 2010 y Saragusty & Arav, 2011). Spak J, Dávid V, 2000) y humanos (Picton et al, 2002) son
cercanas al 70%. Por lo tanto, se ha evidenciado que el
Dentro de los métodos más utilizados para la criopre- método de vitrificación es superior al procedimiento de
servación se encuentran el método de congelación lenta congelación lenta convencional para criopreservación de
y, como alternativa posible, un método de congelación embriones de bovinos, humanos y otras especies anima-
ultrarrápida denominado vitrificación. El método de con- les (Otoi et al, 1998 y Molina et al, 2004).
gelación lenta es, en la actualidad, el más utilizado comer-
cialmente (Vajta G, 2000b). Su curva de congelación lenta
permite mantener el equilibrio entre los factores que pue- 2.3.2 OPS (Open pulled Straw- Pajilla abierta y estirada)
den causar daño celular, como son la formación de crista-
les de hielo, la fractura de la zona pelúcida del embrión, el Para la vitrificación el tamaño de la muestra debe ser lo
daño tóxico y osmótico, así como las alteraciones de las más pequeña posible para aumentar la velocidad de con-
organelas intracelulares y del citoesqueleto, (Dobrinsky et gelación. Con dicho fin se ha descrito un soporte físico
al, 2000 y Vajta G & Kuwayama M, 2006) para la vitrificación como pajillas convencionales de 0,25
ml.
Durante este procedimiento, los embriones son equilibra- El uso de la técnica OPS ha permitido incrementar la
dos dentro de bajas concentraciones de crioprotectores, velocidad de los cambios de temperatura, lo cual ofrece
en pajillas de 0.25 ml, con tasas de refrigeración entre los ciertas ventajas para la congelación como son la dismi-
0.3 a 1 °C/min, hasta alcanzar los -30 a -35°C, para poste- nución de los tiempos de exposición a los crioprotectores
riormente poder ser sumergidos en el nitrógeno líquido. utilizados, con los consecuentes menores efectos osmó-
ticos y tóxicos, lo que produce menores daños por enfria-
miento (Silva & Berland, 2004). Los índices de superviven-
2.3.1 Vitrificación cia de embriones vitrificados son todavía muy bajos en la
especie bovina, lo que podría ser debido al daño de las
La vitrificación pertenece a una técnica de congelación membranas plasmáticas o a la comunicación intracelular,
ultrarrápida fundamentada en el contacto directo entre perjudicando así su posterior implantación. (Carvalho E,
la solución de vitrificación y los embriones (exposiciones 2006)
cortas a altas concentraciones de crioprotectores de
aproximadamente 4-6 mol/L), creándose una solidifica-
ción para formar un estado vítreo o similar al cristal, sin
la formación de cristales de hielo durante el enfriamiento
a tasas muy rápidas (tasa de congelación >2000ºC/min,
25
2.3.3 Desvitrificación
Los protocolos de desvitrificación deben tratar de disminuir la posibili-

dad de recristalización mediante una apropiada transferencia térmica.
El método de desvitrificación más común para ovocitos es un método
rápido y directo (Mucci et al, 2006 y Moore, 2007). Mientras se realiza
la descongelación de las estructuras puede causarse un choque os-
mótico debido a la rápida influencia de agua al interior de la célula,
cuya sensibilidad por la célula es dependiente de la permeabilidad de
la célula al agua y los solutos, y que puede ser reducido por el uso de
un buffer osmótico no tóxico e impermeable como la sucrosa.
La tasa de calentamiento óptima depende de los crioprotectores y su
concentración, al igual que la tasa de descenso de las temperaturas
utilizadas (Cabrera et al, 2006). Para calentar una muestra vitrificada,
se sumerge el soporte de vitrificación en un medio a temperatura fi-
siológica (37,5 - 39ºC), obteniendo velocidades de calentamiento entre
3000 a 8000 ºC/minuto, dependiendo del soporte utilizado. Los em-
briones son puestos en una solución para calentamiento entre 20ºC a
37ºC, para posteriormente rehidratarlos y remover los crioprotectores
utilizados (Mucci et al, 2006).
26
3. P R O C E D I M I E N T O S
3.1 Maduración In vitro (MIV)

Cuando se va a trabajar con ovarios de vacas faenadas se debe antelar la preparación del medio de maduración de ovocitos
y el medio de lavado de ovocitos (ver Anexo).
3.1.1 Montaje de las microgotas
Dentro de una caja de Petri de 100 x15 mm, introducir 2 placas de Petri de 33 mm, en las cuales se podrán hacer de 4 a 6
gotas en c/u dependiendo el número de ovocitos a madurar; el tamaño inicial de cada gota es de 50 µl de medio de madu-
ración, las cuales deben ser cubiertas por 1 mL de aceite mineral, completar cada gota adicionando otros 50 µl de medio de
maduración y finalizar con la adición de 3 mL de aceite mineral. Una vez acabado el montaje de las placas se deben estabi-
lizar en la incubadora a una temperatura de 38.5°C con 5% de CO2 y humedad relativa alta durante mínimo 3 horas para su
respectiva gasificación.
Ilustración 1. Montaje de microgotas de medio de maduración, gasificación en incubadora
3.1.2 Transporte de ovarios de vacas faenadas
Los ovarios una vez colectados en planta de beneficio animal, son transportados en un recipiente con aislamiento térmico
que contenga solución NaCl al 0.9%. Si el transporte de los ovarios al laboratorio es menor a una hora es conveniente man-
tener esta solución a una temperatura de 37°C. En caso de tiempos de transporte prolongados, la solución debería mante-
nerse a temperatura ambiente (~25°C). En el laboratorio, los ovarios son lavados con solución NaCl 0.9% a 37°C, con tijeras
desinfectadas se hace debridación de tejidos adjuntos para evitar contaminación y luego son introducidos en un beaker con
la misma solución a 37°C para su posterior aspiración.
27
Ilustración 2. Termo contenedor de ovarios-Debridación de tejidos adjuntos del

ovario con ayuda de tijeras- lavado de los ovarios en recipiente con NaCl.
3.1.3 Obtención del Complejo Cúmulus Ovocitos (CCOs)
La obtención del CCOs se realiza mediante aspiración folicular con aguja de calibre 18G acoplada a una jeringa de 5 mLara
la manipulación de los ovarios es indispensable el uso de guantes. El líquido folicular se obtiene de la punción de folículos
entre 2 a 8mm y es vertido en tubos cónicos para centrifuga (Falcon®, Franklin Lakes, USA) de 15 o 50mL dependiendo el
volumen de ovarios para aspirar. Terminada la aspiración se espera 10 minutos que decanten los ovocitos para poder hacer
la selección de los mismos.
Ilustración 3. Penetración de la aguja en el folículo- aspiración del folículo- retirada de la aguja

acoplada a la jeringa- liquido folicular depositado en tubo de centrifuga.
28
3.1.4 Recuperación y selección de ovocitos
El sedimento recuperado del líquido folicular se deposita en una placa de Petri de 100 x 15 mm con la ayuda de una pipeta
pasteur. La recuperación y selección de los ovocitos se hace bajo lupa estereoscópica (NIKON SMZ-745T MODEL C-DS).
Los ovocitos seleccionados son sumergidos en medio de lavado (TCM/HEPES) y pasados al menos 5 veces en gotas de 100µl
del mismo medio de lavado. Únicamente ovocitos tipo I y II son usados para la maduración in vitro.
Bajo cámara de flujo laminar son transferidos los ovocitos del medio de lavado al medio de maduración. Para este propósito
se toman máximo grupos de 20 ovocitos en gotas de 100µl de medio de maduración (TCM/SFB). Se recomienda marcar cada
caja con fecha (dd/mm/aa), número (1, 2, 3, etc.) y cohorte de la semana (I, II, III) siempre y cuando esto aplique.
Ilustración 4. Depósito de líquido folicular en placa Petri con ayuda de pipeta Pasteur
- Búsqueda y recuperación de ovocitos - Lavado de ovocitos en medio de lavado y de
maduración - Ovocitos seleccionados
Ilustración 5. Ovocitos seleccionados sumergidos en gotas de medio de maduración - Ovocitos

colocados dentro de incubadora - Pasadas 20-22 horas visualizamos ovocitos madurados.
29
Mantener los ovocitos seleccionados durante 22 a 24 horas 3.2.2 Gradientes de Percoll

en maduración bajo tensión del 5% de CO2, 38.5 °C y alta
humedad relativa (la proporción del medio por ovocito es de Se preparan 3 gradientes de Percoll (90%, 60%, 30%) para el
5µl:1 ovocito). lavado de los espermatozoides. Para preparar los gradientes
(ver Anexo 6). En un tubo de microcentrífuga se hace el mon-
taje de las columnas de Percoll cada una de 300 µl, deposi-
tando el de mayor densidad (90%) en el fondo, el de (60%)
3.2 Fertilización In vitro (FIV) en la mitad y en la superficie el de (30%) evitando las mez-
clas entre las mismas. Después de realizadas las columnas
Antes de cumplirse el tiempo determinado para la madura-
de Percoll, se colocan dentro de la incubadora a una tempe-
ción ovocitaria es necesario preparar medio de fertilización y
ratura de 38.5°C por un lapso de 2 horas.
de lavado de ovocitos (ver Anexo A).
Bajo cabina de flujo laminar se prepararan microgotas (100

µL c/u) de medio de fertilización distribuidas en placas de
Petri de 33 mm (Falcon®, Franklin Lakes, USA). Hacer gotas
de 50µL, luego cubrir con 1 ml de aceite mineral, comple-
tar la gota hasta 100µL y cubrir con 3 mL de aceite mineral.
Marcar cada caja con fecha (dd/mm/aa), número (1, 2, 3 etc.)
y cohorte de la semana (I, II, III) siempre y cuando esto apli-
que- Se preincuban por un tiempo de 3 horas en las mismas
condiciones descritas anteriormente.
Ilustración 7.Columnas de gradientes de Percoll en tubos de microcen-

trifuga puestos dentro de la incubadora para darles temperatura. .
3.2.3 Manejo y preparación del semen
Se coloca agua a baño maría a una temperatura de 35°C du-

rante al menos 15 minutos. Del termo de nitrógeno se toma
una pajilla de semen con el que va hacer realizada la fertili-
zación y se introduce en el agua ya atemperada durante 40
segundos. Seguidamente el semen descongelado se depo-
sita en un tubo de microcentrifuga con capacidad de 1.5 ml
y desde ahí, es colectado y agregado en la parte superior de
las tres columnas de Percoll.
En esas condiciones, el semen se centrifuga durante 3 minu-

tos a 11.0 rpm (centrifuga minispin, Eppendorf®, Hamburg).
Pasada la primera centrifugación, se toma del fondo del tubo
100µl de pellet (espermatozoides vivos) formado por el se-
men, en un nuevo tubo para microcentrifuga que contiene
1 ml de medio para lavado de espermatozoides, se deposita
los 100µL de semen y es sometido a centrifugar por segunda
Ilustración 6. Montaje de microgotas con medio de fertilización vez durante 45 segundos a 5.5 rpm.
30
Ilustración 8.Una vez terminada la 1 centrifugación del lavado del semen en las columnas de Percoll,
se observa ENUNCIADO SIN TERMINAR- En el fondo del tubo se observa el pellet (espermatozoi-
des vivos), en la parte intermedia espermatozoides muertos y en la parte superior plasma seminal y
crioprotector.
Al finalizar la segunda centrifugación, se recupera del fondo del tubo 70µL de semen el cual será utilizado para la fertilización
de los ovocitos madurados. Para determinar la concentración espermática se realiza dilución 1:20 (95 µL de agua con 5 µL
de semen seleccionado).
Realizada la dilución se monta la cámara de Neubauer en la cual se adiciona 10 µL en la parte superior y 10 µL en la inferior
y es llevada bajo luz de microscopio a 400X, donde se lleva a cabo el conteo de las células espermáticas. Mediante la ob-
servación de 5 cuadros, los cuales deben ser los 4 extremos y el medio, se determina el total de espermatozoides en ambos
lados de la cámara.
Ilustración 9. Cámara de Neubauer en la cual se señalan los 5

cuadros a tomar para el conteo espermático.
31
La diferencia en el conteo de las células espermáticas entre A partir de la concentración calculada, el volumen de semen
las dos cámaras no debe ser superior al 10%. Si llegara a necesario a ser aplicado en las gotas de fertilización, se de-
serlo deberá repetirse toda la operación desde el llenado de termina mediante la siguiente fórmula:
la cámara. El valor promedio del conteo de los dos lados de
la cámara se lleva a la siguiente ecuación:
Ecuación 1. *n= promedio del conteo de la cámara supe-

Ecuación 2. Cálculo del volumen de semen
rior e inferior de la cámara de Neubauer.
para cada gota de fertilización.
Teniendo en cuenta que la fertilización in vitro se realiza en gotas de 100 µL, la cantidad de espermatozoides para agregar a
cada gota se calcula de la siguiente manera: colocando como ejemplo una concentración de 2 millones de espermatozoides
por mL
Volumen 1: desconocido (el que se va a hallar)

Volumen 2: volumen de la gota de FIV
Concentración 1: concentración obtenida en cámara
Concentración 2: Concentración ideal mínima para la FIV
de Neubauer
Ecuación 3. Cantidad de espermatozoides para cada gota de FIV
Lavar los ovocitos al menos en 5 gotas, 3 gotas de 100µL correspondientes al medio de lavado y las dos últimas gotas co-
rrespondientes al medio de fertilización también de 100µL preincubados. Colocar grupos de máximo 20 ovocitos en cada
gota de fertilización y guardar inmediatamente en la incubadora al terminar el procedimiento. Los ovocitos madurados de-
ben permanecer en co-incubación con los espermatozoides durante 18 a 20 horas. El día de la FIV es considerado día 0 de
la producción de embriones.
32
Ilustración 10. Ovocitos madurados lavados en gotas de medio de lavado y de fertili-

zación- imagen de micromanipulador donde se observa un ovocito con espermato-
zoides pegados en la zona pelúcida.
3.3 Cultivo In Vitro (CIV)
Inmediatamente después de finalizar la fertilización se debe

preparar el medio de cultivo y lavado de ovocitos y llevar
dentro de la incubadora con las mismas condiciones atmos-
féricas (ver Anexo).
En una caja de Petri de 100 x 15 mm introducir 2 placas de

Petri de 33 mm. En estas realizar el mismo número de gotas
que se hizo durante todas las fases; cada gota de un tamaño
inicial de 50µl de medio de cultivo, en cada caja de Petri adi-
cionar 1 mL de aceite mineral, luego cada gota se completa
con 50 µl del medio y cubrir en totalidad con otros 3 mL
de aceite mineral. Marcar cada caja con fecha (dd/mm/aa),
número (1, 2, 3, etc.) y cohorte de la semana (I, II, III) siempre
y cuando esto aplique. Estas placas se deben llevar a la in-
cubadora junto con el sobrante de medio de cultivo y lavado.
Transcurridas las 20 horas de la fertilización retirar los ovo-
citos fecundados, hacer gotas de medio de cultivo y lavado
para su respectivo lavado; cada grupo de cigotos se debe
Ilustración 11. Montaje de microgotas
lavar en 3 gotas de medio de lavado y en 2 gotas de medio de con medio de cultivo
cultivo; después se deben colocar los presuntos embriones
en las gotas preincubadas; llevar a incubar por 7 días.
33
3.3.2 Estado de desarrollo según la IETS (International Embryo Transfer Society)
ESTADO DE DESARROLLO CLASIFICACION
No fecundado 1
1 a 2 células 2
Mórula temprana 3
Mórula 4
Blastocisto temprano 5
Blastocisto 6
Blastocisto expandido 7
Blastocisto eclosionado 8
Blastocisto eclosionado expandido 9
Estado de desarrollo y clasificación embrionaria
3.3.3 Grados de calidad según la IETS (International Embryo Transfer Society)
CALIDAD CLASIFICACION
Excelente:
Ningún efecto visible, al menos más del 85% intacto 1
Regular:
Irregularidades moderadas, 50% debe permanecer intacto 2
Mala:
Irregularidades mayores, 25% permanece intacto 3
Degenerado:
No viables 4
Tabla 6. Grados de Calidad y clasificación embrionaria.
34
Ilustración 12. A: Ovocito no fecundado. B: Ovocito con división 2 células. C: Mórula temprana. D: Mórula
compacta. E: Blastocisto temprano. F: Blastocisto. G: Blastocisto expandido 8 días. H: Blastocisto expandido
eclosionando 8-9 días. I: Blastocisto eclosionado y zona pelúcida 8-9 días.
35
3.4 Co-cultivo con células del cúmulus.

Durante la búsqueda de los ovocitos fueron seleccionados aquellos acor-
des a lo descrito en la Tabla 1 siendo tomados en cuenta el tipo I y II. Al
momento de agregar los ovocitos al medio de maduración se garantizó
que presentaran células de cúmulus para así lograr obtener las futuras
células que serán co-cultivadas.
Pasado el período de maduración son retirados los ovocitos siempre de-

jando células del cúmulus en dicha placa la cual permanece en la incu-
badora manteniendo en cultivo las células del cúmulus. El día que los
presuntos embriones serán sometidos al medio de cultivo, el medio de
maduración presente en la placa que contiene las células del cúmulus
con las gotas allí dispuestas será recambiado por medio de cultivo previa-
mente gasificado y atemperado, sin retirar las células del cúmulus que se
adhieren a la superficie de la placa. El recambio de medio se debe hacer
de la siguiente forma: con micropipeta se hace una renovación del medio,
retirando 50µL del medio de maduración el cual es desechado en un re-
cipiente de descarte y, agregando 50µL del medio de cultivo nuevo, este
procedimiento se realiza tres veces por cada gota presente en la placa,
preservando de esta manera las células del cúmulus que serán co-culti-
vadas pero, antes de agregar los presuntos embriones, dejar estabilizar la
placa durante al menos 2 horas.
Transcurridas 20 horas de la fertilización los posibles cigotos se pasan a

través de gotas de medio de lavado y cultivo para finalmente ser sumergi-
dos en la placa de cocultivo, donde estarán por 8 días. El día 4 de cultivo
se realiza la evaluación de la tasa de clivaje y se renueva el 50% del vo-
lumen de la gota de medio de cultivo y el día 7 se realiza la evaluación de
la tasa de blastocistos.
36
4. P R O T O C O L O D E
VITRIFICACIÓN POR MÉTODO OPS
4.1 Preparación del sistema OPS

El sistema OPS recibe su nombre de las siglas en inglés Open Pulled Straw, que significa, pajilla abierta y estirada, una vez
que, justamente es en una pajilla previamente estirada y con sus dos extremos completamente abiertos, donde se envasan
los embriones para poder llevarlos directamente al nitrógeno líquido y de esta manera realizar su vitrificación a -196°C.
Para realizar las OPS, es necesario tener pajillas de 0,25 ml y una platina de calentamiento. Tomándolas una a una, las pajillas
se sujetan de los extremos y sobre la platina precalentada a 200°C, las pajillas se aproximan y se hacen girar sobre esta, sin
llegar a hacer un contacto directo. El objetivo inicial es convertir el material plástico del cual están hechas las pajillas en un
material maleable. Una vez logrado este objetivo, se realiza una leve tracción de manera simultánea de cada extremo de la
pajilla hasta lograr estirarla levemente.
Este procedimiento se repite varias veces, hasta conseguir que cada pajilla haya doblado su longitud original, y consecuente-
mente, su diámetro interior haya sido reducido a la mitad. Las pajillas ya estiradas son cortadas en el centro y los extremos,
esto con el objetivo de dejar los extremos completamente libres (sin tapón).
4.2 Preparación de las soluciones

Para la preparación de las soluciones utilizadas durante el procedimiento de vitrificación es necesario tener listos los siguien-
tes reactivos:
- Solución de TCM-HEPES
- Suero fetal Bovino (SFB)
- Etilenglicol
- Dimetilsulfóxido (DMSO)
37
4.2.1 PREPARACIÓN
DEL MEDIO DE
MANTENIMIENTO
O MEDIO HOLDING
A 8 mL de solución de TCM-HEPES, adicionar 2 mL de suero fetal bovino, de esta manera se preparan 10 mL de una solución
al 20% de SFB. Filtrar la solución con membrana de 0,22µm, alicuotar y almacenar en la nevera (4°C).
4.2.2 Preparación de la solución de vitrificación 1
A 800 µL de medio de mantenimiento, adicionar 100 µL de etilenglicol y 100 µL de Dimetilsulfóxido. De esta forma cada
crioprotector debe quedar al 10% en la solución.
4.2.3 Preparación de la solución de vitrificación 2
A 800 µL de medio de mantenimiento, adicionar 200 µL de etilenglicol y 200 µL de Dimetilsulfóxido. De esta forma cada
crioprotector debe quedar al 20% en la solución.
4.3 Procedimiento de
vitrificación
Las soluciones preparadas son colocadas en volúmenes de 500 µL, de forma organizada en placas de cuatro pozos. De esta
manera, en los dos primeros pozos es colocada la solución de mantenimiento, en el tercer pozo la solución de vitrificación 1 y
en el cuarto pozo la solución de vitrificación 2. Es necesario que todas las soluciones y los materiales sean trabajados sobre
platina térmica y mantenidos a una temperatura de 39°C.
38
Ilustración 13. Soluciones de vitrificación sobre plancha térmica.
Con ayuda de una micropipeta y tomando pequeños volúmenes, los embriones a ser vitrificados son lavados en los dos pri-
meros pozos, correspondientes a la solución de mantenimiento. Posteriormente, son colocados durante 1 min en la solución
de vitrificación 1 y finalmente colocados durante 20 segundos en la solución de vitrificación 2.
Antes de completar los 20 segundos en la solución final, los embriones deben ser cargados es las OPS por capilaridad, te-
niendo presente no colectar junto con los embriones un volumen mayor a 2 µL. Inmediatamente después de haber cumplido
el tiempo, los embriones en las OPS son sumergidos directamente en el nitrógeno líquido.
Ilustración 14.OPS dentro de pajilla de 0.5, sumergida en nitrógeno líquido-termo

de nitrógeno donde se guardan los embriones vitrificados.
39
5. DESVITRIFICACIÓN O
CALENTAMIENTO DE LOS EMBRIONES VITRIFICADOS
5.1 Para el calentamiento de los embriones que hayan sido vitrificados, es necesario preparar una nueva solución.
5.1 Preparación de solución de Sucrosa

Son adicionados 1.7115 g de sucrosa a 4,5 mL de solución de TCM-HEPES, esta solución debe ser calentada a 40-45°C para
facilitar su dilución, y finalmente se completa con más TCM-HEPES, hasta alcanzar un volumen de 6 mL. De esta solución
inicial se toman 4 mL y a estos se les debe adicionar 1 mL de suero fetal bovino.
5.1.1 Procedimiento
Antes del calentamiento, las soluciones de mantenimiento y de sucrosa deben ser colocadas de forma organizada en una
placa de 4 pozos. De esta manera, en los pozos 1 y 2 son colocados 800 µL de medio de mantenimiento, mezclados con 400
µL de solución de sucrosa; en el pozo 3 se colocan 800 µL de medio de mantenimiento, mezclados con 200 µL de solución
de sucrosa; y finalmente en el pozo 4 se colocan 800 µL de únicamente medio de mantenimiento.
Durante el procedimiento, todas las soluciones son mantenidas en platina térmica a 39°C. Inmediatamente después de
retirar la OPS con los embriones del termo de nitrógeno, esta es sumergida en la solución del pozo 1 hasta lograr su descon-
gelamiento; de aquí es retirada y colocada durante 5 min en el pozo 2. Posteriormente es dejada otros 5 min. en el 3er pozo
y finalmente es llevada al pozo 4 hasta su uso.
40
6. ANEXO
MEDIOS DE CULTIVOS Y SOLUCIONES
Soluciones Stock
41
Solución TCM S/H. (solución base para el medio de MIV)
REACTIVO MARCA REFERENCIA CANTIDAD
TCM 199 S/H Sigma M5017 9.5 g
NaHCO3 Sigma 56297 2.2 g
H2O Sigma W1503 1000 ml
Filtrar, refrigerar a 5°C, filtrar, empacar en tubos de 50 ml (falcón), duración máxima 15 días.
Solución TCM C/H. (solución de lavado)
TCM 199 C/H Sigma M2520 14.9 g
NaHCO3 Sigma 56297 2.2 g
H2O Sigma W1503 1000 ml
Filtrar, refrigerar a 5°C, filtrar, empacar en tubos de 50 ml (falcón), duración máxima 15 días.
Solución FSH
REACTIVO MARCA CANTIDAD
TCM 199 Sigma 10 ml
FSH Sigma 10 mg
Hacer alícuotas de 10µl. proteger de la luz. Congelar. Duración 3 meses
42
Solución LH
TCM 199 Sigma 15 ml
LH Sigma 30.000UI
Hacer alícuotas de 10µl. proteger de la luz. Congelar. Duración 3 meses
Solución Penicilina/Estreptomicina.
H2O Millipore Direct-Q 3 5ml 10ml
Penicilina Sigma P3032 0.304 g 0.608 g
Estreptomicina Sigma S1277 0.25 g 0.5 g
Filtrar, hacer alícuotas de 30 µL. Proteger de la luz, congelar. Duración 3 meses
Solución Cysteamina
Cysteamina Sigma M6500 11.3 mg
TCM S/H Solución stock Sigma M5017 10 ml
Filtrar, hacer alícuotas de 30 µL, proteger de la luz, congelar, duración 3 meses
43
Solución Heparina
NaCl 0,9% Gibco 5 ml 10 ml
Heparina Sigma 0.005 g 0.010 g
Solución Penicilamina
Penicilamina Sigma 1,5 mg 3,0 mg
Hacer alícuotas de 30 µL. Proteger de la luz. Congelar
Solución Cysteamina
Cysteamina Sigma M6500 11.3 mg
TCM S/H Solución stock Sigma M5017 10 ml
Filtrar, hacer alícuotas de 30 µL, proteger de la luz, congelar, duración 3 meses
44
Solución Hipotaurina
Hipotaurina Sigma 0,545 mg 1,09 mg
Solución Epinefrina
H2O milli-Q Gibco 10 ml 50 ml
Ácido láctico Sigma 33 mg= 26 µL 165 mg= 130 µL
Metabisulfito (Na2SO5) Sigma 10 mg 50 mg
pH 4,0
Del volumen de 50 ml, retirar 40 ml y añadir la epinefrina o del volumen de 10 ml retirar 8
ml y añadir la epinefrina
Epinefrina Sigma 0,36 mg 1,83 mg
45
Solución PHE
100 µL 200 µL
NaCl 0,9% 40 µL 80 µL
Penicilamina Sigma 25 µL 50 µL
Hipotaurina Sigma 25 µL 50 µL
Epinefrina Sigma 10 µL 20 µL
Proteger de la exposición a la luz.
Maduración In vitro de ovocitos
Medio de lavado de ovocitos
REACTIVO CONCENTRACIÓN MARCA REFERENCIA VOLUMEN
5.0 ml 10.0 ml
TCM 199 C/H Sigma M2520 4.745 µL 9.490 µL
SFB* 5% 250 µL 500 µL
Solución 50 UI/ml Sigma P3032 5 µL 10 µL
Penicilina 50 µg/ml Sigma S1277

Estreptomicina
*SFB: Suero Fetal Bovino
46
Medio de maduración de ovocitos
5 ml
TCM 199 S/H Sigma M5017 4385 µL
SFB 10% Sigma 500µL
FSH 0.05 µg/ml Sigma 50,0 µL
LH 5,0 µg/ml Sigma 50,0 µL
Solución 50 UI/ml Sigma P3032
Penicilina 50 µl/ml Sigma S1277 5,0 µL
Estreptomicina
Cisteamina 100mM Sigma M9768 10 µL
47
Fertilización In vitro de ovocitos
Medio de fertilización TALP-FEC ESTOQUE
REACTIVO MARCA CANTIDAD 50 ML
H2O Ultra pura 50 ml
NaCL Sigma 0,333g
NaH2PO4 Sigma 0,002g
NaHCO3 Sigma 0,105g
KCL Sigma 0,012g
MgCl2.6H2O Sigma 0,005g
CaCl2.2H2O Sigma 0,015g
Ácido láctico 98% Sigma 44 µL
Rojo fenol Sigma 0,001g
Piruvato de sodio Sigma 0,0011g

Solución
Penicilina Sigma 50 µL
streptomicina
Ph 7.7-7.9
48
Medio de fertilización Final
REACTIVO CONCENTRADO VOLUMEN
TALP-FEC
1350 µL 450 µL
ESTOQUE
PHE 60 µL 20 µL
Heparina 20 µg/mL 30 µL 10 µL
Proteger de la exposición a la luz.
Medio para preparar los gradientes de Percoll

Solución TALP-10X
H2O Ultra-pura 10 ml 50 ml
NaCl Gibco 0,584 g 2,7 g
NaH2PO4 Sigma 0,0048 g 0,024 g

NaHCO3 Sigma 0,21 g 1,05 g
KCL Sigma 0,0235 g 0,117 g
Ácido Láctico 98% Sigma 230 µL 1133 µL
Piruvato de sodio Sigma 0,011 g 0,055 g
Hepes Sigma 0,238 g 1,19 g
MgCl2.6H2O Sigma 0,031 g 0,155 g
Rojo fenol Sigma 0,0001 g 0,001 g
Solución
Penicilina Sigma 10 µL 50 µL
Streptomicina
pH
7.2-7.4
49
Solución TALP-sp ESTOQUE
H2O Ultra pura 50 ml 100 ml
NaCl Gibco 0,292 g 0,584 g
NaH2PO4 Sigma 0,00175 g 0,0035 g
KCL Sigma 0,0115 g 0,023 g
Ácido Láctico 98% Sigma 95 µL 190 µL
Hepes Gibco 0,119 g 0,238 g
NaHCO3 Sigma 0,105 g 0,210 g
Rojo fenol Sigma 0,0005 g 0,001 g
CaCl2.2H2O Sigma 0,0155 g 0,031 g
MgCl2.6H2O Sigma 0,031 g 0,155 g
Piruvato de sodio Sigma 0,0055 g 0,011 g

Solución
Penicilina Sigma 50 µL 100 µL
Streptomicina
pH
7.2-7.4
50
Solución TALP-sp Uso
TALP-sp ESTOQUE 4,985 µL 9,970 µL
BSA fracción V Sigma 0,03 g 0,06 g

Piruvato de sodio esto-
Sigma 10 µL 20 µL
que 100 mM
Penicilina
Sigma 5,0 µL 10 µL
Streptomicina
Gradientes de Percoll 90 - 60 - 30%
Percoll 90%
1500 µL 3000 µL
Percoll 100% GH 1350 µL 2700 µL
Talp 10x 150 µL 300 µL
Percoll 90%
REACTIVO CANTIDAD
300 µL 600 µL
Percoll 90% 200 µL 400 µL
TALP sp USO 100 µL 200 µL
51
Percoll 30%
REACTIVO CANTIDAD
300 µL 600 µL
Percoll 90% 100 µL 200 µL
TALP sp USO 200 µL 400 µL
Cultivo In vitro
5 ml 10 ml
TCM 199 S/H Sigma M5017 4386 µL 8840 µL
SFB 10% 500 µL 1000 µL
Solución 100 UI/ml Sigma P3032 5 µL 10 µL
Penicilina 100 µL/ml Sigma S1277
Estreptomicina
Piruvato de sodio 100 mM Sigma P4562 75 µL 150 µL
Cysteamina 100µM Sigma M9768 34 µL 68 µL
Cultivar por 7 días, hacer cambio de medio (feeding) en el día 4 de cultivo, evaluar clivaje.
Medio recomendado para cultivo de embriones en ambiente de solo CO2 regulado.
52
7. BIBLIOGRAFÍA
Albarracín Monje J. (2005). Vitrificación de ovocitos bovinos mediante la técnica open pulled straw: Estudio estruc-
tural de cromosomas, microtúbulos, y microfilamentos y posterior desarrollo embrionario in vitro. Tesis doctoral.
Universidad Autónoma de Barcelona. Arav A. (1992). Vitrification of oocytes and embryos In: LAURIA, A., GANDOL-
FI, F., Embryonic
Development and Manipulation in Animal Production. Port Press, London and Chapel Hill, 22: 255-264.
Bó, G. A., & Mapletoft, R. J. (2013). Evaluation and classification of bovine embryos. Anim. Reprod., 10(3), 344–348.
Bols, P., Van Soom, A., Ysebaert, M., Vandenheede, J., & de Kruif, A. (1996). Effects of aspiration vacuum and needle
diameter on cumulus oocyte complex morphology and developmental capacity of bovine oocytes. Theriogeno-
logy, 45(5), 1001–1014.
Bosch, P., Blanch, M. S., Ferrero, S., Díaz, H., Piccatto, F., & Bosch, R. A. (2006). Desarrollo de embriones caprinos in
vitro: Efecto del co-cultivo con células epiteliales de oviducto. Revista Cientifica de La Facultad de Ciencias Vete-
rinarias de La Universidad Del Zulia, 16(3), 273–281.
Brucker, C., & Lipford, G. B. (1995). The human sperm acrosome reaction: physiology and regulatory mechanisms.
An update. Human Reproduction Update, 1(1), 51–62. by slow frezzing and vitrification. Reproduction, 1-19 Cabrera,
P., Yoong, W., & Gamarra, G. (2009). Evaluación de la fertilidad in vitro del semen de toros jóvenes nacionales en
ovocitos provenientes de ovarios de animales beneficiados. Revista de Investigación Veterinaria del Perú, 20 (1),
28–32.
Cabrera, P., Fernández, A., Bastidas, P., Molina, M., Bethencourt, A., Díaz, T. (2006). Vitrificación: Una Alternativa
para la Criopreservación de Embriones. Rev. Fac. Cie. Vet. 47 (1): 9-23.
Carvalho E. (2006).Vitrificação de ovócitos e embriões bovinos utilizando-se etilenoglicol, dimetilsulfóxido e di-

metilformamida como agentes crioprotetores. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Universidade Es-
tadual Paulista: 121 Córdoba IRAC, 309.
53
Cromcomo, L., Wolf, C., Fernanda, C., & DB, S. (2012). Producão de embriões in vitro: Estresse oxidativo e antioxidan-
tes. Vet e Zootec, 19 (4), 470-479.
Cuello C., Gil M., Almiñana C., Sánchez J., Parrilla I., Caballero I., Vázquez J., Roca J., Rodríguez H., Martínez E. (2007).
Vitrification of in vitro cultured porcine two-tofour cell embryos. Theriogenology. 2007; 60: 258-264
Dobrinsky JR. (1996). Cellular approach to cryopreservation of embryos. Theriogenology, 45: 17-26
Dobrinsky JR., Pursel VG., Long CR., Johnson LA. (2000). Birth of piglets after transfer of embryos cryopreserved by
cytoskeletal stabilization and vitrification. Biol Reprod, 62: 564-570
Fahy GM., Macfarlane D., Angell CA., Meryman HT. (1984). Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobio-
logy, 21(4): 407-426.
Farin, P., Crosier, C., & Farin, C. (2001). Influence of in vitro systems on embryo survival and fetal development in
cattle. Theriogenology, 55, 151-170.
Gallí, C., Duchi, R., Grotti, G., Turini, P., Ponderato, N., Colleoni, S., et al. (2003). Bovine embryo technologies. Therio-
genology, 59, 599-616.
Garcia Diaz, J., Romero Aguirregomezcorta, J., Astiz blanco, S., & Ruiz Lopez, S. (2013). Adición de sustancias antioxi-
dantes en los medios de cultivo empleados en la producción in vitro de embriones en mamíferos. Rev Salud Anim,
35 (1), 10-19.
Gonçalves, P., Barreta, M., Sandri, L., Ferreira, R., & Antoniazzi, A. (2007). Produção in vitro de embriões bovinos: O
estado da arte. Rev Bras Reprod Anim, 31 (2), 212217. Gonçalves, P., Visinti, J., Oliveira, M., Montagner, M., y Costa,
L. (2002). Produção in vitro de Embriões. In P. Gonçalves y M. Oliveira (Eds.), Biotécnicas Aplicadas à Reprodução
animal (pp. 195–227). Sao paulo: Varela editora e livraria Ltda.
(Eds.), Biotécnicas Aplicadas à Reprodução animal (pp. 195–227). Sao paulo: Varela editora e livraria Ltda.
González, F. H. D. (2002). Introdução a Endocrinologia Reprodutiva Veterinária. (UFRGS, Ed.). Porto Alegre.
Gottardi, F., & Mingoti, G. (2009). Maturação de oócitos bovinos e influência na aquisicão da competência para o
desenvolvimento do embrião. Rev Bras Reprod Anim, 33 (2), 82-94.
Guérin P, M. S. (2001). Oxidative stress and protection against reactive oxygen species in the pre-implantation em-
bryo and its sorroundings. Human Reproduction Update, 7 (2), 175-189.
Guerra A., Solís G., Sandoya L., & de Armas R. (2011). Evaluación de tres protocolos de criopreservación de embriones
bovinos obtenidos in vitro e in vivo. IX Simposio Internacional de Reproducción Animal. Instituto de Reproducción
Animal de Córdoba IRAC, 309
Gustavo, A. (2001). Biotecnología de la Reproducción (Primera ed.). Argentina: Instituto Nacional de Tecnología
Agropecuaria.
54
Gutiérrez, A., Rizos, D., Fair, T., Moreira, P., Pintado, B., de la Fuente, J., Lonergan, P. (2004). Effect of speed of
development on mRNA expression pattern in early bovine embryos cultured in vivo or in vitro. Molecular Repro-
duction and Development, 68 (4), 441–448.
Hafez, E. S. E., & Hafez, B. (2000). Reproducción e inseminación artificial en animales. (W. y W. I. USA, Ed.) (7th
ed.). Mexico.
Hasler, J. F. (2000). In-vitro production of cattle embryos : Problems with pregnancies and parturition. Human
Reproduction, 15, 47–58.
Herradón, P., Quintela, L., Becerra, J., Rubial, S., & Fernández, M. (2007). Fecundación in vitro: Alternativa para la
mejora genética en bovinos. Arch Latinoam Prod Anim, 15 (1), 33-40.
Kasai M & Mukaida T. (2004). Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification. Reprod Biomed
online, 9: 164-170
Kasai M. (2002). Advances in the cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: Development of ultra-
rapid vitrification. Reproductive Medicine and Biology, 1: 1-9
Larocca, C., Fila, D., Kmaid, S., Fernandez, A., Lago, I., & Roses, G. (1998). Viabilidad de embriones bovinos produ-
cidos in vitro congelados-descongelados en dos medios de cultivo con ß-mercaptoetanol. Archivos De Zoo-
tecnia, 47, 3–10.
Lawrence, T., & Fowler, V. (2002). Growth of farm animals. (F. Chippendale, Ed.) (2nd ed.). USA: Cabi.
Lazar L., Spak J., Dávid V. (2000). The vitrification of in vitro fertilized cow blastocysts by the open pulled straw
method. Theriogenology, 54: 571-578.
Liebermann J., et al. (2003). Recent developments in human oocyte, embryo and blastocyst vitrification: Where
are we now. Reprod Biomed Online, 7: 623-633
Lonergan, P., Rizos, D., Ward, F., & Boland, M. P. (2001). Factors influencing oocyte and embryo quality in cattle.
Reproduction, Nutrition, Development, 41 (5), 427–437.
López, A., & Olivera, M. (2007). Efecto del cocultivo sobre el desarrollo temprano de embriones bovinos produ-
cidos in vitro. MVZ Córdoba, 12 (2), 1061–1067.
Lu, K., & Seidel Jr, G. (2004). Effects of heparin and sperm concentration on cleavage and blastocyst develop-
ment rates of bovine oocytes inseminated whith flowcytometrically-sorted sperm. Theriogenolgy, 62, 819-830.
Luster SM. (2004). Cryopreservation of bovine and caprine oocytes by vitrificaction. The Interdepartamental
Program in Animal Sciences.
Machatkova, M., Hulinska, P., Reckova, Z., Hanzalova, K., Spanihelova, J., & Pospisil, R. (2008). In vitro production
of embryos from high performance cows and the development of frozen-thawed embryos after transfer: A field
study. Veterinarni Medicina, 53 (7), 358–364.
Machaty, Z., Peippo, J., & Peter, A. (2012). Production and manipulation of bovine embryos: technniques and
55
terminology. Theriogenology, 78, 937-950.
Mavrides A., & Morroll D. (2002). Cryopreservation of bovine oocytes: Is cryoloop vitrification the future to
preserving the female gamete. En: Reprod. Nutr. Dev, 42: 73-80
Molina I., Cervera R., Duque C., Alfonso J., ROMEU A. (2004). Criopreservación de ovocitos humanos. Vitrifi-
cación vs. Congelación. Rev Iber Fert, 21(3)
Moore K., Rodriguez Cj., Kramer JM., Johnson S., Wroclawska E., Goicoa S & Nasari A. (2007). In vitro produc-
tion of bovine embryos in médium supplemented with a serum replacer: Effects on blastocyst development.
Cryotolerance and survival to term. Theriogenology, 68:1316-1325
Moraes, A. (2010a). Foliculogênese. In A. Moraes y J. Fora (Eds.), Reprodução da Fêmea Bovina (1st ed., p.
420). Valença-RJ.
Mucci N., Aller J., Kaiser GG., Hozbor F., Cabodevila J., Albeiro RH. (2006). Effect of estrous cow serum during
bovine embryo culture on blastocyst Development and cryotolerance after slow freezing or vitrification.
Theriogenology 2006; 65:1551- 1562.
Otoi T., Yamamoto K., Koyaman N., Tachikawa S., Suzuki T. (1998). Cryopreservation of mature bovine oo-
cytes by vitrification in straws. Cryobiology, 37: 77-85
Palma, G. A. (2008). Producción in vitro de embriones bovinos. In Biotecnología de la reproducción (2nd ed.,
p. 699). Reprobiotec. Retrieved from.
Park, Y., Kim, S., Kim, J., Park, H., & Byun, M. (2005). The effects of duration of in vitro maturation of bovine
oocytes on subsequent development, quality and transfer of embryos. Theriogenology, 64, 123-134.
Parris, J. (2014). Bovine in vitro fertilitation: In vitro oocyte maturation and sperm capacitation with heparin.
Theriogenology, 81(1), 67-73.
Peterson, A., y Lee, R. S. F. (2003). Improving successful pregnancies after embryo transfer. Theriogenology,
59(2), 687–697.
Picton H., Gosden R., Leibo S. (2002). Cryopreservation of oocytes and ovarian tissue. Gamete source, ma-
nipulation and disposition.
Rall WF y Fahy GM. (1985a). Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature,
313: 573-575
Sánchez J., Cuello C., Gil MA., Almiñana C., Parrilla I., Caballero I., García EM., Vásquez JM., Roca J., Martínez EA.
(2008). Factors affecting the success rate of porcine embryo vitrification by the Open Pulled Straw method.
Animal Reproduction Science, 108: 334-344
Saragusty J., & Arav A. (2011). Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow frezzing and
vitrification. Reproduction, 1-19
56
Senger, P. L. (2003). Pathways to Pregnancy and Parturition (2nd ed.). Washington: Current Conceptions,
Incorporated.
Shaw J.M., Jones G.M. (2003). Terminology associated with vitrification and other cryopreservation proce-
dures for oocytes and embryos. En: Hum Reprod Upd, 9
Silva M.; Berland A. Vitrificación de blastocístos bovinos producidos in vitro con el método Open Pulled
Straw (OPS): Primer reporte. Arch. Med. Vet, 36 (1)
Stringfellow, D., & Givens, M. (2010). Manual of the International Embryo Transfer Society (IETS). Champaign,
IL.
Thibier M. (2007) The worldwide activity in farm animals embryo transfer. Embryo Transfer Newsletter, 25:
4-9
Urrego, R., Tarazona, A., Olivera, M., & Camargo, O. (2008). Simplificación de la fertilización de ovocitos du-
rante la producción in vitro de embriones bovinos. Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias, 21, 398–405.
Vajta G. (2000a) Vitrification of the oocytes and embryos of domestic animals. Anim Reprod Sci, 260-61:
357-364
Vajta G. (2000b). Vitrification of the oocytes and embryos of domestic animals. Anim Reprod Sci, 260-61:
357-364
Vajta G., Kuwayama M. (2006) Improving Cryopreservation systems. Theriogenology, 65:236-24
Vanderzwalmen P. (2002). Births after vitrification at morula and blastocyst stages: Effect of artificial reduc-
tion of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction, 17:744-751
Ward, F., Enright, B., Rizos, D., Boland, M., & Lonergan, P. (2002). Optimization of in vitro bovine embryo
production: Effect of duration of maturation, length of gamete co-incubation, sperm concentration and sire.
Theriogenology, 57, 2105-2117.
Woods EJ et al.2004. Fundamental cryobiology of reproductive cells and tissues. Cryobiology, 48:146-156.
Wowk B. (2010). Thermodynamic aspects of vitrification. Cryobiology, 60: 11-22
57

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Jorge Leonardo García Arévalo

Servicio Nacional de Aprendizaje – SENA

Jorge Leonardo García Arévalo

Jose Antonio Lizarazo Sarmiento Claudia Johanna Gomez Perez

Emilio Eliecer Navia Zuñiga

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA PRODUCCIÓN Y VITRIFICACIÓN DE EMBRIONES BOVINOS

Para citar este manual:

Hecho el depósito que exige la ley.

Alfonso Prieto García Nancy Duarte Pabón

Felipe Andrés Gómez Velásquez Julia Teresa Bedoya Mashut

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA PRODUCCIÓN Y VITRIFICACIÓN DE EMBRIONES BOVINOS

Jorge Leonardo García Arévalo

1.1. Objetivo general 17

2.1 Producción In Vitro de Embriones Bovinos 17

3.1 Maduración In vitro (MIV) 27

4. Protocolo de Vitrificación por método OPS 37

5. Desvitrificación o calentamiento de los embriones vitrificados 40

5.1 Preparación de solución de Sucrosa 40

Maduración In vitro de ovocitos 46

Ilustración 1. Montaje de microgotas de medio de maduración, gasificación en incubadora ............27

Ilustración 6. Montaje de microgotas con medio de fertilización. ......................................................................................30

Ilustración 7. Columnas de gradientes de Percoll en tubos de microcentrifuga puestos dentro

Ilustración 9. Cámara de neubauer en la cual se señalan los 5 cuadros a tomar para el

Ilustración 10. Ovocitos madurados lavados en gotas de medio de lavado y de fertilización-

Ilustración 11. Montaje de microgotas con medio de cultivo ..................................................................................................33

Ilustración 12. A: Ovocito no fecundado. B: Ovocito con división 2 células. C: Mórula

Ilustración 13. Soluciones de vitrificación sobre plancha térmica. .....................................................................................38

Ilustración 14. OPS dentro de pajilla de 0.5, sumergida en nitrógeno liquido-termo de

Tabla 1. Clasificación de los grados de calidad ovocitaria ..........................................................................................18

Ecuación 1. *n= promedio del conteo de la cámara

CITOPLASMA: CORPÚSCULO POLAR:

1.1. Objetivo general

1.2. Objetivo específico

2.1 Producción In Vitro de Embriones Bovinos

Tabla 1. Clasificación de los grados de calidad ovocitaria

2.1.1 Obtención de los Complejos Cúmulos

El tiempo para que ocurra este proceso es de aproximada-

En condiciones in vitro el proceso de fecundación se pue-

Las metodologías de mayor uso en los laboratorios para el

Inmediatamente es efectuada la fertilización, es producida la reacción cortical en la membrana plasmática del

2.1.6 Desarrollo Embrionario

2.1.7 Co-cultivo con células del cúmulus

Dependiendo de su formulación, han sido clasificados tres

Durante el período de cultivo los embriones presentan una

Las principales fuentes de energía son la glucosa y el piru-

En estados más avanzados del desarrollo embrionario, ha

2.2 Evaluación de embriones

Tabla 2. Desarrollo y Clasificación embrionaria

ESTADO DE DESARROLLO CLASIFICACION

Adaptado de (Bó y Mapletoft, 2013)

Tabla 3. Clasificación y Grados de calidad embrionaria

Adaptado de (Palma, 2008)

2.2.2 Calidad embrionaria

Tabla 4. Calidad Embrionaria

CÓDIGO ESTADO CARACTERÍSTICAS

Masa embrionaria esférica y simétrica, con blastómeros uniformes en

2.3 Criopreservación de embrio- hasta 14000ºC/min), permaneciendo en este estado du-

Los protocolos de desvitrificación deben tratar de disminuir la posibili-

3.1 Maduración In vitro (MIV)

3.1.1 Montaje de las microgotas

Ilustración 1. Montaje de microgotas de medio de maduración, gasificación en incubadora

3.1.2 Transporte de ovarios de vacas faenadas