2019 Estandarizacion Procedimientos Produccion

ESTANDARIZACIÓN DE PROCEDIMIENTOS PARA LA PRODUCCIÓN IN
VITRO DE EMBRIONES OVINOS EN EL LABORATORIO DE REPRODUCCIÓN

ANIMAL EN EL CENTRO ACADÉMICO GUATIGUARÁ – PIEDECUESTA.
WILSON FERNEY RODRÍGUEZ CORNEJO

ID: 353624
UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
BUCARAMANGA
2019
1
ESTANDARIZACIÓN DE PROTOCOLOS DE MADURACIÓN, FERTILIZACIÓN
Y CULTIVO IN VITRO OVINO EN EL LABORATORIO DE LA REPRODUCCIÓN
ANIMAL EN EL CENTRO ACADÉMICO Y AGROPECUARIO GUATIGUARÁ –
PIEDECUESTA
Wilson Ferney Rodríguez Cornejo

ID: 353624
Práctica Empresarial Presentada para Optar por el Título de Médico

Veterinario Zootecnista
Director:
Edgar Ricardo Moreno Jerez
Tutor interno – Tutor externo
UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
BUCARAMANGA
2
NOTA DE ACEPTACIÓN
_________________________
_________________________
_________________________
_________________________
_________________________
Presidente del jurado
_________________________
Jurado
________________________
Jurado
Bucaramanga, _____ de _________________ del 2019.
3
DEDICATORIA
Este trabajo se lo dedico a mis padres Wilson y Martha por el esfuerzo que día a
día hicieron durante mi formación académica, por su amor, comprensión, educación,
entrega, enseñanzas y apoyo que solo el amor de padres puede ofrecer
incondicional y plenamente.
A mis hermanas Fernanda y Nathalia por su cariño, apoyo constante en cada uno
de mis logros, por ser un buen ejemplo de lucha, dedicación y por la motivación para
salir adelante profesionalmente.
A mis tíos Miguel A. Cornejo y Arturo Rodríguez quienes anhelaron y me motivaron

demostrando que con esfuerzo y trabajo todas nuestras metas y sueños los
podemos hacer realidad.
4
AGRADECIMIENTOS
En primera instancia doy gracias a Dios por haberme permitido finalizar está etapa
de formación, por guiarme y acompañarme a lo largo de estos año de carrera, por
brindarme una vida llena de experiencia, aprendizaje.
Quiero expresar mi más profundo agradecimiento al Dr. Edgar Ricardo Moreno

Jerez por su apoyo y acompañamiento en todas las áreas del conocimiento al que
le debo la oportunidad y disposición de todos los materiales e infraestructura
necesaria para la realización de mi práctica social empresarial y solidaria en el
laboratorio.
Gracias a la Universidad Cooperativa de Colombia y a los docentes que hicieron

parte de este proceso, por sus aportes y conocimientos en cada uno de las áreas,
por sus dedicaciones y espacios brindados, porque hicieron de sus clases
momentos de grandes aprendizajes.
A mis compañeros porque de ellos aprendí experiencias diferentes, compartí

momentos de trabajo y de amistad permitiendo culminar mi carrera con buenas
personas. Finalmente me siento orgulloso de culminar este gran logro que me hará
un gran profesional.
5
CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCION ................................................................................................... 13
1. ASPECTOS GENERALES ................................................................................ 14

1.1 Título de la práctica.......................................................................................... 14
1.2 Planteamiento del problema ............................................................................ 14
1.3 Formulación del problema ............................................................................... 14
2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 15
2.1 Objetivo General .............................................................................................. 15
2.2 Objetivos Específicos....................................................................................... 15
3. MARCO DE REFERENCIA ............................................................................... 16

3.1 Marco Teórico .................................................................................................. 16
3.1.1 Colecta y transporte de ovarios de beneficio ................................................ 16
3.1.2 Criterios para la selección de oocitos ........................................................... 16
3.1.3 Maduración In Vitro (MIV) ............................................................................. 17
3.1.3.1 Maduración Nuclear ................................................................................... 17
3.1.3.2 Maduración Citoplasmática........................................................................ 18
3.1.4 Fertilización In Vitro (FIV) ............................................................................. 18
3.1.4.1 Capacitación .............................................................................................. 19
3.1.5 Cultivo In Vitro (CIV) ..................................................................................... 19
3.1.5.1 Desarrollo embrionario temprano .............................................................. 19
3.1.5.2 Etapas del desarrollo del embrión ............................................................. 20
3.1.6 Componentes................................................................................................ 20
3.1.6.1 Aminoácidos .............................................................................................. 20
3.1.6.2 Piruvato de sodio: fuente de energía ......................................................... 21
3.1.6.3 Suero fetal: macromoléculas ..................................................................... 21
3.2 Marco Geográfico y Contextual ....................................................................... 22
3.2.1 Presentación de la empresa ......................................................................... 24
3.2.2 Misión............................................................................................................ 24
3.2.3 Visión ............................................................................................................ 24
3.2.4 Estructura Organizacional............................................................................. 25
3.3 Marco Normativo.............................................................................................. 25
4. MATERIALES Y METODOS.............................................................................. 27
4.1 Caracterización del Sistema Productivo .......................................................... 27
4.1.1 Ubicación Geográfica.................................................................................... 27
4.2 Población y Muestra ........................................................................................ 27
4.3 Materiales ........................................................................................................ 28
6
5. METODOLOGÍA ................................................................................................ 29
5.1 Tipo de Estudio ................................................................................................ 29
5.2 Fases o Etapas ................................................................................................ 29
5.2.1 Diagnóstico Inicial ......................................................................................... 29
5.3 Estandarización de protocolos para la producción in vitro de embriones ........ 30
5.3.1 Colecta, manejo y Slicing de ovarios ovino-caprinos beneficiados. ............. 30
5.3.2 Selección y clasificación de ovarios ............................................................. 31
5.3.3 Maduración in vitro (MIV) .............................................................................. 31
5.3.4 Preparación de las columnas de percoll y manejo del semen para la
fertilización in vitro (FIV) ........................................................................................ 32
5.3.5 Fertilización In Vitro (FIV) ............................................................................. 33
5.3.6 Cultivo In Vitro (CIV) ..................................................................................... 33
5.4 Resultados y Discusión.................................................................................... 33
5.4.1 Recuperación de oocitos .............................................................................. 34
5.4.2 Clasificación según la calidad ....................................................................... 34
5.4.3 Porcentaje de la tasa de clivaje y la tasa de blastocistos ............................. 35
6. CONCLUSIONES .............................................................................................. 37
7. RECOMENDACIONES ...................................................................................... 38
BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 39
ANEXOS ................................................................................................................ 42
7
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Total de ovarios y oocitos recuperados ................................................... 34
Tabla 2. Calidad oocitaria ...................................................................................... 35
Tabla 3. Porcentaje de clivaje y de blastocisto a partir de los oocitos puestos a
fecundar y de los embriones Clivados, en dos grupos experimentales Piruvato,
Cysteamina. ........................................................................................................... 36
8
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Límites del municipio de Piedecuesta Santander ................................... 23
Figura 2. Mapa localizacion municipio de Piedecuesta Santander ....................... 23
Figura 3. Estructura Organizacional ...................................................................... 25
Figura 4. Ubicación geográfica donde se encuentra ubicado el laboratorio de
biotecnología de la reproducción animal. .............................................................. 27
9
LISTA DE ANEXOS
Pág.
Anexo A. Medios de Cultivo ................................................................................... 42
Anexo B. Soluciones Stock .................................................................................... 46
Anexo C. Formatos de Recolección de Datos ....................................................... 49
Anexo D. Manual de procedimientos para la producción de embriones in vitro de
ovinos versión 2019 (Anexado en documento Word y en documento físico). ....... 52
10
ABREVIATURAS
ARNm: ácido ribonucleico mensajero
BSA: Albumina sérica bovina.
CCOs: Complejo cúmulus oocito.
CIM: medio de cultivo in vitro
CIV: cultivo in vitro
CL-: Ovario sin cuerpo lúteo.
CL+: Ovario con cuerpo lúteo.
CP: cuerpo polar.
FIV: Fecundación in vitro.
FSH: Hormona folículo estimulante.
GV: Vesícula germinal.
MII: metafase II
MIV: Maduración in vitro.
mL: Mililitro.
NaCl: Cloruro de sodio.
NCL: Ningún ovario con cuerpo lúteo.
PIV: producción in vitro de embriones
RA: reacción acrosomica
SOF: medio de cultivo a base de fluidos sintéticos del oviducto
TCM-199: Medio de cultivo tisular.
μl: Microlitro.
11
GLOSARIO
Cultivo in vitro: Procedimiento por el que se desarrolla artificialmente una

población de microorganismos o las células de un tejido.
Cysteamina: Compuesto tiol que puede ser utilizados por las células embrionarias
para la síntesis de antioxidantes.
Embrión: Es un organismo en su etapa más temprana de desarrollo, que no ha

adquirido la forma anatómica que permita reconocer a que especie pertenece.
In vitro: Técnica mediante la cual se logra realizar un determinado experimento en

un ambiente controlado fuera de un organismo vivo.
Incubadora: Dispositivo que sirve para mantener y hacer crecer cultivos

microbiológicos o cultivos celulares. La incubadora mantiene la temperatura, la
humedad y la concentración de gases en grado óptimo.
Osmolaridad: Concentración de las partículas osmóticamente activas contenidas

en una disolución, expresada en osmoles o en miliosmoles por litro de disolvente.
Técnica de Slicing: consiste en la realización de cortes longitudinales y

transversales con una hoja de bisturí́, en la superficie del ovario para liberar el
contenido folicular
12
INTRODUCCION
Las biotecnologías de la reproducción han sido desarrolladas como herramientas

para maximizar el potencial reproductivo de aquellos animales que pretendemos
multiplicar.(1) es por ello, que la producción in vitro de embriones (PIV) ha venido
incursionando en los últimos años como herramienta de los procesos
biotecnológicos en las diferentes especies de animales, permitiendo obtener
embriones de hembras con alteraciones del tracto reproductivo, y aprovechando
oocitos de hembras con edad avanzada o inclusive de hembras desahuciadas, y de
esta manera preservar la genética de dichos animales. Los avances de mayor
impacto en las últimas décadas están dirigidos a mejorar la eficiencia de cada uno
de estos factores.(2)
La PIV de embriones comprende las etapas de maduración de los oocitos,

capacitación de los espermatozoides, fecundación de los oocitos y cultivo de los
zigotos hasta el estadio de mórula o blastocisto.(3) Todo este proceso resulta
realizable y poco complejo siempre y cuando se minimice al máximo cada uno de
los factores que pueden llegar a interferir en el éxito de este proceso. En cabras y
ovejas, hay relativamente pocos estudios en esta área, pero el porcentaje de
blastocistos varía de aproximadamente 20% a 30%.(4) El desarrollo de los
embriones hasta estos estadios, son los deseados para poder seleccionarlos y
transferirlos o crio-consérvalos, y de esta manera reducir los costos con el número
de receptoras utilizadas; aunque el porcentaje es tan bajo, se han realizado
progresos en estos procesos y el cultivo in vitro (CIV) sigue siendo una de las etapas
limitantes en la PIV de embriones ovinos. (3)
Con respecto a las etapas de la maduración oocitaria se debe tener en cuenta la

obtención y clasificación de los oocitos, de tal manera, que al clasificarlos para los
procesos de PIV no deben estar madurados, por tanto, las gamétas no deben
presentar expansión de las células del cumulus, que posean al menos 3 a 4 capas
de células de la granulosa, citoplasma uniformemente granulado y con coloración
homogénea, ni muy clara y ni muy oscura.(3). Con el ámbito de estar a la vanguardia
de los procesos científicos, el laboratorio de Biotecnología de Reproducción Animal
de la Universidad Cooperativa de Colombia está dedicado al estudio de nuevas
biotecnologías aplicables a la reproducción, actualmente cuenta con instalaciones
modernas que facilitan dichos procesos, sin embargo, solo esta estandarizado el
manual de procedimientos para la producción in vitro de embriones en la especie
bovina, por esta razón, el objetivo de esta práctica social empresarial y solidaria va
encaminado a estandarizar los procedimientos para la producción in vitro de
embriones en ovinos y diseñar un manual de procedimientos que permita tener un
paso a paso a todo el personal educativo que requiera de dichos procedimientos y
así logre de la mejor manera obtener resultados eficientes. Cabe resaltar que el
manual queda a disposición del laboratorio y deberá realizarse una actualización
con respecto a la fecha de autorización, o bien, cada que requiera una modificación.
13
1. ASPECTOS GENERALES
1.1 Título de la práctica
Estandarización de protocolos de maduración, fertilización y cultivo in vitro en ovino

caprinos en el laboratorio de Biotecnología de la Reproducción Animal del centro
académico Guatigurá – Piedecuesta
1.2 Planteamiento del problema
La producción de embriones in vitro ovinos es un proceso biotecnológico, servicio

que el laboratorio puede ofrecer a la comunidad en general mostrando el avance
biotecnológico que se ha venido incursionando en los últimos años salvaguardando
animales con gran material genético o con problemas a nivel del aparato
reproductivo.
El laboratorio de biotecnología animal carece de una guía para la realización de

cada uno de los protocolos de maduración, fertilización y cultivo in vitro para obtener
embriones ovino-caprinos, para ello se ha venido trabajando durante la Práctica
social empresarial y solidaria con la realización de una serie de procesos
consecutivos en las nuevas tecnologías de la reproducción, con fines académicos,
investigativos como productivos para dicho laboratorio, debido al gran auge que se
ha venido llevando a cabo en la obtención de embriones a nivel de laboratorio.
Por esta razón se ha considerado la necesidad de realizar una estandarización de

cada uno de los protocolos de la producción in vitro de embriones (PIV), el cual será
plasmado en un manual de procedimientos que contenga el paso a paso de cada
uno de los procesos biotecnológicos.
1.3 Formulación del problema
¿Cuáles son los procesos y metodologías que se debe llevar a cabo en cuanto a la
obtención oocitaria, maduración, fertilización y cultivo para la producción de
embriones in vitro a nivel de laboratorio
14
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo General
Estandarizar los procedimientos para la producción in vitro de embriones ovinos en

el laboratorio de Reproducción Animal del Centro Académico Agropecuario
Guatigurá – Piedecuesta
2.2 Objetivos Específicos
ü Evaluar la tasa de recuperación oocitaria por ovario de ovinos, con sus

respectivas calidades mediante la técnica de Slicing.
ü Determinar el efecto de la adición de cysteamina y piruvato en los medios de

maduración oocitaria y cultivo in vitro sobre la tasa de clivaje y producción de
embriones ovinos.
ü Evaluar los procesos de maduración, fertilización y cultivo in vitro de embriones

ovinos en diferentes condiciones ambientales de gasificación.
15
3. MARCO DE REFERENCIA
3.1 Marco Teórico
3.1.1 Colecta y transporte de ovarios de beneficio
Mediante esta metodología se hace posible obtener oocitos de ovarios de ovinos

que ya han sido beneficiadas; esta es la única manera más económica en la cual
se pueden obtener de forma más numerosa y viable oocitos, sin embargo, no es
posible tener conocimiento y controlar es estatus nutricional, cíclico y reproductivo
de los animales donadores de ovarios, previo a la colecta de oocitos.
Los oocitos obtenidos durante la colecta, solo un 20 - 30% tienen la capacidad para
poder ser madurados, fecundados y cultivados in vitro hasta llegar al estado de
blastocisto. El aprovechamiento de esta técnica incurre sobre todo para casos en
los cuales se tengan animales de alto valor genético y en eventos en los cuales se
vea afectada la vida del animal, o en hembras beneficiadas por motivos sanitarios
o de reposición. Sin embargo, de manera general los oocitos se obtienen de
animales de descarte o de bajo valor genético lo cual nos ayuda para la
estandarización de esta investigación de cada hembra beneficiada.
3.1.2 Criterios para la selección de oocitos
Los criterios utilizados para la evaluación y selección de los complejos cúmulus-

oocitos (CCOs), se basan en la observación morfológica de las estructuras que
componen los dos tipos celulares: las células del cúmulus y los oocitos. Con
respecto a las células del cúmulus se observa la cantidad de células que se
encuentran alrededor del oocito y su grado de compactación, que hace referencia a
la unión entre células, por su parte el oocito debe presentar un citoplasma de
coloración clara y homogénea.
Las células del cúmulus juegan un papel importante en la regulación del crecimiento
de los oocitos y la inducción de la maduración, proveen al oocito de nutrientes como
factores de crecimiento y lo conectan con el mundo externo a través de conexiones
gap(5).
Estas células aportan nutrientes y energía (Piruvato) al oocito, También secretan

ácido hialurónico a la matriz externa de proteoglicanos. Esta secreción provoca la
ruptura de la matriz, lo que trae aparejado el fenómeno denominado expansión del
16
cúmulus, dominado por la acción de la FSH y se caracteriza por el cambio de
interacción entre las células del cúmulus y el oocito(6).
La morfología que presentan los oocitos recogidos de los ovarios, nos brinda la
posibilidad de predecir su capacidad de reiniciar la meiosis. Los oocitos obtenidos
en el laboratorio son clasificados y seleccionados para ser madurados in vitro, según
el aspecto que presenta su citoplasma y las células del cúmulus que lo envuelven,
en el año 1979, se propone el siguiente esquema de clasificación de acuerdo a la
apariencia de las células del cúmulus.
Los oocitos se pueden clasificar en cuatro categorías: Categoría A, Presentan tres

capas compactas de células del cúmulus que los rodean en toda su superficie;
Categoría B, Se presentan rodeados parcialmente por tres capas compactas de
células del cúmulus; Categoría C, Se encuentran rodeados por células del cúmulus
expandidas y semidesnudos; Categoría D, Oocitos desnudos, dentro de los cuales
los considerados aptos para ser sometidos a procedimientos de maduración y
fertilización in vitro son los de categorías A y B, siendo este un factor de exclusión(6).
3.1.3 Maduración In Vitro (MIV)
Los oocitos inmaduros para convertirse en fertilizantes deben someterse a una

maduración citoplasmática y nuclear. Posteriormente, los oocitos destruyen el
primer cuerpo polar y han entrado en la metafase II, a la espera de ser fertilizados.
Por lo tanto, la maduración in vitro es un paso clave para proporcionar oocitos de
buena calidad para la fertilización in vitro y determina la competencia potencial de
desarrollo de los oocitos. En otras palabras, el requisito previo para obtener un
embrión sano es producir un oocito de buena calidad.(7)
3.1.3.1 Maduración Nuclear
Los eventos de la maduración nuclear se asocian con el inicio de la ruptura de la

vesícula germinal y la finalización de la primera división meiótica. La maduración
nuclear comienza una vez reanudada la meiosis, el paso de vesícula germinal (VG)
a metafase II (MII) implica: la disolución de la membrana nuclear conocida como
“ruptura de la vesícula germinal”, la formación del huso meiótico y la condensación
de la cromatina en cromosomas homólogos que se alinean en el huso meiótico,
alcanzando entonces el estadio de metafase I, para continuar con la segregación
de los dos grupos de cromosomas homólogos, dando lugar a la destrucción del
primer cuerpo polar (CP) y al paso del oocito al estadio de MII.(5) La maduración
nuclear finaliza cuando el oocito completa la primera división meiótica con la
formación del primer CP, alcanzando el estadio de MII, posteriormente se produce
17
la segunda detención de la meiosis.(5) Cuando el oocito maduro es fertilizado se
completa la segunda meiosis y se expulsa el segundo cuerpo polar, convirtiéndose
en una célula haploide(5). En condiciones in vitro, el reinicio de la meiosis se
presenta espontáneamente al remover el oocito del ambiente folicular, así́ como por
la ruptura de las uniones intercelulares.(5)
3.1.3.2 Maduración Citoplasmática
La maduración citoplasmática del oocito incluye aquellos eventos que inculcan en

el oocito una capacidad para completar la maduración, fertilización y embriogénesis
temprana y, por lo tanto, proporcionan una base para la implantación. Aunque
podemos definir la maduración citoplasmática de los oocitos, recién ahora estamos
empezando a comprender los pasos moleculares que subyacen en este proceso.(8)
En términos generales, la maduración citoplasmática de los oocitos implica la

acumulación de ARNm, proteínas, sustratos y nutrientes que se requieren para
lograr la competencia en el desarrollo de oocitos que fomenta la competencia del
desarrollo embrionario. Colectivamente, estamos comenzando a especificar la
maduración citoplasmática de los oocitos, y eventualmente surgirá una comprensión
coherente de este evento crítico en la biología de los oocitos.(8)
3.1.4 Fertilización In Vitro (FIV)
La fecundación in vitro, conocida también como inseminación es el procedimiento

por medio del cual los oocitos maduros son cultivados junto con espermatozoides y
así fecundados. Las células espermáticas, como ocurre en condiciones fisiológicas,
deben alcanzar su capacidad fecundante. En consecuencia deben ser sometidos a
un proceso de preparación in vitro con el objeto de iniciar su capacitación y
desencadenar la reacción acrosómica (RA).
Este fenómeno ocurre en el acrosoma, que se origina del aparato de Golgi de la

espermátide. El acrosoma cuenta con las enzimas necesarias para que la célula
espermática ya activada atraviese las cubiertas celulares de los COCs.(9)
Durante la fertilización el espermatozoide interactúa con el oocito a tres niveles: 1)

células del cúmulo, 2) zona pelúcida y 3) membrana plasmática. La capacitación del
espermatozoide es un proceso fundamental para que se lleve a cabo la fertilización
del oocito. (5)
18
3.1.4.1 Capacitación
La capacitación espermática consiste en una serie de cambios en los

espermatozoides donde se mencionan a continuación: desestabilización de la
membrana plasmática, hiperactivación espermática y reacción acrosomal.
La capacitación consta de dos fases, una alteración espermática inicial, a la que

sigue una fusión de la membrana acrosomal externa con la membrana plasmática
del espermatozoide, denominada reacción acrosómica. La reacción acrosómica es
un requisito indispensable para que se pueda producir la penetración del
espermatozoide en el interior del oocito, ya que para ello se necesita la liberación
de las enzimas acrosomales(10).
El fenómeno de la capacitación está muy extendido en todo el reino animal, aunque

la reacción acrosómica es un patrimonio casi exclusivo de los mamíferos Todo este
conjunto de procesos que sufre el espermatozoide comienza en el oviducto,
continúa a través del paso por el cúmulo celular y finaliza en la misma zona pelúcida
del oocitos.(10)
3.1.5 Cultivo In Vitro (CIV)
Entre todas las etapas involucradas en la producción de embriones in vitro, el cultivo

es el que ejerce un efecto mayor sobre su desarrollo, morfología y metabolismo, ya
que los embriones se mantienen en el medio de cultivo por un máximo de ocho días
estando expuestos a una variedad de situaciones que normalmente no se producen
en su desarrollo in vivo, que pueden silenciar o potenciar la expresión de un gen,
particularmente en un momento crítico de desarrollo.(11)
Los efectos perjudiciales del cultivo en condiciones subóptimas pueden ser

percibidos por la dificultad de que los embriones sean crio preservados o concretar
la preñez. Los medios de cultivo no solo influyen en el desarrollo embrionario, sino
también en la respuesta embrionaria post descongelación, es así́ que la viabilidad
de los embriones crio preservados por el método convencional o la vitrificación
varía. Por lo tanto, al mejorar el cultivo se puede conducir a mayores tasas de
supervivencia de los embriones después de criopreservación.(11)
3.1.5.1 Desarrollo embrionario temprano
Muchos eventos importantes se producen durante el desarrollo embrionario, desde

la etapa de cigoto a la formación de blastocisto. Esto incluye la activación del
19
genoma embrionario en la etapa de entre 8 - 16 células; compactación de mórula
en el día 5, que implica el establecimiento del primer contacto célula-célula y la
formación de blastocisto, entre los días 6 y 7, que establece la diferenciación de los
dos tipos de células: el trofoblasto y la masa celular interna. Para el desarrollo
adecuado, un embrión debe ser capaz de responder a los cambios en su medio
ambiente. (11)
3.1.5.2 Etapas del desarrollo del embrión
• Mórula: masa de al menos 16 células, cuyos blastómeros son difíciles de

diferenciar individualmente. La masa celular del embrión ocupa la mayor parte
del espacio peri vitelino.(11)
• Mórula compacta: masa compacta cuyos blastómeros individuales se han

unido. La masa del embrión ocupa 60 a 70% del espacio peri vitelino.(11)
• Blastocisto temprano: se observa en el embrión una cavidad llena de fluido

denominada blastocele. El embrión ocupa el 70 a 80% del espacio peri vitelino.
A principios de esta etapa de desarrollo, el embrión puede aparecer de dudosa
calidad.(11)
• Blastocisto: evidencia pronunciada diferenciación de la capa exterior y el

trofoblasto de la masa celular interna se aprecia más compacto y más oscuro.
El blastocele es muy prominente, ocupa la mayor parte del espacio peri
vitelino.(11)
• Blastocisto expandido: el diámetro total del embrión aumenta

dramáticamente, con un adelgazamiento concurrente de la zona pelúcida a
aproximadamente un tercio de su espesor original. (11)
3.1.6 Componentes
3.1.6.1 Aminoácidos
Los aminoácidos son componentes esenciales utilizados en los medios de cultivo

que actúan como fuente de energía, reguladores del pH y precursores de proteínas
y ácidos nucleicos. Su uso permitió́ incrementar la proporción de embriones viables
de varias especies domésticas (murina, ovina y bovina). (13)
20
Se encuentran dentro de los elementos más importantes como participantes de la
regulación del desarrollo embrionario. Estos elementos serían utilizados como
fuente de energía, como buffer intracelular y para la síntesis de proteínas, siendo
incorporados por transportadores de membrana específicos regulados en función
del estadio de desarrollo o en respuesta a señales externas. (9)
Desempeñan un papel muy importante en el control de la osmolaridad, regulan el

pH intracelular funcionan como quelantes de metales pesados y como sustratos de
energía y también como precursores de proteínas y ácidos nucleicos.(5)
3.1.6.2 Piruvato de sodio: fuente de energía
Las fuentes de energía más utilizadas en los medios de cultivo de embriones son,
en general, el lactato, el Piruvato y la glucosa. Se ha demostrado que durante los
primeros estadios, antes de la activación del genoma embrionario, los embriones
utilizan preferentemente Piruvato, lactato y glutamina como fuente de energía,
aumentando considerablemente la utilización de glucosa en estadios más
avanzados de desarrollo.(12)
La fuente de energía de los embriones durante su desarrollo in vitro se basa en la

fosforilación oxidativa, a través de la oxidación del Piruvato y aminoácidos, durante
los primeros 3 días del desarrollo embrionario y en la glucólisis durante los
siguientes 3 a 4 días. La glucosa ya era reconocida como necesaria para la
protrusión y el desarrollo posterior de blastocistos de ratón. Casi 15 años después
se confirmó́ , para las especies domésticas de interés zootécnico, que la glucosa
tiene un efecto negativo en el desarrollo temprano de embriones bovinos y ovinos.
Sin embargo la glucólisis aeróbica constituye la actividad energética del embrión en
estadios más avanzados de mórula y blastocisto.(13)
3.1.6.3 Suero fetal: macromoléculas
Usualmente se agrega suero bovino y/o albúmina sérica bovina (BSA) como fuente
de proteínas a los medios de cultivo embrionario, aunque los resultados obtenidos
tanto en producción como en sobrevida pos criopreservación tras su inclusión son
contradictorios y motivo de numerosos estudios. El suero constituye la fracción
líquida resultante del proceso de coagulación sanguínea, tanto in vivo como in vitro,
y su calidad, en términos de composición química, depende usualmente del tipo y
estado del donante (suero fetal bovino (SFB), suero de ternero recién nacido, suero
de novillo o vaca, suero de vaca en celo (SVC), y de la partida o lote de
formulación.(12)
21
Algunos de los efectos benéficos que justifican la utilización del suero y la albúmina
son:
• Proteger a los embriones en cultivo de sustancias tóxicas (ej. metales pesados).

• Aportar factores de crecimiento y ciertas hormonas.
• Reducir la tensión superficial del medio, evitando que los embriones se adhieran
al instrumental (placas de cultivo, pipetas, tubos, etc.).
Tanto el suero como la BSA tienen un rol similar como suplemento proteico. Sin
embargo, la posible presencia de elementos no identificados ligados a ambos
determinan que algunos aspectos de su función no sean aun completamente
comprendidos.(12)
3.2 Marco Geográfico y Contextual
El Laboratorio de biotecnología de la Reproducción Animal del Centro Académico

Agropecuario Guatiguará de la Universidad Cooperativa de Colombia está ubicado
en la vereda Guatiguará kilómetro 2 vía Palo Gordo, municipio de Piedecuesta –
Santander, que se encuentra a 17 km de Bucaramanga, formando parte de su área
metropolitana, su extensión territorial es de 344 kilómetros cuadrados; El municipio
limita por el Norte con Toná, Floridablanca y Bucaramanga por el sur con Guaca,
Cepita, Aratoca y Los Santos; por el oriente con Santa Bárbara; por el occidente con
Girón.
La cabecera municipal de este municipio se localiza a los 6°59”19 de latitud norte y

a 0° 47' 00'' de latitud norte con relación al meridiano de Santafé de Bogotá; y a los
73°03”01’ longitud al oeste de Greenwich. Su altura barométrica es de 1.005
m.s.n.m.
22
Figura 1. Límites del municipio de
Piedecuesta Santander
*Imagen representa la división política Wikipedia (2009)(14)
Figura 2. Mapa localizacion municipio de

Piedecuesta Santander
*Imagen en rojo representa el municipio Wikipedia (2009)(14)
23
3.2.1 Presentación de la empresa
El laboratorio de Biotecnología de la Reproducción Animal es un centro de

investigación, docencia y extensión de la Universidad Cooperativa de Colombia el
cual lleva en funcionamiento 7 años dedicado a generar nuevos conocimientos
relacionados con el área de la reproducción animal y sus biotécnicas aportando
beneficios a la comunidad educativa
3.2.2 Misión
El laboratorio de biotecnología de la Reproducción Animal del Centro Académico

Agropecuario Guatiguará es una unidad básica de la Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Cooperativa de Colombia encargado del
desarrollo de las actividades académicas de investigación y extensión universitaria
y a la comunidad en el área de reproducción animal.
3.2.3 Visión
Las labores que allí se ejecutan permiten cimentar al futuro profesional en el

conocimiento y perfeccionamiento de biotecnologías reproductivas para que,
mediante el uso racional de las mismas, pueda contribuir al desarrollo y
mejoramiento animal, generando progreso en el sector agropecuario regional y
nacional.
24
3.2.4 Estructura Organizacional
Figura 3. Estructura Organizacional
3.3 Marco Normativo
Marco normativo nacional el cual da sus directrices para la creación de sistemas

integrales de gestión de calidad y toma en cuenta la creación de manuales de
información, requisitos para la manipulación y verificación de material seminal.
• Normas ISO 9000-2000. Por la cual se dictan las medidas para la gestión de
riesgos.
• Normas ISO 9001-2000. Por la cual se dictan las medidas para sistemas de
gestión de calidad. Requisitos.
• Normas ISO 9001.2015. Por la cual se establece la actualización de las medidas

para sistemas de gestión de calidad. Requisitos.
25
• Guía Técnica Colombiana, ISO/TR 10013. Directrices para la documentación
del sistema de gestión de calidad. Capítulo 4, subcapítulo 4.4. Manuales de
calidad.
• Guía técnica para la elaboración de manuales de procedimientos.
• Buenas prácticas de bioseguridad en centros productores de embriones y

semen Instituto Colombiano Agropecuario ICA.2007.
• Resolución ICA N°2820 del 2011 Por la cual se dictan disposiciones para el
control técnico de la producción, importación y comercialización del material
seminal y embriones.
• Resolución ICA 01426 del 24 de junio de 2002. Por la cual se establecen

requisitos para el registro de Estaciones Técnicas para realizar la verificación
de la calidad de material seminal y auditoría a los centros de producción de
embriones y semen y laboratorios de procesamiento de material seminal.
• Decreto 1295 del 20 de abril de 2010, Artículo 5, Literal 5.8 y 5.9: Registro
calificado de programas académicos.
• Norma ISO 17025 para acreditación de laboratorio.
• Decreto 3616 DE 2005: Por medio del cual se establecen las denominaciones
de los auxiliares en las áreas de la salud.
• Ley 1374 de 2010 por medio de la cual se crea el Consejo Nacional de Bioética
y se dictan otras disposiciones.
• Decreto 0351 de 2014: Por el cual se reglamenta la gestión integral de los

residuos generados en la atención en salud y otras actividades.
26
4. MATERIALES Y METODOS
4.1 Caracterización del Sistema Productivo
El Laboratorio de Biotecnología de la Reproducción Animal del Centro Académico

Agropecuario Guatiguará de la Universidad Cooperativa de Colombia está ubicado
en la Vereda Guatiguará kilómetro 2 vía Palo Gordo, municipio de Piedecuesta –
Santander, con una temperatura promedio de 20-26°C y altitud de 1.005 m.s.n.m.
4.1.1 Ubicación Geográfica
Figura 4. Ubicación geográfica donde se encuentra ubicado

el laboratorio de biotecnología de la reproducción animal.
*Representa la vista satelital donde se encuentra ubicado el laboratorio google maps (2019)(15).
4.2 Población y Muestra
Para la producción in vitro de embriones (PIV) se recolectaron 2049 oocitos donde

se utilizaron 322 ovarios de 161 ovejas que habían sido sacrificadas en una planta
de beneficio ubicada en Bucaramanga, se realizaron diferentes ensayos para la
estandarización de los procesos de la PIV.
27
4.3 Materiales
• Termo transportador • Viales

• Bolsas ziploc • Aceite
• Baño maría • Buffers
• Solución salina • Micropipetas
• Placa pre calentadora • Puntas para Micropipetas
• Tubos Falcon de 50 ml • Medio de lavado
• Tubos Falcon de 15 ml • Medio de fertilización
• Cajas de petri • Medio de cultivo
• Tijeras • Cabina de flujo
• Hojas de bisturí • Estereoscopio
• Guantes de látex • Microscopio
• Jeringas • Incubadoras
• Agujas • Trigas
28
5. METODOLOGÍA
En la Práctica social empresarial y solidaria se realizaron una serie de procesos

referente a la estandarización protocolos de maduración, fertilización y cultivo in
vitro en ovinos en el laboratorio de Biotecnología de la Reproducción Animal, donde
se hicieron ensayos evaluando cada uno de los procesos biotecnológicos, logrando
elaborar un manual de procedimientos, el cual cumplió con los objetivos propuestos
llegando así a estandarizar cada uno de los procesos que se deben llevar a cabo
para la producción de embriones in vitro en ovinos.
5.1 Tipo de Estudio
La práctica social empresarial y solidaria se realizó mediante un estudio descriptivo,

analizando y desarrollando ensayos de los procesos y procedimientos de la
maduración, fertilización y cultivo in vitro ovino-caprino del laboratorio.
5.2 Fases o Etapas
Fase I: análisis y diagnóstico inicial

Evaluación diagnostica inicial del laboratorio y de la documentación utilizada, al
momento de realizar cada uno de los procesos para la producción de embriones in
vitro ovino.
Fase II: diseño y socialización

Elaboración de un manual de procedimientos el cual sea una guía base del
laboratorio de biotecnología de la reproducción animal para la comunidad estudiantil
en general.
Fase III: resultados y discusión

Determinación de resultados y discusión, diagnóstico final por medio del manual,
conclusiones y recomendaciones
5.2.1 Diagnóstico Inicial
El Centro Académico Agropecuario Guatiguará de la Universidad Cooperativa de

Colombia cuenta con buena infraestructura en general sumado a esto ejemplares
29
de diferentes especies como lo son: bovinos, equinos, caprinos y ovinos con los
cuales se realizan diferentes actividades como prácticas y parte de investigación
con el fin de evaluar los procesos biotecnológicos.
El laboratorio de biotecnología de la reproducción animal es un centro de

investigación el cual está encargado del desarrollo de actividades académicas,
investigación y extensión universitaria además de brindarle servicios a la
comunidad en general en el área de la biotecnología de la reproducción animal. El
cual cuenta con equipos e insumos para realizar dichos trabajos, también cumple
con las normas, especificaciones, e instalaciones que debe tener un laboratorio
dedicado a estas actividades.
El laboratorio está a cargo de un profesional idóneo con alto grado de conocimiento,

dispuestos a brindar un buen servicio a la comunidad estudiantil y a los productores
en general dentro del área como lo es la producción in vitro de embriones ovino-
caprinos. Sin embargo en algunas ocasiones se ven afectados los procedimientos
que se deben realizar en el laboratorio por la falta de insumos de alto valor
económico, por lo que algunos proyectos no pueden ser desarrollados de la mejor
manera.
5.3 Estandarización de protocolos para la producción in vitro de embriones
La producción de embriones in vitro se llevó a cabo con una serie de pruebas y

procedimientos los cuales ayudaba a estandarizar cada una de las biotécnicas
utilizadas en los laboratorios in vitro.
5.3.1 Colecta, manejo y Slicing de ovarios ovino-caprinos beneficiados.
Los ovarios fueron colectados de una planta de beneficio animal y almacenados

cada par en una bolsa ziploc para luego ser transportados en un recipiente con
aislamiento térmico, el cual contenía cloruro de sodio (NaCl) al 0.9% adicionándole
antibióticos (penicilina-estreptomicina), con una temperatura corporal en un periodo
de tiempo no superior a dos o tres horas post-sacrificio. Los ovarios en el laboratorio
fueron lavados con una solución de NaCl al 0,9% atemperada a 37ºC, seguido a
esto se procede a retirar el exceso de tejido adherido a los ovarios para así dar inicio
con la selección y clasificación de estos.
30
5.3.2 Selección y clasificación de ovarios
Los ovarios se clasificaron dependiendo a las diferentes estructuras presentes y

según el estatus cíclico con respecto a la presencia o ausencia del cuerpo lúteo de
las hembras beneficiadas.
Luego de haber realizado dicha selección se procedió a realizar el Slicing que fue
la técnica utilizada para la obtención de oocitos, de forma manual con ayuda de una
cuchilla de bisturí. Posterior a la técnica de Slicing se vertió el contenido en un tubo
Falcon acompañado de solución salina de NaCl al 0.9%.
El contenido presente en el tubo Falcon se dejó en reposo durante 10 a 15 minutos

esto con el fin de que se decanten los oocitos, donde luego fueron tomados del
fondo de dicho tubo con ayuda de una pipeta pasteur y depositándolos en una caja
de petri de (100 x 15 mm) para su posterior recuperación y clasificación oocitaria.
Dentro de la calidad oocitaria estuvieron presente cuatro tipos: tipo I (CCOs con más
de tres capas compactas de células del cúmulus, citoplasmas homogéneos y
completos dentro de la zona pelúcida), tipo II (CCOs con menos de tres capas de
células de cúmulus, compactas o cubiertas parciales; citoplasmas homogéneos con
zonas oscuras dentro), tipo III (cubiertas celulares expandidas, dispersadas en una
matriz oscura en forma de telas de araña, con citoplasmas irregulares en la mayor
parte de los casos), y tipo IV (con residuos de células del cúmulus o desnudos,
rodeados únicamente por la zona pelúcida y con citoplasmas regulares o
irregulares). Donde solo se sometieron a maduración únicamente los oocitos de
calidad tipo I y tipo II. Todos los materiales que se requirieron estaban
completamente estériles, con el fin de salvaguardar la inocuidad de dichos oocitos.
5.3.3 Maduración in vitro (MIV)
Bajo cámara de flujo laminar, se realizó el medio de maduración de elección el cual

se colocó a gasificar con trigas (5% oxigeno 5% CO2 y 90% nitrógeno) y finalmente
se puso a incubar a 38.5ºC con una humedad relativa superior al 90%. Esto como
mínimo se realizó con tres horas de anterioridad para que dicho medio quede
gasificado. El montaje de placa se realizó en una caja de petri de 35 x 10 mm,
haciendo gotas de 50µl pero inicialmente solo se hicieron gotas de 25µl (la mitad de
la gota) del medio de maduración in vitro (MIV), ya que se debe adicionar un poco
de aceite mineral SIGMA. Luego se le adicionaron los otros 25µl quedando cada
una de las gotas de un tamaño de 50µl como ya se mencionó.
Se dio continuidad a la búsqueda de los oocitos con ayuda de un estereoscopio, sin

dar importancia a la calidad de cada uno de estos, ya que se tuvo en cuenta la
cantidad de recuperación oocitaria total que se daba en cada clasificación. Seguido
31
a esto, se fueron depositando en gotas de medio de lavado compuesto por TCM
199 con Hepes, penicilina estreptomicina y el 10% de suero fetal bovino (SFB), para
su posterior selección en cuanto a calidad y además no tuvieran residuos que
llegaran afectar la maduración oocitaria. Se ubica la caja de petri que contiene el
medio de maduración in vitro (MIV) ya con oocitos a una bolsa ziploc que se le
adiciono el trigas y se procedió a incubar en un tiempo de 20 a 24 horas como
máximo. Transcurrido este tiempo se retiran los oocitos del medio de maduración in
vitro y se pasan por gotas del medio de lavado para desintegrar las células del
cúmulus pero no en su totalidad, donde luego se iniciara el proceso de fertilización
in vitro.
5.3.4 Preparación de las columnas de percoll y manejo del semen para la

fertilización in vitro (FIV)
Se preparó los gradientes de percoll que son tres: percoll 90%, Percoll 60% y Percoll
30%, cada uno en viales independientes de 1.5 ml. Al tener listos los gradientes, se
selecciona la totalidad del contenido que son 300µl y se deposita en un nuevo vial
completamente estéril en orden de mayor a menor porcentaje quedando el Percoll
90% en el fondo, el percoll 60% en el medio y finalizando con el percoll 30%.
Posteriormente se introdujo el vial que contenía las tres columnas de percoll en la

incubadora, esto con el propósito de que se mantenga atemperado. Se procede a
sacar la pajilla del termo de nitrógeno y se puso a descongelar en el baño maría
durante 40 segundos el cual tenía una temperatura de 37.5ºC.
Luego el semen se evaluó para determinar que este se encontrara viable

observando motilidad masal y motilidad individual; se tomaron 100µL de semen y
se depositó en el vial que contenía las columnas de percoll y fue centrifugado
durante 3 minutos a 11.0 rpm. Pasada la primera centrifugación, se tomaron del
fondo del tubo 75µl de pellet formado por el semen y este se depositó en un nuevo
vial que contenía 1 ml de medio para lavado de espermatozoides (Talp lavado) o
medio de fertilización (FIV) y nuevamente fue sometido en la centrifuga por segunda
vez durante 45 segundos a 5.5 rpm. Seguido a esto se tomaron 5µL de pellet
formado por el semen y se diluyó en 95µL de agua o solución salina con el fin de
poder realizar el conteo espermático en la cámara de Neubauer.
Dicho conteo se llevó a cabo observando las dos cámaras que posee esta lamina,
contando cinco recuadros, de los cuales se deben elegir cuatro de los extremos y
uno en el medio de dicha cámara; el conteo entre las dos cámaras no debe tener
una diferencia superior al 10% con todo este proceso se busca conocer la
concentración espermática de la muestra seminal para estipular la cantidad de micro
litros (µl) que se le debe depositar en la gota de 50µl de medio de fertilización (FIV).
32
5.3.5 Fertilización In Vitro (FIV)
Para la fertilización, se prepararon las cajas de petri con medio de fertilización el

cual estaba compuesto por Fluido oviductual sintético (IVF-SOF), Penicilamina-
Hipotaurina-Epinefrina (PHE) y Heparina, se hicieron gotas de 25µl luego se
cubrieron con 1 ml de aceite mineral y luego se completó la gota hasta 50µl y
nuevamente se le adiciono aceite mineral hasta tapar la totalidad de la gota.
El medio de fertilización suplementado debió ser estabilizado como mínimo 3 horas

antes en la incubadora antes de la FIV, se procedió a lavar los oocitos con el medio
de lavado y por último se lavaron en medio de fertilización (FIV). Seguido a esto se
procedió a insertar el semen en cada una de las gotas que contenían los oocitos ya
maduros y se dejaron en medio de trigas en la incubadora durante un tiempo de 18
a 20 horas.
5.3.6 Cultivo In Vitro (CIV)
Se procedió a retirar los oocitos del medio de fertilización, y se lavaron con un nuevo
medio de lavado con el fin de quitar aquellas células del cúmulus restantes y seguido
a esto se pasaron por dos gotas del medio de cultivo con el fin de acondicionar los
presuntos embriones; luego de realizar dicho procedimiento se pasaron a la caja de
petri que contenía el medio de cultivo in vitro (CIV) medios que fueron
estandarizados con TCM 199 sin hepes, suero fetal bovino al 10% (SFB), antibiótico
y Piruvato de sodio y otro medio de cultivo el cual se le adicionaba Cysteamina, esto
se preparó como mínimo con 3 horas de anterioridad.
Para finalizar con el procedimiento se fueron cambiando día de por medio el medio
de cultivo in vitro hasta al día tres, donde se evaluó la tasa de clivaje hasta llegar al
día siete y poder evaluar la tasa de blastocistos.
5.4 Resultados y Discusión
El estudio estuvo enfocado en estandarizar los procesos y procedimientos de

maduración, fertilización y cultivo in vitro ovino, donde se obtuvieron datos de una
serie de pruebas realizadas para dicha estandarización.
33
5.4.1 Recuperación de oocitos
Para evaluar la tasa recuperación oocitaria se tuvieron en cuenta 11 colectas para

un total de 322 ovarios de hembras ovinas faenadas, recuperándose 2049 oocitos,
obteniendo un promedio de 6,3 oocitos por ovario como podemos observar en la
tabla1, esta recuperación fue similar a los trabajos realizados por Shirazi et al.,
(2005), que obtuvo 6,3 oocitos por ovario con la técnica de Slicing (16). Sin embargo
los resultados obtenidos en este trabajo fueron inferiores al encontrado por Wani
(2000), donde reporto un promedio de 9.5 oocitos por ovario con esta misma técnica
(17). Al hacer la evaluación, teniendo en cuenta la presencia o ausencia del CL,
observamos que ovarios sin presencia de CL tiene una mayor tasa de recuperación
oocitaria, esto se puede deber a que los cuerpos lúteos abarcan alrededor de un
50% de la estructura ovárica. En trabajos similares realizados en bovinos por
Moreno (2018), en el laboratorio de Biotecnología de la Reproducción Animal (no
publicados), cita que Shabankareh (2010) evidencio que ovarios que presentan CL
la irrigación sanguínea no es uniforme, una vez que la funcionalidad de esta
estructura exige un mayor aporte sanguíneo(18)(19).
Tabla 1. Total de ovarios y oocitos recuperados
RECUPERACION OOCITARIA
COLECTAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 TOTAL MEDIA
PRESENCIA CL 91 50 81 89 68 74 73 136 106 100 107 975 88,6
SIN PRESENCIA DE
138 57 82 84 76 90 68 127 103 88 161 1074 97,6
CL
TOTAL OOCITOS 229 107 163 173 144 164 141 263 209 188 268 2049 186,3
TOTAL OVARIOS 34 20 26 26 30 34 30 34 28 30 30 322 29,3
% RECUPERACION
6,7 5,4 6,3 6,7 4,8 4,8 4,7 7,7 7,5 6,3 8,9 69,7 6,3
/ OVARIO
Recuperación oocitaria por ovario y su respectivo porcentaje en 11 trabajos
experimentales, con cada uno de sus porcentajes
5.4.2 Clasificación según la calidad
Teniendo en cuenta la calidad de los CCOs, en la tabla 2 se observa la clasificación

de CCOs recuperados, encontrando que el mayor porcentaje lo obtuvo los CCOs
de calidad tipo IV (43%), aunque en literatura encontrada mencionan que solo
deberán ser sometidos a maduración in vitro los CCOs de calidad tipo I y II. En este
trabajo se obtuvieron tasas muy bajas en estas calidades, en comparación a
estudios realizados por Dadashpour et al., (2014) y Shirazi et al., (2005), quienes
utilizaron la misma técnica, obteniendo una mejor tasa de recuperación en los CCOs
tipo I (80%) y tipo II (73%). (20)(16)
34
Tabla 2. Calidad oocitaria
CALIDAD OOCITARIA
MEDIA
TOTAL OOCITOS OOCITOS OOCITOS OOCITOS TOTAL
GRUPO
OVARIOS TIPO I TIPO II TIPO III TIPO IV OOCITOS
PRESENCIA
191 145 (15%) 143 (15%) 265 (27%) 422 (43%) 975 488
DE CL
SIN
PRESENCIA 131 157 (15%) 148 (14%) 335 (31%) 434 (40%) 1074 537
DE CL
TOTAL 322 302 291 600 856 2049 1025
Clasificación oocitaria según la calidad de oocitos y su respectivo porcentaje y media de 11
trabajos.
5.4.3 Porcentaje de la tasa de clivaje y la tasa de blastocistos
La tasa de clivaje y de blastocistos fueron evaluadas en dos tipos de medios de

maduración y cultivo in vitro, con el fin de estandarizar el medio adecuado para los
procedimientos de PIV en ovinos. En la tabla 3 podemos observar la cantidad de
ovarios y porcentaje de recuperación que se realizó en cada uno de los tratamientos
(suplementado con Piruvato de Na y otro con Cystiamina), siendo el medio
suplementado con piruvato de Na, el que mejor resultado reporto, con un 55% de
recuperación. También podemos observar que de 251 oocitos fertilizados en este
mismo tratamiento, 85 de ellos clivaron para una tasa de clivaje de 34% y el
tratamiento realizado con cysteamina 63 de ellos clivaron de 208 oocitos puestos a
fertilizar para una tasa de clivaje de 30%. valores inferiores a los que obtuvieron
Cognié et al.,(2003)(2004), ya que obtuvieron tasas superiores al 60% en
tratamientos realizados con cysteamina(21)(22).
Con respeto a los embriones clivados se evaluó el porcentaje de la tasa de

blastocistos, encontrando un porcentaje del 13% para el tratamiento con piruvato,
porcentaje superior al evaluado con el tratamiento de Cystiamina ya que fue del 8%.
Estos resultados fueron inferiores a los obtenidos por Souza-Fabjan et al.,(2014)
con un 63% de blastocistos puestos a clivar, en un CIM suplementado con 50 µl de
cystiamina(23). Sin embargo, los datos obtenidos de las tasas de blasocistos fueron
muy bajos y se creería que en los medios de CIV utilizados no fueron tan eficientes,
faltaría realizar más experimentos, como lo señala Paramio et al.,(2014) donde cita
diversos autores utilizando suero de oveja o de cabra en estro(24), esto podría
mejorar la respuesta. Sin embargo Dadashpour et al., (2014) obtuvo porcentajes
superiores al 60% en la tasa de clivaje con medios suplementados con piruvato de
sodio lo que demuestra que es una muy buena fuente de energía(20).
35
Tabla 3. Porcentaje de clivaje y de blastocisto a partir de los oocitos puestos a
fecundar y de los embriones Clivados, en dos grupos experimentales Piruvato,
Cysteamina.
PORCENTAJE DE CLIVAJE Y BLASTOCISTOS

%BLAST %
. BLAST.
# % CC OOCIT # TASA #
PUESTO PUEST
TTO OVARI RE Os / OS / CLIVAD CLIVA BLASTOCIS
S A OS A
OS C MIV FIV OS JE (%) TOS
FERTILIZ CLIVA
AR R
PIRUVAT
118 55 285 251 85 34 11 4 13
O
CYSTEAM
98 45 222 208 63 30 5 2 8
INA
10
TOTAL 216 507 459 148 64 16 7 21
0
Porcentaje de clivaje y de blastocisto a partir del número total de oocitos y a partir de los clivados.
(7 colectas).
36
6. CONCLUSIONES
ü En el desarrollo de este trabajo se logró estandarizar los protocolos utilizados

en los diferentes procesos biotecnológicos, resaltando cada uno de los
componentes necesarios para el desarrollo, crecimiento y competencia
oocitaria fundamentales para la PIV en ovinos.
ü Al comparar los medios utilizados en los procesos biotecnológicos de la

reproducción asistida en el laboratorio, se obtuvo una mejor eficiencia con el
uso de sustancias adicionales como antioxidantes y fuentes energéticas
necesarias para el desarrollo, crecimiento y competencia oocitaria, y por ende
aumentar la tasa de clivaje o división celular.
ü La recuperación y la calidad oocitaria se ve afectada dependiendo de las

estructuras encontradas en el ovario, al estatus cíclico y condiciones
nutricionales y de manejo de los animales.
ü Se determinó que los medios de maduración y fertilización utilizando una

condición medio ambiental de CO2 fueron satisfactorios para la MIV y FIV
mientras que el medio de cultivo in vtiro se necesita condiciones ambientales de
gas patrón o trigas(5%CO2, 5%Oxigeno, 90%Nitrogeno) para su final desarrollo
mejorando la eficiencia de la tasa de blastocistos.
37
7. RECOMENDACIONES
ü Hacer un adecuado uso de los formatos contenidos en el manual de

procedimientos logrando así de esta manera tener un registro y control de cada
uno de los procesos a desarrollar.
ü En la evaluación de los medios de cultivo in vitro, falto realizar más

procedimientos, suplementándolos con suero de oveja en estro o albúmina
sérica bovina con el fin de aumentar la tasa de blastocistos y de esta manera
aumentar la eficiencia en la PIV.
ü Incentivar a los jóvenes a desarrollar futuros trabajos de investigación en las

diferentes especies con fines zootécnicos y así dar un adecuado uso de los
equipos e instalaciones pertenecientes al área de las biotecnologías.
ü Realizar procesos donde se logre evaluar la calidad de los blastocistos para

determinar la tasa de viabilidad de embriones congelados o transferidos.
38
BIBLIOGRAFÍA
1. Menchaca A, Crispo M, Vilariño M, Rubianes E. Avances en la aplicación de

biotecnologías reproductivas en ovinos y caprinos. En: Simposio Internacional
de Producción Animal. Cordoba, Argentina; 2007. p. 164-80
2. A. Menchaca. Avances en la aplicación de biotecnologías reproductivas en

pequeños rumiantes. En: Simposio Internacional de Producción Animal.
Cordoba, argentina; 2017. p. 323-35.
3. Mari Lourdes Bernardi1. Produção in vitro de embriões ovinos. 2005;(Acta

Scientiae Veterinariae):16. Disponible en: http://www.reprobiotec.com/lib
ro_rojo/capitulo_11.pdf
4. Maria Teresa Paramio, Dolors Izquierdo. Recent advances in in vitro embryo

production in small ruminants. 2016;(Theriogenology):152-9.
5. Genaro Salas Barrientos. Momento del cambio de cultivo en un medio

secuencial y el desarrollo temprano de embriones ovinos in vitro [Internet].
[Chapingo, Estado de México]: Universidad de Chapingo; 2014. Disponible en:
https://chapingo.mx/produccionanimal/images/stories/tesis/PPA_MC_047_12_
14_RGP_GSB_b.pdf
6. Chavez Zapana JD. Efecto del suero de oveja súper ovulada sobre la
maduración y fertilización in vitro de oocitos de ovino [Internet]. [Puno - Perú]:
Universidad nacional del altiplano - puno; 2017. Disponible en:
http://repositorio.unap.edu.pe/bitstream/handle/UNAP/6770/Chavez_Zapana_J
orge_Dick.pdf?sequence=1&isAllowed=y
7. Zhu J, Moawad AR, Wang C-Y, Li H-F, Ren J-Y, Dai Y-F. Advances in in vitro
production of sheep embryos. International Journal of Veterinary Science and
Medicine [Internet]. 2018 [citado 13 de marzo de 2019];6:S15-26. Disponible en:
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S2314459917301588
8. Watson AJ. Oocyte cytoplasmic maturation: A key mediator of oocyte and

embryo developmental competence1. Journal of Animal Science [Internet]. 1 de
marzo de 2007 [citado 16 de febrero de 2019];85(suppl_13):E1-3. Disponible
en: https://academic.oup.com/jas/article/85/suppl_13/E1/4775300
9. Mucci N, Aller JF, Kaiser GG, Hozbor F, Alberio RH. Producción in vitro de
embriones bovinos: suplementación de los medios de cultivo con suero.
Archivos de medicina veterinaria [Internet]. 2006 [citado 25 de febrero de
2019];38(2):97-104. Disponible en: https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?sc
ript=sci_abstract&pid=S0301-732X2006000200002&lng=es&nrm=iso&tlng=es
39
10. Palma GA. Producción in vitro de embriones bovinos. Gustavo Palma; 2001.
720 p.
11. oriundo-nuñez-katherine-patricia.pdf [Internet]. [citado 25 de febrero de 2019].

Disponible en: http://repositorio.lamolina.edu.pe/bitstream/handle/UNALM/3
604/oriundo-nu%C3%B1ez-katherine-patricia.pdf?sequence=1&isAllowed=y
12. Archivos de medicina veterinaria - Producción in vitro de embriones bovinos:

suplementación de los medios de cultivo con suero [Internet]. [citado 22 de
febrero de 2019]. Disponible en: http://mingaonline.uach.cl/scielo.php?pid=
S0301-732X2006000200002&script=sci_arttext
13. Palma GA. Producción in vitro de embriones bovinos. 11 de diciembre de

2018;71.
14. Piedecuesta. En: Wikipedia, la enciclopedia libre [Internet]. 2019 [citado 26 de

febrero de 2019]. Disponible en: https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Pied
ecuesta&oldid=113796865
15. Google Maps [Internet]. Google Maps. [citado 26 de febrero de 2019]. Disponible
en: https://www.google.com/maps/place/Via+Guatiguar%C3%A1,+Piedecuest
a,+Santander/@6.9916661,-73.0733621,1063m/data=!3m1!1e3!4m5!3m4!1s
0x8e68470e85bf9b13:0xee687260e1f835c4!8m2!3d6.9980256!4d-73.0627336
16. Shirazi A, Shams-Esfandabadi N, Hosseini SM. A comparison of two recovery

methods of ovine oocytes for in vitro maturation. Small Ruminant Research
[Internet]. junio de 2005 [citado 28 de febrero de 2019];58(3):283-6. Disponible
en: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0921448804002573
17. Wani N., Wani G., Khan M., Salahudin S. Effect of oocyte harvesting techniques
on in vitro maturation and in vitro fertilization in sheep. Small Ruminant Research
[Internet]. abril de 2000 [citado 21 de febrero de 2019];36(1):63-7. Disponible
en: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0921448899000978
18. Tesis Final Maestría UNC Edgar Ricardo Moreno Jerez.pdf.
19. Hamed Karami. The effect of the absence or presence of a corpus luteum on the
ovarian follicular population and serum oestradiol concentrations during the
estrous cycle in Sanjabi ewes | Request PDF [Internet]. ResearchGate. [citado
12 de marzo de 2019]. Disponible en: https://www.researchgate.net/publica
tion/236020227_The_effect_of_the_absence_or_presence_of_a_corpus_luteu
m_on_the_ovarian_follicular_population_and_serum_oestradiol_concentration
s_during_the_estrous_cycle_in_Sanjabi_ewes
20. Dadashpour Davachi N, Zare Shahneh A, Kohram H, Zhandi M, Dashti S. In
40
Vitro Ovine Embryo Production: the Study of Seasonal and Oocyte Recovery
Method Effects. Iranian Red Crescent Medical Journal [Internet]. 5 de
septiembre de 2014 [citado 6 de marzo de 2019];16(9). Disponible en:
http://ircmj.com/en/articles/16419.html
21. Cognié Y, Baril G, Poulin N, Mermillod P. Current status of embryo technologies

in sheep and goat. Theriogenology [Internet]. enero de 2003 [citado 14 de marzo
de 2019];59(1):171-88. Disponible en: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve
/pii/S0093691X02012700
22. Cognié Y, Poulin N, Locatelli Y, Mermillod P. State-of-the-art production,

conservation and transfer of in-vitro-produced embryos in small ruminants.
Reproduction, Fertility and Development [Internet]. 2004 [citado 14 de marzo de
2019];16(4):437. Disponible en: http://www.publish.csiro.au/?paper=RD04029
23. Souza-Fabjan JMG, Locatelli Y, Duffard N, Corbin E, Touzé J-L, Perreau C,

et al. In vitro embryo production in goats: Slaughterhouse and laparoscopic
ovum pick up–derived oocytes have different kinetics and requirements
regarding maturation media. Theriogenology [Internet]. mayo de 2014 [citado 14
de marzo de 2019];81(8):1021-31. Disponible en:
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/ pii/S0093691X14000569
24. Paramio M-T, Izquierdo D. Current Status of In Vitro Embryo Production in

Sheep and Goats. Reproduction in Domestic Animals. 2014;
41
ANEXOS
Anexo A. Medios de Cultivo
A. Medios de cultivo y soluciones
Medio de lavado de Oocitos.

Volumen
Reactivo Concentración Marca Referencia
5.0 ml 10.0 ml
TCM 199 C/H Sigma M2520 4.745 µL 9.490
SFB 5% 250 µL 500
Penicilina 50 UI/ml Sigma P3032 5 µL 10 µL
Estreptomicina 50 µg/ml Sigma S1277 5 µL 10
• Maduración In Vitro Oocitos.
Medio de Maduración de Oocitos. (Opción 1)

Volumen
5 ml 10 ml
TCM 199 S/H Sigma M5017 4311 µL 8622 µL
SFB 10% Sigma F6178 500 µL 1000 µL
FSH/LH 0.05 UI/ml Menopur 25 µL 50µL
Penicilina 50 UI/ml Sigma P3032
5 µL 10µL
Estreptomicina 50 µl/ml Sigma S1277
Aditivo 125 µL 250 µL
Cisteamina 100mM Sigma M9768 34 µL 68µL
Medio de Maduración de Oocitos. (Opción 2)

Volumen
5 ml 10 ml
SFB 10% Sigma F6178 500 µL 1000 µL
FSH/LH 0.05 UI/ml Menopur 25 µL 50µL
Penicilina 50 UI/l Sigma P3032
5 µL 10µL
Estreptomicina 50 µl/ml Sigma S1277
Piruvato de Sódio(100mM) 0.2 mM Sigma P4562 10 µL 20µL
B. Medio de Fertilización in vitro
42
Medio de fertilización in vitro IVF-SOF (FIV).
Reactivo Marca Referencia Cantidad mg/100ml
CaCL2 2H2O Sigma C3881 25.10
Cl2Mg 6H2O Sigma M0250 10.00
NaCL Sigma S5886 580.00
KCL Sigma P5405 53.40
KH2PO4 Sigma P5655 16.20
Na piruvato Sigma P4562 3,6
HEPES Sigma H4043 476.00
Penicilina Sigma P3032 6.30
Streptomicina Sigma S1277 5.00
Na lactato 60% Sigma L4263 47ml
BSA FAF Sigma A8806 600.00
Glicina Sigma 68790 75.00
Glutamina Sigma 68540 16.60
MGM no esencial aa Sigma M7145 1ml
MGM esencial aa Sigma B6766 1ml
H2O Milli Q Millipore Direct-Q 3 100ml
NaHCO3* Sigma S6297 220.00
• Ajustar PH a 7,45 antes de adicionar NaHCO3.

• Ajustar la osmolaridad entre 270-280 mOsm/lt, mediante la fórmula: mOsm -
270/270 x 100ml.
Medio de fertilización in vitro IVF- SOF - USO

Reactivo Concentración Volumen
IVF-SOF 1800µL 3000v

PHE 20 µl/1mL 36 µL 60 µL
Heparina 20 µl/1mL 36 µL 60 µL
Llevar el PHE y Heparina al volumen Eje: 1728 µl IVF-SOF + 36 µL PHE + 36 µL Heparina = 1800
de medio para uso.
Gradientes de percoll 90% - 60% - 30%

Percoll 90%
Cantidad
Reactivo Marca
1500 µL 3000 µL
Percoll 100% GH 1350 µL 2700 µL
Talp 10x 150 µL 300 µL
Percoll 60%
Cantidad
Reactivo
300 µL 600 µL
Percoll 90% 200 µL 400 µL
Talp lavado 100 µL 200 µL
Percoll 30%
Reactivo Cantidad
43
300 µL 600 µL
Percoll 90% 100 µL 200 µL
Talp lavado 200 µL 400 µL
Solución talp libre de calcio (10X)

Reactivo Cantidad mg/100ml
MgCL 6H2O 310
NaCL 600
KCL 230
NaHCO3 420
Na2 HPO4 40
Na Piruvato 110
HEPES 4760
Kanamycina 75
Na lactato 60% 3.7ml
NaOH 300
Milli Q 100ml
Filtrar, refrigerar 5°C, empacar en tubos de 15 ml (Falcón),
• Ajustar el PH a 7.4
Solución talp libre de calcio (lavado espermatozoides)

Reactivo Cantidad mg/1lt
MgCL 6H2O 310
NaCL 600
KCL 230
NaHCO3 420
Na2 HPO4 40
Na Piruvato 110
HEPES 4760
Kanamycina 75
Na lactato 60% 3.7ml
NaOH 400
PVA 1000
Milli Q 1025ml
Filtrar, refrigerar 5°C, empacar en tubos de 15 ml (Falcón), duración 3 meses
• Ajustar el PH a 7.4
C. Medio de Cultivo in vitro
44
Medio de Cultivo In Vitro (Opción 1)
Volumen
5 ml 10 ml
SFB 10% Sigma F6178 500 µL 1000 µL
Penicilina 100 UI/ml Sigma P3032
5 µL 10 µL
Estreptomicina 100 µL/ml Sigma S1277
Piruvato de
100 mM Sigma P4562 75 µL 150 µL
Sódio
Cultivar por 7 días, hacer cambio de medio (feeding) en el día 4 de cultivo, evaluar clivaje.
Medio de Cultivo in vitro (Opcion2)

Volumen
5 ml 10 ml
SFB 10% 500 µL 1000 µL
Penicilina 100 UI/ml Sigma P3032 5 µL 10 µL
Estreptomicina 100 µL/ml Sigma S1277
Piruvato de sodio 100 mM Sigma P4562 75 µL 150 µL
Cisteamina 100µM Siigma M9768 34 µL 68 µL
Cultivar por 7 días, hacer cambio de medio (feeding) en el día 4 de cultivo, evaluar clivaje. Medio
recomendado para cultivo de embriones en ambiente de solo CO2 regulado.
45
Anexo B. Soluciones Stock
A. Solución TCM S/H.
Reactivo Marca Referencia Cantidad

TCM 199 S/H Sigma M5017 9.5 g
NaHCO3 Sigma 56297 2.2 g
H2O Sigma W1503 1000 ml
Filtrar, refrigerar a 5°C, filtrar, empacar en tubos de 50 ml (falcón), duración máxima 15 días.
B. Solución TCM C/H.

TCM 199 C/H Sigma M2520 14.9 g
NaHCO3 Sigma 56297 2.2 g
H2O Sigma W1503 1000 ml
Filtrar, refrigerar a 5°C, filtrar, empacar en tubos de 50 ml (falcón), duración máxima 15 días.
C. Solución Hormona FSH/LH

Menopur FSH 75UI/LH 75UI Menopur 1vial/75 UI
TCM C/H Solución stock Sigma M2520 7.5 ml
Filtrar, hacer alícuotas de 30 µL, proteger de la luz, congelar, duración 3 meses
D. Solución Penicilina/Estreptomicina.
H2O Millipore Direct-Q 3 5ml
Penicilina Sigma P3032 0.304 g
E. Solución Cistiamina.
Cystiamina Sigma M6500 11.3 mg
TCM S/H Solución stock Sigma M5017 10 ml
46
F. Solución Piruvato de sodio
Reactivo Marca Referencia Concentración
H2O Millipore Direct Q 5 ml 10 ml
Piruvato de sodio Sigma P4562 0.055 g 0.11 g
Filtrar, hacer alícuotas de 80 µL, congelar, duración 3 meses
G. Solución Heparina
Reactivo Marca Referencia Concentración
H2O Millipore Direct Q 5 ml 10 ml
Piruvato de sodio Sigma P4562 0.055 g 0.11 g
H. Solución Aditivos
Glutamina Sigma 68540 200 mg
Ácido Ascórbico Sigma 49752 150 mg
PVA Sigma 360 50 mg
Myoinositol Sigma I5125 10 mg
Piruvato de Sódio Sigma P4562 220 mg
H2O Direct Q Millipore Direct-Q 3 50 ml
I. Solución PHE.
Conc. Del componente
Solución inicial
en PHE
ml para hacer 100x
Componente mM Preparación 100x stock Final
PHE stock
Solución 126µl Na lactato
lactato jarabe y
50mg metabisulfito en
bisulfito 1.2
50 ml
de agua puraa
D-
8.0 12mg en 10ml NaClb 0.75 2mM 20µM
penicilamina
b
Hipotaurina 40.0 4.4mg en 1ml NaC 0.75 10mM 100µM
1.8mg en 10ml
Epinefrina 1.0 0.3 100µM 1µM
solución
lactato bisulfito
3.0d
47
a) Después de preparada la solución lactato-bisulfito, esta solución debe ser
acidificada con HCL (1M) hasta conseguir un pH 4.0.
b) La solución de NaCl es una solución stock preparada a una concentración de 157
mM.
c) Mantener la solución de epinefrina en un lugar oscuro mientras se disuelve en la
solución de lactato-bisulfito. El pH de la solución de epinefrina no debería ser mayor
de 6.0.
d) La solución de lactato bisulfito es usada para estabilizar la epinefrina. Después de
preparados los 3ml de solución stock PHE (100x) hacer alícuotas de 40µl y guardar
a -20°C, mantenerlo en un lugar frio y oscuro durante el descongelamiento.
48
Anexo C. Formatos de Recolección de Datos
A. Formato recolector de datos
MEDIO: PARES DE OVARIOS: FECHA: HORA:

POLI-OVULATORIOS:
MONO-OVULATORIOS:
NCL:
CLASIFICACIO MADURACIO
CULTIVO IN VITRO (CIV)
N N
BLASTOCISTO (5
N° TOTAL FERTILIZACIO día)
CLASIFICACIO FIJACIO
OVARIO RECUENT N IN VITRO CLIVAJ %
N N %
S I II III IV O 7 14 22 (FIV) E (3 puestos
puesto
día) a
sa
fecunda
clivar
r
NCL
MONO CL +
MONO CL -
POLI CL +
POLI CL -
B. Formatos para la evaluación de MIV
49
C. Formato para la evaluación de FIV
50
D. Formato para la evaluación de CIV
51
Anexo D. Manual de procedimientos para la producción de embriones in
vitro de ovinos versión 2019 (Anexado en documento Word y en documento
físico).
52

2019 Estandarizacion Procedimientos Produccion

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

2019 Estandarizacion Procedimientos Produccion

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

ESTANDARIZACIÓN DE PROCEDIMIENTOS PARA LA PRODUCCIÓN IN

VITRO DE EMBRIONES OVINOS EN EL LABORATORIO DE REPRODUCCIÓN

WILSON FERNEY RODRÍGUEZ CORNEJO

UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA

Wilson Ferney Rodríguez Cornejo

Práctica Empresarial Presentada para Optar por el Título de Médico

UNIVERSIDAD COOPERATIVA DE COLOMBIA

Bucaramanga, _____ de _________________ del 2019.

A mis tíos Miguel A. Cornejo y Arturo Rodríguez quienes anhelaron y me motivaron

Quiero expresar mi más profundo agradecimiento al Dr. Edgar Ricardo Moreno

Gracias a la Universidad Cooperativa de Colombia y a los docentes que hicieron

A mis compañeros porque de ellos aprendí experiencias diferentes, compartí

1. ASPECTOS GENERALES ................................................................................ 14

3. MARCO DE REFERENCIA ............................................................................... 16

ARNm: ácido ribonucleico mensajero

BSA: Albumina sérica bovina.

CCOs: Complejo cúmulus oocito.

CIM: medio de cultivo in vitro

CIV: cultivo in vitro

CL-: Ovario sin cuerpo lúteo.

CL+: Ovario con cuerpo lúteo.

CP: cuerpo polar.

FIV: Fecundación in vitro.

FSH: Hormona folículo estimulante.

GV: Vesícula germinal.

MIV: Maduración in vitro.

NaCl: Cloruro de sodio.

NCL: Ningún ovario con cuerpo lúteo.

PIV: producción in vitro de embriones

RA: reacción acrosomica

SOF: medio de cultivo a base de fluidos sintéticos del oviducto

TCM-199: Medio de cultivo tisular.

Cultivo in vitro: Procedimiento por el que se desarrolla artificialmente una

Embrión: Es un organismo en su etapa más temprana de desarrollo, que no ha

In vitro: Técnica mediante la cual se logra realizar un determinado experimento en

Incubadora: Dispositivo que sirve para mantener y hacer crecer cultivos

Osmolaridad: Concentración de las partículas osmóticamente activas contenidas

Técnica de Slicing: consiste en la realización de cortes longitudinales y

Las biotecnologías de la reproducción han sido desarrolladas como herramientas

La PIV de embriones comprende las etapas de maduración de los oocitos,

Con respecto a las etapas de la maduración oocitaria se debe tener en cuenta la

1.1 Título de la práctica

Estandarización de protocolos de maduración, fertilización y cultivo in vitro en ovino

1.2 Planteamiento del problema

La producción de embriones in vitro ovinos es un proceso biotecnológico, servicio

El laboratorio de biotecnología animal carece de una guía para la realización de

Por esta razón se ha considerado la necesidad de realizar una estandarización de

1.3 Formulación del problema

2.1 Objetivo General

Estandarizar los procedimientos para la producción in vitro de embriones ovinos en

2.2 Objetivos Específicos

ü Evaluar la tasa de recuperación oocitaria por ovario de ovinos, con sus

ü Determinar el efecto de la adición de cysteamina y piruvato en los medios de

ü Evaluar los procesos de maduración, fertilización y cultivo in vitro de embriones

3.1 Marco Teórico

3.1.1 Colecta y transporte de ovarios de beneficio

Mediante esta metodología se hace posible obtener oocitos de ovarios de ovinos

3.1.2 Criterios para la selección de oocitos

Los criterios utilizados para la evaluación y selección de los complejos cúmulus-

Estas células aportan nutrientes y energía (Piruvato) al oocito, También secretan

Los oocitos se pueden clasificar en cuatro categorías: Categoría A, Presentan tres

3.1.3 Maduración In Vitro (MIV)

Los oocitos inmaduros para convertirse en fertilizantes deben someterse a una

Bucaramanga, _ de _____________ del 2019.