Adhesión y formación de biopelículas microbianas

Los microorganismos se depositan, interactúan en las superficies, comienzan el crecimiento y,

cuando se liberan, pueden contaminar los alimentos.

Las superficies de los equipos o utensilios que entran en contacto con los alimentos durante el
proceso de industrialización no deben contaminarlos ni aumentar la incidencia de
microorganismos, ya sean alterantes o patógenos. Sin embargo, se sabe que, bajo ciertas
condiciones, los microorganismos se depositan, se adhieren, interactúan con las superficies e
inician el crecimiento celular. A medida que se multiplican, forman colonias y, cuando la masa
celular es suficiente para que se le agreguen nutrientes, residuos y otros microorganismos, lo que
se llama biopelícula microbiana (SNYDER, JR., 1992; SASAHARA; ZOTOLLA, 1993; ZOTOLLA, 1994;
ZOTTOLA; SASAHARA, 1994; HOOD; ZOTOLLA, 1995; ARCURI, 2000).

El desarrollo de biopelículas microbianas ocurre con frecuencia en las industrias alimentarias,

donde grandes cantidades de nutrientes están disponibles para los microorganismos, por ejemplo,
cuando las válvulas, las juntas de goma y las partes internas de las tuberías de acero inoxidable
son colonizadas por microorganismos (MAFU et al., 1990 ; ASSANTA et al., 1998; BERESFORD et al.,
2001; LEREBOUR et al., 2004;). En estos puntos, si no hay una buena higiene, sin duda habrá
condiciones favorables para el crecimiento microbiano (CZECHOWSKI, 1990; HOLAH et al., 1990;
MAFU et al., 1990; CAPENTIER; CERF, 1993; AUSTIN; BERGERSON, 1995; ALLISON et al. ., 2000).

La adhesión microbiana y la formación de biopelículas se producen debido al depósito de

microorganismos en una superficie de contacto, donde se asientan e inician el crecimiento.Las
biopelículas están formadas por bacterias unidas a las superficies, que a su vez están rodeadas por
una capa de partículas de materia orgánica, formando depósitos, en los cuales los
microorganismos están fuertemente unidos a una superficie por medio de filamentos, de un
polisacárido o proteína de naturaleza, llamada glicocalix (CRIADO et al., 1994). Las biopelículas
contienen, además de microorganismos, partículas de proteínas, lípidos, fosfolípidos,
carbohidratos, minerales y vitaminas, entre otros, que forman depósitos donde los
microorganismos continúan creciendo, dando como resultado un cultivo puro o una asociación
con otros microorganismos. En la biopelícula, los microorganismos son más resistentes a la acción
de agentes químicos y físicos, como los utilizados en el procedimiento de higiene (CZECHOWSKI,
1990; HOLAH; THORPE, 1990; MOSTELLER; BOULANGE-PETERMANN, 1991; BISHOP, 1993;
LECLERCQ; LALANDE, 1994).

La formación de adhesión (Figura 1), o biofilm, puede ser deseable, en algunos casos (Tabla 1),
como las existentes en los biorreactores utilizados en el proceso de producción de alimentos
fermentados. Las bacterias productoras de ácido acético crecen, se acumulan en fragmentos de
madera y convierten varios sustratos en vinagre. Estos agregados microbianos también se utilizan
en tratamientos aeróbicos y anaeróbicos de aguas residuales para eliminar la materia orgánica e
inorgánica. En el proceso de potabilización de agua, la eliminación de nitrógeno, carbono
biodegradable y precursores de trihalometano puede realizarse mediante biopelículas microbianas
sumergidas (TAKASAKI et al., 1992).

La adhesión y la formación de
biopelículas microbianas pueden ser
indeseables, en varios aspectos, en la
industria alimentaria (Tabla 1), ya que
pueden hacer que el proceso de
cloración del agua sea menos eficiente
(BEER et al., 1994); reducir la
eficiencia de la transferencia de calor
en intercambiadores de calor;
disminuir el flujo en tuberías;
desencadenar procesos corrosivos; y,
principalmente, para convertirse en
fuentes de contaminación microbiana.
Bajo el aspecto microbiológico, la
adherencia puede consistir en la
alteración y / o microorganismos patógenos, que resultan en graves problemas de higiene, salud
pública o económicos (CRIADO et al., 1994).

1. Microorganismos involucrados en los procesos de adhesión y formación de biopelículas

microbianas. Diferentes microorganismos y superficies participan en el proceso de adhesión y
formación de biopelículas.

La participación de microorganismos en el proceso de adhesión y formación de biopelículas en las

superficies de equipos y utensilios para el procesamiento de alimentos se produce a varios niveles
de intensidad. La liberación de estos microorganismos puede tener consecuencias indeseables
para la calidad de los alimentos producidos, como cambios en esto y la transmisión de patógenos.

Estos microorganismos pueden originarse a partir de diferentes fuentes primarias de

contaminación, dentro de la cadena de procesamiento y comercialización de alimentos, incluidos
el suelo, el agua, las plantas, los utensilios, el tracto intestinal de hombres y animales,
manipuladores, alimentos. animales y aire de entornos de procesamiento.
Una gran cantidad de especies de bacterias pueden alterar los alimentos. Entre los más
importantes se encuentran los géneros Acetobacter, Acinetobacter, Aeromonas, Alkaligenes,
Alteromonas, Bacillus, Brochotrix, Campylobacter, Citrobcater, Clostridium, Corynebacterium,
Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Flavobacterium, Lactobacococus, Micrococcus , Proteus,
Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Vibrio y Yersinia.

Los hongos filamentosos también alteran las propiedades de los alimentos, como las especies de
los géneros Alternaria, Aspergillus, Botritys, Byssochlamis, Cephalosporium, Colleotrichum,
Fusarium, Geotricum, Helinthosporium, Monilia, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Sporotrichum y
Thamnidium. de levaduras de los géneros Brettanomyces, Candida, Debaromyces, Endomycopsis,
Hansenula, Kloeckera, Kluyveromices, Mycoderma, Rhodotorula, Saccharomyces,
Saccharomycopsis, Schizosaccharomyces, Torulopsis y Trichosporon.

Especies bacterianas alteradas Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fragi, Micrococcus sp.,

Enterococcus faecium, Bacillus sporothermodurans, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus y
Desulfovibrio desulfuricans (BEECH; GAYLARDE, 1997; ; ANDRADE et al., 1998a; ANDRADE et al.,
1998b; AKUTSU et al., 1999; FIGUEIREDO et al., 2000; FLINT et al., 2001; HJELM et al., 2002).

Ejemplos típicos de microorganismos alteradores, que producen grandes cantidades de limosidad,

son las especies del género Pseudomonas que tienen las siguientes características: son bastones,
gramnegativos, generalmente móviles, no formadores de esporas, presentan solo uno o un grupo
de flagelos en uno o ambos extremos de la celda; son capaces de fermentar grandes cantidades

carbohidratos, produciendo una variedad de productos que afectan el sabor de los alimentos; son
proteolíticos y lipolíticos y sintetizan las vitaminas y los factores de crecimiento necesarios para su
desarrollo; mostrar tendencia de crecimiento en aerobiosis, desarrollo rápido; producir sustancias
oxidadas y limosidades en superficies de alimentos, equipos y utensilios para procesamiento;
También pueden crecer a bajas temperaturas de almacenamiento y producir sustancias
fluorescentes. La especie P. fluorescens se puede detectar cuando se adhiere, considerando que
produce compuestos que emiten fluorescencia bajo luz ultravioleta.

Las especies bacterianas patógenas asociadas con la formación de biopelículas incluyen Listeria
monocytogenes, Listeria innocua, Yersinia enterocolitica, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli
0157: H7, Staphylococcus aureus Bacillus cereus (DOYLE, 1992; HOIZI, 1996; PARIZZI; PARIZZI;
1996 et al., 2004).

Por lo tanto, una microbiota bien diversificada, que incluye Gram-positiva, Gram-negativa,
esporulando o no, varillas, cocos de racimo (Figura 2), cocos de cadena, psicrotróficos, mesofílicos,
termofílicos y termodúricos, está involucrada en los procesos de adhesión y formación de
biopelículas en la industria alimentaria.

En los Estados Unidos, se estima un gasto anual de entre 5 mil millones y 22 mil millones de
dólares en el tratamiento de enfermedades transmitidas por alimentos, considerando todas las
formas de contaminación alimentaria por estos microorganismos patógenos. Estos valores varían
según la metodología utilizada para proceder con la estimación que puede incluir gastos
hospitalarios, horas de trabajo perdidas, gastos con recuperación de la enfermedad y la estimación
de cuánto estarían dispuestos a pagar las personas para no contraer la enfermedad. Según el
Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades, se estima que los CDC, en los Estados
Unidos, tienen 76 millones de personas enfermas debido a alimentos contaminados, con 325,000
hospitalizaciones por año y aproximadamente 35,200 muertes (CDC, 2006). Solo con salmonelosis
el gasto estimado es

1 mil millones de dólares anualmente. Aproximadamente el 25% de estas enfermedades están

asociadas con materias primas, equipos y utensilios contaminados, por lo tanto sujetos a la
formación de procesos de adhesión microbiana.

Los alimentos contaminados pueden causar más de 200 enfermedades, siendo los agentes
etiológicos: bacterias, hongos micotoxigénicos, virus, parásitos, toxinas, metales pesados, priones
y agentes químicos, como residuos de fungicidas, insecticidas, detergentes y desinfectantes. Los
síntomas varían desde gastroenteritis moderada a síndromes renales, hepáticos y neurológicos.
Muchos de los patógenos de gran importancia hoy en día, por ejemplo Campylobacter jejuni,
Escherichia coli O157: H7, Listeria monocytogenes, Cyclospora cayetanensis, no fueron
reconocidos hace 30 años como causantes de enfermedades transmitidas por los alimentos. La
infección por Campylobacter jejuni es una causa común de enfermedades transmitidas por
alimentos en los Estados Unidos. En 1996, el 46% de los casos confirmados reportados por los CDC
y la Administración de Drogas y Alimentos, la FDA, fueron causados por especies de
Campylobacter, seguidas, en prevalencia, por Salmonella (28%), Shigella (17%) e infección por
Escherichia coli. O157: H7 (5%).

Desde 1995, la Organización Panamericana de la Salud, OPS, ha coordinado el Sistema de

Información Regional para la Vigilancia Epidemiológica de las Enfermedades Transmitidas por los
Alimentos. Entre 1995 y 1999, 22 países informaron a esta agencia sobre la ocurrencia de
aproximadamente 3,600 brotes, 114,000 casos y 210 muertes. La comida involucrada fue
diagnosticada en 2,540 brotes, que representan el 75% del total. Los alimentos de origen animal
tuvieron una mayor participación, siendo responsables de 1.457 brotes, lo que representa el
61,7% del total. El agente causal se identificó en 1.940 brotes, con predominio de agentes
bacterianos, que estuvieron involucrados en el 51,4% de los casos. Los brotes causados por
Salmonella spp. y Staphylococcus aureus fueron los que más contribuyeron a la aparición de
enfermedades de origen bacteriano.
Los brotes en Brasil han sido obligatorios desde 1999, según la Ordenanza GM / MS No. 1461, del
22/12/99. Sin embargo, hay informes menores que generalmente ocurren porque la enfermedad
puede manifestarse levemente, sin requerir tratamiento médico, porque el consumidor no
considera que la aparición de trastornos gastrointestinales esporádicos sea importante y tampoco
es consciente de que puede y debe informar para Prevenir la aparición de nuevos casos. La rutina
sobrecargada de servicios de salud, sin espacio para informar brotes de enfermedades
transmitidas por alimentos, también contribuye a la falta de informes.

En los datos puestos a disposición por el Sistema Único de Salud, SUS, en el período comprendido
entre 1998 y 2001, la aparición de infecciones intestinales se destaca como el diagnóstico
principal, que son responsables del 4,5% al 4,8% de las causas de los ingresos hospitalarios
( ANTUNES, 2000). Entre otras enfermedades involucradas están el cólera, la fiebre tifoidea, la
shigelosis y la amebiasis. Tales enfermedades representan

representan aproximadamente el 60% del número total de hospitalizaciones por enfermedades

intestinales en ese período, siendo el grupo de causas con el mayor número de hospitalizaciones,
en comparación con otras enfermedades infecciosas, como la tuberculosis, la malaria, el dengue o
el SIDA. Durante este período, el número de hospitalizaciones por enfermedades infecciosas
intestinales fue de aproximadamente 570,000, con el valor total de estas hospitalizaciones para el
país, en 2001, alrededor de 108 millones de reales, mientras que en 1998 fue de 74 millones de
reales. En comparación con el número de hospitalizaciones por grandes grupos de causas,
clasificadas por el Código Internacional de Enfermedades (ICD 10 / 10th Classification Review), las
enfermedades intestinales infecciosas se clasifican en el sexto o séptimo lugar, considerando la
población en su conjunto ( SCZ, 2002).

En Minas Gerais, entre 1995 y 2000, los datos de la Fundación Ezequiel Dias (FUNED) mostraron
que 12.820 personas estaban intoxicadas y 17 murieron después de comer alimentos
contaminados con enterotoxina estafilocócica (Tabla 2).

Con el desarrollo de la epidemiología y la mejora de los servicios de vigilancia de enfermedades

causadas por alimentos contaminados, los factores específicos que contribuyen a la aparición de
brotes se han hecho evidentes, incluidas las prácticas, procedimientos y procesos de fabricación
deficientes.
Los factores que contribuyen a los brotes de enfermedades transmitidas por los alimentos reflejan
los peligros y, en consecuencia, el conocimiento de estos factores ayuda a establecer puntos
críticos de control en el proceso. Por lo tanto, es posible proponer medidas para eliminar o reducir
los peligros. A partir de ahí, es posible elaborar directrices para evaluar la probabilidad de
ocurrencia de un riesgo y la indicación de dónde es necesaria la verificación del monitoreo de un
punto crítico de control. Los legisladores, los administradores de programas de calidad, los
supervisores y los inspectores deben priorizar estos factores en asuntos relacionados con la
inocuidad de los alimentos.

En la investigación sobre percepciones, experiencias y comportamiento preventivo en

enfermedades causadas por alimentos contaminados en los Estados Unidos, se enumeraron los
principales factores que llevaron a la aparición de estas enfermedades en ese país. Alrededor del
65% de los alimentos fueron comprados en restaurantes, 17% en supermercados, 17%
consumidos en hogares y 1% comprados en industrias. Los principales factores que causaron los
brotes fueron el consumo de alimentos sobrantes o después de la fecha de vencimiento (27%),
enfriamiento inadecuado (23%), alimentos contaminados e inseguros (12%), cocina inadecuada
(10%) , mala higiene y contaminación cruzada (7%) y recalentamiento inadecuado (1%).

Las esporas bacterianas (Figura 3) están ampliamente dispersas en el medio ambiente, el suelo, el
aire y el agua, desde donde pueden contaminar los alimentos y las superficies y originar procesos
de adhesión y formación de biopelículas. Los principales géneros de bacterias que tienen la
capacidad de formar esporas son: Bacillus, Clostridium, Sporolactobacillus, Sporosarcina,
Oscillospira, Alycliclobacillus y Desulfotomacullum, que comprenden especies alteradoras y / o
patógenas. Las esporas son de gran importancia en la industria alimentaria, ya que son resistentes
al tratamiento térmico, la radiación, la desecación y los agentes químicos. Además, son
refractarios y absorben débilmente los tintes comunes, pero se pueden observar utilizando
métodos especiales de coloración. Son varillas o cocos, a veces en forma de filamentos, con un
diámetro entre 0.3 y 2 mm y una longitud que oscila entre 2 mm y 10 mm, hasta 30 mm. La
mayoría de las especies en su forma vegetativa son Gram positivas y, en general, tienen flagelos
peritricos.
La importancia del control de esporas para los alimentos se puede ver al observar especies
bacterianas esporuladas. Entre ellos están: i) Clostridium botulinum, que es la bacteria que
produce la toxina más letal de las especies bacterianas, siendo responsable de la intoxicación
neurotóxica, con alta letalidad; ii) Clostridium perfringens, que causa intoxicación diarreica; iii)
Bacillus cereus, responsable de los síndromes eméticos o diarreicos, dependiendo de la cepa; iv)
Clostridium tyrobutiricum, la causa del relleno tardío de queso; v) Alyciclobacillus acidoterrestris,
cambiador de jugo de naranja; vi) Bacillus sporothermodurans, resistente al tratamiento de Ultra
Alta Temperatura, la UAT; vii) Sporolactobacillus spp., modificador de alimentos ácidos como el
yogur; viii) Bacillus stearothermophilus, que tiene alta resistencia al calor; viii) Bacillus coagulans,
alterador de varios alimentos; y ix) Desulfotomaculum nigrificans, un anaeróbico estricto, que
utiliza nitrato, sulfitos y azufre como aceptores de electrones, reduciéndolos a sulfuro de
hidrógeno, con la formación de pigmentos negros en varios alimentos.

El control de Bacillus sporothermodurans en la industria alimentaria es particularmente

importante en el procesamiento de la leche esterilizada por el sistema UAT (ZARCACHENKO;
LEITÃO, 1999). Esta especie bacteriana formadora de esporas tiene una alta resistencia al calor y
es capaz de resistir el tratamiento con UAT (Tabla 3). Se detectó por primera vez en la leche UAT,
en Italia y Austria, en 1985 (PETTERSSON et al., 1996). Son bacterias estrictamente aeróbicas, no
producen ácidos a partir de azúcares como la celobiosa, fructosa, galactosa, glucosa, lactosa,
manitol, manosa, rafinosa, salicina y xilosa y tienen una reacción positiva en las pruebas de
catalasa y oxidasa y negativa en la prueba Voges-Proskauer. ; no reducen el nitrato a nitrito y no
usan el citrato como fuente de carbono. Las cepas estudiaron la esculina hidrolizada, y la mayoría
de ellas hidrolizó débilmente la caseína y no hidrolizaron arbutina, arginina, gelatina y urea,
excepto una cepa.

Tabela 3 - Características do Bacillus sporothermodurans

Las células cultivadas en el laboratorio estaban en forma de varillas alargadas y filamentosas, de

más de 30 µm de longitud y 0,7 µm de diámetro. No están definidos cuando se someten a tinción
de Gram, con aspecto granular similar a un collar de perlas y motilidad mediante flagelos peritricos
(PETERSSON et al., 1996). No hay evidencia de que este microorganismo sea patógeno, según los
estudios. Esta especie bacteriana se puede encontrar no solo en la leche entera y descremada
UAT, sino también en la leche evaporada y la leche reconstituida (KLIJN et al., 1997; HAMMER et
al., 1995).

Según informes de la Asociación Brasileña de Leche de Larga Vida, ABLV, en Brasil, en mayo de
1997, algunos lotes de leche UAT presentaban problemas para cumplir con los estándares
microbiológicos requeridos por el Reglamento Técnico de Calidad e Identidad con respecto al
conteo de aerobios mesofílicos, detectados por el Servicio de Inspección Federal, SIF, del
Ministerio de Agricultura y Reforma Agraria, MARA. Según los resultados de los informes, los
productos de estos lotes no mostraron cambios físico-químicos y / o sensoriales en comparación
con la leche UAT adecuada para el consumo, presentando productos con acidez, pH, estabilidad de
las proteínas al alcohol, sabor y olor. normal. Sin embargo, eran, desde el punto de vista legal,
contrarios a las reglas vigentes, con respecto al conteo de aerobios mesofílicos. Sckoken-Iturrino y
col. (1996) mostraron la aparición de bacterias esporulantes (Figura 4) del género Bacillus en
muestras de leche UAT en Brasil, informando que el 6.25% de los productos tenían recuentos
superiores a 102 UFC.mL-1, lo que va en contra del estándar requerido por la legislación para el
producto con respecto al recuento de microorganismos aerobios mesofílicos, que es de hasta 1.0 x
102 UFC.mL-1 (Ordenanza SVS / MS, nº 451/97).

Las etapas de transformar una célula vegetativa en esporas son comunes a todas las especies que
esporulan (Figura 4): Etapa 0: corresponde a la célula vegetativa. Etapa I: el material nuclear se
condensa para formar un solo filamento de cromatina axial. Etapa II: un tabique se forma por
invaginación de la membrana celular y la espora se desarrolla en uno de los polos de la célula.
Etapa III: el protoplasma de esporas está rodeado por dos membranas, formando la espora, que ya
está libre en la célula. Etapa IV: entre las membranas de la espora, se forma la capa de origen de la
pared celular, desde la membrana interna, y la corteza, desde la membrana externa. Etapa V -
Formación de la capa e incorporación de calcio. Etapa VI - La espora está madura. Etapa VII: su
liberación ocurre después de la lisis de la célula madre.

La estructura de las esporas es diferente de la de las células vegetativas (Figura 5), que consiste en
capas concéntricas que aparecen en formas ovales o esféricas. Esta estructura, cuando se observa
desde el centro de las capas hacia el exterior, es: primero el protoplasma o núcleo, que contiene
ADN, ARN, enzimas y ribosomas, es decir, el material genético que debe protegerse para originar
un Nueva célula vegetativa. En segundo lugar, alrededor del protoplasma, hay una membrana
interna que origina la membrana celular y una capa que forma la pared celular de la nueva célula
vegetativa. En la secuencia, están la membrana externa y la corteza, formadas por peptidoglicano,
que le da resistencia a la espora a los tratamientos térmicos. La capa de esporas, que es la capa
más externa, consiste en una o más capas de proteína, con un alto contenido de aminoácidos
metionina o cisteína con enlaces disulfuro (S-S). Estos enlaces no se reducen con agentes
oxidantes, lo que proporciona resistencia a los desinfectantes más comunes utilizados en la
industria alimentaria, incluidos el cloro, el yodo, el ácido peracético y los compuestos de amoníaco
cuaternario. Algunas esporas tienen una capa final, la exospora, que consiste en lipopolisacáridos.
Cuando la espora se convierte en una célula vegetativa, la corteza, la tapa y la exospora se
hidrolizan.

Transformación de la celula en espora Figura 4 - Transformação de célula vegetativa em esporo.

 Figura 5 - Morfologia de células
vegetativas bacterianas.
La transformación de la espora en una célula vegetativa comprende las etapas de activación,
germinación, crecimiento posterior a la germinación y multiplicación (Figura 6). La activación se
produce mediante tratamientos subletales, que no causan cambios significativos en la espora,
resistentes a los agentes químicos y al calor. Este paso puede iniciarse mediante la exposición a
tratamientos térmicos, cambios en el pH, sustancias alcalinas o ácidas y otros agentes químicos. La
germinación es un proceso degradante que hace que las esporas sean sensibles al tratamiento
térmico y a los agentes químicos. Las esporas pierden calcio, ácido dipicolínico y refractividad;
Además, son capaces de absorber colorantes, y su densidad óptica disminuye. La germinación
requiere la presencia de sustancias químicas; entre estos: aminoácidos, como L-alanina y L-cistina;
ribosidos, por ejemplo inosina y adenosina; y azúcares, como glucosa y fructosa, así como lactato,
bicarbonato y dipicolinato de calcio.

Figura 6 - Transformação de esporo bacteriano em célula vegetativa.

En el crecimiento posterior a la germinación, las esporas se hinchan debido a la entrada de agua y

nutrientes y luego se alargan, dando lugar a una nueva célula vegetativa, cuando, entonces, se
produce la síntesis de proteínas, la pared celular y la síntesis de enzimas. Esencial para la
multiplicación. La síntesis de ADN ocurre durante la fase de estiramiento. El último paso en el
proceso es la multiplicación, que ocurre cuando los microorganismos aumentan en número,
trayendo una serie de consecuencias para los alimentos.

 De acuerdo con Anderson et al. (1995), las esporas de B. cereus se a dhieren fácilmente a
diferentes superficies, y esta capacidad de adhesión se debe a tres características: alta hidrofobia,
baja carga superficial y morfología de las esporas, ya que tienen apéndices, que también son
responsables de la adhesión. . La especie Clostridium bifermentans tiene un tipo de apéndice que
sobresale hacia afuera, desde un solo punto en la espora. La sección transversal de este apéndice
revela que están formados por tres capas concéntricas de subunidades de baja densidad
electrónica, que pueden influir en la adhesión bacteriana (SAMSONOFF et al., 1970; BROCK et al.,
1994).

Según Desrosier y Lara (1981), algunas esporas bacterianas tienen un apéndice llamado pili. Los
estudios muestran que las esporas de al menos 16 cepas de B. cereus tienen, en promedio, ocho
pilus, que se distribuyen aleatoriamente en la espora, lo que ayuda a que se adhiera.

La razón por la cual la espora bacteriana tiene una fuerte hidrofobia no se conoce bien. Se sabe
que la adhesión de estas esporas a las superficies de la línea de procesamiento y al equipo de la
industria constituye problemas para obtener alimentos de calidad. Ronner y col. (1990) realizaron
estudios con esporas de las especies B. cereus, B. licheniformis, B. polymyxa, B. subtilis y B.
stearothermophilus, para analizar su grado de hidrofobicidad. Descubrieron que la espora de B.
cereus era más hidrófoba, con aproximadamente un 45% de adhesión, mientras que la de B.
licheniformis y la de B. polymyxa tenían entre 10% y 20%. Sin embargo, el grado de adhesión de
las esporas de B. subtilis y B. stearothermophilus no superó el 5%. Se observó, en base a estudios
desarrollados, que, en general, las esporas mostraron una mayor capacidad de adhesión tanto en
superficies hidrofóbicas como hidrofílicas, en comparación con sus células vegetativas.

De las esporas analizadas, la de B. cereus es la única que no tiene una exospora, y su estructura
externa está compuesta principalmente de proteínas (52%), lípidos (13%) y fosfolípidos (6%).
Según (Ronner et al. (1990), la exospora puede contribuir a una alta hidrofobia y un alto grado de
adhesión. Además, los pili pueden estar involucrados en la superposición de la fuerza de repulsión
electrostática, entre las superficies de las esporas y el procesamiento de alimentos .

Las esporas de B. cereus son importantes en la industria láctea, porque cuando están presentes en
cantidades iguales o superiores a 106 UFC por ml o g, pueden causar enfermedades a través de los
alimentos, además de producir proteasas y fosfolipasas extracelulares, lo que resulta en dulces y
en el sabor amargo de la leche pasteurizada (COLLINS, 1981). Larsen y Jorgensen (1997), al
examinar alrededor de 458 muestras de leche, recolectadas en tres industrias diferentes,
observaron que el 56% de ellas tenían B. cereus, cabe señalar que, en el verano, este valor alcanzó
el 72%, frente al 28% en el Invierno. Se detectó B. cereus psicrotrófico en 29 de 115 muestras de
leche cruda y en 120 de 257 muestras de leche pasteurizada, encontrándose células viables dentro
de un rango de 1.0 x 103 UFC.mL-1 a 3.0 x 105 UFC.mL-1. Giffel y col. (1997) evaluaron la
incidencia del microorganismo B. cereus en los tanques de enfriamiento de leche, señalando que
el 40% de 133 muestras estaban contaminadas con el microorganismo.

2. Superficies involucradas en procesos de adhesión microbiana

Según muchos autores (LÓPEZ, 1970; STEVENS, 1990; CZECHOWSKI, 1990; HAYES, 1993; PALMER,
1998; VERGNAUD, 1998; RODRIGUEZ, 2002; RODOLFO JR; NUNES, 2002; INSTITUTO DO PVC,
2004;), o material de superficie comúnmente Utilizado en el proceso de alimentos como acero
inoxidable, polietileno, polipropileno, policarbonato, acero al carbono, madera, fibra de vidrio,
poliuretano, PVC, mármol, silicona, granito, teflón y vidrio, permite el crecimiento microbiano, lo
que puede conducir a procesos de adhesión. formación de bacterias y biopelículas, según varios
autores (CONSTERTON et al., 1978; COSTERTON et al., 1987; CONSTERTON et al., 1989; MARSHAL,
1992; SASAHARA; ZOTOLLA, 1993; ZOTTOLA; SASAHARA, 1994; COSTERTON et al. ., 1995; HOOD;
ZOTOLLA, 1995; BOWER et al., 1996; HOOD, 1996; SAND, 1997; ZOTTOLA, 1997; HERALD;
ZOTTOLA, 1998; STICLER, 1999; O'TOOLE et al., 2000; LEJEUNE, 2003).

Las características de estas superficies de procesamiento se muestran en la Tabla 4 y deben ser

inertes, tanto con respecto a los alimentos como a los detergentes y desinfectantes en
condiciones normales de uso. Además, sus componentes no deben ser tóxicos, no pueden migrar
ni ser absorbidos por los alimentos. Las superficies lisas, duras y continuas sin grietas o fisuras son
las más adecuadas para el contacto sin deformación, como el abultamiento. Las características de
las superficies ayudan a llevar a cabo un procedimiento de limpieza adecuado. Las características
macroscópicas y particularmente microscópicas de las superficies son decisivas para una mayor o
menor adhesión microbiana, con reflejos en la contaminación de los alimentos con
microorganismos alteradores o patógenos. Cuanto más lisa sea la superficie, más fácil será la
limpieza. Lo ideal es que las superficies no formen poros o ranuras, y que sean resistentes a las
deformaciones, como el abultamiento. Se deben tener en cuenta las características de las
superficies para llevar a cabo un procedimiento de limpieza adecuado.

2.1. Acero inoxidable

Entre los materiales disponibles, el acero inoxidable, una aleación cuya composición incluye
carbono, cromo y níquel, es la más utilizada (Figura 7). Existen varios tipos de acero inoxidable,
pero los que contienen 18% de cromo y 8% de níquel son los más utilizados. Este grupo incluye
aleaciones de la clase 300, por ejemplo 304 y 316, que son resistentes a la corrosión causada por
la mayoría de los alimentos, detergentes y desinfectantes, además de ser fácilmente
desinfectables y relativamente económicas. La resistencia del acero inoxidable se debe a la
película protectora de óxido de cromo que se forma en presencia de oxígeno. En situaciones
donde existe la posibilidad de procesos corrosivos más intensos, como salmueras, se debe usar la
clase 316, ya que contiene más níquel en su composición (aproximadamente 10%) y, aún, 2% a -3
% molibdeno. El tipo Hastelloy, que contiene 56% de níquel, 16% de cromo, 16% de molibdeno,
5% de hierro y 4% de tungsteno, es más resistente a la corrosión, pero su uso es limitado debido al
alto costo.

Figura 7. Fotomicrografia de superfície de aço inoxidável, AISI 304 #4 por microscopia eletrônica
de varredura. a) presença de protuberância e b) fissuras com diâmetros variados.
El acero inoxidable también difiere en el acabado de la superficie, que puede variar según el pulido
utilizado (HAYES, 1993; LE CLERCQ-PERLAT et al., 1994; JULLIEN et al., 2002). El acabado o pulido
del acero inoxidable es importante y está clasificado en una escala de 0, sin pulir, hasta 8, cuya
superficie está reflejada. Normalmente, el acero inoxidable pulido se usa en la industria
alimentaria 4. Según Hayes (1993), los tipos de corrosión en las superficies de acero inoxidable
son: i) Puntual: cualquier lesión en la capa de óxido de cromo determina la corrosión. El
desperdicio de alimentos y las partículas incluidas en la superficie pueden producir corrosión al
excluir el oxígeno. En el caso de los alimentos, el problema es más grave, ya que las bacterias que
crecen en la materia orgánica pueden producir ácidos responsables del aumento de la corrosión.
La corrosión puntual también puede ser producida por lesiones físicas y cualquier óxido, mancha o
área áspera que, si no se trata, puede provocar daños más graves. Una de las principales causas de
corrosión es el uso incorrecto de soluciones de limpieza y desinfectantes, especialmente
hipoclorito de sodio. A veces, estas soluciones se dejan en contacto con la superficie durante
mucho tiempo, se aplican en concentraciones incorrectas o se preparan con productos
inadecuados. ii) Corrosión electrolítica: puede originarse cuando hay una humectación de dos
metales diferentes, como aluminio y hierro, o de dos aceros inoxidables de grado diferente con la
misma solución. Por lo tanto, una solución de limpieza o desinfección puede actuar como un
electrolito y causar corrosión cuando entra en contacto con dos metales diferentes que, por
ejemplo, forman parte del mismo equipo. Los electrones pasan del hierro al aluminio, permitiendo
que el aluminio se corroa. iii) Corrosión intergranular: debido al uso de acero inoxidable rico en
carbono. Ocurre en los contornos de los granos de metal y, a menudo, se extiende dentro de la
pieza, dejando pocos signos visibles en la superficie. Puede suceder en lugares cercanos a las
soldaduras de equipos. Es causada por la precipitación de carburos de cromo en los límites del
grano, como resultado de la permanencia prolongada del acero a temperaturas muy altas. Este
problema puede evitarse fácilmente mediante el uso de aceros inoxidables con bajo contenido de
carbono, como el tipo 304. iv) Corrosión general: debido al uso de un acero inoxidable que no
resiste las propiedades corrosivas de los alimentos procesados. Se puede evitar mediante el uso de
equipos de acero con un mayor grado de resistencia.

2.2. Polímeros

Los polímeros son ampliamente utilizados en la industria alimentaria, debido a sus excelentes
propiedades. Pueden reducir la velocidad, evitar cambios y el deterioro del material de embalaje
debido a influencias externas, como la presencia de oxígeno, luz y microorganismos. Una gran
ventaja es su menor costo en relación con otros materiales utilizados para el embalaje, por
ejemplo, vidrio (VERGNAUD, 1998).

Las propiedades de los polímeros varían ampliamente, dependiendo de la materia prima utilizada,
los aditivos incorporados y el método de fabricación. Básicamente, los utilizados en la industria
alimentaria se agrupan en dos categorías: termoplásticos y termoestables. Los termoplásticos se
ablandan cuando se calientan y se endurecen cuando se enfrían, un proceso que puede repetirse
varias veces sin cambios químicos apreciables. Los tipos de termoplásticos que se encuentran más
comúnmente en las industrias alimentarias son: polietileno, polipropileno, poli (cloruro de vinilo) o
PVC y acrílico, entre otros. Los termoestables pueden endurecerse la primera vez que se calientan,
pero si se recalientan, puede producirse una degradación química. El poliéster, las resinas
epoxídicas y los poliuretanos son polímeros termoestables utilizados en la fabricación de equipos
involucrados en el procesamiento de alimentos (HAYES, 1993; RODOLFO Jr. et al., 2002).

El polipropileno se encuentra entre los materiales más populares en la industria alimentaria, ya

que se ha utilizado en la fabricación de tanques, tuberías, accesorios y superficies involucradas en
el corte de alimentos (POMPERMAYER; GAYLARDE, 2000). Por lo tanto, es importante evaluar la
posibilidad de contaminación cruzada de los alimentos y determinar el grado de adhesión
bacteriana y la formación de biopelículas en las superficies de polipropileno.

Algunas superficies consideradas poco convencionales se han utilizado en el procesamiento de

alimentos. Entre ellos, destacan la fibra de vidrio, poliuretano, PVC, silicona, mármol y granito.

Las siliconas son polímeros, químicamente inertes, resistentes a ácidos y álcalis, radiación gamma,
descomposición por calor, agua o agentes oxidantes, además de ser buenos aislantes eléctricos.
Resistentes al calor y a la intemperie, las siliconas se presentan en formas fluidas, de resina o
elastoméricas, es decir, cauchos sintéticos, siempre con numerosas aplicaciones. Sirven, por
ejemplo, como agentes de pulido, sellado y protección y tienen propiedades impermeabilizantes.
Al soportar temperaturas que pueden variar de 65 ° C negativos a 400 ° C positivos, la silicona se
usa en numerosos segmentos de la industria alimentaria sin perder sus características de
permeabilidad, elasticidad y brillo (RODRIGUEZ, 1989; ABIQUIM, 2004).

Las superficies de silicona tienen varias características que son responsables de su amplia
aplicación, destacando la gran flexibilidad, longevidad y compatibilidad con los medios de
aplicación. La silicona, que es inerte y no tóxica, no daña el medio ambiente, no contamina el
suelo, el agua y el aire, y no altera el sabor de los alimentos con los que entra en contacto
(STEVENS, 1990, ABIQUIM, 2004 )

Los recubrimientos para cintas transportadoras de alimentos, utensilios de cocina, máquinas

automáticas para servir bebidas, moldes de confitería, bandejas de hielo y tetinas para botellas
son solo algunas de las numerosas piezas hechas de elastómeros de silicona para aplicaciones de
contacto con alimentos (ABIQUIM, 2004) .

El PVC (Figuras 8, 9 y 10) se caracteriza por ser no tóxico, resistente a la mayoría de los reactivos
químicos, por ejemplo agentes oxidantes; impermeable; estable; y buen aislamiento térmico,
además de tener una gran durabilidad y no propagar llamas. El PVC puede ser rígido o flexible,
opaco o transparente, brillante o mate, coloreado o no. Este material puede formularse con varios
tipos de aditivos, siendo el polímero más versátil. Estos aditivos pueden mejorar las características
de las superficies de PVC, como la resistencia al calor o al frío, los golpes o la luz, entre otros. La
adición de líquidos orgánicos, llamados plastificantes, le da al PVC una gran flexibilidad (STEVENS,
1990; RODOLFO Jr. et al., 2002; INSTITUTO DO PVC, 2004).

El PVC es el único material plástico que no es 100% derivado del petróleo, ya que contiene 57% p /
p de cloro, originario del cloruro de sodio, y 43% p / p de etileno, de origen petrolífero. Entre las
superficies de PVC involucradas con los alimentos, destacamos los empaques utilizados para
empaques, botellas para agua mineral, construcción de tanques, tuberías, accesorios y
revestimiento de cintas transportadoras (HAYES, 1993; INSTITUTO DO PVC, 2004).
Los poliuretanos (Figuras 11 y 12), también conocidos como policarbamatos, son polímeros con
una amplia variedad de propiedades, todos basados en la reacción de un diisocianato orgánico con
componentes que contienen grupos de hidróxidos, llamados polioles (STEVENS, 1990; ABIQUIM,
2004e). Entre las características de este tipo de superficie, destacan las siguientes: alta
durabilidad, resistencia a los ácidos, oxidación, abrasión y radiación gamma, pero no son muy
resistentes a los álcalis (RODRIGUEZ, 1989). Los poliuretanos sólidos o expandidos, flexibles,
semirrígidos o rígidos pueden tomar la forma de artefactos moldeados, recubrimientos,
elastómeros, espumas o fibras (STEVENS, 1990). Entre las aplicaciones en la industria alimentaria,
destacamos el uso en recubrimientos de cintas transportadoras y como aislante térmico en la
cadena de frío (ABIQUIM, 2004a).

Figura 11- Fotomicrografia da superfície de poliuretano de dupla face rugosa por microscopia
eletrônica de varredura: a) presença de protuberância e b) espaço irregular com diâmetro maior
do que 3 µm.

Figura 12 - Fotomicrografia de superfície de poliuretano dupla face lisa por microscopia eletrônica
de varredura: a) presença de protuberâncias e b) elevação (diâmetro maior) e microfuros
(diâmetro menor).

Las superficies de granito (Figura 13) corresponden a rocas ígneas y metamórficas de grano grueso
compuestas principalmente de minerales félicos en la proporción de 50% de cuarzo, 30% de
feldespato y 20% de mica (LÓPEZ, 1970). La dureza del granito se debe a la presencia y
proporciones relativas de estos minerales. Este tipo de superficie es físicamente difícil de explorar
y beneficiarse, sin embargo, tiene un alto brillo en la po
Figura 11- Fotomicrografía de la superficie rugosa de poliuretano de doble cara mediante
microscopía electrónica de barrido: a) presencia de protuberancia yb) espacio irregular con un
diámetro superior a 3 µm.

Figura 12 - Fotomicrografía de superficie lisa de poliuretano de doble cara mediante microscopía

electrónica de barrido: a) presencia de protuberancias yb) elevación (diámetro mayor) y
microagujeros (diámetro menor).

El alimento y la alta durabilidad mecánica, además, presenta resistencia al calor y un costo

relativamente bajo, pudiendo competir con el costo de las superficies sintéticas. Una desventaja es
la sensibilidad a los ácidos, que puede conducir a la pérdida de brillo y al cambio de color, pero
casi no hay disolución de la superficie (FRASCÁ, 2003)

Figure 13 - Fotomicrografia de superfície de granito por microscopia eletrônica de varredura: a)

presença de ranhuras e fendas, b) rugosidades (vista lateral) e c) e d) ondulações e depressões
com diâmetros variados.

Científicamente, las canicas son rocas metamórficas y recristalizadas con granulometría gruesa y
composición a base de carbonato. Estas superficies están compuestas principalmente de
carbonato de calcio (CaCO3), también conocido como calcita, cuyo contenido puede variar entre
90% y 100% según la pureza del material. Las canicas dolomíticas, por otro lado, están compuestas
de aproximadamente 54% de carbonato de calcio y 46% de carbonato de magnesio (MgCO3).
Junto con el carbonato de calcio, también puede haber otros minerales secundarios en cantidades
mayores o menores, como óxido de silicio (SiO2), óxido de hierro (Fe2O3), óxido de manganeso
(MnO) y óxido de aluminio (Al2O3), entre otros. , consideradas impurezas. Estas diversas
composiciones son responsables de las diferentes condiciones de durabilidad y resistencia de este
material, además de la gran variedad de canicas en el mercado (LÓPEZ, 1970).
Figura 13 - Fotomicrografía de la superficie de granito mediante microscopía electrónica de
barrido: a) presencia de surcos y grietas, b) rugosidad (vista lateral) yc) yd) ondulaciones y
depresiones con diámetros variables.

37 Adhesión y formación de biopelículas microbianas cap.01

Desde un punto de vista práctico, una de las principales características que determinan la calidad
de las canicas, en términos de valor, es el color. Según la coloración, las canicas se pueden
clasificar en blanco y coloreado. Los blancos están compuestos únicamente de carbonato de
calcio, mientras que los de color tienen diferentes colores, como amarillo, verde, morado, negro,
que pueden variar según los minerales en su composición (LÓPEZ, 1970).

Las superficies de las canicas se consideran menos compactas debido a su dureza relativamente
baja. Por lo tanto, son fáciles de cortar y pulir y son adecuados para el procesamiento industrial.
Sin embargo, tienen vulnerabilidad al desgaste físico y reacciones químicas, con una gran
sensibilidad a los agentes ácidos y alcalinos, que pueden causar la aparición de manchas y daños
en la superficie (FRASCÁ, 2003).

Todas las superficies donde se procesan los alimentos conducen a la formación de biopelículas, lo
que puede ocurrir incluso en lugares donde las prácticas de higiene se aplican correctamente. Por
lo tanto, la elección de un agente antimicrobiano debe hacerse con cuidado, teniendo en cuenta
los posibles contaminantes microbianos y el tipo de superficie (Rossoni et al., 2000).

3. Mecanismos de adhesión bacteriana Comprender los mecanismos de adhesión bacteriana a las

superficies para el procesamiento de alimentos contribuye a tomar medidas más apropiadas para
su control.

La investigación sobre la adhesión bacteriana comenzó hace algunas décadas, cuando se descubrió
que los microorganismos adheridos o en biopelículas eran responsables de los procesos de
corrosión en superficies sumergidas en sistemas marinos o acuáticos (ZOBELL; ALLEN, 1935;
ZOBELL, 1943; FLETCHER, 1980; CHARACKLIS ; COOKSEY, 1983; COSTERTON et al., 1987; FLETCHER,
1987).

Se han propuesto varios mecanismos para la adhesión bacteriana en diferentes superficies de

contacto (ZOTTOLA; SASAHARA, 1994; ZOTOLLA, 1997). De acuerdo con la teoría descrita por
Marshall et al. (1971), la adhesión a superficies sólidas es un proceso de dos pasos. El primero es
reversible, ya que el microorganismo se adhiere débilmente a la superficie a través de las fuerzas
de van der Waals y las atracciones electrostáticas, lo que facilita la eliminación de la célula
bacteriana. El segundo es irreversible, ya que el tiempo de adhesión implica la adhesión física de la
célula a la superficie, por medio de material extracelular de polisacárido o proteína producida por
el microorganismo, que se llama matriz de glucocalix. El glicocalix ayuda a la formación de biofilm,
que se produce solo después de la adhesión superficial, proporcionando condiciones para la
adhesión del péptido-glicano de bacterias Gram-positivas y la parte externa de la membrana
externa de bacterias Gram-negativas.

Otra teoría sugiere la existencia de cinco etapas, diferenciadas en el siguiente orden: i) transporte
de nutrientes y materia orgánica e inorgánica a la superficie sólida; ii) formación de una capa de
nutrientes orgánicos e inorgánicos; iii) adhesión de microorganismos a la superficie y crecimiento
celular, iv) intensa actividad metabólica en la biopelícula; y v) liberación de células en el medio
(CHARACKLIS; COOKSEY, 1983; ZOTTOLA, 1997).

Una tercera teoría propone la división del proceso de adhesión en tres etapas, la primera es la
fijación de la bacteria, seguida de la consolidación de la bacteria en la superficie y, finalmente, la
colonización de la bacteria (NOTERMANS et al., 1991).

La consolidación es una etapa importante, ya que los microorganismos producen, en esta etapa,
material extracelular que promueve la fijación de las células en la superficie. En este punto, las
células fijas no se eliminan enjuagando con agua (SCHWACH; ZOTTOLA, 1984; STONE; ZOTOLLA,
1985; GÓMEZ-SUAREZ et al., 2002), sino por la acción mecánica o química de los detergentes y
desinfectantes.

Durante la etapa de colonización, es probable que ocurran muchos cambios entre la microcolonia
y la superficie; y un complejo de polisacárido presente en el glicocalix puede unirse a iones
metálicos, cambiando la naturaleza química y física de la biopelícula. En esta etapa, se pueden
encontrar subproductos metabólicos, como ácidos orgánicos, en la matriz y provocar corrosión
local.

Varios factores pueden influir en la adhesión de los microorganismos a las superficies, como las
características del microorganismo; El material adherente y el medio que rodea al microorganismo
(TROLLER, 1993). La especie, el medio de cultivo, la edad del cultivo y la concentración del
microorganismo pueden afectar el proceso de adhesión. En cuanto al material adherente, tanto el
tipo como la forma iónica y el tamaño de partícula son importantes en el proceso de adhesión.
Con respecto al medio, factores como el pH, la concentración de sales orgánicas, compuestos
orgánicos, agitación, tiempo y temperatura de contacto son importantes en este proceso
(TROLLER, 1993).

La adhesión bacteriana a la superficie es un proceso complejo que comienza con la atracción de

fuerzas electrostáticas entre la célula y la superficie (HOOD; ZOTTOLA, 1995). La Figura 15 muestra
un esquema en el que se propone representar la adhesión bacteriana. En el mecanismo de
adhesión bacteriana, se producen los siguientes pasos (BUSSCHER; WEERKAMP, 1987):
Mecanismo teirico de formación de biofilms

i) A grandes distancias de separación, por encima de 50 nm, solo opera la fuerza de atracción de
van der Waals, que es demasiado grande para la oposición de fuerzas y el reconocimiento de
componentes específicos de la superficie. La aproximación está mediada por propiedades no
específicas de la superficie celular.

ii) Debido a la repulsión electrostática, a una distancia entre 10 nm y 20 nm se producen

interacciones secundarias mínimas. Es posible que la adhesión en esta etapa sea reversible, pero
cambie con el tiempo a poco reversible o esencialmente irreversible, debido a la reorganización de
la superficie celular, lo que lleva a interacciones específicas de corta distancia. Para esto, la
película de agua debe eliminarse de la interfaz bacteria / superficie. Es probable que el papel
principal de la hidrofobicidad y los componentes de la superficie hidrofóbica en la adhesión
bacteriana sea la eliminación de agua en esta película, lo que ayuda a la aparición de interacciones
específicas de corta distancia.

iii) A una distancia de menos de 1.5 nm, con la barrera de energía potencial ya superada, pueden
ocurrir interacciones específicas, como las que pueden originarse a partir de fuerzas polares de
corta distancia, y estas interacciones probablemente conduzcan a un enlace esencialmente
irreversible .

La interacción específica es microscópica, como la que existe entre los componentes de las
superficies, que se produce a una distancia extremadamente corta, lo que permite la aparición de
enlaces iónicos, de hidrógeno y posiblemente químicos. La interacción no específica se define
como aquella que, debido a la propiedad total de la superficie microscópica, como las cargas o la
energía de superficie libre, puede actuar a distancias considerables de la superficie. Se propone un
valor calculado en función de la fuerza de van der Waals, en el que una distancia larga sería
superior a 50 nm, mientras que la distancia corta se refiere a fuerzas que actúan a distancias
inferiores a 1,5 nm (BUSSCHER; WEERKAMP, 1987) .
Figura 15 - Mecanismo teórico para la formación de biopelículas.

40

Higiene en la industria alimentaria Nélio José de Andrade

4. Aspectos termodinámicos del proceso de adhesión bacteriana La adhesión microbiana en las

superficies es una condición indispensable en la formación de biopelículas. Como se mencionó
anteriormente, comienza con interacciones débiles, no específicas, de largo alcance entre las
células y la superficie. Estos enlaces son inestables y las bacterias pueden eliminarse por medio de
un líquido porque se adhieren a una etapa reversible. Dado que las células están muy cerca de la
superficie, pueden formarse interacciones de corto alcance y específicas, y las bacterias se
adhieren a la superficie (CHEN; ZHU, 2005). Este proceso se rige principalmente por las
propiedades físico-químicas de los microorganismos, así como por las superficies (OLIVEIRA et al.,
2003). Las cepas bacterianas con diferentes propiedades de superficie celular mostraron
diferentes cinéticas de adhesión y afinidades superficiales (BAKKER et al., 2002; CHEN; ZHU, 2005).
Las propiedades fisicoquímicas de las superficies bacterianas pueden modificarse químicamente
para estimular o prevenir la adhesión (WHITEKETTLE, 1991; VAN DER MEI et al., 2001; CHEN; ZHU,
2005). Por lo tanto, las estructuras extracelulares, como los lipopolisacáridos, los flagelos y las
proteínas de membrana pueden influir en la adhesión de las bacterias a la superficie
(CAMMAROTA et al., 1998; GÓMEZ-SUÁREZ et al., 2002; CHEN; ZHU, 2005).

Se han utilizado diferentes enfoques para describir y predecir simultáneamente la adhesión

bacteriana en las superficies. En general, la adherencia se puede ilustrar con las teorías DLVO
(Derjaguin, Landau, Verwey y Overbeek), la Teoría de Adhesión Termodinámica y la Teoría DLVO
Extendida.

4.1. Teoría de adhesión termodinámica

En este enfoque, la variación de la energía libre de la superficie interfacial del microorganismo y la

interacción de la superficie se compara antes y después de la adhesión. La comparación se expresa
en términos de la variación de la energía de adhesión libre (Ecuación 1): ΔGTOT = g sb- g sl- g bl (1)

donde DGTOT es la variación de la energía libre de Gibbs, gsb la tensión superficial entre la
superficie y las bacterias, gsl la tensión superficial entre la superficie y el líquido y, finalmente, gbl
la tensión superficial entre las bacterias y el líquido (VAN OSS, 1991, 1994 ) Al igual que cualquier
sistema en la naturaleza, la interacción del microorganismo y la superficie también procede a
disminuir la variación de la energía libre, y la adhesión del microorganismo se producirá si la
variación de la energía es negativa (ΔGTOT <0), y la adhesión será termodinámicamente
desfavorable si es positiva (ΔGTOT> 0). El cálculo de las tensiones superficiales es posible midiendo
el ángulo (Figura 16) de contacto (q) de la superficie o bacterias con líquidos estándar con energía
libre conocida (SHARMA; HANUMANTHA RAO, 2003).

El ángulo de contacto formado por una gota de líquido sobre una superficie sólida (Figura 16) es el
ángulo entre un plano tangente a una gota y la superficie donde se deposita el líquido. Este ángulo
permite evaluar la humectabilidad de esa superficie. Para llevar a cabo las mediciones, se debe
utilizar un líquido polar y dos no polares. Si el líquido es agua, el ángulo formado estará
relacionado con la hidrofobicidad de la superficie. Para Van Oss y Giese (1995), los ángulos
inferiores a 50 ° indican una superficie hidrofílica y ángulos superiores a 50 °, hidrofóbicos. Sin
embargo, para Vogler (1998), una superficie hidrófoba debe tener un ángulo de contacto con el
agua mayor de 65 °.

La ecuación de Young-Good-Girifalco-Fowkes relaciona el ángulo de contacto formado por el

líquido en una superficie sólida con los componentes de la tensión superficial del líquido y la
superficie (Ecuación 2):

(1 + cosq) g l TOT = 2 (gsLW glLW + gs + gl- + gs- gl +) (2)

Para líquidos no polares, el componente polar de la tensión superficial es cero y, por lo tanto, la
ecuación 2 se reduce a la ecuación 3:

     gsLW = (1 + cosq) 2 (3)

donde glTOT es la tensión superficial total del líquido, glLW y gsLW son las tensiones superficiales
de las fuerzas de interacción ácido-base de Lewis, gl + y gs + y son los componentes que aceptan
electrones del componente ácido-base de la tensión superficial y gl- e gs- son los componentes
donadores de electrones del componente ácido-base de la tensión superficial, considerando que
son las tensiones para los líquidos (l) y para las superficies analizadas. Las ecuaciones permiten
determinar los componentes de tensión superficial de los líquidos a 25 ° C. La Tabla 5 muestra los
componentes de la tensión superficial de los líquidos (VAN DER MEI et al., 1997).
4.2. Teoría DLVO

La teoría clásica de DLVO descrita por primera vez por Derjaguin y Landau en 1941 y
complementada por Verwey y Overbeek en 1948 parte de la definición de que los
microorganismos son partículas coloidales liofóbicas. Sin embargo, no se tuvieron en cuenta los
aspectos microbiológicos. Esta teoría sostiene que la energía potencial total de interacción entre
dos cuerpos es el resultado de la acción combinada entre las fuerzas atractivas de Lifshitz-Van der
Waals y las fuerzas de doble capa eléctrica (Ecuación 4).

     ΔGTOT = ΔGEL + ΔGLW (4)

donde ΔGEL es la variación de la energía libre de las fuerzas de la doble capa eléctrica y ΔGLW es la
variación de la energía libre de las fuerzas de Lifshitz-Van der Waals (VAN OSS et al., 1990).

4.3 - Teoría extendida de DLVO

La teoría de DLVO considera solo fuerzas de largo alcance. Sin embargo, cuando una partícula o
microorganismo está muy cerca (2 nm - 5 nm) de una superficie, las fuerzas de corto alcance
comienzan a regular el proceso. Dichas fuerzas no DLVO están representadas por las fuerzas de
repulsión de Born, las fuerzas de hidratación, las interacciones hidrófobas y los puentes
poliméricos.

Van Oss et al., En 1994, integraron los aspectos termodinámicos de la adhesión a la teoría DLVO.
Esta teoría se conoce como XDLVO o DLVO extendida y considera fuerzas de corto alcance,
principalmente interacciones hidrofóbicas. La energía libre de las interacciones totales en una
superficie (ΔGTOT) resulta de la suma de las energías libres de las interacciones Lifshitz-Van der
Waals (ΔGLW), las interacciones ácido-base de Lewis (ΔGAB) y las fuerzas electrostáticas de doble
capa (ΔGEL) y interacciones resultantes de movimientos brownianos (ΔGBR), de acuerdo con la
ecuación 5 y la tabla 6:

  ΔGTOT = ΔGLW + ΔGAB + ΔGEL + ΔGBR (5)

La intensidad de las fuerzas de Lifshitz-Van der Waals es directamente proporcional al tamaño de

las partículas que interactúan y en la relación inversa de la distancia a la superficie. Las fuerzas
eléctricas de doble capa están relacionadas con la carga eléctrica superficial y los movimientos
brownianos. La superficie de un sólido cargado eléctricamente en contacto con una solución
acuosa atrae iones con señales opuestas del medio y repele simultáneamente aquellos con señales
iguales. Dado que la mayoría de las superficies adquieren una carga negativa en la solución, las
fuerzas de la doble capa eléctrica generalmente tienen un carácter repulsivo (OLIVEIRA, 2006). De
esta forma, la adhesión solo será irreversible cuando la variación en la energía libre total de Gibbs
sea negativa (ΔGTOT <0) y la distancia entre la superficie y el microorganismo sea lo más pequeña
posible.

La contribución de las interacciones consideradas por la teoría DLVO da como resultado un perfil
de energía potencial que depende mucho de la fuerza iónica del medio (Figura 17). Por lo tanto, si
la fuerza iónica del medio es baja, el perfil de energía potencial de interacción entre los dos
cuerpos de igual señal tiene una energía máxima, que representa una barrera para el
acercamiento de los cuerpos, y una energía mínima, llamada mínima primaria. , que se encuentra
a menos de 2 nm de la superficie. Cuando aumenta la fuerza iónica del medio, la barrera de
energía disminuye, debido a la reducción de la energía de la doble capa eléctrica. Por lo tanto,
para valores intermedios de la fuerza iónica del medio, la energía máxima disminuye y se crea un
mínimo secundario. Esto, cuando los microorganismos que interactúan son bacterias, se
encuentra a 5-20 nm de la superficie y puede ser más profundo cuanto mayores sean las fuerzas
atractivas de Van der Waals. Una vez que se ha excedido la energía máxima y se ha alcanzado el
mínimo primario, la conexión entre los dos cuerpos que interactúan se vuelve irreversible. Para
valores altos de la fuerza iónica del medio, la energía potencial de interacción es siempre negativa,
en cuyo caso todas las partículas pueden alcanzar el mínimo primario. La existencia de dos
mínimos de energía permite distinguir entre adhesión reversible, cuando ocurre en el mínimo
secundario, e irreversible, cuando ocurre en el mínimo primario (CHAVES, 2004).

Factores asociados con la adhesión microbiana y la formación de biopelículas

Aunque la mayoría de los trabajos se han desarrollado utilizando la simulación de laboratorio, no

hay duda de que las biopelículas también se forman en condiciones de procesamiento. Por lo
tanto, la industria alimentaria debe estar preparada para controlar o eliminar las ocurrencias de
estas formaciones. Naturalmente, uno debe actuar de una manera eminentemente preventiva y, a
este respecto, los procedimientos correctos para limpiar las superficies que entran en contacto
con los alimentos juegan un papel relevante. En la limpieza, los agentes detergentes químicos
tienen la función de eliminar los residuos orgánicos y minerales de las superficies, mientras que los
desinfectantes físicos o químicos inactivan los patógenos y reducen el número de cambiadores de
superficie a números aceptables, por ejemplo, 2 UFC.cm-2 de aerobios mesofílicos para superficies
de acero inoxidable, según lo recomendado por la American Public Health Association, APHA, para
superficies que se consideran desinfectadas.

La dinámica biológica, química y física del desarrollo de biopelículas normalmente sigue una
secuencia temporal ordenada, y el desarrollo de biopelículas involucra las fases de adhesión,
crecimiento celular, producción y maduración de polisacáridos, generalmente seguido por la
liberación de parte de la biopelícula desde la superficie.

En los últimos años, se ha discutido mucho sobre la diversidad de especies y su distribución

espacial en las biopelículas, y el desafío para el futuro es comprender la expresión de los genes en
las propiedades fisiológicas y la interacción entre las células en la biopelícula (Tabla 7). El rápido
desarrollo de herramientas moleculares está abriendo nuevas alternativas para estudiar en detalle
la actividad fisiológica y el estado de las células individuales. En consecuencia, se explorarán
mecanismos reguladores para comprender el potencial morfológico y fisiológico de una especie, lo
que puede ayudar a comprender lo que ocurre en las comunidades de biopelículas microbianas
(O'TOOLE, 1989a; O'TOOLE, 1989b; ESCHER; CHARACLIS, 1990; VAN LOBSDRECHT et al., 1990;
FUQUA et al., 1996; SAUER et al., 2002).

El potencial de una bacteria para reaccionar a diferenciaciones complejas, siempre respondiendo

con adaptaciones fisiológicas, debe considerarse en la formación de la biopelícula. Además, el
papel de los factores físico-químicos en la regulación de la estructura de la biopelícula debe
analizarse en asociación con factores genotípicos. En este sentido, estudios como este en
combinación con modelos matemáticos buscarán una teoría unificada para explicar mejor el ciclo
de desarrollo de la biopelícula.

Algunos de los aspectos importantes que influyen en la adhesión bacteriana y la formación de

biopelículas se analizan en los ítems posteriores.
.1 Apéndices celulares

Todavía no se conoce bien el mecanismo preciso de la adhesión de la bacteria a la superficie, pero

se sabe que, aunque la bacteria no hace contacto directo con la superficie, la adhesión está
mediada por estructuras extracelulares capaces de superar los efectos de la repulsión
electrostática. Estas estructuras se refieren a pili, fimbria, exopolisacáridos y proteínas de la pared
celular (DENYER et al., 1993).

Los apéndices superficiales pueden servir como un enlace entre la célula y el sustrato de adhesión,
cancelando la repulsión electrostática. Estos apéndices pueden variar en tamaño y rigidez,
alcanzando varias veces el tamaño de la célula. Muchos componentes de la superficie celular han
sido reconocidos como sondas moleculares que actúan estereoquímicamente con moléculas de
superficie y se denominan adhesinas (BUSSCHER; WEERKAMP, 1987).

Los apéndices contribuyen a la hidrofobicidad, carga superficial y energía superficial libre. Además,
muchas sustancias pueden asociarse transitoriamente con la superficie celular y afectar sus
propiedades. Un buen ejemplo es el compuesto anfifílico, conocido como ácido lipoteicoico,
esencialmente un componente de la membrana citoplasmática de muchas bacterias Gram-
positivas, que migran a través de la pared celular al ambiente que rodea la célula. En la superficie
celular, el ácido lipoteicoico puede actuar como una molécula específica, por ejemplo, uniendo
Streptococcus pyogenes a células epiteliales y al mismo tiempo mediando la conexión de agua e
hidrocarburos en la interfaz (BUSSCHER; WEERKAMP, 1987).

5.1.1 Azotar

Los flagelos son como hélices propulsoras, apéndices rígidos e insertados en la base de la célula,
siendo responsables de la motilidad de los microorganismos (Figura 18). Estos apéndices son
generalmente mucho más largos que las células, muy delgados y solo visualizados, bajo análisis
microscópico, cuando se tiñen con compuestos especiales que aumentan sus diámetros.

Figura 18 - Esquema de un flagelo bacteriano.

Los flagelos se insertan en la membrana y la pared celular a través de una estructura llamada
cuerpo basal, compuesta de dos anillos en bacterias Gram-positivas y cuatro en bacterias Gram-
negativas. Hay una estructura intermedia similar a un cilindro tubular en forma de gancho, como
un filamento que consiste en subunidades de proteínas, flagelina. Las subunidades de flagelina,
expuestas en el cuerpo basal y la porción filamentosa de los flagelos, se pueden colocar para
mediar la adhesión a superficies, como equipos y utensilios utilizados para procesar alimentos. Los
flagelos se usan en la clasificación taxonómica de bacterias y se insertan de diferentes maneras en
microorganismos; se les llama flagelos peritricos cuando se distribuyen en varios puntos alrededor
de la célula, lofotrichio y amphilofotrichio si están en grupos en un extremo de las células o en
ambos, respectivamente, y monotriches cuando solo hay un flagelo.

La investigación con especies marinas de Vibrio sugiere que durante la colonización de la

superficie, el flagelo puede funcionar como un sensor. Estas bacterias de ambientes marinos son
bacilos planctónicos de 2 mm de largo que contienen un solo flagelo polar. La adhesión de este
microorganismo, provocado en condiciones de laboratorio, conduce a la conversión de esta célula
a una forma de más de 30 mm de longitud y muchos flagelos laterales. Este cambio en la
morfología de la célula permite una colonización eficiente de la superficie. El flagelo polar obtiene
energía del transporte de iones de sodio, mientras que el flagelo lateral utiliza el transporte de
protones. Inhibición de la rotación del flagelo polar por agentes que bloquean los canales de sodio.

da como resultado la producción de flagelo lateral, lo que sugiere que cuando las células con
flagelo polar se acercan a la superficie, la rotación de este flagelo puede verse afectada
negativamente. La disminución en la rotación o flujo de sodio es una señal para la producción del
flagelo lateral. Así, el flagelo polar actúa como un sensor (DALTON; MARZO, 1998).

5.1.2. Fímbria y Pili Las fimbrias son estructuras similares a los flagelos (Figura 19), pero no están
involucradas con la motilidad del microorganismo, siendo más pequeñas y más numerosas que los
flagelos. Presentan una estructura filamentosa, compuesta de subunidades proteicas, llamada
pilina. Se encuentran en una variedad de superficies celulares, como Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa y Vibrio cholerae, entre otras. El papel de fimbria en la adhesión
bacteriana por las células patógenas ha sido ampliamente estudiado. La interacción entre la
bacteria y el huésped, o una superficie inerte, depende de la proteína en el cuerpo o en la punta
de la fimbria. La fimbria se une a receptores específicos en el huésped y activa los genes de la
célula huésped, con la traducción de la señalización, lo que lleva a una mayor adhesión o invasión
(AUSTIN et al., 1988; DALTON; MARCH, 1998).

Los pilus (Figura 19) son estructuras similares a las fimbrias, siendo, en general, más largas, y solo
una o pocas de ellas están presentes en la superficie de los microorganismos. Estos apéndices se
pueden ver mediante microscopía electrónica, porque sirven como un receptor de virus específico
y, cuando están cubiertos por estos microorganismos, se pueden observar fácilmente. También
involucrados en procesos de adhesión microbiana (BROCK et al., 1994; DI MARTINO et al., 2003),
los pilus generalmente están formados por monómeros de una sola proteína, llamada pilina, que,
cuando se combinan, tienen una estructura tubular de 3 a 25 nm de espesor y 0.2 a 20 mm de
largo.

Los mutantes de E. coli que no tenían la capacidad de producir pili tipo I, o flagelos, no formaron
biopelículas de PVC, con pocas células adheridas en grupos pequeños. Por lo tanto, se puede decir
que la movilidad es importante para anular la fuerza de repulsión entre las bacterias y el sustrato
y, una vez que se alcanza la superficie, se requiere pili tipo I para estabilizar la adhesión (STICKLER,
1999

Figura 19 - Diagrama de un pili, flagelo y fimbria de células bacterianas.

49 Adhesión y formación de biopelículas microbianas cap.01

Los estudios con mutantes de P. aeruginosa que no pudieron formar biopelícula de PVC mostraron
que estas cepas tenían un defecto en los pili de tipo IV o un flagelo mediador móvil. Las cepas
salvajes de este microorganismo formaron una monocapa de células en la superficie después de
cuatro horas. Entre cinco y ocho horas, las monocapas se volvieron confluentes, haciendo que se
cubriera toda la superficie. Los mutantes sin motilidad no pudieron adherirse al PVC en un período
de ocho horas. Los mutantes con un defecto en pili tipo IV formaron monocapas dispersas, pero
no pudieron densificarlas. La retracción y extensión en los pili de tipo IV se consideran las causas
de la migración celular a través de la superficie, lo que se denomina "contracciones". En el caso de
P. aeruginosa, parece que la motilidad mediada por flagelo es importante para la adhesión y la
formación de monocapas de células dispersas (STICKLER, 1999).

Según los estudios, se puede garantizar que Salmonella Enteritidis pili también participe en el
proceso de iniciación de la biopelícula en acero inoxidable y teflón. Los mutantes incapaces de
producir una fimbria agregativa, llamada SEF 17, no pudieron formar biopelículas gruesas típicas
de las cepas salvajes. También se garantiza que esta fimbria estabilice el contacto célula-célula
durante la formación de la biopelícula (STICKLER, 1999).

5.1.3. Proteínas de la superficie celular Los componentes macromoleculares de la superficie de la

bacteria parecen interactuar con los de la película de acondicionamiento (MARSHALL, 1992). Los
estudios han demostrado que las células Vibrio DW1, debido a la falta de nutrientes (pegajosas),
cuando se adhieren a metabolizar moléculas orgánicas como los ácidos grasos y las proteínas,
comienzan el crecimiento y alcanzan un tamaño normal (Figura 20), cuando, entonces, comienzan
a multiplicar. Estas células se adhieren a una posición perpendicular. La célula madre permanece
unida, mientras que la célula hija se libera, volviéndose planctónica (MARSHALL, 1992).

Otras bacterias se adhieren de manera que se colocan en el mismo plano que la superficie y se
dividen formando

Figura 20 - Ciclos repetidos de adhesión y reproducción de Marine Vibrio DW1: (a) adhesión de
una pequeña célula obstinada, (b) crecimiento celular en la superficie del sustrato, (c) duplicación
y (d) liberación.

colonias o células hijas, que pueden liberarse lentamente en el medio. Se supone que algunas
bacterias se liberan en el medio, debido a cambios en la superficie celular o en las propiedades de
la superficie (MARSHALL, 1992).

Las especies del género Streptococcus expresan un conjunto de componentes importantes de la

superficie para la adhesión celular en el huésped. Esta adhesión puede tener dos etapas: una
inicialmente reversible y la otra irreversible. Hay evidencia de que la fase reversible involucra
interacciones hidrofóbicas entre la célula huésped y el ácido lipoteicoico de la pared celular
bacteriana. Observaciones adicionales indicaron que la proteína M, una adhesina, de
Streptococcus spp. Se requiere para una adhesión irreversible. Este modelo es probablemente
análogo a lo que sucede cuando la bacteria coloniza superficies inertes. Una clase importante de
adhesina se une específicamente a los componentes de la matriz extracelular, particularmente la
fibronectina (Fn), el componente más grande de esa matriz. Algunos estudios se han centrado en
el papel de Fn en la adhesión bacteriana y han demostrado que Campylobacter jejuni expresa una
proteína de membrana externa (37 kDa) que se une a Fn (DALTON; MARCH, 1998).

Staphylococcus aureus expresa dos proteínas asociadas con la pared celular que se unen a la
fibronectina, llamadas fnbPA y fnbPB. Los mutantes de S. aureus que no tenían el gen fnbA o fnbB
no tenían una adherencia deficiente, sin embargo, el doble mutante para fnbA y fnbB era
completamente deficiente. Si uno de los dos tipos de genes se suministra a través de plásmidos, se
restaura la adhesión (DALTON; MARCH, 1998).

Los experimentos con mutantes de Pseudomonas fluorescens que mostraron una deficiencia en la
adhesión a la superficie mostraron que algunos de estos mutantes eran inmóviles, mientras que
otros no podían producir una proteína llamada ClpP, que normalmente se encuentra en la
superficie celular. El crecimiento en citrato, glutamato o medio mínimamente suplementado con
hierro, aunque no restableció la motilidad, recuperó la capacidad de la célula para iniciar la
formación de biopelículas. Se observó un fenómeno similar con los mutantes de ClpP. Se ha
propuesto que Pseudomonas fluorescens puede usar múltiples estrategias para iniciar la adhesión
y que estas dependen de las señales ambientales percibidas por los microorganismos.

.2. Estructura y condiciones ambientales de la biopelícula

La estructura de la biopelícula puede variar según la ubicación, la naturaleza de los organismos

constituyentes y la disponibilidad de nutrientes, que se presentan en capas delgadas o gruesas. Las
biopelículas de Pseudomonas aeruginosa, en las que el flujo de nutrientes era constante,
colonizaron la superficie de manera similar a la de los hongos, en los que los canales de agua
interconectaban las microcolonias, como un sistema circulatorio primitivo, distribuyendo
nutrientes y eliminando residuos de las microcolonias. (PEGATINA, 1999).

Una pregunta importante es cómo las células de Pseudomonas aeruginosa se comunican y

coordinan su supervivencia en la construcción de la biopelícula. En las bacterias Gram negativas, la
comunicación celular se puede realizar a través de lactosas de homoserina aciladas (AHL). Estas
pequeñas moléculas de señalización son excretadas por las células y se acumulan en los cultivos
debido a la densidad celular. Los AHL pueden interactuar con los receptores en la superficie de la
célula bacteriana que controlan la expresión de genes, lo que puede dar como resultado el control
de la densidad celular local. El proceso de comunicación entre las células y la coordinación de la
densidad celular se llama detección de quórum. Los experimentos con mutantes de P. aeruginosa,
incapaces de producir AHL, demostraron que producen una capa delgada de células en la
superficie del vidrio, y la adición de AHL al medio permitió la restauración de la capacidad del
mutante para producir biopelículas de tipo salvaje. También se observó que los mutantes en las
biopelículas no desarrollaron resistencia al tensioactivo biocida dodecil sulfato de sodio, que era
característico de biopelícula de tipo salvaje. Llegamos a la conclusión de que la acumulación de
AHL durante el desarrollo de la biopelícula es responsable de la transformación de las células
planctónicas individuales en células sésiles. Estas sustancias coordinan la formación de estructuras
complejas de comunidades multicelulares (STICKLER, 1999).

Ciertas proteínas tienen un papel importante en la adhesión microbiana. Las albúminas,

fibrinógeno y pepsina, por ejemplo, inhiben la adhesión de especies del género Pseudomonas al
poliestireno, mientras que la caseína favorece el proceso de adhesión. Según los estudios, la
albúmina demostró ser menos favorable a la adhesión de Listeria monocytogenes sobre sílice
(KUMAR; ANAND, 1998).

Denyer y col. (1993) sugirieron que, en la mayoría de los casos, las bacterias adheridas muestran
un aumento en la actividad metabólica, pero solo cuando son bajas en nutrientes. Otros estudios
han demostrado que el crecimiento de Escherichia coli mejoró después de la adsorción de la
superficie, pero solo cuando la concentración de nutrientes (glucosa) fue inferior a 25 mg.L-1. La
adhesión a la superficie puede ofrecer a la célula una ventaja para capturar y, o, la entrada de
nutrientes escasos en el medio. Otros autores también han confirmado un aumento en la actividad
metabólica de las bacterias asociadas a la superficie a una baja concentración de nutrientes o
incluso a una concentración cero.

El pH y la temperatura influyen en el grado de adhesión del microorganismo. Pseudomonas fragi

mostró una adhesión máxima al acero inoxidable, a un pH en el rango de 7 a 8, que son excelentes
para su metabolismo. Otros estudios han demostrado que Yersinia enterocolítica se adhiere mejor
al acero inoxidable a 21 ° C que a 35 ° C o 10 ° C, y que a 35 ° C las células observadas no tenían
flagelo, lo que sugiere que esta estructura ayuda al proceso de adhesión . En cuanto al pH, Yersinia
enterocolitica parece adherirse mejor a pH entre 8.0 y 9.5 que a pH 6.0, a temperaturas de 10 ° C,
21 ° C y 35 ° C. A pH 6.0, se observaron pocos flagelos, lo que puede haber influido negativamente
en la adherencia (HERALD; ZOTTOLA, 1988).

Los estudios de Stone y Zottola (1985) indicaron que, en la adhesión al acero inoxidable en un flujo
continuo de leche, Pseudomonas fragi produjo fimbria en 30 minutos a 25 ° C y en dos horas a 4 °
C. La adhesión de Pseudomonas aeruginosa al acero inoxidable fue mayor a un pH óptimo para el
metabolismo celular, y se supone que esta adhesión se produjo debido al transporte activo de
cationes a la superficie, aumentando su carga superficial (ZOTTOLA, 1994).

.3. Hidrofobicidad, carga eléctrica y rugosidad de la superficie

Se cree que las interacciones hidrofóbicas juegan un papel importante en la adhesión de

organismos patógenos y no patógenos a los tejidos vivos y que mecanismos similares pueden ser
responsables de la adhesión a sustratos inanimados. Las interacciones hidrofóbicas son inducidas
por moléculas de agua ubicadas en el medio de solutos no polares (DENYER et al., 1993). Las
bacterias Gram-negativas y Gram-positivas tienen una carga eléctrica negativa a pH neutro.
Aunque los mecanismos no se entienden completamente, estos factores físico-químicos juegan un
papel importante en el proceso de adhesión microbiana (HOOD; ZOTTOLA, 1995). Los
microorganismos pueden mostrar variaciones en la hidrofobicidad, debido al modo de crecimiento
bacteriano y las condiciones de cultivo. En el quimiostato, por ejemplo, cuando aumenta la tasa de
crecimiento del cultivo, disminuye la hidrofobicidad (KUMAR; ANAND, 1998).

Con respecto a la carga superficial, se puede decir que tanto las bacterias como el sustrato
adquieren una carga, que generalmente es negativa, debido a la adsorción de iones o la ionización
de grupos superficiales, y luego pueden atraer iones contrarios que están en el fase acuosa
circundante. Por lo tanto, cuando la bacteria se acerca a la superficie del sustrato, comienza a
desarrollarse el desarrollo de interacciones resultantes de la atmósfera iónica, que rodea las dos
superficies. La intensidad de esta fuerza depende del potencial de las dos superficies, de la fuerza
iónica y la constante dieléctrica del medio circundante y también depende de la distancia entre las
bacterias y el sustrato (DENYER et al., 1993).

El estudio de la adhesión de bacterias a la superficie requiere el conocimiento de las características

físicas y químicas de las dos superficies, bacterias y sustrato, y la interacción entre ellas. En
general, ambas superficies tienen una carga global negativa, y para que se produzca la adhesión, la
barrera de repulsión electrostática debe ser superada por la fuerza de atracción (DENYER et al.,
1993).

Los enlaces moleculares específicos operan solo en distancias cortas, involucrando tres enlaces:
iónico, hidrógeno y químico. Las cargas superficiales influyen en la adhesión. Los microorganismos,
así como algunas superficies biológicas en las que se adhieren, a menudo tienen un potencial zeta
negativo en condiciones fisiológicas. Las cargas negativas surgen principalmente de grupos fosfato
y carboxílicos, y pueden distribuirse uniformemente con cargas positivas de grupos amino
(BUSSCHER; WEERKAMP, 1987).

53 Adhesión y formación de biopelículas microbianas cap.01

El resultado final de la interacción entre estas fuerzas está determinado por los principios
termodinámicos. El acortamiento de la distancia entre el sustrato y las bacterias hace que las
fuerzas adhesivas comiencen a predominar, lo que se ve favorecido por la presencia de apéndices
y polímeros extracelulares (DENYER et al., 1993)

Según Characklis y Cooksey (1983), la adsorción reversible resulta principalmente de la interacción

de fuerzas a largas distancias, mientras que la adhesión irreversible generalmente se considera el
resultado de interacciones más definitivas. Estas últimas interacciones, en la mayoría de los casos,
dependen del acortamiento de la distancia entre las fuerzas físicas de atracción y están
optimizadas por la interacción de los grupos componentes de la célula receptora de unión
(DENYER et al., 1993).

La Ordenanza SVS / MS No. 326, de 30 de julio de 1997, aprueba el "Reglamento Técnico sobre
Condiciones Higiénico-Sanitarias y Buenas Prácticas de Manufactura para Establecimientos de
Producción / Industrialización de Alimentos", que define las condiciones técnicas para el uso de
materiales que componen equipos y utensilios. De acuerdo con esta Ordenanza, todos los equipos
y utensilios utilizados en lugares de manipulación de alimentos que puedan entrar en contacto con
alimentos deben estar hechos de material que: I) no libere sustancias tóxicas, olores y sabores; II)
no es absorbente y resistente a la corrosión; y III) es capaz de soportar operaciones repetidas de
limpieza y desinfección.

Las superficies deben ser lisas y libres de asperezas, grietas y otras imperfecciones que puedan
comprometer la higiene de los alimentos. No se recomienda usar madera y otros materiales que
no se puedan limpiar y desinfectar adecuadamente, a menos que esté seguro de que su uso no
será una fuente de contaminación. Se debe evitar el uso de diferentes materiales en la misma
superficie, para inhibir la aparición de corrosión por contacto (BRASIL, 1997).

Las características de las superficies ayudan a realizar un procedimiento de higiene adecuado

(HAYES, 1993). Las superficies utilizadas en industrias que entran en contacto con alimentos tienen
diferentes microtografías de superficie (rugosidad), que pueden tener grietas, microgrietas o
hendiduras lo suficientemente grandes como para albergar microorganismos, especialmente
bacterias (Figura 21). La aparición de estas imperfecciones provoca regiones de difícil acceso que
pueden reducir la eficiencia de los procedimientos de higiene, favoreciendo el crecimiento
microbiano y el desarrollo de microorganismos (BOWER et al., 1996). La rugosidad de los
materiales también influye en la formación de la biopelícula (TAYLOR; HOLAH, 1996), pero parece
ser menos importante en relación con la adhesión inicial (BOULANGE-PETERMANN et al., 1998).
Este hecho puede estar relacionado con la superficie de contacto entre microorganismos y
superficies que procesan los alimentos. En general, cuanto mayor es la superficie de contacto,
mayor es la probabilidad de formación de biopelícula, ya que mayor es la fuerza de adhesión
inicial. Sin embargo, no siempre cuanto mayor es la aspereza, mayor es la adhesión inicial. La
influencia de la rugosidad de la superficie en el proceso.

de la formación de biopelículas está relacionado con dificultades durante la limpieza de superficies

rugosas. El equipo de procesamiento de alimentos es una fuente potencial de microorganismos
patógenos (MIDELET; CARPENTIER, 2004). Haeghebaert y col. (2002) mostraron que la
contaminación de los equipos contribuyó con el 59% de los brotes de enfermedades transmitidas
por alimentos investigados en Francia durante 2001. En consecuencia, es importante mejorar el
conocimiento de los factores involucrados en la transferencia de microorganismos del equipo a los
alimentos, especialmente durante el contacto.

Figura 21 - Adesão microbiana: tamanho do microrganismo x rugosidade.

Se analizan algunos parámetros en el análisis de rugosidad, siendo el más importante: (i) Ra, la
media aritmética del valor absoluto de las distancias desde la línea media hasta el perfil R dentro
de la latitud de la muestra. La unidad de este parámetro es el micrómetro; (ii) Rq, el valor medio
de la raíz cuadrada de las desviaciones del perfil de la línea media, dentro de la longitud de la
muestra. Este parámetro tiene significación estadística, la desviación estándar de las alturas de
perfil, se considera más sensible que Ra; (iii) Rz es el valor absoluto de los cinco picos más altos
más el valor promedio absoluto de los cinco valles más profundos, dentro de la latitud de la
muestra. También presenta la unidad en micrómetros (OLIVEIRA, 2006).

Figura 21 - Adhesión microbiana: tamaño del microorganismo x rugosidad.

55 Adhesión y formación de biopelículas microbianas cap.01

.4. Formación de exopolisacárido

La matriz extracelular tiene un alto contenido de sustancias poliméricas extracelulares que varían
del 50% al 90%. La terminología para el material extracelular asociado con agregados celulares o
biopelículas varía de acuerdo con la literatura, y se conoce como limosidad, cápsula, glicocalix,
sustancia polimérica extracelular y sustancias de cementación extracelular (Figura 22).

La última etapa de la adhesión celular a la superficie, llamada adhesión irreversible, involucra

interacciones específicas y está asociada con la producción de exopolisacáridos (Tabla 8). Hace
unos 40 años, se demostró la participación de los polisacáridos ácidos en la adhesión bacteriana
(DENYER et al., 1993). Los azúcares como glucosa, galactosa, manosa, fructosa, ramnosa, N-
acetilglucosamina, ácido glucurónico, ácido galacturónico y ácido gulurónico son componentes
típicos del polisacárido bacteriano (DENYER et al., 1993).

Según la investigación, varios polisacáridos y fosfolípidos se acumulan más tarde en la fase

estacionaria, cuando la célula está bajo estrés fisiológico. Los investigadores han observado la
producción de diferentes polisacáridos durante el crecimiento exponencial y la fase estacionaria.
Los investigadores indujeron la inanición de células en crecimiento exponencial, señalando que se
liberó un polisacárido viscoso y soluble, mientras que las células que crecían no producían el
mismo polisacárido. Parece, por lo tanto, que el hambre produce diferentes polímeros (DENYER et
al., 1993). Figura 22 - Etapas de formación de biopelículas observadas por microscopía electrónica
de barrido (Fuente: ZOLTAI et al, 1981; HERALD; ZOTTOLA, 1988).
Tabela - Informações sobre substâncias poliméricas extracelulares participantes de processo de
adesão

Algunos investigadores han observado una menor producción de polisacáridos por bacterias en
situación de inanición que en cultivos en crecimiento. Cuando el medio de crecimiento es rico, la
bacteria puede producir polímeros a una velocidad alta, pero liberándolos como limo y no
reteniéndolos como una cápsula. Los anticuerpos producidos en cultivos líquidos reaccionaron con
la matriz de biopelícula in situ, lo que indica que la sustancia polimérica extracelular en la
biopelícula contiene algunos polímeros similares a los producidos en el líquido de cultivo por los
organismos. En un estudio se demostró que el mismo microorganismo produce más sustancias
poliméricas extracelulares en la biopelícula que en la suspensión en cultivo (DENYER et al., 1993).

Las sustancias poliméricas extracelulares influyen en las propiedades físicas de la biopelícula,

incluidas la difusividad, la conductividad térmica y las propiedades reológicas. Debido a la
densidad de carga y al estado iónico del exopolisacárido, se puede formar una barrera a la
difusión, haciéndolo actuar como un tamiz molecular. Debido a la naturaleza altamente hidratada
y predominantemente polianiónica del exopolisacárido, también pueden actuar como una matriz
de intercambio iónico, contribuyendo al aumento de la concentración local de sustancias iónicas,
como metales pesados, amoníaco y potasio, entre otros, que tienen el efecto contrario a los de
grupos aniónicos Esto puede no tener efecto sobre los nutrientes cargados, incluidos los azúcares,
sin embargo, puede servir como una trampa para los nutrientes catiónicos como las aminas,
especialmente en condiciones oligotróficas (COSTERTON, 1981). La penetración de moléculas
cargadas, como algunos biocidas, puede reducirse parcialmente por este fenómeno.

Tabla - Información sobre sustancias poliméricas extracelulares que participan en el proceso de

adhesión.

57 Adhesión y formación de biopelículas microbianas cap.01

Algunos polímeros que forman la biopelícula pueden reducir en gran medida la sensibilidad del
microorganismo a una variedad de antibióticos; sin embargo, Nichols et al. (1989) sugieren que
solo la adsorción y la disminución de la difusión causada por el exopolisacárido solo no pueden
explicar la resistencia de la bacteria a los antibióticos. Se necesita más trabajo para comprender la
disminución de la sensibilidad a los antibióticos por parte de las células en las biopelículas.
Characklis y col. (1981) informaron que la conductividad térmica de una biopelícula en cultivo
mixto es similar a la del agua y, por lo tanto, concluyeron que la biopelícula proporciona
aproximadamente 27 veces más resistencia a la transferencia de calor que el acero inoxidable de
igual espesor. De esta manera, una biopelícula muy delgada puede restringir la transferencia de
calor a través de un tubo de acero inoxidable (DENYER et al., 1993).

Assanta y col. (1998), al investigar la adhesión de Aeromonas hydrophila en un sistema de

distribución de agua, observaron que el microorganismo se adhirió fácilmente a todo tipo de
superficies evaluadas, es decir, acero inoxidable, cobre y polibutileno, después de un tiempo de
exposición tan corto como 1-4 horas, a temperaturas de 4 ° C y 20 ° C. El polibutileno, con una
energía superficial de 42,2 mJ.m-2, estaba más colonizado que el acero inoxidable, con 65,7 mJ.m-
2 de energía de activación. Se observaron pocas células adheridas en una superficie de cobre, a
pesar de su baja energía superficial de 45.8 mJ.m-2. Según estos autores, esto puede deberse a un
efecto antimicrobiano del ion cobre, que afecta la capacidad de las bacterias de adherirse y
multiplicarse en esa superficie.

El contacto directo entre bacterias y sustrato puede establecerse, a nivel molecular, por sustancias
poliméricas extracelulares producidas por bacterias. Debido a que estas sustancias no están
sujetas al mismo tipo de repulsión que las bacterias, las uniones entre las bacterias y la superficie
pueden establecerse mediante diversas combinaciones de enlaces químicos, como las
interacciones electrostática, covalente e hidrógeno, dipolo-dipolo, dipolo. -Dipole inducida, ion-
dipolo e interacciones hidrofóbicas; en consecuencia, el mismo tipo de bacteria puede adherirse
en diferentes grados (MARSHALL, 1992).

La cápsula de muchas bacterias está compuesta de polisacáridos, aunque algunas especies del
género Bacillus pueden formar una cápsula polipeptídica. La presencia de una cápsula puede
aumentar la adhesión microbiana y actuar como defensa contra la fagocitosis. Este material
también puede facilitar la adsorción de agentes tóxicos, evitando así su penetración en el
citoplasma (BOWER et al., 1996).

Después del contacto inicial con la superficie, los microorganismos comienzan la producción de
fibras finas, que se pueden ver por microscopía electrónica. Estas fibras

se vuelven más gruesas con el tiempo, lo que conduce a la formación de la matriz de biopelícula, y
dentro de esa matriz, pueden existir otras sustancias orgánicas, inorgánicas y material en
partículas junto con microorganismos. La producción de exopolisacáridos aumenta con la adhesión
de las bacterias a la superficie y, si las células de biopelícula se reinoculan en el medio, con En las
células planctónicas, habrá menos producción de exopolisacáridos (KUMAR; ANAND, 1998).

De acuerdo con Costerton et al. (1978), el glicocalix integra la membrana externa de los
gramnegativos y el péptidooglicano de las células grampositivas, y está compuesto por varias
fibras de polisacárido o proteínas globulares; En su estado hidratado, contiene entre 98% - 99% de
agua. Pseudomonas aeruginosa forma alginato como el componente principal del glicocalix y es
importante para el desarrollo de biopelículas con una sola especie. Los exopolisacáridos
producidos por microorganismos tienen un papel importante, que es proteger a la célula de la
deshidratación, ya que puede retener agua en varias veces su masa y deshidratarse lentamente.
En Pseudomonas aeruginosa, la presencia de ácido urónico acetilado en el alginato bacteriano
aumenta la capacidad de hidratación.

. Composición de biopelículas microbianas

Los porcentajes de componentes orgánicos e inorgánicos en la biopelícula se pueden determinar
por combustión (Tabla 9). Los sólidos volátiles y fijos reflejan la fracción orgánica e inorgánica,
respectivamente. La fracción volátil de una población microbiana planctónica es mayor del 90% y
para las biopelículas este valor es considerablemente menor, ya que existe una masa de
constituyentes inorgánicos atrapados o precipitados dentro de la matriz de la biopelícula. Sin
embargo, en experimentos de laboratorio, en los que predominan los componentes bióticos, la
fracción volátil de la biopelícula puede alcanzar el 80% de su peso seco. La relación carbono /
nitrógeno es aproximadamente cinco veces mayor en algunas biopelículas que en las células
microbianas, probablemente debido a la gran cantidad de polímeros extracelulares que
generalmente tienen una pequeña cantidad de nitrógeno (DENYER et al., 1993).

La fracción inorgánica es mayor en las biopelículas que se encuentran en los ecosistemas acuáticos
naturales, donde la arcilla, la arena y los sedimentos penetran en la matriz, lo que influye en sus
propiedades físicas (DENYER et al., 1993).

La presencia de la biopelícula puede favorecer la corrosión del metal, principalmente la causada

por la aireación diferencial que sufren las células debido a la distribución irregular de la biopelícula
o, aún, por la formación de sitios anaeróbicos en la base, debido a la respiración microbiana. Esto
ofrece condiciones favorables para el crecimiento de bacterias reductoras de sulfato que usan
hidrógeno, generado en un ambiente anaeróbico por la combinación de protones y electrones,
que a su vez aumentan la corrosión del metal. Las bacterias reductoras de sulfato también
producen metabolitos corrosivos, como los sulfitos, que conducen a la incorporación de productos
de corrosión, como el sulfito de hierro en la matriz de biopelículas (DENYER et al., 1993).