Aislamiento e Identificación de Clostridium

botulinum Productora de Toxina

I. Introducción:

Clostridium botulinum es una bacteria Gram positiva, anaerobia, que se encuentra

por lo general en la tierra y es productora de la toxina botulínica, el agente causal del
botulismo. Estos microorganismos que tienen forma de varillas y se desarrollan mejor
en condiciones de poco oxígeno. Las bacterias forman esporas que les permiten
sobrevivir en un estado latente hasta ser expuestas a condiciones que puedan sostener su
crecimiento. La espora es ovalada subterminal y deformante. Es móvil por flagelos
peritricos, no produce cápsula y es proteolíco y lipolítico. Son miembros del género
Clostridium, uno de los grupos más numerosos entre las formas Gram positivas. C.
botulinum fue descubierto y aislada en 1896 por Emile van Ermengem.
Hay siete tipos de toxinas botulínicas designadas por las letras A hasta la G; sólo los
tipos A, B, E y F pueden causar enfermedad (botulismo) en los seres humanos. Esta
enfermedad es muy común en muchas partes del planeta.
Las esporas de C. botulinum pueden sobrevivir en la mayoría de los ambientes y son
difíciles de matar. Pueden sobrevivir temperaturas de ebullición del agua a nivel del
mar, de modo que muchos enlatados son hervidos a altas presiones para obtener una
mayor temperatura, suficiente para destruir las esporas.
El botulismo es una enfermedad de declaración obligatoria. Puede aparecer en
cualquier alimento de origen animal y vegetal. En carnes y alimentos proteicos de baja
acidez provoca, a veces, gas y olor desagradable. Con los ahumados y las especias se
puede enmascarar el buen olor por el olor propio de dichos alimentos.
El crecimiento de la bacteria puede ser prevenida con acidez, una alta concentración
de azúcar disuelto, altos niveles de oxígeno o poca humedad. Por ejemplo, en baja
acidez, vegetales enlatados como las judías verdes que no hayan sido calentadas lo
suficiente para destruir las esporas, puede proveer un medio libre de oxígeno que le
permita a las esporas crecer y producir la toxina. Por otro lado, los tomates que sean
suficientemente ácidas para prevenir crecimientos, aún si las esporas estuviesen
presentes, no presentan peligros para los consumidores. La miel, el jarabe de maíz y
otros aditivos dulces pueden contener las esporas de C. botulinum, pero las esporas no
pueden crecer en soluciones con tan altas concentraciones de azúcares; sin embargo,
cuando el dulce es diluido en el ambiente de bajo oxígeno y baja concentración del jugo
gástrico de un infante, las esporas pueden desarrollarse y producir la toxina. Tan pronto
como los recién nacidos comienzen a consumir alimentos sólidos, el ácido gástrico se
vuelve suficiente para permitir el crecimiento de la bacteria. En neonatos, la enfermedad
puede ser secundaria a la colonización del colon por Clostridium botulinum.
La toxina es ingerida junto con los alimentos, son absorbidas a nivel duodenal y
actúan a nivel de las vesículas sinápticas colinérgicas impidiendo la liberación de
acetilcolina. Como resultado de esta acción el paciente desarrolla parálisis fláccida,
pudiendo morir por parálisis respiratoria.

II. Objetivos:

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- Determinar la presencia de la toxina botulínica en muestras de conservas de
pescado alterados.
- Aislar de muestras diversas a C. botulinicum.
III. Materiales:

- Medios de cultivo: - Tubos de dilución con tapa rosca

- Muestra: Latas de atún - Mechero bunsen
abombadas, chancadas o - Pipetas
abolladas - Frascos estériles
- Ratones de Laboratorio - Gradillas
- Triturador mecánico - Centrifuga
- Baño María - Agujas hipodérmicas

IV. Procedimiento:

- Prueba exploratoria de presencia de la toxina:

o Triturar u homogenizar el alimento (muestra).
o Poner en el tubo de dilución con tapa rosca muestra a igual al peso de la
solución salina a utilizar (dilución 1/1).
o Centrifugar el homogenizado a alta velocidad, preferentemente en
centrífuga refrigerada (se tendrán dos tubos, o sea, dos muestras).
o Cogemos uno de los tubos centrifugados y lo sometemos a baño María
por 10 min. (agua hervida).
o Del contenido, inyectamos 0.5 mL al ratón de prueba, esto con aguja de
tuberculina (Nº 25), vía intraperitoneal.
o Del otro tubo centrifugado (al que no se le calienta), se le inyectará (a
otro ratón de prueba), la misma cantidad de inóculo y por la misma vía.
o Se recomienda que antes de inyectarle el sobrenadante sospechoso a los
ratones se le debe inocular la antitoxina (en este caso, por carecer de ella,
no se hizo).
o Observar por los sgtes. 4 días.
o La positividad de la prueba se comprueba por la parálisis motora
progresiva, esto es, abdomen contraído, respiración dificultosa, arrastre
de las patas, debilidad en aumento.
o La presencia de la Toxina E causa una muerte mucho más rápida (en
menos de 24 h.).

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- Aislamiento (en alimentos):
o Para el aislamiento usamos medios enriquecidos como el de carne cocida
(medio Roberson) o el medio tripticasa-glucosa (ATG).
o En tubos de dilución con tapa rosca colocamos 10 mL del medio a usar
(este estará previamente calentado, por lo tanto semilíquido).
o Previamente en cada tubo hemos agregado un poco de la muestra y luego
agregamos en cada tubo el ATG semilíquido calentado previamente.
o Luego sometemos los tres tubos a temperaturas diferentes:
 El primer tubo no se calienta.
 El segundo tubo lo calentamos en baño María a 60 ºC por 10 min.
 El tercer tubo lo calentamos a 80 ºC por 30 min.
o Luego, incubamos los tubos por tres a 4 días en Jarra de Brewer
(anaerobiosis).
o Se podrá observar (si la muestra es positiva) la presencia de gas y
resquebrajamiento del medio.

V. Resultados:

- En la Prueba Exploratoria de presencia de la Toxina, se inoculó al ratón albino la

dosis indicada del sobrenadante sin calentar, se esperó la acción de ésta hasta el
4º día, pero no obtuvimos resultados, el ratón albino no murió, por lo que
podemos concluir que la muestra utilizada (conserva de atún) no presenta la
toxina botulínica y lo más probable es que tampoco esté presente el propio C.
botulinum.

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- En lo que respecta al aislamiento de C. botulinum, no se pudo llegar a aislar de
la muestra de alimento utilizada (conserva de atún), aunque en algunos tubos se
puedo observar una pequeña presencia de gas.

Pequeña
presencia
de gas

- En el grupo de la otra mesa, la muestra tratada (conserva de atún) mostró

resultados positivos, como presencia de gas de gas y resquebrajamiento del
medio.

Gran
presencia
de gas

- Pruebas bioquímicas se usa para identificar a C. botulinum

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 o Para identificar C. botulinum se realizarán las sgtes. Pruebas
bioquímicas:
 Utilización de carbohidratos: glucosa, sacarosa, lactosa, manosa,
ribosa, arabinosa, adonitol, xilosa, trealosa, manitol.
 Producción de lipasas y lecitinazas.
 Indol.
 Hidrólisis de la gelatina.

VI. Referencias:

- Wikipedia, La Enciclopedia Libre (2008) Clostridium botulinum. Obtenido el 15

de marzo de 2008 en http://es.wikipedia.org/wiki/Clostridium_botulinum
- Apuntes sobre bacteriología (2003) Clostridium perfringens y Clostridium
botulinum. Obtenido el 15 de marzo de 2008 en
http://www.bvsops.org.uy/pdf/clostridium.pdf
- BARILOCHE, E. 2002. Aislamiento y caracterización de cepas de Clostridium
botulinum tipos C y D en el Brasil. Publicado en Revista de Med. Vet., Vol
83(2): 55-58 pp. Obtenido el 15 de marzo de 2008 en
http://www.inta.gov.ar/bariloche/info/documentos/animal/salud/ct-417.pdf