UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MACHALA

UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

CARRERA DE INGENIERÍA ACUÍCOLA

CUARTO SEMESTRE

BIOLOGÍA MOLECULAR

GRUPO Nº3

TEMA:

HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU: TÉCNICAS

PROFESOR:

DR. NIRCHIO MAURO, PHD.

CARRERA:

INGENIERÍA ACUÍCOLA

CICLO:

CUARTO

PARALELO:

“A”

MACHALA- ECUADOR

2018
Alumnos

 Moreno Cabezas Sucre Damian.

 Neira Cueva Julissa Katherine.
 Pacheco Figueroa Gabriela Esthefania.
 Prieto Sarango Jefferson David.
 Pulgarin Bustamante Anthony.
 Quijije Frías Jereny Quijije.
 Rueda Pardo Nathalie Geanella.
 Ruiz Peralta Daniela Maria.
 Sanmartin Campoverde Kerly Lisbeth.
 Segovia Campuzano David Joselo.
 Tituana Vera James Alberto.
 Valarezo Miñan Ayrton Rual.
 Valle Perez Francisco Mauricio.
 Vasquez Sanchez Nicole Tatiana.
 Índice

Contenido
Índice ............................................................................................................................................ 3
Hibridación .................................................................................................................................. 4
Fase de prehibridación................................................................................................................ 4
Lavado de poshibridación. ......................................................................................................... 4
Técnica de hibridación ................................................................................................................ 5
Hibridación in situ con fluorescencia ........................................................................................ 5
¿Cómo funciona la HFIS? .......................................................................................................... 5
HFIS en metafase ........................................................................................................................ 6
HFIS en interfase......................................................................................................................... 7
HFIS en hebra ............................................................................................................................. 7
HFIS inverso ................................................................................................................................ 7
HFIS on a chip ............................................................................................................................. 7
HFIS multicolor ........................................................................................................................... 8
Tipos de sondas HFIS ................................................................................................................. 8
Conclusión.................................................................................................................................... 9
Bibliografía .................................................................................................................................. 9
Hibridación

Es un proceso de construcción artificial de ácidos nucleicos bicentenarios, en el que las

dos cadenas complementarias que se unen proceden de moléculas diferentes y que pueden
ser dos cadenas de ADN, dos cadenas de ARN o cadena de ADN y la otra de ARN.
En biología molecular, el fenómeno de la hibridación se utiliza para detectar secuencias
concretas de ácidos nucleicos mediante el empleo de fragmentos complementarios o
sondas que se marcan para poder ser visualizados.

Fase de hibridación

Todas las técnicas se pueden dividir en cuatro fases genéricas

1. Preparación de la muestra y soporte (prehibridación).

2. Hibridación.
3. Lavado de poshibridación.
4. Detección de hibrido.

Fase de prehibridación

Se puede desarrollar en múltiples pasos, que incluyen digestión enzimática,

electroforesis, transferencias, bloqueos de uniones inespecíficas, etc.

Lavado de poshibridación.

El objetivo es mantener los híbridos sonda/secuencia diana y eliminar los híbridos

imperfectos con secuencias parecidas a la diana. Por lo tanto, de esta fase depende en gran
medida la especificidad de la técnica.
El lavado se realiza con un tampón en el que se fijan las llamadas condiciones de
rigurosidad combinando temperatura de lavado, fuerza ionica y concentración de
formamida.
Técnica de hibridación

Hibridación in situ con fluorescencia

En esta técnica se produce la hibridación de fragmentos de ADN con sondas marcadas

con fluorocromos. Se observa el resultado de la hibridación con el microscopio de
fluorescencia.

La técnica HFIS se puede utilizar tanto sobre tejido o cultivo celular como sobre
cromosomas. Las sondas más utilizadas son las sondas Centroamérica, las sondas para
todo el cromosoma y las sondas de secuencia única que se unen a un locus específico
posición fija en un cromosoma. Además, esta técnica se la puede aplicar sobre células
con núcleos en metafase e interfase de extensiones celular tejidos, cromosomas, biopsias,
etc.

Ilustración 1:Hibridación in situ con fluorescencia.

¿Cómo funciona la HFIS?

La HFIS es útil, por ejemplo, para ayudar a un investigador a identificar dónde se

encuentra un gen específico dentro de los cromosomas de un individuo. El primer paso
es preparar secuencias cortas de ADN monocatenario (de una sola hebra) que
correspondan a una parte del gen que esté buscando el investigador. Estas secuencias se
conocen como sondas. El siguiente paso es marcar estas sondas con uno de varios colores
de tinte fluorescente.
El ADN está compuesto de dos hebras de moléculas complementarias que se unen entre
sí como imanes químicos. Debido a que las sondas de los investigadores consisten en una
sola hebra, éstas pueden unirse a la hebra complementaria del ADN, donde quiera que se
encuentre en los cromosomas de una persona. Cuando una sonda se une a un cromosoma,
su marcador fluorescente ofrece una manera para que los investigadores puedan ver su
ubicación.

Los cromosomas que son usualmente analizados por HFIS son los 13, 18, 21, X e Y, que
son los más propensos a sufrir anomalías. HFIS usa segmentos de una única hebra de
ADN que son tintados, o etiquetados, con una sustancia fluorescente que puede ligarse a
un cromosoma específico; estos segmentos de ADN son llamados sondas. En un principio
se empleaban sondas de carácter radiactivo, pero este tipo de marcaje fue reemplazado
por los fluoróforos por mayor seguridad, eficacia y facilidad de detección.

La técnica HFIS puede realizarse a los cromosomas en metafase o en interfase.

HFIS en metafase

Cuando las células están en metafase, sus cromosomas se encuentran condensados a

modo de preparación para la división celular. Este tipo de HFIS se utiliza para detectar
microdeleciones específicas, translocaciones o para identificar material adicional
desconocido. Los tipos de sondas usadas son:

 Los cósmidos: son secuencias únicas que hibridan con fragmentos pequeños. Se
emplean en estudios de microdeleciones.
 Las sondas satélites: están formadas por secuencias altamente repetidas que se
encuentran cerca de lo centrómeros. En la mayoría de los casos son específicas de
cada cromosoma. Se usan para determinar aneuploidias o para identificar el origen
de cromosomas marcadores.
 Las sondas completas: marcan el cromosoma por completo mediante la suma de
las sondas que hibridan distintas zonas del cromosoma. Se usan para ver
translocaciones.
HFIS en interfase

No siempre es posible tener núcleos fijados en metafase para realizar el HFIS, y los
resultados obtenidos no serán tan específicos. Sin embargo, el HFIS en interfase tiene la
ventaja de que no es necesario cultivar previamente las células durante diversos días antes
de poder analizar sus cromosomas. Además, cuando las células se encuentran en interfase,
la cromatina está en torno a 10 000 veces más descondensada que en metafase, lo cual
permite una mayor resolución a la hora de detectar anomalías pequeñas.

HFIS en hebra

Este tipo de HFIS se aplica sobre hebras de ADN desproteinizadas (es decir, desprovistas
de las histonas encargadas de su compactación). Se extiende linealmente y de forma
mecánica en una pórta el fragmento de cromosoma a estudiar. Se observarán puntos
discontinuos por rotura de la hebra de ADN. La técnica puede ser usada para detectar
deleciones en clones y para estimar huecos en los proyectos genoma.

HFIS inverso

Es una técnica que se usa mucho para determinar la procedencia de un cromosoma

marcador. Este tipo de HFIS tiene la peculiaridad de ser el ADN problema el que se
marca. El procedimiento consiste en recortar un fragmento de cromosoma o dicho
cromosoma marcador de un porta donde se encuentran todos los cromosomas fijados. Se
encuentran teñidos con Giemsa o con una sonda, esto sirve para marcar ese ADN y
convertirlo en una nueva sonda. Una vez identificado, el cromosoma marcador pasaría a
ser llamado un cromosoma derivativo.

HFIS on a chip

Esta nueva técnica conlleva numerosas ventajas, como la necesidad de utilizar menor
cantidad de reactivos, el empleo de un menor número tiempo de análisis (ya que en menos
de una hora se pueden analizar los núcleos, frente a las 2-3 horas que precisa el
procedimiento de HFIS convencional), su rapidez para la obtención de resultados, su alta
sensibilidad o su menor coste, con comparación con la técnica convencional de HFIS.
HFIS multicolor

Es una adaptación que permite la visualización de los 23 pares de cromosomas a la vez,

teñidos con diferentes sondas fluorescentes.

A nivel comercial sólo hay 5 colores distintos posibles, por lo que se puede usar la sonda
de un color concreto o combinar dos tipos de sondas para crear un nuevo color. El sistema
de detección del equipo empleado debe estar adaptado a los 5 colores. Inicialmente se
pensaba que iba a reemplazar al cariotipo tradicional, pero presenta desventajas como su
elevado costo y una menor definición que el HFIS convencional. Sólo se pueden ver
cromosomas y traslocaciones grandes, sin poder observar bandas.

Tipos de sondas HFIS

Los científicos utilizan tres tipos diferentes de sondas de HFIS, cada una de las cuales
tiene una aplicación diferente:

Las sondas de locus específicos: se unen a una región específica de un cromosoma. Este
tipo de sonda es útil cuando los científicos han aislado una pequeña parte de un gen y
quieren determinar en qué cromosoma se encuentra el gen.

Las sondas centroméricas de repetición: son generadas a partir de secuencias

repetitivas encontradas a la mitad de cada cromosoma. Los investigadores usan estas
sondas para determinar si un individuo tiene o no el número correcto de cromosomas.

Las sondas de cromosomas enteros: son colecciones de sondas más pequeñas, cada una
de las cuales se une a una secuencia diferente a lo largo de un cromosoma específico. Al
usar múltiples sondas marcadas con una mezcla de distintos tintes fluorescentes, los
científicos pueden marcar cada cromosoma con su propio color único. El mapa resultante
del cromosoma a todo color se conoce como un cariotipado espectral. Las ondas de
cromosomas enteros son especialmente útiles para examinar anomalías cromosómicas,
por ejemplo, cuando un segmento de un cromosoma está unido al final de otro
cromosoma.
Conclusión

La hibridación fluorescente in situ (HFIS) brinda a los investigadores una manera de

visualizar y mapear el material genético en las células de un individuo, incluidos genes
específicos o partes de los genes. Esto es importante para entender una variedad de
anomalías cromosómicas y otras mutaciones genéticas. Esta técnica permite la rápida
determinación de aneuploidías, microdeleciones, duplicaciones, inversiones, así como la
adjudicación de un marcador genético a un cromosoma.

Bibliografía
Gomez Aguado, F., Lorenzo Luque, I., Simon , F., & Hernández Giménez, B. (2015).
Biologia molecular y citogenética . España: Sagrafic S.L.
Mota Caparros, M., Cuenca Pardo, J., & Sipán Sarrión , C. (2016). Biología molecular y
citogenética. España: Graficas Summa.
National Human Genome Research Institute. (2015). Hibridación fluorescente in situ
(HFIS). National Human Genome Research Institute, 4-16.