Por una cultura

de la vida, su
calidad y su
sentido

Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido

 Triatoma pallidipennis
Trypanosoma cruzi
Tesista: María Alejandra Lozano Barreto

Director: Ms. Ciencias Biológicas Fredy Palacino Rodríguez

Co-directora: Dra. Ciencias Biomédicas Ana Erika Gutiérrez

Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido

 Chagas

Tumblr.com
Dengue
80 %
Freepick.com

(Álvarez,2018).
Cerca de un millón de especies descritas
(Zhang, 2013 & Chapman, 2009).
Tumblr.com Malaria Membrana perimicrovil iar (PMM)
Epitelio intestinal
Matriz Peritrófica (PM) MM
Epitelio intestinal PMM
MM
PM
Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido
Microscopía electrónica de Trasmisión Microscopía electrónica de barrido

(Gutiérrez, et. al., 2014).

(Gutiérrez, et. al., 2014).

Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido
 Infecta Vector
Mamíferos Triatominae

Amastigotes Epimastigotes Tripomastigotes

Tripomastigotes sanguíneo
Tripomastigotes metacíclico

Otros tipos de trasmisión Epimastigotes

• Transfusiones de sangre
• Trasplante de órganos
• Consumo de alimentos contaminados con
Amastigotes
heces de insectos infectados Freepick.com
• Exposición accidental en el laboratorio
Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido
 Epimastigotes

Triatoma pallidipennis
Reino: Animalia
Phylum: Arthropoda
Subphylum: Hexapoda
(Azambuja et. al., 2006).
Clase: Insecta
Orden: Hemiptera
Trypanosoma cruzi
Familia: Reduviidae Reino: Protista
Subfamilia: Triatominae Phylum: Sarcomastigophora
Género: Triatoma Subphylum: Mastigophora
Especie: Triatoma pallidipennis Clase: Zoomastigophora
Orden: Kinetoplastidia
Familia: Tripanosomatidae
Género: Trypanosoma
Especie: Trypanosoma cruzi

(Álvarez,2018).
Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido
 Identificar las moléculas de la membrana perimicrovil iar que
interactúan con los epimastigotes de Trypanosoma cruzi.

 Seleccionar anticuerpos monoclonales que reconozcan la PMM. (Álvarez,2018).

 Aislar proteínas de superficie de la forma epimastigotes T. cruzi

 Determinar la interacción de moléculas de epimastigotes y la PMM de
Triatoma pallidipennis.
Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido
1

Electroforesis Trasferencia a MNC Western blot

SDS-PAGE 1D
En una cámara de
trasferencia 1 hora a 100 V Quimioluminiscencia y/o fosfatasa alcalina
Coomassie y/o plata

Tumbl
Por una cultura de r.com su calidad y su sentido
la vida,
 1 Hacer gel de 2 Preparar muestra 3 Cargar y correr muestras
poliacrilamida al 10% • Cargar marcador de peso
• Buffer de carga 4X molecular
• Inhibidores de • Cargar muestras
proteasas • Llenar con Buffer de corrida 1X
• Calentar en baño
serológico a 100°C Conectar a fuente de
Gel separador Gel concentrador
Centrifugar 2min a 13000rpm poder 1 hora a 150V
• Tris Base 1,5 M • Tris Base 0.,5 M
• Acrilamida- • Acrilamida-
Bisacrilamida 30% Bisacrilamida 30%
• SDS 10% • SDS 10% 4 Obtención de bandas proteicas 5 Tinción con coomassie y/o plata
• APS 10% • APS 10%
• Agua Mil iQ • Agua Mil iQ
• TEMED
• TEMED

Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido

1 Se utilizó la membrana de nitrocelulosa Anticuerpo primario 3

con las proteínas trasferidas  Medios de cultivo

Directo Muestras
de hibridomas

Anticuerpo secundario 4

 Anti mouse HRP

Indirecto Quimioluminiscencia

2
Se bloqueó con PBS Tween  Anti mouse AP
(0,05%) leche (0,5%) y se usó Fosfatasa alcalina
un ELISA indirecto
Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido
 2

Disección del tracto Obtención del Inclusión en una

digestivo intestino Cortes con
resina LR White ultramicrotomo Bloquean con
BSA 2%

Montaje en Incubar
glicerol 30% con Incubar anticuerpo anticuerpo
Observar en microscopio DAPI secundario 1 hora a T°a en primario 2 horas
de fluorescencia oscuridad (Alexa 488) a T°a (Sueros)
Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido
Seleccionar anticuerpos monoclonales que reconozcan la PMM

Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido

 KDa

200
Estomago

2
Intestino

1
PMM

1
Perfil proteico del tracto digestivo de Triatoma pallidipennis
180 2 2 1
KDa Estomago Intestino PMM
130 0 0 0
100 0 0 0 200 2 1 1
95 2 1 2 180 2 2 1
80
72
1
2
1
0
2
0
20µg de proteína cada muestra 130 0 0 0
100 0 0 0
60
55
1
2
1
0
1
0
Gel al 10% 95
80
2
1
1
1
2
2
50 3 2 3 72 2 0 0
45 3 3 3
Tinción con: Coomassie coloidal 60 1 1 1
43 0 0 0 55 2 0 0
42 0 0 0 50 3 2 3
34 0 0 0 45 3 3 3
32 3 1 2 43 0 0 0
28 1 1 1 Intensidad Valor 42 0 0 0
26 1 1 1 No hay 0 34 0 0 0
23 0 0 0 Tenue 1 32 3 1 2
19 0 0 1 Fuerte 2 28 1 1 1 Inte
17 2 2 2 Muy fuerte 3 26 1 1 1 N
23 0 0 0 T
19 0 0 1 F
17 2 2 2 Mu
Figura 1. Electroforesis SDS-PAGE de muestras de tracto digestivo de Triatoma pallidipennis. Tabla 1. Peso molecular de muestras de tracto digestivo de Triatoma
Perfil proteico resuelto en gel de acrilamida al 10% para muestras de estómago, intestino y pallidipennis. Intensidad y peso molecular en kDa de las proteínas de
PMM de Triatoma pallidipennis, teñido con azul de Coomassie coloidal. (20ug muestras de estómago, intestino y PMM de Triatoma pallidipennis..
Porpor
unacarril).
cultura de la vida, su calidad y su sentido
 KDa Estomago Intestino PMM Perfil proteico de la PMM
200 2 1 1
PMM con azul 7µg de PMM
180 2 2 1 KDa
20µg de PMM de coomassie con plata
130 0 0 0
200 1 0
100 0 0 0 Gel al 10% 180 0 0
95 2 1 2
Tinción con: Coomassie 130 1 1
80 1 1 2 100 0 0
72 2 0 0 95 1 2
60 1 1 1 80 1 1
55 2 0 0 7µg 5µg de PMM 72 0 1
50 3 2 3 Gel al 10% 60 1 1
45 3 3 3
Tinción con: Plata 55 2 2
43 0 0 0 50 0 0
42 0 0 0 Tiempo de revelado: 7min
45 2 3
34 0 0 0 43 0 0
32 3 1 2 42 0 0
28 1 1 1 Intensidad Valor 34 0 2
26 1 1 1 No hay 0 32 0 0
23 0 0 0 Tenue 1 28 0 2
19 0 0 1 Fuerte 2 26 0 0
17 2 2 2 Muy fuerte 3 23 0 0
19 0 0
Figura 2. Electroforesis SDS-PAGE de muestras de PMM de T. 17 1 1
pallidipennis. Perfil proteico resuelto en gel de acrilamida al 10% para Tabla 2. Peso molecular de muestras de PMM de Triatoma pallidipennis. Intensidad y peso molecular en
muestra de PMM de T. pallidipennis, teñido con azul de coomassie (A) y kDa de las proteínas de muestras de PMM de Triatoma pallidipennis, teñidas con coomassie blue y con
con tinción de plata (B) cargado con 7µg de proteína de PMM. tinción de plata en dos cantidades diferentes de muestra (7µg y 5µg de proteína de PMM).
Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido
 1A3 1B4 1B5 1B6

L
L L L

LB LB LB
LB

3B2 3B3 3B4 3B5

LB
L L L
L

LB LB LB

. Cortes trasversales de intestino de T. pallidipennis utilizando diferentes medios de cultivo de hibridomas como anticuerpo primario y el fluoróforo Alexa como anticuerpo secundario que fluoresce
verde a 488nm. En azul se evidencian los núclePor os teñi
unados con Dapi
cultura de la. Lami
vida,nasubasa (LB),
calidad y suLumen
sentidointestinal (L), Membrana perimicrovil iar PMM.
 3C2 3C3 1A4 3C4

L L
L L

LB
LB LB LB

3C5 3C6 3D3 3D4

L L
L L

LB LB LB
LB

. Cortes trasversales de intestino de T. pallidipennis utilizando diferentes medios de cultivo de hibridomas como anticuerpo primario y el fluoróforo Alexa como anticuerpo secundario que fluoresce
verde a 488nm. En azul se evidencian los núclePor os teñi
unados con Dapi
cultura de la. Lami
vida,nasubasa (LB),
calidad y suLumen
sentidointestinal (L), Membrana perimicrovil iar PMM.
 3D5 4B2 4B3 4A3

L L L
L

LB LB LB

4B4 4B5 4C2 4C3

LB LB
L L
L L

LB LB

. Cortes trasversales de intestino de T. pallidipennis utilizando diferentes medios de cultivo de hibridomas como anticuerpo primario y el fluoróforo Alexa como anticuerpo secundario que fluoresce
verde a 488nm. En azul se evidencian los núclePor os teñi
unados con Dapi
cultura de la. Lami
vida,nasubasa (LB),
calidad y suLumen
sentidointestinal (L), Membrana perimicrovil iar PMM.
 Medio de cultivo de hibridomas Parental

100µg de PMM
Gel al 10%
Revelado con: Fosfatasa alcalina
Tiempo de revelado: 8min

AP
Anti mouse
Anti-PMM
PMM

Figura 3. Wb de medios de cultivos de hibridomas anti-PMM en proteínas de PMM. Tamizaje de los 17 medios de cultivo de hibridomas por WB utilizando
PMM como sustrato. Por fosfatasa alcalina se evidencian las bandas proteicas que distintos medios de cultivo de hibridomas reconocen de la PMM. PBS (C-).
Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido
 Medio de cultivo de hibridomas 3D4 y sus clonas

100µg de PMM
100µg de PMM
Gel al 10%
Gel al 10%
Revelado con: Quimioluminiscencia
Revelado con: Fosfatasa alcalina Tiempo de revelado: 7min
Tiempo de revelado: 13min

AP HRP
Anti mouse Anti mouse
3D4 3D4
PMM PMM

Figura 4. Wb del medio de cultivo de hibridomas 3D4 en proteínas de PMM. Tamizaje del medio de cultivo de hibridomas 3D4-1B8 y sus clonas por Wb utilizando PMM como
sustrato. Por fosfatasa alcalina (A) y quimioluminiscencia (B) se evidencian las bandas proteicas donde la PMM reconoce el anticuerpo producido por el medio de cultivo de
hibridoma 3D4 (C+) y sus clonas 3D4-1B8-2 (C2), 3D4-1B8-3 (C3), 3D4-1B8-5 (C5), 3D4-1B8-8 (C8), 3D4-1B8-9 (C9). Se utilizó PBS Tween como control negativo (C-).
Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido
 Inmunohistoquímicas del medio de cultivo de hibridomas 3D4 y sus clonas

PMM

Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido

 Inmunohistoquímicas del medio de cultivo de hibridomas 3D4 y sus clonas

PMM

Figura 5. Reactivad del medio de cultivo de hibridomas 3D4 en intestino de T. pallidipennis. Inmunoreactividad de los anticuerpos generados contra la PMM en cortes
trasversales de intestino de T. pallidipennis. En el lado izquierdo se muestran imágenes tomadas con un objetivo 20 X y en el derecho la imagen correspondiente en 100
X. En (A-1), (A-2) hibridoma 3D4-1B8-2; (B-1), (B-2) hibridoma 3D4-1B8-3; (C-1), (C-2) hibridoma 3D4-1B8-5; (D-1), (D-2) hibridoma 3D4-1B8-8; (E-1), (E-2) hibridoma
3D4-1B8-9; (F) control positivo hibridoma 3D4-1B8; (G) control negativo en 20X, incubando sólo con el anticuerpo secundario. En verde se observa la fluorescencia por
el reconocimiento de los anticuerpos. En cada imagen se indica la lámina basal (1), las células del intestino (2), vesículas del retículo endoplásmico (3), la PMM (4) y los
núcleos teñidos con DAPI en azul (5).
Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido
Aislar proteínas de superficie de la forma epimastigotes de T. cruzi

Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido

 Perfil proteico de las proteínas biotiniladas de T. cruzi
T. cruzi en T. cruzi por
KDa
KDa Estomago Intestino 10µg de T. cruzi
PMM
Plata quimioluminiscencia
100 2
200 2 1 1 Gel al 10% 95 3
180 2 2 Tin1ción con: Plata 90 2
130 0 0 0 de revelado: 4min 72 2 2
Tiempo 60 2 3
100 0 0 0
95 2 1 2 55 1 2
80 1 1 2 50 3
72 2 0 de T. cruzi 0
4µg 45 1 2
60 1 1 Gel al 10% 1 43 3 3
55 2 0 0 40 2 1
50 3 Revel a do2con: Qui m i o l u mi n3iscencia HRP 39 1 1
37 1 1
45 3 Tiempo3 de revelado: 5mi3n Sterptavidina 35 1 1
43 0 0 0
Biotina 33 3
42 0 0 0
T. cruzi 32 2
34 0 0 0
27 2
32 3 1 2
25 1
28 1 1 1 Intensidad Valor
20 1
26 1 1 1 No hay 0
19 2
Figura 6. Perfil de bandeo en23SDS-PAGE y Wb 0 de las proteínas 0 totales y de 0 Tenue 1
superficie de epimastigotes de19T. cruzi. (cepa 0Morelos). En la 0línea 2 (STcP) 1 se Fuerte 2 Tabla 6. Pesos moleculares de muestras de T. cruzi biotinilado.
muestra la tinción con plata del Intensidad y peso molecular en kDa de las proteínas de muestras
17 lisado total en2el que se encuentran
2 las proteínas 2 Muy fuerte 3
biotiniladas En la línea 3 (STcQ) se muestra el patrón de bandeo de las proteínas de T. cruzi biotiniladas, teñidas con tinción de plata y reveladas
biotiniladas En la línea 1(MP) se muestran los marcadores de peso molecular.
Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido por el método de quimioluminiscencia.
Determinar la interacción de moléculas de epimastigotes
y la PMM de Triatoma pallidipennis.

Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido

 Proteínas biotiniladas de T. cruzi en proteínas de PMM

(̴ 95, 80, 60, y 19 kDa)

20µg de T. cruzi
HRP Gel al 10%
Streptoavidine Revelado con: Quimioluminiscencia
T. cruzi Biotinilado Tiempo de revelado: 2min
PMM Barrido
Figura 7. Wb de proteínas de superficie de epimastigotes de T. cruzi en proteínas
de la PMM. Tamizaje de las proteínas de superficie biotiniladas de T. cruzi,
utilizando como sustrato PMM y revelado con Streptoavidina acoplada a HRP.

Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido

 Control del medio d cultivo de hibridomas 3D4 y clonas anti-PMM en T. cruzi

20µg de T. cruzi superficie

Gel al 10% AP
Revelado con: Fosfatasa alcalina Anti - mouse
Tiempo de revelado: 15min
3D4
T. cruzi
Figura 8. Control del medio de cultivo de hibridomas anti-PMM en T. cruzi. Tamizaje
del medio de cultivo de hibridomas 3D4-1B8-2 y 3D4-1B8-5 por Wb utilizando proteínas
de superficie de la forma epimastigotes de T. cruzi como sustrato. Revelado por
fosfatasa alcalina. Las tiras de la MNC contienen medios de cultivo de hibridomas 3D4-
1B8-2 en proteínas de superficie de T. cruzi (TcSC2) y medio de cultivo de hibridomas
3D4-1B8-5 en proteínas de superficie de T. cruzi (TcSC5).

Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido

 Bloqueo del medio de cultivo 3D4 y clonas a la adhesión de T. cruzi a la PMM

T. cruzi en buffer T. cruzi en

Buffer nativo con Solo las clonas buffer nativo
nativo con clonas y
parental clonas y parental y la parental
PBS Tween

HRP
Anti mouse
T. cruzi & 3D4

PMM

Figura 9. Bloqueo con el medio de cultivo de hibridomas 3D4. Tamizaje del medio de cultivo de hibridomas 3D4-1B8 y sus clonas por WB utilizando PMM como
sustrato, con dos tiempos de incubación. En el primer tiempo se incubó proteínas de superficie de T. cruzi en buffer nativo (1P, 1C2, 1C5), el medio del buffer nativo
sin T. cruzi (2P, 2C2, 2C5) y PBS Tween (3P, 3C2, 3C5). Para el segundo tiempo se incubo 3D4-1B8 (1P, 2P, 3P), y las clonas 3D4-1B8-2 (1C2, 2C2, 3C2) y 3D4-1B8-
5 (1C5, 2C5, 3C5). Revelado por quimioluminiscencia acoplado a HRP. Como controles negativos se utilizó T. cruzi en buffer nativo (C-1) y PBS Tween (C-2).
Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido
 Algunos reportes de moléculas que contiene la
PMM de T. pallidipennis son Manosa (Man),
Glucosa (Glc), galactosa (Gal), N-
acetilgalactosamnia (GalNAc), N-
acetilglucosamina (GlcNAc) y residuos de
monosacáridos del ácido 5-N-acetilneuramínico
(Neu5Ac) (Gutiérrez et al., 2014)

Estos residuos de azúcar unidos a las proteínas

PMM desempeñan un papel importante en la unión
de los epimastigotes a la superficie de las células
epiteliales intestinales que permiten que el
parásito complete su ciclo de vida en el vector,
además, los carbohidratos unidos a las proteínas
de las células del insecto suelen participar en las
interacciones insecto-patógeno (Alves et al., 2007).

(Gutiérrez et al., 2018) Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido

 Se probó que los mAbs de hibridomas 3D4 en la
interacción PMM-epimastigotes fueron capaces de
bloquearla. Estos estudios preliminares sobre la
interacción de estas moléculas y su bloqueo
utilizando anticuerpos anti-PMM, puede extenderse
mediante la implementación de antígenos nativos
para ampliar nuestro conocimiento de las proteínas
desde el intestino de T. pallidipennis.

Creemos que estas observaciones abren una nueva

perspectiva para modificar la interacción vector-
parásito y desarrollo de nuevas estrategias para
posibles vacunas.

Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido

En primer lugar, quiero agradecer a Dios quien me dio la oportunidad y los medios para desarrollar este trabajo ayudándome en cada paso del desarrollo del

proyecto aun cuando los experimentos no salían como se esperaba, le agradezco por darme la fuerza para trabajar cada día y poder sacar mi mejor versión y a

mi familia por su entero compromiso y fidelidad.

De corazón, quiero expresar mi más grato agradecimiento a mi director de tesis Fredy Palacino Rodríguez quien ha sido mi mentor, mi orientador y mi guía a lo

largo de la carrera y agradecerle por su asesoría durante todo el proceso y por darme la posibilidad y la confianza de arrancar con este nuevo tema en el

laboratorio, que disfruté enormemente a pesar de los inconvenientes y pruebas tuve que afrontar. A la Dra. Ana Erika Gutiérrez Cabrera por haberme acogido

en su casa y recibirme para trabajar, por brindarme su apoyado, por guiado y asesorarme para la realización de este trabajo

A las Doctoras Alba Neri Lecona y Roció Argotte por brindarme sus consejos a lo largo del proyecto, por apoyarme y corregirme cuando las cosas no iban

bien y asesorarme con mucha paciencia. A mis compañeros Santiago Álvarez y Sebastián Bravo, por su ayuda, colaboración y apoyo en la fase de laboratorio

del proyecto y por todas las experiencias compartidas. A mi familia de Laboratorio Ana, Alex, Lily, Albita, Chio, Ever, Dani, la Dra. Mari Carmen, Less, Vicky y

Bianca por todas las experiencias compartidas haciendo inolvidable mi estancia en México.

A la Universidad El Bosque por permitirme realizar mis estudios de pregrado y al personal de la misma por su valiosa ayuda y orientación en los tramites

escolares y de internacionalización para mi estancia en México y al Proyecto CONACyT número 2016-01-2471 Fronteras de la Ciencia por hacerme participe

del mismo.
Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido
Alves, C. R., Albuquerque-Cunha, J. M., Mello, C. B., Garcia, E. S., Nogueira, N. F., Bourguingnon, S. C., … Gonzalez, M. S. (2007). Trypanosoma
cruzi: Attachment to perimicrovillar membrane glycoproteins of Rhodnius prolixus. Experimental Parasitology, 116(1), 44–52.
https://doi.org/10.1016/j.exppara.2006.11.012

Azambuja, P., Gonzalez, M. S., Garcia, E. S., Ratcliffe, N. A., & Whitten, M. M. (2006). Exploring the role of insect host factors in the dynamics
of Trypanosoma cruzi–Rhodnius prolixus interactions. Journal of Insect Physiology, 53(1), 11–21. https://doi.org/10.1016/j.jinsphys.2006.10.006

Chapman., D. (2009). Full-Text, (September), 1–80. Retrieved from https://www.environment.gov.au/system/files/pages/2ee3f4a1-f130-465b-

9c7a-79373680a067/files/nlsaw-2nd-complete.pdf

Gutierréz, A. E., Alejandre-aguilar, R., Hern, S., & Espinoza, B. (2014). Arthropod Structure & Development Development and glycoprotein
composition of the perimicrovillar membrane in Triatoma ( Meccus ) pallidipennis ( Hemiptera : Reduviidae ), 43, 571–578.
https://doi.org/10.1016/j.asd.2014.07.001

Gutiérrez, A. E., Zandberg, W. F., Zenteno, E., Rodr, M. H., Espinoza, B., & Lowenberger, C. (2018). Glycosylation on proteins of the intestine and
perimicrovillar membrane of Triatoma ( Meccus ) pallidipennis , under different feeding conditions, 1–13. https://doi.org/10.1111/1744-7917.12579

Zhang, Z. Q. (2013). Phylum Athropoda. In: Zhang, Z.-Q. (Ed.). Animal Biodiversity: An Outline of Higher-Level Classification and Survey of
Taxonomic Richness (Addenda 2013), 3703(1), 17–26. https://doi.org/10.11646/zootaxa.3703.1.6
Por una cultura de la vida, su calidad y su sentido