Libro de laboratorio

del Semillero
SECAES.

Tomar 150ml de muestra con el

recipiente estéril dejando una cámara
de aire de 2,5ml, preservar a ≤ 6 °C
(nota: no tomar la muestra muy cerca
ni muy alejado de la orilla) llevar a
laboratorio en una nevera estéril.

Nota: la muestra vence a las 30horas.

 Semillero de Estudios de Control Ambiental Aplicado a Estrategias Sostenibles.
SENA, Centro de la Construcción.
Fecha: 05 de marzo del 2018

Coliformes Totales y E. coli por el método de vertido en placa en agar Cromogénico Colinstant y agar
MacConkey.

TÍTULO: DETERMINACIÓN DE ESCHERICHIA COLI Y COLIFORMES

TOTALES EN AGUA POR EL MÉTODO DE VERTIDO EN PLACA EN AGAR
CROMOGÉNICO COLINSTANT Y AGAR MACCONKEY.

ELABORADO POR: MAIRA ALEJANDRA VALENCIA OROZCO

REVISADO POR: JHOANA FERNANDEZ BERMUDEZ

APROBADO POR:

Este documento debe ser revisado por lo menos cada dos años.
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Coliformes Totales y E. coli por el método de vertido en placa en agar Cromogénico Colinstant y agar
MacConkey.

1. INTRODUCCIÓN:

Los Coliformes Totales son un grupo de bacterias que fermentan la lactosa con producción de
ácido y gas a 35 ± 2 °C dentro de un tiempo de 24 – 48 horas. En este grupo encontramos géneros
como la Eschericha coli, Enterobacter spp, Klebsiella spp y Citrobacter ssp, las cuales pertenecen a
la familia Enterobacteriaceae y que generalmente se encuentran en la capa superficial del agua o
en los sedimentos del fondo, como también en el intestino del hombre, de los animales, suelo,
plantas, cascara de huevo, entre otros.

La importancia de encontrar Coliformes en agua, radica en la contaminación de esta con heces de

humanos o animales, sin embargo, existen muchos Coliformes de vida libre. Por esta razón se ha
considerado los Coliformes como indicadores de contaminación fecal en el control de la calidad de
agua que ha sido tratada para consumo humano.

La presencia de Escherichia coli indica contaminación fecal en agua, ya que este microorganismo
es habitante normal del tracto digestivo de animales de sangre caliente y rara vez se encuentra en
agua o suelo que no haya sufrido algún tipo de contaminación fecal, por ello se considera como
buen indicador.

Para la determinación de Coliformes totales y E. coli se realizará el método de vertido en placa; en

este método se deposita la dilución seleccionada de la muestra directamente en la Petri y
posteriormente, se vierte el medio de enriquecimiento selectivo ya sea agar Cromogénico
Colinstant o agar MacConkey.

El medio de cultivo agar MacConkey se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de
fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no,
lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia
Enterobacteriaceae se desarrollan en el mismo. En este medio de cultivo, las peptonas, aportan los
nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono
fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben
el desarrollo de gran parte de la flora gram positiva. Por fermentación de la lactosa, disminuye el
pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales biliares. Los
microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

La selectividad del agar Cromogenico Colinstant está constituida principalmente por dos
sustancias. El 6-cloro-3-indolilb-D-galactopiranósido y el 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-
glucurónido. La primera de ellas es degradada por una enzima característica de los coliformes, la
b-D-galactosidasa, provocando que la colonia de coliformes Totales adquiera un color que va del
salmón-rojo. La segunda sustancia Cromogénica es atacada por la b-D-glucuronidasa, un enzima
que presentan todas las cepas de E. coli, de forma casi exclusiva y que libera un pigmento azulado-
violeta que tiñe la colonia de tonos azules. Las otras colonias de bacterias Gram negativas
aparecen incoloras, blancas, amarillas; excepto algunas pocas capaces de producir glucuronidasa,
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que dan colonias de color azul claro a azul turquesa; en caso dado es recomendable verificar la
identidad de E. coli por la producción de indol. Para ello se cubre la colonia azul oscuro-violeta con
una gota del Reactivo de Kovacs para Indol (Ref. RE0007). Si el reactivo vira a un color rojo cereza
en pocos segundos se considera la producción de indol positiva y con ello la presencia de E. coli
queda confirmada.

2. DEFINICIONES.

Coliformes Totales: Bacterias gram negativas, no esporoformadoras, oxidasa negativa, con

capacidad de crecimiento aeróbico y facultativamente anaeróbico en presencia de sales biliares,
que a temperatura especificada de 35ºC +/- 2ºC causan fermentación de lactosa con producción
de gas. Poseen la enzima B-galactosidasa.

E. coli: Escherichia coli: Bacilo gram negativo, capaz de desarrollarse en presencia de sales biliares
u otros agentes (tensoactivos) que tengan propiedades similares e inhibitorias del crecimiento y
que son capaces de fermentar la lactosa a temperaturas de 35°C +/- 2°C, con producción de ácido,
gas y aldehído en un lapso de 18 a 48 horas. Oxidasa negativa, no esporógena y reduce el nitrato a
nitrito. También es capaz de producir indol a partir de triptofano a una temperatura de 44°c +-05
en un tiempo de 21+/- 3 horas. Poseen la enzima B-glucoronidasa, la cual es detectada por medios
cromógenos o fluorógenos.

Medio de Cultivo Selectivo: Medio que promueve el crecimiento de microorganismos específicos,

al tiempo que inhibe, total o parcialmente, el crecimiento de otros microorganismos. Como es este
medio de cultivo.

UFC/100mL: Unidades formadoras de colonias por 100 mililitro.

mL: mililitros.
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3. ASPECTOS DE SALUD Y SEGURIDAD

Las medidas de seguridad en el área de microbiología para las actividades de Análisis y Lectura
son:

 Hacer las resiembras de las cepas con mucho cuidado, manipúlelas con todos los elementos de
seguridad del caso.

 Realizar todos los procedimientos evitando al máximo la formación de aerosoles. Cubrir las zonas
de trabajo con papel absorbente, siempre que exista riesgo de derrame de material peligroso

 En caso de derrame de algún material, cubrir la zona con un desinfectante (hipoclorito de sodio
al 2%) de 15 a 30 minutos antes de limpiar.

 Evitar abrir las cajas de petri, incluso las de mesófilos si no se tiene tapabocas, pueden provocar
infección por inhalación.

 Evitar movimientos bruscos o innecesarios ya que puede ocasionar derrame infeccioso

 Evitar tener contacto con superficies no estériles cuando se esté sembrando o cuando se tengan
guantes.

 Mantener cerradas las puertas del área de microbiología mientras se está sembrando.

 Evitar el paso de personal ajeno por el área de microbiología mientras se siembra.

Los siguientes son los elementos de protección personal en el laboratorio de análisis

microbiológico:

 Bata de laboratorio manga larga

 Tapabocas

 Monogafas

 Guantes de latex

 Zapatos antideslizantes

La incorporación de estas sustancias en el organismo, puede producir efectos nocivos de menor

trascendencia a la salud.
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4. EQUIPOS, MATERIALES y REACTIVOS.

EQUIPOS:

 Autoclave.
 Incubadora.
 Balanza.

MATERIALES:

 Vasos de precipitado.
 Mechero de alcohol.
 Micropipeta.
 Puntas para micropipeta.
 Probetas graduadas de 100 ml.
 Vasos de precipitado 100 ml.
 Cajas de Petri en vidrio.
 Frascos para toma de muestra en vidrio autoclavado con tapa de rosca.
 Papel kraft.
 Boecos de 500 ml.
 Boeco de 1000 ml.
 Pinzas.
 Cinta testigo
 Encendedor
 Espátula
 Papel parafilm
 Cinta para rotulo.
 Micropunta.

REACTIVOS:

 Agar Cromogenico Colinstant.

 Agar MacConkey.
 Agua destilada.
 Alcohol
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5. PREPARACION, TOMA, PRESERVACION, TRANSPORTE DE LA MUESTRA.

Lavar material de laboratorio
con jabón alcalino por 1
hora, luego con ácido al 10%
por 1 hora y finalmente
enjuagar con agua destilada
y dejar secar.
Envolver material de laboratorio en papel kraft y sellar con cinta
testigo (nota: para recipientes con boca, tapar con gaza y algodón y
6. con papel kraft y cinta testigo; agregar agua destilada). Cuando
luego DETERMINACION
DE COLIFORMES
ya esté listo el material, incluyendo el recipiente de vidrio con el que
se va recolectar la muestra, Esterilizar a 121°C durante 30min en una
TOTALES Y E. COLI
autoclave (nota: preparar este material un día antes de ir a tomar la
POR VERTIDO EN
muestra)
PLACA EN AGAR
CROMOGENICO
COLINSTANT Y AGAR MACCONKEY EN LABORATORIO.

Cuando se llegue de
campo preparar agar
Cromogénico Colinstant
y MacConkey

Autoclave el agua destilada y el agar Cromogénico

Colinstant y MacConkey a 121°C a 30min (Nota: antes
La cantidad del medio a preparar depende del número de muestras a preparar
en el ensayo ejemplo: de utilizar la autoclave cambiar agua a este equipo)

1000ml 41,5gr (gramos del agar Cromogénico Colinstant y MacConkey)

25ml x

X= 25ml x 41,5gr = 1,0375gr de agar Cromogénico Colinstant y MacConkey

1000

25ml x 3 muestras= 75ml

1,0375gr x 3 muestras= 3,1125gr

R/= Diluir 3,1125gr de agar en 75ml de agua destilada

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Autoclave 1000ml de agua destilada

1mL 0,1mL 0,01mL

0,001mL
Hacer diluciones dentro de la campana de Dejar reposar agar y alcohol en la
extracción. campana. (Nota: limpiar antes de
Verter el volumen de la dilución en las Petri, sin levantar usar la campana con alcohol).
mucho la tapa. Luego verter el agar Cromogénico Para la dilución se agrega 9mL de agua
Colinstant y MacConkey en la Petri que corresponda cada destilada y 1mL de muestra hasta la dilución
agar. (esta debe rotulada con fecha, año, lugar. Durante que desea obtener (para agua de rio se
este procedimiento el mechero debe estar encendido). hacen dilución de 1; 0,1; 0,01 hasta de
0,001mL).
El tiempo transcurrido desde el momento en que la
muestra se incorpora al diluyente, hasta que finalmente se Nota: hacer un blanco.
adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de
20 minutos.
Despues de las 22 – 24 horas.
Tapo y sello con papel parafilm y homogenizo la Petri
suave en circular.
Cuenca las colonias si es posible con una lupa.

Colonias de color:

E. coli: Rojo.
Salmonella typhimurium: Incoloras
Salmonella dublin: Incoloras.
Shigella sonnei: Incoloras.
Proteus mirabilis: Incoloras.
Llevar las cajas Petri reposadas a la
Color intermedio: incubadora (selladas con papel
parafilm) previamente calentada,
E. coli: Rojo.
invertirlas e incubar a 36 °C durante 22
Salmonella typhimurium: Amarillenta
Salmonella dublin: Amarillenta. -24 horas.
Shigella sonnei: Amarillenta.
Proteus mirabilis: Amarillenta.
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7. CALCULOS:

Una vez realizado el conteo se reporta la densidad de coliformes como el total por 100mL; Para
determinación de coliformes totales por el método de filtración por membrana.

El cálculo se efectúa tomando aquellas cajas en la que tenga crecimiento entre el rango de 25 -
250 colonias según la FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos) de los estados unidos.

Formula de UFC/ml:

UFC/mL = A colonias enumeradas x Factor de dilución

B mL sembrados

Ejemplo:

Dilución 0,01/100: 27 colonias x 10-3 = 27 x 10-5

100ml

Nota: el resultado va en números enteros.

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8. BIBLIOGRAFIA

FALTA ACOMODAR

http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/maconkeyagar.htm

http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis286.pdf

http://www.cofes.org.ar/descargas/relas/6_jornada/12-05-
2016/Metodo_de_membrana_filtrante_Eugenio_Vazquez_2016.pdf

http://www.ideam.gov.co/documents/14691/38155/Coliformes+totales+y+E.
+coli+en+Agua+Filtraci%C3%B3n+por+Membrana.pdf/5414795c-370e-48ef-9818-ec54a0f01174

http://www.calidadmicrobiologica.com.co/microbiologia/coliformes-totales

http://javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis203.pdf

http://www.ideam.gov.co/documents/14691/38155/Coliformes+totales+y+E.
+coli+en+agua+NMP+M%C3%A9todo+Colilert.pdf/463a6c8d-122c-4f75-8572-81bd64baa2d2

http://coli.usal.es/Web/demo_fundacua/demo2/FiltraMembColiT_auto.html

Documento de cinara lo olvidar para citar

http://www.annardx.com/productos/images/productos/industria/microbiologia-
industrial/01618500.pdf

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Cuenta-en-placa_6527.pdf