UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

ESCUELA DE MEDICINA
VIROLOGIA

DOCENTE:
DRA. CARMEN MOSQUERA HERRERA
FECHA DE ENTREGA
07 DE ENERO DEL 2021
GRUPO:06
SUBGRUPO:
1
CICLO:
2020-2021 CII

Integrante Teórico Práctico Firmas

BONILLA OLVERA
YUKSEL ELIZABETH

BARRIGA SALINAS
MILENA DIANE
ACOSTA PIANDA MARIA
JOSE

ALVAREZ MORALES
NICOOL AKIRA
ARCINIEGA GUERRERO
DARLYN DAYANA

AREVALO ROMERO
MELANIE NICOLE
 GENÉTICA VIRAL YUKSEL BONILLA

La genética es la ciencia de la transmisión de los caracteres hereditarios y su variación.

Los sistemas virus-célula permitieron extraordinarios avances en el conocimiento de los
mecanismos moleculares básicos comprometidos en la transmisión y expresión de la
información genética.
Gen: Es la unidad molecular de la herencia genética, pues almacena la información
genética y permite transmitirla a la descendencia. Los genes se encuentran en los
cromosomas
Genoma: Es el conjunto de genes contenidos en los cromosomas, lo que puede
interpretarse como la totalidad del material genético que posee un organismo o una
especie en particular.
INTRODUCCIÓN A LA TERMINOLOGÍA
Para comenzar necesitaremos familiarizarnos con algunos términos utilizados en forma
arbitraria en la descripción de diferencias entre virus. Si bien no existen dudas sobre el
significado de genotipo (información genética definida por la secuencia de ácido
nucleico, que comprende tanto las regiones que se expresan en forma de ARN y proteínas
como las regiones regulatorias) y fenotipo (características observables productos de la
expresión del genotipo), el uso habitual de algunos otros términos no es tan claro y no
requiere algunas consideraciones.
Así los términos sepa tipos variantes y montante se usan extensa e indirectamente para
iluminar a virus que difieren de alguna manera heredable de un virus parental o Wild
Type. Los genetistas moleculares le asignan el nombre de Wild Type a un virus
Generalmente cultivado en el laboratorio del que se obtuvieron mutantes que se comparan
al wt de laboratorio y los virus recientemente aislados de su hospedero natural que se
denomina aislamientos de campo.
Cepa es utilizado para Designar instintos wt y mutantes caracterizados del mismo virus.
Tipo se convirtió en sinónimo de serotipo definido por neutralización cruzada de la
infectividad (un mismo serotipo incluye varias cepas).
Variantes se utiliza para indicar qué un virus es genotípicamente diferente del wt.
BASES MOLECULARES DE LOS CAMBIOS EN LOS GENOMAS
Los virus se reproducen con ayuda de las células a las que infectan para generar nuevas
copias de sí mismos (progenie).Los procesos de replicación de los ácidos nucleicos son
bastante elaborados y la copia de la secuencia nucleotídica extraordinariamente fiel,
aunque, de vez en cuando, se puede deslizar algún error. En la replicación de la
información en forma de ADN existen mecanismos de corrección de errores si esto fuera
extrictamente el único que ocurre no habría variación genética y evolución.
Las variaciones de los genomas ocurren por dos mecanismos que cambian la secuencia
de los ácidos nucleicos de manera que al menos algunos miembros de la progenie no
resulten idénticos a sus progenitores mutación y recombinación. En el caso de los virus
en los que el genoma se encuentra repartido en varias moléculas de ADN o ARN (genoma
segmentado) la variación también puede ocurrir por reordenamiento de los juegos de
moléculas (reasociacion).
MUTACIONES
Las mutaciones son cambios en la secuencia nucleotídica comprenden cambios de un
nucleótido por otro (transiciones: una purina por otra purina o una pirimidina por otra;
transversiones: una pirimidina por una purina y viceversa). Inserciones de uno más
nucleótidos y delecciones: eliminación de uno o más nucleótidos de la secuencia original.
A los virus con genoma de RNA se deben agregar los retrovirus, que expanden aún más el
esquema básico central de la biología molecular (es decir, el flujo de información ADN→ ARN→

MUTACIONES ESPONTANEAS
Distintos agentes mutagenicos de tipo químico físico que aumentan la frecuencia de la
mutación de acuerdo a la concentración o dosis en que se administren algunos actúan
sobre el material genético (por ejemplo, agente metilantes) en forma directa y otros
requieren que se esté recopilando para producir su efecto (por ejemplo, análogos de
bases).

TIPOS DE MUTACIONES
• Mutantes letales. El cambio en la secuencia nucleotídica conduce a la anulación de
alguna de las funciones esenciales del virus. Este tipo de mutantes no puede ser aislado,
a menos que se utilicen líneas celulares que expresen el gen faltante.
• Mutantes letales condicionales. Este tipo de mutantes puede propagarse en una
condición que se denomina permisiva, aunque no lo hacen en otra situación.
• Mutantes sensibles a la temperatura. La alteración en la secuencia nucleotídica es tal
que el producto del gen alterado resulta inactivo a una cierta temperatura llamada no
permisiva (alta), a la que no puede adoptar su conformación activa.
• Mutantes de rango de hospederos. Se trata de mutantes que son capaces de crecer en
un tipo de células y no en otro. Algunos mutantes que se usan como vacunas a virus
vivos poseen un neurotropismo (capacidad de infectar células del sistema nervioso)
muy disminuido cuando se los compara con el virus wt del que fueron derivados.
• Mutantes resistentes a drogas. Las interacciones entre la droga y la molécula viral
blanco se ven afectadas por la mutación. Por ejemplo, transcriptasa inversa de un
retrovirus es capaz de utilizar como sustrato algunos análogos de nucleósidos (por
 ejemplo, ATZ) que, una vez incorporados a la cadena creciente de ADN, impiden la
incorporación del próximo nucleótido.
• Mutantes de deleción. Este tipo de mutantes puede ser el resultado de la eliminación
de regiones esenciales o no esenciales de la secuencia nucleotídica del genoma viral.
• Mutantes de escape a la neutralización. Algunos cambios en las secuencias de genes
que codifican proteínas externas del virion pueden resultar en alteraciones de epítopes
que son reconocidos en el wt por cierto anticuerpo monoclonal. De esta manera, el
mutante es capaz de eludir la neutralización por ese anticuerpo e infectar a la célula
hospedera.
INTERACCIONES GENÉTICAS ENTRE VIRUS
Cuando dos diferentes viriones infectan simultáneamente la misma célula puede ocurrir
una variedad de tipos de interacción genética entre las moléculas del recién sintetizado
ácido nucleico.
RECOMBINACIÓN
Los virus con genomas que consisten en una sola molécula de DNA o RNA pueden
intercambiar información genética en una célula infectada simultáneamente acción física
directa de sus genomas. Los virus grandes a ADN (adeno, herpes, pox) pueden
intercambiar información genética por recombinación homóloga. Generalmente, la
recombinación entre dos mutantes que coinfectan una célula produce proporciones
equivalentes de los tipos de recombinantes recíprocos, además de viriones con los
genomas parentales.
Los eventos moleculares que conducen a la recombinación ocurren en forma simultánea
con la replicación del genoma. En el caso de los virus a DNA la recombinación ocurre
según el modelo de corte y reunión o mecanismo de recombinación intramolecular.
Mientras tanto, en los virus a ARN, las evidencias experimentales apoyan el mecanismo
de selección de copia (copy choice) en el que la ARN polimerasa salta de un molde a otro
generando una molecula del genoma en la que una parte resulta de copiar el RNA molde
de uno de los virus parentales y otra parte, del otro.
La recombinación en el hospedero infectado con dos variantes de un virus puede producir
virus con una patogenicidad alterada. En este sentido, se han descrito infecciones in vivo
con dos variantes no virulentas del virus herpes simplex (HSV) que generaron
recombinantes letales.
REASOCIACIÓN DE SEGMENTOS GENÓMICOS
En los genomas no segmentados, la frecuencia de recombinación depende de la distancia
de los marcadores genéticos sobre el cromosoma (por ejemplo, mutaciones ts en dos
genes distintos, A y B) máximo teórico de 50% solo en el caso de que los marcadores
estén alejados a una distancia infinita. Los virus no segmentados, en cambio, exhiben un
comportamiento muy distinto: dado un par de marcadores, la frecuencia de
recombinación es muy alta (hasta 50%), cuando estos pertenecen a segmentos distintos,
o es muy baja cuando los marcadores encuentran sobre el mismo segmento.
A diferencia de los genomas de molécula única, en una infección mixta de dos virus con
genomas segmentados la progenie puede contener las combinaciones (assortments)
alternativas de segmentos por simple empaquetamiento o reasociación (reassortment) de
segmentos de uno u otro virus.
COMPLEMENTACIÓN
Se refiere a la interacción de productos génicos virales en la célula infectada con dos
virus, uno o ambos de los cuales puede ser defectuoso. Tiene como consecuencia la
replicación de una o ambas partículas virales bajo condiciones en las cuales no ocurriría
replicación en forma ordinaria.
En la infección mixta, en condiciones no permisivas, también se puede producir un
aumento en el rendimiento de la progenie de los mutantes sin que cambien sus genomas.
En este fenómeno, que se conoce como complementación, uno de los mutantes
proporciona el producto génico que es defectuoso en el otro y viceversa, permitiendo que
se produzca la replicación.

ONCOGÉNESIS VIRAL
En cambio, el fenómeno de oncogénesis siempre se da en animales (o humanos) e implica
la adición lenta y sucesiva de varias mutaciones críticas en algunos genes regulatorios del
crecimiento celular. El hecho de que un virus sea capaz de provocar transformación
celular in vitro no indica en absoluto que pueda inducir una neoplasia humana.
CANCER
Engloba un conjunto de enfermedades que tienen en común un crecimiento celular
desordenado (tumor) y una colonización tisular (metástasis), todo ello determinado por
la acumulación de mutaciones en el genoma y por la alteración de las marcas
epigenéticas. La participación de los genes en la carcinogénesis puede seguir dos tipos de
mecanismo: mutación, gen mutado, proteína alterada, ausente o exceso, descontrol del
ciclo, celular o represión de la apoptosis, proliferación anormal, daños tisulares,
alteración epigenetica. Mutaciones que afectan esencialmente: protooncogenes y genes
oncosupresores.
ETAPAS Y CARACTERISTICAS EN EL DESARROLLO DEL CANCER.
A grandes rasgos, su desarrollo suele agruparse en 3 fases con posibles subetapas de
difícil delimitación: formación del tumor primario benigno, progresión insitu e invasión
y aparición de metástasis o tumor maligno.
Tumor primario benigno: mutación, célula progenitora de cáncer, clon neoplásico,
acumulación de nuevas mutaciones. Cuantitativamente se cree que son necesarias cerca
de 6 mutaciones para que una célula normal de convierta en cancerosa.
Cáncer in situ: Corresponde a la situación en la que las células del tumor primario no han
escapado del tejido donde se originaron. Generalmente benigno à puede corregirse por
simple extirpación quirúrgica.
Tumor maligno o cáncer propiamente dicho: La etapa que define y caracteriza el
cáncer es su progresión o propagación tumoral. Puede dividirse en varias subetapas, de
difícil subordinación.
Formación del tumor secundario o metástasis: Mediante la invasión o diseminación
celular, las células del tumor primario pueden fijarse en tejidos normales, para
multiplicarse y diferenciarse en ellos, dando lugar al llamado tumor secundario o
metástasis.
MUTACIÓN DE PROTOONCOGENES: ONCOGENES
Oncogén: la forma mutada de un gen normal o protooncogén que causa cáncer como
consecuencia de una “ganancia de función” de la proteína expresada por el gen
TIPOS DE PROTOONCOGENES
Se ha identificado protooncogenes que codifican proteínas muy diversas:
• Factores estimuladores del crecimiento celular. La mutación oncogénica origina una
producción excesiva del factor proteico o una mayor actividad de este.
• Receptores de factores de crecimiento o de hormonas, la forma oncoproteica del
receptor puede ser aquella con una conformación que la mantiene activa aunque no se
le una el ligando. Ejm: el protooncogén erbB codifica el recetor de membrana para el
factor de crecimiento epidérmico EGF.
• Proteínas citoplasmáticas que intervienen en los sistemas de transducción de señales.
La mutación hace que el oncogén exprese una proteína que se mantiene activa sin
necesidad de que llegue la señal.
 • Factores de transcripción que controlen la expresión de genes que codifican a su vez
proteínas implicadas en la señalización, el control del ciclo celular o la apoptosis.
• Proteínas responsables de la activación directa del ciclo celular (tales como las ciclinas
o las quinasas y fosfatasas activadoras de las Cdk) o de la inhibición de la apoptosis. Los
oncogenes respectivos expresan proteínas en mayor cantidad o con función
aumentada.

MUTACIÓN DE GENES ONCOSUPRESORES

GENES ONCOSUPRESORES: genes que causan cáncer como consecuencia de una
mutación experimentada por la forma normal, llamados también genes supresores de
tumores o anti oncogén (porque su acción es contraria a la de los oncogenes, aunque
la ejercen por un mecanismo distinto).
TIPOS DE GENES ONCOSUPRESORES

• Factores inhibidores del crecimiento celular. La mutación del gen oncosupresor

correspondiente anula la funcionalidad de la proteína sintetizada.
• Receptores de esos inhibidores o de hormonas que frenan el crecimiento celular.
La forma mutada del gen oncosupresor codifica un receptor insensible a su
ligando o que no transmite la señal al interior de la célula.
• Proteínas citoplasmáticas que intervienen en los sistemas de transducción de
señales acopladas a los receptores anteriores. La situación varía según sea la
función concreta de la proteína.
• Factores de transcripción que dirijan la expresión de genes cuyos productos
proteicos frenan el ciclo celular o producen apoptosis. La forma mutada del gen
oncosupresor expresa una proteína no funcional. • Ej.: los genes oncosupresores
Rb y p53.
• Proteínas que frenan el ciclo celular o producen apoptosis. El gen mutado no
expresa la proteína oda lugar a una forma no funcional.
ALTERACIONES CAUSADAS POR EL CÁNCER
El proceso canceroso ejerce una influencia directa sobre la propia célula y su vecindad
(efecto local) o sobre la totalidad del organismo (efecto generalizad o sistémico).

• EFECTOS LOCALES: obstrucción de vasos sanguíneos, comprensión de

tejidos, destrucción celular, daños en el SN.
• EFECTOS GENERALIZADOS: causados por la variación de la secreción de
moléculas reguladoras.
MARCADORES TUMORALES

• CITOSINAS O MEDIADORES SOLUBLES DE ORIGEN CELULAR.

 • MARCADORES TUMORALES DE SECRECIÓN O MARCADORES “CLÁSICOS”: Pueden
clasificarse en función de los factores (tisulares, metabólicos, fisiológicos,
metodológicos…) que determinan su concentración en líquidos biológicos,
principalmente la sangre. También pueden clasificarse en función del material
biológico en el que se pueden estudiar: marcadores séricos, urinarios, de líquido
cefalorraquídeo y de metástasis óseas.

TOMA DE MUESTRA Y DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO

DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO: Serie de métodos y procedimientos para la detección e
identificación del agente etiológico de una infección viral clínica o inaparente, y / o de la
respuesta inmune específica del huésped.
IMPORTANCIA y CONTRIBUCION DEL DIAGNOSTICO VIRAL:

• Una intervención terapéutica

• Definir el pronóstico en la evolución de un paciente
• Indicar la necesidad de una vacunación
• Desde un punto de vista epidemiológico sirve para adoptar medidas de salud
• publica en una comunidad

OBTENCIÓN DE MUESTRAS
• Para obtención adecuada
• Patogenia de cada infección viral
• Características del virus
• Estadio de la enfermeda
Se obtienen por:

• Hisopados
• Aspiraciones
• Muestras
Obtenerlos en etapas tempranas

• Refrigerarlos
• Enviarlos correctamente

Sx. / ENFERMEDAD VIRUS MUESTRAS

Infección respiratoria
Gastroenteritis
En inmunocompetentes Aspirado nasofaríngeo
Hisopado nasal/faríngeo
Aspirado traqueal
En inmunocomprometidos Respiratoria
Sangre
Rotavirus, astrovirus, sapovirus. Heces

Herpes simplex Hisopado

Lesiones cutáneo-mucosas Varicela-zóster
Poxvirus Hisopado-Biopsia
usuales LCR
Meningitis Inusuales
HIV Plasma
Usuales (no asociados a HIV) LCR
Encefalitis
Usuales (asociados a HIV) LCR
Conjuntivitis/ Queratitis Adenovirus, herpes simplex Hisopado conjuntival
Retinitis Citomegalovirus, Herpes simplex Humor vitreo

MÉTODOS DIRECTOS E INDIRECTOS

MÉTODOS DIRECTOS: Son aquellos que detectan la presencia del virus (o alguno de sus componentes)
en muestras clínicas, lo que puede realizarse a través de diversas técnicas que investigan la presencia de:

• Agentes infecciosos (mediante la observación de su replicación en cultivos celulares “aislamiento

viral”)
• Partículas virales (microscopia electrónica)
• Antígenos virales por técnicas de inmunomarcacion
• Fenómenos virales por técnicas moleculares

METODOS INDIRECTOS: Investigan la respuesta inmune humoral mediada por anticuerpos específicos
antivirales en el suero o plasma del paciente. Por ende no detectan la presencia del agente etiológico. Para
realizar un diagnóstico es necesario determinar la conversión serológica (seroconversión) o bien la presencia
de IgM especifica antiviral.
MÉTODOS MOLECULARES: Detectan el genoma del virus, si ha sufrido mutaciones o cambios
estructurales.

• PCR
• PCR larga
• PCR anidada
• RT-PCR
• PCR en tiempo real
• Hibridación
• RFLP
 • Secuenciación nucleotídica

ACOSTA PIANDA MARIA JOSE

CULTIVOS CELULARES

Los cultivos celulares se desarrollan a partir de muestras de tejido que son disgregadas por métodos
mecánicos, químicos y enzimáticos para conseguir células apropiadas para el aislamiento de virus.
CULTIVOS PRIMARIOS: Se denominan así a aquellos cultivos preparados directamente a partir de un tejido
u órgano.
CULTIVOS SECUNDARIOS: En estas condiciones las células suelen multiplicarse hasta cubrir la superficie
del recipiente de cultivo, formando una monocapa.
CULTIVO CONTINUO O LINEA CELULAR: Cultivo celular que tiene alta capacidad de multiplicarse in vitro,
establecido a partir del primer subcultivo de un cultivo primario y que tiene las mismas características que el
tejido de origen.
PROCEDIMIENTO

• Obtención de muestras: primeros días de enfermedad

• Enviarse inmediatamente, refrigeradas en baño hielo y rohiladas
• En laboratorio, Procesadas para su inoculación en cultivos celulares sensibles
• Descontaminadas previamente (ANF, materia fecal u órganos), por tratamiento con antibióticos o por
filtración o centrifugación.
• Muestra inoculada en tubos con monocapas de células sensibles
• Se inocula 0.2 – 0.3 ml de la muestra descontaminada y diluída en medio de cultivo con antibióticos,
y se incuban a 37°C durante 1h
• Se añade medio de cultivo fresco, se procede a incubación de cultivos por estufa, a 37°C, o en VR a
33°C.
• Se deben incluir siempre células para control negativo en la observación de ACP
• Para viabilidad de células, el medio se cambia cada 2-3 dias en fresco al microscopio invertido
USO DE LA PRUEBA

• Estudio virológicos
• Producción de vacunas
• Ingeniería de proteínas
• Estudios de interacción/señalización celular
• Producción para trasplantes
• Reproducción “in vitro” de plantas de interés comercial
• Ensayo de nuevos medicamentos
• Estudio de toxinas

HUEVOS EMBRIONARIOS
Son muy utilizados como fuente de cultivos primarios de fibroblastos,
de células renales en monocapa, para el aislamiento de virus aviares.
VIAS DE INOCULACION:

• Saco vitelino: embriones de 5-7 días para herpes simple

• Corion: embriones 9-11 días herpes simple ➢ poxvirus ➢
sarcoma de rous
• Alantoides: embriones de 9-11 días➢ Influenza ➢ Viruela ➢
Sarampión ➢ Mixovirus
• Amnios: embriones 9-11 dias ➢ Parotiditis ➢ Paramixovirus ➢
Mixovirus
PROCEDIMIENTO

• Antisepsia
• Pequeño orificio en la cáscara de los huevos embrionados de 7-14 días
• Se inyecta el inóculo con aguja y jeringa
• Se tapa con tela adhesiva
• Se incuba a 37ºC
USO

• Permite cultivo viral en forma sencilla, barata y no requiere de equipos sofisticados.

• Susceptibilidad de sus tejidos a numerosos virus aviares
• Se debe emplear huevos libres de agentes patógenos SPF
• La inoculación se realiza por diversas rutas que está en función a la edad del embrión
ANIMALES EN EXPERIMENTACION

• Primates • Agente de la encefalopatía espongiforme • Virus de la hepatitis

• Conejos • Producción de antisueros Hámster • Virus oncogénicos
• Hurones • Mixovirus Ratones • Virus rábico • Togavirus • Arenavirus • Virus Coxsackie
• Ratones lactantes • Virus Coxsackie • Arbovirus • Arenavirus
VIA DE INOCULACION INTRACRANEAL - PROCEDIMIENTO

• Utilice una jeringa de plástico con una aguja 276

• Sujete al animal sobre una superficie firme con la parte dorsal hacia arriba
• Se introduce la aguja en el cerebro con un ángulo de 45°
• Observar las primeras 12 horas
 MICROSCOPIA ELECTRONICA

PRINCIPIO

• El ácido fosfotúngstico ¨tiñe¨ negativamente las muestras, en los viriones que no penetra la tinción
se observa partículas blancas en fondo oscuro.
• Concentración de partículas virales es de al menos 10⁶/ml
APLICACION

• Identificación rápida de viriones con morfología distintiva.

• Observación directa de muestra clínica.
• A veces en líquido de cultivo celular
INMUNOELECTROMICROSCOPIA

• Reacción inmune + microscopia electrónica

• Muestra de suero
• Inmunosuero contiene anticuerpos contra el antígeno viral
• Conglutinar las partículas
• Virus hepatitis B
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA

PRINCIPIO

• Demuestra la presencia de complejos antígenos anticuerpos.

• Utilización de colorante fluorescente
• Virus respiratorios, Herpes virus, Virus influenza B, Virus sincicial, Virus herpes I y II,
Citomegalovirus.
VENTAJAS: Más certero y rápido (1 hora); Elevada sensibilidad (70%) Requerimiento pocas células; De
fácil realización.
DESVENTAJAS: Alto costo de Microscopio y reactivos; Requerimiento de mucha experiencia.
 ELISA DIRECTA ALVAREZ MORALES NICOOL AKIRA
Principio
Su principio se basa en una inhibición o activación de la reacción enzimática por el complejo antígeno-
anticuerpo.
De la reacción consiste; al cuerpo problema se le agrega un conjugado que son anticuerpos dirigidos contra
anticuerpos humanos o antígeno, los cuales se unirán a una enzima. Las enzimas son capaces de modificar
al sustrato en presencia de un cromógeno produciendo un producto coloreado que es detectado
visualmente o por un espectrofotómetro
Cuanta con una placa porta objeto poliesteleno que contiene 12 pocillos en horizontal y 8 en vertical, total
96 pocillos para las muestras.
Procedimiento
1. Preparación de la muestra a 25° durante media hora, si está congelada la descongelo.
2. Disolución de la muestra con el diluyente de la muestra, cojo 100 microlitro de diluyente de la
muestra y 20 microlitros del suero del paciente y se coloca en los pocillos
3. Primera incubación: en una cajita, soporte plástico, se hace una cámara húmeda y se lleva a la estufa
1h o media hora a 37° la estufa.
4. La saco y lavo 5 o 6 veces la muestra que fue incubada
5. Y ponemos el sustrato TMB (TETRA METIL BENZIDENO) en una estufa durante 15min y se hace los
pocillos de color azul
6. Colocamos con un gotero la solución de stop y se pone 100 microlitro en cada pocillo y se para la
reacción.
7. Listo para su uso en donde se observa amarillo anaranjado en los pocillos que se encuentra el
antígeno-anticuerpo y la enzima que se liga con el sustrato generando una reacción oxidativa química
Interpretación
En el fondo del pocillo se adhiere al antígeno, se agrega la muestra del
paciente con el anticuerpo marcado con la enzima que se adhiere al
sustrato el cual hace una reacción oxidativa química en el pocillo que
cambia de color azul dado por el sustrato a amarillo anaranjado. A través
de un espectrofotómetro si es por encima de 400 densidad óptica es
positiva, en si los resultados pueden ser: positivos o no reactivos,
inespecífico o negativo o no reactivo

INMUNOPEROXIDASA
Principio
Es una técnica inmunohistoquimica que permite detectar antígenos virales. En la técnica directa, el
anticuerpo especifico este marcado con una enzima (peroxidasa). Mide la reacción antígeno-anticuerpo
Procedimiento
1. El suero se pone en contacto con el sustrato antigénico. Si hay Ac se unen al Ag.
 2. Se agrega un Ac marcada con peroxidasa. Si hay el complemento Ag-Ac esta
se une.
3. Al unirse se produce una reacción colorimétrica. Posible observar en el
microscopio óptico.

Utilidad
La ventaja de esta técnica sobre la IF es que los preparados son permanentes y
se observan al microscopio óptico. Uno de los mayores inconvenientes es que
la peroxidasa endógena que contienen algunas células puede dar falso
resultados positivos, por lo que debe eliminarse previamente.
NEUTRALIZACION
Principio
La prueba esta basada en aislamiento viral con el uso de cultivos/líneas celulares. Es la capacidad de los ac de
quitar la parte toxica/infectiva. Pone en evidencia la capacidad neutralizante de los anticuerpos presentes en
el suero del paciente sobre cepas virales patrón (prototipo).
Procedimiento
1. Recuperar el virus del medio de cultivo y de las células
2. Mezclar alícuotas del virus con anticuerpos específicos antivirus polio (1,2 y 3) antivirus Echo y
antivirus coxsackie
3. Incubar 1 hora a 37 C
4. Inocular en nuevos cultivos
5. Si el virus aislado es polio será neutralizado por el suero antipolio polivalente y los cultivos
infectados con esa mezcla no desarrollaran ACP. Por el contrario, los cultivos inoculados con las
mezclas virus+ suero anti-Echo y virus+ suero anti-Coxsackie desarrollaran ACP
Utilidad
De gran valor en estudios epidemiológicos. Determina la presencia de anticuerpos protectores inducidos
mediante vacunas
ELISA INDIRECTA
Principio
La prueba se basa en una placa de microtitulación de poliestireno con 96 pocillos, en el fondo de cada
pocillo se encuentra un ac especifico, en la que se agrega la muestra que contiene el virus, luego se le
agrega la enzima (peroxidasa), y por último el sustrato (TMB) que es aquel que dará la reacción
colorimétrica.
Procedimiento
1. Preparación de la muestra a 25° durante media hora, si está
congelada la descongelo. Preparo el kit, el protocolo
2. Disolución de la muestra con el diluyente de la muestra, cojo
100 microlitro de diluyente de la muestra y 20 microlitros
del suero del paciente y se coloca en los pocillos
3. Primera incubación: en una cajita, soporte plástico, se hace
una cámara húmeda y se lleva a la estufa 1h o media hora a
37° la estufa.
4. La saco y lavo 5 o 6 veces la muestra que fue incubada.
Coloco la enzima de rábano picante (segunda incubación) y
la inoculo 1hora, lavo 5 veces.
5. Y ponemos el sustrato TMB (TETRA METIL BENZIDENO) en una estufa durante 15min y se hace los
pocillos de color azul
6. Tercera incubación: Colocamos con un gotero la solución de stop y se pone 100 microlitro en cada
pocillo y se para la reacción.
7. Listo para su uso en donde se observa amarillo anaranjado en los pocillos que se encuentra el
anticuerpo especifico poli o monoclonal que captura el antígeno de la muestra, al ponerle la enzima
el TMB o sustrato dará la detección colorimétrica
Interpretación
Para la detección de la IgM especifica se emplea un ELISA de captura en fase solida en el cual se absorben
sobre esta (policubeta, tubo o perla) los anticuerpos específicos anti-cadena u, luego, se añade el suero en
estudio y toda la IgM presente será absorbida. Posteriormente, se agrega el antígeno viral que se unirá a la
IgM especifica. La presencia o ausencia del antígeno unido se revela mediante la marcación enzimática del
mismo o de un anticuerpo anti-antigeno. La detección de IgM especifica se usa habitualmente para
diagnóstico de infección reciente por rubeola, citomegalovirus humano, virus hepatitis A, virus Epstein
Barr, etc.

WESTERN BLOT
La técnica de western blot= mancha en papel. (INMUNOTRANSFERENCIA)

¿QUE DETECTA?
Detecta proteínas virales, es decir los antígenos de los virus presentes en suspensiones virales o en células
infectadas, así como también detecta anticuerpos específicos presentes en el suero del paciente.. Prueba
de oro para VIH.
Principio
 1. Separación de los Antígenos de lisado viral con sulfato de sodio dodecil (SDS) y electroforesis en gel
de poliacrilamida (PAGE)
2. Transferencia (absorción) de los antígenos separados a papel de nitrocelulosa
3. Prueba de la muestra del suero desconocido directamente en la membrana absorbente utilizando
una técnica similar a la Elisa
Procedimiento
1. Añadir 2ml de TAMPÓN DE LAVADO DILUIDO a
cada pocillo.
2. Utilizando unas pinzas extraiga con cuidado del
tubo las TIRAS DE NITROCELULOSA necesarias y
coloque cada tira en su pocillo con el numero
hacia arriba.
3. Incube las tiras durante 1 o 2 min a
temperatura ambiente en un plato basculante.
Extraer el tampón por aspiración.
4. Añada 2ml de TAMPÓN BLOTTING DE TRABAJO
a cada pocillo.
5. Añada 20 microlitros de suero de pacientes en cada uno de los pocillos.
6. Cubra la bandeja con la tapa suministrada e incube durante 1 hora a temperatura ambiente en el plato
basculante.
7. Aspirar la mezcla de los pocillos. Evitar contaminaciones.
8. Lave tres veces cada tira con 2ml de TAMPÓN DE LAVADO DILUIDO, dejando que se empapen durante
5min en la plataforma basculante.
9. Añada 2ml de SOLUCIÓN DE CONJUGADO DE TRABAJO a cada pocillo.
10. Cubrir la bandeja e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en la plataforma basculante.
11. Aspire el Conjugado de los pocillos y lavar tres veces.
12. Añadir 2ml de SUSTRATO a cada pocillo.
13. Cubra la bandeja e incube durante 15min en la plataforma basculante.
14. Aspire el sustrato y lavar tres veces.
15. Utilizando pinzas, coloque las tiras con suavidad sobre paños de papel, cúbralas y séquelas con cuidado.
16. Coloque las tiras en una hoja de trabajo y Observe las bandas calificando los resultados.

Interpretación
Se interpretarán tres bandas, que reflejarán los genes del VIH (ENV, GAG, POL), esas bandas son las proteínas
de cada gen.
▪ Calle 1: Resultado negativo (ninguna banda especifica presente). O solo aparece la p17
▪ Calle 2: Resultado indeterminado (se observa una única banda que reacciona contra la proteína p17
viral). Puede aparecer una sola banda de cualquier proteína viral ejemplo p24
▪ Calle 3: Resultado positivo.
Calle (-): Control negativo.
Calle (+): Control positivo.
Se requiere la presencia de al menos dos de las bandas correspondientes a los antígenos p24, gp41/gp120
y/o gp160 reconocidos por los anticuerpos presentes en el suero del paciente, para que se informe como
positivo.
Se utilizan tiras que se exponen al suero del paciente, después de una incubación se lavan y se vuelven a
incubar con una IgG antihumana marcada con una enzima (conjugado), se lavan y posteriormente con la
exposición de un revelador enzimático (sustrato de la enzima o cromógeno) producirá una banda coloreada
(azul-violeta) en las zonas correspondientes a los anticuerpos específicos que contenga la muestra del
paciente en estudio.
La banda de control interno se encuentra junto al extremo no numerado de la tira y permite validar la adición
de la muestra y de los reactivos, así como un buen desarrollo del método. Se debe observar cuidadosamente
las tiras, ya que pueden contener un número variable de bandas; por lo tanto, debe comparase cada tira
problema simultáneamente con el corrimiento de un suero control NEGATIVO y un suero control POSITIVO.

INMUNO FLUORESCENCIA INDIRECTA, INHIBICIÓN DE HEMAGLUTINACION, FIJACIÓN

DEL COMPLEMENTO
ARCINIEGA GUERRERO DARLYN
InmunoFluorescencia Indirecta:
Principio de la prueba:
La técnica indirecta utiliza anticuerpos especificos no marcados y lucgo de lavados éstos, se
incuban las muestras con anticuerpos conjugados con fuorocromos y dirigidos contra la especie
animal en la que se preparó el antisuero viral a tecnica indirecta es generalmente más sensible que
la directa pues los anticuerpos especificos adheridos a los antigenos virales pueden incrementar el
numero de uniones a los anticuerpos marcados. Asimismo, requiere sólo anticuerpos macados
contra la cspecie animal y no para cada muestra de Virus individual Sin embargo se necesitan más
controles y pasos en esta reaccion.
Los resultados positivos por son aquellos que demuestranuna tincion especifica de la celula
intectada, documentando la presencia de antipgenos en distintas localizaciones celulares (nucleo
Citoplasma o membrana) a I es ampliamente utiizada en ediagnostico virologico tanto para la
deteccion rapida de antigenos virales en muestras clinicas como para diagnostico serologico
Interpretación y utilidad:
Esta técnica utiliza anticuerpos específicos marcados con fluorocromos como isotiocianato de
fluoresceína, rodamina, rojo Texas u otros. La reacción antigeno-anticuerpo se visualiza usando un
microscopio con luz UV Es altamente específica y rápida
Permite la detección de anticuerpos específicos virales en el suero del paciente por medio de un
furocromo isotiocianato de fluoresceína, el principio está basado en una lámina portaobjeto con
pocillos circunscritos en el cual se pone la muestra del paciente ac no conjugado, se lava, se lo deja
media hora, se coloca el conjugado fluoresceína, se lava cuatro veces y se lee los resultados. Las
ventajas son que permite diagnosticar en pocas horas, tiene elevada sensibilidad del 70%, y es de
fácil realización. Sus desventajas son de alto costo del microscopio de IF y dificultad para
interpretarse.
Procedimiento:
Preparación de la muestra cortada por criostato en portaobjetos, Incubación con antisueros
específicos a 37C a 30 min, Lavado que elimina anticuerpos no fijados, Agregado del anticuerpo
conjugado con fluoresceína Igs, Incubación por media hora más. Lavar.

Inhibición de la Hemaglutinación:
Principio de la prueba:
Si se hace reaccionar un virus con capacidad de hemaglutinación con su anticuerpo especifico,
este anulara su capacidad de hemaglutinacion por bloqueo de las hemaglutininas presentes en la
envoltura del virión. Este fenómeno se llama inhibición de la hemaglutinacion y es utilizado con
frescuencia para identificar virus y en estudios serológicos para determinar la presencia de
anticuerpos inhibidores de la hemaglutinacion
Interpretación y utilidad:
Anticuerpos IHA se producen como respuesta a la infección con virus que presenta hemaglutinina
en su envoltura, los anticuerpos IHA son tipo específicos, aparecen tempranamente luego de la
infección y persisten por varios años. Son de fácil detección ya que no son necesarios cultivos
celulares. Se puede utilizar para rubéola, sarampión, influenza, parainfluenza, parotiditis,
adenovirus y algunos enterovirus.
Procedimiento:
Rotular las placas, Anadir de BABAS, Añadir suero tisular, Diluir sueros con pipeta, Añadir a
pozuelos dilución del antígeno con 8 unidades hemaglutinantes, Agitar y dejar reposar temperatura
ambiente 45 min, Añadir glóbulos rojos diluidos en ph óptimo para el virus, Agitar y dejar reposar
por 30 min.
Fijación del Complemento:
Principio de la prueba:
Esta técnica detecta antígenos virales solubles, obteniéndose generalmente reacciones cruzadas
dentro de las familias, géneros o serotipos que comparten antigenos.
Se basa en la capacidad del conocimiento para unirse a los complejos Ag-Ac, su utilidad se basa
en que permite detectar anticuerpos contra antígenos internos del virus.
Interpretación y utilidad:
Dada la baja sensibilidad del metodo, su relazion compleja y la restringida duracion de los
anticuerpos fijadores de complemento, esta tecnica no se utiliza en la actualidad, habiendo sido
reemplazada por otras como IFI o diversos ELISASs.
Procedimiento:

NESTED PCR O PCR ANIDADA---NICOLE AREVALO

Diseñada para aumentar la especificidad. Esta modificación consta de dos grupos de cebadores
dirigidos contra la misma diana:
1. El primer grupo de cebadores se desarrolla de la manera usual (5’ a 3´)
2. el segundo grupo son cebadores situados internamente o anidados con respecto al primer
grupo
En una primera ronda, se amplifica de manera convencional con los dos cebadores más externos
a la región que se desea amplificar. Seguidamente, el producto de este primer PCR se utiliza como
molde para una segunda ronda, la cual utiliza cebadores internos a la región previamente
amplificada. La sensibilidad de la PCR anidada es extremadamente alta debido al proceso de
amplificación dual. La mayor desventaja de esta reacción es el alto riesgo de contaminación
cruzada durante la transferencia de los productos de amplificación de la primera ronda a un
segundo tubo de reacción.
La especificidad de la PCR anidada depende, fundamentalmente de la temperatura empleada en
la fase de hibridación y de la cantidad de iones divalentes que se incorporan a la reacción (además
de depender de la secuencia de los cebadores)
Hay estudios en donde la PCR anidada ha sido una herramienta valiosa y complementaria para el
diagnóstico de la histoplasmosis en pacientes con SIDA, utilizando muestras de médula ósea.

RT- PCR
La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), se retrotranscribe una
hebra o cadena o banda de ARN en ADN complementario (ADNc) usando
una enzima llamada transcriptasa inversa o transcriptasa reversa, asi se van agregando los
desoxirribonucleótidos y posterior a esto se va hibridar la cadena de ARN para que asi solo quede
la cadena complementaria del ADN y el resultado se amplifica mediante una PCR tradicional.
Es el método con mayor capacidad de detección de los disponibles para la medida de la expresión
génica in vitro
Los principales usos de la RT-PCR están relacionados con el campo del diagnóstico molecular y
con la investigación científica. Puede utilizarse como método de detección molecular de genes,
para estudiar el genoma de virus de ARN como los retrovirus (por ejemplo, el VIH, a o el virus de
la gripe (el virus de la influenza, Orthomyxoviridae).
Otro de sus usos se relaciona con la cuantificación de la expresión génica, mediante la combinación
de esta técnica con el análisis de Northern blot.

PCR EN TIEMPO REAL

La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real es la técnica más sensible para la detección
de ácidos nucleicos (ADN y ARN). La PCR en tiempo real se basa en el principio del método de la
PCR desarrollado por Kary Mullis en la década de los 80, que permite detectar ADN a partir de
pequeñas cantidades, amplificándolas hasta más de un billón de veces (Mullis 1990).
El fundamento radica en amplificación, detección y cuantificación simultanea de ADN por
fluorescencia que posee equipo para monitorear generación de productos de amplificación de
material genético.
La PCR en tiempo real es una técnica que combina la amplificación y la detección en un mismo
paso, al correlacionar el producto de la PCR de cada uno de los ciclos con una señal de intensidad
de fluorescencia. Posee características importantes como:
• alta especificidad,
• amplio rango de detección (de 1 a 107 equivalentes genómicos de la secuencia blanco).
• rapidez en la visualización del producto ya que no es necesario realizar una electroforesis
posterior.
Se cuantifica el número de ciclos que han sido necesarios para alcanzar una cantidad prefijada de
DNA productos, La cuantificación depende de sondas de hibridación
 Los equipos para llevar a cabo la PCR en tiempo real incluyen
un termociclador y una unidad capaz de detectar señales
fluorescentes (fluorómetro) para monitorear el progreso de la
reacción de amplificación, así como un Hardware y un Software
para la captura y el análisis de los datos, respectivamente. El
termociclador del equipo debe ser capaz de mantener una
temperatura uniforme para todas las muestras y ser lo
suficientemente rápido en la transición de temperaturas de una
etapa a otra (desnaturalización del ADN molde, alineamiento de
los oligonucleótidos y síntesis). El sistema fluorométrico
consiste en una fuente de energía para excitar a los fluoróforos
(a una determinada longitud de onda de excitación) y un
sistema de detección, que permita monitorear la señal emitida (a una longitud de onda de emisión).
La fuente de energía que proporciona la luz de excitación para los fluoróforos puede provenir de
una lámpara (tungsteno), una resistencia (diodo emisor de luz) o un láser

Sondas de hibridación
Entre las más utilizadas se encuentran las sondas TaqMan que se conocen también como sondas
5’ nucleasas (ya que utilizan la actividad 5’ exonucleasa de la ADN polimerasa). En este sistema
se utiliza una sonda, es decir, un oligonucleótido específico (~20 bases) para la secuencia del gen
de interés marcado con dos fluoróforos, un reportero unido al extremo 5’ y un apagador en el
extremo 3’. La longitud de la sonda es la distancia entre los dos fluoróforos, de manera que la
fluorescencia del reportero está apagada por el fenómeno FRET. La actividad 5’ exonucleasa de la
ADN polimerasa corta los nucleótidos de la sonda durante la amplificación, los fluoróforos se
separan y se observa la señal de fluorescencia. Es decir, la hidrólisis de la sonda provoca un
incremento en la señal del reportero y ésta aumenta proporcionalmente al incremento del amplicón.
Algunos ejemplos de fluoróforos reporteros son FAM, VIC y NED, entre los apagadores se
encuentran TAMRA, DABCYL y BHQ

La PCR en tiempo real se ha convertido en una herramienta común en la investigación básica, la

industria, la agricultura, la medicina forense y la clínica, mismas que se han visto beneficiadas por
la sensibilidad, velocidad y especificidad de este método.
 METODOS DE HIBRIDACIÓN
Las técnicas de hibridación molecular se basan en el estudio de secuencias específicas del DNA o
RNA, tanto para su identificación como para su eventual cuantificación. Para realizarlas se parte de
sondas que son secuencias de DNA o de RNA, complementarias a aquellas; que se quieren
detectar.

DOT BLOT Y SLOT-BLOT

Es el más simple, consiste en transferir directamente el ADN a la membrana sin haber realizado
previamente rotura del ADN ni electroforesis e incubarlo con sondas de ADN complementarias a
las secuencias de ADN que buscamos (que contengan las mutaciones que buscamos). En este
método cada muestra se coloca en un punto determinado (“dot”) y posteriormente se desnaturaliza
para que la hibridación pueda tener lugar
el ADN parcialmente purificado de la muestra problema es sembrado sobre un filtro de nitrocelulosa
o nylon y fijado mediante calor o radiación ultravioleta. Existen dispositivos que permiten la
aplicación del acido nucleico a estudiar en el filtro a través de pequeñas ranuras (slot) produciendo
manchas con dicha forma luego de la hibridación con la sonda marcada y posterior revelado.
Se realiza en pruebas de heces sangre o esputo
Si es gota a gota: dot blot y si son manchas alargadas: slot blot
SOUTHERN BLOT
Southern es un método de biología molecular que permite detectar la presencia de una secuencia
de ADN concreta en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Para ello, emplea la técnica
de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar los fragmentos de ADN de acuerdo a su
longitud y,
después, una
transferencia a
una membrana
en la cual se
efectúa la hibridación de la sonda.
PASOS
1. Extracción del ADN
Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de ADN en la escena
de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima muerta, células del folículo capilar y
saliva. El ADN extraído de las pruebas del delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con
el extraído de muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la
sangre.
2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción
El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que es una enzima
que corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia característica. La enzima que se usa
más frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'.
3. Electroforesis en gel de agarosa
Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño
mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que
poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su
velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores se
mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado, se
produce una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo
que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de
aplicación de la muestra.
4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot")
Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en
el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución alcalina. Tras la neutralización de esta, el
DNA monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando
así una copia o "calco" (la traducción más literal del inglés blot, conservando este sentido, es
"secante"). Este proceso de desnaturalización y transferencia se conoce como método de Southern
en recuerdo de quien lo inventó, Edward Southern. Al igual que la aplicación de un secante a un
papel con la tinta húmeda transfiere una réplica de la imagen del papel al secante, el "calco" del
ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la distribución espacial de los fragmentos de ADN
conseguida en el gel como resultado de la electroforesis.
5. Hibridación con sonda radioactiva
Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar (es decir, de
formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de restricción concreto en
el ensayo de Southern. La formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del
emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente
en el "calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo radiactivo para
facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locus genético polimórfico en un solo
cromosoma humano. El ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución
que contiene una sonda radiactiva de locus único, bajo condiciones de temperatura y concentración
de sales que favorezcan la hibridación. Tras producirse esta, se lava el exceso de sonda no unido,
de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al ADN
del locus diana.
6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía
Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de Southern
se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica, la membrana de nailon se coloca, una vez
lavada, junto a una película de rayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra
las posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico, el
registro resultante de la hibridación de Southern se conoce como autorradiografía
7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales
En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios cromosomas
diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía para la primera sonda, se puede lavar la
radiactividad con una disolución a elevada temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo
con una segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7,
detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autorradiografías de una misma transferencia
de Southern se conoce como un "perfil de ADN"

NORTHERN BLOT
Northern blot, es una técnica de detección de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de una
secuencia dada dentro de una mezcla compleja (por ejemplo, un ARN mensajero para
un péptido dado en una muestra de ARN total). Para ello, se toma la mezcla de ARN y se somete
a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos de acuerdo con su tamaño. Tras esto,
se transfiere el contenido del gel, ya resuelto, a una membrana cargada positivamente en la que se
efectúa la hibridación de una sonda molecular marcada radiactiva o químicamente.
El procedimiento general comienza con la extracción del ARN total de una muestra de tejido
homogeneizado. El ARNm se puede aislar mediante cromatografía para retener solamente los ARN
con colas de poli(A). Las muestras de ARN se separan entonces mediante electroforesis en gel.
Dada la fragilidad de los geles y la dificultad para que las sondas penetren en la matriz, las muestras
de ARN, separadas por tamaño tras la electroforesis, se transfieren a una membrana de nailon,
bien por capilaridad o empleando un sistema de vacío.
Una membrana

de nailon cargada positivamente es el soporte más eficaz para realizar la hibridación en el northern
blot ya que los ácidos nucleicos, que están cargados negativamente, tienen una alta afinidad por
estas membranas. El tampón de transferencia que se usa en el ensayo suele contener formamida,
dado que esta reduce la temperatura de interacción de las muestras, lo que evita la utilización de
altas temperaturas que podrían desnaturalizar las moléculas de ARN. Una vez que el ARN se ha
transferido a la membrana, se inmoviliza mediante enlaces covalentes formados con la membrana,
lo cual se consigue por medio de luz ultravioleta o calor. Después del marcaje de la sonda, ésta se
hibrida con el ARN en la membrana. Las condiciones experimentales que pueden afectar la
eficiencia y especificidad de la hibridación están determinadas por las condiciones iónicas, de
viscosidad, la presencia de ARN bicatenario, bases desemparejadas y composición de las mismas.
Finalmente, la membrana debe lavarse para asegurar que la sonda se ha unido de forma específica
y para evitar ruido de fondo en las señales emitidas por la misma. Estas señales pueden
cuantificarse mediante densitometría. Para crear controles y poder asegurarnos de que no se están
mostrando genes que no nos interesen se puede realizar posteriormente la determinación
empleando chips de ADN o RT-PCR.
 El RNA puede correr en un gel de agarosa para mostrar las
subunidades ribosomales 28s (banda superior) y 18s (banda
inferior).

El ensayo northern permite observar un patrón particular de expresión genética entre tejidos,
órganos, estadios del desarrollo, niveles de estrés ambiental, infecciones causadas por patógenos
y durante el curso del tratamiento de las mismas. Esta técnica se ha utilizado para mostrar la
sobreexpresión de oncogenes y la desregulación de genes oncosupresores en células
cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales.
Los patrones de expresión obtenidos nos ayudan a conocer las funciones de los genes. Desde que
el RNA se separó por su tamaño, las sondas contra el mismo pueden darnos una idea de su
tamaño, sugerir ayuste alternativo, o motivos repetidos en la secuencia.