GENÉTICA DE LA FIJACIÓN

DE NITRÓGENO Y
SIMBIOSIS MICROBIANA

Prof.Débora Alvarado Iparraguirre

Curso: Genética Microbiana

Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
 N2 atmosférico total 1015 ton
Ciclo transforma 3 x 109 ton N2 / año

Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
Jarrell et al., 2011
Importancia de la Fijación del
Nitrógeno en la naturaleza
• El gas Nitrógeno (N2) conforma el 79% de la
atmósfera pero no es directamente utilizable
por la mayoría de organismos.
• El Nitrógeno es requerido por todos los
organismos vivos, pero solamente algunos
pueden fijarlo de la atmósfera.
• El Nitrógeno es con frecuencia un nutriente
limitante en los ecosistemas de suelo.

Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
Colonización de pelo radical
por Azospirillum brasilense

Microfotografía
de transmisión

Marcación con sonda alfa1b

marcado con rodamina y
microfotografía de epifluorescencia
con imagen de rastreo confocal
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
 Bioquímica de la Fijación de Nitrógeno
945 KJ/mol No reactivo
__
N __
__ N
No disponible
metabolicamente
Altamente estable

Dinitrogenasa
N2 + 4H+ + 4NADPH + 16-24ATP → 2 NH3 + 4NADP+ + 16-24ADP + 6Pi

Fijadores de N2 Diazotrofos
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
 Complejo
enzimático
reductasa

Sistema
Nitrogenasa Pasos para la fijación
del N2:reducción de
N2 a 2NH3
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
 Nitrogen – fixing
bacteria
Nitrogenase
(Fe, Mo or V)

N2 NH4+
Nitrite reductase Nitrifying
(Fe) Nitrogen bacteria
NO2- NO3-

Denitrifying Nitrate reductase

(Fe, Mo)
bacteria

Las más importantes enzimas para la asimilación

del N requieren Fe.
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
 Complejo enzimático
Nitrogenasa
• Dos proteinas están involucradas en el
complejo, cada una con subunidades múltiples.
• Dinitrogenasa, proteína que contiene Molibdeno y
Fierro (2 Mo/molécula, 22-24 Fe/molécula)
• Dinitrógeno reductasa, proteína que contiene Fierro
y Azufre (4 Fe/molécula, 4 S/molécula).
• En células que fijan nitrógeno, 10 al 40% de las
protéinas celulares pueden ser nitrogenasas.
• El proceso es relativamente lento y requiere
1,25 seg para formar dos moléculas NH3.

Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
• La energía requerida para romper la molécula
de N2 (16 ATP aprox), es una inversión
significativa de energía de las células.
• Cerca de 15 mg N2 es fijado por cada gramo de
carbono consumido para energía.
• Los organismos aeróbicos son más eficientes que
los organismos anaeróbicos.
• La producción de amonio industrial requiere
altas temperaturas (500oC), alta presión (~200
atm), y un catalizador (usualmente Niquel).
• La producción de una tonelada métrica de NH3
requiere energía e hidrógeno de combustibles
tales como gas natural (31,000 ft3 ), o petróleo (5.5
bls) o carbón mineral (2 Tm).

Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
La enzima nitrogenasa funciona a
temperatura y presión ambiental.

Proceso biológico eficiente.

Es un proceso presente en la
naturaleza antes de la fotosíntesis
Heterocisto

Adaptaciones morfológicas y de comportamiento de

cianobacterias en relación a la fijación del N2
Berman-Frank 2003
Res Microbiol 154:157–164
Los nódulos proveen un ambiente para los
microorganismos. La planta provee los
substratos orgánicos necesarios y protege a
los organismos del oxígeno por la presencia Células fijadoras de N2
de leghemoglobina (compuesto rojo
parecido a la hemoglobina).
Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
 Straight, 2009
Annu. Rev. Microbiol.. 63:99

Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
 Mecanismos
de protección
para la
nitrogenasa
contra el O2
Azotobacter
vinelandii.

Sabra, 2000
Appl Environ Microbiol 66:4037

Lab.Microbiol.Molecular y
Biotecnología-UNMSM
 Vista superficial, en microfotografía electrónica, de
células de Azotobacter vinelandii crecidas a 2.5 y 20% de
saturación de aire en un quimiostato con limitacion de
fosfato. PHB, poli-b-hidroxibutirato.

Lab.Microbiol.Molecular y Biotecnología-UNMSM
Lab.Microbiol.Molecular y
Biotecnología-UNMSM
Lab.Microbiol.Molecular y
Biotecnología-UNMSM
 Uridililtransferasa
Efector Regulación de la
N alostérico
Fijación del N2
Vía de
regulación de
nitrógeno
global
NifL, regulador
negativo de expresión
Vía de genes nif (inhibe NifA)
regulación de en proteobacterias.
oxígeno global Nif A, activador
Oxida transcripcional cataliza
Flavoproteina
NifL actividad de RNA
O2 polimerasa con factor
sigma 54 (regulación
Lab.Microbiol.Molecular y dual)
Biotecnología-UNMSM
Inhibición por O2
Fijación de Nitrógeno en Swain & Abhijita 2013
presencia de Oxígeno J.Global Biosciences 2(5), pp. 98-112

Schematic representation of nitrogen fixation in

Streptomyces thermoautotrophicus
 Swain & Abhijita 2013
J.Global Biosciences 2(5), pp. 98-112

• Los avances recientes en la comprensión de la fijación de

nitrógeno endosimbiótico y endofítico con plantas no
leguminosas pueden representar nuevas vías originales y
alternativas para la ingeniería de cultivos de no leguminosas
que fijan nitrógeno.
• Comprender el mecanismo molecular de la fijación de nitrógeno
fuera de la simbiosis leguminosa-rizobio podría tener
importantes implicaciones agronómicas y permitir reducir o
incluso evitar el uso de fertilizantes nitrogenados.
• Una mejor comprensión podría conducir a una explotación más
sostenible de la biodiversidad de los organismos fijadores de
nitrógeno a corto plazo y, a más largo plazo, a la transferencia
de capacidades endosimbióticas de fijación de nitrógeno a los
principales cultivos no leguminosos.
 Revisando el concepto de simbiosis
• Etimológicamente:
• sym, juntos
• bio, vida
• Es una red de interacciones entre organismos
sobre un continuo entre efectos beneficiosos y
dañinos.

Un continuo:

parasitismo comensalismo mutualismo

 Ejemplo de endosimbiosis

One cell
containing
numerous
autotrophic
algal cells

Vorticella (protozoan) under ~5µm

compound light microscope
Scanning electron microscope
 Symbioses between plants and bacteria
Bacteria Example effect on plant physiology

Many are parasitic, but Rhizobium

is mutualistic
 Exposure to mycorrhizal fungi
Mycorrhizae __
+
Myco=fungus,
rhiza=root

• Fungus gets carbohydrates from plant

• Plant gets better nutrient absorption
• Both have protective effects on the other
White pine (Pinus)
 Franche 2009
Plant Soil 321:35–59

• Intercambio de señales en la simbiosis Rhizobium-planta.

• Los flavonoides producidos por la planta huésped actúan sobre los genes
nod rizobianos. Esto conduce a la producción de factores Nod.
• La figura anexa muestra un hilo de infección que pasa por la corteza de
la raíz hacia un grupo de células en división que se convertirá en un
promordio de la raíz.
Tikhonovich & Provorov, 2009
Ann Appl Biol 154 341–350
 microbial‐associated molecular patterns (MAMPs)
Secreted fungal effectors , fungal proteins (MiSSP)

Signaling molecules and their role at different stages of the

establishment of mutualistic ectomycorrhizal interactions.
 Nyholm, 2004
Nature Rev Microbiol 2:632
 Flórez, 2015
Nat. Prod. Rep., 32, 904

Types of defense mechanisms in animals mediated by

ectosymbionts (including those in the gut and in the proximate environment
of the host) or endosymbionts (intra- or extracellular) against different
possible antagonists (described or likely effective against).
 Cladogram of selected animal
groups highlighting those with
described defensive microbial
symbionts and the
corresponding symbiont taxa.
Colored circles represent the
major biosynthetic pathways
reported for symbiont-
produced compounds.
Common names in brackets
denote selected groups within
the respective taxon that
harbor known defensive
symbionts.

Flórez, 2015
Nat. Prod. Rep., 32, 904
A graphical summary of the genome evolution events in
Spiroplasma and its derived lineages
 AMP,
antimicrobial
peptides;
LPS,
lipopolysaccharide;
PGN,
peptidoglycan;
PSA,
polysaccharide A;
SCFA,
short-chain fatty
acids;
TMA,
trimethylamine oxide
AVANCES EN INVESTIGACIÓN
SOBRE SIMBIOSIS
Some examples for symbioses between Archaea and other
organisms (red Archaea, green Bacteria, blue-unicellular
Eukarya, and metazoans). Wrede et al. 2012
Archaea Article ID 596846, 11 pp
Perspectivas de investigación
• Plantas transgénicas con genes de la
nitrogenasa para su aprovisionamiento de
nitrógeno, particularmente de nitrogenasas no
sensibles al oxígeno.
• Identificación, selección y mejoramiento
genético de bacterias diazotróficas asociadas
a plantas.
• Más móviles y con mayor capacidad de
adherencia.
• Con mayor tolerancia a estreses edáficos: acidez,
salinidad y alta temperatura.
• Reto, asociación con otra flora simbionte como las
micorrizas.
Perspectivas de investigación
• Uso de diazotrofos en biorremediación de derrames
de petróleo.
• Búsqueda de nuevos productores de nitrogenasas .
• Reto, búsqueda de enzimas con menor requerimiento
energético y menos sensibilidad al O2.
• Utilización de simbiontes bacterianos para la
manipulación de características nocivas de insectos
vectores.
• Estudio de nuevas relaciones simbióticas para la
comprensión de sus complejos mecanismos
evolutivos. La utilización biotecnológica de los
hallazgos es obvia.