Gicela Mazabuel Solarte, COD.

102113011122
Departamento de química
Bioquímica avanzada
Procedimientos de identificación y cuantificación de citoquinas y/o quimiocinas
Las citocinas son proteínas de bajo peso molecular producidas por células inmunes y no inmunes
en respuesta a un estímulo externo. No obstante, las quimiocinas son también conocidas como
«citocinas quimiotácticas» que son pequeñas proteínas ligadas a la heparina.

Las citocinas y quimiocinas están involucradas en prácticamente todas las facetas de la inmunidad
y la inflamación, incluida la inmunidad innata, la presentación de antígenos, la diferenciación de la
médula ósea, el reclutamiento y activación celular y la expresión de moléculas de adhesión.  Las
citocinas que se producen en respuesta a una agresión inmunitaria determinan inicialmente si se
desarrolla una respuesta inmunitaria y posteriormente si esa respuesta es citotóxica, humoral,
mediada por células o alérgica. Se puede ver una cascada de respuestas debido a la expresión de
las citocinas y, a menudo, se requieren varias citocinas para sinergizar y expresar una función
óptima(Borish & Steinke, 2003). Una variable de confusión adicional en la disección de citocinas ,
es la cuestión de que cada citocina puede tener una función completamente diferente,
dependiendo de la fuente celular, el objetivo y, lo más importante, la fase específica de la
respuesta inmune durante la cual se presenta(Zeng et al., 2012). Todas estas variables conducen a
la necesidad fundamental de conocer métodos de identificación y cuantificación para la evaluación
de citocinas en fluidos corporales, células o tejidos que proporcionen información importante para
comprender los procesos celulares complejos, como inflamación, cáncer y enfermedades
autoinmunes y de esta forma diseñar estrategias de tratamiento.

Es bien conocido que las citocinas inducen efectos biológicos en microambientes seleccionados del
cuerpo incluso en cantidades mínimas (10 -10 - 10-15 M) pero al mismo tiempo son poderosos
mediadores en la alteración de la respuesta inmune frente a infecciones o induciendo
inflamación(Zeng et al., 2012). La biología de las citocinas es muy compleja debido a una variedad
de factores, como la vida media corta, las concentraciones plasmáticas bajas, la pleiotropía, la
redundancia, la variación en sus efectos sistémicos y locales y aún queda mucho por aprender.

La identificación y clasificación de citoquinas ha pasado por 3 fases de desarrollo. Inicialmente, las

citocinas se identificaron puramente por sus actividades biológicas, que reflejan esa actividad (Ej.,
Factor de crecimiento de células T). El desarrollo de estrategias de clonación y la capacidad de
generar proteínas recombinantes purificadas (Ej., IL-2) llevaron al reconocimiento de lo confusa
que resultan algunas variables, debido que la acción de las citocinas es pleiotrópica, es decir,
pueden actuar sobre una variedad de dianas celulares, y redundante, es decir, el mismo efecto
biológico puede estar mediado por varias citocinas distintas. Posteriormente, las citocinas se
identificaron sobre la base de sus patrones de expresión únicos, como en los linfocitos T auxiliares
activados. Esta fase de clonación recombinante condujo a gran parte de nuestro conocimiento
actual de las citocinas. Sin embargo, la biología de las citocinas ahora ha evolucionado hacia una
tercera fase impulsada principalmente por la genómica y, en particular, el proyecto del genoma
humano. Con la identificación del repertorio completo de genes humanos, ahora se está aplicando
un gran esfuerzo para asignar una función a la enorme biblioteca de proteínas previamente no
reconocidas. En la actualidad, se han propuesto al menos 70 citocinas candidatas. Una vez que se
logra la identificación y el consenso con respecto a la actividad biológica de cada candidato, se
asigna una nomenclatura de citocinas(“Laboratory for Clinical and Biological Studies, University of
Miami-Miller School of Medicine, Miami, Florida 33136,” 2007).

Sobre la base del tipo de respuesta inmune provocada, las citocinas se han clasificado en tipo Th1,
Th2 o Th3. El tipo de citocinas Th1 incluye interleucina-12 (IL-12), IL-2, interferón gamma (IFN-γ) y
factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), con IL-12 jugando un papel central en la eliminación de
infecciones intracelulares, causada por virus o parásitos, modulación de enfermedades
autoinmunes específicas de órganos o mediación del rechazo de aloinjertos. Recientemente, se ha
identificado que la IL-23 y la IL-27 contribuyen a las respuestas inmunitarias Th1, pero sus
mecanismos son diferentes a los de la IL-12. El tipo de citocinas Th2 incluye; IL-3, IL-4, IL-5 e IL-13
que participan en la promoción de respuestas mediadas por anticuerpos. La tercera clase de
citocinas, Th3, incluye mediadores reguladores como IL-10 y factor de crecimiento transformante
beta (TGF-β) que son responsables de mantener un equilibrio en el microambiente del huésped.
Algunas de las citocinas recientemente descubiertas, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 e IL-26, se han
clasificado en la familia de citocinas relacionadas con IL-10. Las búsquedas de nuevas citocinas
ahora se realizan a menudo a nivel del ADN, identificando genes similares a los genes de citocinas
conocidos(“Laboratory for Clinical and Biological Studies, University of Miami-Miller School of
Medicine, Miami, Florida 33136,” 2007).

A partir de 2019, se identificaron unas 750,000 publicaciones revisadas por pares para "citocinas o
quimiocinas". Se citan 100.000 en una búsqueda de "citocina o quimiocina Y
biomarcador"(Manglani et al., 2019). Hoy en día, se encuentra disponible una amplia gama de
ensayos de citocinas, que incluyen:

 Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

 Radioinmunoensayo (RIA)
 Quimioluminiscencia
 Bioensayos de citocinas
 Citometría de flujo multiparamétrica
 Cuantificación o aislamiento basado en perlas magnéticas de células productoras de
citocinas
 Ensayos basados en ARNm; Transcriptasa inversa cuantitativa ligada: reacción en cadena
de la polimerasa (RT-PCR), transferencia Northern, hibridación in situ (ISH), ensayos de
protección de ARNasa (RPA)
 Tinción de citocinas intracitoplásmicas (ICC)
 Inmunospot ligado a enzimas (ELISPOT)
 Inmunotinción; Inmunofluorescencia, inmunocitoquímica
 Microarrays de citocinas; Microarrays de ADN, Microarrays de proteínas

Medición de citocinas (directas) o receptores de citocinas solubles (indirectos) en los fluidos

biológicos o sobrenadantes celulares.

 Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)

Si bien hay muchas herramientas disponibles para evaluar la producción de citocinas y
quimiocinas, la más utilizada es ELISA. Este tipo de ensayos se desarrollan para cumplir con las
especificaciones estándar de la industria que incluyen calibración estándar, precisión, sensibilidad,
especificidad, recuperación, consistencia de lote a lote y paralelismo para la cuantificación de
citocinas y quimiocinas, en donde generalmente se miden mediante un ELISA tipo sándwich. El
método básico de ELISA tipo sándwich de citoquinas utiliza anticuerpos anti-citoquinas altamente
purificados (anticuerpos de captura) que se adsorben de forma no covalente ("recubiertos",
principalmente como resultado de interacciones hidrófobas) en placas de micropocillos de
plástico. Los anticuerpos inmovilizados sirven para capturar específicamente las proteínas de
citocina solubles presentes en las muestras que se aplicaron a la placa. Después de lavar el
material no unido, las proteínas de citocina capturadas se detectan mediante anticuerpos anti-
citocina conjugados con biotina (anticuerpos de detección) seguido de la adición de una avidina o
estreptavidina marcada con enzima. Después de la adición de un sustrato cromogénico, el nivel de
producto coloreado generado por los reactivos de detección ligados a enzimas unidos se puede
medir convenientemente espectrofotométricamente usando un lector de placas ELISA a una
longitud de onda apropiada(Kain, 2005).

 Radioinmunoensayo (RIA)

RIA es muy sensible y preciso en la cuantificación de citocinas en muestras biológicas. Como

cualquier otro inmunoensayo, RIA o ensayos inmunorradiométricos (IRMA) requieren anticuerpos
específicos de citocinas marcados y / o citoquinas marcadas o sus receptores con un radioisótopo
(principalmente 125I) seguido de detección. El RIA basado en microplacas se puede contar rápida y
fácilmente en los contadores de centelleo beta, mientras que los ensayos configurados en tubos
de ensayo se pueden contar en los contadores gamma.

Otro tipo de RIA, los ensayos de radio-receptor (RRA) miden las concentraciones de citocinas al
desplazar ligandos de los receptores unidos a las células. El método se desarrolló inicialmente para
la identificación y cuantificación de receptores hormonales específicos, pero es igualmente bueno
para las mediciones de citocinas. En este ensayo, la mezcla de la muestra de ensayo y una cantidad
conocida de la sustancia radiomarcada bajo ensayo se expone a una cantidad medida de
receptores para la sustancia y la cantidad en la muestra de ensayo se determina a partir de la
proporción de receptores ocupados por moléculas de radiomarcado de la sustancia bajo el
supuesto de que las moléculas marcadas y no marcadas se unen a los sitios receptores al azar. Una
ventaja particular del RRA es que tiene una especificidad dirigida hacia las regiones biológicamente
activas de la citoquina, en lugar de hacia la región inmunológicamente activa que puede tener
poca o ninguna participación en la expresión de la actividad de las citocinas (“Laboratory for
Clinical and Biological Studies, University of Miami-Miller School of Medicine, Miami, Florida
33136,” 2007). Sin embargo, los ensayos que implican el uso de radioisótopos han sido
reemplazados en gran medida por ensayos no radiactivos debido a consideraciones de exposición
a radiaciones, procedimientos que requieren mucho tiempo y trabajo y requisitos de equipos
costosos, como contadores beta o gamma.

 Quimioluminiscencia

Recientemente, se ha desarrollado ELISA de quimioluminiscencia (CL-ELISA), lo que resulta en un

aumento de 100 veces en la sensibilidad. Estos ensayos implican la escisión o fragmentación del
enlace O-O de un compuesto de peróxido orgánico (sustrato) con una peroxidasa (enzima) durante
la detección del antígeno (citocina o su receptor). Es importante resaltar que a pesar de la
sensibilidad mejorada de este método, aun se continua usando ELISA debido a los altos costos
generados por la quimioluminiscencia(Loré & Andersson, n.d.).

 Bioensayos de citocinas

Estos bioensayos incluyen la medición de la estimulación o inhibición de la proliferación celular,

citotoxicidad / apoptosis, actividad antiviral, diferenciación y regulación positiva de la expresión de
proteínas intracelulares, secretadas y de membrana de superficie. En la práctica, los bioensayos
requieren más tiempo y trabajo que los inmunoensayos. Requieren instalaciones de cultivo de
tejidos, debido a la necesidad de una línea celular diana, que sirve como una lectura de la
respuesta biológica. Las líneas de células diana utilizadas en los bioensayos de citocinas se
seleccionan cuidadosamente por su sensibilidad o dependencia de una citocina
determinada(“Laboratory for Clinical and Biological Studies, University of Miami-Miller School of
Medicine, Miami, Florida 33136,” 2007).

 Cuantificación o aislamiento basado en perlas magnéticas de células productoras de

citocinas

Se han desarrollado inmunoensayos basados en microesferas que pueden monitorizarse con

plataformas de citometría de flujo que permiten mediciones de citoquinas altamente sensibles y
multiplexadas en muestras de volumen de microlitros bajo. Estas plataformas incorporan
conjuntos de microesferas (~ 5 a 7 μm de diámetro exterior) identificables por la concentración de
fluoróforos incrustados en las perlas que sirven como soporte sólido para el inmunoensayo. El
sistema de citometría de flujo es capaz de discriminar la intensidad del fluoróforo en el conjunto
de perlas, así como la intensidad media de fluorescencia (MFI) para el anticuerpo de detección
marcado. Con anticuerpos de alta afinidad y cinética de reacción rápida en solución, los
inmunoensayos multiplexados basados en microesferas para citometría de flujo proporcionan un
método de análisis más rápido, específico y reproducible que tiene un rango de sensibilidad de
tres a cuatro logarítmicos en comparación con uno o dos registros para ELISA(“Laboratory for
Clinical and Biological Studies, University of Miami-Miller School of Medicine, Miami, Florida
33136,” 2007).

 Ensayos basados en ARNm

Los métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para medir la regulación de la

expresión de genes de citocinas también se utilizan comúnmente para estudios que involucran
citocinas. Esta es una tecnología madura para las mediciones de la expresión de ARN de citocinas
que hace más de dos décadas permitió mediciones de tan solo 20 células.  Con la tecnología
mejorada para manejar volúmenes del tamaño de picolitros a partir de los avances en
microfluídica, se encuentran disponibles instrumentos que pueden realizar PCR en una sola célula
y se han utilizado para estudios unicelulares de expresión de citocinas. El sistema PCR es un
método altamente sensible y específico para la detección simultánea de hasta 12 especies de
ARNm diferentes en una sola muestra de ARN total. El método utiliza ribosondas específicas, que
se generan utilizando ARN polimerasas dependientes de ADN de los bacteriófagos T7 o T3. Las
sondas lineales resultantes se hibridan con ARNm diana. Después de digerir las sondas libres y
otras moléculas de ARN monocatenarias con ARNasa, los dúplex de sonda / ARN diana hibridados
se resuelven según el tamaño en geles de poliacrilamida y se transfieren a una membrana de
nailon(Manglani et al., 2019).

Medición de citocinas producidas por células individuales. (ensayos unicelulares)

 Tinción de citocinas intracitoplásmicas (ICC)

En laboratorios se han desarrollado métodos para la detección de citocinas y quimiocinas a nivel

de proteína en células individuales basados en técnicas de tinción de inmunofluorescencia o
inmunohistoquímica. Las dificultades en estos procedimientos radican en los pasos críticos de
fijación y permeabilización de las células en combinación con una selección muy cuidadosa de
anticuerpos específicos de citocinas o quimiocinas adecuados. Para detectar citocinas y
quimiocinas intracelulares, las células deben permeabilizarse para permitir que los anticuerpos
específicos penetren en la membrana de la superficie celular, el citosol y las membranas del
complejo Golgi-retículo endoplasmático. Por lo tanto, es necesario fijar las células para que
resistan los efectos del agente permeabilizante. Una combinación óptima de fijador y detergente
preserva la morfología celular y la antigenicidad de las proteínas intracelulares con una mínima
agregación y pérdida celular(Kain, 2005).

 Inmunospot ligado a enzimas (ELISPOT)

Se caracteriza por ser muy sensible y, por ello, muy útil para detectar células secretoras poco
frecuentes (hasta 1 entre 300,000). La liberación de citocinas en respuesta a un antígeno puede
mapearse en una célula individual, por lo que puede calcularse la frecuencia de células T
respondedoras. La información obtenida con esta prueba es tanto cuantitativa como cualitativa, ya
que da información sobre el tipo de respuesta que ha sido producida. La principal aplicación es
monitorizar respuestas inmunes tanto en humanos como en animales(Zeng et al., 2012).

Una placa de poliestireno que permite fijar proteínas o PVDF es tapizada con un anticuerpo
monoclonal anti-citocina de alta afinidad. Las células estimuladas con mitógeno o antígeno se
añaden en los pocillos y son incubadas durante un periodo de tiempo específico, lo que permite
que cualquier citocina secretada pueda ser capturada por el anticuerpo. Después de un lavado
para eliminar las células y cualquier sustancia que no se haya unido, las citocinas pegadas se
detectan utilizando un anticuerpo biotilinado y otro anticuerpo que reconoce a este último. El
paso final es la precipitación, exponiendo los sitios de secreción de citocinas como un punto. Estos
pueden contarse con un lector ELISPOT automatizado o manualmente utilizando un microscopio
de disección. A continuación se observa el procedimiento usado para un ensayo ELISPOT:
  Microarrays de citocinas; Microarrays de ADN, Microarrays de proteínas

Los inmunoensayos basados en perlas, ha habido un gran interés en el desarrollo de matrices de

proteínas multiplexadas. Los anticuerpos se han modelado sobre superficies mediante
fotolitografía y han conservado su actividad. Esto ha llevado al desarrollo de matrices comerciales
utilizadas para la detección de citocinas que pudieron detectar de 1 a 15 pg / ml de IFN-γ, IL-1β, IL-
2, IL-4, IL-6, IL-12, IL -13, y TNF-α en 15 μL utilizando un ELISA sándwich con estreptavidina Cy-5
utilizada como marcador frente a anticuerpos de detección biotinilados. El uso de microarrays de
anticuerpos y todas las citocinas que se han detectado con esta técnica se ha revisado
extensamente(“Laboratory for Clinical and Biological Studies, University of Miami-Miller School of
Medicine, Miami, Florida 33136,” 2007).

Los procedimientos y protocolos se han optimizado individualmente para producir límites

ultrasensibles de detección y cuantificación. En esta revisión se nombraron algunos de los
métodos que mejoran la sensibilidad, la precisión y la reproducibilidad de los inmunoensayos, así
como las dificultades clave en el diseño y la ejecución de los ensayos. Sin embrago queda mucho
por abordar en cuanto a la cuantificación y detección de citocinas y quimiocinas.

Bibliografía
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Laboratory for Clinical and Biological Studies, University of Miami-Miller School of Medicine,
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Loré, K., & Andersson, J. (n.d.). at the Single Cell Level. 249, 201–218.
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