MLG-4.10 en Español PDF

United States Food Safety Office of Laboratory QA Staff
Department of and Inspection Public Health 950 College Station Road

Agriculture Service Science Athens, GA 30605
Laboratory Guidebook
Notice of Change
Chapter new, revised, or archived: MLG 4.10

Título: Aislamiento e identificación de Salmonella a partir de carne, aves, huevos
pasteurizados y productos de siluriformes (pescado) y canales y esponjas ambientales
Effective Date: 1/02/19
Descripción y propósito del cambio (s):
El ensayo de diferenciacion molecular rápido se revisó en la sección del equipo y se

agregaron instrucciones de diferenciacion rápido adicionales al procedimiento.
Se incluyó la secuenciación del genoma complete como una opción para caracterizar aún
más los aislamientos durante la confirmación en lugar de las pruebas serológicas con
antígeno somático (O) y flagelar (H) Pruebas de aglutinación de antígeno.
Se agregaron instrucciones adicionales para realizer un control de fluorescencia en la placa

SBA durante la confirmación bioquímica para el control positivo de Salmonella UV y
muestras positivas presuntas después de la incubación.
Los procedimientos opcionales no utilizados por los laboratorios del FSIS se eliminaron
del método, incluidas las referencias a los medios de enchapado XLT4 y la serología.
MLG 4C "Procedimiento FSIS para el uso de un ensayo de reacción en cadena de la

polimerasa (PCR) para el cribado de Salmonella en productos cárnicos, de aves, huevos y
siluriformes (pescado) y cadáveres y esponjas ambientales" se archivará como el
procedimiento de cribado molecular rápido ahora incluido en MLG 4.
QD-F-Micro-0004.08 Issuing Authority: Director, Laboratory Quality Assurance Staff (LQAS)

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Effective: 11/15/18
United States Department of Agriculture
Food Safety And Inspection Service, Office of Public Health Science
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MLG 4.10
Title: Isolation And Identification of Salmonella From Meat, Poultry, Pasteurized Egg, and
Siluriformes (Fish) Products and Carcass and Environmental Sponges
Revision: .10 Replaces: .09 Effective: 01/02/19
Procedure Outline
4.1 Introduction
4.2 Safety Precautions
4.3 Quality Control Procedures
4.3.1 Method Controls
4.3.2 Specific Procedure Controls
4.4 Equipment, Reagents, Media and Test Kits
4.4.1 Equipment
4.4.2 Reagents and Test Systems
4.4.3 Media
4.5 Sample Preparation
4.5.1 Ready-to-Eat Meat, Poultry and Siluriformes Foods
4.5.2 Raw Poultry Products
4.5.3 Raw Meat and Raw Beef Mixed Products
4.5.4 Carcass Sponges and Environmental Sponges
4.5.5 Whole Bird and Parts Rinses
4.5.6 Pasteurized Liquid, Frozen, or Dried Egg Products
4.5.7 Raw Siluriformes (Fish) Products
4.5.8 Fermented Products
4.5.9 Dried Products (Breading Mix, Dehydrated Sauce, Dried Soup Mix, and Dried Milk)
4.5.10 Most Probable Numbers (MPN) Determination
4.6 Rapid Screening Salmonella Test Procedure
4.7 Selective Enrichment and Plating Media
4.8 Examination of and Picking Colonies from Plating Media
4.8.1 Picking Colonies
4.8.2 Screening Media
4.9 Biochemical Procedures
4.10 Culture Storage and Maintenance
4.11 Selected References
Issuing Authority: Director, Laboratory Quality Assurance Staff (LQAS)

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4.1 Introducción
Los métodos descritos en esta guía son para uso de los laboratorios del FSIS. El FSIS no respalda
específicamente ninguno de los productos de prueba mencionados y reconoce que productos equivalentes
pueden estar disponibles para uso en laboratorio. El FSIS utiliza los siguientes criterios de rendimiento al
evaluar la idoneidad de un método o producto de laboratorio alternativo para un par de analito y matriz de
muestra dado:
 Sensibilidad del 90% o mayor.

 Especificidad del 90% o mayor.
 Precisión del 90% o mayor.
 Valor predictivo positivo de 90% o más.
 Valor predictivo negativo del 90% o mayor.
Los criterios de rendimiento son relativos al método cultural de referencia para ese analito y matriz de muestra
como se describe en el capítulo MLG correspondiente. La validación del método es necesaria para demostrar
la equivalencia de las pruebas alternativas como se detalla en el documento titulado "Guía del FSIS para
evaluar el rendimiento del kit de prueba".
Este método describe el análisis de varios productos de carne, pollo y Siluriformes (pescado), muestras de
esponja y enjuague, y productos de huevo para Salmonella. No está destinado al aislamiento e identificación
de Salmonella typhi.
El éxito en el aislamiento de Salmonella de cualquier alimento puede estar relacionado con una serie de
factores, incluidos los procedimientos de preparación de alimentos, la cantidad de organismos presentes, el
manejo de muestras después de la recolección, etc. Varía de una muestra a otra y de un tipo de matriz a otra.
Otra consideración es si el examen es para monitoreo de rutina o para propósitos epidemiológicos. El analista
puede optar por aumentar el método con fines epidemiológicos con procedimientos de enriquecimiento
adicionales y medios de cultivo, dos temperaturas de incubación, selección intensificada de colonias de placas
y / o métodos de detección rápida.
A menos que se indique lo contrario, todas las mediciones citadas en este método tienen un rango de tolerancia
de ± 2%.

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4.2 Precauciones de seguridad
La Salmonella generalmente se clasifica como patógenos de Nivel 2 de Bioseguridad. Se deben seguir las pautas
de los CDC para el manejo de patógenos de Bioseguridad Nivel 2 siempre que se utilicen cultivos vivos de
Salmonella. Se recomienda un gabinete de bioseguridad de flujo laminar de Clase II para procedimientos en los
que se pueden crear aerosoles o salpicaduras infecciosas. La Hoja de datos de seguridad (SDS) debe obtenerse del
fabricante para los medios, productos químicos, reactivos y microorganismos utilizados en el análisis. El personal
que manejará el material debe leer la SDS antes del inicio.
4.3 Procedimientos de control de calidad
4.3.1 Controles del método
Se debe utilizar un cultivo de Salmonella sp H2S positivo y un control de medios no inoculados desde el inicio
del análisis. Un Salmonella sp H2S negativo. el cultivo positivo también se incluirá desde el inicio del análisis o
se limitará a los conjuntos que contienen muestras positivas de cribado, desde los pasos de diferenciación y
confirmación que comienzan con el rayado a las placas de agar BGS y DMLIA. Para facilitar la identificación de
los aislados de control, el laboratorio puede usar cepas de serogrupos o cultivos etiquetados que se encuentran con
poca frecuencia, como los que fluorescen visiblemente bajo la luz ultravioleta (UV) para diferenciar las cepas de
QC de contaminantes verdaderos. S. Abaetetuba se sugiere como un cultivo positivo para H2S fácilmente
disponible que no se encuentra comúnmente en carnes o productos cárnicos. S. Choleraesuis es típicamente
negativo para la producción de H2S. Estos cultivos pueden obtenerse de ATCC. Se pueden encontrar otros
serotipos que tienen cepas negativas para H2S. Los cultivos de control positivo deben inocularse en una matriz
apropiada a un nivel bajo de inóculo, por ejemplo, preparando una suspensión de organismo de prueba en caldo o
solución salina equivalente en turbidez a un estándar de 0,5 McFarland. Usando un bucle de 1 µL, inocular el
caldo o rayar las placas a analizar. Alternativamente, se pueden usar gránulos bacterianos preparados
comercialmente. Una vez que se inician los cultivos de control, incube los controles junto con las muestras y
analícelos de la misma manera que las muestras. Confirme al menos un aislado de la muestra de control positivo
de H2S. Se requiere la confirmación de al menos una colonia del control negativo de H2S al confirmar muestras
negativas de H2S. En ausencia de una muestra de prueba positiva, los cultivos de control pueden terminarse en el
mismo punto que los análisis de la muestra.

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4.3.2 Controles de procedimientos específicos
Cada paso del análisis requiere el uso de controles apropiados para verificar que los resultados sean válidos. Los
fabricantes de kits bioquímicos y pruebas rápidas pueden especificar cultivos de control para usar con sus
productos. Si no se especifica, los procedimientos de control de calidad para pruebas bioquímicas y medios de
prueba deben incluir cultivos que demuestren las características pertinentes del producto.
4.4 Equipos, reactivos, medios y kits de prueba
No todos los materiales enumerados a continuación pueden ser necesarios. Pueden ser necesarios medios y
reactivos específicos para el método de prueba bioquímico seleccionado además de los materiales enumerados a
continuación.
4.4.1 Equipamiento
a. Cucharadas estériles, tijeras, pinzas, cuchillos, varillas de agitación de vidrio, pipetas, placas Petri, tubos
de ensayo, varillas de vidrio dobladas ("palos de hockey") según sea necesario
b. Equipo de mezcla / mezcla: licuadora de paletas, licuadora de tipo Osterizador estéril con conjuntos de
corte esterilizados, y jarras de la batidora o equivalentes y adaptadores para usar con jarras Mason;
c. Bolsas de polipropileno lisas, transparentes y estériles (aprox. 24 "x 30 - 36"), o bolsas tipo Whirl-pak, o
equivalente
d. Incubadora, 35 ± 2°C
e. Incubadora o baño de agua, 42 ± 0.5°C
f. Balanza, 2000 g de capacidad, sensibilidad de 0.1 g
g. Agujas y asas de inoculación.
h. Mezclador Vortex
i. Lámpara UV,intencidad de luz azul 475-495 nm de luz
j. Sistema de detección molecular 3M ™
• Inserto de bloque de calor de detección molecular 3M ™ MDSHBIN
• Bandeja del cargador de velocidad de detección molecular 3M ™ MDSSLT
• Lisis de detección / tapa de detección molecular de 3M ™-Lisis
• Inserto de bloque de enfriamiento de detección molecular 3M ™ MDSCBIN mantenido a 20-25 ° C
• Calentador de bloque digital VWR 2 o equivalente configurado a 100 ± 1 ° C
• Pipeteador para suministrar 20 μL y puntas de filtro desechables estériles
• Pipeta multicanal para suministrar 20 μL
k. Sistema compacto VITEK® 2, o equivalente

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4.4.2 Reactivos y sistemas de prueba
a. Colorante cristal violeta, solución acuosa al 1%

b. Solución salina, 0.85%
c. Carbonato de calcio, estéril
d. Ensayo de detección molecular 3M ™ 2 - Salmonella
e. Panel de prueba bioquímica (tarjetas GN para el sistema compacto VITEK® 2)
4.4.3 Media
a. Agua de peptona tamponada (BPW) o caldo de soja de triptona modificada (mTSB)

b. TT caldo (Hajna)
c. Caldo Rappaport Vassiliadis (mRV) modificado, caldo Rappaport-Vassiliadis R10 o caldo
de peptona de soja Rappaport-Vassiliadis (RVS)
d. Agar sulfa verde brillante (BGS; contiene sulfapiridina sódica al 010,1%)
e. Agar de lisina hierro doblemente modificado (DMLIA)
f. Agar triple de hierro y azúcar (TSI)
g. Agar lisina de hierro (LIA)
h. Inclinación de agar nutriente
i. Agar de soja tríptico con agar sangre de oveja al 5%
j. Medios adicionales según sea necesario para las pruebas bioquímicas.
4.5 Preparación de muestra
Los productos sellados intactos deben desinfectarse en los sitios de incisión inmediatamente
antes de la incisión para el muestreo utilizando un desinfectante apropiado, por ejemplo,
peróxido de hidrógeno al 3%, aprox. 70% de etanol o ca. 70% de isopropanol. Si el paquete
no parece estar limpio, frote suavemente con agua jabonosa y enjuague bien antes de la
desinfección. Un bisturí estéril puede ser útil para cortar el embalaje. Separe asépticamente el
embalaje para exponer el producto al muestreo.
Nota: Para las salchichas listas para comer (RTE) con envoltura, la cubierta / envoltura es una
parte integral de la muestra y debe estar libre de patógenos y toxinas. La cuvierta no debe
desinfectarse ya que algunas son permeables y el desinfectante puede introducirse en el núcleo
del producto. Además, los consumidores a menudo cortan una cuvierta no comestible y luego
la eliminan, por lo que cualquier contaminación en la superficie de la carcasa podría
transferirse al núcleo comestible del producto. La preparación de la muestra y los tiempos de
incubación de enriquecimiento pueden variar según la matriz y el programa. Consulte la Tabla
1 y las siguientes secciones de preparación de muestras.

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Table 1. Sample Preparation and Enrichment Guide
Sample Preparation Incubation
Product Enrichment Amount Cultural or rapid
Portion Size
determined by volume or weight screen
Carne listo para comer,
aves y 325 ± 6.5 g 975 ± 19.5 ml BPW 35 ± 2C for
Alimentos Siluriformes 18-24 h
325 ± 32.5 g 1625 ± 32.5ml BPW

Productos crudos de aves 35 ± 2C for
or or
de corral 20-24 h
25 ± 2.5 g 225 ± 4.5 ml BPW
Productos crudos de 325  32.5 g 975± 19.5 ml mTSB

42 ± 1C for
carne cruda y carne cruda or or
15-24 h
25 ± 2.5 g 75 ± 1.5 ml mTSB
1 esponja
Canal de aves de corral y prehumedecida 50 ± 1 ml BPW to bring total 35 ± 2C for
esponjas ambientales con 10 ml de agua volume to 60 ml* 20-24 h
tampón
1 esponja
Canal de carne y esponjas prehumedecida 50 ± 1 ml mTSB to bring total 42 ± 1C for
ambientales con 10 ml de agua volume to 60 ml* 15-24 h
tampón
aves enteras y enjuagues de 30 ± 0.6 ml muestra de 35 ± 2C for
partes líquido de enjuague 30 ± 0.6 ml BPW 20-24 h
Productos de huevo
pasteurizados líquidos, 100 ± 2 g 900 ± 18 ml BPW 35 ± 2C for
congelados o secos 18-24 h
Productos Siluriformes 25 ± 2.5 g 225 ± 4.5 ml BPW 35 ± 2C for

Crudos 22-26 h
325 ± 6.5 g + 2925 ± 58.5 ml of BPW with 1 ml of
Productos fermentados 10 g de carbonato de a 1% aqueous solution of 35 ± 2C for
crystal violet per liter 18-24 h
calcio esterilizado
Productos secos (mezcla
para empanizar, salsa 35 ± 2C for
325 ± 6.5 g 2925 ± 58.5 ml BPW
deshidratada, mezcla para 18-24 h
sopa, leche en polvo)
* o mantenga una proporción de 1: 6 para diferentes volúmenes de tampones del proyecto, por ejemplo, 25 ml de
tampón + 125 ml de enriquecimiento

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4.5.1 Alimentos listos para comer carne, aves y siluriformes
Siga los requisitos adicionales del programa para preparar compuestos de muestra y submuestra. Las muestras de
brotes pueden requerir una preparación de muestra diferente. Siga las especificaciones del cliente.
Con un bisturí, un cuchillo, una cuchara, un cincel u otra herramienta estériles, corte piezas pequeñas de los sitios
representativos del producto enviado para preparar una porción de muestra compuesta. Mientras que generalmente
se envían múltiples paquetes de un producto, para productos grandes se puede enviar un solo paquete.
Para productos RTE de múltiples componentes, siga las instrucciones de preparación de muestra apropiadas que se
enumeran a continuación:
Si el componente de carne, pollo o Siluriformes es separado y distinto de otros ingredientes que no son de carne,
analice solo la porción representativa de carne / pollo del producto RTE. Los ejemplos incluyen productos con la
porción de carne / pollo separada de cualquier componente de vegetales / postre, o kits de fajita con carne / pollo,
cebolla / pimiento y tortillas en tres paquetes / bolsas internas separadas dentro de un paquete externo.
Cuando se combina carne, pollo o Siluriformes con otros ingredientes para formar el producto (por ejemplo,
estofado de carne que contiene vegetales, papas, etc.), analice porciones representativas de carne / pollo en
combinación con otros ingredientes.
a. Pese la muestra compuesta en una bolsa estéril grande (o en una jarra de licuadora estéril si así lo requiere
el cliente o el tipo de muestra).
b. Añadir a temperatura ambiente agua peptonada tamponada estéril (BPW). Mezcla o homogenice
aproximadamente dos minutos.
c. Incubar a 35 ± 2 ° C Durante 18-24 h.
d. Vaya a la Sección 4.6 para usar la pantalla rápida o consulte la Sección 4.7 para continuar el análisis cultural.

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4.5.2 Productos avícolas crudos
a. A menos que se envíe la porción de muestra exacta, pese el producto en una bolsa de polipropileno estéril,
una jarra mezcladora estéril u otra jarra estéril. Nota: Si la muestra aún no está molida, en algunos casos
puede ser mejor picarla con tijeras estériles o dejarla entera (por ejemplo, alitas de pollo) para evitar atascar
las cuchillas de la licuadora con la piel o el tejido conectivo.
b. Añadir el agua peptona tamponada (BPW). Homogenizar, licuaar o amazar con las manos hasta que los
grumos se dispersen.
c. Incubar a 35 ± 2 ° C Durante 20-24 h.
d. Vaya a la Sección 4.6 para usar la pantalla rápida o consulte la Sección 4.7 para continuar el análisis
cultural.
4.5.3 Productos crudos de carne cruda y carne cruda
a. A menos que se envíe la porción de muestra exacta, pese la carne en una bolsa de polipropileno estéril,
una jarra de licuadora estéril u otra jarra estéril.
b. Agregue el Caldo soya Tripticasa modificado (mTSB) a una dilución 1: 4, por ejemplo, 325 ± 32.5 g de
muestra con 975 ± 19.5 ml de caldo mTSB. Homogenice, licuado o masaje de manos hasta que los grumos
se dispersen.
c. Incubar a 42 ± 1°C Durante 15-24 h.
cultural.
4.5.4 Esponjas de cubiertas y esponjas ambientales
a. Para la carcasa de aves de corral o esponjas ambientales, agregue el el agua peptona tamponada (BPW) a
la bolsa de muestra que contiene una esponja humedecida con 10 ml de tampón para llevar el volumen
total a 60 ml. Mezclar bien. Si el proyecto requiere un mayor volumen de tampón, ajuste el volumen del
caldo de enriquecimiento a una dilución 1: 6. Incubar a 35 ± 2 ° C durante 20-24 h.
b. Para la carcasa de carne o esponjas ambientales, agregue el Caldo soya Tripticasa modificado (mTSB) a
la bolsa de muestra que contiene una esponja humedecida con 10 ml de tampón para llevar el volumen
total a 60 ml. Mezclar bien. Si el proyecto requiere un mayor volumen de tampón, ajuste el volumen
del caldo de enriquecimiento a una dilución 1: 6. Incubar a 42 ± 1°C durante 15-24 h.
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c. Vaya a la Sección 4.6 para usar la pantalla rápida o consulte la Sección 4.7 para continuar el análisis
cultural.
4.5.5 Enjuagues de aves enteras y partes
Debido a las diferencias entre los tipos / tamaños de muestra (por ejemplo, cuerpo del pollo frente a pavo;
tamaño de las partes), siga las instrucciones dadas en el protocolo específico del proyecto.
a. Para cuerpos de pollo:

Asépticamente drene el exceso de líquido del cuerpo y transfiera el cuerpo a una bolsa estéril grande.
Vierta 400 ml (u otro volumen especificado en el protocolo del programa) de medio de recolección en
la cavidad del cuerpo contenida en la bolsa.
Enjuague el ave por dentro y por fuera con un movimiento de balanceo durante un minuto (ca. 35
RPM). Esto se hace agarrando el cuerpo de la bolsa con una mano y la parte superior cerrada de la
bolsa con la otra. Balancee con un movimiento recíproco en un arco de aproximadamente 18-24
pulgadas, asegurando que se enjuaguen todas las superficies (interior y exterior del cuerpo).
b. Para partes de pollo:

Agregue el peso de la parte específica más el volumen del medio de recolección especificado por el
protocolo del programa en la bolsa estéril.
Enjuague las partes con el caldo asegurándose de enjuagar todas las superficies.
c. Transfiera el líquido de enjuague de la muestra a un recipiente estéril.
d. Use 30 ± 0.6 ml del líquido de enjuague de muestra obtenido anteriormente para el análisis de
Salmonella. Agregue 30 ± 0.6 ml de agua de peptona tamponada estéril (BPW) y mezcle bien.
e. Incubar a 35 ± 2 ° C durante 20-24 h.

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NOTA: Si se van a realizar análisis que no sean Salmonella, el cuerpo se puede enjuagar y hacer diluciones
directamente del enjuague de recolección.
4.5.6 Productos de huevo pasteurizados líquidos, congelados o secos
a. Mezcle la muestra líquida con una cuchara estéril, una espátula o agitándola.
b. Pese el producto de huevo líquido en una bolsa de polipropileno estéril, una jarra de licuadora estéril u
otra jarra estéril.
c. Mezcle bien el agua de peptona tamponada estéril (BPW) inoculado agitándolo, homogenizandolo o
mezclándolo.
Nota: Si una muestra o especificación especial requiere un tamaño de muestra diferente a 100 g, la dilución de la
muestra de huevo al agua de peptona tamponada estéril (BPW) se debe mantener a 1:10.
d. Con muestras de huevo seco, agregue gradualmente el agua de peptona tamponada estéril (BPW) a la
muestra. Agregue una pequeña porción de agua de peptona tamponada estéril (BPW) estéril y mezcle para
obtener una suspensión homogénea. Agregue el resto de la agua de peptona tamponada estéril (BPW.
Mezcle hasta obtener una suspensión sin grumos.
e. Incubar a 35 ± 2 ° C durante 18-24 h.
f. Vaya a la Sección 4.6 para usar la pantalla rápida o consulte la Sección 4.7 para continuar el análisis
cultural.
4.5.7 Productos Siluriformes (Pescado) Crudos
Siga los requisitos del programa para preparar compuestos de muestra y submuestra.
a. Pese el pañuelo en una bolsa estéril, un vaso mezclador estéril u otro vaso estéril.
b. Añadir el agua de peptona tamponada estéril (BPW). Homogenice o mezcle, según sea necesario, durante
aproximadamente dos minutos o agite bien.
c. c. Incubar a 35 ± 2 ° C durante 22-26 h.

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cultural.
4.5.8 Productos fermentados
Siga el procedimiento para alimentos RTE en la Sección 4.5.1 excepto:
a. Mezcle / homogenice la muestra con 10 ± 0.2 g de carbonato de calcio esterilizado.
b. Utilice agua de peptona tamponada que contenga 1 ml de una solución acuosa al 1% de cristal violeta por
litro.
4.5.9 Productos secos (mezcla de empanado, salsa deshidratada, mezcla de sopa seca y
leche en polvo)
a. Pese el producto en una bolsa de polipropileno estéril, una jarra de licuadora estéril u otra jarra estéril.
b. Agregue una pequeña porción de agua de peptona tamponada estéril (BPW) a temperatura ambiente y
mezcle para obtener una suspensión homogénea. Agregue el resto del agua de peptona tamponada estéril
(BPW). Mezcle hasta obtener una suspensión sin grumos.
c. Incubar a 35 ± 2 ° C durante 18-24 h.
cultural.
Nota: Los productos secos, como las mezclas de sopa, pueden requerir una dilución de muestra / caldo mayor a
1:10 debido a las dificultades físicas encontradas por la absorción del caldo por el producto deshidratado.

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4.5.10 Determinación de los números más probables (NMP)
Siga las instrucciones de la MPN que figuran en el protocolo específico del proyecto o consulte el Apéndice 2 de
MLG, Procedimiento y tablas de números más probables.
4.6 Procedimiento de prueba de detección rápida de Salmonella
Después de la incubación, realice la detección rápida utilizando la guía del usuario actual del Sistema de detección
molecular 3M ™, o la tecnología de detección rápida equivalente para preparar reactivos, realizar el resto del
ensayo y leer los resultados.
a. Las muestras que son rápidas negativas en pantalla se informarán como negativas. Todas las demás
muestras continuarán con el análisis cultural según MLG 4, Sección 4.7. Alternativamente, para muestras
con resultados de cribado rápidos que no se consideran concluyentes, el laboratorio puede investigar.
Según los hallazgos, el laboratorio puede:
 repita el análisis rápido de pantalla del paso de lisado o
 prepare nuevos tubos de lisado de cribado rápido y repita el análisis.
b. En las pruebas analíticas donde los resultados del control positivo NO son positivos, todas las muestras se
ven afectadas y se debe realizar una investigación. Según los hallazgos, el laboratorio puede:
 repita el análisis rápido de pantalla del paso de lisado
 prepare nuevos tubos de lisado de cribado rápido y repita el análisis o
 analizar todas las muestras culturalmente.
Si las circunstancias (por ejemplo, un corte de energía o una falla del equipo) no permiten realizar pruebas con el
sistema de cribado rápido, el laboratorio deberá, si es posible, continuar con el análisis cultural de todas las
muestras siguiendo los pasos de aislamiento y purificación según MLG 4, Sección 4.7.
4.7 Medios de enriquecimiento selectivo y enchapado
a. Transfiera 0.5 ± 0.05 ml de muestra a 10 ml de caldo TT (caldo Hajna) y 0.1 ± 0.02 ml a 10 ml de caldo
mRV.
b. Incubar a 42 ± 0.5°C durante 22-24 h o en un baño de agua a 42 ± 0.5°C durante 18-24 h.

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c. Mezcle cuidadosamente el contenido del tubo mediante agitación vorticial o medios equivalentes. Raya a
las placas de agar BGS y DMLIA usando un bucle de 10 µl de inóculo para cada placa. Raya toda la placa
de agar con una única muestra de enriquecimiento.
d. Incubar a 35 ± 2 ° C durante 18-24 h.
e. Seleccione colonias típicas.
4.8 Examen y selección de colonias de medios de recubrimiento
4.8.1 Seleccion de Colonias
a. Después del intervalo de incubación recomendado, examine las placas de agar selectivo diferencial y los
controles para detectar la presencia de colonias que cumplan con la descripción de colonias sospechosas
de Salmonella. Elija colonias bien aisladas.
 BGS. Seleccione colonias que sean rosadas y opacas con una apariencia suave y
borde completo rodeado de un color rojo en el medio. En placas muy llenas, busque
colonias que den un aspecto bronceado contra un fondo verde.
 DMLIA. Seleccione colonias moradas con centros negros (H2S positivo) o sin
(H2S negativo). Dado que Salmonella típicamente descarboxila lisina y no
fermenta la lactosa ni la sacarosa, el color del medio vuelve al púrpura.
b. Elija al menos una colonia aislada típica de cualquiera de las placas. (NOTA: Antes de que cualquier
muestra se informe como Salmonella negativa, seleccione al menos tres colonias típicas totales, si están
disponibles. Debe seleccionarse un representante de cada tipo de colonia típica de cada tipo de placa antes
de informar la muestra como Salmonella negativa). Elija solo de la superficie y el centro de la colonia.
Evite tocar el agar porque estos medios altamente selectivos suprimen el crecimiento de muchos
organismos que pueden ser viables.
c. Si hay colonias típicas en una placa que no están bien aisladas, elija las colonias típicas y raye directamente
a un nuevo conjunto de placas de agar selectivo. Alternativamente, transfiera colonias típicas a un tubo de
caldo TT (Hajna) o caldo mRV e incube durante la noche, luego raye a agares selectivos.
d. Incubar todas las placas durante 18-24 h adicionales a 35 ± 2°C.

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e. Vuelva a examinar las placas inicialmente negativas y seleccione las colonias como se indicó
anteriormente. Después de 48 horas de incubación, las placas sin colonias típicas pueden descartarse como
negativas. Las placas con colonias sometidas a pruebas de confirmación deben almacenarse a 2-8 ° C hasta
que se complete la prueba. Si las colonias sospechosas de Salmonella no lo confirman, vuelva a examinar
las placas de las que fueron recolectadas y, si corresponde, seleccione nuevamente las colonias para su
confirmación siguiendo la Sección 4.8.1.b.
4.8.2 Medios de cribado
a. Inocular los sesgos TSI y LIA en conjunto con una sola selección de una colonia con puncion en el fondo
y rayando el bisel en una sola operación. Si se utilizan tubos con tapa de rosca, las tapas deben aflojarse.
Incubar a 35 ± 2 ° C durante 24 ± 2 h.
Nota: La misma colonia puede usarse para rayar una placa utilizada para las pruebas bioquímicas posteriores
descritas en la Sección 4.9.
Examine las inclinaciones de TSI y LIA como un conjunto. Tenga en cuenta los colores del fondo y el bisel, el
ennegrecimiento de los medios y en los sesgos de TSI la presencia de gases lo indican las bolsas de gas o el
agrietamiento del agar. Tenga en cuenta también la aparición del crecimiento en el bisel a lo largo de la línea de
la raya. Un control típico en LIA debería producir un fondo púrpura con (H2S positivo) o sin ennegrecimiento
(H2S negativo) de los medios. Un control típico sobre TSI debería producir una fondo amarillo y un bisel rojo,
con (H2S positivo) o sin (H2S negativo) ennegrecimiento de los medios.
Deseche, o vuelva a marcar para aislar, cualquier conjunto que muestre "enjambre" del sitio original de
inoculación. Deseche los conjuntos que muestran una inclinación rojiza en agar lisina de hierro. Aislamientos que
dan Salmonella sp. reacciones y aislamientos que son sugerentes pero no típicos de Salmonella sp. debe
confirmarse mediante una combinación de procedimientos bioquímicos y serológicos. Consulte la Tabla 2 para
ver un resumen de las reacciones TSI-LIA.
Nota: Las inclinaciones TSI y LIA se pueden mantener a 2-8 ° C por hasta 96 horas. Antes de cualquier prueba
posterior, se deben inocular e incubar nuevos TSI y LIA inclinados según las instrucciones en a (arriba).

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a. La prueba de motilidad en la última columna de la tabla es opcional. Consulte "Identificación de

Edrogers y Ewing de Enterobacteriaceae" (Ewing, 1986) para obtener información adicional.
b. El serotipo molecular o la secuenciación del genoma completo se pueden realizar para caracterizar aún
más los aislamientos en lugar de las pruebas serológicas con pruebas de aglutinación de antígeno
somático (O) y antígeno flagelar (H).
4.9 Procedimientos bioquímicos
Los kits de prueba bioquímicos disponibles en el mercado, incluidos los sistemas automatizados, pueden usarse
para la identificación bioquímica. Alternativamente, use métodos tradicionales de identificación bioquímica.
Consulte el Método oficial 967.27 de AOAC o "Identificación de Enterobacteriaceae de Edwards y Ewing",
4ª edición, para conocer las reacciones bioquímicas de Enterobacteriaceae y los medios de fermentación y los
procedimientos de prueba.
Para algunos kits de prueba bioquímica, es decir, el Sistema Compacto VITEK® 2, coloque una placa TSA +
5% de agar de sangre de oveja (SBA) desde la inclinación TSI, la inclinación LIA o una sola selección de
colonias del medio de recubrimiento si se inocula TSI y LIA sesgos en tándem. Incubar 16-24 ha 35 ± 2°C. Si
usa un control positivo para UV, realice una verificación de fluorescencia en la placa SBA para el control
positivo y las muestras presuntas positivas después de la incubación. Use luz UV de onda larga para examinar
la pureza de las placas y la evidencia de contaminación cruzada con el control positivo. Solo el cultivo de
control positivo debería fluorescer. Si las placas de SBA de muestra positiva presunta son puras y no
contaminadas, realice la prueba bioquímica.
Algunos sistemas comerciales de pruebas bioquímicas pueden requerir la formación de rayas en otros medios
no selectivos antes de la inoculación de su kit de prueba. Siga las instrucciones del fabricante.
Nota: Las placas pueden almacenarse hasta 96 horas a 2-8 ° C. Las placas almacenadas se deben rayar a una
nueva placa e incubar según las instrucciones antes de su uso.

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Tabla 2. Reacciones potenciales de Salmonella que requieren análisis bioquímicos. Se puede requerir trabajo
de cultivo adicional y se deben considerar otros factores antes de descartar cualquier muestra. No todas las
reacciones están cubiertas en este cuadro.
Triple Sugar Lysine Iron O group and Further Testing/

Iron Agar Agar H antigen Disposal
Butt Slant H2S Butt H2S O H
Y R + P + + + B. & M. T.
Y R + P + + - B. & M. T.
Y R - P - B. & M. T.
Y R - Y - + + B. & M. T.
Y R - Y - - - B. & M. T.
Y R + Y +/- B. & M. T.
Y or
Y Y - - Discard
P
Y Y + P + B. & M. T.
NC NC Discard
Y = Yellow (or A = acid reaction); R = Red (or K = alkaline reaction); P = Purple (or K = alkaline reaction);
B. & M. T. = Perform biochemical testing, e.g., VITEK® 2 Compact
System, and optional motility tests;
NC = No change in color from uninoculated medium.

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4.10 Almacenamiento y mantenimiento de cultivos
Para el almacenamiento a corto plazo (no más de 3 meses), inocular una inclinación de agar nutriente, incubar a
35 ± 2 ° C durante la noche y luego almacenar a 2-8 ° C. Para el almacenamiento a largo plazo, liofilice los cultivos
o congélelos a ≤ -70 ° C con crioperlas, es decir, Cryostor ™ o equivalente.
Mantenga cultivos de stock de Salmonella “activos” en sesgos de agar nutritivo o equivalentes. Transfiera los
stocks mensualmente a sesgos de agar nutriente duplicados, incube durante la noche a 35 ± 2°C y luego
manténgalos a 2- subcultivar
para reducir la posibilidad de contaminación.
4.11 Referencias utilizadas
Bailey, J. S., J. Y. Chiu, N. A. Cox, and R. W. Johnston. 1988. Improved selective procedure
for detection of salmonellae from poultry and sausage products. J. Food Prot. 51:391-396.
Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health (CDC/NIH).
2007. BioSafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5th ed. or current.
http://www.cdc.gov/od/ohs/biosfty/bmbl5/bmbl5toc.htm
Horowitz, William. (ed.). 2000. Official methods of analysis of AOAC International, 17th
Edition. AOAC International Inc., Gaithersburg, MD 20877.
Ewing, W. H. 1986. Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriaceae, 4th Edition.

Elsevier Science Publishing Co., Inc., New York.
Vassiliadis, P., D. Trichopoulos, A. Kalandidi, and E. Xirouchaki. 1978. Isolation of

salmonellae from sewage with a new procedure of enrichment. J. Appl. Bacteriol. 66:523-
528.
Vassiliadis, P. 1983. The Rappaport-Vassiliadis (RV) enrichment medium for the isolation of
Salmonellas: an overview. J. Appl. Bacteriol. 54:69-76.
3M® Molecular Detection System User Guide

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Descripción y propósito del cambio (s):

El ensayo de diferenciacion molecular rápido se revisó en la sección del equipo y se

Se agregaron instrucciones adicionales para realizer un control de fluorescencia en la placa

MLG 4C "Procedimiento FSIS para el uso de un ensayo de reacción en cadena de la

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 Sensibilidad del 90% o mayor.

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4.2 Precauciones de seguridad

4.3 Procedimientos de control de calidad

4.3.1 Controles del método

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4.3.2 Controles de procedimientos específicos

4.4 Equipos, reactivos, medios y kits de prueba

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4.4.2 Reactivos y sistemas de prueba

a. Colorante cristal violeta, solución acuosa al 1%

a. Agua de peptona tamponada (BPW) o caldo de soja de triptona modificada (mTSB)

4.5 Preparación de muestra

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325 ± 32.5 g 1625 ± 32.5ml BPW

Productos crudos de 325  32.5 g 975± 19.5 ml mTSB

Productos Siluriformes 25 ± 2.5 g 225 ± 4.5 ml BPW 35 ± 2C for

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4.5.1 Alimentos listos para comer carne, aves y siluriformes

c. Incubar a 35 ± 2 ° C Durante 18-24 h.

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4.5.2 Productos avícolas crudos

c. Incubar a 35 ± 2 ° C Durante 20-24 h.

4.5.3 Productos crudos de carne cruda y carne cruda

c. Incubar a 42 ± 1°C Durante 15-24 h.

4.5.4 Esponjas de cubiertas y esponjas ambientales

4.5.5 Enjuagues de aves enteras y partes

a. Para cuerpos de pollo:

b. Para partes de pollo:

c. Transfiera el líquido de enjuague de la muestra a un recipiente estéril.

e. Incubar a 35 ± 2 ° C durante 20-24 h.

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4.5.6 Productos de huevo pasteurizados líquidos, congelados o secos

e. Incubar a 35 ± 2 ° C durante 18-24 h.

4.5.7 Productos Siluriformes (Pescado) Crudos

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4.5.8 Productos fermentados

Siga el procedimiento para alimentos RTE en la Sección 4.5.1 excepto:

a. Mezcle / homogenice la muestra con 10 ± 0.2 g de carbonato de calcio esterilizado.

c. Incubar a 35 ± 2 ° C durante 18-24 h.

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4.5.10 Determinación de los números más probables (NMP)

4.6 Procedimiento de prueba de detección rápida de Salmonella

4.7 Medios de enriquecimiento selectivo y enchapado

b. Incubar a 42 ± 0.5°C durante 22-24 h o en un baño de agua a 42 ± 0.5°C durante 18-24 h.

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d. Incubar a 35 ± 2 ° C durante 18-24 h.

e. Seleccione colonias típicas.

4.8 Examen y selección de colonias de medios de recubrimiento

4.8.1 Seleccion de Colonias

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4.8.2 Medios de cribado

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