TRABAJO DE CURSO DE BIOINFORMÁTICA

Aplicación de análisis bioinformáticos al estudio del

inhibidor de serino proteasas CmPI-II, aislado del
anélido Cenchritis muricatus

Equipo 3

Eliany Arias del Río

Mayda Carrasco Alfonso

Yiliet Rodríguez Quevedo

Rancés Rodríguez Téllez

Bioquímica 4to Grupo 1

1. INTRODUCCIÓN
Los inhibidores de proteasas (IP) son las moléculas responsables de uno de los mecanismos de
regulación que emplean los seres vivos para controlar la actividad de sus enzimas dianas. Su
presencia en los más diversos tejidos indica su importancia para procesos vitales, al garantizar la
proteólisis parcial como evento fisiológico e impedir la proteólisis no deseada, mecanismos que
tienen lugar en prácticamente todas las células de los organismos vivos. Por lo mismo, los IP son
considerados herramientas bioquímicas útiles en los estudios de la relación estructura-función de
las proteasas y sus mecanismos de interacción, lo que los convierte en moléculas muy atractivas
dadas las múltiples potencialidades biomédicas y biotecnológicas que se les atribuyen (González
et al., 2010). El interés actual en el estudio de los IP está principalmente determinado por la
demostración del control de la proteólisis como instrumento farmacológicamente válido y su uso
con éxito en la terapéutica. El tratamiento del SIDA y de enfermedades inflamatorias,
inmunológicas y respiratorias, así como desórdenes cardiovasculares y neurodegenerativos, como
la enfermedad de Alzheimer, constituyen ejemplos de la eficiencia y las potencialidades de los IP
como productos terapéuticos (Camejo, 2016).
Los organismos marinos han resultado ser una fuente natural importante de compuestos con
diversas actividades biológicas, en especial de IP de tipo serino (Camejo, 2016). En el Centro de
Estudio de Proteínas de la Universidad de La Habana, se aislaron tres inhibidores de proteasas
con diferentes características estructurales y funcionales a partir del molusco marino Cenchritis
muricatus. El inhibidor mayoritario, CmPI-II, es un polipéptido de 50 residuos aminoacídicos,
con un peso molecular de 5480 Da y tres puentes disulfuro, que pertenece a la familia Kazal de
inhibidores canónicos (González et al., 2010). Los inhibidores canónicos constituyen el grupo
más abundante y más estudiado de los inhibidores de serino proteasas; como característica
distintiva presentan un lazo de unión a la enzima, que está expuesto al solvente y que es
complementario al sitio activo de la proteasa (Cabrera, 2017).
Los inhibidores Kazal están constituidos por uno o más dominios y se distinguen por sus
relaciones topográficas entre los enlaces disulfuro y por la localización del sitio reactivo. Esta
familia de inhibidores controla la acción de enzimas serino proteasas y está involucrada en
diversas funciones como la digestión, la defensa y la acción anticoagulante (Cabrera, 2017). De
manera general, un dominio Kazal típico está constituido por 40-60 residuos de aminoácidos, que
presentan la secuencia consenso CIXn-CIIXnPV-CIIIGXnYXn-CIVXn-CVXn-CVI (donde Xn
representa cualquier residuo de aminoácido en número variable). Cada dominio presenta seis
cisteínas que forman tres puentes disulfuro: CI-CV, CII-CIV y CIII-CVI, que estabilizan y
determinan su conformación característica. La posición del sitio reactivo o sitio P1* está
conservada entre los miembros de la familia y está ubicada en la segunda posición después de la
CII (CII-X-P1). El plegamiento típico de un dominio Kazal consiste en una hélice α y una hoja β
de tres hebras antiparalelas (núcleo central), y un 60% de estructura al azar, donde el segmento
amino terminal y la región cercana al lazo de unión a la enzima (lazo reactivo) son las zonas más
flexibles de la molécula. El lazo canónico o de unión a la enzima se encuentra entre la segunda y
la tercera cisteína y se extiende entre las posiciones P3-P3' donde el enlace P1-P1' puede ser
hidrolizado y resintetizado, sin que ocurran cambios conformacionales en el resto de la molécula.
El mecanismo de inhibición involucra al lazo de interacción convexo, extendido y expuesto al
solvente, altamente complementario al sitio activo cóncavo de la proteasa y con el residuo
reactivo ubicado en la región más expuesta del lazo (Cabrera, 2017). Ksjvsvshjv6llkgsvjm
*
Según la nomenclatura propuesta por Schechter y Berger en 1967, el residuo reactivo o sitio P1 del inhibidor se encuentra hacia el
extremo amino del enlace que es hidrolizado (P1-P1'); a partir de esta posición, los residuos que se encuentran hacia los extremos
amino y carboxilo se identifican como P1, P2, P3,…, Pn y P1', P2', P3',…, Pn', respectivamente.
Los inhibidores Kazal presentan hipervariabilidad en el aminoácido del sitio reactivo P1, cuya
identidad se considera el principal determinante de la especificidad. Generalmente, la presencia
de residuos básicos en esta posición indica la inhibición de tripsina y, la presencia de metionina,
leucina o residuos hidrofóbicos indican la inhibición de quimotripsina, elastasas y subtilisinas.
Por otra parte, se ha demostrado que el residuo P1 no es el único determinante de la especificidad
de este tipo de inhibidores. La variabilidad de los residuos de aminoácidos presentes en la región
del lazo de unión, así como la conformación y flexibilidad de este lazo, también contribuyen a la
especificidad y la fortaleza de la interacción con la proteasa diana (Cabrera, 2017).
El inhibidor CmPI-II define un nuevo subgrupo dentro de los inhibidores no clásicos de la familia
Kazal, de acuerdo al posicionamiento distintivo del puente disulfuro CI-CV en comparación con
otros inhibidores Kazal no clásicos (González et al., 2010). Este inhibidor, además, presenta la
peculiaridad de que es activo frente a proteasas de tipo serino como la subtilisina A de Bacillus
licheniformis (SUBTA), la elastasa pancreática porcina (EPP) y la elastasa de neutrófilos humana
(ENH), a pesar de presentar un residuo de arginina básico en posición P1 (Camejo, 2016). Un
residuo básico en esta posición tradicionalmente se ha relacionado con la inhibición de tripsina y
es inusual en los inhibidores de la SUBTA y la ENH. Esta peculiar capacidad de CmPI-II de
inhibir a la SUBTA y a la ENH es muy atractiva, debido al papel que juegan estas enzimas en
enfermedades infeccionas y en patologías respiratorias e inflamatorias, respectivamente
(Cabrera, 2017).
Por la importancia del inhibidor de serino proteasas CmPI-II, como herramienta para el estudio
de las funciones fisiológicas de la ENH y, por sus múltiples potencialidades terapéuticas, en el
presente trabajo se modelará, evaluará y caracterizará su estructura tridimensional, tanto
individual como en complejo con la ENH, mediante la aplicación de diferentes métodos
bioinformáticos.
1.1. OBJETIVOS
 Predecir la estructura 3D de CmPI-II.
 Determinar el grado de conservación de los residuos aminoacídicos del sitio reactivo
de CmPI-II en la familia de inhibidores Kazal.
 Predecir la estructura 3D del complejo de CmPI-II con la ENH.
 Predecir la importancia relativa de los residuos de CmPI-II involucrados en la interfaz
de interacción con la ENH.
2. MÉTODOS
2.1. PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA 3D DE CmPI-II
La predicción de la estructura 3D de CmPI-II se realizó mediante modelación por homología. La
secuencia aminoacídica blanco se obtuvo en formato FASTA utilizando la base de datos Uniprot
(http://www.uniprot.org/uniprot) y el código de acceso de CmPI-II (IPK2_CENMR). A fin de
encontrar secuencias similares a la de proteína blanco madura con estructura 3D resuelta, que
pudieran utilizarse como molde, se realizó una búsqueda en Uniprot con el programa BLAST. Se
escogió como molde el inhibidor de trombina infestina (Código Uniprot: Q95P16_TRIIF) con
score 108 y 50% de identidad de secuencia, que además también pertenece a la familia Kazal. El
inhibidor de trombina infestina tiene 2 entradas en la base de datos PDB, entre ellas se seleccionó
la estructura 2ERW con resolución de 1.40 Å y se inspeccionó con el programa visualizador de
estructuras PDB Pymol para revisar si el molde seleccionado era adecuado. Se observó que la
estructura presentaba moléculas no proteicas (agua e iones) procedentes de la cristalización que
no contribuyen a la modelación; para eliminarlas se editó el archivo PDB utilizando el programa
WordPad. Finalmente, la construcción del modelo se llevó a cabo empleando el servidor Swiss-
Model (http://swissmodel.expasy.org), donde se introdujo la secuencia blanco en formato FASTA
y el archivo PDB editado de la proteína molde. Para una mayor seguridad al elegir el modelo se
analizaron los resultados del Molprobity y del ploteo de Ramachandran. Para evaluar la calidad
del modelo obtenido se analizaron los parámetros de comprobación GMQE y QMEAN y,
además, se realizó una comparación visual con Pymol del modelo 3D resultante con la estructura
del molde utilizado y con la estructura de CmPI-II obtenida experimentalmente por Resonancia
Magnética Nuclear (RMN).
2.2. DETERMINACIÓN DEL GRADO DE CONSERVACIÓN DE LOS RESIDUOS DEL CENTRO
ACTIVO DE CmPI-II EN LA FAMILIA DE INHIBIDORES KAZAL
Primeramente, se identificaron los residuos que conforman el centro activo de CmPI-II de
acuerdo a los reportados por González et al., 2010. Para la determinación del grado de
conservación de estos residuos, se seleccionaron todos los inhibidores de la familia Kazal
resultantes del BLAST previo (18 en total), se descargaron sus secuencias en un archivo FASTA,
y con ellas se realizó un alineamiento múltiple de secuencias utilizando el programa Clustal
Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo). El resultado en forma de archivo MAS se
introdujo en el servidor Consurf (http://consurf.tau.ac.il/) y se seleccionó como secuencia query la
IPK2_CENMR, para obtener el grado de conservación de los residuos en dicha estructura, así
como los posibles residuos funcionales, estructurales, expuestos y ocluidos de la misma.
2.3. PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA 3D DEL COMPLEJO DE CmPI-II CON LA ENH
La predicción de la estructura 3D del complejo CmPI-II/ENH se realizó mediante acoplamiento
molecular (Docking) utilizando el servidor ClusPro (https://cluspro.bu.edu/). Para esto eran
necesarios los archivos en formato PDB de la ENH (Código Uniprot: ELNE_HUMAN) y el
modelo 3D de CmPI-II. La ENH tiene 22 entradas en la base de datos PDB, entre ellas se
seleccionó la estructura 3Q76 con resolución de 1.86 Å y se inspeccionó con Pymol en busca de
determinadas moléculas (agua, iones, ligandos) que deben ser eliminadas antes de realizar el
acoplamiento. Se observó que la proteína se encontraba en una forma homodimérica y que
contenía iones provenientes del proceso de cristalización. Para eliminar una de las cadenas
polipeptídicas y los iones se editó el archivo PDB utilizando el programa WordPad. Con el
objetivo de refinar el docking se introdujo en el servidor, junto a la estructura PDB del modelo
tridimensional del inhibidor y la estructura PDB editada de la elastasa, información experimental
de que el residuo de Arg12 en la secuencia aminoacídica del inhibidor es clave para la interacción
proteína-proteína (González et al., 2010).
2.4. PREDICCIÓN DE LA IMPORTANCIA RELATIVA DE LOS RESIDUOS DE CmPI-II
INVOLUCRADOS EN LA INTERFAZ DE INTERACCIÓN CON LA ENH
No todos los residuos aminoacídicos contribuyen de igual manera en las interacciones proteína-
proteína. A partir del complejo CmPI-II/HNE obtenido anteriormente, se construyeron in silico
mutantes puntuales de alanina empleando el servidor Drugscore (http://www.dsppi.de). Se
obtuvieron los valores de energía libre de formación del complejo, con los cuales fue posible
predecir la importancia relativa de cada residuo en la interfaz de interacción proteína-proteína.
2.5. DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA 3D DE CmPI-II
La búsqueda de posibles moldes mediante el programa BLAST en Uniprot arrojó 22 resultados:
21 de ellos con porcientos de identidad de secuencia comprendidos en el rango de 35.7% a 50% y
scores comprendidos en el rango de 73 a 110, y 1 de ellos con 61.9% de identidad de secuencia y
score de 73. Se seleccionó el inhibidor de trombina infestina (Código Uniprot: Q95P16_TRIIF,
con 50% de identidad de secuencia y 108 de score) que pertenece, al igual que el CmPI-II, a la
familia de inhibidores Kazal; esto indica, junto a la identidad de secuencia, que la estructura de
ambas proteínas debe ser similar. El modelo obtenido presentó un valor de GMQE de 0.64,
indicativo de buena calidad del modelo, y, un valor de QMEAN de 0.17, lo que implica que el
modelo es comparable a una estructura de tamaño similar obtenida experimentalmente. Sin
embargo, se debe mencionar que en el alineamiento de secuencias realizado por el servidor
Swiss-Model, se detectó homología desde el residuo 7 hasta el 50 del blanco (44 de los 50
aminoácidos que conforman CmPI-II) con respeto a los residuos del 4 hasta el 47 del molde, por
lo que el molde utilizado no cubrió toda la secuencia blanco, para un 90% de cobertura del blanco
aproximadamente (Fig. 1A). La calidad estimada de los residuos del modelo se muestra en la Fig.
1B, en la que se aprecia que debido a la baja similitud blanco-molde que comprende a los
residuos del 1 al 6, no se calculó QMEAN para estos residuos, lo que implica problemas en la
modelación de este segmento, razón por la que se introdujo un gap de 6 residuos en el modelo.

FIGURA 1: A) Cobertura de la secuencia blanco, esquemática y porcentual, según el

alineamiento de secuencias blanco-molde realizado por el programa Swiss-Model. B) Ploteo de
la calidad estimada de los residuos. Se muestra el número de los residuos del modelo (eje X) y el
valor local de QMEAN de cada residuo a partir del número 7 (eje Y).

Para analizar con más detalle la calidad del modelo, se examinaron los resultados del ploteo de
Ramachandran (Fig. 2) y del Molprobity. En la Fig. 2 se observa que no hay problemas
estructurales con el modelo, todos los residuos se encuentran dentro de las zonas verdes
permitidas. Los resultados del Molprobity arrojaron que no hay residuos con propiedades
geométricas inusuales, como malos ángulos, choques entre residuos o desviaciones de carbonos β
(datos no mostrados).
Las diferencias tridimensionales entre el modelo obtenido y el molde utilizado se muestran en la
Fig. 3, que se obtuvo mediante la superposición de ambas estructuras en Pymol. Como puede
apreciarse, sus principales diferencias radican en la orientación espacial de las hebras β, en el
número de residuos que las componen y en la longitud de los extremos C terminales, puesto que
el blanco a modelar tenía 50 residuos y el molde que se utilizó tenía 56 residuos.
 FIGURA 2: Ploteo de Ramachandran del programa
Swiss-Model. Se muestran los valores de los ángulos
phi (eje X), los valores de los ángulos psi (eje Y), las
zonas permitidas (verde) y las zonas prohibidas
(blanco).
FIGURA 3: Superposición modelo-molde
visualizada en Pymol. Se muestran el modelo
(rojo), el molde (azul) y los extremos carboxilo
terminales de ambos (Ct).

La Fig. 4A muestra el modelo tridimensional obtenido para el inhibidor CmPI-II, visualizado en

Pymol. El modelo 3D de CmPI-II mostró las características del plegamiento típico de los
inhibidores de la familia de Kazal: segmento amino terminal con estructura al azar, seguido de
dos hebras β antiparalelas (β1: Val17-Gly19; β2: Gly22-Tyr25), a continuación una hélice α (Pro28-
Cys38) y otra hebra β (β3: Ala45-Met47) hacia el extremo carboxilo; el resto son estructuras al azar
o lazos. En esta figura también se aprecia la presencia en el modelo de dos puentes disulfuro: i)
Cys10-Cys29 (CII-CIV) y ii) Cys18-Cys50 (CIII-CVI), y la presencia del lazo reactivo, que se extiende
desde la Cys10 hasta la Tyr15.
Con el objetivo de comprobar la fiabilidad del modelo obtenido por Swiss-Model y compararlo
con la estructura 3D de CmPI-II obtenida experimentalmente por RMN (PDB 2N71), se visualizó
también esta estructura mediante Pymol (Fig. 4B). La estructura obtenida por RMN está formada
por una hélice α (Pro28-Cys38), una hoja β compuesta por tres hebras antiparalelas (β1: Val17-
Gly19; β2: Val23-Tyr25; β3: Ile44-Met47) y estructuras al azar o lazos, con tres puentes disulfuro: i)
Cys4-Cys38 (CI-CV), ii) Cys10-Cys29 (CII-CIV) y iii) Cys18-Cys50 (CIII-CVI), y el lazo reactivo que se
extiende desde la Cys10 hasta la Tyr15. Como puede verse, los segmentos de estructura secundaria
del modelo de CmPI-II muestran una buena superposición con los de su estructura experimental.
A pesar de la buena similitud en estructura secundaria apreciada, al comparar el modelo
bioinformático (Fig. 4A) con la estructura RMN (Fig. 4B) de CmPI-II se pueden distinguir
diferencias marcadas entre ambos: falta de homología entre los extremos amino terminales y
variación en el número de puentes disulfuro. El análisis del número de puentes disulfuro mostró
que la estructura experimental presenta dos puentes (CII-CIV y CIII-CVI) en las posiciones
espaciales conservadas de los inhibidores de la familia Kazal y, adicionalmente, como la mayoría
de estos inhibidores, un tercer puente formado por las Cys4-Cys38 (CI-CV), cuya posición es
variable entre los miembros de esta familia (Cabrera, 2017). Como se mencionó anteriormente,
en el modelo no se modelaron los primeros 6 aminoácidos de la cadena polipeptídica blanco (que
incluye a la Cys4 que interviene en la formación del puente disulfuro CI-CV) debido a la falta de
similitud de secuencia blanco-molde que se encontró en este segmento (Figs. 1A y 1B), razón que
permite explicar la presencia en el modelo de solo dos de los tres puentes disulfuro esperados y la
poca superposición en los extremos amino encontrada. La falta de similitud en el segmento inicial
de CmPI-II con respecto al molde predicha por el programa Swiss-Model se ha comprobado
experimentalmente. Más aún, se ha demostrado que en CmPI-II existen diferencias estructurales
en la estructura tridimensional del extremo amino terminal y en la posición del puente disulfuro
CI-CV, con respecto al resto de los inhibidores de la familia Kazal (Cabrera, 2017).

FIGURA 4: A) Modelo de cintas y lazos de la estructura de CmPI-II obtenida mediante Swiss-Model.

B) Modelo de cintas y lazos de la estructura de CmPI-II obtenida por RMN (PDB: 2N71). Se muestran
la hélice α (rojo), las hebras β (amarillo), las estructuras al azar (verde), el lazo reactivo (azul), los
puentes disulfuro (círculos negros) y los extremos amino terminales (Nt).

3.2. DETERMINACIÓN DEL GRADO DE CONSERVACIÓN DE LOS RESIDUOS DEL CENTRO

ACTIVO DE CmPI-II EN LA FAMILIA DE INHIBIDORES KAZAL
En la Fig. 5 se aprecia el grado de conservación de los residuos de CmPI-II, resultante del análisis
mediante Consurf del alineamiento múltiple de secuencias realizado en Clustal Omega. En la
misma se puede observar la longitud de 40-60 residuos de aminoácidos y la presencia de la
secuencia consenso CIXn-CIIXnPV-CIIIGXnYXn-CIVXn-CVXn-CVI (donde Xn representa cualquier
residuo de aminoácido en número variable) que caracterizan a los representantes de la familia
Kazal. Aparecen además como altamente conservadas las Cys10, Cys18, Cys29 y Cys50 que forman
los puentes disulfuro Cys10-Cys29 (CII-CIV) y Cys18-Cys50 (CIII-CVI), que también distinguen a los
miembros de esta familia (Cabrera, 2017). La Cys10 también marca el inicio del lazo reactivo
(ubicado entre la segunda y la tercera cisteína, generalmente comprendido entre los residuos 10 y
15) y forma uno de los puentes disulfuro que lo estabilizan. La Cys18 marca el final del lazo
reactivo (Cabrera, 2017). Otros residuos del lazo reactivo, como la Thr11, la Arg12, el Glu13, el
Trp14 y la Tyr15 constituyen residuos moderadamente variables, lo que se corresponde con la
información experimental de que la variabilidad del lazo en la familia, constituye uno de los
determinantes de las diferentes especificidades y fortalezas de unión de los inhibidores con sus

FIGURA 5: Grado de conservación de los residuos de CmPI-II en la familia de inhibidores Kazal.

Se muestra la escala de conservación, el color azul denota los residuos variables y el color rosa
denota los residuos conservados; la intensidad del color en escala del 1 al 9 indica cuán variable o
cuán conservado está el residuo en cuestión. Las letras e indican residuos probablemente expuestos,
las letras b denotan residuos probablemente enterrados, las letras s denotan residuos con un posible
rol estructural y las letras f denotan residuos con un posible papel funcional.
proteasas diana (Cabrera, 2017). La posición del sitio reactivo o sitio P1 está conservada entre
los miembros de la familia y está ubicada en la segunda posición después de la segunda cisteína
(CII-X-P1). La identidad de este aminoácido se considera el principal determinante de la
especificidad (Arg12 en el caso de CmPI-II). Se conoce que los inhibidores tipo Kazal presentan
hipervariabilidad en este aminoácido; generalmente la presencia de un residuo básico en esta
posición indica una fuerte inhibición de la tripsina, y la presencia de residuos hidrofóbicos indica
una fuerte inhibición de quimotripsina, elastasas y subtilisinas (Cabrera, 2017). Se observa
también en la Fig.5 que la posición de la Cys4 está propuesta como altamente variable y la de la
Cys38 como moderadamente variable, lo que se relaciona con la posición diferencial en CmPI-II
del tercer puente disulfuro Cys4-Cys38 (CI-CV), con respecto a los restantes miembros de la
familia Kazal. Esta diferencia podría deberse a la especificidad inusual por elastasas y subtilisinas
de este inhibidor, a pesar de presentar un residuo básico en posición P1 (Cabrera, 2017). Otros
residuos como la Thr24 y la Asn30, que se sabe forman parte de los sitios de interacción (sitios P),
se muestran altamente conservados, mientras que la Val23 que pertenece al sitio P18’ del
inhibidor CmPI-II, se muestra como un residuo altamente variable en la familia. Por último, la
Arg12 está propuesta como residuo expuesto, lo que coincide con lo descrito en la literatura de
que el sitio P1 se ubica hacia la región más expuesta del lazo de interacción (Cabrera, 2017).
3.3. PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA 3D DEL COMPLEJO DE CmPI-II CON LA ENH
El programa ClusPro realizó un total de 70000 modelos, en los que se mantuvo fija la posición
del receptor y se varió la posición del ligando. Entre ellos escogió los 1000 que presentaron el
valor de energía libre de interacción más favorable y los agrupó en 10 clusters según la
desviación cuadrática media de las posiciones atómicas (RMSD), tomando como centro del
cluster al modelo donde la posición del ligando tuviera la mayor cantidad de modelos vecinos en
una distancia de 9 Å y como miembros del cluster a todos esos modelos vecinos. Los resultados
consisten en 10 modelos representantes de cada cluster que se encuentran ordenados de manera
descendente según el número de miembros que compone el cluster (datos no mostrados).
Para la visualización mediante Pymol de la estructura 3D del complejo CmPI-II/ENH (Fig. 6) se
escogió, siguiendo las recomendaciones del programa, el modelo representante del cluster 0 pues
este presentaba el mayor número de miembros (402) y valores favorables de energía de
interacción (-869.3 para el centro y mínimo de -1126.6).

FIGURA 6: A) y B) Visualización en Pymol del complejo de CmPI-II/ENH propuesto por el programa

ClusPro (cluster 0). Se muestran la ENH en conformación de superficie (verde pálido), el inhibidor CmPI-II
en conformación de cintas y lazos (amarillo), el residuo de Arg12 perteneciente al sitio de unión P1 en
conformación de líneas (rojo) dentro del bolsillo de unión de la elastasa (S1). En conformación de líneas se
muestran, además, los residuos Arg7 (verde), Lys8 (azul oscuro), Ala9 (salmón), Cys10 (naranja), Thr11 (violeta
claro), Glu13 (cian), Trp14 (marrón), Val23 (violeta), Thr24 (rosado oscuro), Ser26 (blanco) y Asn30 (negro),
pertenecientes a los sitios P.
En la visualización del modelo seleccionado se observa como la Arg12, el residuo clave en la
interacción del inhibidor con la elastasa (información que se introdujo en el programa con el fin
de refinar el acoplamiento), interactúa directamente, penetra y encaja en el sitio de unión de la
enzima, denominado bolsillo S1 (Fig. 6A), tal y como está reportado en la literatura para el
complejo CmPI-II/ENH (González et al., 2010), lo que es indicativo de la buena calidad del
modelo obtenido. Además, se observa (Fig. 6B) como el lazo reactivo y los demás residuos que
se sabe están involucrados en la interacción y forman parte de los sitios primarios y secundarios
de unión (sitios P) del inhibidor (González et al., 2010) se encuentran en contacto con la elastasa.
3.4. PREDICCIÓN DE LA IMPORTANCIA RELATIVA DE LOS RESIDUOS DE CmPI-II
INVOLUCRADOS EN LA INTERFAZ DE INTERACCIÓN CON LA ENH
La variación en la energía libre de unión del complejo (ddGcalc (kcal/mol)) es la diferencia entre
la energía libre de unión del complejo intacto y la energía libre de unión del complejo en el que
uno de sus residuos aminoacídicos fue sustituido por alanina. Su valor indica si el cambio fue
favorable para la estabilidad del complejo (ddG<0), en cuyo caso el residuo no sería relevante en
la estabilización, o desfavorable para la estabilidad del complejo (ddG>0), en cuyo caso el
residuo es fundamental en la interacción.
El servidor Drugscore realizó el scanning de alanina con los residuos involucrados en la interfaz
de interacción del modelo obtenido previamente en ClusPro (cluster 0). Todos los residuos
analizados arrojaron valores de ddG positivos, lo que indica que contribuyen a estabilizar el
complejo (Tabla 1). Los residuos del 10 al 15, como ya se mencionó, forman parte del lazo
reactivo del inhibidor por lo que es lógico que contribuyan a la estabilización de la interacción,
entre ellos, la Arg12 presentó el mayor de ddG (4.62) lo que se corresponde con los resultados
experimentales que plantean que este residuo, perteneciente al sitio primario de interacción P1, es
fundamental para la formación del complejo. A
TABLA 1: Valores de ddG y del grado
continuación de la Arg12, en términos de valor de ddG, de internalización para los residuos
se encuentra el Trp14 (1.77), que forma parte del lazo involucrados en la interfaz de
reactivo y además es un residuo expuesto, lo que indica interacción, obtenidos en el servidor
un papel funcional en la interacción. Luego se Drugscore, del modelo del complejo
encuentra la Asn30 (0.96), que se sabe forma parte de CmPI-II/ENH propuesto por el
programa ClusPro (cluster 0). Se
uno de los sitios P, la Tyr15 (0.60) que es también parte muestran resaltados los mayores
del lazo reactivo, el Gln37 (0.59) y el Glu49 (0.44) que valores de ddG (naranja) y subrayados
son residuos expuestos y podrían jugar un papel en la los valores mayores que 0.28 y menores
interacción, la Asn27 (0.47) que es un residuo enterrado que 1 (negro).
y podría jugar un papel en la estabilización de la
estructura del inhibidor, y por último, la Cys38 (0.37)
que se sabe forma un puente disulfuro fundamental en
la estabilización del lazo reactivo. El resto de los
residuos analizados mostró valores de ddG
comprendidos entre 0.05 y 0.28 kcal/mol, indicativos de
menor relevancia en la estabilización. Residuos como
Arg7, Lys8, Val23, y Thr24, que se sabe que forman parte
de los sitios P, no aparecen entre los resultados del
Drugscore, lo que puede ser indicativo de que el modelo
del complejo seleccionado no es muy confiable en
cuanto a la conformación de los sitios de interacción
inhibidor-elastasa.
4. CONCLUSIONES
En el presente trabajo se logró modelar, evaluar y caracterizar con éxito las estructuras
tridimensionales del inhibidor de serino proteasas CmPI-II y la de su complejo con ENH,
haciendo uso de diferentes métodos bioinformáticos. Los métodos bioinformáticos constituyen
herramientas útiles para predecir no solo el plegamiento 3D de proteínas aisladas y en complejo,
sino también para predecir sus características estructurales y funcionales, así como aminoácidos
conservados importantes para la actividad y para la interacción con otras proteínas o ligandos.
Siempre se debe recordar que un modelo no es una estructura experimental y por ello los
resultados de la modelación no deben tomarse como definitivos. Aunque lo ideal sería contar con
la estructura tridimensional determinada experimentalmente para la proteína o proteínas en
estudio, lo cierto es que muchas veces estos procedimientos escapan a las posibilidades de la
mayoría de los investigadores. A pesar de esto, para muchos estudios, los modelos
bioinformáticos son válidamente utilizados, pues cumplen con los requisitos indispensables. Las
innumerables aplicaciones de la Bioinformática, que no hacen más que perfeccionarse día a día,
la han erigido como una rama de la ciencia cada vez más robusta.

5. RECOMENDACIONES
 Modelar por otro método diferente al de homología utilizado en este trabajo, al inhibidor
CmPI-II y, comparar los resultados con los que se obtuvieron aquí y con la estructura
RMN de este inhibidor, para determinar si se logra obtener una modelación más cercana a
la estructura experimental.
 Analizar más modelos propuestos por el programa ClusPro para el complejo CmPI-
II/ENH, ya que el que mostró mejor puntaje y que se reportó como modelo más probable
puede no ser el más cercano a la estructura real. Realizar también los scanning de alanina
correspondientes para estos modelos y comparar sus resultados con los obtenidos en este
trabajo y con los reportados en la literatura.
 Predecir la estructura 3D del complejo CmPI-II/ENH por el método de modelación basada
en complejos homólogos y comparar sus resultados con los de docking obtenidos aquí.
Para ello se pueden considerar tanto complejos del inhibidor CmPI-II con otras serino
proteasas, como complejos de la ENH con otros inhibidores de la familia Kazal.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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3. González, Y., Gil, D., Alonso, M., Besada, V., Gil, J., Araújo, M. S., Tanaka, A. S., Pons, T.
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