Apuntes de Bioensayos.

1.- INTRODUCCIÓN Y PRINCIPIOS GENERALES.

Características generales del curso

1.1.1. Propósito y entrega de temario y calendario de prácticas de

laboratorio.

1.2. Conceptos Básicos.

Que es un Bioensayo??

Un bioensayo es el uso de un organismos VIVO como un agente de

prueba para la presencia o concentración de un compuesto químico o
un efecto ambiental.

1.2.1. Diseño Experimental.

Un experimento es una investigación planeada para descubrir

nuevos hechos o para confirmar o negar los resultados de
investigaciones previas. En un experimento se manipulan
deliberadamente una o más variables independientes (supuestas
causas) para analizar las consecuencias que la manipulación tiene
sobre una o más variables dependientes (supuestos efecto), dentro de
condiciones controladas por el investigador.

El diseño experimental, es el proceso de planeamiento de un

experimento, tal que se tomen datos apropiados con la mayor realidad
posible, los cuales deben ser analizados mediante métodos estadísticos
que deriven conclusiones válidas y objetivas. Podemos decir que la
filosofía del diseño experimental es la obtención de información con
una alta fidelidad sobre el mensaje de la naturaleza a un costo
mínimo.

Los diseños experimentales deben tener algunas características

como:
 1. Simplicidad. La selección de los tratamientos y la disposición
experimental deberá hacerse de la forma más simple posible.

2. Grado de precisión. El experimento deberá tener la

capacidad de medir diferencias entre tratamientos con los grados de
precisión que desee el investigador. Para cumplir con este propósito se
deberá partir de un diseño y un número de repeticiones adecuados.

3. Ausencia de error sistemático. Se debe planear un

experimento con el propósito de asegurar que las unidades
experimentales que reciban un tratamiento no difieran
sistemáticamente de aquellas que reciben otro tratamiento,
procurando de esta manera obtener una estimación insesgada del
efecto de tratamientos.

4. Rango de validez de las conclusiones. Este deberá ser tan

amplio como sea posible. Los experimentos que contribuyen a
aumentar el rango de validez del experimento son los experimentos
replicados y los experimentos con estructuras factoriales.

5. Cálculo del grado de incertidumbre. En todo experimento

existe algún grado de incertidumbre en cuanto a la validación de las
conclusiones. El experimento deberá ser concebido de modo que sea
posible calcular la probabilidad de obtener los resultados observados
debido únicamente al azar.

1.2.2. Organismo de Prueba.

La elección de un organismo de prueba adecuado para un

Bioensayo depende del efecto que se desea evaluar y de las
características del organismo, por ejemplo, un canario es un
organismo adecuado de un bioensayo para detectar gases tóxicos o
falta de oxígeno en una mina, porque se tiene el antecedente de su
uso para estos fines, los mineros entraban con un canario y si el
canario moría, por ser mas sensible, ellos tenían la oportunidad de
salir y no correr la misma suerte. Otros ejemplos de organismos de
prueba son, el uso de cerdos para detectar y colectar trufas, perros
para detectar explosivos y drogas, gametos de erizo de mar para
detectar eco toxicidad en agua de mar, Euglena gracilis para detectar
niveles de vitamina B12.

Lo anterior es útil para asegurarse que la respuesta de una

población expuesta a cierto agente tóxico se deba al efecto de éste y
no a variaciones tanto de la sensibilidad de los organismos como de
fallas operacionales en la aplicación del método.

Los Organismos de prueba pueden ser:

 Organismos criados en Laboratorio

 Organismos colectados en campo.

En general, es preferible utilizar organismos criados en el laboratorio

en vez de los recolectados en el campo porque los exámenes
estandarizados requieren de un abastecimiento siempre disponible de
organismos en buena salud provenientes de cultivos de condiciones
conocidas y constantes. Los bioensayos hechos en el laboratorio
usando organismos recolectados en el campo han sido menos
satisfactorios, con muy pocas excepciones. Los organismos
recolectados en el campo son más satisfactorios cuando el laboratorio
está cerca al lugar de recolección y el abastecimiento de agua desde
allí está siempre disponible, como es el caso de nuestro curso que
cuenta con un laboratorio que provee esas condiciones.
1.2.3. Material de Prueba.

Cualquier objeto orgánico o inorgánico donde se van a aplicar los

diseños experimentales con el fin de observar una respuesta,

Compuestos químicos, extractos, fuente de compuestos o materia que

pueden generar una respuesta biológica en los organismos de un

ecosistema. Puede ser material de prueba, el sedimento marino,

pesticidas, materia orgánica

1.2.3. Aplicación del análisis Estadístico.

En esta etapa se selecciona la(s) variable(s) respuesta(s) o

variable (s) dependiente(s). El experimentador debe estar seguro que
la respuesta que se va a medir realmente provee información útil
acerca de la investigación.

Cada respuesta medible, está representada matemáticamente en

un modelo lineal. La idea general de un modelo es expresar las

observaciones generalmente denotadas por , en términos de

“efectos'' que contribuyen a . Esos efectos se pueden clasificar en

tres categorías: Efectos de Tratamiento, Efectos de Diseño y Efectos
de Error.

Los efectos de tratamientos, son un reflejo del efecto de diseño

como también de los tratamientos simples o combinaciones de
factores.

Los efectos de diseño, son determinados por el diseño de control

de error, en particular, efectos debidos a las varias clases de bloqueo.

Los efectos de error, representan diferentes clases de variación

aleatoria. Estos son: (1) el error experimental y (2) el error
observacional.
 Error Experimental. Una característica de todo material
experimental es la variación. Asociada con la unidad experimental está
el error experimental, este error es el reflejo de que las UE no son
iguales. También podemos decir que es una medida de la variación
existente entre las respuestas de las UE tratadas en forma similar.
Contribuyendo al error experimental están:

a) El error de tratamiento, el cual resulta de cualquier falta de

uniformidad en la realización física del experimento o en la replicación
de un tratamiento. Por ejemplo, si se van a administrar 20 ppm de
cierta sustancia, administramos 19 ó 21 ppm.

b) El error de estado.o variabilidad inherente al material al cual

se aplican los tratamientos, el cual es debido a los cambios aleatorios
en el estado físico de una UE. Por ejemplo, en un experimento de
nutrición con camarones como material experimental, los individuos
tendrán constitución genética diferente, ésta es una variabilidad
inherente al material experimental o error de estado. Las camarones
se colocarán en jaulas sujetas a diferencias de calor, luz y otros
factores; esto constituye una falta de uniformidad en la realización
física del experimento o error de tratamiento.

Al hacer inferencia estadística, ya sea por intervalos de confianza

o pruebas de hipótesis, la magnitud del intervalo de confianza y el
poder de la prueba estadística dependen en definitiva del estimador de
la varianza del error experimental, llamado cuadrado medio del
error,

Así que para obtener intervalos cortos o alto poder la prueba se

debe hacer todo esfuerzo posible para reducir el error experimental.
Para lograr lo anterior debemos:
 Manejar el material experimental de tal manera que se logre
reducir los efectos debido a la variabilidad inherente.

Refinar la técnica experimental. Es responsabilidad del

experimentador que se haga todo lo posible para asegurar una técnica
cuidadosa porque ningún tipo de análisis estadístico puede mejorar los
datos obtenidos de experimentos mal efectuados. La técnica
defectuosa puede aumentar el error experimental de dos maneras:

i) Puede introducir fluctuaciones adicionales de una naturaleza

más o menos aleatoria y, posiblemente, sujetas a las leyes del azar.
Tales fluctuaciones, si son grandes, deberán revelarse por sí mismas
en la estimación del error experimental, posiblemente mediante la
observación del coeficiente de variación. Este es una medida de
variación relativa y es utilizado para comparar la precisión de dos
experimentos o de dos medidas.

ii) Mediante errores no aleatorios. Éstos no están sujetos a las

leyes del azar y no siempre pueden detectarse mediante la
observación de las medidas individuales. Se dispone de pruebas
estadísticas para detectarlo.

La técnica defectuosa también puede producir medidas

consistentemente sesgadas, lo que no afecta el error experimental en
las diferencias entre las medias de tratamientos, pero sí a los valores
de las medias de tratamientos.

En general la variación proveniente de una técnica deficiente no

es aleatoria y no está sujeta a las leyes del azar, en la cuales se basa
la inferencia estadística. Esta variación puede denominarse inexacitud,
en contraste con la falta de precisión. Desafortunadamente, la
exactitud en la técnica no siempre produce alta precisión ya que ésta
también tiene que ver con la variabilidad aleatoria entre las unidades
experimentales, la cual puede ser bastante grande.
 El error experimental no puede detectar sesgos; estima la
precisión o la repetibilidad de las medidas, pero no estima la exactitud.

Error Observacional. Se considera como parte del error

observacional el error de medida, es decir, el error debido a la
imprecisión de la medida o procedimiento de detección (aparatos) y el
error de muestreo debido a la selección de las UE para la
investigación.

1.3. Panorámica de la Aplicación del Bioensayo en problemas

relacionados con la bioprospección en el medio marino.

La evaluación de sustancias bioactivas o de condiciones

ecotóxicas requiere de la medición de una multiplicidad de parámetros
que se deben de tomar de manera y en cantidad suficiente para que
permitan extraer conclusiones a través de un análisis estadístico
correcto. A pesar de que en el mar viven unas 500,000 especies lo que
representa casi el 75% del total de especies del planeta, el número de
sustancias bioactivas, conocidas, de origen terrestres superan
considerablemente a las de origen marino. Esta diferencia se puede
deber a que el medio marino es mucho mas homogéneo que el
ambiente terrestre, principalmente en factores como la disposición de
luz, nutrientes y temperatura, sus variaciones no son tan drásticas y
probable la necesidad de generar sustancias para afrontar
adversidades y competencia es menor en el medio marino. También es
probable que el potencial de sustancias bioactivas del medio marino
se encuentre subevaluado debido principalmente a la dificultad de
acceso al medio marino, lo que se ha ido solucionando con los avances
en técnicas de buceo y de inmersión submarina.

La gran variedad de organismos que habitan en mares y océanos

y las posibles propiedades farmacológicas y médicas de sus extractos,
hacen del medio marino una fuente potencial de fármacos y un campo
abierto a la investigación en farmacognoscia marina (DE LARA-ISASSI
et al., 1989). A pesar de que en cantidad la lista de sustancias de
origen marino es menor a las de origen terrestre, en calidad hay
muchos ejemplos de sustancias; la saliva que el pulpo emplea para
inmovilizar cangrejos contiene un poderoso estimulante cardiaco
llamado 5-HT, Las microalgas generan toxinas muy potentes, el fluido
corporal del cangrejo cacerola inhiben el crecimiento de bacterias
coliformes, experimentación exploratoria en este mismo curso de
Bioensayos ha demostrado que la tinta del Invertebrado conocido
como “Vaquita” Aplysia californica inhibe significativamente el
crecimiento de bacterias coliformes, las esponjas producen Ectionina
que es un antibiótico de amplio espectro, la holoturina de los pepinos
de mar es un bloqueador nervioso. Además de los organismos
marinos, en general el agua de mar es un suero biológico que además
de contener sales disueltas contiene una gran cantidad y variedad de
materia orgánica entre esta materia se encuentran disueltas
hormonas, enzimas, toxinas y esteroides principalmente, lo que hace
del agua de mar un medio que inhibe y promueve reacciones
bioquímicas.

2. BIOÉTICA

Según la Encyclopedia of Bioethics (Nueva York 1978, vol. I, p.

XIX) la bioética es el "estudio sistemático de las ciencias de la vida y
del cuidado de la salud, examinada a la luz de los valores y de los
principios morales".

"...una primera aproximación -que podríamos llamar periférica- a la

bioética, como conjunto de temas atravesado por el cuestionamiento a la
idea del avance tecnocientífico como progreso lineal de la humanidad.
Esta forma de hacer bioética es más bien teórica y se inscribe en la visión
crítica de la ciencia y la técnica.".

Principalmente la bioética trata por medio de la aplicación de la

ciencia y la tecnología buscar una mejor vida en sociedad y de mejorar
la calidad de vida humana. Esta disciplina esta conformada por la
interacción de varias ciencias por lo que se fundamenta en la
experimentación con seres vivos. Se puede decir que en si, esta
ciencia trata de justificar la investigación en animales. Existen distintas
agrupaciones humanas que rechazan la idea de experimentar en
animales, ya que estos últimos tienen el mismo derecho a la vida que
un ser humano; pero también hay algunos movimientos humanos que
la apoyan y mantienen de esta manera a los laboratorios.

2.1. Utilidad del uso de los bioensayos en la investigación

biomédica y ambiental pros y contras.

PROS

La utilidad de los bioensayos recae primordialmente en ser un

método de detección relativamente simple y que se puede emplear
para el monitoreo de causas y sus efectos de tipo ambiental y en
farmacología. En un organismo, especial, la respuesta biológica
(efecto) se puede generar a concentraciones menores a los límites de
detección de los principales métodos analíticos y aunque, un método
analítico sea lo suficientemente fino para evaluar un nivel o
concentración de compuesto o causa de daño, sus datos no nos
indican el efecto biológico al ecosistema o al organismo de prueba los
cuales se pueden observar en los organismos aun cuando la exposición
a los compuestos o causas ha finalizado.

La detección de efectos en organismos se puede emplear para

monitoreo lo que es muy útil para

 Inspección o vigilancia antes y después de un evento o

dosificación de algún compuesto.

 Vigilar la efectividad de un proceso de remediación o

biorremediación.
  Vigilancia para asegurar el cumplimiento de parámetros
estatales y federales de calidad ambiental.

Estas acciones se pueden aplicar en:

 Toma de decisiones de corporativos industriales y/o compañías

biomédicas en el desarrollo, manufactura y comercialización de
nuevos productos.

 Cumplir requisitos de regulación para registrar nuevos productos o

procesos.

 Obtener permisos de descarga.

 Evaluación de riesgo ambiental.

 Elementos de cargo o descargo en litigios.

 Fuente de datos de calidad del medio ambiente para proteger

organismos de futuras afectaciones.

CONTRAS.

La principal desventaja de un bioensayo es que sus resultados,

difícilmente, generan información especifica de un compuesto, causa o
condición ambiental. Durante el desarrollo de los bioensayos los
organismos de prueba son sometidos a diferentes condiciones
experimentales en las cuales se incluye la muerte del organismo como
un efecto normal y el problema es que las causas de este efecto
pueden ser muchas y difíciles de detectar por medio de un Bioensayo
como para decir que en este proceso, valió la pena el sacrificio del
organismo.

En evaluación ambiental, la presencia o sobre vivencia de una

especie u organismo en un medio ambiente nos indica que este
ecosistema le provee lo necesario para solventar sus necesidades,
PERO la ausencia de un organismo en un ecosistema NO
necesariamente significa lo contrario o sea que el ecosistema no le
provea lo necesario.

2.2. 2.3. El Derecho de los animales a no ser usados en la

investigación Biomédica. Y El Derecho del hombre a utilizar
organismos para experimentación.

La Asociación Médica Mundial afirma que el uso de animales en

la investigación biomédica es esencial para el progreso médico, y a
pesar que se dice que en la experimentación con animales deben de
cumplirse las normas que rigen el trato compasivo de los animales,
esto no se cumple o de la misma manera sigue afectando al
organismo. Ya que al estar experimentando con animales y producir
alguna lesión es un proceso traumático aunque se utilicen anestésicos
ya que al terminar el efecto les producen dolor y se ven afectados en
la disminución de peso. Así mismo, el impacto de estrés sobre los
mecanismos fisiológicos se ha estado analizando al igual que el miedo,
que tan solo con sentir el acercamiento del hombre les causa miedo,
una posible solución sería tener un mayor acercamiento a los
organismos para que mitiguen el miedo ante la presencia humana.

Se conoce que la bioética tiene por objeto material los actos

humanos que suponen una intervención sobre la vida (no sólo humana
sino también animal y vegetal) para considerarlos bajo el punto de
vista formal de la ética, a saber, conocer si son buenos o malos para
guiar su obrar. Puesto que el número de animales que padece
sufrimiento por su empleo en la investigación representa un bajo
porcentaje de las muertes animales por actividades humanas causadas
por pesticidas, deforestación, construcción civil, maltrato, entre otras,
el sacrificio animal dirigido a la investigación científica es solo una
pequeña parte de las perdidas comparadas a las actividades humanas.
Lo cual pudiese fundamentar el derecho de los humanos a usar
animalitos u otros seres vivos.
2.4. Otras alternativas al uso de animales en experimentación
biomédica y en la enseñanza en la carrera de oceanología.

La creciente sensibilidad respecto a la experimentación en

animales en investigación biomédica y la enseñanza de las ciencias
naturales, y la búsqueda de enfoques nuevos en los aspectos prácticos
de la misma son parte de un debate actual y, probablemente,
necesario.

La utilización de animales de experimentación en investigación

Biomédica y en la enseñanza de las prácticas de diferentes
asignaturas de las Ciencias naturales y en especial en nuestra
Facultad en las prácticas de Fisiología, Bioquímica, Zoología, Química
Orgánica, Aprovechamiento de Productos Marinos, Acuacultura y por
supuesto en BIOENSAYOS ha venido siendo la metodología más
empleada por todos los profesores de estas disciplinas. Gracias a la
utilización de estos animales, los estudiantes han podido ver de cerca
los diferentes fenómenos que se les habían explicado anteriormente en
la clase de teoría. En la mayoría de los casos, excepto en
BIOENSAYOS, son prácticas cruentas donde varios animales son
sacrificados y además en la mayoría el fin didáctico no se cumple y el
estudiante se convierte. en un simple espectador. Es obvio que éste
era el único método del que disponían los profesores hace unos años
para enseñar. Pero en los últimos años las cosas han cambiado y el
avance de la informática y de las tecnologías de la imagen ha
permitido el desarrollo de numerosas alternativas que no requieren el
uso de estos animales para lograr los objetivos docentes que nos
planteamos con las prácticas.

El número de animales utilizados con fines educativos es

relativamente pequeño comparado con el número total de animales
utilizados en investigación y se ha venido reduciendo en los últimos
años, pero a pesar de ello todavía se puede reducir más. En el artículo
25 de la Convención Europea para la Protección de los Animales
Vertebrados utilizados en Experimentación y otros Fines Científicos se
especifica:

"aquellos procedimientos llevados a cabo con fines educativos o

de entrenamiento … se deben restringir a los absolutamente
necesarios para los fines relativos a la enseñanza y el entrenamiento y
se permitirán únicamente si sus objetivos no pueden ser conseguidos
por métodos audiovisuales u otros que sean suficientemente
efectivos".

En las legislaciones relacionadas con la protección de los

animales de todos los países se considera fundamental aplicar el
principio de las 3Rs, promulgado por Russell y Burch en 1959 (1). Este
principio nos indica la necesidad de Reemplazar los animales de
experimentación por otros métodos, siempre que sea posible y que el
nuevo método nos aporte el mismo grado de información.

En el caso de la docencia e investigación se plantea el reemplazo

de los animales de experimentación por otros métodos. Entre los
métodos propuestos se pueden citar: a) modelos, maniquíes y
simuladores mecánicos; b) películas y vídeos; c) simulaciones de
computadora y sistemas de realidad virtual; d) autoexperimentación
en el propio individuo; e) experimentos con plantas; f) uso de material
procedente de mataderos; g) estudios in vitro con líneas celulares y h)
aprovechamiento de animales muertos de forma natural o utilizados
después de un procedimiento científico.

3. RESPUESTA BIOLÓGICA A LAS SUSTANCIAS BIOACTIVAS

3.1. Composición y propiedades fisicoquímicas de las

membranas.

La membrana celular está constituida de lípidos y proteínas. La

parte lipídica de la membrana está formada por una película
bimolecular que le da estructura y constituye una barrera que impide
el paso de substancias hidrosolubles.

Las proteínas de la membrana están suspendidas en forma

individual o en grupos dentro de la estructura lipídica, formando los
canales por los cuales entran a las células, en forma selectiva, ciertas
substancias.

La selectividad de los canales de proteínas le permite a la célula

controlar la salida y entrada de substancias así como los transportes
entre compartimentos celulares. Las proteínas de la membrana no solo
hacen que el transporte a través de ella sea selectivo, sino que
también son capaces de llevar a cabo transporte activo (transferencia
en contra del gradiente de concentración).

Las demás funciones de la membrana, como son el

reconocimiento y unión de determinadas substancias en la superficies
celular están determinadas también por la parte proteica de la
membrana. A estas proteínas se les llaman receptores celulares. Los
receptores están conectados a sistemas internos que solo actúan
cuando la substancia se une a la superficie de la membrana. Mediante
este mecanismo actúan muchos de los controles de las células,
algunos caminos metabólicos no entran en acción a menos que la
molécula "señal", por ejemplo, una hormona, haya llegado a la
superficie celular.

En la membrana se localizan unas glicoproteínas que identifican

a otras células como integrantes de un individuo o como extrañas
(inmunoreacción). Las interacciones entre las células que conforman
un tejido están basadas en las proteínas de las membranas.

Resumiendo, la estructura de las membranas depende de los

lípidos y las funciones dependen de las proteínas.

3.2. Procesos de entrada de sustancias a través de membranas

Absorción

La absorción de un Xenobiótico se define como el proceso por

medio del cual éste atraviesa membranas y capas de células hasta
llegar al torrente sanguíneo. El mecanismo de ingreso del xenobiótico
al organismo usa los mismos mecanismos de transporte diseñados
para movilizar compuestos de estructura similar.

Los principales mecanismos de transporte son los siguientes:

Difusión simple (Pasivo). Depende de la existencia de un

gradiente positivo de concentración. La difusibilidad de una substancia
a través de las membranas biológicas depende de sus propiedades
físicoquímicas, las substancias polares de bajo peso molecular (hasta
600 daltons) pasan a través de los poros acuosos de las membranas,
mientras que, las moléculas hidrófobas se difunden a través de las
zonas lipídicas. En general, los lípidos penetran más fácilmente las
membranas que las moléculas ionizadas. A través de los poros
acuosos o canales de pequeño tamaño pueden pasar de modo pasivo
los compuestos hidrófilos, iones y electrólitos (PM menor 100)

La difusión simple es el mecanismo de transporte más

importante en la absorción de los Xenobióticos. La velocidad de
difusión pasiva se basa en la ley de Fick

dX DmAKmw(Cf  Ci )

dt d

Donde:

 Dm: Coeficiente de difusión del Xenobiótico en la membrana

(cm2/min)
 A: Superficie de la membrana (cm2)
 Kmw: Coeficiente de partición del Xenobiótico en la interfase agua-
membrana.
 Cf: Concentración del xenobiótico fuera de la membrana
 Ci: Concentración del xenobiótico en el interior de la membrana
 d: Grosor de la membrana en cm.
http://www.d.umn.edu/~sdowning/Membranes/diffusion.html
 Transporte activo.- El transporte activo, la endocitosis o la
difusión mediada por un transportador son los mecanismos por los
cuales se difunden los compuestos de peso molecular grande (sean
polares o liposolubles) y los que se transportan en contra del gradiente
de concentración. Requieren de un transportador y se consume
energia (ATP).

Cinética
Extracelular Memb Intracelular

X  P  XP 
V1
v3 X ' P
V2

El Xenobiótico fuera de la
membrana se absorbe y enlaza
al portador “P”a una velocidad V1
para formar el complejo XP, la
velocidad V2 es la velocidad de
desorción a la cual el xenobiótico
se separa de P y permanece
fuera de la célula.

V 1  X  P   V1  K1 X P 
V 2  XP   V2  K 2 XP 
En el equilibrio V 1  V 2  K1 X  P   K 2 XP  1

 X P   K 2  Kt Constante de Transporte

 XP  K1

[ X ' ] [ XP ]  V 3  K 3 XP  2

La concentración intracelular del Xenobiótico es directamente

proporcional a la concentración del complejo Xenobiótico-Portador.

La Endocitosis
 Existen dos formas la
Fagocitosis y la
Pinocitosis, se trata de
un proceso activo por
ejemplo la asimilación
de vitaminas a, d, y c

Difusión Facilitada

 Se realiza a favor de un
gradiente de concentración

 Necesita un portador

 No consume energia

3.3 Factores inherentes a los principios activos que influyen en

el efecto farmacológico.

Las propiedades fisicoquímicas de los Xenobioticos

Pequeño radio atómico o molecular

Grado de ionización
 Coeficiente de partición

Pka

Tamaño

Lipofilicidad

Solubilidad

En general pasan mas fácilmente moléculas de bajo peso

molecular, neutras y lipofílicas.

La absortividad de ácidos y bases débiles depende de su estado

de ionización y por lo tanto del pH y Pka. Se transportan más
fácilmente las formas no disociadas. La cantidad absorbida depende de
la velocidad de absorción y del tiempo de residencia del agente en la
superficie de transporte.

3.4. Factores inherentes a los organismos que influyen en el

efecto farmacológico.

Cuando el tóxico se ingiere, entra al Tracto Gastro Intestinal

(TGI), la mayor cantidad se absorbe en el estómago y en los intestinos
aunque también puede haber absorción en cualquier lugar del TGI,
incluyendo las absorciones sublingual y rectal.

El sitio de absorción depende en parte del estado de ionización

del compuesto. Los ácidos débiles es más probable que se absorban en
el estómago, donde hay un pH bajo, mientras que las bases débiles,
que están menos ionizadas a pH alto, se absorben mejor en el
intestino donde existen estas condiciones.

La gran área de absorción del intestino y los largos tiempos de

residencia, dependiendo de la movilidad intestinal, permiten que se
tengan absorciones considerables aunque el flux, cantidad
transportada por unidad de área y de tiempo, sea pequeño.
 La absorción de los xenobióticos usa los mismos mecanismos
que tiene el TGI para absorber los nutrimentos. Por ejemplo, el plomo
se absorbe en el intestino usando el sistema de transporte del calcio.

Para que un compuesto ingerido pueda alcanzar la circulación

general, accesar el resto del organismo y tener la posibilidad de causar
un daño, debe primero ser capaz de resistir:

 la acción de las enzimas digestivas,

 el pH del estómago,

 la biodegradación por la flora intestinal.

 la biotransformación por las enzimas hepáticas.

La absortividad del tóxico ingerido depende de sus propiedades

físicoquímicas. Como se mencionó antes, los compuestos liposolubles
de bajo peso molecular y los compuestos no ionizados se absorben
mejor.

Los xenobióticos se pueden ligar reversiblemente a las proteínas

plasmáticas, por medio de distintos tipos de uniones: interacciones
hidrófobas, puentes de hidrógeno y fuerzas de van der Waals. La
molécula de proteína tiene un número limitado de sitios donde se
pueden ligar, tanto los xenobióticos, como los compuestos endógenos.
Así que, un agente determinado tiene que competir con los demás
compuestos (xenobióticos y/o endógenos) por los sitios de unión
disponibles. La unión reversible del compuesto a las proteínas impide
la difusión simple pero no limita su transporte activo.

3.5. Modelos que explican la absorción, distribución,

biotransformación y excrecion de sustancias por los
organismos.

3.5.1. ADBE.

Adsorbción.
 Distribución

Biotransformación

Eliminación.

3.5.2. ADME

Adsorción

Distribución

Metabolismo

Eliminación

Los modelos ADBE y ADME representan la cinética de

transferencia de xenobióticos en un organismo y su efecto
farmacológico, a traves del estudio de estos modelos se generan las
terapias correspondientes para eliminar su efecto.

La interacción dinámica de todos los procesos que constituyen el

ADME, determina el tiempo que permanecerá un agente dentro del
organismo después de que éste ha sido expuesto a una dosis
determinada. Al estudio de la velocidad de cambio de la
concentración de las especies tóxicas dentro del organismo se
le conoce como toxicocinética.

Las tasas de cambio que se presentan en cada fase del ADME se

pueden modelar matemáticamente e integrarlas en un modelo que
represente la dinámica global del tóxico dentro del organismo.

Cada proceso, sea este de cambio de lugar y/o de identidad

química, se puede representar por una ecuación diferencial en la que
la derivada de la concentración con respecto al tiempo en un sitio
determinado, se expresa como una función de la concentración en ese
lugar. La constante de proporcionalidad se denomina velocidad
específica y normalmente se representa por la letra "k".
(http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/c2-3-5.html)
 Podemos representar al cuerpo por un modelo de un solo
compartimiento que sigue una cinética de primer orden si se supone
que se llega rápidamente al equilibrio en la interface sangre-tejido. En
este caso, el cambio de concentración en plasma refleja el cambio de
concentración en los tejidos. Este modelo establece que la velocidad
de eliminación de un compuesto, en un momento dado, sólo es
proporcional a su concentración. La variable eliminación incluye la
expulsión del compuesto por todas las rutas de excreción y la
desaparición por biotransformación. La cinética de primer orden se
representa matemáticamente de la siguiente manera:

dC/dt = - kelC

donde
C = concentración plasmática
kel = constante de velocidad de eliminación de
primer orden
t = tiempo al que se muestreó la sangre.

Este modelo indica que la velocidad global a la que procede el

ADME de un compuesto es directamente proporcional a la
concentración y que la velocidad no varía linealmente con la dosis,
sino que su variación es exponencial. La velocidad de eliminación es
alta cuando la dosis es alta, pero disminuye fuertemente a medida que
la concentración del tóxico disminuye.

Vida media es el tiempo que tarda el organismo en reducir a la

mitad la concentración del tóxico.

Si un compuesto tiene una vida media de 24 horas y su

concentración en un momento dado es 40 mg/L, en un día se bajará la
concentración a 20 mg/L, pero bajar esta concentración otros 20 mg/L
(bueno, casi 20 mg/L, digamos 19.8 mg/L) requerirá de más de 6 días.
 La constante kel se puede evaluar graficando la concentración
plasmática contra el tiempo en escala semilogarítmica. Se obtiene una
línea recta con pendiente - kel.

La mayoría de los compuestos siguen una cinética de primer

orden, pero no todos, el alcohol etílico sigue una cinética de orden
cero, en la cual la velocidad de eliminación es independiente de la
concentración y sólo es función del tiempo. La cinética de orden cero
se presenta cuando se saturan las enzimas de un camino metabólico.
Si la concentración de un agente es muy alta, se saturarán las enzimas
y su eliminación mostrará una cinética de orden cero aparente, aunque
a concentraciones no saturantes presente una cinética de primer
orden. Por el contrario, los compuestos que normalmente se eliminan
siguiendo una cinética de orden cero, cuando las concentraciones son
muy bajas, su eliminación sigue una cinética de primer orden
aparente. El modelo que representa la cinética de orden cero es:

dC/dt = Ko

Donde: ko es la constante de velocidad de

orden cero,
C y t tienen el mismo significado que en la
ecuación anterior

Cuando se tienen dosis repetidas el nivel del tóxico se aproxima

a la concentración de estado estacionario porque las velocidades de
eliminación y de absorción son iguales. Se necesitan aproximadamente
5 vidas medias para alcanzar el estado estacionario, así que los
compuestos que se eliminan muy lentamente tardan mucho en
alcanzarlo.

El cálculo de la concentración en estado estacionario se hace con

la siguiente ecuación:
 C* = FD/tTs

Donde:
C* es la concentración en el estado
estacionario;
D es la dosis;
F la biodisponibilidad o fracción de la dosis
absorbida;
Ts es el tiempo de residencia en el organismo y
t es el intervalo entre dosis.

3.6. Biotransformación.

Biotransformación Fase I

(http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/c2-3-4-1.html)

La Fase I es un conjunto de reacciones de oxidación que

preparan a los tóxicos para que puedan transformarse por las
reacciones de la Fase II. Esto lo logran transformando los grupos
funcionales del xenobiótico en sitios que pueden llevar a cabo
reacciones de la Fase II, o bien introducen grupos nuevos que le dan
esta característica. Para hacer este trabajo las células cuentan con dos
sistemas de enzimas, que tienen la función de introducir en el
substrato un átomo de oxígeno proveniente del oxígeno molecular
(oxigenasas de función mixta). Estos dos sistemas son las amino-
oxigenasas y los Citocromos P-450. Ambos sistemas se encuentran
localizados en el retículo endoplásmico. Las amino-monoxigenasas
oxidan aminas y compuestos sulfurados.

Los Citocromos P-450 están formados por dos proteínas

diferentes, una tiene función de reductasa y la otra es una
hemoproteína con actividad de oxigenasa. La oxigenasa es una
proteína, que en estado reducido y monoxicarbonada, presenta un pico
de absorción a 450 nm. Que es lo que le da el nombre a esta familia
de enzimas).

El mecanismo de la reacción de la oxidación del xenobiótico

catalizada por citocromo P-450, en términos generales es como sigue:
(A) el xenobiótico entra a su sitio activo que se encuentra en la
oxigenasa, (B) la reductasa transfiere un electrón al hierro hemático
reduciédolo del nivel (III) a (II), de férrico a ferroso, (C) la reducción
abre el sitio activo del O2, (D) el O2 entra a su sitio activo y oxida al
xenobiótico que está en la superficie de la enzima transfiriéndole uno
de los átomos de oxígeno.

Existen varios Citocromos P-450 que se diferencian en su

especificidad, por ejemplo, el P-450 IIE oxida al etanol y el P-450 IA
oxida al alfa-benzo-pireno.

Si la concentración de oxígeno en la célula es muy baja,

entonces la reacción catalizada por el Citocromo P-450 es una
reducción en la que el NADPH actúa como donador de iones hidruro.

Las reacciones de reducción más comunes son la transformación

de nitroderivados aromáticos a aminas, la azoreducción de aminas
primarias y la deshalogenación reductiva. La reducción puede dar lugar
a la formación de un radical libre más tóxico que el xenobiótico
original, capaz de producir daños en el ADN. Esta biotransformación es
entonces una bioactivación. Por ejemplo; el tetracloruro de carbono
sufre la deshalogenación reductiva produciendo el radical libre
triclorometilo.
 Reacciones Comunes de Oxidación en la Fase I.

Reacciones de Reducción Catalizada por Citocromo P-450.

 Reacciones de Exposición de Grupos Funcionales

Los Citocromos P-450 exponen grupos funcionales catalizando

reacciones de desalquilación, desaminación y deshalogenación . Las
peroxidasas catalizan reacciones entre los xenobióticos y los peróxidos
endógenos, permitiendo, al mismo tiempo, que la célula oxide al
xenobiótico y se deshaga de estos compuestos endógenos altamente
tóxicos. El producto de esta reacción es un alcohol que puede ser
destoxificado por una alcohol deshidrogenasa.

Biotransformación Fase II

La Biotransformación Fase II, tal como se mencionó

anteriormente, consiste en reacciones de conjugación, catalizadas por
un conjunto de enzimas, la mayoría de ellas localizadas en el citosol.
 Las reacciones consisten en agregar un grupo polar de tamaño
relativamente grande a los productos de las reacciones de la Fase I o a
los xenobióticos originales que contienen los grupos funcionales
apropiados para ser substratos de las reacciones de conjugación. Los
donadores de los grupos polares tienen que ser compuestos de alta
energía, ya que las reacciones de conjugación no son
termodinámicamente favorables.

El resultado que se logra con estas reacciones es un gran

incremento de la solubilidad en agua del xenobiótico.

Glucuronidación.- La reacción consiste en agregar un grupo

glucuronil en un grupo hidroxilo, amino o sulfhidrilo del tóxico. La
enzima que cataliza la reacción es la UDP glucuronil transferasa y el
donador del grupo polar es el ácido UDP glucurónico. La enzima se
encuentra localizada en el retículo endoplásmico, a diferencia de las
otras enzimas de la Fase II que se localizan en el citosol. Los
compuestos glucuronidados son muy solubles en agua y aparecen en
la orina y en la bilis. Existe un número muy grande de xenobióticos
que son substrato de esta enzima.

Sulfatación.- La reacción consiste en la transferencia de un

grupo sulfato de PAPS (3´-fosfoadenosil-5´-fosfosulfato) a un grupo
hidroxilo o amino en el xenobiótico. La reacción es catalizada por
sulfotransferasas, enzimas solubles localizadas en el citosol. El
producto de la reacción es un sulfato orgánico ionizado, muy soluble
en agua que se excreta en la orina.

Aminoacidación.- La reacción consiste en la formación de una

unión peptídica entre el grupo amino de un aminoácido, normalmente
glicina, y un carboxilo en el xenobiótico. Obviamente para que esta
reacción se pueda dar es indispensable que el xenobiótico tenga un
grupo carboxilo. Estos conjugados son eliminados en la orina debido a
que el sistema de transporte del riñón reconoce al aminoácido.
 Glutationización.- La glutationización consiste en la adición de
glutatión (GSH), a través de su grupo sulfhidrilo (nucleofílico), con un
carbón electrofílico del xenobiótico. La reacción es catalizada por la
glutatión-S-transferasa y el glutatión mismo es el cofactor de alta
energía. El glutatión es un tripéptido, Glu-Gli-Cis. El compuesto que se
forma se rompe en el riñón produciendo el Cis-derivado, que se acetila
para producir un conjugado del ácido mercaptúrico, el cual se excreta
en la orina. Esta reacción es importante en la destoxificación de
epóxidos y peróxidos. La glutatión-S-transferasa se encuentra en
células de muy diversos tejidos. Si esta reacción disminuye
significativamente el nivel celular de glutatión, el organismo puede
sufrir daños considerables debido a la peroxidación de lípidos o por
otros tipos de agresión química.

Metilación.- La metilación juega un papel menor en la

biotransformación de xenobióticos, excepto en la destoxificación de
arsénico. Los compuestos inorgánicos de arsénico se transforman en
metabolitos monometilados y dimetilados que son menos tóxicos. La
reacción consiste en la transferencia de un grupo metilo a un hidroxilo,
amino o sulfhidrilo, es catalizada por las metiltransferasas y el
compuesto donador de grupos metilo es la SAM (S-adenosil-
metionina). La metilación es importante en la transformación de
compuestos endógenos y forma parte en la biosíntesis de varios
aminoácidos y esteroides, así como en la metilación del ADN.

Las reacciones de la Fase I activan grupos funcionales, la

metilación los enmascara impidiendo que participen en reacciones de
la fase II, por lo tanto, si se metilan los xenobióticos se disminuye la
tasa de eliminación del compuesto.

Como se puede ver, varias de las reacciones de la Fase II

requieren de los mismos grupos funcionales, así que los compuestos
que pueden ser modificados por más de una enzima entran en
reacciones que son mutuamente competitivas.

Qué tanto tiene lugar una reacción determinada depende, de la

capacidad del tejido para llevar a cabo la reacción y de la afinidad de
la enzima por el substrato. La capacidad está definida por la cantidad
de cofactor presente en el tejido cuando éste es expuesto al
xenobiótico.

Capacidades y Afinidades de las Reacciones de

Conjugación

CAPACIDA AFINIDA
REACCIÓN
D D

Glucuronidació
Alta Baja
n

Aminoacidació
Media Media
n

Sulfatación Baja Alta

Glutationizació
Baja Alta
n

Acetilación Variable Variable

Por ejemplo, el fenol contiene un grupo hidroxilo y puede ser

transformado por una glucuroniltransferasa o una sulfotransferasa. La
capacidad de estas reacciones dependerá de la concentración celular
de UDP glucuronato y PAPS.

Cuando se administran cantidades pequeñas de fenol, aparece el

sulfoester en la orina, si se administran cantidades crecientes de fenol,
se incrementará la concentración del sulfoester y posteriormente
aparecerá el derivado glucuronidado. Esto significa que el fenol tiene
mayor afinidad por la sulfotransferasa, esta reacción procederá hasta
que se agote la disponibilidad de PAPS. Cuando se agota el PAPS se
empieza a utilizar el UDPglucuronato. En el caso de la N-acetilación,
las afinidades y capacidades pueden cambiar debido al polimorfismo
de esta enzima (acetiladores lentos contra los acetiladores rápidos).

Reacciones de Conjugación de Fase II.

Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) tienden a

bioacumularse en peces y moluscos, mientras que los peces tienen un
conjunto de enzimas de la fase I y II que asimila, distribuye,
metaboliza y elimina (ADME) estos compuestos y en cuestión de días
después de la exposición de estos tóxicos solo se encuentran niveles
detectables de PAHs en la bilis en forma de compuestos hidrosoluble,
producto de la fase II.

En los moluscos esta biotransformación es muy lenta y los PAHs

tienden a acumularse en estos organismos.
Bioactivación

La bioactivación es el conjunto de reacciones metabólicas que

incrementan la toxicidad de los xenobióticos, o sea que los metabolitos
resultantes de la biotransformación de la sustancia absorbida son más
tóxicos que el compuesto original. Por ejemplo las toxinas de las
mareas rojas incrementan su toxicidad cuando son metabolizadas en
el hígado de los peces.

La mayoría de las bioactivaciones son producidas por las enzimas

de la Fase I, aunque algunas de las enzimas de la Fase II también
pueden bioactivar algunos xenobióticos. Este efecto lateral indeseable
de la biotransformación ocurre cuando se producen especies químicas
muy reactivas, normalmente compuestos electrofílicos con gran
afinidad por los nucleófilos. El ADN, las proteínas y los lípidos son
nucleófilos.

La mayoría de las reacciones en los que se generan productos de

aducción de ADN y proteínas se deben a la interacción de estas
macromoléculas con los productos de las reacciones de bioactivación.
El acetoaminofén se N-hidroxila en el hígado, vía un Citocromo P-450.
El producto de la hidroxilación reacciona con proteínas del hígado,
produciendo hepatotoxicidad.

La aducción del ADN es un tema de estudio de gran importancia,

ya que da por resultado la transformación de las células normales en
cancerosas. El benzo-alfa-pireno es un cancerígeno que es bioactivado
en el hígado, formando un epoxidiol altamente electrofílico que se liga
al ADN.

Existen varios mecanismos por medio de los cuales una

substancia puede incrementar la toxicidad de otra:

 Inducción de Enzimas. Un xenobiótico puede inducir una enzima

que bioactiva a otro xenobiótico. Por ejemplo el etanol induce la
 síntesis del Citocromo P-450 que bioactiva al tetracloruro de
carbono. Esta interacción hace que el tetracloruro de carbono
sea más tóxico cuando se administra junto con alcohol

 Inhibición de enzimas. La inhibición también puede incrementar

la bioactivación. Por ejemplo, una substancia que bloquee la
síntesis de los Citocromos P-450 hará que el organismo se
vuelva más susceptible a los tóxicos que son destoxificados por
los P-450. Las substancias que inhiben la síntesis de Citocromo
P-450 también pudieran servir de antídoto si la especie tóxica es
producto de la bioactivación del xenobiótico por el Citocromo P-
450

Las rutas de Bioactivación son las siguientes:

1. El tejido blanco contiene las enzimas para bioactivar el

xenobiótico y es el sitio activo para la especie tóxica. El ejemplo
clásico de esta ruta es la bioactivación del tetracloruro de
carbono vía la deshalogenación por el P-450 del hígado,
produciendo el radical libre triclorometilo, el cual reacciona con
proteínas y lípidos del hígado.
2. Un tejido no blanco bioactiva al xenobiótico, el cual experimenta
otra bioactivación en el tejido blanco. Ejemplo, el benceno es
oxidado a fenol por los P-450 del hígado y este compuesto se
transporta hasta la médula ósea donde se transforma en hidroquinol,
un diol que causa daño en la médula ósea.

3. Un tejido no-blanco bioactiva el xenobiótico, el cual tiene sus

efectos en el tejido blanco. Ejemplo: el hexano se transforma en
2,5-hexanodiona por la acción del P-450 y la alcohol
deshidrogenasa del hígado. Este metabolito produce ligaduras
cruzadas en los neurofilamentos causando daño en nervios
periféricos.
 Ejemplos de Reacciones de Bioactivación

En resumen:

 La biotranformación Fase I son reacciones de oxidación

catalizadas por un sistema complejo de enzimas que convierten
los xenobióticos no polares en compuestos solubles en agua. La
mayoría de los xenobióticos no serían substrato de las enzimas
de la Fase II sin las transformaciones introducidas por las
reacciones de la Fase I
 A bajas concentraciones de oxígeno, los Citocromos P-450
pueden catalizar reducciones de los xenobióticos

 Las reacciones de la Fase I pueden dar lugar a bioactivaciones

 Las reacciones de la Fase II son adiciones de residuos polares en

los grupos funcionales del xenobiótico, normalmente producidos
en la Fase I, que dan productos mucho más solubles en agua
que los compuestos absorbidos y los productos de la Fase I
  Algunas reacciones de la Fase II producen compuestos menos
solubles en agua

 La capacidad de los tejidos para hacer transformaciones Fase II

depende de la cantidad disponible de cofactores en las
condiciones fisiológicas en las que se encuentra el organismo

Normalmente el organismo tiene las defensas adecuadas para manejar la

agresión química para lo cual cuenta con lo siguiente:

 las enzimas de las dos fases de la biotransformación

 la presencia de antioxidantes que eliminan radicales libres y
reducen especies tóxicas

 las proteínas plasmáticas que ligan los tóxicos en el plasma

sanguíneo impidiendo su difusión hacia los tejidos

La toxicidad ocurre cuando todas las defensas han sido vencidas.

Por ejemplo el fenol, como vimos anteriormente, se destoxifica
primero por sulfatación y después por glucuronidación. Cuando se
agotan los dos cofactores para estas reacciones, el fenol se empieza a
acumular y se produce su distribución hacia su sitio activo, la médula
ósea, donde produce su respuesta tóxica.

Oxiradicales y Estrés Oxidativo

Rand 1995. Cap 17 Fund. Aquatic Toxicology.

El Oxígeno vital para la vida, oxida la materia orgánica mientras

se reduce a agua. Cada molécula de O2 requiere 4e- para reducirse a
agua, la secuencia de la reacción es:
 O2  e 
 O 2 

O 2   e  2

H
 H 2O 2

H 2O 2  e  
H .
OH  H 2O

OH  e  
. H
H 2O

Reacción Neta

O 2  4e  4

H
 H 2O

En esta secuencia se producen radicales como el O 2-

(superóxido), H2O2 (peróxido de Hidrógeno) y OH-, que son muy
reactivos y perjudiciales a los sistemas biológicos. El O 2-, y el OH- son
radicales libres del oxígeno. El agua oxigenada; H 2O2, aunque no es un
radical libre es también muy reactiva y junto con el O 2- es un precursor
del OH-:

.OH  OH   O 2
O 2   H 2O 2 

Esta reacción es muy lenta sin embargo metales como el Fe y Cu

catalizan la reacción y facilitan la producción de .OH.:

O 2   Fe 3  Quelato 
 O 2  Fe 2  Quelato
Fe  2  Quelato  H 2O 2 
 .OH  OH   Fe  3  Quelato

Reacción Neta: O 2  H 2O 2 

.OH  OH   O 2

Compuestos que generan radicales libres:

Quinonas, Herbicidas, Nitro-Aromáticos, Hidroxi-Aminas

Aromáticas, Compuestos Azo, Quelatos de Metales; Fe-EDTA , Cu-
Bleumicina.

Mecanismos de defensa –Antioxidantes-

Los mecanismos de defensa de antioxidantes es el costo

Bioquímico que se paga por la eficiencia del oxígeno para producir
energía. Los radicales libres se generan por el oxígeno disuelto, la luz
UV y por reactivos oxidantes. Los antioxidantes, que reducen su efecto
nocivo, pueden ser de naturaleza hidrosoluble y liposoluble:

Hidrosoluble Liposoluble
Glutationa Vitamina E ( -Tocoferol)
 Vitamina C Vitamina A (-caroteno)
Xantofilas
SuperOxidasaDismutasa (SOD)
Catalasa
SOD
2O 2  2 H    H 2O 2  O 2
CAT
2 H 2O 2  2 H 2O  O 2

La célula no está indefensa contra estas especies reactivas,

tiene dos líneas principales de defensa para protegerse.

 La primera es la presencia de antioxidantes los cuales donan o

aceptan un electrón para formar intermediarios estables.
Ejemplos de ellos son el alfa-tocoferol, ascorbato y GSH.

 Probablemente de mayor importancia, particularmente en la

destoxificación de radicales oxigenados y del peróxido de
hidrógeno, son los sistemas de enzimas protectoras. Éstas
incluyen la peróxido dismutasa, la cual convierte el superóxido
en peróxido de hidrógeno, la GHS peroxidasa y la catalasa
convierten al peróxido de hidrógeno en agua.

Si el radical libre no es inactivado causará daños a la célula y

puede hacerlo vía la unión a un blanco o capturando un hidrógeno del
blanco.

Los radicales libres neutros, como el HO* y el Cl 3C*, se pueden

unir covalentemente a biomoléculas y alterar su función, o en el caso
que se unan a ADN el resultado sea una mutación.

Los radicales libres pueden capturar un hidrógeno de otras

moléculas, convirtiéndolos en radicales libres. La abstracción de
hidrógeno del ADN produce rompimiento o ligaduras cruzadas de las
cadenas, la abstracción por lípidos inicia la peroxidación de estos
compuestos.
 El daño por radicales libres está implicado en las lesiones
causadas por agentes químicos, por radiación, inflamación,
envejecimiento y reperfusión/isquemia.

Metabolismo de Metales y Toxicidad.

Se pueden clasificar en dos tipos

Metales esenciales : Cu, Mn, Zn

Metales no esenciales: Cd, Pb, Hg

La exposición a concentraciones elevadas de ambos tipos de

metales es tóxica, los metales generan enlaces no específicos a
biomoléculas. El metabolismo y biotransformación de un metal y su
enlaces dentro de las células, generan quelatos que bien pueden ser
almacenados en compartimientos intracelulares o pueden eliminarse.
Los mecanismos de biotransformación en macro y microalgas pueden
implicar diferentes procesos como la unión con Metalotioeninas,
síntesis de fitoquelatos o la formación de complejos con polifenoles o
Taninos.

Las Metalotieneinas son proteínas de bajo peso molécular ricas

en cysteina que compleja iones metálicos en anillos Tiol. La función de
estas proteínas es la de quelar las trazas de metales y reducir la
concentración de iones libres, citotóxicos.

Las microalgas se pueden emplear en la purificación de agua

contaminada con metales pesados. (W. Gekeler, E. Grill, E. Winnacker,
and M.H. Zenk, Arch Microbiol, 1988, 150, 197.)

En las algas pardas y en menor proporción las algas rojas,

contienen diferentes tipos de polifenoles sulfatados que tienen la
capacidad de quelar o secuestrar irreversiblemente una gran cantidad
de metales pesados. Los polifenoles algales estan compuestos
principalmente de unidades de 1,3,5-trihydroxybenzoid
(floroglucinol-). Los Tambien los Bromochlorofenoles como la sal
dibásica del potasio de 2,3,-dibromo-5-hydroxyl-1’,4-disulfato son
muy efectivos en secuestrar iones metálicos.

Estos mecanismos de biotransformación actuan como

reguladores de metales esenciales y no esenciales y modulan su
biodisponibilidad para las macromoléculas.

Se conoce que algas pardas como el Fucus vesiculosus tienen la

capacidad de asimilar grandes cantidades de metales sin sufrir daño en
su metabolismo.
 4. CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE ORGANISMOS DE
PRUEBA.

4.1. Principios de Weil.

4.1.1. Semejanza Metabólica

Para generar la dosis de referencia (DRf) de un medicamento

para su aplicación en Humanos se debe de considerar que existe un
factor de incertidumbre (Uf) que se presenta cuando se usan animales
de prueba como modelos de toxicidad para humanos. La magnitud de
esta incertidumbre de puede determinar por evaluación de las
variaciones Inter-químicas que existen entre las proporciones de dosis
asociadas con efectos toxicológicos similares en animales de
laboratorio y humanos:

Uf= NOAEL crónico en Animales/ NOAEL crónico en Humanos

NOAEL (Non Observed Adverse Effects Level) es el nivel de exposición

experimental que representa el máximo nivel probado al cual no se
observan efectos tóxicos. Para el propósito de evaluación de riesgos
éste es el dato clave que se obtiene de los estudios de Dosis-
Respuesta. Si las exposiciones experimentales fueron intermitentes, se
corrige el valor del NOAEL para que representen exposiciones
continuas.

De esta evaluación se observa que:

 La evidencia de toxicidad se incrementa con el peso corporal,

sin embargo los humanos no son siempre mas sensibles a
una dosis que los animales.

 Los valores de las proporciones de Uf son menores a 10 en la

mayoria de los casos pero no para todas las drogas.
  Mientras mas información se tenga sobre una droga en
diferentes especies, abulones, camarones, almejas y monos,
la dosis de referencia, DRf, que se obtiene permite reducir el
factor de incertidumbre, Uf.

 Los datos de comparación entre especies sugieren que las

proporciones pueden variar según la dosis empleada en el
ensayo.

Además de las consideraciones anteriores para la evaluación del

Uf, se debe de tener en cuenta la variabilidad interhumana, porque
cuando se tienen datos suficientes sobre el efecto de una droga en
Humanos, su dosis se puede estimar sin la necesidad de aplicar el
factor de incertidumbre Uf. Pero, cuando no existen datos suficientes
sobre seres humanos sensibles, al Uf se agrega otro factor de
incertidumbre que expresa la variabilidad en respuestas entre
individuos y se trata con un factor de 10 veces.

Este factor de incertidumbre asume que existe variabilidad de

respuesta entre humanos y que esta variabilidad no se puede obtener
categóricamente debido al tamaño de la muestra que se puede usar es
muy reducido. Este factor también implica que existen sub-poblaciones
de humanos que son mas sensibles a la toxicidad de un producto
químico que el promedio de la población mundial.

La variabilidad de respuesta a dosis de drogas es mayor en

humanos que en animales de laboratorio, existen diferencias
considerables entre humanos en su capacidad de metabolizar
Xenobioticos y el factor de 10 veces incluye entre el 80 y 95% de la
población.

Para calcular La dosis de referencia DRf se dividen los niveles

NOAEL sobre el producto de todos los factores de incertidumbre Uf,
observados.
 DRf= NOAEL/ Ufn

4.1.2. Vias de entrada.

Consideraciones sobre la vía de exposición. La filosofía

detrás del cálculo de la DRf es la misma, independientemente de cual
sea la vía de exposición, sin embargo, la forma de calcularla es
diferente.

Si en los estudios experimentales la exposición fue intermitente,

la DRf se calcula ajustando los valores observados de tal manera que
reflejen exposiciones continuas.

El procedimiento de cálculo de las dosis de referencia orales es el

descrito anteriormente.

Los valores tabulados de las DRf están expresados en mg de

substancia por Kg de masa corporal por día.

Cuando la vía de exposición es el aparato respiratorio, la

extrapolación de datos obtenidos con animales debe de considerar

 Las diferencias anatómicas entre el animal de estudio y el hombre.

Estas diferencias pueden afectar el patrón de deposición, salida y
redistribución de los contaminantes. Consecuentemente, las diferentes
especies, no recibirán la misma dosis de contaminante en los mismos
lugares del aparato respiratorio, aunque hayan estado expuestos a las
mismas concentraciones de partículas o gases.
 Las dosis calculadas en animales se convierten a dosis equivalentes en
humanos sobre las bases de consideraciones de fisiología comparada,
v.g., parámetros de ventilación y superficie de las diferentes regiones
pulmonares.

Las diferencias en las características físicoquímicas de los

contaminantes, tales como tamaño y forma de las partículas, o si el
contaminante es un aerosol o un gas, también influyen en los patrones
de deposición, salida y redistribución.
 Los valores de DRf tabulados se expresan en función de la
concentración del tóxico en el aire en mg por metro cúbico para una
exposición continua de 24 horas por día.

Otros índices. Además de las DRf se han calculado y publicado

otros índices de toxicidad que se denominan HA 1 y HA10 para
exposiciones de corta duración. Son concentraciones de contaminantes
en agua potable, a las cuales no se presentan efectos adversos si la
exposición es de una duración especificada, un día o 10 días
respectivamente. Estos índices de toxicidad no-cancerígena se
obtienen dividiendo el NOAEL por los Uf y UFM adecuados. Se basan
en que un niño de 10 Kg. ingiere 1 litro de agua por día y se incluye un
margen de seguridad para proteger a los miembros más sensibles de
la población. Los HAs no incluyen ningún riesgo cancerígeno aún si la
substancia es un cancerígeno potencial.

4.2. Criterios para la selección de organismos de prueba.

Se entiende por bioensayo un ensayo en que un tejido, organismo

o grupo de organismos vivos se usan como reactivo para determinar la
potencia de cualquier sustancia fisiológicamente activa cuya actividad
se desconoce (FAO, 1981).

Los bioensayos, o pruebas de toxicidad son experimentos que

miden el efecto de uno o más contaminantes en una o más especies
(Reish y Oshida, 1987), permiten evaluar el grado de toxicidad de una
sustancia química, un efluente, un cuerpo de agua, etc., empleando
organismos vivos (Esclapés, 1999). Puede determinarse la influencia
relativa de cada factor sobre los parámetros biológicos estudiados. Los
rangos de variación de los factores considerados pueden ser mayores
que los existentes en el ambiente natural, lo que muchas veces facilita
el estudio de su modo de acción. También pueden estudiarse
combinaciones de dos o más factores, lo que permite revelar la
existencia de antagonismos o sinergismos entre ellos. La posibilidad de
 controlar muchas de las variables hace posible la eliminación de las
fluctuaciones propias de las condiciones naturales, que generalmente
oscurecen o interfieren con la finalidad principal del estudio llevado a
cabo (Rodríguez et al., 1995).

Selección de Especies

Para obtener la máxima información de los bioensayos es

necesario escoger los organismos más apropiados. Se debe tener en
cuenta que requieren diferentes períodos de aclimatación en el
laboratorio, según las especies, y es sumamente importante que los
organismos de ensayo se manipulen con cuidado, no sufran daños, se
encuentren sanos y sean de edad o tamaño uniformes (FAO, 1981);
Según Henry (1988) la selección de organismos para bioensayos debe
basarse en:

 Los objetivos del programa toxicológico

 La información disponible sobre los posibles organismos

 Las características de las especies

 Las instalaciones y equipos de laboratorio

 El nivel de capacitación de los técnicos

Criterios generales de selección:

¿Existe suficiente información sobre la historia de vida del

organismo? ¿Sobre las técnicas de cultivo? ¿Sobre los procedimientos
de bioensayos? (Henry, 1988).

Los organismos acuáticos frecuentemente tienen ciclos de vida y

requerimientos de cultivo y de manejo complejos. El desarrollo de esta
información es una tarea larga que frecuentemente requiere años de
investigación. Es recomendable que se consideren solo aquellos
organismos de los que se tiene suficiente.
Adaptabilidad de los organismos como especies para
bioensayos.
 Adaptabilidad del organismo Comúnmente
utilizado como
Organismos para
un organismos
bioensayos Cultivo de Recolección
para
laboratorio de campo
bioensayos

1. Algas Excelente Disponoble Si

Muy difícil de
2. Protozoos Excelente recolectar Muy limitado
cultivo puro

3. Invertebrados

a. Planctónicos

Muy difícil de
1. Rotíferos Bueno recolectar Limitado
cultivo puro

Alta tasa de
mortandad
2. Cladóceros Excelente después de la Si
recolección de
campo

Alta tasa de
mortandad
3. Copépodos Mediano después de la Limitado
recolección de
campo

4. Camarones Bueno Bueno Si

b. Bénticos
 1. Anélidos Mediano Mediano Limitado

2. Insectos Bajo Mediano Si

3. Moluscos Bueno Mediano Si

4. Crustáceos Bajo Mediano  

4. Peces Excelente Alta tasa de Si

mortandad
después de la
recolección de
campo

(Henry, 1988)

¿Es apropiado el ciclo de vida de los organismos a los objetivos y

diseños? (Henry, 1988).

El diseño de los bioensayos tiene que ser cuidadosamente

considerado en el contexto del ciclo de vida del organismo. La mayoría
de los protocolos de bioensayos agudos y crónicos requieren
organismos jóvenes o recién nacidos. Sin embargo, algunos protocolos
tales como la prueba de crecimiento de ostras, se aplican a
organismos adultos. Asimismo, para pruebas crónicas que involucran
reproducción, el tiempo requerido para la reproducción del organismo
es un factor clave (Henry, 1988).

¿El bioensayo es para toxicidad en agua o en sedimentos? Para

sedimentos, ¿es el objetivo determinar las sustancias tóxicas que se
filtrarán hacia el agua superficial o las sustancias tóxicas que pueden
acumularse en los organismos bénticos? (Henry, 1988).

Los sedimentos pueden servir como fuentes de sustancias

tóxicas para el agua superficial o para los organismos bénticos que
viven en los sedimentos. Las sustancias tóxicas que se mueven desde
los sedimentos hacia el agua superficial pueden ser determinados
preparando lixiviados del sedimento para bioensayos. También pueden
ser de preocupación las sustancias tóxicas que están estrechamente
ligadas a los sedimentos y que pueden ser bioconcentradas en
organismos bentónicos, particularmente cuando éstos son un
componente importante de una cadena alimenticia que resulta en la
exposición humana (Henry, 1988). Los bioensayos para determinar
toxicidad en agua o de sedimentos en contacto con agua se realizan en
mejor forma con organismos planctónicos o de libre natación. Aún
cuando el sedimento puede ser el material de prueba, la toxicidad
puede ser evaluada exponiendo los organismos planctónicos a un
lixiviado o a un extracto del sedimento usando el agua superficial
(Henry, 1988). Si se sospecha la presencia de sustancias tóxicas
firmemente ligadas a los sedimentos, entonces deben usarse los
organismos bentónicos en contacto directo con los sedimentos. Estas
pruebas revelarán cualquier toxicidad de los sedimentos y también el
potencial de bioacumulación de las sustancias tóxicas y su
transferencia a través de la cadena alimenticia (Henry, 1988).
Características de un organismo óptimo para bioensayos:

 Representativo del ambiente, de amplia distribución en el país

o de importancia comercial (Esclapés, 1999).

 Disponibilidad, ser fáciles de encontrar, en número suficiente

y colectarse sin dificultad. Se debe tomar en cuenta
problemas con el transporte (FAO, 1981).

 Con un tamaño suficientemente pequeño para poseer los

necesarios por experiencia y que sean representativos para
los estudios estadísticos (FAO, 1981).

 De fácil cultivo, lo que garantiza un adecuado suministro de

organismos en los ensayos y el establecimiento con exactitud
de la edad o estado de desarrollo. La edad es de suma
 importancia en los bioensayos, ya que la sensibilidad puede
variar significativamente durante su desarrollo (Esclapés,
1999).

 Especies con gran susceptibilidad a exposiciones con

sustancias xenobióticas. Garantizando cubrir el peor de los
escenarios, y proporcionando resultados que ofrecen una alta
protección al resto de la cadena trófica (Esclapés, 1999).

El uso de más de una especie permitirá una determinación más

cuidadosa de toxicidad porque los organismos acuáticos varían en su
respuesta a las sustancias tóxicas. Por ejemplo, los peces pueden ser
más sensibles que los invertebrados a una sustancia química, mientras
que puede suceder lo contrario con otra sustancia química (Henry,
1988).

Organismos criados en el laboratorio para bioensayos. Ventajas:

Disponibilidad en forma inmediata de organismos aclimatados,
saludables, que han sido criados bajo las mismas condiciones (Henry,
1988). Los organismos cultivados minimizan la variabilidad genética
que supondría traer individuos capturados en diferentes localidades
geográficas (Esclapés, 1999). La respuesta de los organismos para
bioensayos a la sustancia tóxica está influenciada por factores tales
como su edad (los animales jóvenes son usualmente más sensibles),
dieta (los animales bien alimentados brindan respuestas más
consistentes), estrés (los organismos alterados son más sensibles) y
condiciones físicas como temperatura, luz y el nivel de oxígeno disuelto
en el agua (Henry, 1988). Los organismos para bioensayos cultivados
en laboratorio representan una fuente predecible de organismos de
prueba de una edad conocida. El uso de condiciones estándares de
laboratorio y de alimentación asegurará que todos los organismos de
prueba responderán a las sustancias tóxicas en forma similar con el
paso del tiempo. Es una característica importante cuando se comparan
los resultados de diferentes laboratorios (Henry, 1988). Desventajas:
Muchos organismos con ciclo complejo de vida o información
insuficiente sobre su cultivo no pueden ser cultivados en el laboratorio.
Por lo tanto, la variedad de organismos está limitada cuando se usan
los que han sido cultivados en el laboratorio. Los requerimientos de
cultivo para organismos acuáticos varían sustancialmente, aún entre
especies estrechamente relacionadas. Es necesario conocer el alimento
óptimo, la temperatura, el ciclo de luz y el agua a fin de mantener
cultivos continuos en el laboratorio. Aunque muchas algas,
invertebrados y especies de peces se han usado como organismos
para bioensayos, sólo existe información disponible sobre algunas
especies, que permiten un cultivo satisfactorio de laboratorio (Henry,
1988).

Falta de representatividad a las condiciones y organismos en la

comunidad a ser probada. El aspecto negativo de los organismos
estándares criados en el laboratorio es que ellos no son
necesariamente representativos de la comunidad acuática o de las
condiciones de salud de los organismos de cada lugar. Por lo tanto, si
el objetivo es estudiar un efluente específico o la descarga a un río o
lago, entonces deben considerarse los organismos recolectados en el
campo como una alternativa (Henry, 1988).

Organismos recolectados en el campo para bioensayos

Según Henry (1988), existen circunstancias en las que los organismos
recolectados en el campo son apropiados. Las siguientes son algunas
preguntas que necesitan hacerse antes de decidir usar los organismos
recolectados directamente del medio.

 ¿Puede recolectarse el organismo directamente del campo?

¿Esto ocurre en poblaciones grandes, monoespecíficas?

 ¿Están los organismos disponibles durante todo el año o sólo

durante ciertas estaciones?
  ¿Es el organismo sensible al manejo durante su recolección y
transporte al laboratorio?

 ¿Se adaptará el organismo al agua del laboratorio o se

necesita un abastecimiento de agua fresca diariamente desde
el campo?

Ventajas: Representativo de la comunidad impactada por el

efluente. Se puede seleccionar una especie importante en una
comunidad específica (Henry, 1988). Las pruebas de microcosmos
conteniendo muchas especies pueden prepararse fácilmente. Se
pueden desarrollar exámenes con varias especies en la misma cámara
de prueba. Los organismos que son compatibles, tales como caracoles,
almeja, peces y plantas acuáticas pueden incluirse en la misma
cámara de prueba, permitiendo un estudio simultáneo de efectos
múltiples (Henry, 1988). Los bioensayos hechos en el laboratorio
utilizando organismos recolectados en el campo han sido menos
satisfactorios, con muy pocas excepciones. Los organismos
recolectados en el campo son más satisfactorios cuando el laboratorio
está cerca al lugar de recolección y el abastecimiento de agua desde
allí está siempre disponible (Henry, 1988). Desventajas: El estrés y la
mortalidad frecuentemente están asociadas con los procedimientos de
recolección y transferencia. Muchos organismos pueden morir antes o
durante la prueba y otros pueden ser inusualmente sensibles a
sustancias tóxicas como resultado de la presión asociada con los
procedimientos de recolección y transferencia. Las muertes en los
controles pueden invalidar la prueba (Henry, 1988). La disponibilidad
de los organismos puede estar limitada. Muchas especies no abundan
durante todo el año o tienen varios cambios en su ciclo de vida (Henry,
1988). La edad, salud y condiciones de cultivo de los organismos son
desconocidas. No existe manera de obtener organismos
"estandarizados" del campo y frecuentemente hasta la edad es
desconocida (Henry, 1988). Los invertebrados son un grupo mucho
más diverso que las algas o los peces, con diferencias dramáticas en
su forma física, sus características históricas de vida y sus requisitos de
cultivo (Henry, 1988). Es conveniente el uso del plancton en los
bioensayos debido a su pequeño tamaño y porque con ellos es posible
realizar muchos ensayos en espacios reducidos. Su ciclo vital es muy
corto y se conocen sus necesidades nutricionales. Son buenos para los
estudios de bioacumulación, puesto que se ubican en el nivel más bajo
de la pirámide trófica (FAO, 1981).

5 ESTRATEGIAS PARA LA VALORACIÓN DE SUSTANCIAS

BIOACTIVAS.

5.1. Bioprospección.

La bioprospección es la búsqueda de elementos útiles de la

naturaleza, generalmente para fines comerciales o medicinales.

El potencial biomédico de los organismos marinos representa

una fuente muy grande de compuestos con actividad biológica de
importancia medicinal pero aun mas importante que esto representan
una fuente de modelos moleculares para la síntesis de medicamentos
mas eficientes.

5.1.1. PLANEACIÓN Y BÚSQUEDA DE ANTECEDENTES

Como la meta de la bioprospección es la identificación de nuevos

agentes farmacológicos, una pregunta muy importante es que
actividades se han observado y que conclusiones se han generado de
ellas?? Con respecto a la relación de actividad de acuerdo al phyla,
ambiente marino, temperatura, profundidad, localidad geográfica.

Con respecto al phyla se ha observado que la actividad es una

propiedad general, pero hay actividades específicas que se concentran
en cientos phylas, por ejemplo la actividad antifungal se observa
principalmente en los Holothuridos (Echinodermata). Durante la
campaña AHCE 1978 (Alpha Helix Caribbean Expedition) se evaluaron
unas 650 especies en actividades antibacteriales, antifungales y
antivirales, además de citotóxicas.

Actividades, antimicrobianas, antivirales y citotóxicas en

diferentes pilas. Bioprospección Alpha Helix Caribbean. 1978.

% de Especies activas
Phylum Especies E.c B.s. S.c. P.a. HSV-1 CV-1
evaluadas
Porifera 187 14 41 19 11(138) 14 62
Cnidaria 70 4 26 7 2 (66) 17 56
Ectoprocta 1 100 100 0 0 0 0
Mollusca 20 5 15 0 0 (17) 0 33
Annelida 3 33 0 0 0 0 0
Arthropoda 6 0 0 0 0 0 0
Echinodermata 36 0 3 50 26(27) 16 72
Chordata 27 15 37 15 14(22) 23 70
Cyanophyta 5 20 60 20 0 (4) 100 80
Chlorophyta 42 7 55 10 5 (41) 7 36
Phaeophyta 19 0 37 0 0 (18) 25 50
Rhodophyta 43 10 35 7 0 17 43
Tracheophyta 3 0 0 0 0 33 0

E.c. Escherichia coli, B.s. Bacillus subtilis, S.c. Saccharomyces cereviseae, P.a.
Penicillym atrovenetum., HSV inhibición del virus del Herpes simples, CV,citotoxicidad
a las células del higado de chimpancé a ≤; 200 μg/disco

Los datos de la expedición R/V Seward Jonson Sea Pharm en el

caribe occidental en 1985 y en Islas Galapagos en 1986, comparan las
actividades respecto a la profundidad e indican que a pesar de ser
localidades diferentes, las actividades son similares en las dos
localidadas. La actividad presenta patrones parecidos en organismos
bentónicos de profundidades de 600 a 762m. La principal limitante en
la colecta de organismos a profundidades superiores es por supuesto
el costo.

Son pocas las variaciones con la profundidad las actividades

antibacteriales y antifungales se reducen generalmente en organismos
colectados en aguas profundas. Este fenómeno probable esta
relacionado con las temperaturas del agua, ya que la incidencia de
actividades antibacteriales y antifungales en organismos colectados en
la costa oeste de España asi como en Maine y Nueva Escocia son muy
bajas mientras que las actividades citotóxicas y antivirales se
presentan en intervalos normales. Las actividades con respecto a la
temperatura del agua indican que los organismos de zonas trópicales
exhiben mayores actividades que aquellos de aguas templadas. Esto
se refleja principalmente en la presencia de Icthiotoxinas de esponjas
y holoturidos. Las aguas frias de las costas Nororientales de Estados
Unidos, orientales de Canada, Oeste de España y Nueva Zelanda son
zonas ricas de aprovisionamiento de sustancias con actividades
antitumor, citotóxicas y antivirales

La bioprospección de una gran cantidad de especias marinas

han producido la generación de agentes farmacéuticos en diferentes
áreas como antitumorales, antiinflamatorios, antivirales,
antibacteriales y citotóxicos.

5.1.2. Métodos para la colecta y acopio de datos.

Recolección de datos
Para la recolección de los datos o toma de observaciones se
deben tener en cuenta las siguientes recomendaciones:

i). El experimentador debe liberarse de toda simpatía personal

hacia determinado tratamiento que pudiera sesgar los resultados.

ii). Todas las observaciones que se tomen deben ser anotadas

cuidadosamente en un registro apropiado, no dejando nada a la
memoria. Los datos deben anotarse en forma ordenada, de tal forma
que puedan ser utilizados por otro experimentador si fuese necesario
en una fecha más o menos lejana, quien debe poder entender todas
las anotaciones.

iii) Se recomienda que el experimentador tome las

observaciones (aleatoriamente) olvidándose cuáles son los
tratamientos de las parcelas a fín de no dejarse influir por prejuicios
sobre determinados tratamientos.

iv). En algunos experimentos no es práctico tomar

observaciones en toda la unidad experimental, tal es el caso de
determinaciones químicas. En estos casos es recomendable muestrear
la unidad experimental para obtener subunidades. Generalmente hay
mas variabilidad entre las unidades que entre las subunidades
experimentales. Es por esto que no debe haber mucho interés en
muchas determinaciones químicas en cada unidad experimental, ya
que las subunidades solo sirven para estimar las UE, y el experimentar
está basado en la variabilidad entre las UE y no entre subunidades
experimentales.

Un aspecto muy importante en el desarrollo de los bioensayos es

la reproducibilidad de estas pruebas, lo que consiste en obtener
resultados similares con la misma sustancia química. Esto requiere que
las pruebas sean estandarizadas de acuerdo a protocolos muy
definidos. En el caso de la especie en estudio, el número de resultados
consecutivos contemplados se ajusta a lo recomendado por USEPA
(1990), organismo que establece para una correcta intra calibración un
número mínimo de cinco (5) bioensayos triplicados consecutivos. Otros
organismos internacionales, como EPS (1990), indican que se debe
ejecutar un número mínimo de veinte (20) bioensayos de toxicidad
consecutivos con el tóxico de referencia antes que se pueda realizar
una calibración intralaboratorio. El Laboratorio de Bioensayos ha
trabajado estrechamente bajo la guía de la US EPA, Los bioensayos,
como toda herramienta de medición, deben tener cierta precisión y
exactitud en sus resultados.

Organizaciones internacionales (ASTM, 1996; OECD 1993;ISO,

1996;EC, 1992 y USEPA, 1994) han estandarizado metodologías para
la realización de estos bioensayos con distintos organismos, en donde
además se describen métodos de cultivo, condiciones de los
experimentos, aplicabilidades y restricciones.

Una vez estandarizadas las metodologías experimentales, los

laboratorios que ejecuten el bioensayo deben realizar una calibración
de su método. La calibración es un proceso relacionado con los
conceptos que rigen el control de calidad, y cuyo objetivo es
determinar la precisión y exactitud que puede y debe alcanzarse en los
resultados generados por un determinado bioensayo. Lo anterior es
útil para asegurarse que la respuesta de la población expuesta a cierto
agente tóxico se deba al efecto de éste y no a variaciones tanto de la
sensibilidad de los organismos como de fallas operacionales en la
aplicación del método. La precisión y exactitud se determina con el
concurso de un químico llamado tóxico de referencia, el cual permite
definir un rango de variabilidad máximo aceptable en los resultados
generados por el bioensayo. Además, los resultados de la calibración
permiten definir en forma estadística el rango de sensibilidad de la
especie frente al tóxico de referencia, al tiempo de exposición y a la
manifestación biológica empleados.

Us Epa. 1990. Methods for measuring the acute toxicity of

effluents and receiving waters to freshwater and marine organism.
Fourth Edition. Report 600/4-90/027F.

Pruebas de hipotesis
 Si queremos decidir entre dos hipótesis que afectan a un
cierto parámetro de la población, a partir de la información de la
muestra usaremos el contraste de hipótesis, cuando optemos por
una de estas dos hipótesis, hemos de conocer una medida del error
cometido, es decir, cuantas veces de cada cien nos equivocamos.

En primer lugar, veremos cómo se escribirían las hipótesis

que queremos contrastar:

H0 se llama hipótesis nula y es lo contrario de lo que

sospechamos que va a ocurrir (suele llevar los signos igual, mayor o
igual y menor o igual)

H1 se llama hipótesis alternativa y es lo que sospechamos

que va a ser cierto (suele llevar los signos distinto, mayor y menor)

Los contrastes de hipótesis pueden ser de dos tipos:

 Bilateral: En la hipótesis alternativa aparece el signo distinto.

 Unilateral: En la hipótesis alternativa aparece o el signo > o el signo

<.

Podemos aceptar una hipótesis cuando en realidad no es cierta, entonces

cometeremos unos errores, que podrán ser de dos tipos:

 Error de tipo I: Consiste en aceptar la hipótesis alternativa cuando la

cierta es la nula.

 Error de tipo II: Consiste en aceptar la hipótesis nula cuando la

cierta es la alternativa.

Estos errores los aceptaremos si no son muy grandes o si no nos importa

que sean muy grandes.

 alfa: Es la probabilidad de cometer un error de tipo I.

 beta: Es la probabilidad de cometer un error de tipo II.

De los dos, el más importante es alfa que llamaremos nivel de significación

y nos informa de la probabilidad que tenemos de estar equivocados si
aceptamos la hipótesis alternativa.
 Debido a que los dos errores anteriores a la vez son imposibles de
controlar, vamos a fijarnos solamente en el nivel de significación, este es
el que nos interesa ya que la hipótesis alternativa que estamos
interesados en probar y no queremos aceptarla si en realidad no es
cierta, es decir, si aceptamos la hipótesis alternativa queremos
equivocarnos con un margen de error muy pequeño.
El nivel de significación lo marcamos nosotros. Si es grande es más fácil
aceptar la hipótesis alternativa cuando en realidad es falsa. El valor del
nivel de significación suele ser un 5%, lo que significa que 5 de cada 100
veces aceptamos la hipótesis alternativa cuando la cierta es la nula.
Solamente vamos a estudiar el contraste bilateral para la media.

CONTRASTE DE HIPÓTESIS BILATERAL PARA LA MEDIA

Si se cumple una de las siguientes hipótesis:

 El tamaño de la muestra es mayor de 30 y la variable sigue un

modelo normal.

 El tamaño de la muestra es mayor de 100.

Estudiaremos el siguiente contrate de hipótesis bilateral:

Calculamos los siguientes valores: 

 , valor experimental que se calcula a partir de la muestra.

 , valor teórico y es el valor que en la distribución N(0,1) deja a

su derecha un área de alfa/2 para un nivel de significación alfa. Es
el valor z que definíamos ala principio del tema.

La regla de decisión fijado el nivel de significación, alfa, es la siguiente:

  Si   se acepta la hipótesis alternativa, llegamos a la
conclusión de que la hipótesis es cierta.

 Si se acepta la hipótesis nula, en realidad no podemos

afirmar que sea cierta, sino que la hipótesis alternativa no es
cierta, ya que el margen de error con el que se acepta la hipótesis
nula es muy grande.

Actividad 21. Un equipo de psicólogos han comprobado que en cierta

población infantil, el tiempo (en minutos) empleado en realizar
determinada actividad manual, sigue un modelo Normal de probabilidad.
Un grupo de 36 niños, seleccionados aleatoriamente en dicha población,
realizaron esa actividad manual en un tiempo medio de 6,5 minutos con
una desviación típica muestral de 1,5 minutos. A partir de esta
información, para un nivel de significación del 1% (alfa=0,01) ¿podíamos
rechazar la hipótesis de que el tiempo medio en la población es de 7
minutos? Utiliza la escena siguiente.

  

No podemos aceptar la hipótesis alternativa, y por lo tanto no podemos

rechazar la hipótesis de que el tiempo medio en la población es de 7
minutos.

Actividad 22.  El gerente de una empresa selecciona aleatoriamente entre

sus trabajadores una muestra de 169 y anota el número de horas de
trabajo que cada uno de ellos ha perdido por causa de accidentes
laborales en el año 2001. A partir de la información obtenida determina,
en esos 169 trabajadores, un número medio de horas perdidas por
accidentes laborales en el 2001 de 36,5 horas. Sabiendo que: 
 donde representa el número de horas perdidas por el i-ésimo
trabajador.

a)  ¿Podríamos rechazar, con un nivel de significación del 1% la hipótesis

de que el número medio de horas perdidas a causa de accidentes
laborales en esa empresa durante el año 2001 fue de 35 horas?

b) ¿Y para un nivel de significación del 5%?

Adaptación de María Vicenta Cabalgante Perera

de la unidad:

http://descartes.cnice.mecd.es/Bach_HCS_2/inferencia_estadistica/index_inferencia.htm

en If adequate toxicity data on humans do not exist, then

experimental animal data are used as the basis of the assessment, and
an uncertainty factor of 10 is routinely applied to the NOAEL. The basic
assumptions for this uncertainty factor are that the results seen in
experimental animals are relevant to humans, that toxicokinetic and
toxicodynamic differences exist among species, and that humans are
more sensitive than animals at a given mg/kg/day dose or mg/m 3
concentration. A number of authors have tried to quantify this area of
uncertainty by investigating the ratios between animals and humans,
and between different animal species for a number of parameters.
 Weil, C.S. (1972). Statistics vs safety factors and scientific
judgment in the evaluation of safety for man. Toxicol. Appl.
Pharmacol. 21, 454-463.

Weil, C.S., and McCollister, D.D. (1963). Relationship between

short- and long-term feeding studies in designing an effective toxicity
test. Agric. Food Chem. 11, 486-491.

Factores de Incertidumbre en dosis de medicamentos entre

Humanos y pruebas con animales

Variabilidad De Interhuman

Siempre que sea posible, los datos sobre seres humanos se

utilicen para conducir el gravamen de riesgo del noncancer, de tal
modo evitando los problemas inherentes con la extrapolación de los
interspecies. Si existen los suficientes datos sobre individuos sensibles,
la dosis subliminal se puede estimar directamente, es decir, sin la
necesidad de un factor de la incertidumbre. Si no existen los datos
adecuados sobre seres humanos sensibles, se encuentra una
incertidumbre que se debe tratar -ma's a menudo con un factor 10-
fold. Este factor de la incertidumbre asume que ocurre la variabilidad
en respuesta a partir de un ser humano al siguiente y que esta
variabilidad no se pudo haber detectado en el estudio, generalmente
debido al tamaño de muestra pequeño. Este factor puede también
asumir que existen las subpoblaciones de seres humanos que sean
más sensibles a la toxicidad del producto químico que la población
media.

Dourson y Stara (1983) describen un análisis de los datos agudos de la

toxicidad en animales de experimento en 490 productos químicos de Weil
(1972), que sugirió que para el cerca de 92% de los productos químicos un
factor de diez veces rindiera una reducción adecuada de una respuesta
mediana . Concluyeron que un factor de diez veces para explicar
variabilidad interhuman fue apoyado indirectamente, pero que puesto que
 los animales de experimento son generalmente menos heterogéneos
cuando están comparados a los seres humanos, el factor de diez veces no
era necesariamente conservador. Calabrese (1985) encontró diferencias
considerables entre temas humanos en su capacidad de metabolizar
sustancias extranjeras, y concluyó que un factor de diez veces
proporcionó la protección para cerca de 80-95% de la población. Esta
conclusión, sin embargo, fue basada en la suposición que el factor de diez
veces era explicar la gama total de la variabilidad humana. Hattis et el al.
(1987) analizaban 101 modems de los parámetros toxicokinetic individuales
para 49 sustancias específicas (sobre todo drogas) en los grupos de
adultos cinco o más sanos. Estos datos sugirieron que un factor de diez
veces de la incertidumbre considerara el cerca de 96% de la variación en
estos parámetros toxicokinetic. Sin embargo, estos datos también midió la
gama total de la variabilidad humana en este experimento, y no el punto
medio a la variabilidad humana sensible. Sheeman y Gaylor (1990)
compararon los cocientes del LD 50 del adulto a los mamíferos recién nacidos
para 238 productos químicos como medida de variabilidad de los
intraspecies. El cociente mediano era 2,6 (adulto a recién nacido). Los
cerca de 86% por de los valores eran menos que un cociente de diez veces,
similar a las observaciones Dourson y Stara (1983).

En general, el valor prefijado de 10 para la variabilidad interhuman aparece

ser protector al comenzar de una respuesta mediana, o por inferencia, de
un NOAEL asumido para ser de un grupo medio de seres humanos. Sin
embargo, cuando NOAELs está disponible en una subpoblación humana
sensible conocida, o si el toxicokinetics o el toxicodynamics humano se
sabe con una cierta certeza, este valor prefijado de 10 se debe ajustar o
substituir por consiguiente.

Animal to Human

If adequate toxicity data on humans do not exist, then

experimental animal data are used as the basis of the assessment, and
an uncertainty factor of 10 is routinely applied to the NOAEL. The basic
assumptions for this uncertainty factor are that the results seen in
experimental animals are relevant to humans, that toxicokinetic and
toxicodynamic differences exist among species, and that humans are
more sensitive than animals at a given mg/kg/day dose or mg/m 3
concentration. A number of authors have tried to quantify this area of
uncertainty by investigating the ratios between animals and humans,
and between different animal species for a number of parameters.

For example, Brown and Fabro (1983) identified the lowest effective dose to
cause teratogenicity in animals and humans for eight chemicals. Ratios
(animal-to-human) vary from 1.8 to 50, with a geometric mean of 7. For the
chemicals examines, these authors state that humans appear to be more
sensitive, although the difference is generally less than an order of
magnitude. Dourson and Stara (1983) showed an interspecies adjustment
factor calculated as the cubed root of the ratio between the assumed
average human body weight (70 kg) and animal weight. Assuming that
such an adjustment could account for all of the differences in animal to
human extrapolation, then a 10-fold factor accounts for many of the
experimental animal to human differences. Ford (1990) suggests that
kinetic and metabolic data, when available, should be used in the
assessment of the likely human health hazard of reproductive toxicants
from animal toxicity data. Calabrese et al. (1992) and Hoel et al. (1975) have
recommended that an uncertainty factor for animal-to-human extrapolation
and a technique for dose normalization be considered separately. In this
case, the adjustment based on body weight might account for toxicokinetic
differences; toxicodynamic differences would be addressed by a separate
factor. An example of this recommendation which might be worked into the
existing subthreshold dose methods is provided in the Renwick (1993)
approach discussed in the next section.

Perhaps the most promising research in the area is that of physiologically-

based pharmacokinetic (PBPK) modeling. Such modeling can serve as the
basis for replacing the toxicokinetic component of the traditional 10-fold
uncertainty factor for interspecies extrapolation in noncancer risk
assessment. The use of PBPK models for this purpose is likely to grow
 (Jarabek 1995a,b). Agencies such as Health Canada, IPCS, and EPA have
positions reflecting the use of reduced interspecies UF when dosimetric
adjustments, toxicity data or comparative toxicokinetics are available.

Less-than-Chronic Studies to Chronic

The subchronic-to-chronic UF is based on the assumption that an effect

seen at shorter durations will also be seen after a lifetime of exposure, but
at lower doses. This factor also assumes that effects may only be seen
after an experimental group is exposed chronically. In fact, several
investigators have examined subchronic-to-chronic ratios of NOAELs and
LOAELs, and the average differences between subchronic and chronic
values are only 2 to 3, while some small percentage of chemicals have
ratios that exceed 10-fold (McNamara, 1976; Dourson and Stara 1983;
Woutersen et al., 1984; Aida et al. 1992; Kadry et al., 1995). Lewis (1993)
showed an analysis of subchronic-to-chronic NOAEL ratios based on peer-
reviewed literature or information from the U.S. National Toxicology
Program. Criteria for inclusion in their analysis were rigorous. Of 54
chemicals considered, only 18 chemicals were analyzed. Of these, 78% had
ratios of 3.5 or less. All but one of these ratios (17/18, or 94%) had ratios of
10-fold or less. Unpublished work in EPA (Swartout, 1995) encompasses
more chemicals than described above, but the criteria for inclusion are not
as rigorous. Despite this lack of rigor, however, the mean of these
unpublished ratios lies between 2- and 3-fold with approximately 95% of
the ratios with values of 10-fold or less.

The data shown here suggests that the routine use of a 10-fold default
factor for this area of uncertainty should be closely examined. For example,
short term (2 weeks) and subchronic (90 days) NOAELs are often available
for comparison, which can give an indication of the possible differences in
the subchronic NOAEL and the expected chronic NOAEL. However, when
such data are not available, a 10-fold uncertainty factor may not be
unreasonable, but it should be considered as a loose upper-bound
estimate to the overall uncertainty.

LOAEL to NOAEL
If a LOAEL exists on which to base the estimation of a subthreshold dose,
the uncertainty in the NOAEL must be addressed. Analysis of several data
bases suggest that a factor of 10 or lower is adequate and that use of data
does support a lower factor with certain chemicals. For example, Dourson
and Stara (1983) describe ratios of LOAELs to NOAELs of either
subchronic or chronic exposures based on data from Weil and McCollister
(1963). Ninety-six percent of these ratios had values of 5-fold or less. Kadry
et al. (1995) also evaluated the uncertainty factor for LOAEL to NOAEL
extrapolation for several chlorinated compounds. Ratios were 1.4 to 8.9 for
methylene chloride, 2 to 5 for pentachlorophenol, 2 or 4.2 for
monochlorobenzene, 3.3 or 10 for chlorpyrifos, and 1.6 or 2.2 for 1,1-
dichlorethane. The authors conclude that 91% of these ratios were 6-fold or
less; all of them were 10-fold or less.

The results of the research on LOAEL to NOAEL extrapolation are not

extensive, nor unexpected. Experiments are seldom designed with doses in
excess of 10-fold apart, leading to the common statement that these ratios
depend more on dose spacing than inherent toxicity. The choice of dose
spacing, however, often reflects the judgment on the likely steepness of
the dose-response slope, with steeper slopes resulting in tighter dose
spacing. The data indicate that when faced with a LOAEL and not a NOAEL,
the choice of uncertainty factor should generally depend on the severity of
the effect at the LOAEL. More severe effects should be judged to need a
larger uncertainty factor because the expected NOAEL is further away from
the LOAEL. Less severe effects would not require a large factor, because,
presumably, the LOAEL is closer to the unknown NOAEL.

2.5.1 Curvas Dósis-Respuesta

Si se obtiene una respuesta de una magnitud definida para cada dosis,

dentro de un rango de dosis, se dice que la respuesta es "gradual". Es
decir que a diferentes dosis, D1, D2,...Di, se observan los efectos, E1, E2,...Ei,
que varían en forma continua y tienen un valor único para cada dosis
(dentro de la variabilidad normal que siempre se observa cuando se hacen
bioensayos).

La curva dosis-efecto se construye graficando en las ordenadas los

Efectos (E) causados en el organismo expuesto a una substancia química
y en las absisas las Dosis (D) a las que fue expuesto. Si la experimentación
se hizo con el tejido blanco aislado expuesto directamente a la substancia,
la respuesta observada normalmente es una función hiperbólica de la
dosis de una forma similar a la ecuación Michaelis-Menten para expresar la
velocidad inicial de una reacción enzimática. La curva pasa por el origen
del sistema de coordenadas cartesianas y la pendiente máxima se presenta
en el origen. La pendiente permanece aproximadamente constante durante
un rango amplio de la dosis (cinética de primer orden), después la
pendiente disminuye con la dosis hasta que se vuelve cero (cinética de
orden cero) y la respuesta adquiere su valor máximo. A este valor máximo
se le denomina efecto máximo (Emax) y es una medida de la eficacia del
tóxico.

En algunas ocasiones, la relación dosis-efecto no es tan definida y dentro

de una población se observa una distribución de respuestas para cada
dosis. En este caso el efecto que se mide no es la magnitud, se mide el
porcentaje de la población en estudio que presenta una determinada
respuesta para cada dosis suministrada. Este tipo de efecto se le
denomina cuantal. En estos casos se acostumbra graficar, en la ordenada,
el por ciento de la población que presenta un determinado valor de la
respuesta y en la absisa, el logaritmo de la dosis suministrada. Esta curva
tiene forma sigmoidal.
 Figura 2.5.1.A.- Curva Dosis-Respuesta.
0 a 1.-Región NOAEL; 2.-LOAEL; 3.-Región Lineal; y 4.-Respuesta Máxima.

La curva pasa por el origen (cuando la dosis es cero, la respuesta es cero)

y a valores muy bajos de la dosis, la curva es horizontal con un valor del
efecto igual a cero (la curva va sobre el eje de las dosis). La respuesta
empieza a tener un valor mayor que cero cuando la dosis llega al nivel
límite. De allí en adelante la pendiente de la curva crece con la dosis, hasta
que se llega a una pendiente máxima. Esta pendiente se mantiene por un
amplio rango de dosis en el que la respuesta es directamente proporcional
a la dosis (línea recta). A dosis mayores la pendiente empieza a decrecer
hasta que la curva se vuelve asintótica a un valor máximo de la respuesta
(Emax).

A la región de la curva donde los efectos no son medibles, se le conoce

como región NOAEL (por sus siglas en ingles No Observed Adverse
Effects Level).

La región lineal de la curva abarca aproximadamente del 16 al 84% de la

respuesta máxima. El valor de Emax es una medida de la eficacia del tóxico
o la droga (Figura 2.5.1.A). Algunas substancias presentan relaciones
dosis-respuesta diferentes a la descrita y la curva no tiene la forma de S.

Hay compuestos peligrosos que presentan dos curvas dosis-efecto, una

curva que representa efectos tóxicos y otra los efectos letales. Cuando se
aumenta el nivel de la dosis, se pasa de una área de la curva en la que no
se observan efectos dañinos a otra donde se observan efectos tóxicos
crecientes. Cuando se aumenta aún más la dosis se presentan los efectos
letales crecientes que también se relacionan con la dosis en la misma
forma que los efectos anteriores. Las dos curvas son paralelas (Figura
2.5.1.B).

Figura 2.5.1.B. Curva Dosis-Respuesta. Compuesto que presenta las dos

curvas.

1= curva de dosis-efectos tóxicos; y 2= curva de dosis-efectos letales.

2.5.1.1 Potencia vs. Eficacia

Potencia se refiere al rango de dosis dentro del cual una substancia

produce respuestas crecientes. La curva del tóxico (o droga) más potente
aparece más cercana al origen.

Figura 2.5.1.C.- Potencia y Eficacia de 3 Compuestos.

 La potencia de un droga está influenciada por factores tales como la
absorción, el metabolismo, etc. La eficacia está relacionada a una acción
más fundamental de la droga, es una medida de la capacidad intrínseca de
la droga para producir un efecto. Este valor se estima midiendo la altura
máxima de la curva dosis-respuesta (cuando la curva se vuelve asintótica a
las absisas) y, como ya vimos anteriormente, se le denomina E max.

Dos drogas que son cualitativamente iguales en producir un efecto

particular pueden diferir en su eficacia, en su potencia, o en ambas (Figura
2.5.1.C). El compuesto 1 es más potente que el compuesto 2, y el
compuesto 2 es más potente que el compuesto 3; los compuestos 1 y 2
tienen igual eficacia, pero el compuesto 3 es menos eficaz que 1 y 2 .