Interpretación de resultados de laboratorio de patologías monitoreadas, análisis de las

muestras tomadas desde los RM (rastro municipal) para la toma de decisiones.

UNAN-LEON
MÓDULO: MICROBIOLOGÍA
LABORATORIO N° 5: Aislamiento e Identificación Salmonella spp.

1. Objetivo

Este procedimiento describe el análisis de muestras de carne y leche para el aislamiento e

identificación de Salmonella spp y confirmación mediante pruebas bioquímicas.

2. Introducción.

Salmonella spp: es un género de bacterias que pertenece a la familia Enterobacteriaceae,

formado por bacilos Gram negativos, anaerobios facultativos, con flagelos perítricos y que no
desarrollan cápsula (excepto la especie S.typhi) ni esporas. Son bacterias móviles que producen ácido
sulfhídrico (H2S). Emplean glucosa por poseer una enzima especializada, pero no lactosa y no
producen ureasa.

Aislamiento bacteriano: Método de Diagnóstico para la determinar la presencia o ausencia de un

microorganismo.

Pruebas bioquímicas: Medios de cultivos líquidos o sólidos que contienen sustancias especiales de
enriquecimiento, suplemento, que al ser inoculados permiten la diferenciación de la bacteria.

Este método se basa en el desarrollo de cinco etapas fundamentales que nos permiten el aislamiento
de la especie Salmonella y su posterior identificación bioquímica y serológica de la siguiente manera:

Enriquecimiento no selectivo: Por medio del cual promovemos que un pequeño número de
bacterias de la especie Salmonella normales o afectadas se desarrollen en un medio líquido no
selectivo (Agua de Peptona Tamponada) a 35 ± 2 °C por 18  24 horas. En ese medio y a esa
temperatura se desarrollarán también otras bacterias, por lo que se hace necesario a continuación
realizar la siguiente etapa.

Enriquecimiento selectivo: caldo selenito: Este es un sub cultivo que se examina después de incubar a
42 ± 0.5 °C durante 24 horas.
Plateo con Medios: Plateo en placas con Agar Verde Brillante Sulfa (BGS) y Agar Tergitol Xilosa
Lisina 4 (XLT4) o Agar XLD, Agar SS, que se examinan después de Incubar a 37 ± 2 °C por 24– 48
horas.

Examen y Selección de Colonias de Medios Plateados: Lo que nos permite observar si la muestra
tratada con los medios anteriores, contiene colonias que por sus características puedan considerarse
como de la especie Salmonella.

Identificación: Se examinan estas colonias para conocer las características bioquímicas y serológicas
de las especies de Salmonella spp y el método Analytical Profile Index API 20 E

3. Equipos y materiales

1. Utensilios estériles para la manipulación de las muestras tijeras, cucharas.

2. placas Petri

3. gradillas.

4. Incubadora de 35 ± 2 ºC

5. Incubadora de 42 ± 2 ºC

6. Incubadora de 37± 2 ºC

7. Asas (10 μl)

8. agujas de inoculación

9. Mezclador Vortex

10. Microscopio

11. Tubos de ensayo

12. Cabina de bioseguridad clase II

13. Bolsas estériles para Stomacher

14. Baño maría entre 48 y 50 ºC

15. Balanza

Soluciones, medios, reactivos químicos y biológicos

 a) Medios de pre-enriquecimiento
 Agua de Peptona Tamponada (APT)
b) Medios selectivos de enriquecimiento

 Caldo selenito

Medios de cultivo

 Agar Verde Brillante Sulfa (BGS), conteniendo 0.1% de Sulfapiridina de Sodio

 Agar Xilosa Lisina Tergitol- 4 (XLT4)
 Suplemento para XLT4.
 Agar xilosa Lisina deoxicholate (XLD)
 Agar SS
 Agar Soya Tripticase(TSA)
c) Medios para pruebas bioquímicas
 Agar hierro triple azúcares (TSI)
 Agar lisina hierro (LIA)
 Citrato de Simmon
 MIO

d) Kits Necesarios.
 API 20 E

1. Preparación de la muestra

En general, las muestras deben mantenerse en las condiciones adecuadas, hasta el momento del
examen.

2. Realización del ensayo

Enriquecimiento no selectivo

1- Pesar 25 ± 0.5 g/ ml de la muestra en bolsa para Stomacher.

2- Agregar 225 ± 22.5 mL de Agua de Peptona Tamponada (APT). Mezclar bien
3- Incubar a 35 ± 2 °C por 20 – 24 horas.
Enriquecimiento selectivo

1. Transferir un volumen de 0.1 ± 0.02 mL de la muestra en un tubo de ensayo con 10 mL de

caldo de selenito.

2. Incubar a 42 ± 0.5 °C por 22 – 24 horas.

3. Mezclar cuidadosamente el contenido de cada tubo mediante un Vortex u otro medio

equivalente.

Aislamiento selectivo en medios sólidos.

1. Rayar en placas con Agar XLD o SS, utilizando un asa de siembra con 10 L de inoculo para
cada placa. Rayar la placa de Agar completa con un solo enriquecimiento de la muestra.

2. Incubar a 35 ± 2 °C por 18 – 24 horas.

Selección de colonias en medios selectivos.

1. Después del intervalo de incubación recomendado, examinar las placas de agar selectivo-
diferencial y las placas de control, para observar la presencia de colonias que cumplen con la
descripción de colonias de Salmonella sospechosas. Elegir colonias bien aisladas.

BGS. Seleccionar colonias que son de color rosa opaco y con un aspecto liso y borde entero rodeado
por el color rojo en el medio. En las placas muy pobladas, buscar colonias que den un aspecto
bronceado contra un fondo verde.

XLT4 o XLD. Seleccionar colonias negras (H2S-positivas) o colonias rojas sin centro negro (H2S,
negativas). El borde de la colonia todavía puede ser de color amarillo en 24 horas, posteriormente
debe ponerse rojo.

2. Si hay colonias típicas en una placa que no están bien aisladas, tomar de las colonias típicas y
volver a rayar directamente en placas de agar selectivo. XLD o SS.

3. Incubar de nuevo todos los platos por un tiempo adicional de 18 – 24 horas

a 35 ± 2 °C. Revisar colonias típicas.

4. Las placas con colonias sometidas a pruebas de confirmación con resultado positivo deben ser
almacenadas a temperaturas entre 2 °C y 8 °C hasta que las pruebas de confirmación sean
 completadas. Antes de realizar pruebas bioquímicas recuperar las colonias sospechosas en
Agar TSA incubando a la temperatura de 30 ºC – 35 ºC, durante 18 y 24 horas.

Pruebas Bioquímicas

Prueba en Agar TSI (Triple-Azúcar-Hierro)

1- Inocular con el microorganismo en estudio en el Agar TSI tanto en picadura y sobre

superficie inclinada en estrías.
2- Es importante que la línea de siembra no se extienda a más de 3 – 5 mm del fondo del
tubo, esto con el fin de evitar la entrada de aire en la parte profunda.
3- Incubar de 30°C - 35°C de 18 – 24 horas.
Resultados
a) Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, sacarosa y/o lactosa
b) Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente
c) Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador.
d) Precipitado negro en el fondo: producción de H2S
e) En el fondo también se observará una producción de gas G que puede producir un
desprendimiento del medio.

Observaciones
1. Una bacteria productora de puede dar tal cantidad de precipitado negro de sulfuro ferroso que
oculte completamente la acidez producida en la capa profunda. sin embargo, si se forma H2S
es que existe en la capa profunda una condición acida, aun cuando no se observe, y debe ser
registrada como tal.
2. Es esencial que se interprete la fermentación al término de 18-24 horas de incubación, ya que
una interpretación prematura o demorada dará formas de fermentación no validas que llevaran
a errores en el agrupamiento del género o especie.
3. Los resultados se escriben siempre siguiendo un patrón. Primero la reacción del pico de flauta
seguida por la reacción de la capa profunda, separada por una barra ejemplo: K/A
 Tabla 1. Característica de Salmonella spp en prueba Agar TSI

Microorganismo Fondo Fondo Superficie H₂S

inclinada

Salmonella spp A G/g K ±

Donde:

A: viraje a Amarillo.

G/g: Formación de gas

K: medio sin alteración del color rojo original.

H2S: producción de Ácido Sulfhídrico.

Prueba de Agar Lisina-Hierro (LIA).

1- Inocular con el microorganismo en estudio en el agar LIA tanto en estría sobre superficie
inclinada como picadura.
2- Es importante que la línea de siembra no se extienda a más de 3 – 5 mm del fondo del tubo,
esto con el fin de evitar la entrada de aire en la parte profunda.
3- Incubar de 30°C - 35°C de 18 – 24 horas.
Resultados
a) Los microorganismos que descarboxilan la lisina producen un viraje al violeta. K
b) Los microorganismos que no descarboxilan la lisina y fermentan glucosa producen un viraje al
amarillo. A
c) La formación de H2S se indica por la aparición de una coloración negra. H2S +
d) Las bacterias ácido alfa-cetocarbónico forman compuestos pardo-rojizos en el medio de
cultivo con la sal de hierro y en aerobiosis. R
e) La formación de burbujas indica la producción de gas.
 Tabla 2 Característica de Salmonella spp en prueba Agar LIA

Microorganismo Fondo Fondo Superficie H₂S

inclinada

Salmonella spp K G/g K ±

Donde:

G: formación de gas.

K: medio sin alteración del color purpura original.

H2S: formación de ácido Sulfhídrico.

Prueba de Motilidad, Indol, Ornitina (MIO)

a) Inocular con el microorganismo en estudio en el agar MIO por picadura en forma vertical.
b) Es importante que la línea de siembra no se extienda a más de 3 – 5 mm del fondo del tubo,
esto con el fin de evitar la entrada de aire en la parte profunda.
c) Incubar de 35°C - 37°C de 24-48 horas.

Resultados

Ornitina descarboxilasa
Positivo: color purpura del medio
Negativo: color amarrillo del medio
Movilidad
Positiva: Los organismos móviles migran de la línea de siembra y se difunden en el medio
provocando turbiedad.
Negativa: crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea de siembra
Prueba de Indol
Indol
Luego de la incubación adicionar 5 gotas de reactivo de Kovacs y agitar suavemente el tubo
interpretar inmediatamente
Positivo: anillo rojo en la superficie del medio
Negativa: no se produce color.
Negativa: color naranja en la superficie del medio
 Observaciones

Se leen las reacciones de movilidad y de Ornitina descarboxilasa antes de agregar el reactivo de

Kovacs para la prueba de Indol.

Prueba con citrato: Inocular una colonia como una estría única en la superficie del pico de
flauta. Incubar durante 24 - 48 ± 2 horas a 35± 2°C. El crecimiento, aunque no exista cambio
de color y crecimiento y el medio de color azul intenso en pico de flauta indica que la prueba
es positiva, sino se observa crecimiento y medio de color verde indica que la prueba es
negativa.
NOTA: El inoculo debe ser liviano si este es demasiado grande, compuestos orgánicos
preformados dentro de la pared celular de las bacterias que están muriendo pueden liberar
suficiente carbono y nitrógeno como para dar un resultado falso – positivo

Prueba de identificación de entero bacterias Analytical Profile Index (API 20E).

API20E es un sistema estandarizado que permite la identificación rápida para bacterias de la familia
Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram -. Básicamente consta de 21 test bioquímicos
estandarizados y miniaturizados, y una base de datos. Cada tira de API 20E contiene 20 micro tubos
o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioquímica distinta. Se
pueden identificar 127 géneros y 550 spp Diferentes, Bacterias oxidasa-negativo y bacterias de la
familia Enterobacteriaceae y otros Gram -.

Procedimiento.

Preparación de la galería

1. Repartir aproximadamente 5 ml de agua destilada o desmineralizada (o cualquier agua sin

aditivos o derivados susceptibles de liberar gases) en los alveolos de la cámara para crear
atmosfera húmeda.
2. Inscribir la referencia de la muestra en la lengüeta lateral de la cámara
3. Sacar la galería de su envase
4. Colocar la galería en la cámara de incubación.
Preparación del inoculo
 1. Abrir una ampolla de API Nacl 0.85 % médium o utilizar un tubo que contenga 5 ml
de agua fisiológica estéril o agua destilada estéril, sin adictivos.
2. Inocule con un hisopo estéril o un asa estéril una colonia (2-3mm diámetro) del
cultivo puro, obtenido del medio TSA, en solución salina 0.85%. asegúrese que la
suspensión sea homogénea. Esta suspensión debe ser utilizada inmediatamente
después de su preparación.
Inoculación de la galería
1. Luego de hacer la suspensión con una pipeta inocular los micro tubos de API 20E (para evitar
la formación de burbujas en el fondo de los tubos, colocar la punta de la pipeta sobre la pared
de la copula, inclinando ligeramente la cámara de incubación hacia adelante)
2. Llenar con la suspensión de bacterias los tubos, no la cúpula (cada pocillo tiene un tubo y una
cúpula, parte aerobia), de todos los pocillos.
3. Llenar la cúpula de los pocillos CIT, VP, GEL con la suspensión de bacterias.
4. Cubrir con aceite mineral las cúpulas de los pocillos ADH, LDC, ODC, URE, H2S para
obtener anaerobiosis
5. Incubar a 35 °C ± 2 durante 18-24 h

Lectura e interpretación

Lectura de la galería

1. Después de la incubación, la lectura de la galería debe hacerse remitiéndose a la tabla de

lectura.
2. En caso de que 3 o más ensayos (test GLU + O -) , resulten positivos , anotar en la hoja de
resultados todas la reacciones espontaneas y después revelar los ensayos que necesitan la
adicción de reactivos

TDA: Añadir una gota de TDA, una coloración marrón / Roja indica una reacción positiva y una
coloración amarilla negativa.

VP: Añadir una gota del reactivo VP1 y una gota del reactivo VP2, esperar 10 min, una coloración
rosa / rojo indica una reacción positiva y cuando no hay coloración indica una reacción negativa. Una
débil reacción rosa que aparece después de 10 minutos debe ser considerada como negativa.
IND: Añadir una gota de reactivo de James o de Dimetilamino-cinamaldehido. Una coloración color
rosa o anillo rosa-rojo indica una reacción positiva y una coloración amarilla una reacción negativa.
La prueba de indol debe de realizarse de último ya que la liberación de gas puede interferir con las
demás reacciones. No volver a colocar la tapa de la cámara de incubación después de agregar el
reactivo.

Nota: si el número de pruebas positivas antes de añadir los reactivos (incluyendo el ensayo GLU) es
inferior a 3, reincubar la galería 24 ± 2 horas suplementarias sin añadir los reactivos

Interpretación

Determinación del perfil numérico:

1. La lectura de los resultados se lleva a cabo por comparación de los colores de cada pocillo
con los de las tablas de lectura, y anotando el resultado como positivo o negativo.
2. Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un perfil numérico de 7 cifras. Los pocillos
están separados en grupos de tres: en total tenemos 7 grupos de tres tubos o tripletes (el test
número 21 corresponde al test de la oxidasa).
3. Para obtener el perfil numérico de 7 cifras, a cada pocillo se le dará el valor 0, 1, 2 ó 4, de
acuerdo a los siguientes criterios:
1. Si la reacción es negativa se pone 0.
2. Si la reacción es positiva se pone: 1 si es el primer pocillo de un triplete, 2 si es el segundo, 4
si es el tercero.
3. Se suman los valores de cada triplete, con las sumas de los siete tripletes se obtiene un código
de 7 cifras. Identificación: Se realiza a partir de la base de datos Con la ayuda del catálogo
analítico: se localiza el perfil numérico en la lista de los perfiles. Con la ayuda del software de
identificación api web: introducir manualmente mediante el teclado el perfil numérico de 7
cifras.

Nota: en ciertos casos el perfil de 7 cifras resulta insuficientemente discriminante, en necesario

realizar los siguientes ensayos complementarios:

 Reducción de nitratos en nitritos (NO2) y en nitrógeno (N2): añadir una gota de los reactivos
NIT 1 y NIT 2 en el tubo GLU. Esperar 2 a 5 minutos. una coloración roja indica reacción
 positiva (NO2) una reacción negativa (coloración amarilla), agregar 2 a 3 mg de reactivo de
Zn en la cúpula GLU. después de 5 minutos, si el color sigue siendo amarillo indica una
reacción positiva (N2). Si el color de la copula cambia a naranja-rojo la reacción es negativa.
 Por las mismas razones que en la prueba de Indol la prueba de reducción de nitratos debe
realizarse en último lugar.

Interpretación de Resultados

1- Si las pruebas bioquímicas (TSI, LIA, MIO, CITRATO.) son típicas de Salmonella, se
informa como Presencia de Salmonella spp
2- Si las pruebas bioquímicas (TSI, LIA, MIO, CITRATO.) son típicas de Salmonella y el
API 20E detecta la presencia de Salmonella se informa como Presencia Salmonella spp.
3- Si las pruebas bioquímicas no son típicas de Salmonella spp se informa como Ausencia de
Salmonella spp.

7 Aseguramiento de la Calidad

Controles del Método

1. Confirmar al menos una cepa de cada muestra de control positivo.

2. En ausencia de una muestra de ensayo positiva los cultivos de control pueden terminar
en el mismo punto en que terminan los análisis de las muestras.

ANEXO 1. Reacciones de pruebas bioquímicas

Pruebas bioquímicas de TSI

Prueba bioquímica de LIA

Prueba bioquímica de MIO

Prueba de citrato
 ANEXO 2. Tabla de resultados de las reacciones bioquímicas del API 20E

ONPG Beta-galactosidasa sin color amarillo

ADH Arginina deshidrolasa amarillo rojo o naranja

LDC Lisina descarboxilasa amarillo rojo o naranja

ODC Ornitina descarboxilasa amarillo rojo o naranja

CIT Utilización del citrato verde azul oscuro o turquesa
sin precipitado
H2S Producción de H 2 S precipitado negro
negro

URE Ureasa amarillo rojo o naranja

TDA Triptófano desaminasa amarillo marrón-rojo
color rosa o anillo rosa-
IND Producción de indol amarillo
rojo
VP Producción de acetoína (Voges-Proskauer) sin color rosa-rojo

GEL Gelatinasa sin difusión difusión de pigmento

GLU Fermentación/oxidación de glucosa azul o verde amarillo

MAN Fermentación/oxidación de manitol azul o verde amarillo

INO Fermentación/oxidación de inositol azul o verde amarillo

SOR Fermentación/oxidación de sorbitol azul o verde amarillo

RHA Fermentación/oxidación de ramnosa azul o verde amarillo

SAC Fermentación/oxidación de sacarosa azul o verde amarillo

MEL Fermentación/oxidación de melobiosa azul o verde amarillo

AMY Fermentación/oxidación de amigdalina azul o verde amarillo

ARA Fermentación/oxidación de arabinosa azul o verde amarillo

OX Citocromo oxidasa