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Libro de Microbiologia Industrial PDF
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Biotecnología
Ambos tipos de microbiología abarcan diferentes aplicaciones de la biotecnología. La idea de la
biotecnología surge en los años 20, ligada a la producción de alimentos. Tuvo su auge en los años 50,
centrada en la producción de plásticos e hidrocarburos. La biotecnología será por lo tanto el uso integrado
de la bioquímica, la biología y la ingeniería química para conseguir aplicaciones tecnológicas de los
sistemas biológicos y los cultivos celulares. Una nueva definición de biotecnología actualmente dice que
la biotecnología es el conjunto de procesos industriales donde se utilizan organismos obtenidos mediante
DNA recombinante y otras técnicas genéticas.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Biotecnología
Manipulación de organismos vivos, sobre todo a escala genética, para obtener productos útiles. Según esta
definición, parece que la microbiología industrial no sería biotecnología.
Combinación de procesos industriales donde se usan sistemas biológicos obtenidos mediante DNA
recombinante u otras técnicas de manipulación genética. Se aproxima más a la microbiología industrial, pero no es
adecuada aun.
Uso integrado de la bioquímica, microbiología y de la ingeniería química con el fin de obtener productos
útiles y aplicaciones tecnológicas de los microorganismos, cultivos celulares y otros sistemas biológicos.
Esta es la definición más adecuada a los contenidos de la microbiología industrial y alimentaria.
Es la rama de la biotecnología que obtiene producción a gran escala, con costes reducidos. Sus
principales productos son alimentos o ingredientes saborizantes, alcohol industrial, antibióticos y ácido
cítrico. Se trata de producción en toneladas y se valora en aproximadamente 3·1010 $ anuales
Se concentra en la fabricación de productos al detalle. Producción de tan solo kilogramos al año, pero
son productos de un gran valor añadido, como pueden ser insulina, interferón, enzimas,... Se requiere el
uso de técnicas más nuevas de ingeniería genética y de la fusión de células para obtener organismos
capaces de generar los productos deseados. Hacia 1989 la biotecnología fina generaba
aproximadamente 109 $ al año, pero cada vez representa una mayor fracción de la industria total.
Esta división no quiere decir que la biotecnología clásica no utilice las más modernas técnicas de
ingeniería genética, ya que si son necesarias, se usan. Ni tampoco quiere decir que en la biotecnología
fina no se usen los conocimientos adquiridos tras tantos años de trabajo en la biotecnología tradicional.
En realidad, el ser humano aprovecha las reacciones mediadas por los microorganismos desde hace
siglos:
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Aplicaciones ambientales
Depuración de aguas residuales Fangos activos Bacterias aerobias
Protozoos
Depuración de materia orgánica Biodigestión anaerobia Bacterias anaeróbicas
semisólida Arqueas
Metanógenes
Biodegradación de xenobióticos Biodegradación de hidrocarburos Pseudomonas
Aplicaciones analíticas
Biosensores Análisis de glucosa Aspergillus
Bioensayos Tests de Toxicidad ambiental Photobacterium
Tests mutagénicos Test de Ames Salmonela
Producción de biomasa microbiana
Microorganismos unicelulares Levadura de panificación Saccharomyces
Proteína unicelular bacteriana Methylophilus
Proteína unicelular de levaduras Candida
Microalgas Chlorella
Scenedesmus
Spirulina
Esporas bacteriana Bioinsecticidas Bacillus
Biomasa fúngica Proteína unicelular fúngica Paecilomyces
Cultivo de setas Morchella
Producción de enzimas y otras proteínas
Enzimas Amilasas Aspergillus
Proteasas Bacillus
Hormonas Insulina humana Escherichia
Otras proteínas Interferón humano Escherichia
Microorganismos: Son los sistemas biológicos más usados en la microbiológica industrial. Se trata de
bacterias, hongos, protozoos y virus.
Esporas: En ocasiones el sistema biológico de interés para producir el producto o el servicio son las
esporas, como en el caso de los bioinsecticidas. Obtendremos las esporas a partir de cultivos celulares.
Cultivos celulares. Podemos usar cultivos celulares vegetales o animales para la fabricación de productos
o la obtención de servicios, como por ejemplo el uso de hibridomas para la obtención de anticuerpos
monoclonales. En ocasiones se pueden usar solo algunos orgánulos.
Los microorganismos presentan una serie de ventajas sobre los otros posibles sistemas biológicos.
- Tienen una elevada diversidad metabólica y una gran plasticidad. Siempre existirá algún
microorganismo que pueda hacer la reacción que se desea en un determinado momento. El
único problema es que se ha de encontrar el microorganismo más adecuado. Se cree que se
conocen tan solo 1/3 de los microorganismos existentes en el mundo.
- Son extremadamente fáciles y baratos de cultivar.
o Crecen sobre sustratos baratos. En ocasiones pueden crecer sobre residuos de otras
empresas, como papeleras, cárnicas,...
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Estos procesos hacen que la materia orgánica en suspensión en el agua se elimine por
procesos de sedimentación. Esto genera lodos, lo que implica que las plantas de depuración
de aguas eliminan residuos líquidos, pero los producen sólidos, que deberán ser tratados
como otros residuos sólidos.
- Residuos sólidos. Son otro gran problema de los países desarrollados. Estos residuos pueden
ir desde la simple basura del hogar, hasta los lodos resultantes de la depuración de aguas,
pasando por residuos agrícolas e industriales. Los residuos sólidos se someten normalmente
a procesos de digestión anaerobia. Este tipo de digestión reduce el volumen de los residuos.
En condiciones de anaerobiosis, una buena parte del sustrato a partir del cual crecen las
bacterias deberá ser dedicado a la obtención de energía, de manera que el crecimiento de
bacterias a partir del sustrato es bajo. Los residuos orgánicos pasan a ser casi totalmente CH4
y CO2, lo que se conoce como biogas. El metano producido puede ser un combustible, por lo
que puede ser usado como fuente de energía, pero puesto que el principal objetivo es la
reducción del volumen de residuos y su estabilización, la producción de metano no está
optimizada, aunque se debe aprovechar el que se produzca.
- Xenobióticos. Además de los residuos cotidianos, eventualmente se producen vertidos
puntuales de xenobióticos. Se trata de productos producidos químicamente por el hombre,
no producidos por ningún ser vivo, y que no pueden ser degradados por ningún ser vivo.
También pueden darse vertidos de sustancias recalcitrantes, que son de difícil y lenta
degradación. Se han descubierto una serie de organismos capaces de degradarlos, que son
inoculados cuando se produce un vertido. El problema de los xenobióticos se está haciendo
desgraciadamente cada día más común. Un problema que se encuentra también es que para
recalificar el suelo industrial a urbanizable, mucho más rentable, este debe estar limpio de
productos xenobióticos.
6. Aplicaciones analíticas. Existe la posibilidad de usar microorganismos como biosensores. Se
pueden usar tanto los microorganismos vivos, como sus enzimas u orgánulos unidos a electrodos
de manera que las reacciones biológicas devengan corrientes eléctricas. Esto permite medir
concentraciones de compuestos específicos en diferentes entornos, detectando contaminantes,
aditivos en alimentos,... Los biosensores han despertado un gran interés, pero aún se están
poniendo a punto.
Otro uso analítico de los microorganismos son los bioensayos, que consisten en la determinación
de una sustancia biológicamente activa, ya sea conocida o no, sobre material vivo. No todos los
bioensayos implican el uso de microorganismos. Antes de producir una sustancia a escala
industrial, deberemos realizar con ella una serie de bioensayos, que mida una serie de factores de
dicha sustancia.
- Biodegradabilidad. Toda sustancia que sea producida a gran escala industrialmente, en
cantidades de toneladas, ha de ser biodegradable, porque si no lo fuese se acumularía muy
rápidamente en los ecosistemas. Se han de hacer una serie de ensayos en el laboratorio que
demuestren dicha biodegradabilidad. En términos legales, cuando hablamos de
biodegradable, en realidad nos referimos a que el 70% del producto es biodegradable,
pasando a ser tan solo agua y dióxido de carbono. El 30% restante no se degradará y su
composición permanecerá desconocida. Esto es lo que estipula la ley.
- No toxicidad al medio. Las sustancias que van al medio no han de alterar la salud del
ecosistema. Existen dos tipos diferentes de ensayos de toxicidad.
o Agudos: Se expone al ser vivo al producto en cuestión a una concentración muy
elevada, durante un período breve de tiempo de su vida, por ejemplo, si calculamos
una vida de 40 años, el período breve serían 5 minutos
o Crónicos: Se expone al individuo a concentraciones bajas del producto durante un
largo período de su vida, pudiendo incluso llegar a tratar a sus descendientes para
ver el efecto en estos.
Se han de hacer pruebas para evaluar el efecto de un producto sobre el ecosistema. En teoría
debería haber una serie de tests que permitiesen evaluar la toxicidad sobre todos los niveles
del ecosistema, hasta llegar al hombre. Pero no sale rentable, por lo que se realizan muchos
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Microbiología Industrial y Alimentaria
tests sobre bacterias, de manera que si es tóxico para la bacteria no se comercializará. Pero
pese a no ser tóxico para la bacteria podría ser tóxico para otros organismos.
- Mutagenicidad. Es un factor que se ha de tener muy en cuenta. El problema que presenta la
mutagenicidad es que los efectos se pueden producir muy adelante, incluso en la
descendencia, por lo que los ensayos que comprueban esto son muy largos y complejos. El
test más empleado actualmente es el que se conoce como test de Ames. Ames obtuvo
mutantes His- de S. typhimurium. Este mutante tiene una tasa de reversión elevada de
aproximadamente 10-4, que Ames tenía muy bien medida. Esta bacteria se ponía en contacto
con la sustancia a comprobar. Si aumentaba la tasa de reversión, se trataba de un producto
mutagénico, en caso de no aumentar era no mutagénico. El problema radica en que muchas
sustancias son premutágenos, que en su forma inicial no son mutagénicas, pero que al llegar
al hígado se activan y pasan a ser mutágenos. Para comprobar que la sustancia no es un
premutágeno se le administraba a una rata. Después se sacrificaba, se extraía el hígado y se
sometía a éste a una centrifugación diferencial. Aíslas entonces las fracción microsomal, que
contendrá premutágenos activados y la compruebas con S. typhimurium.
7. Lixiviación. Podemos usar los microorganismos para la recuperación de metales a partir de
minerales y restos de minas, con contenidos de metales demasiado bajos para la fundición, el
método tradicional. La biolixiviación la realiza Thiobacillus ferrooxidans.
Breve historia de la biotecnología
Podemos dividir la historia de la humanidad en tres períodos, considerando la manera de conseguir los
alimentos. En una primera etapa de cazadores – recolectores, el hombre debía perseguir y buscar los
alimentos. En una segunda etapa de agricultores – ganaderos, el hombre cultiva los alimentos, lo que
implica un aumento de la población, así como de la esperanza de vida, pero a la vez genera un problema,
puesto que habrá épocas del año en las que no se podrá recolectar alimento, por lo que el que se recoja en
tiempos de disponibilidad deberá durar todo el año. Se empezaron a desarrollar métodos de conservación
rudimentarios. Además, debido a la acción microbiológica, se desarrollaron otras técnicas de
conservación, como pueden ser el queso, el yogurt, los embutidos,... En lo que respecta al vino y a la
cerveza, se ha de tener en cuenta que hasta hace poco eran la forma más sana de beber agua, ya que había
una gran posibilidad de que estuviese contaminada. Actualmente estamos en una tercera etapa, en la que
somos ya “gourmets”, ya que en la alimentación humana el problema no lo representa ya la disponibilidad
de alimentos, sino que actualmente los alimentos han de ser saludables y sabrosos.
Indicadores de desarrollo y calidad de vida
Típicamente, un indicador del desarrollo de un país y de su calidad de vida suele ser la renta per cápita, el
PIB,... pero la producción de basuras por habitante y día puede ser un indicador tan bueno como cualquier
otro. Una producción de basura superior a 1Kg al día indica una buena situación económica, mientras que
valores inferiores indican una situación económica peor.
Otro valor que puede ser de interés es el consumo de agua diario. Un ser humano necesita estrictamente
1,5 l de agua al día, que es la que ha de beber, pero en la práctica, el consumo de agua por individuo al día
es muy superior, sobre todo en países desarrollados. En países en vías de desarrollo el consumo diario
oscila entre los 20 y los 40 litros diarios por persona. En países más desarrollados se alcanzan valores más
elevados. En Barcelona se oscila entre los 170 – 250 litros al día por habitante, pero considerando la
totalidad de España se alcanzarán valores cercanos a los 300, ya que se considerarán también todos los
campos de cultivo. Los países más desarrollados tienen un consumo diario aproximado de 350 litros por
habitante.
Cada vez se usa más agua, por lo que nos enfrentamos a un problema, ya que la precipitación anual en
Barcelona es de 400 – 550 mm. Básicamente se siguen dos técnicas para poder tener el agua necesaria. En
primer lugar el agua se reutiliza, y en segundo lugar puede ser necesario traer agua de otras cuencas más
ricas.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Fermentaciones Industriales I
En los temas siguientes veremos todas las etapas que componen una fermentación industrial. En la tabla
las vemos todas resumidas.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Medios de cultivo
Los medios de cultivo usados para hacer crecer los microorganismos han de tener todos los elementos
necesarios en la forma y las proporciones adecuadas para la síntesis de material celular y la producción de
metabolitos. En un laboratorio se pueden usar productos químicos, de composición conocida, para la
obtención de medios de cultivo, que son medios sintéticos, pero en las fermentaciones industriales los
medios han de ser lo más baratos posibles. En microbiología industrial raramente se usan medios óptimos,
equilibrados o definidos, sino que en muchos casos los medios usados están formados a partir de
subproductos de otras industrias. Serán medios muy variados en su composición, nunca óptimos ni
equilibrados, ni mucho menos definidos. Esto presenta una serie de consecuencias sobre el desarrollo de
los organismos y sobre el control de la fermentación.
I. Un medio de cultivo óptimo y más o menos equilibrado es obligatorio para conseguir la
máxima producción. Es necesario por lo tanto optimizar los medios industriales, lo que no
es tarea fácil, teniendo en cuenta los ingredientes de los que se parte, muy complejos y
variables. Los medios de cultivo industriales pueden optimizarse usando métodos
estadísticos, mediante programas diseñados con ordenador. En caso de ser necesario pueden
añadirse suplementos de elementos críticos ausentes o insuficientes en el medio.
II. Control de calidad. Los medios se diseñan para conseguir la máxima producción. En todos
los casos, los nuevos sustratos han de ser evaluados precisamente antes de iniciar la
producción industrial, mediante fermentaciones prueba.
III. Represión por el catabolito. Consiste en la represión de la síntesis de determinadas proteínas
como consecuencia de la presencia de una determinada fuente de carbono y energía, como
puede ser la glucosa. La existencia de una fuente de carbono y energía óptima en el medio
puede provocar que algunas proteínas no se expresen, lo que puede reducir la eficacia de
ciertas reacciones de interés industrial, o incluso impedirlas. La represión por el catabolito o
por el producto puede eliminarse optimizando los nutrientes en el medio, de manera que no
haya glucosa, por ejemplo, o por gestión adecuada del fermentador, de manera que se añada
la glucosa poco a poco al medio. Si no funcionase esta aproximación, deberían usarse cepas
mutantes desreguladas para la producción.
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En lo que respecta a los sustratos usados como fuentes de nitrógeno, en muchos procesos industriales se
usan los siguientes.
- NH4+, sales, urea o NH4+ gaseoso.
- Líquido de maceración del maíz. Se trata de un subproducto de la producción de almidón a
partir del maíz. El extracto concentrado tiene un 4% de N y numerosos aminoácidos, como
son: Ala, Arg, Glu, Ile, Tre, Val, Fenil Alanina, Met y Cis.
- Extracto de levaduras. Es un sustrato excelente para muchos microorganismos. Se produce a
partir de levaduras de panificación, induciendo su autólisis a 50 – 55º C o por plasmólisis en
alta concentración de NaCl. Contiene aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en agua y
carbohidratos. El glucógeno y la triohalosa se hidrolizan a glucosa durante la producción del
extracto.
- Peptonas. Se trata de hidrolizados de proteínas, de manera que contendrá aminoácidos y
péptidos. Pueden ser usadas por muchos microorganismos, pero son bastante caras para la
producción industrial, aunque pese a este su uso está muy extendido. Las peptonas pueden
tener dos orígenes.
o Proteínas animales. Caseína, gelatina, queratina.
o Proteínas vegetales. Semillas de cacahuete, harina de soja, semillas de algodón y
girasol. Todo esto aún retiene mucho nitrógeno, aun siendo subproductos de otras
industrias.
La composición de aminoácidos y de péptidos variará según el origen. Por ejemplo, la gelatina es rica en
prolina e hidroxiprolina, pero casi no contiene aminoácidos con azufre. En cambio los péptidos de la
queratina tienen una elevada concentración en prolina y cisteína, pero carecen de lisina. La composición
del producto final está determinada también por el tipo de hidrólisis a que se someta, que puede ser ácida
o enzimática. Especialmente afectado se ve el contenido en triptófano, ya que la hidrólisis ácida reduce su
nivel mucho.
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Para poder conocer los componentes que tenemos disponibles para confeccionar nuestro medio, existe lo
que se conoce como la bolsa de residuos, que es un órgano público, donde las empresas deben declarar
sus residuos. Los objetivos de la bolsa son:
- Censar los residuos que se producen, para saber donde se producen exactamente y en qué
cantidad los diferentes tipos de residuos.
- Solucionar el transporte y la reutilización cuando se pueda. Muchos residuos de los que se
producen pueden no tener utilidad para la empresa, pero sí tenerla para otras empresas, lo
que pueden implicar el reaprovechamiento.
Prospección y mejora
En el momento de fabricar un producto o proporcionar un servicio, se ha de encontrar un microorganismo
que permita realizar este proceso. A excepción de algunos productos de la industria alimentaria, donde se
usan cepas silvestres, en la mayoría de los casos, es necesario buscar microorganismos y después
mejorarlos. El protocolo clásico que se ha de seguir para realizar la mejora deseada consta de 3 pasos:
prospección, selección y mejora.
Características generales
Como resulta evidente, el principal factor implicado en el éxito o fracaso de un proceso de fermentación
es el microorganismo. Una cepa económicamente rentable deberá cumplir una serie de atributos
generales, independientemente del proceso en que esté implicada.
1. Tiene que estar disponible en cultivo puro, libre de otros organismos.
2. Tiene que ser capaz de producir fácilmente células vegetativas y/o esporas u otras unidades de
propagación, para aumentar su valor.
3. Tiene que crecer vigorosamente una vez introducida en el fermentador, ya que no todos los
organismos crecen adecuadamente en volúmenes grandes, y usar sustratos baratos.
4. Tiene que formar un producto conveniente, preferiblemente uno solo, fácilmente recuperable y,
si es posible, en ausencia de productos colaterales tóxicos.
5. Tiene que producir la sustancia deseada en un tiempo corto, a ser posible menor a 3 días.
6. Es mejor si tiene protección contra posibles contaminaciones, ya sea por crecer a pH ácido, o a
elevadas temperaturas,...
7. Tiene que ser modificable, mejorable mediante agentes mutagénicos, pero ha de ser
genéticamente estable en ausencia de éstos.
8. Tiene que ser fácilmente conservable en períodos largos de tiempo.
Prospección
Los microorganismos pueden aislarse a partir de:
- Colecciones tipo o similares. Las colecciones de cultivos actúan como fuentes de cepas de
referencia o como lugares de depósito de cultivos. Los cultivos de interés industrial se
conservan permanentemente. Los cultivo de investigación acabados de descubrir se guardan
hasta descubrir aplicaciones futuras.
- De la naturaleza. Si no se encuentra nada en las colecciones tipo, se puede pasar a buscar en
la naturaleza. Siempre es necesario buscar con criterio. Para encontrar organismos poco
corrientes, es necesario buscar en nichos ecológicos poco corrientes. Las fuentes más
comunes de los microorganismos industriales son suelos, lodos, lagos y ríos.
La búsqueda de fuentes de microorganismos es tan solo un primer paso del proceso de prospección. Al
buscar se encuentran cepas salvajes, de las cuales alguna puede tener interés, mientras que otras no lo
tendrán. Una vez se tienen algunas muestras, se han de seleccionar las que tengan interés. Se han de
realizar en primer lugar una serie de métodos de enriquecimiento para aislar los microorganismos más
infrecuentes y débiles, y potencialmente útiles. Se realiza entonces un proceso de selección primaria, que
es únicamente un test cualitativo, para saber si cumple la función deseada. Generalmente se hace en
medio sólido.
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Podremos aumentar la frecuencia de mutaciones mediante el uso de agentes mutágenos, que pueden ser o
bien químicos o bien físicos, cuya presencia daña, altera o interfiere en la reparación del DNA. Se pueden
emplear diferentes tipos de agentes mutagénicos:
Agente mutágeno Forma como actúa Tipo de mutación
Radiaciones
Ultravioleta Formación de dímeros de
pirimidina La reparación puede causar
sustituciones o microdeleciones
Radiaciones ionizantes (X, γ) Rotura de cadenas del DNA
Análogos de bases
5 – bromouracilo Incorporado en lugar de T
Transiciones
2 - aminopurina Incorporado en lugar de A
Agentes alquilantes
Monofuncionales: Etilmetanosulfonato Metilación de G Transiciones
Bifuncionales: mostazas de nitrógeno, Metilaciones,
mitomicina, nitrosoguanidina Mutaciones puntuales y deleciones
entrecruzamiento de cadenas
Colorantes intercalantes
Acridinas, Bromuro de etidio,... Inserción entre 2 pares de
Microinserciones y microdeleciones
bases
Otros compuestos
Ácido nitroso Desamina A y C
Transiciones
Hidroxilamina Reacciona con C
Como se ve en la tabla, cada agente mutágeno tiene características y efectos diferentes, por lo que se
deberá elegir siempre el que más se ajuste a las necesidades.
Después del tratamiento obtendremos 3 tipos de organismos:
- Parentales: el tratamiento no les ha afectado, no han sufrido mutación.
- Mutantes no viables: organismos a los que la dosis del mutágeno ha causado tantas
mutaciones que ya no son viables.
- Mutantes viables
Los más numerosos suelen ser siempre los no viables, por lo que será necesario ajustar la dosis de
mutágeno que se aplica para que quede un porcentaje de viables adecuado. Una vez pasado el tratamiento,
se han de hacer crecer las células en medio rico, para incrementar la viabilidad de los mutantes viables,
para recuperarlos del tratamiento. Llegados a este punto podemos empezar a aplicar técnicas de
enriquecimiento de los mutantes. De todos los mutantes obtenidos se deberá seleccionar el mutante que
resulte más ventajoso.
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Una misma ruta metabólica puede tener regulación de diferente complejidad en diferentes cepas
bacterianas, de manera que en el momento de producir una determinada sustancia, trabajaremos con el
microorganismo que facilite el trabajo.
Al igual que tener el tratamiento mutagénico adecuado, es necesario que tengamos un método preciso
para la determinación y aislamiento del mutante. Pero en caso de que no se pueda detectar mediante
ninguno de los métodos típicos, de podrán analizar diferentes clones en fermentaciones líquidas para ver
cual de ellos sería mejor para la fermentación deseada.
Fusión de protoplastos
Hasta principios de los años 90, la mutagénesis al azar era el método más empleado, pero a partir de
entonces se han introducido nuevos métodos de modificación genética de microorganismos, como el de la
fusión de protoplastos, que consiste en una trasferencia génica precedida por la fusión en sí. Requiere
también requiere un proceso de selección posterior al tratamiento, ya que la recombinación que se da es al
azar.
Los protoplastos se generan por el tratamiento de las células con enzimas líticos diversos, que degraden la
pared. Será necesaria la presencia de un estabilizador osmótico para evitar la lisis. La fusión es potenciada
por la acción del polietilenglicol, PEG, o mediante electrofisión, y la recombinación puede ser potenciada
mediante el uso de cepas que tengan mutaciones que favorezcan este proceso. La fusión de protoplastos
se usa mucho en la mejora de hongos y levaduras, ya que en muchos casos son organismos asexuales.
Otra de las ventajas que presenta la fusión de protoplastos es que se pueden fusionar células de taxones
muy alejados, aunque cuanto más alejados, menor la viabilidad del híbrido.
Tecnología del DNA recombinante
Se conoce como tecnología del DNA recombinante al conjunto de técnicas que permiten la manipulación
de los genes como unidades bioquímicas e incluye técnicas como:
- Recombinación in vitro
- Clonación génica
- Manipulación génica
- Ingeniería genética
Permiten la introducción de secuencias específicas de DNA en organismos procariotas o eucariotas y la
posterior replicación y expresión de estas secuencias para llevar a cabo la información codificada en estas
secuencias. Seguimos un protocolo, como se ve a continuación:
1. Aislamiento de la secuencia de DNA de interés para su clonación posterior
Las endonucleasas de restricción, ER, son enzimas bacterianos que las protegen de la invasión
de DNA ajeno. Cortan DNA bicatenario en secuencias específicas, generalmente palindrómicas,
de 4 a 11 nucleótidos, generando extremos romos o cohesivos.
Cuando no conocemos la secuencia de DNA que queremos clonar, la estrategia consiste en hacer
una genoteca, y posteriormente seleccionar con el método adecuado los clones que presenten el
carácter deseado. Si conocemos la secuencia de DNA, la podemos usar como una sonda para
encontrar el clon que buscamos.
2. Incorporación de la secuencia de DNA aislada en un vector
Existe una gran variedad de vectores para la transferencia de DNA. Los más usados son los
plásmidos y los fagos, junto con los cósmidos.
Los plásmidos son elementos genéticos:
o Circulares, por lo que están protegidos contra las endonucleasas.
o Pequeños, por lo que pueden ser transferidos fácilmente.
o Tienen un origen de replicación, por lo que se pueden replicar en el huésped.
o Pueden codificar para numerosas funciones celulares, como resistencias o la
capacidad de conjugar con otros organismos.
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Dependiendo de lo que quieras hacer con el DNA aislado, lo insertarás en uno u otro tipo de
vector, ya que existen diferentes tipos de vectores, como:
o De clonación: son vectores usados para amplificar el DNA en la célula huésped.
o De secuenciación: son vectores que contienen un elevado número de lugares de
restricción, de manera que al ser cortado se generan fragmentos de tamaño variable
para ser secuenciados.
o De expresión: además de un lugar de clonación, el polilinker, contienen operadores,
promotores, terminadores y un ribosome binding site, RBS, para permitir la
expresión del DNA clonado.
La introducción del DNA exógeno al plásmido se hace de diferente manera, en función de si al
cortar con los enzimas de restricción se generan extremos romos o cohesivos. Si se generan
extremos romos, los extremos 5’ se digerirán con una exonucleasa, mientras que los 3’ se
elongarán mediante una transferasa terminal, con ATP o TTP, generando una cola de poliA o
poliT. Se podrán unir entonces y formar el plásmido deseado. En el caso de que se generen
extremos cohesivos, cortaremos con dos diferentes enzimas, de manera que el inserto se insertará
en la dirección deseada en el plásmido.
3. Incorporación del vector con el DNA insertado en la célula huésped
La eficiencia de la incorporación del DNA por la célula huésped es una fase crítica en la
manipulación genética. Dentro de las células huésped podemos encontrar tanto microorganismos
como células animales o vegetales. Dependiendo de la naturaleza del huésped usaremos uno u
otro sistema para introducir el DNA, como pueden ser pistolas génicas, Agrobacterium,...
4. Selección de los huéspedes que hayan incorporado el vector
Es necesario distinguir los clones que han introducido el DNA exógeno, para lo que podemos
examinar diferentes puntos:
o La presencia del vector recombinado, mediante el análisis de colonias. Para esto se
usa la técnica de la inactivación del marcador, por ejemplo. Se trata de un vector
con dos marcadores, pero que uno de ellos contiene la diana para la incorporación
del DNA exógeno. De manera que, si da negativo para ambos marcadores, no habrá
incorporado ningún vector, si da positivo en ambos, ha incorporado un vector que
no tenía el inserto, pero si da positivo en uno y negativo en el otro, habrá
incorporado el inserto con el DNA ajeno.
o La presencia del DNA exógeno. Se puede hacer mediante la hibridación de las
colonias. Se hace una réplica de la placa con un tampón de terciopelo sobre un
filtro de nitrocelulosa, provocando la lisis de las colonias sobre el filtro y
desnaturalizando el DNA. Se hace un lavado para eliminar el exceso de proteínas y
se fija el DNA al filtro calentándolo y se analiza la presencia mediante una sonda
para la secuencia específica.
o Detección indirecta del DNA por expresión de la proteína, ya sea mediante un
Northern, mRNA, o un Western, detección de proteínas.
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Equipos auxiliares
Aunque la cubeta del biorreactor es el principal foco de interés, una instalación de han de considerar una
serie de mecanismos adicionales necesarios para que el sistema funcione.
- Sistema de agitación: Los biorreactores tienen un gran volumen. Es necesario un sistema
para que se homogenice. Existen diferentes tipos de agitadores. El más habitual es el
agitador en disco, que consta de un disco de diámetro apropiada, del que salen de 4 a 8 palas
radiales, asociadas a un motor que las hace girar. Las palas pueden tener diferente geometría
y diferentes rendimientos.
- Sistema de aireación: Si se
trata de un proceso aerobio,
será necesario que haya
oxígeno. Considerando las
características del biorreactor,
no podemos poner oxígeno al
principio, y ya está, ya que el
oxígeno se diluye muy mal. Es
necesario un aporte continuado
de oxígeno en el medio, que se
introducirá a través de una
entrada de aire.
Una vez en el interior, el aire
se distribuye a través de placas
difusoras, que generan
burbujas, que serán destruidas
por el sistema de agitación,
que influye de esta manera en
la aireación. El aire que entra
debe ser esterilizado, como ya
veremos más adelante, pero se
ha tener también en cuenta que
cada minuto podemos tener
que introducir el mismo
volumen de aire que de medio
hay en el fermentador.
- Sistema de eliminación de Biorreactor instrumentalizado de laboratorio
espuma: Los medios de cultivo - OD, T, pH, ES: sensores de O2 disuelto,
suelen producir espuma, ya temperatura, de pH y de espuma
que son ricos en materia - AE, OH-, H+: recipientes con antiespumante,
orgánica. La espuma es un álcali y ácido
problema, porque puede - F: Filtros de aire
interferir en la medida de los - M: Motor de rompeespumas y de la agitación
sensores. Podemos eliminar la (inferior)
espuma de dos maneras: - PM: Toma de muestras
o Rompe espuma: Es el - B: Rompecorrientes
método más sencillo, - R: Resistencia térmica
consiste en un
sistema similar al agitador. También se puede destruir la espuma gracias a la fuerza
centrífuga.
o Adición de antiespumantes: Se añaden en la interfase entre aire y líquido, para que
no se mezclen con el medio. Los agentes químicos usados como antiespumantes
han de ser lo más inertes posibles, para que no interfieran con el proceso que tiene
lugar en el fermentador. Suelen usarse aceites o alcoholes
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Esterilización
Para una buena rentabilidad, en virtualmente todos los procesos, será necesario que en todas las etapas
estén libres de contaminantes. También depende, no obstante, del campo en que nos estemos moviendo.
En el campo medio ambiental, hablar de esterilización no tiene mucho sentido, mientras que en el campo
alimentario será esencial. Generalmente, la necesidad de un proceso de esterilidad está en relación con el
valor añadido del producto.
La probabilidad de que exista contaminación a lo largo del proceso depende de las características del
mismo. La probabilidad de que exista contaminación en un cultivo mesófilo es mayor que en un cultivo
termófilo. También será más probable que exista contaminación en un medio con pH aproximado a 7,
más que a pH ácido. La probabilidad de que haya contaminación será mayor en los que consuman mucho
oxígeno, que en los que consuman menos.
Llegado a este punto hemos de plantear la optimización del proceso a nivel de producción, sino a nivel de
seguridad. Si se puede ajustar el pH hacia abajo, mejor, que será más seguro.
Durante la fermentación hemos de observar diferentes puntos para garantizar la esterilidad:
- Esterilidad del medio de cultivo: el medio nutritivo que se prepara inicialmente contendrá un
elevado número de células vegetales y otras derivadas ingredientes del medio. Todos estos
microorganismos han de ser eliminados por el proceso adecuado antes de la inoculación.
Existen diferentes métodos, pero normalmente se usa el calor, y raramente otros.
- Pureza del inóculo: el inóculo representa entre el 2 y el 5% del volumen total del
biorreactor, si el cultivo no es puro habrá contaminaciones.
- Esterilización del aire que fluye: La mayor parte de fermentaciones se dan en condiciones de
agitación vigorosa. El aire que entra ha de ser estéril. El aire puede contener entre 10-105
partículas/m3. de los cuales entre 5 y 2000 serán microorganismos, principalmente esporas
de hongos, bacterias Gram negativas y fagos en suspensión. La esterilización del aire que
entra es esencial.
- Construcción apropiada del biorreactor, para que la esterilización entre fermentación y
fermentación pueda servir para prevenir la contaminación. Cuando decimos biorreactor
queremos decir todos que contenedores usados para que tenga lugar la reacción.
¿Cuál será el método usado para la esterilización? Mediante el uso de un agente biocida que inactive los
microorganismos. Los agentes biocidas tienen diferentes dianas. Los usados en biotecnología se clasifican
en:
- Agentes químicos: existe un elevado número de desinfectantes químicos líquidos y
gaseosos. Pueden ser sustancias oxidantes como O3, óxido de etileno,... En la práctica se
usan poco, porque son difíciles de eliminar y por lo tanto se corre el riesgo de inhibir el
crecimiento de los microorganismos después, en la fermentación.
- Agentes físicos: son los más habituales.
o Radiaciones ionizantes: Rayos X, UV, o γ. Aunque ocasionalmente se usan en
industria alimentaria, no se usan de manera habitual en fermentaciones industriales
por el riesgo que suponen para el manipulador.
o Calor: es el método más empleado, sobre todo para el medio y para las
instalaciones. Usualmente se usa vapor de agua para esterilizar mejor.
o Métodos mecánicos: Filtración, Centrifugación,... La filtración es la única que se
usa en la práctica. Es útil para la esterilización de medios con partes sensibles a
calor y para esterilizar el aire.
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Tal y como ya hemos dicho, el calor es el método más empleado. Los agentes biocidas suelen tener
cinéticas de primer orden. Se ha de tener siempre en cuenta el factor CT, siendo c la concentración o
intensidad del agente biocida y t el tiempo de tratamiento. Es necesario recordar esto, puesto que se puede
conseguir el mismo efecto esterilizando 2 horas a 90º C o 4 horas a 45º C.
En la microbiología industrial, cuando se habla de esterilización, no se considera la esterilidad absoluta,
como en el laboratorio, sino que se trata de esterilidad comercia. En muchos productos podemos
encontrar microorganismos, pero dado que no tienen efecto sanitario, no resulta rentable eliminarlos.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Para que la productividad y el rendimiento sean máximos, será necesario que todos los parámetros del
fermentador sean óptimos y se mantengan constantes. El control de los parámetros es crucial. Existen una
serie de problemas típicos:
- Problema del calor: El proceso funciona a una temperatura óptima, específica de cada
proceso, si bien normalmente todos están entre los 20 y los 45º C, rango mesófilo, o a mas
de 45º C, rango termófilo. La temperatura ha de ser determinada para que de máximo
crecimiento y máxima producción. Tenemos fuentes de calor ajenas a la fermentación, como
pueden ser motores,... y fuentes internas, como pueden ser los microorganismos oxidando
materia orgánica. Es necesario regular el balance para que todo funcione de manera
adecuada.
- Problema de la agitación y de la mezcla: Una fermentación microbiana puede ser
considerada un sistema de 3 fases:
o Líquida: contiene el agua y las sales disueltas, así como los sustratos y los
metabolitos. En algunos casos puede existir una segunda fase líquida, si existen
sustancias inmiscibles en agua.
o Sólida: Consiste en células individuales, micelio, sustrato no disuelto o productos
del metabolismo que precipiten.
o Gaseosa: Contiene una reserva de oxígeno para la bacteria, siempre y cuando sea
aerobio, claro. También hay dióxido de carbono y otros gases que se hayan podido
formar.
La fermentación implica reacciones entre las 3 fases. El funcionamiento óptimo de la misma
requerirá una buena homogenización de las 3 fases. La agitación asegura el transporte de
nutrientes dentro del fermentador. La agitación produce los siguientes efectos en las 3 fases:
o Dispersión del aire en la solución de nutrientes.
o Homogenización de la temperatura y de otros factores en el fermentador.
o Suspensión de los microorganismos y los nutrientes no disueltos
o Dispersión de los líquidos inmiscibles.
Agitar implica transferencia de energía, por lo que requerirá a su vez un coste. Es necesario
optimizar la agitación, para lo que se han de tener una serie de parámetros en cuenta.
o Nº de Reynolds: Se trata de un número adimensional, que permite medir si el flujo
es laminar o turbulento.
Una buena homogenización viene indicada por Re. Para alcanzar el número de
Reynolds deseado los parámetros que se han de ajustar principalmente son la
velocidad de agitación y las dimensiones. En un sistema industrial se tienen que
optimizar también:
• Tiempo de mezcla: tiempo necesario para homogenizar el fermentador
hasta el grado deseado, hasta el Re deseado. Ha de ser mínimo.
• Nº de potencia, Np: es la energía necesaria para alcanzar el Re. Ha de ser
mínimo.
Hemos de usar palas de manera que el número de Reynolds sea elevado, pero con
tiempo de mezcla bajo y número de potencia reducido.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
La viscosidad puede ser también un problema. Una solución puede ser de dos tipos, en
función de su comportamiento.
o Fluido newtoniano: Se trata de un fluido, la viscosidad del cual es constante e
independiente de la velocidad de cizaña, a temperatura y presión constante. Todos
los gases y algunos líquidos lo son.
o Fluido pseudo plástico: Se trata de fluidos en los cuales la viscosidad aparente es
baja, pero después pasa a ser lineal. Es el comportamiento característico de mucho
cultivos de floriduras y de actinomicetes.
o Fluido neopéctico: Se trata de fluidos que al ser sometidos a tensión de cizaña
constante, presentan una viscosidad aparente que baja con el tiempo.
- Problema de la aireación: uno de los problemas que se presentan en una fermentación
industrial es el suministro de un flujo de gases adecuado. El oxígeno es el sustrato gaseoso
más importante, y el dióxido de carbono el producto metabólico gaseoso más importante.
Cuando una fermentación requiere oxígeno como sustrato, normalmente este es uno de los
factores más limitantes del proceso, debido a la baja solubilidad de este gas. Tan solo 9 ppm
se disuelven en un litro de agua pura a 20º C, pero la presión de solutos reduce este índice.
Existen numerosas barreras que dificultan la llegada del oxígeno del aire hasta el interior del
microorganismo. Aunque insertamos mucho aire, las barreras existentes entre la fase líquida
y la gaseosa, así como la membrana del organismo después hacen difícil la llegada del gas.
Es necesario que el flujo de aire insertado sea muy elevado, para que así el gas no sea
limitante del crecimiento del organismo.
Recuperación de productos
Una vez realizada la fermentación, hemos de recuperar el producto que hemos generado. Las técnicas
para recuperar el producto son similares a las usadas en la industria química convencional, pero con la
salvedad de que nuestro producto es biológico, por lo que no podremos usar ninguna técnica que pueda
inactivar el producto. También hemos de tener presente la localización de nuestro producto, de manera
que si queremos la célula o un producto sintetizado por ella las técnicas variarán, igual que variarán si el
producto es intracelular o extracelular.
Otro aspecto que se ha de tener en cuenta y no olvidar nunca es que estamos en la industria, lo que
implica que buscamos rentabilidad, de manera que no podremos usar algunas técnicas. En general, la
recuperación puede suponer el 20% del coste del producto, pero en productos con un alto valor añadido
puede llegar al 95% del total.
La selección de las técnicas a emplear depende de:
1. Naturaleza del producto
a. Localización del producto: Variará si es intra- o extracelular.
b. Características físicas y químicas del producto: si tiene carga, PM,...
c. Características biológicas: se altera con facilidad?
2. Concentración en la que se encuentra
3. Presencia de productos laterales
4. Destino del producto: el grado de purificación será diferente si se trata de un producto
medioambiental, alimentario o sanitario.
5. Precio del producto: si el producto tiene un precio bajo, entonces se usarán técnicas que no
hagan encarecer los costes.
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Existen una serie de etapas en el proceso de recuperación del producto, una vez ha concluido la
fermentación y tenemos el medio de cultivo con el producto y los organismos.
- Separación de los sólidos en suspensión; microorganismos básicamente. Se ha de tener en
cuenta que si el producto es intracelular deberemos lisar los microorganismos antes de
eliminarlos, o bien conservar la parte sólida y eliminar el medio.
- Extracción, concentración y purificación. En este punto se tienen que considerar los
diferentes métodos de extracción, ya que no se usarán los mismos métodos para extraer
antibióticos que para extraer alcohol.
Podemos iniciar el proceso de extracción en base al tamaño del producto. Podemos tener
diferentes tamaños. En función de cual sea el tamaño se usará un método u otro. Existen
diferentes protocolos, basados en diferentes principios, ya sean el tamaño, la carga, el
peso,... Se usará uno u otro como criterio de selección.
Veremos ahora una serie de métodos, basados en el tamaño. Estos métodos están ordenados
en función de tamaño, de manera que los primero sirven para partículas más grandes que los
últimos.
a. Sedimentación: es el método más fácil y barato. Si el producto es estable, se deja
sedimentar en el propio fermentador. Un problema es que la sedimentación requiere
tiempo, entre 24 y 48 horas, lo que es bastante tiempo.
b. Centrifugación: es un proceso más rápido que la sedimentación, pero ya no es gratis,
sino que requiere energía a la vez que algunos aparatos adecuados. Además no se puede
usar la centrífuga de carga, sino en continuo. Se usan desnatadores westfalia.
c. Floculación: resulta de mucho interés en la industria, puesto que es gratis. Para
sedimentar, las partículas han de ser mayores o iguales a 3µm. Si son más pequeñas, se
añade un floculante, provocando que aumenten de tamaño y sedimenten. Se ha de ir con
cuidado con el floculante que se añade, ya que si lo que sedimenta es residuo no hay
problema, pero si es el producto, se ha de ir con cuidado con el floculante, que no podrá
ser insoluble.
d. Filtración: es un método de mucho interés. El problema es que suele resultar caro, ya
que los filtros resultan caros y que requiere energía. Se ha de optimizar el proceso.
e. Filtración perpendicular: se hace pasar lo que se quiere filtrar perpendicularmente al
filtro. Se ha de hacer un prefiltrado para eliminar posibles residuos grandes que puedan
obturar el filtro.
f. Filtración tangencial: es similar al anterior, pero el flujo es tangencial.
g. Diálisis: la mezcla se introduce en un saco semipermeable adecuado, que se sumerge en
agua o un tampón adecuado. Lo que pueda pasar a través de la membrana saldrá,
mientras que lo que no permanecerá en la bolsa.
Existen otras técnicas de separación, que cada día son más importantes a nivel
biotecnológico.
h. Cromatografía de adsorción: se llena la columna de carbono activo o similar. Se vierte
el producto a purificar, y por interacciones se podrá purificar el producto.
i. Cromatografía de intercambio iónico: el producto tiene una carga eléctrica, sea cual sea.
Se llena de resina catiónica o aniónica, según sea el caso, en una columna. El producto
quedará retenido entonces por carga. El tipo de resina dependerá de la carga del
producto.
j. Cromatografía de exclusión molecular: existen ciertos polisacáridos, como dextranos o
sephadex, que permiten hacer columnas a la carta. La idea es que confiere una forma
con receptáculos para moléculas de determinado tamaño, ni más grandes ni más
pequeñas.
k. Cromatografía de afinidad: es la más fina de todas las técnicas, pero por lo tanto, la más
cara. Se usa una columna con un sustrato muy afin al producto, como puede ser la
relación antígeno – anticuerpo, o enzima – sustrato,... Se buscan interacciones muy
específicas entre sustrato – producto.
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En las próximas tablas podemos apreciar los diferentes métodos usados para la extracción de los
productos.
Las principales operaciones de recuperación en relación con las etapas en que son utilizadas son:
SEPARACIÓN DE SÓLIDOS
Eléctrica Electroforesis
ROTURA CELULAR Rotura mecánica, lisis física, lisis química, lisis enzimática
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Hemos hablado de diferentes tipos de cromatografías, que se diferencian en diversos aspectos, como se ve
en la tabla inferior:
Existen diferentes técnicas para la rotura celular, en caso de que el producto de interés se encuentre en su
interior.
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Alcoholes
Fermentación alcohólica
La producción de etanol es un proceso industrialmente viejo. El etanol por su uso como materia primera
química se produce por fermentación desde los inicios de la microbiología industrial, y para la producción
de bebidas alcohólicas desde hace miles de años. Pero durante muchos años se ha obtenido por
procedimientos químicos, mediante la hidratación
de etileno. Últimamente se ha retomado la
producción de etanol para su uso químico a través
de la fermentación. El etanol se produce por
fermentación para fabricar bebidas alcohólicas y
alcohol industrial, pero el uso del etanol como
combustible no es rentable, ya que es más
económico comprar petróleo que producir etanol.
Tan solo lo producen algunos países
subdesarrollados.
La producción de etanol por fermentación de la
glucosa se produce por la vía
de Embden - Meyerhof – Parnas (EMP). A través
de esta vía, el piruvato producido pasa a ser
acetaldehído por acción de la piruvato
descarboxilasa. El acetaldehído pasará a alcohol
por acción de la alcohol deshidrogenasa.
El 96% de la producción de etanol la llevan a cabo
hongos, diferentes especies de levaduras,
principalmente:
Saccharomyces cerevisiae
Khuyveromyces fragilis
Torulospora
Los sistemas biológicos discontinuos para la producción de etanol se inician en aerobiosis, ara obtener la
máxima biomasa posible, ya que si las condiciones anaerobias empiezan demasiado pronto, la población
no será lo suficientemente grande como para obtener una buena velocidad de conversión a etanol.
Distinguimos por lo tanto 2 fases:
- Fase aerobia: Glucosa 6 CO2, es una fase de crecimiento
- Fase anaerobia: Glucosa 2 Etanol + 2 CO2, es la fase de producción de etanol
Por otro lado, incluso en la fase anaerobia será necesaria una cierta presencia de oxígeno, ya que las
levaduras lo necesitan para producir sus esteroles y sus AGs insaturados de membrana.
El principal problema es que el etanol es inhibidor a altas concentraciones. La tolerancia al alcohol de las
levaduras es crítica para obtener rendimientos elevados. La tolerancia al alcohol de diferentes cepas varía
considerablemente. A medida que aumenta la concentración disminuye la velocidad de crecimiento, en
primer lugar, y a ciertas concentraciones, incluso la síntesis de alcohol se ve inhibida. El crecimiento
generalmente se detiene al llegar al 5% de etanol, mientras que la síntesis se detiene entre el 6 y el 10 %.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
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Elaboración de la cerveza
La cerveza es la bebida alcohólica más consumida en el mundo. España es el tercer productor de cerveza
de Europa, con 6000 Ml al año, pero tan solo somos el noveno consumidor mundial.
El proceso de producción de la cerveza es importante como tal, como sistema de producción de la
cerveza, pero también porque es la base de todas las bebidas alcohólicas que tengan como base la
fermentación a partir de cereales, como el whisky.
1. Materias primas y preparación de la
malta. En los granos de cereales los
carbohidratos se encuentran en
forma de almidón principalmente.
Dado que las levaduras utilizadas en
la fermentación no tienen amilasas,
es necesario hidrolizar este almidón.
Este proceso se conoce como
malteado. Se trata de una
sacarificación, ya que se pasa de
almidón a sacarosa. Consiste en
hacer germinar los granos de cebada
para que produzcan los enzimas
necesarios para la transformación de
proteínas en aminoácidos y el
almidón en azúcares fermentables.
En el proceso de malteado, los
granos se sumergen en agua a una
temperatura entre 10 y 25º C entre
48 – 60 h. Durante este tiempo, los
granos se hidratarán, pasando de un
10 – 12% de agua a un 44 – 50%.
Una vez remojado el grano, la
germinación se hace entre
15 y 21º C, según el tipo de malta.
Esto se hace en unos
compartimentos especiales, con el
suelo perforado, donde se controla la
humedad y el flujo de aire. Durante
la germinación se producen
diferentes enzimas hidrolíticos como
α - y β-amilasas, peptidasas,
celulasas,...La β-amilasa ya está
presente en el grano, pero en una
forma inactiva, que se activará por
unión a otras proteínas. Es la
encargada de la mayor parte de la
degradación del almidón. Una vez
alcanzado el grado deseado de
germinación, cuando los granos están blandos, la malta se deseca hasta tener un 6% de humedad
aproximadamente, a 65º C primero y después a 80 – 85º C, para reducir la humedad a un 4,5%.
Con esto se detienen los procesos de germinación, de crecimiento bacteriano y se favorece la
reacción de Maillard, que contribuye a darle a la cerveza su aroma y color característico. El
malteado es un proceso limpio, ya que el resultado está esterilizado. En ocasiones puede ser
necesario añadir amilasas de origen fúngico. La malta de buena calidad tiene suficiente actividad
enzimática como para facilitar la extracción y conversión de mezclas de maceración que
contengan hasta el 60 – 70% de cereales, además de la propia malta. Los enzimas microbianos
industriales pueden sustituir a la malta como fuente de enzimas para la producción de mosto
cervecero, de manera que actualmente se puede obtener una mayor variedad de bebidas
alcohólicas procedentes de cereales, ya que no con todos los cereales funcionaba bien el
malteado.
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2. Maceración y filtración. Durante la maceración, las materias primas se extraen con agua, con lo
cual los azúcares y otros nutrientes necesarios para la fermentación, que sean solubles, se
extraerán del cereal. Esta fase se hace en condiciones de calentamiento controlado. Puede
hacerse de dos maneras.
o Maceración por infusión: el grano se introduce en una cámara de maceración, el
fondo de la cual está constituido por una placa filtrante, parcialmente llena de agua
caliente, a una temperatura de 65º, para permitir la conversión enzimática y la
extracción del mosto. Posteriormente el mosto se separa por filtración, mientras que
la parte insoluble se usa para hacer piensos,...
o Maceración por decocción: la harina se macera a unos 50º C inicialmente, pero la
temperatura va subiendo. Se transfiere parte de la masa a una caldera, donde
hervirá y se devolverá a la masa restante. Una vez macerado, el mosto se separa de
la masa agotada por filtración en una tina llamada cámara de clarificación.
La temperatura óptima de las proteasas, amilasas,... de la malta usada dicta las condiciones de
maceración. Si al final del proceso de maceración la extracción de azúcares ha sido insuficiente,
pueden añadirse harinas más sacarificadas de otro cereal que aporten más amilasas.
El resultado de la maceración se mezcla con lúpulo, que aporta componentes como el pirogalol,
taninos, resinas y aceites, que dan la amargura característica de la cerveza y además actúan como
estabilizantes.
3. Cocción del mosto. El mosto clarificado mezclado con el lúpulo se cuece durante 60 – 90
minutos, con tal de favorecer:
o La inactivación de los enzimas de la malta
o La esterilización del mosto
o La precipitación de las proteínas y los taninos, que se separan, en la clarificación
del mosto.
o La extracción de sustancias amargantes procentes del lúpulo. El lúpulo se pone y se
elimina después, pero deja el gusto característico. Si no se pusiese, no tendría el
gusto característico, en cuyo caso tendríamos mosto cervecero, que podría servir
para muchas cosas.
o La producción de color, aromas, y sabores característicos por la caramelización de
los azúcares, la formación de melonoidina y la oxidación de los taninos.
o Destilación de los volátiles.
A continuación se separa el precipitado proteico, el lúpulo agotado y el resto de sólidos, a veces
con la ayuda de un agente floculante, en un separador adecuado o mediante la combinación de
un tanque de sedimentado y un filtro o centrífuga. Una vez separados los sólidos, el mosto se
enfría, mediante un sistema de intercambio de calor, hasta la temperatura inicial de
fermentación. Además se airea hasta que la concentración de oxígeno sea entre 5 y 15 mg por
litro, para favorecer la formación de ácidos grasos insaturados y esteroles que después no se
podrán producir.
4. Fermentación de la cerveza. El mosto se inocula con levaduras, hasta que tiene
aproximadamente 107 células por ml o más, si es necesario para incrementar la velocidad de
fermentación. Tradicionalmente la producción de la cerveza inglesa, “ale”, se hacía
entre 15º - 22º C, y se usaban levaduras de fermentación alta, Saccharomyces cerevisiae, que
subían a la superficie y se podían eliminar en forma de espuma, mientras que la cerveza “lager”,
o “pilsen” alemana, se hacía entre 8º y 15º C y con levaduras que sedimentaban al fondo del
contenedor, Saccharomyces carlsbergensis, hacia el final del proceso. Con la introducción de los
grandes dispositivos fermentadores y el uso de centrífugas, esta tendencia tiende a desaparecer.
En las fermentaciones para obtener lager, el recuento inicial de células es de 107 células por
mililitro. Se usan levaduras seleccionadas, preparándose un inóculo nuevo para cada
fermentación. La temperatura inicial es de unos 10º C. Al cabo de unos 3 días, la población de
levaduras se ha incrementado unas 4 – 5 veces. La temperatura tiende a aumentar a lo largo del
proceso de fermentación. Puede ser necesario refrigerar cuando se alcanza el máximo. Si la
temperatura se mantiene entre 6 y 10º, la fermentación dura unos 10 días, pero si se hace entre 15
y 22º C, se completará en 3 días.
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La uva es una fruta atípica, aunque todas las frutas tienen un elevado porcentaje de azúcares libres, en la
uva existe una elevada concentración de azúcares en la uva en forma de glucosa directamente. En
cambio el grano tiene almidón, por lo que para la cerveza se requiere el malteado y para el vino no.
El vino hasta hace poco se hacía con levaduras salvajes que existían de forma natural en la viña. La
cerveza siempre se ha inoculado, porque en el proceso anterior a la fermentación se destruyen todos los
organismos.
En el vino hasta el 3-4% de alcohol existe una población mixta de levaduras, pero a partir de este punto
sólo puede actuar Saccharomyces cerevisiae, mientras que en la cervezas es un cultivo puro, que has
inoculado.
La uva o el mosto no se puede cocer o limpiar, llegan tal y como viene del campo y se tritura todo.
Todo lo que haya en la uva pasará al vino, de manera que estará más o menos contaminado. Esto es un
problema, que se soluciona poniendo bisulfito, si unos 15 días antes de la cosecha hay un tiempo
húmero, ya que crecerán hongos, que tomarán nitrógeno y que dificultarán la clarificación del vino.
En la uva puede existir déficit de N o P que puede dificultar que la levadura arranque. En ese caso se
puede añadir PO4-- o NH4NO3 y vitamina B.
El pH del mosto es más ácido que el del malteado, 3 contra 5.
La cerveza al principio tiene que tener una cierta cantidad de oxígeno para conseguir la masa crítica de
la levadura. En el vino no es necesario, porque llega ya suficientemente aireado. La fase aerobia dura
entre 2 y 3 días, mientras que la anaerobia unos 8 meses.
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Desde hace unos 10 años se hace un proceso conocido como estabilización tartárica. El ácido tartárico se
encuentra en saturación en el vino. Un descenso de temperatura podría provocar la precipitación del ácido
en forma de cristales. Para que el consumidor no encuentre cristales en su botella el vino se lleva a
temperaturas bajas, para que precipite todo el ácido tartárico. Los cristales irán a la industria
farmacéutica, que los podrá para hacer sales de frutas,... Todo se aprovecha. Antes no se realizaba este
proceso, simplemente se confiaba en que hiciese frío y que precipitase.
Después de la estabilización tartárica se vuelve a filtrar, por un filtro de 0,45 µm de diámetro, para
eliminar levaduras. Después de esto se embotella y se deja pasar por un proceso de envejecimiento
reductor.
Entendemos como vino de crianza aquel vino que ha estado entre 1 y 3 años en la bodega, mientras que
los vinos de reserva han estado entre 3 y 5 años.
Vinificación en blanco
Las diferencias respecto a la vinificación en negro son:
- Sólo se utiliza el
prensado, se evita
la extracción de
pigmentos.
- No se envejece el
vino, porque en el
vino blanco no
queremos buscar
los aromas debidos
al envejecimiento,
sino que queremos
un aroma afrutado.
- Desfangado: Como
no se limpia, no se
desrapa, después
de exprimirlo
queda como un
fango, que se
puede eliminar por
sedimentación o
por centrifugación.
Esto hace que se
pierdan algunas
levaduras. Esto
hace que a la
fermentación le
cueste empezar.
De hecho el
sustrato es peor
que en el caso del vino negro.
- Se añade SO3-- a lo largo de todo el proceso, no solo al principio
- Generalmente no hay fermentación maloláctica porque la uva no se coge tan madura.
Generalmente se hace sin este fermentación, pero en el caso del vino de Borgoña sí que se
hace.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Con el tiempo se ha ido aplicando la tecnología moderna a la industria del vino, pero muy poco. Algunas
de las cosas que se pueden hacer son:
- Maceración carbónica: Se aplica a la vinificación en negro. La uva no se pisa, sino que se
encuba directamente.
Entonces se hace el
vacío y se inyecta
CO2. Esto provoca
que los granos se
aplasten por su propio
peso. La ventaja que
presenta es que las
células vegetales
llegan vivas a la cuba,
de manera que al
respirar el oxígeno se
agotará más
rápidamente, de
manera que se puede
acortar el tiempo del
tratamiento inicial.
Los enólogos opinan
que al hacerse el vino
así no envejece tan
bien, de manera que
sirve para hacer vinos
de crianza, pero no
para hacer reservas.
En Francia se hace
mediante este método
un vino, conocido
como vino del año,
que sale por Navidad,
tan solo 3 meses
después de la
vendimia. Es un vino
normal, que no
aguanta mucho
tiempo, pero que se
hace muy rápido.
- Vinificación en caliente: Se aplica a la vinificación en blanco. Se aplica cuando la cosecha
está en malas condiciones sanitarias, ya sea por haber llovido 15 días antes de la cosecha, de
manera que la uva se hinche, provocando que los granos revienten y se contaminen de
hongos y bacterias lácticas, o por cualquier otra cosa. Los hongos producen enzimas que
dificultan mucho la clarificación. Se hace un pasteurización rápida la mosto, de unos
segundos a 70 – 80º C, de manera que se inactiven los enzimas, pero que no se vean
afectadas las levaduras ni las bacterias. El vino resultante nunca será un vino de gran
calidad, ya que las materias primas eran defectuosas y hemos tenido que aplicar un proceso
para poderlas aprovechar.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Vino Rosado
¿Cómo se hace el vino rosado?
- Si se hace como dicta la ley, será un vino de vinificación en negro con extracción de color
muy corta
- Se puede hacer también mezclando vino de vinificación en negro, donde la uva negra se ha
mezclado con la uva blanca. A esto se la ha de llamar vino de mezcla, siendo ilegal llamarlo
rosado. En algunos países se hace así.
Se conoce como vino monovariedad al vino obtenido íntegramente al 100% de una única variedad.
Generalmente evolucionan de una manera poco predecible. A las bodegas no les interesa, porque el
producto de un año y de otro puede ser muy diferente, con lo que su producto final también será muy
diferente. Normalmente con poner un 25% de una variedad ya está bien. El Cavernet – Sauvignon tiene
un 85% de esta variedad.
Vino espumoso
El vino espumoso más conocido mundialmente es el champagne. El que se hace en Catalunya, por el
método tradicional, es champán, pero no se le puede llamar así porque no se hace en esa región, por lo
que se le conoce como cava.
La mayor parte de la producción nacional de cava se hace entre St. Sadurni y Vilafranca, pero hay otros
sitios donde también se produce. La producción mundial de cava está en los 500 millones de botellas.
España produce unos 150 millones, Francia entre 150 y 170, mientras que el resto se produce en América,
pero para empresas españolas o francesas.
El descubrimiento del cava se produjo por la
fermentación secundaria de un vino de mesa seco
seleccionado, al que se le añadió azúcar, para que
haga una segunda fermentación, ácido cítrico y
una levadura especial que es capaz de sedimentar
durante el embotellado.
Esta fermentación secundaria se hace en la
botella, entre 15,5º y 18º C, entre 6 y 8 meses. La
sedimentación se mueve progresivamente hacia el
cuello de la botella por agitación progresivo y
almacenado hacia abajo. El cabo de 6 – 8 meses
de fermentación la tapa de levaduras se elimina.
Se congela el cuello y se quita el tapón,
llevándose así las levaduras. Para reponer el
volumen perdido se añade una pequeña dosis de
licor de expedición, que a veces lleva azúcar.
Después de esto se le pone un tapón de corcho a
la botella. La presencia de CO2 se debe a la
formación de etilpirocarboteno, que proporciona
las burbujas persistentes del auténtico champaña.
En los vinos espumosos se inyecta el CO2, dando
lugar a un burbujeo más ligero.
Aparte del método tradicional existen 2 métodos
más tecnológicos:
- Gran basse: La fermentación y
envejecimiento, en lugar de hacerse
en botellas individuales, se hace en
grandes fermentadores, y en
condiciones isotérmicas. Lo que
duraba unos 3 meses ahora dura unas dos semanas. Se dice que este método permite reducir
el tiempo de envejecimiento, sino eliminarlo directamente, porque como las levaduras han
estado siempre por allí, el trasvase de aromas ya se ha producido. Esto resulta en un ahorro
de dinero y de espacio. El producto que sale es aceptable, aunque los expertos afirman que
no es de la misma calidad, debido a que el intercambio no ha sido tranquilo.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Ácidos orgánicos
Los ácidos orgánicos se usan frecuentemente como aditivos en la industria alimentaria, así como aditivos
químicos en piensos. Todos los ácidos del ciclo de los ácidos tricarboxílicos pueden ser producidos
microbiológicamente con un elevado rendimiento. Otros ácidos orgánicos derivan directamente de la
glucosa como es el caso del glucónico, o ser forman como productos finales de fermentaciones a partir de
piruvato o de etanol, como el ácido láctico y el acético.
Excluyendo al ácido cítrico, producido exclusivamente por fermentación, existe normalmente
competencia entre los métodos químicos y los biológicos.
Ácido cítrico
La producción de ácido cítrico es de aproximadamente 750000 toneladas al año, de las cuales actualmente
el 99% se producen por medios biológicos. Los procesos de fermentación se hacen sobre la superficie de
los cultivos o en fermentadores de hasta 220 metros cúbicos. El rendimiento de la fermentación es de
entre 60 y el 70% del rendimiento máximo, y el 40% de las materias primas pasan a ser ácido cítrico.
El ácido cítrico se consume por:
- Industria alimentaria: aproximadamente 65%. Se usa como potenciador o preservador del
sabor de zumos, caramelos, helados...
- Industria farmacológica: 10 – 15%. Preserva la sangre. Se usa en pomadas, pastillas y
cosméticos.
- Industria química: aproximadamente 25%. Se usa como agente antiespumante, ablandador,
y para el tratamiento de tejidos. En la industria metalúrgica los metales puros se producen a
en forma de citratos metálicos.
Las cepas productoras son cepas de Aspergillus niger y A. wentii, altamente modificados. Muchas cepas
de hongos excretan ácido cítrico, pero para la producción industrial se usan cepas especialmente mutadas
que no produzcan productos laterales como ácido oxálico, isocítrico,... de manera que entre el 30 y el
40% del producto final sea cítrico.
Producción de ácido cítrico
El ácido cítrico es un producto del metabolismo primario, formado en el TCA. En la trofofase, parte de la
glucosa del sustrato se usa para la producción de medio y pasa a ser CO2. En la idiofase la glucosa
restante pasa a ser ácido orgánico, excepto una pequeña parte que pasa a CO2 por la respiración.
El sustrato para la producción de ácido cítrico suelen ser sustratos azucarados. Antes se usaban muchas
melazas, pero la crisis de la industria azucarera, provocada por el hecho de que cada vez se consuma
menos azúcar, y que cada vez se aprovechan más los residuos, ha hecho que aumenten los posibles
sustratos. Ahora se usan aguas sulfhídricas de papeleras, que es un residuo muy contaminante, o sustratos
más raros, procedentes de la industria alimentaria. Los medios usados han sido muy perfeccionados a lo
largo de los años de la producción de ácido cítrico.
El ácido cítrico se produce tanto en procesos en superficie como sumergidos.
1. En superficie: Los procesos en superficie puede ser divididos en función del estado del medio de
cultivo usado:
a. Medio sólido: Plantas de baja producción, muy limitadas, unas 500 toneladas al año. Se
usa sustrato sólido, como mollas de pan o pulpa de almidón. El pH del medio se reduce
hasta 4 o 5 antes de la esterilización. Después se inocula con esporas, extendiéndolo
sobre bandejas en capas de 3 a 5 centímetros de grosor y se incuba a 28º C. El proceso
dura unas 90 horas, al final de las cuales la solución entera se extrae con agua caliente
para aislar el ácido cítrico.
b. Medio líquido: Es el método más antiguo de producción. Actualmente se produce el
20% del total con este método. Permanece en uso todavía debido a la baja inversión que
requiere para su funcionamiento, ya que la tecnología es sencilla, el coste en energía
para los sistemas de refrigerado es bajo. El mayor coste viene por la mano de obra, más
grande que en los reactores sumergidos, pero es mano de obra no especializada. En
reactores sumergidos se requiere menos mano de obra, pero más especializada.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Ácido acético
La producción de ácido acético a partir de líquidos alcohólicos es conocida desde hace tanto como la
producción de las bebidas alcohólicas. El vinagre es un producto muy viejo, y aunque por el nombre
podríamos pensar que es solo un subproducto de la industria del vino, es más que eso. De hecho para
hacer un vinagre de mesa no podremos partir de un vino malo. Es un subproducto de la industria del vino
tan solo cuando el acético está destinado para ser de uso industrial. La producción anual es de entre 2 y 3
millones de toneladas, que van a parar a la industria alimentaria y a la industria química, donde se usa
para la fabricación de plásticos.
Producción de ácido acético
La producción de ácido acético no es más que la oxidación incompleta del alcohol hasta ácido acético, de
manera que no es una fermentación en el sentido microbiológico del término porque el poder reductor se
transfiere al oxígeno y el producto está más oxidado que el sustrato. Es llevada a cabo por bacterias del
ácido acético. Existen de dos tipos:
Supraoxidans: Acetobacter Va lento, pero hace el proceso entero Azúcar alcohol acético CO2
Podría parecer que Gluconobacter es el ideal para producir el ácido acético, pero en realidad no es así,
porque produce cetonas y otros productos que dificultan la purificación del producto final. Se usa
Acetobacter, pero vigilando que no se agote el alcohol, porque en ese caso empezaría a degradar el
acético. Se ha de considerar además que la ley prohíbe que el vinagre tenga más de 0,5º de alcohol.
Todos los métodos requieren un sustrato inicial con una concentración de etanol baja, que no sea superior
al 5 – 6%, porque al principio es sensible al alcohol, y una cierta cantidad de azúcares, porque al principio
de la fermentación se usan azúcares. Las materias de partida serán vino, suero de la leche, malta o sidra,
que no requerirán ningún componente adicional para ser una solución completa de nutrientes. En cambio
si usamos licores de patata o grano será necesario añadir nutrientes en muchos casos para poder obtener el
crecimiento y la producción de acético. En la fermentación sumergida la concentración ha de ser 5 veces
superior debido a la mayor biomasa que extraes del biorreactor con el vinagre.
Existen procesos de producción en superficie y sumergidos.
1. Procesos en superficie. Pese al éxito de los procesos sumergidos, los procesos en superficie se
utilizan aún hoy en día de manera amplia en la producción de vinagre y vinagres de lujo.
Existen dos métodos básicos de producción en superficie:
a. Método de Orleáns o método lento. Acetobacter es muy aerobia, si pasan más de 2
minutos sin
oxígeno mueren.
En este método, y
al principio en
todos, se usa
Acetobacter
xulium, porque
produce celulosa
que le permite
flotar, a diferencia
que la mayoría de
las bacterias que se
hunden. No
obstante, después
del crecimiento, la
masa de bacterias
pesa demasiado y
se hunde.
En este método, la madre del vinagre, la masa de crecimiento, flota en la superficie de
una bota, en contacto con el vino y con el aire.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
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Microbiología Industrial y Alimentaria
La recuperación está facilitada por el hecho de que el ácido acético cristaliza a temperaturas inferiores a
15º C, de manera que es fácil de concentrar. El producto de cristalización directa aún puede ser llamado
vinagre, ya que no está purificado. Para tener acético es necesario purificarlo más. Las bacterias se
eliminan por filtración. Una vez obtenido el filtrado, si se desea, se puede decolorar mediante el uso
de K4[Fe(CN)6].
Para que sea vinagre, es necesario que tenga residuos, ya que no es legal que una solución de acético en
agua sea llamada vinagre. El producto cristalizado se usa para eliminar los residuos más grandes,
momento en que se calienta para que se licue de nuevo, pero no se eliminan más residuos.
Ácido láctico
En teoría debería ser uno de los ácidos más consumidos por la industria alimentaria, porque la
fermentación láctica interviene en al fabricación de muchos alimentos. Pero de hecho, debido a que en la
mayoría de los casos la fermentación láctica se hace sobre el producto, y no se añade de manera adicional,
el ácido láctico es uno de los productos en los que resulta más barato usar la síntesis química que la
biológica. La fermentación para obtener litros de ácido láctico no tiene mucho sentido, pero sí que lo tiene
la fermentación láctica para la fabricación de muchos productos diferentes como pueden ser:
- Productos lácteos
- Conservas cárnicas. Embutidos.
- Conservas vegetales. En teoría la conservación de los vegetales debería hacer mediante la
fermentación láctica, pero en la práctica se añade simplemente vinagre y se pasteuriza. Se
hace esto porque los materiales de partida para hacer una fermentación láctica son muy
heterogéneos. Mediante el uso del vinagre se obtienen resultados más seguro y homogéneos.
- Fermentación málico – láctica del vino
Productos lácteos
En España se consumen dos productos lácteos principalmente, entre los que no se encuentra la leche.
- Yogurt
- Queso, pero sólo una décima
parte del consumo en Francia.
En el proceso de fabricación del yogurt
consiste en la inoculación de la leche con
Lactobacillus bulgaricus y con
Streptococcus termophillus en una
proporción similar. Al final del proceso la
proporción de ambas bacterias es también
similar, pero existen fases de predominio de
una u otra bacteria.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
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Microbiología Industrial y Alimentaria
En resumen, los probióticos destinados al consumo humano no son más que una manera de potenciar el
consumo de productos lácteos, que han desarrollado las industria del sector. Además, al no ser yogurt per
se, pueden saltarse la ley que regula ese producto y usar bacterias diferentes, pH diferentes, fechas de
caducidad diferentes,... Y además se vende como un producto beneficioso y básico para la salud.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Vitaminas
La producción mundial de vitaminas se la
dividen básicamente entre 2 empresas:
Roche y Ziba – Henti.
Sólo existen 3 vitaminas diferentes, B12,
vitamina c y riboflavina, que se produzcan
mediante métodos microbiológicos a escala
industrial, porque la extracción de vitaminas
de productos ricos o la síntesis química
suelen ser métodos más baratos.
Para la síntesis de vitamina B12, la 5’
desoxiadenosil cobalamina, se usan cepas de
Propionibacterium: P. freudenreichii y P.
shermanii
Métodos de producción de aminoácidos
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Microbiología Industrial y Alimentaria
La ruta de síntesis de las cobalaminas es bastante compleja, como se puede ver en la gráfica. Partimos de
materias primas caras, como pueden ser la lisina
o el succinil Coa. El proceso sigue en
anaerobiosis, representado en rosa en la gráfica.
Después se pasan a condiciones aeróbicas,
representadas en verde. Si de hecho la síntesis
es compleja, el proceso de extracción lo es aun
más. La producción de vitamina oscila cerca de
los 25 mg por litro de medio de cultivo. Existe
una patente de Pseudomonas que afirma que la
producción es de 70 – 80 mg/l, pero no parece
tener mucha consistencia.
Producción de enzimas
El primer enzima producido industrialmente lo
produjo Parker – Dans, un laboratorio
farmacéutico, en 1894. En 1915 prácticamente
todos los detergentes industriales en Estados
Unidos contenían proteasas, enzimas de síntesis
microbiana. Los detergentes lleva un siglo
conteniendo enzimas...
La mayor parte de los enzimas producidos va a
la industria alimentaria, mientras que otro
porcentaje va al campo analítico, pero se trata
de enzimas diferentes. Existe un tercer campo
muy reducido, pero de gran valor añadido, que
es el que busca las aplicaciones clínicas, por ejemplo en medicación, como pueden ser lipasas,
hialuronidasas,...
En el gráfico de la izquierda se puede ver
como se reparte el uso de enzimas en las
diferentes industrias. De hecho, la industria
de la producción de enzimas es una de las
mayores en el campo.
Dentro de la industria del almidón se
encuentran muchos tipos diferentes de
enzimas. De hecho, dentro de esta industria
se encuentra incluso la industria petrolera.
Dentro del porcentaje que representa la
industria de la alimentación encontramos
muchos enzimas diferentes, que se pueden
usar con diferentes finalidades, entre ellas
las de facilitar la decantación...
Aparte se ha de considerar el porcentaje
que representa la producción con destino a
la parte clínica o analítica, de gran
importancia.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Producción de microorganismos
Levaduras
La levadura es el microorganismo más usado en la industria. Se usa principalmente en la panificación,
aunque también en la cervecería y en los procesos de vinificación.
Se produce a partir de aquellos sustratos con suficiente azúcar y nitrógeno como para soportar el
crecimiento de estos organismos. El sustrato más típico serían las melazas, pero cada vez más este
sustrato se usa menos, debido a que la industria azucarera está en crisis, debido a la presencia de
edulcorantes.
Hasta ahora, en todos los casos en los que hemos hablado de la levadura, hablábamos de ella como parte
de un proceso de fermentación. En este caso nos centraremos en ella como simplemente la masa de
levaduras que será, aunque en el caso de la panificación serán requeridos para hacer una fermentación.
El proceso se hace totalmente de manera aerobia, para que todo el carbono que haya en el sustrato inicial
pase a ser biomasa microbiana, ya
que si no hubiese oxígeno, haría
fermentaciones, que no es lo que
buscamos en este caso. Existe un
control en la fermentación de las
levaduras, que implica que no
puede haber más de un 0,2% de
alcohol, ya que eso sería una señal
de que habría hecho una
fermentación. Las levaduras
producidas van principalmente a
panificación, aunque también se
usan como suplemento para
piensos, ya que será la fuente de
todo el nitrógeno necesario, así
como aportará también vitaminas
liposolubles, como la vitamina B.
Producción de levaduras
La levadura en pastillas está viva, pero sin nutrientes. Es necesario que se
consuma rápidamente, por lo que las fábricas de levaduras estaban hace años cerca de las industrias a las
que suministraban. Otra alternativa es la levadura son las levaduras secas y activas, totalmente
deshidratadas. Se originó en Canadá, y actualmente este método ha tenido mucho éxito. Con los procesos
de desecación se alcanzan concentraciones de 1010 levaduras por gramo. Se almacena en envases
especiales, más caros, pero que permiten la conservación de las levaduras durante casi un año. La
industria de panificación ahora depende más de este método que del suministro de levaduras diario.
Existen unas pocas empresas que se encarguen de esto.
Levaduras alimentarias y en polvo
Como producto dietético se usan levaduras de cerveza, ya que no es más que eso. No tiene mucha salida.
También se usa para hacer medios de cultivo, pero entonces se denomina levadura autolisada. Las
industrias cerveceras aprovechan la masa de levaduras que les queda después de la fermentación, que
aunque está medio muerta, aún conserva todas las vitaminas y nutrientes. Esto no deja de ser un
subproducto, no es un producto final.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Bioinsecticidas
El segundo tipo de microorganismos en importancia son aquellos que tienen capacidades insecticidas. Se
han encontrado diferentes organismos, pero los que se producen principalmente son diferentes cepas de
Bacillus thuringensis, aunque se probó también con B. papillidae, B. lentimorbus y Pseudomonas
aeruginosa, pero en todos los casos con menos éxito.
B. thurigensis, durante la esporulación, produce un cristal piramidal que contiene una proteína
denominada δ - toxina, que es un gran tóxico para los insectos. Al principio se pensó que afectaba
especialmente a lepidópteros. Una de las ventajas que presenta esta bacteria, es que al morir el insecto,
ella queda allí, y dado que es un morador habitual del suelo, sus propiedades insecticidas se prolongan
durante una temporada. Lo importante era que la bacteria quedase encima de las hojas, para que fuese
ingerida por los insectos.
Bacillus thuringensis se producía inicialmente por cultivos sumergidos, según la gráfica de la derecha.
Después se separaba la bacteria
de la espora, con cuidado de
que no se rompiese la espora.
La espora se unía a alguna
sustancia pegajosa para que
quedase unida a las hojas.
En teoría si lo aplicabas al
principio de la temporada,
podías eliminar las larvas, de
manera que evitabas una buena
parte de la reproducción, y de
hecho, si tenías suerte te duraba
2 años. De hecho tenía una
elevada eficiencia. Se empezó a
usar en los años 60 – 70, con
gran éxito, pero a causa de la
competencia que ejercían estas
empresas contra los Producción sumergida de Bacillus thuringensis
insecticidas químicos, en muchos casos derivados del
petróleo, las grandes empresas petrolíferas compraron y cerraron casi todas las fabricas. En Europa no
queda ninguna, solo en la República Checa, y en Estados Unidos siguen funcionando, ya que en las
hortalizas con destino humano no se pueden aplicar
productos químicos.
La solución a la que se ha llegado es que ya no se puede
vender la bacteria, ni la espora, sino sólo el insecticida,
por lo que no se reproducirá, de manera que cada año se
deberá volver a aplicar el insecticida. Además, la síntesis
ahora de la toxina es más cara. Otra opción que se ha
considerado ha sido clonarlo en Pseudomonas, pero no ha
tenido éxito sobre el terreno. Se ha pensado insertar la
proteína en Z.mays, pero no ha dado gran éxito y el grano
sólo es apto para el forraje.
Actualmente se sabe que Bacillus thuringensis afecta
también a otros tipos de insectos como coleópteros,
dípteros,... además se sabe que hay cepas que son capaces
de sobrevivir a su paso por el intestino del insecto, con lo
que las heces contendrán la bacteria.
B. papillidae y B. Lentimorbus actúan sobre un
escarabajo japonés, que ataca a las plantas de tipo textil,
Producción semi sólida de Bacillus thuringensis
como algodón o lino. Se perdió el interés por estas dos
bacterias porque son parásitos obligados, de manera que para su producción es necesaria una granja de
escarabajos.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
En ocasiones se han usado hongos como bioinsecticidas, pero no son de mucha utilidad. Al cortar un
árbol, el tocón queda abierto, con sus vasos al descubierto a posibles infecciones. Si las raíces de
diferentes árboles están en contacto, la infección podrá pasar de uno a otro. Si se aplica un hongo
incompatible con el patógeno en el tocón, se podrá evitar la infección. No obstante, la producción es
bastante escasa, inferior a una tonelada al año.
Se ha considerado también el hecho de cultivar virus para usarlos como bioinsecticidas, dado que serían
acciones superespecíficas, pero no parece factible, ya que son difíciles de cultivar y además son parásitos
obligados.
Rizobios
Se trata de organismos que actúan en simbiosis con las leguminosas. Se pensó que si se ponían rizobios
en el suelo no sería necesario abonar. La idea se originó en la unión soviética, pero no condujo a nada.
Actualmente la producción de rizobios es muy baja, de unas 3 toneladas al año. Se usan para bañar las
semillas de las leguminosas, de manera que cada leguminosa tenga su rizobio. Los propios poseedores de
las semillas son los que tienen los fermentadores para la producción o lo compran. No da ningún
problema para crecer, ya que puesto que normalmente crece en el suelo, crece sobre cualquier cosa.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Rotura del RNA celular por enzimas endógenos de la célula y liberación de 5’ mononucleótidos
Hidrólisis química del RNA de levaduras a nucleósidos, con fosforilación química posterior
Las cepas usadas en la producción son B.subtilis y B.megaterium principalmente, aunque se pueden usar
otras, como Micobacterium.
La producción tuvo un pico hace unos años, pero actualmente se ha estancado mucho. La mayor parte de
las empresas están en Asia, ya que se usan principalmente allí para dar sabor a los platos... En Europa se
produce cada vez más.
Producción de biopolímeros
Se trata de un campo muy interesante para la industria. Los polímeros de más interés actualmente son:
- Dextranos
- Scleroglucanos
- Pululanos
- Ácido algínico
- Xantano
Los biopolímero se han usado siempre como estabilizadores de los alimentos, e incluso para hacer plasma
y sangre artificial. El biopolímero más sintetizado actualmente es el xantano, del que se producen
aproximadamente 104 toneladas al año. Este producto es fabricado por Xanthomonas. Los biopolímeros
son mejores que los polímeros químicos, porque son degradables.
Para que se forme el biopolímero es necesario que haya unas condiciones de saturación de oxígeno, así
como que la relación entre C y N se decante hacia C, cuanto más mejor. La relación más adecuada es de
10 a 1. Se forma el polímero unido a un nucleótido, que irán atravesando la membrana hasta llegar al
medio. El medio se va espesando a medida que se produce polímero, con lo que la producción bajará. Ha
de haber una gran regulación del proceso.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Alginato
Ha llegado a la producción industrial, pero si hay una buena cosecha de algas sale más a cuenta extraerlo
de estas que producirlo. En caso de que se produzca lo producen Azotobacter vinlandii y otros del género
Azotobacter. En el laboratorio tiene utilidad para hacer agar, y su uso en la industria alimentaria está muy
limitado. Se llegó a usar para mantener la espuma en la parte superior de la cerveza, pero ya no se usa.
España es un gran producto de agar.
Curdlano
Es producido por Alcaligenes faecalis var. myxogenes. No se usa en la industria alimentaria. Se hincha en
presencia de agua, pero no es digerible. Tiene su utilidad para la industria farmacéutica para la
producción de normalizantes intestinales. Dentro de la industria alimentaria se puede usar para enriquecer
los productos con fibra, porque tiene el mismo efecto.
Poliesteres
Aún no están en producción industrial del todo, su producción oscila entre 100 y 1000 toneladas. Son
producidos por diferentes tipos de Pseudomonas. Este género no es un gran productor de polímeros, pero
algunas especies, en presencia de C y deficiencia de N. Se trata de una mezcla de polímeros. Actualmente
se intenta conseguir una muestra cada vez más homogénea, para hacer plásticos de alta resistencia. Se
usan subproductos de la industrial petrolífera como sustratos. Se hacen 2 o 3 transformaciones y se
consigue una muy buena materia primera.
Ciclodextrina
Todavía está en producción piloto. Es un polímero circular hecho por diferentes microorganismos. Cada
organismo lo hace de un diámetro determinado. Se trata de un polímero estable, con un núcleo hidrófobo.
El problema es que lo hacen organismos termófilos y anaerobios, por lo que el cultivo es complejo, ya
que se requiere exceso de oxígeno para inducir la síntesis de polímeros, de manera que se ha de ajustar
mucho. Parece tener utilidad como emulsionante. Se usa en laboratorios.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Bioconversión
Se trata de una transformación llevada a cabo por un microorganismo sobre una molécula preexistente
para dar lugar a otra molécula diferente. Se intenta sustituir la síntesis química de algunos productos por
la síntesis biológica. Tiene diferentes ventajas:
- Especificidad de sustrato que no tiene la industria química.
- Alta especificidad topológica de la molécula.
- Estereoespecificidad
- No dañará el producto final.
- No sindicado, trabajo 24h al día, totalmente informatizable.
Los microorganismos harán casi cualquier reacción que queramos hacer nosotros. El problema es
encontrar el organismo que haga la reacción deseada y ponerlo en las condiciones adecuadas para que
lleve a cabo esa reacción. Para localizarlos será necesario seguir un proceso típico de prospección,
mejora, selección... De hecho la mayoría de los que se usan están mejorados y modificados.
Generalmente el mayor problema que podemos encontrar es que la molécula a transformar sea lipófila. El
problema será que el microorganismo tenga acceso hasta la molécula. Una solución consistirá en añadir
una elevada cantidad de la molécula.
Este tipo de cultivos son rápidos, de 72 a 96 horas, e incluso menos en caso de bacterias, y unos pocos
días en el caso de los hongos. Se han conseguido reducir enormemente los costes de producción.
El principal cliente de este tipo de procesos es la industria sanitaria y los productos antiguamente difíciles
de producir están ahora al alcance de cualquiera. Algunos ejemplos pueden ser los anticonceptivos, los
corticoides,... Los procesos que se siguen se desconocen, son exclusivos de las compañías que los
realizan.
Otras biotransformaciones son las que afectan a la vitamina C, la DHA (dihidroxiacetona fosfato) y las
prostaglandinas.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Microbiología alimentaria
Nos centraremos en la relación de los microorganismos y los alimentos, desde dos puntos de vista. Por
un lado veremos los microorganismos como modificadores de los alimentos y por otro los alimentos
como vehículos de los microorganismos.
Los microorganismos viven con una única idea, reproducirse y autoperpetuarse. Para poder hacer esto
necesitarán nutrientes. Uno de los sitios de donde extraerán estos nutrientes es de los alimentos. Para que
esto no ocurra, deberemos tratar de conservar los alimentos. Además, se ha de tener en cuenta que
actualmente la demanda de productos frescos se incrementa.
A nivel de transformación no existen muchas normas, pero a nivel de vehiculización sí que se han de
cumplir una serie de estrictos criterios microbiológicos. Muchos alimentos pueden ser contaminados. De
hecho, casi todos los alimentos están ya contaminados. En un ser humano hay 1013 células eucariotas,
pero tenemos 1014 células procariotas de pasajeras.
Desde el punto de vista típicamente antropocéntrico tan solo nos interesan aquellas bacterias que puedan
ser alterantes o bien patógenas. Cada alimento será afectado principalmente por algunos tipos de
microorganismos. Los alimentos se contaminan, lo que es un hecho casi inevitable. Estos organismos
contaminantes vendrán del suelo, de plantas, de agua, de utensilios, del tracto intestinal, de la piel, de
animales, del aire....
Se ha de ser muy cuidadoso en la manipulación, un campo extremadamente regulado, ya que es donde se
producirán las contaminaciones, y habrá que evitar añadir patógenos adicionales a los que ya pueda llevar
el alimento. Los propios manipuladores pueden ser inconscientemente portadores de la enfermedad. De
hecho, el 50% puede ser portador de S.aureus. Además, dado que están expuestos a un mayor número de
vectores de transmisión implicará un mayor riesgo de que se conviertan en portadores.
En teoría, en la superficie del animal no debería haber ningún organismo cuando se le quite la piel. En la
práctica sí que habrá organismos, entre 104 y 106. Otro de los grandes peligros estará en la eliminación del
tracto gastro-intestinal. Un factor de riesgo que se debe controlar especialmente son los piensos, ya que en
estos pueden ser transportados patógenos de un grupo animal a otro.
La instauración de la normativa ISO9000 ha tenido un efecto dominó en la industria, ya que un
distribuidor que la cumpla deberá exigirla a sus proveedores, estos a los mataderos, a los productores y
finalmente a los productores de piensos, en el caso del ganado.
Alteración de alimentos
La determinación de cuándo un producto está alterado y no es apto para el consumo depende básicamente
del consumidor, de si está dispuesto a consumirlo o no. Los alimentos se alteran debido a:
- Crecimiento de los microorganismos. Los microorganismos ven el alimento como una
fuente de carbono para crecer y como tal lo aprovechan.
- Los mismos alimentos pueden tener enzimas propios que los alteren.
- Pueden darse casos de reactividad química espontánea como oxidaciones,...
- Los insectos y los roedores pueden alterar también los alimentos.
- Las manipulaciones industriales pueden tener efectos alterantes en los alimentos.
Los alimentos se pueden clasificar en 3 grandes grupos:
- Estables o no perecederos. Están en este grupo legumbres, harinas,... Con unos cuidados
mínimos se mantendrán bien.
- Semi – perecederos. Con el cuidado adecuado se pueden mantener un cierto tiempo. Es el
caso de las patatas, pan...
- Perecederos. Son la inmensa mayoría de los alimentos. Si no se va con mucho cuidado se
degradan fácilmente.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Existen una serie de factores que intervienen en la selección de los organismos y en la alteración de los
alimentos.
- Factores intrínsecos. Características físicas, químicas y biológicas del alimento.
- Condiciones medioambientales en las que se encuentra el organismo durante la
conservación.
- Los procesos industriales que se realizan con el alimento
- Las interacciones microbianas, ya sean antagonismos o sinergismos.
Factores intrínsecos
pH
Es determinante para el crecimiento de los organismos. En cada organismo su tolerancia oscila entre un
máximo y un mínimo, entre los cuales está el valor óptimo de crecimiento. Se ha de tener en cuenta que al
modificar uno de los factores óptimos se estarán variando también los demás. Veamos los márgenes de
crecimiento de los diferentes organismos.
Organismo Margen de pH
Hongos 0 – 11
Bacterias
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Agua
El agua es otro de los factores intrínsecos. Es un elemento básico para la vida, de manera que todos los
seres vivos, incluso los microorganismos la necesitan para vivir. Es
básico tener en cuenta en los alimentos lo que se conoce como P vapor agua en alimento
actividad de agua (AW), que es la relación del vapor de agua del AW =
alimento y la presión de vapor del agua pura, que es 1. La AW oscila P vapor agua pura
entre 0 y 1. Cuantos más solutos
Organismo AW tenga el alimento, menor será su AW. HR = AW x 100
Podemos establecer una relación
Mayoría de bacterias > 0,90 inversa entre la presión osmótica del alimento y su AW. Los
microorganismos necesitan agua para poderse multiplicar.
Levaduras > 0,88 Con AW < 0,6 no podrá crecer nada, tendremos un alimento estable. Son
alimentos muy desecados o con una elevada presión osmótica. La
Mohos > 0,80 mayoría de los patógenos necesitará AW superiores a 0,9. Una excepción
es S.aureus, que puede crecer con AW de 0,86. Con menos de 0,7 de AW
Bacterias halófilas > 0,75 muy pocas cosas podrán crecer y muy concretas.
Dependiendo de las características de cada alimento tendremos unas
Mohos serófilos > 0,61
condiciones de AW. Los alimentos frescos tiene una AW de 0,98, y a
partir de aquí la AW va bajando.
Levaduras osmófilas > 0,61
El contenido acuoso crítico es el porcentaje que tiene que tener el
alimento a partir del cual sería seguro de conservar sin que se produjesen alteraciones. Este porcentaje
puede variar según las características del alimento.
El contenido acuoso de un alimento se puede regular con humectantes.
Potencial Oxido – Reducción
Se define como la facilidad con la que un sustrato gana o pierde electrones. Se da un diferencial de
potencial. Si este diferencial es positivo se oxida la sustancia. Si es negativo se reduce. Se mide en Eh.
Atendiendo a este potencial distinguimos de más Eh. a menos los siguientes tipos de microorganismos:
aerobias, microaerófilos, aeróbicos facultativos, anaerobios estrictos. En base al alimento crecerán unos u
otros organismos, pero también es importante la presencia de oxígeno en la atmósfera y su capacidad de
penetración en ésta.
Puede darse una típica secuenciación, de manera que en el alimento crezcan en primer lugar alimentos
aerobios, pero a medida que se agote el oxígeno y los componentes del alimento aparecerán otros
organismos en un caso típico de sinergismo.
Contenido de nutrientes de alimentos
Los organismos ven el alimento como un sustrato para su crecimiento, pero para que el alimento pueda
sustentar el crecimiento microbiano, deberá tener una serie de nutrientes y componentes. Los propios
alimentos determinan los organismos que crecen sobre ellos.
Sobre alimentos ricos en carbohidratos pero pobres en nitrógeno sólo podrán crecer organismos que
puedan obtener el nitrógeno de otra manera. En los productos lácteos crecen preferentemente bacterias
lácticas. Los microorganismos pueden requerir vitaminas, como las del grupo B, la B12 concretamente,
que es muy escasa en los vegetales, de manera que en frutas y en verduras crecerán preferentemente
hongos. Sobre lípidos podrán crecer bacterias lipolíticas,...
61
Microbiología Industrial y Alimentaria
Temperatura
Siempre será un factor a tener en cuenta para la Organismos T. Mínima T. Óptima T. Máxima
conservación de los alimentos. El margen de
crecimiento de los microorganismos es muy Psicrófilos -15 10 – 15 18 – 20
amplio, va de –34 a 90º C. La tabla que se
presenta a la derecha indica las temperaturas de Psicrótrofos -5 20 – 30 35 – 40
cada organismo, en condiciones óptimas de los
demás factores. Mesófilos 5 – 10 30 – 37 45
Se ha de tener en cuenta que incluso en la nevera Termótrofos 15 42 – 46 50
podrían crecer los dos primeros tipos de
organismos. Normalmente se multiplican sólo los Termófilos 25 - 42 50 – 80 60 – 85
organismos alterantes, pero existen algunos
patógenos capaces de multiplicarse en frío, como serían Salmonella, Vibrio o Yersinia. De hecho existen
organismos capaces de crecer incluso en el congelador, como los psicrófilos. Los organismos dejan de
multiplicarse debido a su necesidad de agua, ya que en condiciones de frío el agua es menos
biodisponible, siendo su AW menor a 0,86.
Si congelamos los alimentos entre –18 y –20º C, estaremos seguros que no se produce crecimiento de los
organismos, pero se podrá producir actividad enzimática. Para estar seguros que no se produce ninguna
alteración, deberemos realizar ultracongelación, a menos de –40º C. Otro factor que se ha de tener en
cuenta son los termótrofos, en los alimentos que se venden calientes.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Humedad relativa
Es de sumo interés, ya que como ya hemos dicho, la actividad del agua es la base. La HR se equilibrará
con el agua del alimento, o como mínimo tiende a ello. Será útil entonces usar humidificadores o
desecadores para regular el contenido de agua de la atmósfera. Además para evitar que se equilibre, otra
opción es la de usar envoltorios alrededor del alimento, haciendo que éste tenga una atmósfera aislada.
Atmósfera
La atmósfera a la que se encuentra un organismo es básica para su conservación, sobre todo a nivel de la
presión parcial de oxígeno y su capacidad de difusión.
Se observó que había algunos gases que parecían tener funciones inhibidoras del crecimiento de las
bacterias. Puede ser de utilidad añadir hielo seco, dióxido de carbono sólido, para conservar los alimentos,
como las frutas. Una atmósfera rica en CO2 inhibirá el crecimiento de algunas bacterias, pero también
beneficiará el crecimiento de otras.
Controlando la atmósfera del alimento podemos alargar su vida útil, pero sin alterarlo. Además se ha de
tener en cuenta que un alimento fresco es siempre más caro que uno conservado. En el caso del pescado,
donde se producen puntas de producción, pero es uno de los alimentos que más se altera. En atmósferas
controladas, el pescado puede llegar a durar semanas, sin las atmósferas controladas no pasa de unos
pocos días. Se cambian los organismos que normalmente alterarían el pescado, como Pseudomonas o
Alteromonas, por otras bacterias, con tiempos de generación más largos, de tipo láctico.
En la industria de la fruta o de las flores es básico el controlar la atmósfera para obtener los beneficios
deseados. De hecho, actualmente se usan estos métodos en casi todos los alimentos.
Normalmente será la combinación de la regulación de la atmósfera con el control de la temperatura como
se alargará la vida útil de los alimentos
Procesos industriales
Los procesos industriales que se lleven a cabo pueden afectar a los organismos que crezcan en el
alimento, ya sean procesos de embotellado, calentamiento, ....
No entraremos en más detalle, ya que se verán en algunos ejemplo.
Relaciones entre microorganismos
Una relación que exista entre 2 organismos puede ser de dos tipos. Se puede dar antagonismo, en el que
un organismo actúe inhibiendo el crecimiento de otro o se puede dar sinergismo, si un organismo
favorece el crecimiento del otro. Esto nos va a interesar para evitar el crecimiento de organismos
alterantes o patógenos, ya que hay ciertos patógenos que pueden ser antagónicos del crecimiento de otros
organismos y viceversa. Puede existir una flora autóctona que impedirá el crecimiento de otros
organismos.
Se conoce como bacteriocina a aquellas sustancias producidas por microorganismos, generalmente
codificadas en plásmidos, que se secretan al exterior y tienen efectos antibióticos restringidos. Son
producidas por diferentes géneros y especies bacterianos, como E.coli, Bacillus, bacterias lácticas.... Es
casi un antibiótico. Se ha producido en toneladas, como en el caso de la nisina, para ser utilizado como
conservante. Se han añadido antibióticos y bacteriocinas como conservantes, pero no es lo óptimo.
Listeria
Listeria monocitogenes es una bacteria ubicua, que puede crecer en muchos lugares. Puede crecer en
piensos, leche, quesos,... No puede ser eliminada si llega al alimento, por lo que se tuvo que pensar
entonces qué hacer. Se llegó a la idea de que se podía insertar un plásmido que codificase una
bacteriocina en el interior de las bacterias características de ese alimento. De esta manera, se puede evitar
la contaminación por Listeria, pero sin añadir ningún aditivo, lo que le da valor añadido al producto.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Otros agentes con capacidad para afectar a estos alimentos son los hongos. Botrytis cinnerea
provoca la podredumbre gris en los vegetales. Tiene la capacidad de crecer sobre el fruto. Puede
alterar la fresa incluso aunque esté integra. Proliferará igualmente si las condiciones de
almacenamiento no son adecuadas.
El agente causal de la podredumbre ácida es Geotrichum candidum. En este caso es necesario
que intervenga algún vector, para que el organismo llegue al sustrato. Es necesario que
intervengan moscas u otros insectos.
Rhizopus stolonifera es el agente que provoca la podredumbre blanda de los vegetales. Es
necesario un vector o que el vegetal haya sufrido alguna herida o similar para que el organismo
penetre el tegumento.
2. Carnes
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Bacterias Los géneros con más probabilidades de alterar la carne son los que se
muestran en la tabla de la izquierda.
Pseudomonas El factor temperatura es el más importante para regular la velocidad y el tipo
de alteración de la carne. Con índices de 104 y 105 serán carnes no alteradas.
Acinetobacter Con 106 hay ligeros signos de alteración, de manera que entre 106 y 107 hay
grandes indicios, mientras que con 108 ya no es consumible la carne. Con 109
Moraxella hablaríamos ya de putrefacción.
Alcanigenes Podemos medir los índices de contaminación de la carne con mediciones
directas de los microorganismos, pero no es práctico, porque tardarían
Aeromonas demasiado, de manera que deberemos buscar un método que nos permita
hacer mediciones a tiempo real. Se puede medir la calidad de la carne de
Hongos muchas maneras:
• Mediante características físicas, como pueden ser
Cladosporium conductividad o pH.
Nitritos
La adición de nitritos, que tienen capacidades aditivas y conservantes, inhibirá el crecimiento de
un grupo de organismos, los Gram negativos. La carne sería degradada por otras bacterias, como
las Gram positivas, que tardarían más. Entre éstas podríamos encontrar las bacterias del ácido
láctico.
Si combinamos la adición de nitritos con una atmósfera rica en dióxido de carbono se potenciará
el efecto.
3. Pescados
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Shewanella En la tabla de la izquierda se pueden ver las bacterias más comúnmente detectadas
en pescados. Los dos primeros géneros acumulan cerca del 50% de los casos,
Pseudomonas mientras que Flavobacterium se da más raramente.
Se podrían hacer recuentos para medir la calidad del pescado, pero no tiene mucho
Alteromonas sentido, porque el pescado dura muy poco. Normalmente se buscan sustancias
producidas por bacterias, como pueden ser alcoholes,... Un ejemplo es la detección
Acinetobacter de TMA-O. La trimetilamina oxidada está presente en el pescado fresco, pero no
en el pescado alterado, ya que por acción bacteriana pasará a TMA, que se puede
Moraxella detectar fácilmente, ya que tiene un olor característico.
Flavobacterium En algunas especies se puede producir una acumulación de histamina.
Normalmente no hay problemas, pero por descarboxilación de la histidina se
puede pasar a histamina, debido a la acción de Morganella morganii o Hafnia. En estos casos se
puede llegar a 400 mg de histamina, sobre los 40 de ingesta máxima diaria. En estos casos se
suelen producir alergias y reacciones similares.
4. Crustáceos y mariscos
Tienen una composición similar a los pescados, pero con hidratos de carbono, de 0 a 1 % en
crustáceos y de 3 a 5 % en moluscos. Esto provocará una cierta facilidad para la alteración.
Además de las bacterias ya mencionadas, podrán aparecer otros géneros, como Protius o
Serratia.
La frescura del alimento dependerá del pH que tenga. De 6 a 5,9 será aceptable. Entre 5, 9 y 5,7
estará alterado. Si está por debajo de 5 estará claramente pasado.
Se ha de tener en cuenta que los organismos que contaminarán un alimento serán los que se
encuentren normalmente en el medio, de manera que será muy importante si el alimento es un
filtrador, porque en ese caso se convierte en un bioacumulador.
5. Huevos
El huevo es un alimento protegido intrínsecamente, debido a su cáscara. Pero además se ha de
añadir la presencia de lisozima, un pH elevado, de carácter alcalino. Debido a todos los
nutrientes que tiene en su interior, el huevo es un medio de crecimiento para los organismos
brutal.
En teoría, el interior del huevo es estéril. Pero parece ser que existe la posibilidad de que se
contamine el interior del huevo con Salmonella. Existen más de 1000 serotipos de Salmonella,
de algunos de los cuales el hombre es reservorio, mientras que otros viven en los animales o en
la naturaleza. El problema es que los huevos se contaminan desde el mismo momento de la
puesta con contaminantes fecales.
Por lo tanto, el huevo que se usa a nivel industrial es pasteurizado.
6. Leche
Pueden crecer muchos organismos en la leche. A priori debería ser estéril, si la vaca está sana.
Lo normal es que al principio tenga de 104 a 105 microorganismos. Podremos encontrar
microorganismos fecales debido a la proximidad, así como los organismos que crezcan en el
entorno en que vive la vaca.
Hemos de asegurarnos, pues, de que estos organismos no proliferen e incluso si podemos
eliminarlos de la leche.
7. Cereales y harinas
Tienen un alto contenido en carbohidratos y bajo en proteínas. Aparte de la poco agua que
tienen, lo que ya puede constituir una barrera, muy pocos organismos podrán degradarlos, tan
solo los que tengan amilasas, debido a la forma en que se encuentran los carbohidratos. Un
género de riesgo es Bacillus. El tratar las harinas, hidratándolas, aumentan los riesgos.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Análisis microbiológicos
Normalmente, en los laboratorios de análisis, aparte de los servicios de análisis que se ofrecen, se ofrece
también otra cosa. La CALIDAD. Esta calidad la determina la propia empresa, se decide la calidad que
se ofrece. La calidad será un valor fijo que se establece y que se afirma que cumple el producto o servicio.
Es necesario seguir unas pautas preestablecidas para poder garantizar una cierta calidad. En todos los
laboratorios se seguirán las Buenas Pautas de Laboratorio o Good Laboratory Practices. En la industria
se deberán seguir las Buenas Pautas de Fabricación, para garantizar la calidad del producto. Mediante el
cumplimiento de estas prácticas se garantiza que en el laboratorio se hacen las cosas como es debido, se
cumplen las normas, se alcanza un nivel de calidad.
Será importante que todos los laboratorios sigan unas normas estrictas. Se entiende como norma el hecho
de que todos los laboratorios actúan haciendo lo mismo, no por obligación, sino porque así se garantiza la
calidad. Actualmente, la norma a seguir por todos los laboratorios es la ISO 45001. No son más que
reglas que estas son las pautas que se deben seguir. Actualmente, debido a algunos problemas, que han
surgido en su aplicación, a finales del 2002 entrará en vigor la ISO 17025.
Se conoce como normalización al proceso por el que se llegan a establecer las normas a seguir. Para esto
es necesario que existan una serie de organizaciones que se encarguen de establecer esas normas.
Internacionalmente tenemos la International Standarization Organization. En Europa existe la CEN,
mientras que en España existe la Asociación Española de NORmalización. Estas organizaciones prueban,
aprueban y distribuyen las normas.
Hemos de distinguir entre lo que significa homologado y el concepto de acreditado, junto con el de
normalizado.
Normalizado: Es necesario trabajar bajo unas normas, para poder garantizar una calidad.
Homologado: Funcionamiento siguiendo unas normas. Para ser homologado se requiere ser reconocido
por un grupo de personas.
Acreditado: Reconocimiento por parte de algún tercero, mediante algún examen o similar, en algún
organismo acreditador.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Ha de estar presente y ser detectable en los alimentos que queramos valorar su calidad
La multiplicación del organismo y su número deben estar en relación negativa directa a la calidad del
alimento.
La detección y el recuento del organismo han de ser sencillos, y a ser posible que la flora acompañante no
interfiera en el proceso.
Si controlamos la presencia y el crecimiento de los organismos alargaremos la vida útil de los alimentos.
Los indicadores de inocuidad han de seguir una serie de criterios.
Los requerimientos nutricionales y la velocidad de crecimiento del indicador han de ser similares al
patógeno
La tasa de muerte del indicador y el patógeno ha de ser similar, aunque es recomendable que el indicador
persista más que el patógeno
Todos los alimentos exentos del patógeno han de estar exentos del indicador, o este ha de estar en un
número muy bajo.
Los primeros indicadores que se usaron fueron para las contaminaciones fecales, para evitar el cólera,
estos indicadores tenían una serie de criterios.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Coliformes
Citrobacter
Enterobacter
Klebsiella
Escherichia
Escherichia
Klebsiella
Citrobacter
Existen organismos exclusivamente intestinales, y otros con distribución mixta, como Enterobacter
aerogenes.
Pueden existir algunas E.coli patogénica, de diversos tipos:
- enterotoxigénicas
- enteroinvasivas
- enterohemorrágicas
- enteropatógenas facultativas
E.coli O157:H7 es una enterohemorrágica, ya que produce una toxina, la shiga toxina o
verocitotoxina. Aparecen en carnes poco cocinadas. Si llegase al riñón podría provocar un fallo renal.
Enterococos
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Bifidobacterium
Colifagos
Por seguridad, algunos alimentos deben pasar por algunos procesos antes de ser consumidos, como es el
caso de la leche, que se ha de pasteurizar. En aves se corren riesgos de Salmonella, de manera similar a
las carnes.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
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Microbiología Industrial y Alimentaria
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Microbiología Industrial y Alimentaria
d. Método del Número Más Probable (NMP). Se trata de un método estadístico para
averiguar el número de organismos. Se basa en la presunción de que
independientemente del número de organismos que haya en la muestra, pasado un
cierto tiempo, si están los organismos que creemos, la prueba deberá ser positiva. Las
tablas que se usan se elaboran mediante programas informáticos. De nuevo
encontramos el problema de la mano humana en este proceso, añadiéndole el hecho de
que pueden ser necesarias réplicas para ir sobre seguro, de manera que hará falta mucho
material. La técnica del NMP puede ser más precisa incluso que la de recuento de UFC.
Se ha de tener en cuenta siempre que todos los tubos del NMP no pueden ser positivos,
ya que en ese caso se debe volver a empezar, pero con una dilución mayor a la
empleada. Se han desarrollado blisters que permiten usar el NMP.
e. Fluorógenos y cromógenos. La cuestión es que observando los microorganismos se ha
observado que determinadas géneros, especies o cepas tienen actividades enzimáticas
características. Elaboraremos entonces sustratos fluorógenos o cromógenos, de manera
que la actividad del enzima sobre estos provoque el desprendimiento de esta sustancia,
de manera que dará color. Se usarán uno u otro tipo según gustos. Uno de los
fluorógenos más usados es el MUG, 4-metil-umbelifenil-β-D-glucurónido. Detecta la
actividad de la β-D-glucuronidasa. Casi todas las E.coli tienen esta actividad, y
prácticamente ninguna otra bacteria. Estas sustancias se añaden a los medios de
crecimiento de la bacteria a detectar.
2. Indirecta
Necesitas encontrar sustancias o actividades que estén relacionadas con la cantidad de
microorganismos. En la industria alimentaria uno de los métodos usados más frecuentemente es
el de la impedancia. Los métodos indirectos no tienen la misma precisión que los directos, pero
son más rápidos en muchos casos, y están más automatizados.
a. Impedancia. Se basa en tomar una medida eléctrica relacionada con la resistividad o la
conductividad del medio. Un medio estéril tendrá la misma impedancia en todo
momento, mientras se mantenga estéril. Pero con la presencia de microorganismos, se
gastarán nutrientes y se producirán metabolitos, con lo que se modificará la resistividad.
El parámetro de tiempo de detección de cambio de impedancia está relacionado con la
cantidad de microorganismos en el medio. Hemos de encontrar una relación entre UFC
e impedancia, para poder así calibrar el aparato que mide la impedancia. Para poder
hacer esto usaremos patrones conocidos.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Identificación de microorganismos
Consta de una serie de etapas.
- Preparación de la muestra
- Enriquecimiento de la muestra, en medio líquido
Se puede hacer por IMS, separación inmunomagnética, con Dynal, por ejemplo. Se trata
de bolas magnetizadas cubiertas por Ac. Las bolas capturarán los microorganismos para los
que estén diseñadas, de manera que con un imán podremos separar las bolas. Con un
preparado ácido se podrá separar los organismos de las bolas. En 30’ tenemos la muestra
lista para lo que haga falta. Se trata de un método muy específico, por lo que es muy caro.
Los protocolos que se usan están normalizados.
- Aislamiento en medio sólido
Existen muchos tipos de medios de cultivo.
- Purificación
- Identificación prescriptiva
Identificar consiste en asignar a un grupo desconocido un grupo taxonómico por similitud.
Debemos conocer una serie de características para poderlo identificar, a la vez que
necesitamos una clasificación preexistente donde estén todos los grupos taxonómicos.
Algunas características que se usan en la identificación son:
o Ácidos nucleicos. Es el carácter más de moda. Puedes secuenciar el genoma del
organismo.
o Enzimas y proteínas.
o Componentes celulares. Se conoce como quimiotaxonomía.
o Fenotipo. Dentro de este grupo se puede considerar movilidad, forma, pruebas
BQ...
En los laboratorios, para hacer las pruebas bioquímicas se usan tests miniaturizados, en lo
que se conoce como API. Son pequeñas celdillas que permiten realizar una serie de pruebas
bioquímicas sobre la muestra. Se trata de una marca comercial, que comercializa estos
pozos, en grupos de 20 a 50. Existen máquinas que permiten hacer API de manera
automatizada. Existen muchas marcas diferentes de galerías, los conjuntos de pozos,
miniaturizados en el mercado actualmente, aparte de API.
Estas pruebas no dan solo resultados de positivo o negativo, sino que a partir de éstas
podemos llegar a obtener más información, incluso de utilización de sustrato.
- Identificación definitiva
Se ha de tener en cuenta que no buscamos una identificación de la especie, sino que
queremos saber si la cepa que se ha localizado es la misma que se localizó en otro momento
en otro lugar y que ocasionó pérdidas. Queremos tipar las cepas.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
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Microbiología Industrial y Alimentaria
+ Energía - Energía
<λ >λ
Se trata de una esterilización fría. Su uso data de los años 20. se usan radiaciones ionizantes, de mucha
energía, de menos de 2000 Å de longitud de onda. Se pueden usar los UV, que son un potente germicida,
pero tienen como inconveniente su escasa capacidad de penetración, de manera que son ideales para
limpiar atmósferas y superficies.
Se pueden usar radiaciones β o electrónicas para esterilizar alimentos. Son haces de electrones. Se trata de
radiaciones que tienen una energía y capacidad de penetración. Son muy manejables, siendo muy precisos
en dirección e intensidad, pero son poco prácticos por su carácter de agentes mutagénicos.
Los más usados en la alimentación son los rayos γ. Se trata de partículas que salen de los núcleos de Co o
de Cs. Son sustancias peligrosas, pero de muy elevada energía. Son muy efectivos. Su uso requiere
instalaciones muy buenas. Normalmente destruir microorganismos es un proceso caro, pero en el caso del
Co o del Cs, que son basura nuclear, podría resultar económico.
Después de esterilizar el alimento se ha de garantizar que no se volverá a contaminar, mediante el uso de
las protecciones adecuadas.
El uso de radiaciones puede provocar la aparición de radicales libres, por radiolisis. Estos radicales libres
pueden ser peligrosos para el consumo. La aparición de los radicales libres disminuye si reducimos la
dosis o bien si eliminamos el agua o reducimos la cantidad de oxígeno. Otra opción considerada es la
adición de sustancias que neutralicen los radicales libres.
En España existe actualmente la autorización para irradiar patatas y cebollas. En USA, la FDA autorizó
su uso para la esterilización de hamburguesas, para evitar la aparición de brotes de E.coli O157. También
en muchos productos secos está autorizada. También la mayoría de los pollos que comemos estarían
contaminados por Salmo y Campilobacter, de no ser por la irradiación.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Una dosis de 103 RAD es suficiente para provocar la muerte. El uso de 104
RAD sobre los vegetales provocaría la detención de la germinación. Entre RAD = 100 Hz / g muestra
105 y 106 RAD son los tratamientos que se usan en los alimentos para
destruir las bacterias. Entre 107 y 108 RAD son los tratamientos que se usan Gy = Gray = 1J / kg
para destruir virus. Una dosis de 109 permitiría la inactivación de un enzima.
1 Gray = 100 RAD
Existen diferentes tratamientos específicos que se aplican en los alimentos
para inactivar o destruir los microorganismos:
1 KGy = 105 RAD
- Radapertización
Equivale a una esterilización comercial en frío.
La dosis empleada es de 30 – 40 KGy
- Radicidación
Equivale a una pasteurización, a la eliminación de patógenos.
La dosis empleada va de 2,5 a 10 KGy
- Radurización
También es equivalente a una pasteurización Alarga la vida del alimento por la reducción de
los microorganismos alterantes.
La dosis empleada es de 2,5 – 7,5 KGy
Microorganismos resistentes a la radiación
Existen algunos géneros de microorganismos resistentes a la radiación, como pueden ser Deimococcus,
Rubobacter, Acinetobacter,...
El hecho de que posean resistencia puede ser debido a:
- Pared específica: Principalmente compuesta por ácidos teicoicos, como los G+ y por AG,
normalmente más del 50% de palmitoleatos
- Sistemas de reparación de DNA. Pueden tener sistemas de reparación de DNA mucho más
eficaces que otras bacterias, de manera que son más resistentes.
Obviamente la combinación de ambos factores incrementará la resistencia a la radiación.
Calor
El calor como agente biocida va a desnaturalizar las proteínas y los enzimas. Valdrá cualquier
temperatura superior a la temperatura máxima de crecimiento. Distinguimos 3 rangos básicos de
temperatura: menor a 100º, pasteurización, superior a 100º, esterilización, y de aproximadamente 100º,
que es la que se da al freír, cocer los alimentos y en las conservas caseras.
Pasteurización y esterilización
La pasteurización destruirá a todos los patógenos o destruirá un elevado número de 63º C 30’
organismos alterantes. Se trata de combinar la temperatura y el tiempo, en los límites
mostrados en la tabla. En el caso de la pasteurización es necesario un tratamiento posterior 94º C 0’1’’
de algún tipo para conservar el alimento.
La esterilización destruirá supuestamente todos los organismos viables presentes en la muestra. Mediante
una esterilización comercial se destruirán casi todos los organismos viables de la muestra. El número que
quedará es tan bajo que no se podrá detectar en los cultivos normales o bien no será significativo. Se
deberán seguir las normas típicas de envasado y almacenado.
La técnica de la Ultra High Temperature, UHT, consiste en el uso de temperaturas estériles, superiores a
100º C, generalmente cercana a 140 – 150º C, pero durante tiempos cortos. La principal ventaja es que se
preservan mucho mejor las características organolépticas del alimento.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Termoduria
Se trata de la resistencia al calor. Normalmente las esporas son termodúricas. La termoduria depende del
tipo de organismo, así como del estado fisiológico de ésta, de manera que la resistencia será diferente en
la fase de crecimiento que en la fase estacionaria. También dependerá de las condiciones del medio. En
condiciones óptimas, la resistencia aumentará, mientras que en condiciones no óptimas, disminuirá.
También es muy importante la actividad de agua, de manera que a menor AW, mayor resistencia, y a
mayor AW, menor resistencia. Cualquier factor que afecte a la AW intervendrá en la resistencia al calor
de la bacteria, al menos de manera indirecta.
Se ha de tener en cuenta que se ha de conseguir la temperatura en todo el alimento, incluso en el centro.
Además, hemos de considerar dos opciones. Hemos de considerar si esterilizamos el alimento y el
envoltorio a la vez, o bien si los esterilizaremos por separado, para envasarlos después en asepsia.
Los organismos que más problemas ocasionarán serán los termodúricos y las esporas de algunos géneros,
como Clostridium o Bacillus.
La cinética de activación será una cinética normal de primer orden, como
la que se muestra en la gráfica de la derecha, cuya pendiente dependerá
del microorganismo, así como de las condiciones en que se encuentre,
por lo que normalmente será más útil usar condiciones desfavorables
para el organismo. Será mucho más útil que la actividad de agua sea lo
más elevada posible. Además, se ha de tener en cuenta que hay sales que
favorecen y otras que perjudican la termorresistencia.
Se conoce como tiempo de reducción decimal al tiempo necesario en
unas condiciones dadas, en que el número de organismos se reduzca un
logaritmo. De manera que “12D” sería el tiempo necesario para que se reduzca 12 logaritmos. Se conoce
como TDT, Thermal Death Time, al tiempo necesario para matar un
número determinado de organismos a una temperatura determinada.
Además, existen una serie de factores, medidos en Fahrenheit. F es
igual a D a 250º C. Z es la franja de temperatura necesaria para que la
cantidad de viables descienda un logaritmo.
Características de los organismos termófilos
La principal característica de los organismos termófilos es su
termorresistencia. Algunos de los que podemos encontrar son de los
géneros Bacillus o Clostridium, junto con arqueobacterias, pero estas últimas no se de mucho interés para
la industria alimentaria.
Dentro de los enzimas de los termofilos podemos distinguir 3 categorías:
- Termorresistentes de por sí, independientemente de la temperatura de crecimiento.
- Termorresistentes, si hay los nutrientes adecuados en el medio.
- Termorresistentes a la temperatura de crecimiento, pero no a T más altas.
Normalmente suelen ser más hidrofóbicas que otras proteínas. Los ribosomas de los termofilos parecen
más resistentes a los de los mesófilos, debido posiblemente a una mayor proporción de G y C. Es
importante, porque la temperatura máxima de crecimiento está relacionada con la temperatura de
inactivación de los ribosomas. Los lípidos de las membranas de los termófilos tienen un mayor porcentaje
de ácidos grasos insaturados.
Como contrapartida a su resistencia a la temperatura, las bacterias termófilas tienen requisitos de
nutrientes muy estrictos, de manera que si no se cumplen, el crecimiento se verá muy afectado.
Las cinéticas de primer orden se pueden explicar fácilmente, ya que debido a una mínima lesión en la
membrana, se podrá destruir la bacteria, mientras que las lesiones en otros orgánulos no explican esas
cinéticas.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Conservación de alimentos
Se emplean principalmente temperaturas bajas en la conservación de los alimentos. Los sistemas
biológicos tienen un coeficiente de temperatura de entre 1,5 y 2,5, lo que significa que en caso de que la
temperatura varíe 10º C, las reacciones variarán en ese factor.
Muchos organismos pueden continuar replicándose a bajas temperaturas. Vibrio sp puede replicarse
a –5º C, mientras que Yersinia enterocolitica puede hacerlo a –2º C. Su temperatura de crecimiento es
de 14º C. Muchas bacterias G- pueden replicarse a temperaturas de tan solo 5º C, de hecho muchas
bacterias lácticas pueden replicarse a esta temperatura.
En el proceso de almacenamiento de los alimentos encontramos una serie de temperaturas:
Va de 7 a 12º C. Se usa para alimentos frescos que queremos que nos duren. El organismo que podrá
crecer será psicrófilo. Se podrá controlar la atmósfera, la humedad relativa y, en determinados
alimentos, podremos considerar irradiación con UV para alargar la vida útil
Temperatura de nevera:
Temperatura de congelación:
Es importante la preparación previa del alimento, por lo que existirá un coste. Congelaremos solo
aquello que se va a consumir, solo lo necesario. Es importante en verduras el blanqueado o escaldado
para conseguir la fijación del color, así como la inactivación de los enzimas. Además, se producirá el
marchitado, con lo que disminuirá el volumen a almacenar. En estos casos siempre se produce una
reducción de la cantidad del organismo en 1 o 2 logaritmos.
Distinguimos 2 tipos de congelación:
- Congelación lenta: Se alcanza la temperatura de congelación en varias horas o días. Es la
congelación que se podría dar en un congelador doméstico.
- Congelación rápida: Es la congelación industrial. Se alcanza la temperatura de
congelación en menos de 30’. Las técnicas usadas para esto pueden ser la presencia de un
flujo de aire frío, por inmersión en líquido congelante o por contacto con superficies frías.
Se ha de recordar que siempre querremos evitar la purga o fuga de descongelación. Esto consiste en que
al congelar un alimento se formará hielo, que formará a su vez cristales. Estos cristales podrán provocar
la perdida de nutrientes, reduciendo el valor del alimento. Esto no se da en los casos en los que se aplica
la congelación rápida.
La quemadura del congelador es un proceso que se da en aves y en algunos otros alimentos. Es debido a
deficiencias en la envuelta. Se producen migraciones de agua, especialmente a nivel superficial, de
manera que se producen las alteraciones conocidas como quemadura del congelador.
Descongelado
Al descongelar quedarán muy pocos organismos viables, pues se destruirán en este proceso.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
AW 0 – 0,6
No hay ningún organismo que pueda crecer. Los más resistentes: Zygosaccaharomyces rousi necesita
0,62 y Aspergillus rousi necesita 0,64
AW 0,6 – 0,85
No resisten tanto como los anteriores, de manera que puede ser necesaria la adición de un antifúngico.
Tendrán humectantes para regular la AW. No podrá crecer ninguna bacteria, que requieren 0,9 ni
S.aureus, que requiere 0,86. Normalmente tendrán pH bajo.
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Los alimentos desecados son alimentos estables, están diseñados para durar. Pero podemos tener
problemas, ocasionados por la reactividad química del alimento.
- Oxidación de los lípidos. Enranciamiento
- Reacción de Maillard. Reacción entre los grupos carbonilo de los azúcares y los grupos
amino de las proteínas. Da un sabor amargo.
El primer problema se puede evitar asgurando bien el cierre del producto, o por la adición de
antioxidantes. El segundo problema es más complejo. Se puede reducir su incidencia reduciendo la
cantidad de azúcares, o bien reduciendo el contenido de agua. Al reducir el contenido de agua se reducirá
también el riesgo de enranciamiento.
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Aditivos alimentarios
Un aditivo es cualquier sustancia química añadida expresamente al alimento. Dentro de este definición
entran también los condimentos usados en la cocina. Dependiendo de las propiedades de los aditivos
distinguimos 31 categorías diferentes: edulcorantes, emulgentes, conservantes, colorantes,....
Nos centraremos en los conservantes, que son sustancias que se añaden para alargar el tiempo de vida útil
del alimento. Asumiendo una ingesta de 1000 Kg anuales, 36 Kg serían sal y azúcar, los conservantes
más antiguos que se conocen, mientras que 4 Kg serían el resto de aditivos.
Para poder utilizar un aditivo y añadirlo en un producto, debe estar autorizado su uso, porque podrían
tener efecto sobre la salud del consumidor. Los aditivos presentan una serie de ventajas e inconvenientes:
Ventajas
Desventajas
Seguridad
El uso de aditivos requiere una autorización previa. Para conseguir la autorización se han de llevar a cabo
3 tipos de estudios de toxicidad, generalmente en 2 modelos animales, usualmente perro y cobaya.
Normalmente se mirará la toxicidad tanto bioquímica como histopatlógica.
1. Intoxicación aguda. Miras la dosis letal 50, mediante el producto puro, y compruebas su
toxicidad. Si no hay problemas, se pasa a 2.
2. Intoxicación subcrónica. Se administra el producto durante 9 semanas a diferentes
concentraciones. Si no hay problemas, se pasa a 3.
3. Intoxicación crónica. Se administra el producto durante 2 años, a diferentes concentraciones.
Una vez realizadas las pruebas, se pasará a calcular la ingesta máxima teórica, que será autorizada en un
valor 100 veces menor.
Pese a todas estas precauciones, ciertos consumidores puede presentar ciertos problemas de toxicidad y
alergia a ciertos aditivos. Se han de mejorar los ensayos.
En cualquier caso, sería muy difícil, si no imposible, para la industria alimentaria funcionar sin aditivos.
Lo óptimo sería utilizarlos en la mínima cantidad posible, y solo cuando fuese necesario.
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Conservantes
Hay cientos de conservantes autorizados. Pueden actuar a diferentes niveles, como pueden ser ácidos
nucleicos, membranas,... Su uso puede ser en forma de líquido, de sólido,.... Los conservantes presentan
una serie de requisitos.
Sal y Azúcar
Son los conservantes que se usan en mayor cantidad. Ambos actúan por desecación osmótica. Al subir la
concentración de los solutos, se podrá provocar la plasmolisis de los organismos presentes. Para
conseguir el mismo efecto hará falta 6 veces más azúcar que sal.
Nitritos
Son usados con gran profusión, sobre todo en carnes y queso. Su aplicación tiene una serie de efectos
sobre el alimento.
Eliminación de microorganismos
En medio ácido, el nitrito pasará a óxido nitroso, que puede pasar a ácido nítrico. Este ácido interactuará
con la mioglobina, fijando el color. Además, puede interactuar con algunos enzimas y con porfirinas, de
manera que impedirá el crecimiento de los organismos aerobios.
Se observó que al combinar nitritos con el calor se formaba un inhibidor de Clostridium botulinum, que
inhibía su crecimiento. A esto se le conoce como efecto Perigó.
El problema que presentan los nitritos es que llegan al estómago en cantidades bajas, entre 10 y 30 ppm.
Allí se disociarán y se podrán unir a aminas, formando nitrosaminas, que son sustancias cancerígenas,
por lo que el uso de nitritos conlleva un riesgo. La solución ha sido añadir sal y provocar un descenso de
pH, de manera que con bajas concentraciones de nitritos se consigue el mismo efecto que antes con altas
concentraciones. El problema es que se pierde sabor.
Ácido benzoico
Se usan benzoatos o parabenos, los ésteres. Históricamente se ha usado mucho. Su actividad depende del
pH, de manera que a mayor acidez, mayor efecto. Su función es modificar el tránsito de la membrana. Se
usan como potentes antifúngicos, para evitar el crecimiento de hongos y mohos.
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Ácido sórbico
Se usan en forma de sorbatos. Se pueden usar en combinación con los nitritos. Tienen utilidad contra
géneros como Vibrio,... Impiden la germinación de esporas. Actúan a nivel de la membrana celular.
Existen muchos más conservantes, como pueden ser ácido láctico, acético, propiónico,... Se ha de tener en
cuenta que normalmente los aditivos se usan en cantidades pequeñas, de ppm.
Dióxido de azufre
Se usa en forma de gas, con efectos conservantes. Se han usado tambien sulfito (H2SO3),
bisulfito (HS2O3) y metabisulfito. El pH va ascendiendo, siendo más bajo con el dióxido de azufre y más
alto con el metabisulfito.
Actúan interfiriendo con los grupos tiol, actuando a nivel de los puentes bisulfuro, provocando cambios
en la molécula. A altas concentraciones, 20 ppm, tienen efecto antifúngico, mientras que a bajas
concentraciones, 1 – 2 ppm, su efecto es bactericida.
Óxido de etileno
Es un gas tóxico e inflamable. Produce vómitos, nauseas,... Se ha de ser precavido en su manipulación. Es
un potente agente alquilante, siendo también tóxico para los microorganismos. Puede usarse para llegar
donde no llegarían otros conservantes, como muchos gases. Se puede usar para en bajas concentraciones
para el tratamiento y conservación de cereales, ya que también matará insectos.
Si se usa a la vez que el dióxido de carbono, este gas lo inertizará. El óxido de propileno es similar.
Se puede usar en combinación con otros gases, como ozono, cloro,...
Antibióticos
Durante mucho tiempo se pensó en usar antibióticos como conservantes, pero actualmente es una idea en
desuso. Lo que más se ha usado es la nisina, que es una bacteriocina, sustancias actualmente de mayor
interés. En general están muy en desuso.
Los aditivos son sustancias difíciles de eliminar actualmente en la industria. Los consumidores quieren
cada vez menos conservantes y menos aditivos en general. Óptimamente hemos de buscar aditivos que
aparte de su posible función tengan otras funciones:
Antioxidantes: Algunos tiene poder conservante, como el ácido cítrico, derivados de fenoles,...
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Microbiología Industrial y Alimentaria
Riesgo: Probabilidad de que ocurra el peligro como resultado a una exposición dada.
Tasa de incidencia: Número de casos que ocurrirán ante la cantidad definida de peligro.
Normalmente las enfermedades que se van a transmitir en los alimentos afectarán al sistema digestivo,
siendo de tiempos de incubación cortos.
De la mayoría de las enfermedades se pueden establecer epidemiologías, pero las epidemiologías más
precisas serán aquellas de las enfermedades más agudas, como gastroenteritis, mientras que para las
enfermedades crónicas será más difícil establecer epidemiologías.
Existe una serie de enfermedades, unas 300, de tipo infeccioso, que es necesario declarar para las
encuestas epidemiológicas de la salud general de la población. Las gastroenteritis, así como otras
enfermedades, son autolimitantes, que empiezan y acaban rápidamente. Siempre se producirán más de las
declaradas. En el caso de un bebé, una gastroenteritis puede provocar la pérdida del 20% del peso.
Deben existir programas de vigilancia que permitan el estudio de los diferentes brotes, interesándonos por
diferentes enfermedades, pero yendo más allá, porque nosotros queremos saber de donde sale la
enfermedad. Existen una serie pasos que se deben realizar en estos casos.
Identificación del peligro. Se tiene que responder a todos los peligros, incluso a los inexistentes.
Valoración de riesgos.
¿Causante? Hemos de poder aislar el organismo causante tanto en el paciente como en el alimento
causante, garantizar que es el mismo organismo.
Se ha de tener en cuenta siempre también la dosis mínima infecciosa, el número de Shigella 102
organismos que he de ingerir para sufrir la infección.
A nivel de virus, protozoos u otros parásitos, el número mínimo teórico necesario Campylobacter 104
será 1, pero en realidad serán necesarios bastantes más. En el campo de las
bacterias, la DMI es la que se indica en la tabla de la izquierda. Salmonella 106
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Caso – control Consiste en establecer dos grupos de personas, uno donde se de la enfermedad y otro
donde no. Entonces se hacen las preguntas para tratar de establecer el origen de la
enfermedad.
Casos cohorte Se trata de hacer cohortes de afectados o no por diferentes incidencias, para tratar de
averiguar a qué se deben esas diferencias.
Casos controlados Se emplean voluntarios, a partir de los que se realizaran los estudios.
A partir de esto deberemos hacer una valoración del riesgo para ver si éste es aceptable o no. El riesgo
nunca podrá ser 0. El riesgo aceptable lo impone la sociedad.
Existe un organismo internacional que recoge toda la información acerca de los brotes vinculados a los
alimentos. Es lo que se conoce como códex alimentario. En él se establecen unas normas epidemiológicas
que se han de cumplir para que el riesgo sea aceptable.
En el códex estarán todas las enfermedades consideradas, pero faltan muchas otras no declaradas o de
baja incidencia.
Normas microbiológicas
Todo lo que estamos considerando debe estar dentro de las buenas pautas de fabricación. Se deben tener
en cuenta los resultados obtenidos de los estudios epidemiológicos. Se debe considerar en toda industria
alimentaria el Análisis de Riesgo de Puntos Críticos de Control (ARPCC). Todo se recoge en una
comisión internacional para la estandarización microbiológica de los alimentos, ICMSF, que es la que
elabora el códex alimentario, donde se recogen las normas microbiológicas adecuadas. Las normas son de
un alimento dado, puede haber variaciones entre ellos. La primera norma data de principios de siglo, de
las hamburguesas. Más adelante se regularon la leche y otros alimentos.
Una norma puede constar de criterios preceptivos o consultivos:
Consultivos: Los criterios son una especificación microbiológica del producto final destinado a
aumentar.
Métodos analíticos
Plan de muestreo
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Categoría 2: n, c, m
Categoría 3: n, c, m, M
Siempre existe la posibilidad de que escape algún patógeno a los estudios microbiológicos, o incluso
toxinas. Normalmente no deberá haber ninguna de ellas, por lo que deberemos reducir esta probabilidad
al mínimo.
Se ha de tener siempre presente que las marcas que se asocian a algún problema sanitario tienen graves
problemas y acaban desapareciendo. La idea hace años era asegurar que el producto es sano, realizando
estudios sobre estos productos. Hemos de tener siempre en mente las BPF. Si las materias primas no
tienen ningún patógeno y no se le añade en el proceso, el producto final tampoco tendrá ninguno. Hemos
de considerar todas las etapas hasta llegar al consumidor final.
En general descansará sobre 7 postulados:
Relacionar los riesgos o peligros relacionados con las etapas del proceso.
Determinar los puntos críticos de control necesarios para controlar los riesgos determinados.
Establecer las medidas correctivas a adoptar cuando exista algún error determinado.
Dependiendo del alimento y su consumidor final los riesgos pueden ser diferentes. Siempre hemos de
considerar un diagrama con las etapas del proceso, para determinar que el alimento es seguro.
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Es un punto del sistema en que la pérdida de control no entraña un riesgo inadmisible para la salud.
Es un punto donde se puede ejercer un control, de manera que el riesgo se reduzca al mínimo.
Límite crítico:
Tolerancias prescritas que se deben satisfacer para garantizar que un PCC realmente control un riesgo
microbiológico para la salud.
Control:
Verificación:
Se ha de tener siempre en cuenta que no existe ninguna actividad humana que no comporte ningún riesgo.
La cuantificación de riesgos puede ser debida a la demanda de la población. Al hacer la evaluación de
riesgos se deben considerar todas las posibilidades.
Si en nuestro análisis de riesgo se ve la evidencia de un peligro, se deben tomar todas las medidas para
minimizarlo. En ocasiones el análisis de riesgo puede dar lugar a situaciones perniciosas:
Los alimentos bajo ningún concepto pueden producir enfermedades. No se puede consentir que haya un
riesgo de que un alimento produzca una enfermedad.
Enfermedades alimentaria
Se conoce como enfermedad alimentaria cualquier enfermedad relacionada con la alimentación. Nos
centraremos en intoxicaciones e infecciones alimentarias. Puede haber enfermedades relacionadas con el
sistema inmunológico. Normalmente las enfermedades alimentarias suelen afectar al sistema digestivo,
pero también pueden afectar a otros sistemas. Los síntomas más comunes son:
- Dolor abdominal
En el abdomen hay pocas terminaciones nerviosas, por lo que el dolor será algo importante.
- Vómito
Acto reflejo, coordinado por el cerebro. Está conectado mediante el nervio vago al
estómago. Algunas toxinas pueden provocar la émesis, ya que actuarán sobre esas
terminaciones nerviosas.
- Diarrea
Pérdida de agua y electrolitos, que si no se compensa puede llegar a producir la muerte.
Puede ser a causa de toxinas o a causa de proliferaciones invasivas.
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Intoxicaciones alimentarias
Se deberá a la ingesta de algún producto tóxico o venenoso. En este caso no hay tiempo de incubación.
Existen de dos tipos:
Químicas
Están producidos por sustancias químicas que por error se incorporaron al alimento que pasará al consumidor.
Algunos ejemplos pueden ser las dioxinas, aceite de colza,...
Existen muchos productos que pueden actuar como tóxicos. Cuando la sustancia está incorporada ya, será
difícil de eliminar, por lo que se acabará destruyendo.
Biológicas
Algas
En España gran parte del agua viene de embalses. Se pueden dar blooms algales, como
pueden ser cianofíceas, algas azules, o dinoflagelados, mareas rojas, que podrán contener
algas toxigénicas.
Es muy importante la buena gestión de los embalses.
Hongos
Las micotoxinas son sustancias tóxicas de los hongos. Son metabolitos secundarios, que
son toxigénicos. Algunos hongos pueden producir sustancias toxigénicas o cancerígenas, y
tendrán efectos acumulativos.
En alimentos en mala conservación se puede dar la proliferación de hongos, que a su vez
producirán micotoxinas.
Con los productos fermentados puede haber también problemas. A nivel industrial no hay
riesgos, pero con los quesos o embutidos artesanales puede haber también problemas.
Bacterias
Son producidas por diferentes genes bacterianos. Pueden darse intoxicaciones por
diferentes géneros, en función de las condiciones:
- Por Clostridium, en condiciones de anaerobiosis.
- Estafilococcicas, S.aureus en alimentos preparados.
- Por Bacillus, requiere un ambiente rico en hidratos de carbono.
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Infecciones alimentarias
Se dará la infección y la proliferación de los patógenos. El alimento podrá ser tan solo un vector, donde
no será necesario que se replique el organismo, o bien podrá multiplicarse en el alimento. Hablaremos de
toxoinfecciones alimentarias cuando el organismo además libere una toxina en el alimento. Normalmente
las enfermedades alimentarias suelen afectar al sistema digestivo, pero también pueden afectar a otros
sistemas, como pueden ser el muscular, nervioso, linfático,...
Será necesario un tiempo de proliferación inicial. El agente causal puede ser muy variado.
Virus
Hay más de 150 virus entéricos diferentes que pueden usar los alimentos como vectores. Los más
comunes son:
- Hepatitis A, en proceso de exclusión.
- Rotavirus, provocan las diarreas infantiles.
- Calicivirus
Las gastroenteritis que provocan suelen ser autolimitantes. Además, se ha de tener en cuenta que existe
grupos de riesgo, como niños, ancianos,....
Bacterias
Salmonelosis y Shigelosis
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