CURSO DE FORMACIÓN

CONTINUADA A DISTANCIA

TALLER DEL LABORATORIO

CLÍNICO

ALERGENOS RECOMBINANTES

CURSO 2008 - 2009

Nº 5
I.S.S.N.- 1988-7469
Título: Taller del Laboratorio Clínico
Editor: Asociación Española de Biopatología Médica
Maquetación: AEBM
Fecha de Distribución: Marzo 2009
 Alergenos recombinantes.
Artaza Álvarez, Carlos*; Casas Losada, Mª Luisa**
MIR3*; Tutora de MIR HUFA**; Hospital Universitario Fundación Alcorcón

1.INTRODUCCION

1.1 Bases inmunológicas de las reacciones de hipersensibilidad

Las distintos procesos alérgicos se caracterizan por respuestas anormales frente a

diferentes sustancias desencadenantes a las que se denomina alergenos.

La respuesta alérgica se inicia y mantiene mediante una red de interacciones de

células inmunológicas e inflamatorias (Fig. 1), con la participación de linfoquinas, en

respuesta a la exposición a los alergenos. Cuando un alergeno se pone en contacto

con el organismo se produce una respuesta frente al mismo, que básicamente sigue

los mecanismos de cualquier respuesta inmune. En primer lugar hay un

reconocimiento del antígeno por el sistema inmune. Así, el alergeno es captado por

una célula presentadora de antígeno (APC), quien lo interioriza y procesa en

pequeños fragmentos peptídicos para a continuación presentarlo, unido a moléculas

de clase ll del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC), a los linfocitos T. El

reconocimiento de los antígenos por parte de las células T es altamente específico y

está mediado por el receptor del linfocito T (TCR). La interacción entre la célula

presentadora de antígeno (APC) y el linfocito T afín produce una activación parcial de

los linfocitos T que es completada con una segunda señal, aportada bien por

moléculas expresadas en las células presentadoras y células T o bien por factores de

220
crecimiento o por linfoquinas. La activación completa de la célula T conduce a la

producción de linfoquinas, a la proliferación de la propia célula T y a la activación y

proliferación de las células B, cuyo resultado final es la producción de anticuerpos

específicos del antígeno.

Figura 1: Esquema de la respuesta alérgica: interacciones de células inmunológicas e

inflamatorias (ver texto)

En el caso de las reacciones alérgicas, el subtipo de célula T que se activa tras

la interacción con el alergeno es el linfocito denominado Th2, que produce

preferentemente las interleuquinas IL-4,IL-5,IL-6, IL-10 e IL-13. La IL-4 induce, con

la colaboración de otras señales (moléculas CD40L expresadas en linfocitos Th2 y

CD40 en linfocitos B), el cambio de isotipo de la célula B hacia la síntesis de IgE, así

como una inhibición del subtipo Thl. Además, los linfocitos Th2, junto con IL-3 e IL-

221
10, estimulan a los mastocitos y basófilos; también estimulan a los macrófagos para

producir IL-I. La IL-5 es un potente factor quimiotáctico y de activación de los

eosinófilos. Los basófilos, mastocitos y eosinófilos, productores de IL-4 e IL-13 al

igual que los linfocitos Th2, activan a los linfocitos B, induciendo su diferenciación y

la producción de IgE. Los basófilos activados expresan también la molécula CD40L.

Por su parte, la IgE sintetizada se une a los receptores de alta afinidad presentes en

mastocítos y basófilos. Al contactar de nuevo el alergeno con el organismo, se

produce la unión de aquél con la IgE fijada a los mastocítos y basófilos, que da lugar

a la liberación por estas células de potentes mediadores preformados y a la síntesis

de novo de otros mediadores, cuyo resultado final son las manifestaciones clínicas

inmediatas, características de los procesos alérgicos. Estas sustancias producen

también el reclutamiento y la activación de diversas células inflamatorias, entre otras

los eosinófilos, en el foco de la inflamación alérgica, originando así la denominada

respuesta tardía (1). En definitiva, los mastocítos, basófilos y eosinófilos se

comportan de una parte como células efectoras, induciendo una respuesta

inflamatoria, y de otra como células inmunorreguladoras, activando a los linfocitos

Th2 y a los propios linfocitos B, induciendo la producción de IgE (2,3,4).

2. ALERGENOS

Se define a los alergenos como sustancias de naturaleza heterogénea, que

introducidas o en contacto con un organismo sensible producen la aparición de un

fenómeno alérgico, es decir la respuesta inmunitaria de éste, contra dicha sustancia

(5).

222
 Los alergenos se pueden clasificar en exógenos y endógenos. Los alergenos

exógenos pueden subdividirse a su vez, según la vía de penetración en el organismo,

en: alergenos introducidos a través del aparato digestivo (cereales, mariscos,

fármacos); alergenos absorbidos a través de las mucosas (aeroalergenos: polen,

polvos insecticidas o pelos de animales); alergenos activos por contacto (disolventes

industriales, colorantes o cosméticos), y alergenos introducidos directamente en la

circulación sanguínea (antibióticos inyectables, sueros o venenos). Los alergenos

endógenos se forman durante el metabolismo o como consecuencia de la

descomposición intraorgánica de distintos elementos .

La mayor parte de los alergenos son proteínas, glicoproteinas y polipéptidos.

Su peso molecular oscila entre 5 y 70 Kd, su estructura corresponde a una cadena

de aminoácidos con cadenas laterales que se pliegan presentando una conformación

espacial (estructura terciaria) que permite que ciertas partes de la proteína queden

expuestas para ser reconocidas como antígenos. Algunas características, como la

capacidad de acceder al sistema inmune, la concentración y lacomplejidad molecular,

la solubilidad y estabilidad de la molécula y las características bioquímicas de una

proteína, favorecen que esta llegue a ser un alergeno en un paciente susceptible

(5,6).

2.1 Obtención de alergenos

2.1.1 Fuente o materia prima alergénica:

Son los materiales originales a partir de los cuales obtenemos las sustancias

alergénicas. Las fuentes alergénicas pueden ser tan variadas como causas de alergia

223
existen, siendo las principales causas de alergia los ácaros, pólenes de plantas,

hongos, epitelios de animales y alimentos (7). Al ser por lo general materia viva, la

fuente puede tener variabilidad en su composición proteica tanto cuantitativa como

cualitativa, dependiendo de las condiciones de crecimiento de la misma en el caso

por ejemplo de ácaros, o de las condiciones climatológicas en el caso de pólenes.

2.1.2 Extracto alergénico:

Son preparados que derivan de la fuente o materia prima alergénica; son mezclas

complejas de biomoléculas, principalmente proteínas y glicoproteínas hidrosolubles,

así como carbohidratos, que constituyen todos los alergenos potenciales presentes

en la fuente, habiéndose retirado todo el material antigénicamente irrelevante. Es a

partir de este extracto que se obtienen los alergenos.

Obtención del extracto alergénico:

La elaboración de un extracto alergénico presenta una serie de procesos que

permiten garantizar que todas las proteínas alergénicas estén presentes en el

extracto final (Fig. 2). El proceso general de elaboración incluye la selección de la

materia prima, la extracción de proteinas hidrosolubles, la clarificación, la dialisis y la

esterilización. El número de alergenos presentes en un material biológico puede ser

grande pero no es ilimitado, y desde luego no todos tienen la misma relevancia en la

sintomatología clínica. En una fuente biológica dada podemos encontrar dos tipos de

alergenos:

224
• Alergenos principales o mayores; se denominan así a aquellos alergenos frente a

los cuales son sensibles (presentan IgE específica) un elevado porcentaje de

pacientes (más del 50% de alérgicos al extracto alergénico completo)

• Alergenos secundarios o menores; son aquéllos que son reconocidos por menos

del 50% de los pacientes alérgicos.

Figura 2: Fases para la obtención de extractos alergénicos

En la elaboración de extractos alergénicos es importante disponer de un

extracto de referencia con adecuada caracterización tanto de su composición como

de su actividad alergénica (7,8). La caracterización del extracto incluye el análisis de

su contenido en proteínas y carbohidratos, el análisis proteico mediante técnicas de

electroforesis, el contenido de alergenos mediante inmunodetección y la valoración

de su actividad biológica o potencia in vivo, probando el extracto en pacientes

225
alérgicos y calculando la cantidad de alergenos mayores en el extracto utilizando

anticuerpos monoclonales.

La valoración biológica de los extractos alergénicos presenta importantes ventajas

como:

1) Permite establecer la potencia del extracto en base al contenido de

alergenos o componentes activos.

2) Asegura la homogeneidad de los diferentes lotes de extracto mediante la

comparación con un extracto de referencia de actividad biológica conocida.

3) Asegura que extractos alergénicos procedentes de distintas materias primas

pero con igual actividad in vitro provoquen el mismo tipo de respuesta

cutánea en la población alérgica correspondiente.

La obtención de alergenos individualizados y la identificación de la naturaleza

de los mismos posibilita la realización de un mapa alergénico universal muy preciso,

así como un mapa epidemiológico de las enfermedades alérgicas en relación con los

agentes etiológicos reales (antígenos, epítopos) y no en base a las especies

animales, vegetales, fúngicas, protistas o mónera que los contienen (9, 10, 11).

3. BIOLOGIA MOLECULAR Y OBTENCIÓN DE ALERGENOS

La utilización de técnicas de biología molecular aplicadas a la obtención de

alergenos ha hecho posible disponer de grandes cantidades de material alergénico

estable y reproducible. El uso de la tecnología recombinante ha permitido la

226
obtención de material alergénico de alta pureza mejorando significativamente el

diagnostico y el tratamiento de los pacientes alérgicos (12).

3.1 Tecnología recombinante:

Se denomina así al conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un

organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. De esta

manera podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria, hongo) o un

virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña.

Estas técnicas se emplean normalmente para la producción de proteínas en gran

escala, ya que podemos hacer que una bacteria produzca una proteína humana y

lograr una superproducción, como en el caso de la insulina humana. Como las

bacterias se multiplican muy rápidamente y pueden expresar grandes cantidades de

proteínas, es posible lograr una sobreproducción de la proteína deseada. El

desarrollo de la tecnología del ADN recombinante fue posible gracias a varias líneas

de investigación:

1) El conocimiento de las enzimas de restricción,

2) La replicación y reparación del ADN,

3) La replicación de virus y plásmidos, y

4) La síntesis química de secuencias de nucleótidos.

El desarrollo de la tecnología recombinante se remonta a 1869, cuando Miescher

aisló por primera vez el ADN. En 1944 Avery demostró que el ADN y no la proteína

contenía la información genetica. Watson y Crick en 1953 propusieron el modelo de

la doble helice para la estructura del ADN. En 1957 Kornberg descubrió la DNA

polimerasa I, la enzima que ahora se utiliza para producir sondas de DNA marcadas.

227
En 1961 Marmur y Doty descubrieron la renaturalización del DNA, estableciendo la

especificidad y la posibilidad de las reacciones de hibridación de los acidos nucleicos.

En 1962 Alber proporcionó la primera evidencia de la existencia de las nucleasas de

restricción del DNA, lo que condujo a su posterior purificación y utilización en la

caracterización de las secuencias del DNA por parte de Nathans y H. Smith. En 1967

Geller descubrió la DNA ligasa, la enzima que permite unir fragmentos de DNA.

Entre 1972 y 1973 Boyer, Cohen, Berg y colaboradores desarrollaron las técnicas de

clonaje del DNA. Entre 1975 y 1977 Sanger, Barrell, Maxam y Gilbert desarrollaron

metodos rapidos de secuenciación del DNA. Por último, en 1985 Mullis y

colaboradores idearon y desarrollaron la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

para amplificación del DNA (12, 13).

La tecnología del DNA recombinante in vitro es un término general que

engloba todas aquellas técnicas que conducen a la transferencia de información

genética (DNA) desde un organismo a otro, que generalmente sigue las siguientes

etapas (Fig. 3):

• El DNA de un organismo “donador” se extrae, se rompe enzimáticamente y se

junta (liga, une) a otro DNA (vector de clonación) para formar una nueva molécula

de DNA recombinado: construcción del vector de clonación-DNA insertado.

• Esta construcción vector de clonación-DNA insertado se transfiere y mantiene

dentro de una célula hospedadora (huésped); La introducción del DNA en la célula

huésped se denomina transformación.

228
Figura 3: Etapas en la tecnología del DNA recombinante

229
• Las células transformadas se identifican y se seleccionan de aquéllas que no

contienen la construcción vector de clonación-DNA insertado.

• Si es necesario, la construcción de DNA puede manipularse para asegurarnos que

la proteína que es codificada por la secuencia del DNA clonado es producida por la

célula huésped (14).

3.1.1 Técnicas utilizadas para la tecnología del DNA recombinante.

1. Extracción y purificación del DNA

Para obtener el DNA libre de otros compuestos celulares se parte de una suspensión

celular, las células se lisan para liberar el DNA, se añade alcohol y el DNA precipita

en la interfase. Se retira el DNA y se transfiere a otro tubo, esta solución acuosa se

trata con RNAasas para eliminar el RNA y las proteínas se eliminan usando fenol (las

proteínas pasan a la fase orgánica y el DNA a la fase acuosa). Repitiendo estos

procedimientos varias veces puede conseguirse DNA puro. La solución de DNA así

obtenida nunca tiene la longitud de las moléculas nativas en la célula, ya que la

manipulación provoca roturas aleatorias del DNA. Si el DNA se ha manipulado con

cuidado, la longitud de los fragmentos será aproximadamente la centésima parte de

la longitud total del cromosoma.

2. Detección del DNA

El método más utilizado es la absorción de la radiación ultravioleta a una longitud de

onda de 260 nm. Esta absorción es debida a las bases púricas y pirimidínicas. El DNA

bicatenario absorbe menos que el monocatenario debido a que la interacción de las

230
bases complementarias en el DNA bicatenario reduce la absorbancia en el

ultravioleta.

3. Electroforesis en gel

La electroforesis en gel es el procedimiento por el cual moléculas cargadas migran en

un campo eléctrico. El grado de movilidad viene determinado por su tamaño y su

carga eléctrica. En la electroforesis en gel el ácido nucleico se incluye en el gel,

normalmente de agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleicos migran a través de

los poros del gel dependiendo de su tamaño y de su forma. Las moléculas pequeñas

y compactas migran más rapidamente que las grandes. Después de un tiempo

definido de migración (normalmente unas pocas horas), la ubicación de las moléculas

de DNA en el gel puede observarse por iluminación con luz ultravioleta (Bromuro de

etidio), por tinción con nitrato de plata (AgNO3), o por radioactividad.

Las moléculas grandes de DNA (mayores de 400 000 pares de bases) no se separan

unas de otras mediante esta técnica, por lo que es necesario el uso de otras técnicas

electroforéticas como la electroforesis en campo pulsante (PFGE, por Pulsed Field Gel

Electrophoresis) que consiste en cortos pulsos eléctricos a una serie de electrodos

que rodean el gel. El PFGE y las técnicas relacionadas son muy útiles para separar

fragmentos grandes de DNA, incluso cromosomas (15).

4. Marcaje de los ácidos nucleicos (DNA radioactivo)

La radioactividad se usa en la investigación de ácidos nucleicos porque puede ser

detectada en cantidades muy pequeñas. Los ácidos nucleicos radioactivos pueden

detectarse directamente en un contador de radioactividad o bien indirectamente

sobre una placa fotográfica (autorradiografía).

231
Un ácido nucleico puede hacerse radioactivo simplemente por la adición de fosfato

radioactivo (fósforo 32) durante su síntesis. Así, si se añade fosfato radioactivo al

medio de cultivo cuando está teniendo lugar la síntesis de DNA, el nuevo DNA será

radioactivo.

Alternativamente, se puede marcar radioactivamente el extremo 5' de una cadena de

DNA usando ATP radioactivo marcado en el tercer fosfato. La enzima polinucleótido

quinasa quita específicamente el tercer fosfato del ATP y lo une al grupo hidroxilo 5'

del DNA. Esta técnica es extremadamente útil y rápida, ya que permite el marcaje de

moléculas de DNA ya preformadas.

Se han desarrollado también métodos de marcaje de ácidos nucleicos que usan

compuestos no radioactivos que se incorporan al DNA y pueden detectarse o bien

porque dan un color determinado o incluso porque emiten luz (y por tanto pueden

detectarse por autorradiografía). Algunos de estos métodos casi igualan al

radioactivo en cuanto a sensibilidad teniendo la ventaja añadida de que no generan

desechos radioactivos.

5. Desnaturalización de los ácidos nucleicos

Las dos cadenas del DNA están unidas por puentes de hidrógeno (H2) que pueden

romperse por acción del calor sin afectar a los enlaces covalentes que unen a los

nucleótidos. Por lo tanto, las cadenas de un DNA bicatenario pueden separarse por

calentamiento, proceso conocido como fusión. Como ya se ha indicado, las moléculas

bicatenarias absorben menos que las monocatenarias en el ultravioleta. Por tanto, si

se va observando la absorción a medida que se calienta un DNA bicatenario, el

incremento en absorbancia cuando el DNA bicatenario se convierte en

232
monocatenario nos indicará la temperatura de fusión (Tm). El Tm está en función

del contenido en guanina-citosina (GC) del DNA en cuestión, ya que los pares de

bases GC se unen por 3 puentes de H2, mientras que los pares adenina-timina (AT)

sólo por dos. Cuanto mayor sea el contenido en GC mayor será la temperatura de

fusión. Si el DNA calentado se enfría lentamente, la doble cadena vuelve a formarse

(el DNA se renaturaliza). Esto permite realizar hibridaciones con cadenas de DNA

procedentes de fuentes distintas.

Las cadenas del DNA también pueden separarse a temperatura ambiente cambiando

las condiciones iónicas del medio. Al no estar implicada la temperatura, el proceso se

conoce como desnaturalización. Sin embargo, el resultado final es el mismo; si las

condiciones iónicas vuelven a lo normal se restablece de nuevo la doble hélice.

6. Hibridación de ácidos nucleicos

La hibridación es la construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios a partir de

dos monocatenarios y por complementariedad de bases. Cuando una solución de

DNA que ha sido calentada se enfría lentamente se produce la rehibridación dando

lugar a la estructura inicial. Tal reasociación ocurre sólo si las secuencias de bases

son complementarias. Por lo tanto, la hibridación permite la formación de complejos

bicatenarios no naturales de DNA:DNA y de DNA:RNA. Este es un método muy

versátil que permite estudiar el grado de relación genética entre dos ácidos

nucleicos. También permite la detección de fragmentos de DNA que son

complementarios de fragmentos monocatenarios de secuencia conocida (sondas).

La hibridación puede incluso realizarse después de la electroforesis. Las moléculas de

ácido nucleico se transfieren del gel a las membranas bien por capilaridad o bien

233
aplicando corriente eléctrica, y es entonces cuando se añade la sonda. La sonda, que

es radioactiva, se unirá al fragmento con el que tenga complementariedad y se

detectará por autorradiografía.

7. Secuenciación de DNA

Se puede determinar la secuencia de bases tanto en el DNA como en el RNA, aunque

es más fácil hacerlo en el primero. Actualmente existen máquinas automáticas para

hacerlo.

Para llevar a cabo la secuenciación lo primero que se hace es generar distintos

fragmentos de DNA que terminen en cada una de las cuatro bases y que queden

marcados radioactivamente. Los fragmentos se separan por electroforesis de modo

que las moléculas con diferencia de un nucleótido sean separables en el gel. Esta

electroforesis requiere por tanto cuatro carriles, uno para cada fragmento que

termina en cada una de las cuatro bases del DNA (adenina, guanina, citosina y

timina). La posición de los fragmentos se localiza por autorradiografía y, sabiendo

qué base representa a cada carril, es fácil leer la secuencia nucleotídica en un

fragmento de DNA.

8. Endonucleasas de restricción

El descubrimiento de las endonucleasas de restricción hizo posible trabajar en

clonación. Las endonucleasas de restricción son enzimas bacterianas que cortan

internamente las moléculas de DNA de una forma específica que viene determinada

por la secuencia de los pares de bases. Una de las primeras endonucleasas de

restricción que se caracterizó fue de la bacteria Escherichia coli y se designó EcoRI.

234
Estas enzimas se denominan con el nombre del género en letras mayúsculas seguido

de las dos primeras letras del nombre de la especie en minúscula, utilizándose

números romanos para designar el orden de caracterización de diferentes

endonucleasas de restricción del mismo organismo (HpaI, HpaII de Haemophilus

parainfluenzae).

La EcoRI se une a una región del DNA con una secuencia palindrómica específica (las

dos cadenas son idénticas cuando se leen en la misma polaridad, por ejemplo 5'--

>3'; un palíndromo es un conjunto de caracteres que se lee lo mismo de derecha a

izquierda que de izquierda a derecha) de seis pares de bases, y la corta entre los

residuos de guanina y de adenina de cada cadena cortando específicamente el

enlace internucleotídico entre el oxígeno del carbono 3' del azúcar de un nucleótido y

el grupo fosfato unido al carbono 5' del azúcar del nucleótido adyacente. Este corte

simétrico del DNA por EcoRI produce dos cadenas sencillas con los extremos

complementarios y cada una con una extensión de cuatro nucleótidos. En este caso,

cada extensión de la cadena sencilla finaliza en un grupo fosfato 5' mientras que el

grupo 3' hidroxilo está retirado. Las secuencias palindrómicas donde se unen y que

posteriormente cortan las endonucleasas de restricción se llaman secuencias de

reconocimiento.

Las enzimas de restricción solas no son suficientes en la clonación, ya que cuando se

alinean los extremos de las cadenas de DNA los puentes de H2 de las bases que se

aparean no son lo suficientemente fuertes como para mantener dos moléculas de

DNA unidas. Es necesaria la unión internucleotídica entre el grupo hidroxilo 3' y el

grupo fosfato 5' de los dos sitios de corte. Este problema puede resolverse usando la

235
enzima DNA ligasa, normalmente del bacteriófago T4. Esta enzima cataliza la

formación de enlaces fosfodiester entre los extremos de las cadenas de DNA que ya

están unidas por el apareamiento de bases de dos extensiones.

9. Vectores de clonación

Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN que tienen capacidad

para autorreplicarse dentro de las células huésped. Las características que requiere

un vector de clonación de alta calidad son:

I. Pequeño tamaño. Es necesario, ya que la eficiencia en la transferencia de DNA

exógeno decrece significativamente cuando se utilizan moléculas mayores de 15 Kb.

II. Un único sitio de reconocimiento para las endonucleasas de restricción dentro del

cual se pueda clonar el DNA insertado.

III. Uno o más marcadores genéticos fácilmente seleccionables que permitan

identificar las células huésped que contienen la construcción DNA insertado - Vector

de clonación.

Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus

(13,16).

A) Plásmidos.

Son moléculas de DNA circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se

replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen

de replicación. Virtualmente todos los géneros bacterianos tienen plásmidos. Algunos

plásmidos llevan información sobre su propia transferencia de una célula a otra

(plásmidos F), otros codifican resistencia a antibióticos (plásmidos R), otros llevan un

conjunto de genes específicos para la utilización de metabolitos inusuales (plásmidos

236
degradativos) y algunos contienen genes sin función conocida (plásmidos crípticos).

El tamaño de los plásmidos varía desde menos de 1 Kb a más de 500 Kb. Algunos

plásmidos están representados por 10 a 100 copias dentro de cada célula (plásmidos

de alto número de copias). Otros mantienen de 1 a 4 copias por célula (plásmidos de

bajo número de copias). Algunos plásmidos sólo pueden replicarse en determinadas

especies de células hospedadoras (plásmidos de rango estrecho). Otros pueden

replicarse en un gran número de especies bacterianas (plásmidos de amplio rango).

Uno de los plásmidos usados como vector de clonación y mejor estudiado y más a

menudo utilizado para "propósitos generales" es el pBR322. Estos vectores de

clonación, en general, se denominan con la letra minúscula p (de plásmido) y alguna

abreviatura que puede ser descriptiva o, en el caso del pBR322, anecdótica. La BR

son las iniciales de los investigadores que crearon el plásmido (F. Bolivar y R.

Rodríguez) y el 322 es una designación numérica que tiene relevancia para estos

investigadores.

El plásmido pBR322 tiene 4361 pb. Contiene dos genes de resistencia a antibióticos:

uno confiere resistencia a ampicilina (Ampr) y el otro a tetraciclina (Tetr).

B) Bacteriófagos.

Son elementos extra-cromosomales autónomos que pueden replicarse por si solos,

portan información genética y pueden conferirle a la bacteria nuevas propiedades.

Los fagos pueden clasificarse de acuerdo a su desarrollo en dos grupos: los fagos

virulentos y los fagos temperados. El desarrollo de los fagos virulentos se inicia

237
infectando a la bacteria, posteriormente sus genes son transcritos y traducidos para

producir sus propias proteínas, las cuales son necesarias para la replicación de su

genoma, para la formación de su cápside y tallo, para el empaquetamiento del nuevo

material genético sintetizado y para la lisis bacteriana, teniendo como objetivo final

la producción de las partículas o viriones maduros. Los fagos temperados pueden

seguir al igual que los fagos virulentos la vía lítica, pero a diferencia de éstos, pueden

convivir como profagos dentro de la bacteria. A la bacteria que posee un fago

integrado se le denomina bacteria lisógena, y al fago integrado se le denomina

profago. En la vía lisogénica, como en el caso del bacteriófago λ (lambda) que

infecta a su huésped Escherichia coli, su ADN inyectado en forma lineal es

primeramente circularizado para ser posteriormente integrado al cromosoma

bacteriano. El ADN de λ integrado estará formando parte del cromosoma bacteriano.

La replicación del ADN se lleva en forma pasiva, o sea que solo se replicará si se

replica el cromosoma del huésped. Las funciones necesarias para que se desarrolle la

vía lítica estarán reprimidas y por consiguiente permanecerá en un estado de

latencia. Este estado puede continuar a través de un número indefinido de

generaciones, hasta que algún disturbio ambiental induzca la señal para que el ADN

se escinda. Las funciones líticas se verán reactivadas y se producirán nuevos

viriones.

El bacteriófago λ se caracteriza por estar constituido por aproximadamente la mitad

de proteína y la otra mitad de ADN. Su cromosoma lo forma una molécula de ADN de

doble cadena y consta de 48,502 pb, conteniendo aproximadamente 50 genes, que

codifican para 5 proteínas relacionadas con la regulación, 7 con la recombinación, 21

con la morfogénesis de la cápside y tallo, 2 con la replicación y 2 con la lisis

238
bacteriana. La cápside tiene una estructura icosaédrica, con un diámetro aproximado

de 0.05 m, y unido a ésta, una proyección tubular de 0.15 m de longitud.

Los Bacteriófagos permiten clonar segmentos de DNA más largos (hasta 23000 pares

de bases). Alrededor de un tercio de su genoma no es esencial, por lo que se puede

reemplazar por DNA foráneo.

C) Cósmidos.

Representan plásmidos recombinantes que combinan caracteristicas útiles de los

plásmidos y del bacteriofago. Permiten la clonación de fragmentos largos de DNA

(hasta 45 000 pares de bases).

10. Transformación y selección

El DNA clonado debe ser introducido en la célula huésped. En bacterias, el proceso

de introducir DNA purificado dentro de una célula se llama transformación. Para

Escherichia coli, uno de los métodos de transformación requiere que las células sean

tratadas con CaCl2 en frío, seguido de una breve exposición a alta temperatura

(42°C).

Después de la transformación es necesario identificar y seleccionar, de la manera

más fácil posible, aquellas células que contienen la construcción plásmido-DNA

clonado.

11. Identificación del DNA clonado

Una vez que se ha creado un banco de genes es necesario identificar aquellos clones

que contengan la secuencia diana. Normalmente se utilizan tres métodos de

identificación:

239
• Hibridación del DNA con una sonda de DNA radioactivo: el DNA se

desnaturaliza y las cadenas sencillas se unen de manera irreversible a una

matriz (nitrocelulosa, nylon). Posteriormente se añade la sonda marcada

radioactivamente, y si esta sonda es complementaria de una secuencia de la

muestra se aparean las bases, ocurriendo la hibridación. Esta hibridación

puede detectarse por autorradiografía.

• Ensayo inmunológico: si no se dispone de sondas, se pueden utilizar

métodos alternativos de screening en un banco de genes. Por ejemplo, si la

secuencia de DNA clonado se transcribe y traduce, la presencia de la

proteína, o incluso parte de ella, puede determinarse por ensayos

inmunológicos.

• Ensayo de actividad : si el gen que se busca produce una enzima que

normalmente no es sintetizado por la célula huésped, se puede llevar a cabo

el screening al identificar los miembros de un banco de genes que llevan el

gen funcional que codifica para esa enzima. Por ejemplo, han sido aislados

los genes de α-amilasas, endoglucanasas y ß-glucosidasas de varios

organismos al utilizar un banco de genes de Escherichia coli (que no produce

esos enzimas), e incubar la bacteria en un medio suplementado con un

sustrato específico para posteriormente, utilizando un colorante selectivo,

identificar aquellas colonias que son capaces de utilizar el sustrato. Este

mismo principio se puede utilizar también en complementación de mutantes

auxotrofos, para producción de antibióticos, etc.

240
4. ALÉRGENOS RECOMBINANTES

La aplicación de las técnicas de ingeniería genética al campo de la

caracterización alergénica ha permitido la generación de alergenos recombinantes.

Un alergeno recombinante es una molécula alergénica producida mediante

biotecnología e identificada originalmente a partir de un extracto alergénico. Los

alérgenos más importantes de ácaros, pólenes, insectos y alimentos han sido

clonados, secuenciados y expresados. Se han desarrollado sistemas de expresión en

bacterias, levaduras o células de insectos para producir grandes cantidades de

alérgenos (Fig. 4) y se ha comprobado que estos muestran una fijación a Ig E

comparable con la del alergeno natural, así como excelentes resultados en los

análisis de reacción cutánea y análisis de diagnostico in vitro . En un principio fueron

utilizados con esta finalidad organismos procarióticos como la bacteria E. coli, pero

en los últimos años se ha extendido el uso de organismos eucarióticos, siendo la

levadura metilotrófica Pichia pastoris el más utilizado. Este organismo está

permitiendo la obtención de alergenos cuya producción en E. coli había sido

incorrecta o escasa. Una vez producida la proteína recombinante en la levadura, la

purificación suele comprender un menor número de etapas y menor dificultad

técnica. Ello se debe al hecho de que frecuentemente se puede introducir, junto con

el gen a expresar, un segmento nucleotídico que codifica un péptido en la región N-

terminal de la proteína recombinante que permite a la célula de Pichia la secreción

del producto expresado al medio extracelular (a veces este péptido de secreción está

ya codificado por el propio gen de la proteína a expresar). Este medio se encontrará

241
muy enriquecido en el alérgeno recombinante y su purificación se verá notablemente

simplificada (12, 16).

Figura 4: Etapas de la producción de alergenos recombinantes.

4.1 Ventajas de la producción de alérgenos recombinantes frente a la

alternativa natural.

• Están perfectamente caracterizados a nivel molecular e inmunoquímico,

permitiendo la disponibilidad de productos muy bien definidos, de estructura y

propiedades conocidas y fácilmente cuantificables

• Están altamente purificados y son fáciles de estandarizar

• Hace posible una producción ilimitada de la proteína, ya que disponiendo del

vector de expresión con el cDNA del alérgeno insertado se puede repetir el

242
 proceso tantas veces como sea necesario, utilizando además grandes volúmenes

de cultivo.

• La estabilidad del producto es superior a la de las preparaciones naturales, entre

otros motivos por la ausencia de proteasas, agentes oxidantes, otras proteínas

que interaccionen con el alérgeno, etc.

• Posibilita la expresión de alérgenos modificados, ya que por mutagénesis dirigida

se pueden introducir cambios en la estructura proteica para alterar alguna

propiedad del alérgeno como su estabilidad o su capacidad de unir anticuerpos

IgE o IgG, etc, de forma que posea sus propiedades alergénicas atenuadas o

suprimidas, o incluso una actividad antigénica superior a la del producto natural;

también pueden prepararse fragmentos del alérgeno que conserven alguna

propiedad (por ejemplo unión a IgG) y que carezcan de otras indeseables (como

unión a IgE).

Estas alternativas abren las puertas a la preparación de formas hipoalergénicas de

los alérgenos, para las que se augura un prometedor futuro.

4.2 Utilidad de los alergenos recombinantes

Los alérgenos recombinantes son instrumentos muy útiles para el estudio de los

extractos alergénicos y para el diagnóstico y el tratamiento de la enfermedad

alérgica, gracias a sus características, y en particular a su pureza (Fig. 5).

El uso de estos alérgenos permite comprender mejor la epidemiología de las

alergias; las pruebas in vitro con alérgenos recombinantes permiten estudiar

fenómenos complejos, como por ejemplo diferencias de reactividad clínica en

243
Figura 5: Alérgenos recombinantes e inmunoterapia de enfermedades alérgicas.

función de la ubicación geográfica, así como reacciones cruzadas entre fuentes de

alérgenos aparentemente alejadas. En concreto, la cuantificación de IgE específica

de alérgenos recombinantes ha permitido explicar por qué en el norte de Europa los

síntomas característicos de la alergia a la fruta y a la verdura suelen ser de tipo oral,

mientras que en el sur de Europa los pacientes suelen presentar síntomas sistémicos.

El estudio de estos perfiles muestra que en el norte de Europa domina la

sensibilización al Bet v 1 (alérgeno mayoritario del abedul), orientando las

sensibilizaciones hacia reacciones homólogas de esta proteína presente en otras

especies. Por el contrario, en la zona mediterránea domina la sensibilización a las

proteínas de transferencia de lípidos (LTP), lo que induce la predominancia

244
de una verdadera alergia alimentaria (17, 18, 19).

Tambien permiten determinar perfiles de reactividad y analizar las reacciones

cruzadas entre alérgenos, aportando información antes inaccesible. Por ejemplo, en

una fuente de alérgeno como el polen del abedul permiten precisar las moléculas

responsables de los síntomas.

Cuando las plantas son taxonómicamente próximas y polinizan durante el mismo

periodo, el uso de alérgenos recombinantes permite identificar qué fuente de

alergeno es realmente responsable de los síntomas (Fig. 6).

Utilizando un análisis con alérgenos recombinantes, también será posible comprender

qué proteínas pueden inducir la reacción clínica y cuáles provocar las reacciones

cruzadas, y así deducir los pasos a seguir para ofrecer el mejor tratamiento posible al

paciente.

Es posible obtener perfiles de reactividad con dosis de IgE específicas de alérgenos

recombinantes complementadas con dosis tradicionales, lo que permite comprender

el origen de las reacciones y analizar las interacciones potenciales heteroespecíficas.

Se puede determinar también un perfil de sensibilización antes de un tratamiento

con inmunoterapia específica para evaluar si las reacciones alérgicas del paciente

245
Figura 6: Antigenos recombinantes y diagnóstico con separación de componentes

están provocadas por la sensibilización al alérgeno mayoritario de una materia prima

alergénica (por ejemplo, el Bet v 1 en el polen de abedul). En este caso, el paciente

responderá probablemente mejor a la inmunoterapia porque los extractos contienen

cantidades elevadas y controladas del alérgeno mayoritario.

Actualmente, los alérgenos recombinantes también se utilizan para mejorar las

pruebas in vitro. En algunos casos, cuando la extracción no permite representar de

forma suficiente un compuesto alergénico específico, el hecho de añadir al extracto

esta proteína obtenida por ingeniería genética mejora la sensibilidad clínica. Dos

ejemplos concretos de ello son la mejora del látex mediante el alérgeno

246
recombinante rHev b 5 y, más recientemente, la mejora de la avellana enriquecida

con rCor a 1.

Por tanto, la producción de alérgenos mediante el uso de tecnología recombinante

abre las puertas al desarrollo de mejores pruebas diagnósticas y nuevos tratamientos

que marcarán un hito durante los próximos años en el manejo de las patologías

alérgicas.

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