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Paso 8 LABORATORIO DE VIROLOGÍA EN LA PRACTICA CLINICA PDF
Paso 8 LABORATORIO DE VIROLOGÍA EN LA PRACTICA CLINICA PDF
LABORATORIO DE VIROLOGÍA EN LA
PRÁCTICA CLÍNICA
VIROLOGY LABORATORY FOR CLINICAL PRACTICE
Email: ltapia@clc.cl
la población. El concepto de epidemiología molecular, en la viral, como para estimar en los casos en los que necesitemos
que se caracteriza molecularmente a los agentes que circulan evaluar la respuesta inmune del hospedero. Por otro lado, son
en determinados brotes epidémicos, epidemias o pandemias, determinantes la cantidad y calidad de la muestra, además
nos invita a vigilar constantemente a los agentes que afectan de las condiciones en la que es mantenida y el tiempo en la
a nuestra población. El laboratorio de virología juega entonces que es transportada al laboratorio (Tabla 1).
un rol fundamental en este desarrollo.
Técnicas diagnósticas:
Ante la necesidad de solicitar exámenes de diagnóstico
TOMA DE MUESTRA PARA EL DIAGNÓSTICO virológico debemos recordar que los virus son organiza-
VIROLÓGICO ciones macromoleculares que constan esencialmente de
La probabilidad de obtener un buen rendimiento diag- genoma (ácidos nucleicos de tipo ARN o ADN) y proteínas.
nóstico depende de la calidad de la muestra recibida en el Algunos de ellos presentarán además lípidos en su manto e
laboratorio. Para obtener muestras de alta calidad debemos hidratos de carbono unidos a las proteínas virales. Tal como
conocer, por ejemplo, el sitio o lesión donde se sospecha esté se muestra en la Figura 1, existen técnicas de laboratorio
el agente, de manera de pedir la secreción o el tejido donde específicas para la detección de la partícula viral completa,
el virus (o parte de éste) esté presente. Es importante también los antígenos virales (proteínas) y del genoma viral. Además,
estimar el período en que se encuentra la infección, tanto podemos detectar y caracterizar la respuesta inmune anti-
para solicitar la muestra en el momento de mayor replicación viral específica.
Hisopado o cepillado ¥ Trula o cepillo flexible Se recogen clulas epiteliales (piel o mucosas) donde est
(células epiteliales) ¥ Medio de transporte viral ocurriendo la replicacin activa del virus.
¥ Unidad refrigerante Trula o cepillo de preferencia de dacron o plstico.
En caso de necesitar aislamiento viral, la muestra debe enviarse
en medio de transporte viral.
Mientras se espera traslado a laboratorio conservar a 4¡C (no
congelar).
Sangre ¥ Tubo sin anticoagulante (tapa Los volmenes requeridos dependern de las tcnicas. Tcnicas
roja) para pruebas en SUERO. moleculares requieren menor volumen.
¥ Tubo con anticoagulante (tapa Se recomienda en general entre 5 y 10 ml en adultos.
lila) para pruebas en sangre Evitar hemlisis.
total, leucocitos o plasma. Mantener a 4¡ en caso de que el transporte al laboratorio tome
ms de un da (no congelar).
Fluidos o secreciones ¥ Trcar para puncin (LCR) En caso de muestras respiratorias, deben ser puestas en medio
o sonda fina (aspirado de transporte viral. LCR, orina o leche materna no necesitan
nasofarngeo o traqueal) medio de transporte.
¥ Medio de transporte viral Mientras se espera traslado a laboratorio conservar a 4¡C (no
¥ Unidad refrigerante congelar).
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[REV. MED. CLIN. CONDES - 2015; 26(6) 744-752]
Microscopa electrnica
Partcula viral Aislamiento viral
Inmunoanlisis:
Inmunofluorescencia
ELISA
Antgenos virales
Radioinmunoanlisis
Inmunoaglutinacin
Inmunocromatografa
ELISA
Respuesta inmune
Inmunofluorescencia
especfica antiviral
Western blot
En cuanto a la detección de la partícula viral completa, Para detectar antígenos virales disponemos de múltiples
las técnicas de aislamiento viral o microscopia electrónica técnicas de inmunoanálisis, las cuales se basan en la espe-
sólo están disponibles en laboratorios especializados en cificidad de la reacción antígeno-anticuerpo. En todas estas
virología y se encuentran generalmente reservadas para técnicas es necesario conocer el antígeno a detectar, de
fines de investigación. Estas técnicas clásicas han sido manera de definir el anticuerpo específico para dicho fin.
reemplazadas en la práctica clínica por técnicas molecu- La detección puede realizarse mediante métodos directos o
lares o inmunoensayos que requieren menor infraestructura indirectos. Como se muestra en la Figura 3, en el método
e implican un menor tiempo en la entrega de resultados. directo, el anticuerpo específico contra el antígeno a
d e te c tar e s tá ac o p l ad o a u n m arc ad o r. E n e l m é to d o
La característica de los virus de ser parásitos intracelulares indirecto, el anticuerpo anti-antígeno no posee marcador,
implica que para el aislamiento viral se deban utilizar líneas- y la formación del complejo antígeno-anticuerpo se
cultivos celulares, los cuales son “infectados” por el virus evidencia mediante un segundo anticuerpo marcado,
viable presente en la muestra y tras lo cual se observan los llamado anticuerpo secundario conjugado. De esta forma, la
cambios morfológicos de las células hospederas o efectos denominación de las técnicas de inmunoanálisis se basa en
citopáticos, como consecuencia de una replicación viral el tipo de marcador utilizado para evidenciar la unión del
efectiva (Figura 2). Todo aislamiento viral debe ser confir- anticuerpo con el antígeno:
mado mediante técnicas de inmunodiagnóstico (inmu-
nofluorescencia) o moleculares específicas, debido a que ¥ Inmunoflorescencia: el anticuerpo está unido a una
ningún efecto citopático es patognomónico de un virus molécula que emite fluorescencia (Figura 4).
en particular. Una de las mayores ventajas del aislamiento ¥ Radioinmunoanlisis: el marcador en este caso es un
viral es la posibilidad de obtener altas concentraciones de isótopo radioactivo.
virus completo, para posteriores estudios de caracteriza- ¥ ELISA (ensayo inmuno enzimtico): el anticuerpo está
ción genómica y antigénica, de sensibilidad antiviral y para acoplado a una enzima que al reaccionar con un sustrato
conservación en biorepositorios. produce un producto coloreado visible.
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[LABORATORIO DE VIROLOGÍA EN LA PRÁCTICA CLÍNICA - Dra. Lorena I. Tapia F. ]
A B
A. Células Hep-2 infectadas por virus respiratorio sincicial. Se observa formación de sincicios producto de la fusión de membranas secundaria a la
presencia de la proteína viral de fusión (F) tras la replicación viral efectiva. B. Células Vero infectadas por virus herpes simplex tipo 2. Se observa efecto
citopático característico, con focos de lisis celular y megacariocitos (células “abalonadas”). Gentileza de Dra. María José Martínez.
MTODO DIRECTO
Fluorforo: Inmunofluorescencia
Radioistopo: Radioinmunoanlisis
Enzima: ELISA
Anticuerpo anti-antgeno
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[REV. MED. CLIN. CONDES - 2015; 26(6) 744-752]
hace migrar por capilaridad sobre esta membrana, la que tiene Esta valiosa herramienta nos entrega información que
los anticuerpos antivirales específicos fijados y que eviden- permite clasificar a los virus (genotipificación), conocer su
ciarán la unión del antígeno mediante una banda de color distribución y transmisión en las poblaciones, y detectar
oscuro. Ambas pruebas requieren mínima infraestructura y mutaciones asociadas a resistencia a drogas antivirales o a
pueden estar disponibles en cualquier centro de salud. manifestaciones clínicas inusuales. Es uno de los pilares de
diagnóstico, estudio y caracterización viral durante brotes
La detección de genoma viral en la actualidad es la técnica epidémicos como los ocurridos con influenza pandémica el
de elección en la mayoría de las infecciones virales que 2009, MERS 2012 y ébola 2014. Las autoridades de salud
requieren de diagnóstico virológico certero y rápido. Se se basan en estas técnicas para rastrear virus emergentes.
basa en la identificación de secuencias específicas de ADN o Por otro lado, la caracterización genética nos acerca a los
ARN viral y puede ser virtualmente utilizada para cualquier cambios que pueden ocurrir en las proteínas virales que
virus. Más aún, la masificación y perfeccionamiento de estas influyen en la patogénesis y nos orienta hacia los meca-
técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (TAAN) nos ha nismos que tienen los virus para escapar de la respuesta
llevado al descubrimiento de nuevos virus desde la detec- inmune del hospedero (presión inmunológica), siendo
ción de su genoma. ampliamente utilizada en investigación. Las técnicas de
secuenciación han avanzado enormemente en los últimos
Los análisis pueden ser específicos para un virus o bien años, siendo la “secuenciación de nueva generación (NGS)”
para un grupo de ellos. Entre sus principales ventajas están una promesa para avanzar en el conocimiento de la pato-
el poder detectar virus que no pueden ser aislados en genia viral y para descubrir y rastrear nuevos o descono-
cultivos celulares, o en aquellas infecciones en las que la cidos virus.
carga antigénica es muy baja como para ser detectada por
inmunoanálisis. Además, debido a la estabilidad del ADN, Por último, a pesar que actualmente no representa uno de
la detección de virus con este tipo de genoma es posible los pilares del diagnóstico virológico, la detección y caracte-
a pesar de que las condiciones de la muestra no sean las rización de la respuesta inmune antiviral continúa siendo
óptimas. La desventaja principal es la posibilidad de conta- necesaria para determinar infección aguda en algunas
minación y falsos positivos. infecciones virales, para caracterizar la susceptibilidad de
los individuos a potenciales infecciones (pre-trasplante,
La técnica prototipo de las TAAN es la PCR, o reacción en pacientes oncológicos), en la vigilancia de la seroconver-
cadena de la polimerasa, en la que se amplifican segmentos sión en individuos vacunados y en población general y en
de ADN utilizando partidores específicos y una ADN polime- la caracterización de los perfiles de respuesta a infecciones
rasa termoestable (Taq polimerasa). Cabe mencionar que en crónicas como en la infección por virus hepatitis B. Las
los casos en que se deba detectar ARN viral, la amplificación técnicas de inmunoanálisis utilizadas en estos casos son de
debe estar precedida por un paso de transcripción reversa, tipo indirecto, dado que se marcará la unión antígeno-an-
donde el ARN es copiado a un “ADN copia (ADNc)”. Este ADNc ticuerpo específico (el que está presente o no en el suero
será el templado que se utilizará en el posterior proceso de del paciente) mediante la unión de un segundo anticuerpo
amplificación por la polimerasa. que evidenciará la formación del complejo. Los ensayos más
utilizados son inmunofluorescencia, ELISA y Western blot.
Los productos de amplificación podrán ser visualizados
mediante distintos métodos: electroforesis en el caso de
PCR convencional; mediante sondas fluorescentes que LABORATORIO VIROLÓGICO SEGÚN TIPOS DE
permiten la detección en la medida que ocurre la amplifi- INFECCIONES FRECUENTES EN LA PRÁCTICA CLÍNICA
cación (PCR en tiempo real), o mediante la hibridación en En la mayoría de los casos en los que se sospecha una infec-
plataformas que permiten la detección de múltiples virus a la ción viral, el diagnóstico etiológico se hará basándose en
vez (Ej: Pneumovir®, Filmarray ®). Para mayor detalle acerca una completa historia clínica y un detallado examen físico.
de estas técnicas de biología molecular referirse al artículo de Cuadros como el resfrío común, gripe, bronquiolitis, vari-
“Biología molecular aplicada al diagnóstico clínico”. cela, herpes zoster, diarrea viral entre otros, serán gene-
ralmente diagnosticados al reconocer los síntomas y signos
Además de su importante rol en el diagnóstico virológico, característicos. A continuación se entrega una tabla resumen
la amplificación del genoma viral ha permitido caracte- donde se detallan las técnicas de laboratorio, las muestras a
rizar las secuencias nucleotídicas de los agentes detec- solicitar y algunas características de los exámenes de diag-
tados mediante técnicas de secuenciación nucleotídica que nóstico viral sugeridos ante tipos de infecciones frecuentes
se han perfeccionado enormemente en el último tiempo. en la práctica clínica (Tabla 2).
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TABLA 2. RECOMENDACIONES DE MUESTRAS Y EXÁMENES A SOLICITAR SEGÚN CUADROS INFECCIOSOS
FRECUENTES EN LA PRÁCTICA CLÍNICA
Técnica (s)
Cuadro clnico Muestra Virus a estudiar Observaciones
sugerida (s)
Infeccin Aspirado, lavado Virus respiratorio ¥ Inmuno- ¥ Alta sensibilidad especialmente en poca de epidemia (VRS) y bajo costo.
respiratoria en o cepillado sincicial, rinovirus, fluorescencia ¥ Requiere microscopio de fluorescencia y personal entrenado.
niños nasofarngeo influenza,
parainfluenza,
Lavado bronquio- metapneumovirus, ¥ Test rpidos ¥ Tcnicas de fcil implementacin, bajo costo y sensibilidad alta en epidemia
alveolar adenovirus, de deteccin de
coronavirus, antgenos
bocavirus.
¥ Tcnicas de ¥ Alta sensibilidad, puede detectar genoma sin virus viable.
amplificacin de ¥ Recomendable en pacientes crticos e inmunosuprimidos
cidos nucleicos ¥ Requiere infraestructura y personal especializado
¥ Mayor costo
Infeccin Aspirado, lavado Virus respiratorio ¥ Tcnicas de ¥ Alta sensibilidad, lo que es deseable en estos pacientes que excretan menor
Infeccin Deposiciones Rotavirus, ¥ ELISA ¥ Alta sensibilidad en episodio agudo, debido a la alta excrecin viral (10 9 a 1010
gastrointestinal calicivirus, ¥ Test de partculas virales por gramo de deposicin)
adenovirus, aglutinacin ¥ Bajo costo
astrovirus. ¥ Fcil implementacin
Síndrome Sangre* Virus Epstein ¥ Deteccin de ¥ Deteccin de respuesta IgM en primo-infecciones o de IgG para determinar
mononucleósico Barr (VEB), anticuerpos seroconversin o susceptibilidad a infeccin
Citomegalovirus mediante ELISA ¥ Deteccin de anticuerpos anti VIH requiere de confirmacin diagnstica segn
(CMV), Virus de o IF normas del ISP
inmunodeficiencia
humana (VIH) ¥ Tcnicas de ¥ Alta sensibilidad y especificidad
amplificacin de ¥ Se recomiendan tcnicas cuantitativas para determinar carga viral
cidos nucleicos ¥ Requiere infraestructura y personal especializado
¥ Mayor costo
*Suero en
¥ Aislamiento ¥ De eleccin en sospecha de CMV en recin nacidos y eventualmente en nios y
determinación
viral, Shell vial adultos. Implica virus viable, replicando. Precauciones en manejo de la muestra para
de anticuerpos y
conservar viabilidad viral
sangre total en
TAAN
Hepatitis Sangre (suero) Virus hepatitis (VH) ¥ Deteccin de ¥ Deteccin de respuesta IgM en primo-infecciones o de IgG para determinar
A, B, C, D, E. anticuerpos seroconversin o susceptibilidad a infeccin
especficos ¥ En VHB se realiza seguimiento con antgeno de superficie (HBsAg), y anticuerpos
o antgenos especficos anti AgS (Ac anti-HBs) y anti core (Ac anti-HBc)
virales mediante
inmunoensayos
Agradecimientos.
Se agradece al Dr. Luis Fidel Avendaño y a la Dra. María José Martínez por permitir el uso de fotografías de su propiedad en esta publi-
cación.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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