DETERMINACIÓN DEL NITRÓGENO TOTAL

METODO MACRO – KJELDAHL

I. OBJETIVOS
 Determinar el porcentaje de nitrógeno en una muestra (especialmente de
alimentos), usando el método de Kjeldahl.
 Determinar el porcentaje de proteínas en un alimento determinado.

II. FUNDAMENTO TEORICO

Determinación del nitrógeno y proteína bruta
El nitrógeno se presenta en una gran variedad de sustancias orgánicas
importantes incluidas proteínas, péptidos, drogas sintéticas y fertilizantes.
El método de Kjeldahl se ha convertido en el método patrón para la
determinación de Nitrógeno proteico de cereales, carnes y otros materiales
biológicos.

En el trabajo de rutina se determina mucho más frecuentemente la proteína

total que la proteína o aminoácidos individuales. En general, el
procedimiento de referencia Kjeldahl consta de las siguientes etapas:
1) Digestión
2) Destilación
3) Valoración

En la digestión se usa Na2SO4 para aumentar el punto de ebullición y un

catalizador para acelerar la reacción, tal como CuSO4. Asimismo el NH3
liberado se atrapa en un ácido normalizado (H 2SO4) y se valora por
retroceso, o en todo caso usando ácido bórico que se valora directamente. 

Es importante dejar en claro que el método Kjeldahl no determina todas

las formas de nitrógeno a menos que se modifiquen adecuadamente los
reactivos; esto incluye nitratos y nitritos.

La mayoría de procedimientos para determinar Nitrógeno en alimentos

pertenecen a uno de las siguientes técnicas:
a) Destilación macro-Kjeldahl.
b) Destilación semi-micro Kjeldahl.
c) Técnica de micro-difusión de Conway.
d) Valoración al formol.
e) Métodos (colorimétricos) de teñido.

Los métodos de (d) y (e) se deben normalizar frente al método de

referencia Kjeldahl.

Para elegir el método adecuado para una muestra particular depende de

varios factores:
 Disponibilidad de equipo,
 Número de muestras examinadas regularmente,
 Urgencia en la obtención de resultados,
 Grado de precisión deseado y
 Homogeneidad de la muestra.

Factores utilizados en el método kjeldahl para la determinación de

proteína bruta.

En el caso del método Kjeldahl, este determina la proteína bruta o la

materia nitrogenada total, la misma que se calcula multiplicando el
nitrógeno total (N) por un factor empírico (f), y el resultado se expresa como
Proteína, es decir:
% P = %N * f
Estos factores se han calculado considerando los componentes básicos de
un gran número de muestras del mismo alimento. Para estos factores
consúltese anexo 01.
 ANEXO 01

FACTORES DE CONVERSION DE NITROGENO EN PROTEINAS

DE ALGUNOS ALIMENTOS

PRODUCTO FACTOR
Harina de trigo refinada y productos 5,70
Trigo completo  5,83
Centeno, cebada y avena 5,83
Arroz pilado 5,95
Almendras 5,18
Nueces de Brasil 5,46
Maní ( con y sin cáscara) 5,46
Frijol de soya y sus productos 5,71
Coco, castañas y otras oleaginosas 5,30
Leche y sus productos 6,38
Gelatina 5,55

NOTA:
F = factor de transformación de nitrógeno en proteína. Para el trigo y derivados
es de 5,7 y para los restantes cereales es de 6,25.

El porcentaje de proteína bruta sobre sustancia seca se determina teniendo en

cuenta el contenido en humedad.

III. MATERIALES Y REACTIVOS:

 Ácido Sulfúrico cc (P.A.)
 Solución de NaOH al 50 %
 Solución Estandarizada de HCl 0,1000 N
 Solución Estandarizada de NaOH 0,1000 N
 Mezcla Catalítica: Mezclan íntimamente 400 g de Na 2SO4, 16 g de
CuSO4.5H2O y 3 g de dióxido de selenio.
 Indicador mixto de Proteínas (Rojo Enmascarado): Disolver 0,016 g de rojo
de metilo y 0,083 g de verde de bromocresol en 100 mL de alcohol etílico
al 50 %.

IV. PROCEDIMIENTO:
1. Pesar una muestra entre 0,25 – 2,5 g (según la referencia o se presuma
el contenido de nitrógeno) y colocar en balón Kjeldahl de 500mL.
2. Añadir 8 g de mezcla catalítica y 25 mL de H2SO4 cc (libre de nitrógeno).
3. Mezclar por agitación.
4. Realizar la digestión en caliente dentro de campana para gases.
5. Calentar gradualmente hasta que el líquido hierva moderadamente,
asegurando la reacción total del material.
6. Una vez aclarado el líquido, se continúa calentando durante 1 hora. Dejar
enfriar a temperatura ambiente.
7. Diluir la mezcla con 200 mL de agua y trasvasar a un balón de destilación
de 1 L, con mucho cuidado.
8. Lavar el balón Kjeldahl con pequeños volúmenes de agua destilada hacia
el balón de destilación, completando un volumen de aproximadamente
400 mL. Adicionar trozos pequeños de perlas (cuentas) de vidrio.
9. Adicionar 5 gotas de indicador fenolftaleína, y conectar al refrigerante.
10. Depositar 50 mL de una solución estandarizada de HCl 0,1000 N y
agregarle 3 a 5 gotas del indicador mixto de proteínas en un frasco
lavador de gases, el cual esta conectado a la salida del condensador.
11. Agregar al balón de destilación, (dejando caer poco a poco por la trampa
con llave), aproximadamente 75 mL de NaOH al 50 %. Cerrar todo el
circuito, asegurándose que el medio sea básico (añadir 5 gotas de
fenolftaleína antes de cerrar).
12. Tratar de uniformizar con cuidado la mezcla dentro del balón.
13. Destilar hasta obtener un recuperado dentro del frasco lavador de gases
de aproximadamente 120 mL.
14. Abrir la llave de la trampa de entrada del NaOH, (es crucial en el éxito
realizar primero este paso). Ahora recién podemos retirar el sistema de
calefacción.
15. Lavar el interior del condensador con pequeños volúmenes de agua
destilada hacia el lavador de gases.
16. Trasvasar todo el contenido del frasco lavador a un matraz Erlenmeyer de
500 mL.
17. Adicionar 2 a 3 gotas más (ver paso 10) del indicador de proteínas y titular
con la solución estandarizada de NaOH 0,1000 N.
18. Anotar el gasto y realizar los cálculos para determinar el % Nitrógeno y
luego aplicar el factor adecuado para transformarlo en % Proteína.
NOTAS
 La muestra, a no ser de que el producto sea líquido, se pesa en un papel
de filtro colocado sobre un vidrio de reloj, se enrolla papel y contenido y
se deja caer directamente al fondo del matraz. Un papel de filtro similar
deberá emplearse para el blanco.
 En caso de que la muestra tenga exceso de grasa o aceite (interferente),
se deberá hacer una extracción del mismo para luego tomar la muestra
para la determinación de proteína.
 Evitar que el producto no se adhiera al cuello del matraz.
 Productos gruesos requieren más ácido, y en ese caso también se
utilizará más álcali para la destilación.
 Colocar el matraz de tal forma que se pueda agitar fácilmente.
 Es importante verificar el medio básico antes de realizar la destilación
(paso 11), lo que se comprueba cuando el líquido pasa de azul claro a
oscuro debido al efecto sobre el catalizador de cobre.
 Verificar la velocidad de flujo del agua en el refrigerante para mantener
una condensación adecuada.

V. REACCIONES
El método se basa en la oxidación en caliente de la muestra orgánica con
H2SO4 cc, para transformar el nitrógeno orgánico en sulfato de amonio, el
cual es descompuesto posteriormente con una base fuerte siendo entonces
liberado el NH3 a través de una destilación. El NH 3 ahora es capturado
haciéndolo reaccionar en una cantidad medida de ácido valorado, para
finalmente titular el remanente de este ácido que no fue consumido por el
NH3, lo cual se conoce como retro-titulación.

N + H2SO4 (NH4)2SO4………………….……………..DIGESTION

(NH4)2SO4 + 2 OH- 2 NH3 + 2 H2O + SO42-……..

DESTILACION
NH3 + HCl NH4Cl………………………………
 NaOH + HCl NaCl + H2O………………………..VALORACION

VI. CALCULOS:
Aplicar la relación:
% N = ( N1 * V1 - N2 * V2 ) * 0,014 * 100
Wm

Donde:
N1 = normalidad de la solución estándar de HCl 0,1000 N
N2 = normalidad de la solución estándar de NaOH 0,1000 N
V1 = mL utilizados de la solución estándar de HCl 0,1000 N
V2 = mL gastados de la solución estándar de NaOH 0,1000 N
Entonces:
% Proteínas = % N * 6,25

Nota: Cuando no se conoce el factor para un alimento se usa el factor universal

= 6,25
 PREPARACION Y VALORACION DE SOLUCIONES DE ACIDO
CLORHIDRICO 0,1000 N Y DE
HIDROXIDO DE SODIO 0,1000 N

I) OBJETIVO :
1.- Preparar soluciones aproximadamente 0,1 N de HCl y de NaOH (o
más diluidas o más concentradas por modificación apropiada de
los procedimientos).
2.- Determinar la relación de volúmenes de las soluciones de HCl y de
NaOH.
3.- Estandarizar soluciones de ácido HCl e NaOH usando estándares
primarios.

II) FUNDAMENTO TEORICO :

Para preparar soluciones de HCl 0,1 N se diluyen ácidos de mayor
concentración, según la ley de dilución. El HCl concentrado tiene 37%
de pureza en peso, s.p.= 1,19 y el peso molecular de HCl es 36,46;
según estos datos el HCl concentrado tiene una normalidad
aproximada de 12.
Para valorar una solución de HCl se usa como patrón primario el
Na2CO3 usando como indicador Anaranjado de metilo.
Para preparar soluciones de NaOH 0,1 N se usa soluciones de mayor
concentración o NaOH en pellets.
Para valorar soluciones de NaOH se usa como patrón primario a
biftalato de potasio (KHC8H4O4), y usando como indicador la
fenolftaleína. Es suficiente que una de las dos soluciones (HCl o
NaOH) se valore con su patrón primario respectivo para valorar la otra
usando el número de equivalentes de ambos.

III) REACTIVOS :
- HCl concentrado (37%) P.A.; Densidad 1,19 g / mL PM = 36,46
- NaOH en pellets P.A.
- NaOH 50% (100 g NaOH en pellets con 100 g agua destilada)
- Biftalato de Potasio P.A.
 - Na2CO3 P.A.
- Anaranjado de Metilo (1 g / L alcohol 50ª)
- Fenolftaleína (1 g/ L alcohol 50ª)

IV) PROCEDIMIENTO
PREPARACION DE HCl 0,1 N
Se calcula el volumen de HCl concentrado (12 N) necesario para la
preparación de un volumen determinado de una solución
aproximadamente 0,1 N y luego se lleva a enrase con agua destilada
del volumen determinado.
Ejemplo : Se desea preparar 1 000 mL HCl 0,1 N. ¿Cuántos mL de
HCl concentrado (12 N) se necesitará ?
N1 * V1 = N2 * V2
1 000 * 0,1 = 12 * V2
V2 = 8,3 mL
Por lo tanto para preparar 1000 mL HCl 0,1 N se toma 8,3 mL de HCl
conc., se lleva a una fiola de 1000 mL y se afora. Otro ejemplo: deseo
preparar 250 mL HCl 0,1 N. Cuantos mL de HCl conc. se necesita ?
250 * 0,1 = 12 V2
V2 = 2,1 mL

Entonces para preparar 250 mL HCl 0,1 N se toma 2,1 mL de HCl

conc., se lleva a una fiola de 250 mL y se afora con agua destilada.

VALORACION DE HCl 0,1000 N

Patrón primario: Na2CO3 peso equivalente = 53 g

53 g Na2CO3 ------ 1000 mL ----- 1,0000 N

5,3 g Na2CO3 ------ 1000 mL ----- 0,1000 N
0,0053 g Na2CO3 ------ 1 mL ----- 0,1000 N

En equivalentes:
1 mL HCl 0,1 N = 1 ml Na2CO3 0.1 N
1 mL HCl 0,1 N = 0,0053 g Na2CO3
 40 mL HCl 0,1 N = 0,2120 g Na2CO3
45 mL HCl 0,1 N = 0,2385 g Na2CO3

Para la valoración se sigue los siguientes pasos.

1) Pesar entre 0,21 y 0,23 g de Na2CO3 en balanza analítica.
2) Agregar 50 mL de agua destilada.
3) Agregar 3 gotas de indicador anaranjado de Metilo.
4) Titular con HCl hasta el cambio de color del amarillo canario hasta
amarillo- anaranjado (salmón).
5) Calcular la normalidad con 4 cifras decimales, según fórmula (1).

NOTA: Si se conociera la normalidad exacta de NaOH (Nb), entonces se

procederá así: se toma 25 mL de NaOH (Vb) y se pasa a un Erlermeyer, se
agrega 50 mL de agua destilada, se agrega 3 gotas de indicador
fenolftaleína mediante se pone color grosella por último se titula con HCl
hasta incoloro. Sea Va el número de mL de HCl gastado. Calcule la
normalidad de HCl (Na) usando la fórmula (2).

PREPARACION DE NaOH 0,1 N

El peso molecular del NaOH es 40 g, por lo que se tendría que pesar 4 g
(décima parte de su equivalente) para un litro de solución; pero debido a
que el NaOH es un reactivo higroscópico se toma 4,4 g.
La preparación ideal es tomar un volumen equivalente de NaOH al 50%
para evitar tomar Na2CO3 que se forma; para este caso se pesa 8,8 g de la
solución de NaOH al 50% para un litro de solución.

VALORACION DE NaOH 0,1 N

Patrón primario biftalato de potasio cuyo peso equivalente es de 204,23 g.

204,23 g KHC8H4O4 ----- 1000 mL ---- 1,0000 N

20,423 g KHC8H4O4 ----- 1000 mL ---- 0,1000 N
0,020423 g KHC8H4O4 ---- 1 mL ---- 0,1000 N
 1 mL NaOH 0,1 N = 1 mL KHC8H4O4 0,1 N
1 mL NaOH 0,1 N = 0,020423 g KHC8H4O4

40 mL NaOH 0,1 N = 0,8169 g

45 mL NaOH 0,1 N = 0,9190 g

Para la valoración se sigue los siguientes pasos:

1) Pesar entre 0,81 y 0,91 g de KHC8H4O4 en una balanza analítica.
2) Agregar 50 mL de agua destilada.
3) Agregar 3 gotas de fenolftaleína.
4) Titular de incoloro hasta levemente grosella.
5) Calcular la normalidad según fórmula (3)

NOTA: Si se conociese la normalidad exacta de HCl (N a) entonces se

procederá así: se toma 25 mL de HCl (Va) y se pasa a un Erlermeyer, se
agrega 50 mL de agua destilada, se agrega 3 gotas de fenolftaleína y se
titula hasta color levemente grosella. Sea Vb el número de mL de NaOH
gastado en titulación, calcular la normalidad de NaOH según fórmula F4.

V) REACCIONES

Na2CO3 + 2 HCl -------- 2 NaCl + CO2 + H2O

KHC8H4O4 + NaOH -------- KNaC8H4O4 + H2O

HCl + NaOH --------- NaCl + H2O

VI) CALCULOS
N = ___W___ …………………. (1)
(PE) V

Donde: W = g de Na2CO3 con sus cuatro cifras decimales;

PE = peso miliequivalente de Na2CO3 = 0,053;
V = mL de HCl gastado en la titulación para la valoración;
 N = normalidad de HCl.

Na = Nb (Vb/Va) …………………………….…. (2)

Nb = normalidad exacta de NaOH;

Vb = mL de NaOH tomado como alícuota = 25 mL;
Va = mL de HCl gastado en titulación;
Na = normalidad de HCl a calcularse.

Nb = __ A ___ …………………………….. (3)

B*C

A = g de KHC8H4O4 ;
B = mequiv. KHC8H4O4 que es igual a 0,20423
C = mL de NaOH gastados en titulación.

N b = Na ( Va/Vb ) ………………………………
(4)

Nb = normalidad de NaOH a calcularse;

Va = volumen de HCl tomado como alícuota = 25 mL;
Na = normalidad conocida de HCl;
Vb = mL de NaOH gastados en titulación.