MEDIOS DE CULTIVO

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo pueden clasificarse según diferentes criterios, pero los más importantes
son aquellos que se basan en:
a) Su consistencia.
b) Su utilización.
c) Su composición.
d) Su origen.
SEGÚN SU ESTADO FÍSICO (CONSISTENCIA):

1) Medios líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón
caldos. El medio líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente
de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la
obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración.
2) Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente
gelificante. Los más utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una proteína animal
obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y
además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (licúa a temperatura
ambiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que es la tempera óptima de
crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar: Es un polímero de azúcares obtenido de
algas marinas. Se trata de una molécula insoluble enagua pero soluble en agua caliente; una
solución al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39ºC y no se funde por debajo de 85ºC. Funde
a 90ºC y solidifica una vez fundido alrededor de los 45ºC. Tiene el inconveniente de que
introduce compuestos orgánicos indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades
nutritivas de un microorganismo. Aunque el agar es una mezcla de polisacáridos, Araki, en 1937,
los dividió en dos grupos:
- agarosa, con poco sulfato, libre de ácido pirúvico, y - agaropectina, con mucho sulfato y gran
cantidad de cenizas. La proporción de agarosa a agaropectina en el agar varía según el alga de
origen. El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los más importantes son: agar
comercial para la industria alimenticia, agar bacteriológico, agares purificados y agarosa,
utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se
utiliza en trabajo microbiológico, por lo que es importante la ausencia de metales tóxicos.
3) Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente
solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la
investigación de la movilidad de las bacterias
SEGÚN SU UTILIZACIÓN.

1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda
producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más
conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al
caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar tripticase de soja, el agar
Columbia, etc.
2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales,
incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos
exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos
(sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible
añadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej.
Polivitex, Isovitalex, etc ) El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cisteína para su
crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de
cultivo (agar chocolate).
3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias
contenidas en una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar
nutricionalmente el crecimiento de una población microbiana específica. Un ejemplo de medio
selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar
el del resto de enterobacterias.
4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo impiden totalmente
el crecimiento de una población microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores
podrían considerarse como una variante más restrictiva de los medios selectivos. Los medios
inhibidores se consiguen habitualmente por adición de sustancias antimicrobianas o de cualquier
otra que inhiba completamente el desarrollo de una población determinada. Un medio inhibidor
es el MacConkey que permite el crecimiento de los gérmenes Gram negativos e impide el
crecimiento de los Gram positivos.
5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que
ayuden a diferenciar géneros o especies. La adición de un azúcar fermentable o un sustrato
metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque
permite distinguir los gérmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. También
lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemólisis), el SS (que es
doblemente diferencial), etc.
6) Medios de identificación: Son los destinados a comprobar alguna cualidad específica que
puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer
los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato
específico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar
Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya añadido un
elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificación.
Actualmente están apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios específicos de
identificació n para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultáneamente abaratar
el costo y reducir el tiempo de identificación. Son ejemplos de esto últimos los medios CPS ID3
o Uriline ID (Biomerieux), utilizados para identificar los gérmenes urinarios más importantes a
partir de la placa de cultivo gracias a la utilización de sustratos cromogénicos específicos.
7) Medios de multiplicación: Sirven para obtener una gran cantidad de células a partir de un
microorganismo ya aislado. Se emplean en la obtención de vacunas, en la investigación y en la
industria. Los medios más adecuados para la multiplicación suelen ser líquidos. El caldo-infusión
cerebro-corazón (BHI), es un ejemplo típico de estos medios.
8) Medios de conservación: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos
interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y
reactivos utilizados en el Laboratorio de Microbiología. En el laboratorio se pueden conservar las
cepas de tres formas:
a) haciendo pases periódicos de placa a placa.
b) mediante liofilización de una suspensión bacteriana
c) congelando las cepas en leche descremada estéril al 0,1%.
9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clínicas que no pueden
sembrarse inmediatamente. Su utilización debe hacerse introduciendo la torunda con la que se
obtuvo la muestra en el interior del medio (generalmente en un tubo). Son ejemplos típicos de
este grupo los medios de Stuart -Amies, Cary-Blair, etc.
ATENDIENDO A SU COMPOSICIÓN.

Según las sustancias que entren a formar parte en su composición, los medios de cultivo pueden
ser clasificados en:
1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los más empleados se preparan a partir
de tejidos animales, y más raramente de vegetales. Su composición no es exactamente definida, y
por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en
condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podrá ser exacta. En la práctica
corriente estos medios dan excelentes resultados y son los más empleados.
2) Medios sintéticos: Son aquellos que contienen en su composición exclusivamente sustancias
químicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un
medio de composición perfectamente definida.
3) Medios semisintéticos: El gran número de factores de crecimiento exigidos para ciertos
gérmenes hace que la fabricación de un medio sintético para estos gérmenes sea imposible o
demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto
orgánico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos gérmenes no crecen en
ningún medio por muy enriquecido que esté éste, haciéndolo exclusivamente en células vivas
con unas características determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las
Chlamydias, Rickettsias, etc.

SEGÚN SU ORIGEN:

a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal
como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce
exactamente.
b) SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición química definida cualitativa y
cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.
c) SEMISINTÉTICOS son los sintéticos a los que se les añaden factore s de crecimiento bajo
una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.
AJUSTE DE PH DE UN MEDIO DE CULTIVO

El estudio del intervalo de tolerancia de pH se ha realizado modificando el pH del medio de

cultivo, en este caso TSB, en un rango de valores que ha oscilado entre 4 y 10. Para la
realización del ensayo se preparan soluciones de TSB cuyo pH se ajusta añadiendo HCl 1N para
la obtención de valores ácidos y NaOH 1N para los valores básicos. Estas soluciones se
esterilizan en autoclave en las condiciones habituales (121 ºC, 20 min) y posteriormente se
toman alícuotas de cada solución para volver a comprobar los valores de pH que se tomarán
como definitivos. Las distintas soluciones de TSB se reparten en placas de microtiter en
cantidades de 200µL por pocillo. Para la preparación de los inóculos de cada una de las cepas se
utilizan tubos de Ringer 1/4 con 2 mL de solución, de manera que se obtengan suspensiones de
una turbidez igual a 1 de la escala de McFarland. Para inocular los tubos de Ringer ¼ se utilizan
cultivos en TSA de 3 d a 15 ºC. Una vez preparadas las suspensiones bacterianas se inocula la
placa microtiter con 10µL de la suspensión bacteriana por pocillo. Los cultivos se incuban a 15
ºC durante 14 d revisando los resultados a partir del tercer día. Como control del medio se deja
un pocillo de cada valor de pH sin inocular. Para el control de la turbidez se inocula un pocillo de
Ringer ¼ para poder comparar si la turbidez es debida al inóculo o al desarrollo bacteriano.
Preparación de medios de cultivo Los medios de cultivo pueden adquirirse comercialmente listos
para su uso o se pueden preparar en el laboratorio a partir de material deshidratado (el cual
contiene los componentes necesarios para elaborar cada uno de los tipos de medios existentes).
Para su elaboración hay que seguir las instrucciones dadas por el fabricante, que se especifican
en el prospecto del envase. Normalmente consiste en disolver el medio deshidratado en agua
destilada, proceso que se conoce como reconstitución. La cantidad de agua será la que indica el
fabricante. En el caso de medios que contienen agar como agente gelificante, hay que disolver
agitando y calentando a la vez, debido a que el agar funde en torno a 100 ºC. Para ello se puede
utilizar un termoagitador magnético (que evita una ebullición prolongada). Una vez reconstituido
el medio de cultivo, hay que esterilizarlo para asegurarse de que no crecerá ningún
microorganismo contaminante, ya que el objetivo del cultivo es determinar el crecimiento de los
microorganismos presentes en muestras clínicas para su posterior identificación. La
esterilización se realiza en un autoclave a 121 ºC durante 15-20 min. Los medios de cultivo en
tubo se fraccionan antes de esterilizar y se introducen en el autoclave tapados con algodón graso
y papel de aluminio. Sin embargo, los medios sólidos en placa se suelen esterilizar en recipientes
grandes (botellas o matraces) con tapón de plástico o algodón graso. Posteriormente se
recomienda esperar a que la temperatura baje a unos 45-50 ºC para fraccionarlo en placas,
siempre cerca del mechero para evitar contaminación ambiental. El fraccionamiento consiste en
depositar una pequeña cantidad en la placa, hasta que alcance unos 4 mm de altura. Dejar enfriar
a temperatura ambiente hasta que solidifique por completo. Una vez sólido, se invierte (de tal
forma que la superficie de apoyo sea la tapa de la placa) y se almacena refrigerado a 4 ºC.
Los medios de cultivo que incluyen en su composición sustancias termolábiles, es decir, que se
alterarían tras someterse a un tratamiento con calor, necesitan un procedimiento alternativo para
su esterilización. Generalmente se realiza filtración con membranas de un diámetro de poro de
0,2 a 0,45 µm. Los virus no se eliminan, pero sí las bacterias y hongos que pudieran contaminar
el medio. Serían ejemplos de sustancias termolábiles el suero y determinados antibióticos.

PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO SOLIDO Y LIQUIDO.

En la naturaleza, la mayoría de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados

en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus
propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo
cultivos axénicos o puros. Un cultivo axénico o puro es aquel que contiene un sólo tipo de
microorganismo y que procede generalmente de una sola célula; el crecimiento de ésta origina,
en medio sólido, una masa de células fácilmente visible que recibe el nombre de colonia. Para
obtener cultivos puros a partir de una población microbiana mixta, se utilizan las denominadas
técnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister
utilizó diluciones seriadas en medio líquido con esta finalidad, pero la presencia de
contaminación, es decir, de microorganismos no deseados, dificultó el aislamiento. La escuela de
Robert Koch introdujo los medios sólidos, complementados con agar, y las placas de Petri en
Bacteriología, permitiendo así la separación física de las colonias sobre la superficie del medio
de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas
especies microbianas.
SIEMBRA Y FORMAS PARA REALIZAR LA TRANSFERENCIA

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio

adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Para sembrar en microbiología es
necesario mantener la habitación sin corrientes de aire y estar al lado de la llama de un mechero
(no más de 15 cm. de distancia). También se puede trabajar bajo campana, o en flujo laminar,
previa esterilización con luz UV.
La siembra puede realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando ansa, hilo, o bien
hisopo o pipeta estéril. Se debe esterilizar en la llama (hasta que todo el filamento se haya puesto
al rojo vivo) el ansa o el hilo y enfriar, antes y después de realizada la siembra. Para transferir los
microorganismos, se recomienda: a) Medio líquido a medio líquido: utilizar pipeta Pasteur o
graduada, ansa o hilo. b) Medio líquido a medio sólido: utilizar pipeta Pasteur o graduada, ansa o
hilo, e hisopo. El ansa se toma del mango como si fuera un lápiz 16 c) Medio sólido a medio
sólido: utilizar ansa o hilo. d) Medio sólido a medio líquido: ansa o hilo. Luego de sembrado, el
medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.

CULTIVO EN MEDIO SÓLIDO

Tubos con agar inclinado
Previo a la siembra y con posterioridad a ésta es importante pasar la boca del tubo (sin la tapa)
por la llama del mechero (flameado). Esta operación genera corrientes de convección que
previenen que los contaminantes del aire caigan dentro de los recipientes. El calentamiento
puede también matar los microorganismos que se encuentren en la boca de los recipientes. Para
realizar la siembra se puede utilizar el ansa, realizando un movimiento suave sobre la superficie
del agar en forma de zigzag, desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no dañar el agar.
También se puede utilizar el hilo. En este caso, se realiza la punción y luego se siembra en la
superficie de manera similar a lo descripto, pero extremando los cuidados para no romper la
superficie. Luego de la incubación, se observará el aspecto general del medio y la aparición de
crecimiento sobre su superficie. Este tipo de siembra permite el cultivo de microorganismos
aerobios o anaerobios facultativos y además se utiliza para almacenar cultivos durante cortos
períodos de tiempo a temperaturas de 4°C, o para la amplificación de un inóculo pequeño.

Siembra en placas
Puede ser en superficie (utilizando espátula de Drigalski, ansa o hisopo) o por mezcla (el inóculo
con el medio de cultivo agarizado aún fundido, a temperatura de unos 45°C, se mezclan y se
vierte en la placa de Petri, como se explica en detalle más adelante).
Las placas se incuban invertidas, ya que la alta concentración de agua en el medio puede
provocar condensación durante la incubación y si cae sobre la superficie del agar, se extiende
dando un crecimiento confluente. En medio sólido cada célula viable dará origen a una colonia y
por lo tanto la siembra en placas se puede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino
además para contar y aislar. En general cuando se quieren tener colonias aisladas a partir de un
material determinado, es necesario diluir la muestra en tubos con suero fisiológico estéril.

CULTIVO EN MEDIO SEMISÓLIDO

Se utilizan tubos sin inclinar. Se siembra por picadura o punción utilizando un hilo. Este tipo de
medio contiene una proporción menor de agar que los medios sólidos. El medio queda inoculado
al introducir el hilo en profundidad, pero sin tocar el fondo del tubo, retirándolo posteriormente
por la misma trayectoria utilizada al realizar la picadura. En medio semisólido se podrá
comprobar si el microorganismo es o no móvil, ya que en el primer caso se observará que el
crecimiento difunde alrededor de la zona donde se hizo la picadura, detectándose turbidez (ver
ejemplo tubo 1 de la figura). Los microorganismos inmóviles crecerán únicamente a lo largo de
la picadura.
Una siembra con ansa o con un cierto movimiento de vaivén podría originar un patrón de
crecimiento que se interpretaría erróneamente como movilidad bacteriana. Este tipo de siembra
en picadura sirve, también, como otro método de conservación de microorganismos anaerobios
facultativos.

CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO

Habitualmente se realiza en tubos, frascos o erlenmeyers. Antes y después de realizada la

siembra, se debe pasar la boca del recipiente (sin tapa) por la llama del mechero (flameado). En
los cultivos líquidos no tiene lugar la formación de colonias, por lo tanto, no sirven como técnica
de aislamiento. La utilización de medios de cultivo líquidos permite la obtención de una
población microbiana grande, con un elevado número de microorganismos, para ser utilizados
posteriormente. En estos cultivos se examinará la existencia de enturbiamiento más o menos
intenso, la formación de una película o velo sobre la superficie, la aparición de sedimento en el
fondo del tubo, etc.