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Guía de Estudio
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de manera que la probabilidad de que 2 partículas virales distintas penetren en la misma
célula sea insignificante. Después se plaquean las células sobre la caja de Petri.
8) ¿Qué se entiende por "sexo" en organismos procarióticos
R: A los bizarras formas de transferencia parcial de ADN entre bacterias de la misma o de
distinta especie: transformación, a través de bacterias muertas que actúan como
“machos” (donantes); transducción, a través de sus virus; conjugación, a través de
plásmidos y estructuras de secreción que conforman puentes celulares.
9) Describa brevemente el mecanismo de conjugación. ¿Siempre se observa
transferencia de información genética cromosómica?
R: Se produce entre una bacteria conteniendo un plásmido conjugativo (históricamente
denominado Factor F o episoma) llamada F+ y una que no lo contiene. La conjugación es
el mecanismo por el cual una bacteria transfiere a otra una hebra simple de ADN. El
mecanismo es similar al de replicación por círculo rodante (rolling circle). Primero se
genera un corte (nick) en una de las cadenas, más precisamente en la región conocida
como oriT, por origen de transferencia. En el sitio de corte, una helicasa comienza a
separar ambas cadenas, a partir de ese punto comienza la transferencia de una de ellas.
La transferencia termina cuando se transfiere la secuencia completa (plásmido, por
ejemplo) o cuando se interrumpe el contacto entre la bacteria aceptora y la dadora
(transferencia cromosómica). En el caso de los plásmidos, cuando finaliza la transferencia
se recircularizan utilizando el oriT y la cadena complementaria se sintetiza de novo tanto
en la bacteria dadora como en la aceptora. Además del oriT, los plásmidos transmisibles
contienen una serie de genes que son necesarios para la transferencia, los genes tra.
Estos genes codifican para el “pilus” que es una estructura que protruye de la bacteria
dadora y hace contacto con la bacteria receptora y facilita la formación de complejos de
secreción tipo III. Además del pilus, otros genes tra codifican para proteínas que no tienen
un rol estructural, como ser la endonucleasa que realiza el corte inicial y la helicasa .Otro
tipo de plásmidos que no son transmisibles, pero si son movilizables se encuentran en la
naturaleza. Dichos plásmidos no contienen el juego completo de genes tra, pero sí
contienen la región mob, que permite que los genes tra de un plásmido transmisible
puedan actuar en trans para transferir a los plásmidos movilizables. La región mob
contiene un origen de transferencia y algunas de las enzimas necesarias para la
transferencia, como ser la endonucleasa y la helicasa. En el caso más común, sólo se
transfiere una copia (en general completa) del plásmido (ej. factor F) por lo que la célula
receptor (F-) se convierte en F+. NO hay transferencia de genes cromosómicos ni, por lo
tanto, aparición de recombinantes para genes cromosomales; a menos que estos se
encuentren transpuestos en el Factor F (sexducción), lo que no es muy común. Esta
forma de “apareamiento” permite transferir horizontalmente (es decir, incluso entre
especies distintas como E. coli y Salmonella typhimurium) genes nuevos importantes
como pueden ser los genes de resistencia a antibióticos que pueden ubicarse en
plásmidos por la susodicha transposición. Se observa transferencia de ADN cromosómico
en donantes Hfr (factor F cointegrado al genoma cromosomal) o en sexducción (factor F
recombinado = F' conteniendo algún gen cromosomal).
10) ¿Cuál es la diferencia entre una cepa Hfr y una F+?
R: Hfr proviene de “High frequency recombination”. El plásmido F tiene aproximadamente
unas 100 kpb y codifica para los genes tra que lo hacen transmisible, manteniendo en
general una copia por célula. Las cepas F+, son las que contienen el plásmido F como
episoma. Como el plásmido F tiene algunas secuencias homólogas a secuencias
cromosómicas (transposones llamados elementos IS), en algunos casos ocurren eventos
de recombinación, donde el plásmido F se integra al cromosoma. En estos casos, el oriT y
los genes tra siguen siendo funcionales, y pro-mueven la transferencia del cromosoma,
que puede llegar incluso a ser completa. La transferencia cromosómica es la causa de la
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alta frecuencia de recombinación de estas cepas y de allí su nombre Hfr. La cointegración
del plásmido (la cual se produce, usualmente, por entrecruzamiento via recombinasa (rec
A combinada con recBCD) entre el cromosoma y el factor F en regiones con secuencias
homólogas, usualmente transposones duplicados en ambos ADNs o, más raramente,
como producto de una transposición sin resolución). Resolución quiere decir: separación
de los 2 círculos cointegrados después de que se produjo la copia o transferencia del
transposón entre el círculo de ADN dador al receptor).
11) ¿Qué es un F' y cómo se origina?
R: Un F' es un plásmido derivado del F que contiene fragmentos de ADN cromosómico.
Cuando un plásmido F se escinde de una cepa Hfr (resolución), en general ocurre por
recombinación entre los sitios IS flanqueantes (los mismos que permitieron la integración).
Hay casos en que los eventos de recombinación ocurren entre secuencias más lejanas
(otros elementos IS o secuencias homólogas) y el plásmido que se escinde es mayor que
el original y contiene el fragmento cromosómico que estaba contenido entre las
secuencias que recombinaron. Estos plásmidos F se denominan F’. También se pueden
generar plásmidos F’ por otros mecanismos como ser la transposición. Un F’ es una forma
“natural” (in vivo) de clonado molecular en un vector plasmídico, sin uso de enzimas de
restricción, muy usada por los genetistas bacterianos. Los genetistas bacterianos suelen
utilizar, para ello, un virus que es, al mismo tiempo, un transposón llamado fago μ.
12) ¿Cómo determinaría orden y distancia entre genes utilizando la técnica de
"apareamiento interrumpido"?
R: Cuando una cepa Hfr conjuga con una cepa F-, el ADN se transfiere desde el oriT.
Puede llevar más de una hora y media la transferencia completa, lo que generalmente no
ocurre. El ADN transferido puede recombinar con el cromosoma de la cepa aceptora.
Dado que en la suspensión, la interrupción de la conjugación ocurre durante todo el
proceso, la frecuencia de recombinantes cae exponencialmente con la distancia al oriT.
La frecuencia de recombinación para un marcador es entonces una medida de la
distancia al oriT. Para determinar el orden entre dos marcadores se analizan la cantidad
de recombinantes dobles. Cuanto mayor es la frecuencia de aparición de los dobles
recombinantes, menor es la distancia entre ellos (menor es la frecuencia de
recombinantes entre ellos). Por lo tanto, se hace cronometrando la aparición de
recombinantes en una conjugación entre una Hfr y una F-que se interrumpe artificialmente
con una licuadora a distintos intervalos y que implique la transferencia de alelos
diferenciables de los genes a estudiar.
13) Algunos bacteriófagos tienen la capacidad de llevar a cabo dos tipos de ciclos
dentro de su hospedador. Explíquelos y ejemplifique. ¿Qué es un profago o un
provirus?
R: Existen fagos en los cuales el proceso de infección puede tomar por dos vías
antagónicas, lisis o lisogenia. En el ciclo lítico, las funciones tempranas y tardías
codificadas por el fago son activadas en forma programada originando un gran número de
partículas virales y provocando finalmente la lisis. En el ciclo lisogénico, la mayor parte de
los genes virales son reprimidos, el ADN viral se cointegra al genoma bacteriano
formando un provirus (llamado pro-fago en bacterias) y se multiplica silenciosamente en la
bacteria. Hay procesos externos, como el daño al ADN que producen la activación del
ciclo lítico. Esta cointegración puede ser mediada por enzimas de recombinación
codificadas por los virus como es el caso de la integrasa del fago λ que, a diferencia de la
recombinasa del huésped, pro-duce recombinación específica de sitio (una secuencia de
ADN llamada attB, presente entre los operones gal y bio de E. coli. Como esto es muy
distinto a la recombinación homóloga tradicional, se lo denomina recombinación ilegítima.
El virus HIV (y otros retrovirus eucarióticos) también tienen una fase proviral. Si bien el
mecanismo es más complejo, los retrovirus son capaces de transducir genes
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cromosomales (por ejemplo se ha estudiado mucho la transducción de oncogenes entre
células eucarióticas, al igual que lo hacen los fagos en bacterias).
14) Compare transducción generalizada y especializada.
R: En la transducción, un bacteriófago (virus) transfiere DNA desde la bacteria en la cual
se reprodujo a la bacteria que infecta. El virus debe tener la característica de no producir
la lisis del hospedero al cual transfiere el material genético, es decir la partícula viral debe
ser defectiva. Existen diferentes tipos de transducción, ellas son: Los fagos que las
realizan tienen estrategias diferentes de encapsidación. Los fagos que permiten la
transducción generalizada (por ej. P1) no son capaces de reconocer específicamente el
ADN que encapsidan por lo que son capaces de transducir cualquier segmento de ADN
cromosómico, sin importar su secuencia. Es decir que, potencialmente, pueden transferir
cualquier segmento cromosómico del tamaño apropiado. Es decir, que es aquella en que
cualquier porción del genoma del hospedante del virus puede hacerse parte de la
partícula viral madura reemplazando al ADN viral.
Transducción Especializada o Restringida. Se define a ésta cuando el virus sólo puede
transferir determinados genes bacterianos cercanos a su sitio de integración genómica.
Los fagos que permiten t.e. son aquellos que pueden pasar por una fase lisogénica (por
ej. el fago λ) integrándose en un sitio preciso del genoma (entre los operones gal y bio en
el caso de λ) y tienen mecanismos de reconocimiento de ADN al encapsidar (tipo
secuencia cos del fago λ) por lo que sólo son capaces de transportar genes vecinos al
sitio de integración que accidentalmente permanecen unidos al genoma viral en el
entrecruzamiento que se produce al resolver el cointegrado (como primer paso hacia la
activación de la fase lítica). Además, en la t.g. el segmento de ADN donante se incorpora
por recombinación homóloga reemplazando al alelo nativo (la célula sigue siendo
monoploide). En la t.e. el ADN donante se integra como si fuera un profago y se produce
un diploide parcial. Nota: todo esto se puede resumir en un cuadro.
15) Cómo sería afectada en su capacidad de dar colonias transducidas una cepa
bacteriana rec-(deficiente en los sistemas de recombinación celulares) al infectarla
con un lisado transductor del bacteriófago λ? ¿y por el fago P1?
R: La inducción del fago λ requiere de la proteína RecA. RecA se activa por daño
cromosómico (por formación de ssDNA que es sustrato de RecA) y, a su vez, esta
interactúa con el represor del ciclo lítico. Esto produce la derre-presión de las funciones
líticas y el ciclo lítico comienza. El fago λ se integra como profago al genoma bacteriano
en sitios específicos, attB. Requiere además funciones celulares como IHF y la integrasa
que es una recombinasa específica de secuencia (la secuencia attB) de λ, pero NO
requiere RecA. Esto implica que no se vería afectada la capacidad de transducir si la cepa
aceptora es RecA-. En el caso del fago P1, la capacidad de transducción se vería
afectada, ya que el fago P1 transduce fragmentos de ADN cromosómico de la cepa
dadora que tienen que recombinar con las porciones homólogas de la cepa aceptora.
16) ¿Pueden recombinar los virus entre sí? ¿Qué mecanismos están involucrados?
R: Sí. En los casos de virus con genoma de ADN de doble cadena: recombinación
homóloga usando las enzimas de la célula huésped. En los virus a ADN de simple
cadena, la recombinación puede realizarse entre las formas replicativas (que son de doble
cadena). Hay mecanismos de (pseudo)recombinación en virus a ARN cuya explicación
excede lo que se pretende enseñar en la materia.
17) Describa algunas aplicaciones de la utilización de fagos para la ingeniería
genética.
R: El fago λ es un vector ampliamente utilizado en ingeniería genética en el que el ADN
conteniendo los genes codificantes para lisogenia fueron artificialmente reemplazados por
ADN (por ej. humano) que es “transducido” sin posterior lisogenización a bacterias (que
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no tienen otra opción que ser lisadas) para su clonado molecular, con-servación y
multiplicación.
18) ¿Qué es la transformación bacteriana? ¿Se logra únicamente en forma artificial
o también ocurre en poblaciones naturales?
R: La transformación bacteriana es un proceso por el cual las bacterias incorporan ADN
del medio. Se logra en condiciones de competencia, es decir, cuando las bacterias son
competentes para la transformación. La competencia puede ser natural, lo que se observa
en algunas especies o puede ser inducida en laboratorio. La transformación natural
implica, entre otras cosas, el ingreso de ADN de simple cadena en la célula receptora
después de un “reconocimiento” por receptores ubicados en la periferia celular, un
reemplazo alélico en las colonias recombinantes. En la transformación artificial (también
llamada transfección), las células son forzadas a permeabilizar el ingreso de ADN (que
suele ser de doble hebra como por ejemplo un plásmido) mediante mecanismos
artificiales. E. coli, por ejemplo, no es una bacteria que intercambia ADN por
transformación en la naturaleza y es la bacteria que más se transforma (= transfecta) en el
laboratorio.
19) ¿Se pueden mapear genes por transformación?
R: Sí; en forma similar a la transducción, la eficiencia de cotransformación es una medida
de la cercanía de dos loci determinados. Contrariamente a los mapeos utilizando cepas
Hfr, pero en forma similar a la transducción, la transformación es útil para los mapeos
finos. Al igual que en la transducción generalizada, el % de cotransformación de 2 genes
es inversamente proporcional a su distancia. Estos métodos de mapeo genético en
bacterias han sido totalmente reemplazados, en la actualidad, por métodos de mapeo
físico por lo que se les prestará menor importancia a la que se le da en los libros de texto.
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Guía de problemas
1) Los genes para la síntesis del aminoácido prolina en Yersinia pestis se encuentran organizados
en el genoma como se muestra en la siguiente figura.
A B C D E
Para determinar la organización transcripcional de este locus se dispone de mutantes por inserción
de un gen de resistencia a antibiótico que es “polar” sobre los genes río abajo, es decir que posee un
terminador de la transcripción en su extremo 3’. Sobre cada mutante se miden las actividades
enzimáticas de todos los genes del locus. Las actividades se expresan como porcentajes de la
actividad de la cepa parental o silvestre, los datos son:
a) Marque en la región genómica la posición de el/los promotor/es e indique que gen se encuentra
interrumpido en cada mutante.
Por otro lado se sabe que, debido a que es un operón anabólico, la síntesis del mismo se induce en
ausencia de prolina. Se posee una mutante en el gen regulatorio del operón y la misma es auxótrofa
para prolina. ¿Qué le indica este resultado?
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a) Uno de los genes está claramente alejado de los otros tres, los cuales parecen estar
estrechamente ligados. ¿Cuál es el gen distante?
b) ¿Cuál es el orden de los tres marcadores que están ligados?
a+ strpr
N° recomb.
b+ c+ d+
+
10 20 30 40 min.
Luego se tomaron 100 colonias d+, 100 b+ y 100 c+ de las placas de 30 minutos y se
ensayó su genotipo para los otros dos marcadores. Los resultados se resumen en la
tabla:
d+ b+ c+
d+ ----- 93 93
b+ 95 ----- 100
c+ 92 100 ----
5) Suponga que Ud. ha aislado independientemente, 2 cepas mutantes arg-, desde una cepa
parental de E. coli que ya era met- y strpr. Ud. aparea sus dos mutantes (1 y 2) con una Hfr
sensible a streptomicina y que no requiere de arginina ni de metionina para crecer.
Utilizando la técnica de apareamiento interrumpido Ud. obtiene las curvas de tiempo de
entrada que se muestran en la figura.
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arg+ + strpr
No
recomb.
met+ + strpr
10 20 30 40 min.
No met+ + strpr
recomb.
arg+ + strpr
10 20 30 40 min.
Dibuje un mapa genético que explique las diferencias observadas entre ambos
cruzamientos.
1- MM + thr
2- MM + leu (MM= medio mínimo)
3- MM
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7) El genoma de la bacteria Escherichia coli jejuni ha sido completamente secuenciado. A pesar de
que su genoma es casi idéntico al de E. coli, esta bacteria presenta un locus cromosómico
diferencial llamado Aep1, cuya organización genómica se detalla en la figura, y para el cual no se
tiene ninguna información (ni experimental ni por homología de secuencia) acerca de la función de
las proteínas que codifica:
P Q R S
Para comenzar a analizar el locus Aep1, se generaron mutantes polares por inserción de un cassette
de resistencia a kanamicina en los genes p, q y s, y en cada uno de estos mutantes se midió la
expresión de todos los genes del locus Aep1 por Western blot usando anticuerpos generados contra
las correspondientes proteínas recombinantes. Los resultados son:
Expresión
Inserción en p q r s
Gen p 0% 0% 0% 100%
Gen q 100% 0% 0% 100%
Gen r 100% 100% 0% 100%
Gen s 0% 0% 0% 0%
a) Indique una posible manera de generar uno de estos mutantes por inserción (detalle los pasos de
construcción, selección y evaluación del mutante), suponiendo que usted dispone de todas las
herramientas moleculares que necesite.
b) ¿Aconsejaría la utilización de trasposones para generar estas mutantes? Justifique.
c) ¿Cómo es la organización transcripcional del locus? ¿Donde están él o los promotores?
d) A partir de esta organización transcripcional, ¿puede decir algo de la funcionalidad de los genes
estudiados?
e) ¿Como sería el patrón de expresión de los genes en una mutante por inserción del mismo cassette
en el gen r?
Para realizar el estudio dispone de 2 cepas de bacterias: Hfr a+b+c+ StrS y otra F- a- b- c- StrR con las
cuales realizó un experimento de conjugación interrumpida obteniendo los siguientes resultados:
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a) ¿En qué medios se seleccionaron cada uno de los genotipos de bacterias del gráfico anterior?
b) ¿A qué distancia del origen de transferencia de la cepa Hfr utilizada mapean los genes a, b y c?
c) Grafique y explique los resultados que hubiera tenido en el experimento de conjugación interrumpida
si el genotipo de la cepa dadora hubiese sido:
i) Hfr a+b+c+ StrR
ii) Si el origen de transferencia de la cepa Hfr se encontrara entre el gen b y el c.
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