En t. J. Environ. Res. Salud pública 2015, 12, 1029-1043; doi: 10.

3390 / ijerph120101029
ACCESO ABIERTO

Revista Internacional de
Investigación ambiental y
Salud pública
ISSN 1660-4601
www.mdpi.com/journal/ijerph

Artículo

Producción de etanol y ácido acético a partir de monóxido de carbono en un

Clostridium Cepa en biorreactores continuos alimentados por gas

Haris Nalakath Abubackar, María C. Veiga y Christian Kennes *

Laboratorio de Ingeniería Química, Facultad de Ciencias, Universidad de La Coruña, Rúa da Fraga 10, 15008 La Coruña, España;

Correos electrónicos : harisnalakath@yahoo.com (HNA); veiga@udc.es (MCV)

* * Autor a quien debe dirigirse la correspondencia; Correo electrónico: Kennes@udc.es ; Tel .: +

34-981-167-000 (ext .: 2036); Fax: + 34-981-167-065.

Editor Académico: Satinder Kaur Brar

Recibido: 30 de octubre de 2014 / Aceptado: 9 de enero de 2015 / Publicado: 20 de enero de 2015

Resumen: El efecto de diferentes fuentes de nitrógeno, así como sus concentraciones, en la bioconversión de monóxido de

carbono en productos metabólicos como el ácido acético y el etanol por

Clostridium autoethanogenum fue estudiado. En un primer conjunto de ensayos, en condiciones de lote, NH 4 4 Cl, El caldo de soja

tripticasa o el extracto de levadura (YE) se utilizaron como fuentes de nitrógeno. El uso de YE se encontró estadísticamente

significativo ( p < 0,05) en el espectro del producto en tales ensayos por lotes. En otro conjunto de experimentos, se operaron tres

biorreactores con suministro continuo de CO, para estimar el efecto de las condiciones de funcionamiento en los productos y la

formación de biomasa. Los biorreactores fueron operados bajo diferentes condiciones, es decir, EXP1 (pH = 5,75, YE 1 g / L),

EXP2 (pH = 4,75, YE 1 g / L) y EXP3 (pH = 5,75, YE 0,2 g / L). En comparación con EXP2 y EXP3, se descubrió que EXP1

producía la acumulación máxima de biomasa (302.4 mg / L) y las concentraciones de productos, es decir, ácido acético (2147.1

mg / L) y etanol (352.6 mg / L). Esto puede atribuirse al hecho de que el mayor pH y la mayor concentración de YE utilizados en

EXP1 estimularon el crecimiento celular y, en consecuencia, también aumentaron la producción de metabolitos. Sin embargo,

cuando el etanol es el producto final deseado, como biocombustible, el pH más bajo utilizado en EXP2 fue más favorable para la

solventogénesis y produjo la relación más alta de etanol / ácido acético, alcanzando un valor de 0,54.
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Palabras claves: ácido acético; bioetanol; monóxido de carbono; Clostridium autoethanogenum;

syngas; gas residual

1. Introducción

El monóxido de carbono (CO) se emite en grandes cantidades en forma de gases residuales industriales generados durante la

combustión incompleta de materiales que contienen carbono. También es un componente principal del gas de síntesis [1]. Algunas bacterias

anaerobias tienen la capacidad de crecer en CO como su única fuente de carbono y metabolizarlo en una variedad de combustibles y

químicos [2,3]. Estos unicarbonotrofos fermentan CO en acetil-CoA, a través de la vía acetil-CoA o la vía Wood-Ljungdahl (WL), y luego en

metabolitos como el ácido acético, etanol, hidrógeno, norte- butanol o 2,3-butanodiol. En la ruta WL, el ATP neto obtenido por la fosforilación a

nivel de sustrato (SLP) es cero; por lo tanto, para hacer posible el crecimiento bacteriano en CO, la vía WL debe estar acoplada a la

conservación de energía [4,5]. Sin embargo, los mecanismos exactos involucrados en la conservación de la energía aún no están claros.

Muy recientemente, se han utilizado acetógenos diseñados metabólicamente para producir selectivamente metabolitos a partir de CO [6,7],

aunque también es posible producir metabolitos específicos de interés a partir de CO, en bacterias de tipo salvaje, mediante la manipulación

de la composición del medio y / o el funcionamiento condiciones en biorreactores [8,9]. Se sabe que varios acetógenos producen ácido

acético, como metabolito final principal, a partir del CO, incluidos Moorella thermoacetica, Acetobacterium woodii, Eubacterium limosum KIST

612, Peptostreptococcus productus U-1 y Clostridium aceticum [ 3]; mientras Clostridium ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum, Clostridium

ragsdalei y Alcalibaculum bacchi son acetógenos etanógenos, capaces de producir etanol además del ácido acético [2,3]. Recientemente Clostridium

ljungdahlii, Clostridium autoethanogenum y Clostridium ragsdalei se descubrió que producían 2,3-butanodiol y ácido láctico también [10].

En el presente trabajo, se estudió la conversión biológica de CO, utilizando C. autoethanogenum, para producir varios metabolitos. En la

mayoría de los estudios de bioconversión de CO a etanol, se observó la coproducción de grandes cantidades de ácido acético. Aunque el etanol es

un metabolito interesante como biocombustible, los productos como el ácido acético también tienen muchas aplicaciones industriales, como la

materia prima clave para la fabricación de monómero de acetato de vinilo, anhídrido acético y ésteres de acetato como el acetato de etilo, norte- acetato

de butilo y acetato de isopropilo [11]. Del mismo modo, el 2,3-butanodiol es otro posible subproducto, con aplicaciones potenciales en las industrias

manufactureras, como en la producción de alimentos, productos farmacéuticos, tintas de impresión, perfumes, fumigantes, cauchos sintéticos,

potenciadores de octano o plastificantes. Tres estereoisómeros de

Existe 2,3-butanodiol, que comprende el dextro- [ópticamente activo L - (+) -] y levo- [ RE-( -) -] formas y el ópticamente inactivo meso- formar.

Se ha informado que C. autoethanogenum puede producir 2,3-butanodiol en forma de

RE( -) - 2,3-butanodiol (96%) y meso- 2,3-butanodiol (4%) [10]. Esta ruta biológica anaeróbica de producción de productos químicos
como etanol, ácido acético y 2,3-butanodiol a partir de CO es una alternativa extremadamente atractiva en comparación con la ruta

química tradicional y otros procesos de biorefinería [3].

Los microorganismos requieren nitrógeno para su integridad estructural, así como para las proteínas, y la optimización de sus

concentraciones en los medios de cultivo podría mejorar la productividad del proceso y reducir el costo del medio. En algunos de nuestros

estudios de lotes anteriores, se descubrió que la naturaleza y la concentración de los metabolitos producidos a partir del CO dependen de la

composición del medio de cultivo, así como de otros

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condiciones experimentales como el pH y la presión, entre otros [12]. Guo et al. observó que un medio optimizado que contiene (g / L)

NaCl 1.0, KH 2 correos 4 4 0.1, CaCl 2 0.02, extracto de levadura 0.15, MgSO 4 4 0.116 y NH 4 4 Cl 1.694, a pH = 4.74 podría producir una

concentración de etanol de alrededor de 0.25 g / L usando

C. autoethanogenum en estudios de microcosmos [13]. Se realizó algún estudio previo para evaluar la sensibilidad del crecimiento y la

formación de productos a las fuentes de nitrógeno y su concentración en clostridios [14]. Sin embargo, la xilosa se usó como sustrato de

carbono en ese estudio en lugar de CO. Esto nos llevó a llevar a cabo los presentes estudios con CO, ya que la fermentación de xilosa por

acetógenos exhibe algunas diferencias y también implica la glucólisis y la oxidación del piruvato a acetilo. -CoA además de la ruta WL.

Además, los pocos estudios previos destinados a estimar el efecto de la composición del medio sobre el crecimiento bacteriano y la

producción de metabolitos en clostridios se realizaron generalmente en ensayos por lotes, en botellas, sin regulación del pH. En la presente

investigación, se utilizaron biorreactores operados a pH constante, con suministro continuo de CO. Este es un aspecto relevante ya que tanto

el pH como la composición del medio afectan el metabolismo y el patrón de crecimiento. Cuando se permite que ambos parámetros varíen,

se hace difícil determinar cuál está realmente afectando más.

El propósito de este trabajo fue investigar el efecto de varias fuentes de nitrógeno en la bioconversión de CO a varios metabolitos, por C.

autoethanogenum, tanto en botellas como en biorreactores continuos alimentados con gas. En el presente estudio, primero, la influencia de

diferentes fuentes de nitrógeno (NH 4 4 Cl, extracto de levadura y caldo de tripticasa de soja) se compararon por su efecto sobre el crecimiento y la

formación del producto. En la investigación descrita en este documento, el ácido acético es el principal producto final. La selección adecuada del

medio y las condiciones de cultivo permitirían que el etanol se convierta en el metabolito final principal, o incluso único. Primero, los experimentos

se llevaron a cabo en viales de suero de 200 ml usando un 2 3 Diseño factorial completo. En la segunda parte de la investigación, se estudió el

efecto de las fuentes individuales de nitrógeno en el crecimiento y la producción de metabolitos. En la parte final de la investigación, los

experimentos se realizaron en fermentadores a escala de laboratorio en modo continuo (alimentación continua de gas) aplicando resultados y

condiciones previamente optimizadas en experimentos por lotes.

2. Sección experimental

2.1. Microorganismo

Clostridium autoethanogenum DSM 10061 se adquirió de la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH (Braunschweig, Alemania), y se mantuvo en medio (pH = 6) con la siguiente composición (por litro de
agua destilada): NH 4 4 Cl, 0,9 g; NaCl, 0,9 g; MgCl 2 · 6H 2 O, 0,4 g; KH 2 correos 4, 0,75 g; K 2 HPO 4, 1,5 g; FeCl 3 · 6H 2 O, 0,0025 g;
trypticase peptone, 2.0 g; extracto de levadura (YE), 1,0 g; cisteína-HCl, 0,75 g; 0,1% de resazurina, 0,5 ml; con 0,5% de
xilosa y solución SL-10, 1,0 ml. La solución madre de trazas de metal SL-10 contenía (por litro): 7,7 M de HCl, 10 ml; FeCl 2
· 4H 2 O, 1,5 g; ZnCl 2, 70 mg; MnCl 2 · 4H 2 O, 100 mg; H 3 BO 3, 6 mg; CoCl 2 · 2H 2 O, 190 mg; CuCl 2 · 2H 2 O, 2 mg; NiCl 2 · 6H 2 O, 24
mg; y Na 2 Mugir 4 4 · 2H 2 O, 36 mg. Para los estudios experimentales, se omitió la xilosa del medio.
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2.2. Estudios de bioconversión

2.2.1. Experimentos por lotes de botellas

Un factor de dos niveles tres (2 3) Se utilizó un diseño experimental factorial completo para estudiar los efectos combinados de NH 4 4 Concentraciones

de Cl (0.2–2 g / L), tripticasa (0.2–2 g / L) y YE (0.1–1 g / L), como fuentes de nitrógeno, en la formación de productos y la estabilidad del cultivo

durante la bioconversión de monóxido de carbono por

C. autoethanogenum. El paquete de software Minitab 16 (Minitab Inc. State College, PA, EE. UU.) Se utilizó para diseñar los experimentos y

para el análisis de datos en forma de análisis de varianza (ANOVA). La Tabla 1 muestra la matriz de diseño obtenida en valores no

codificados con el software MINITAB y los valores observados de las respuestas obtenidas para cada experimento, así como el pH final. El

diseño factorial es una herramienta estadística importante que permite concluir los factores que más influyen en el proceso de bioconversión

mediante la realización de un número limitado de experimentos. Por lo tanto, se llevaron a cabo un total de 18 corridas experimentales,

incluidos los experimentos replicados en los puntos centrales. Los efectos individuales y de interacción de los diferentes parámetros se

estudiaron utilizando la técnica de mínimos cuadrados con la ayuda de un software específico.

Tabla 1. 2 3 Tabla de diseño factorial de experimentos y respuestas.

Ejecutar no NUEVA HAMPSHIRE 4 4 Cl Trypticase YE Etanol (g / L) Ácido acético (g / L) Biomasa (mg / L) pH final

1 0.2 0.2 0.2 0.2 0,10 0,1733 1.806 152,29 3.88

2 2,0 0.2 0.2 0,10 0,3032 1.560 142,81 3.84

3 0.2 0.2 2,0 0,10 0.2290 1.855 222,7 4.03

44 2,0 2,0 0,10 0.1959 1.663 244,49 4.00

55 0.2 0.2 0.2 0.2 1.00 0,0883 2.146 302,90 3.91

66 2,0 0.2 0.2 1.00 0,1048 2.101 294.80 3.84

77 0.2 0.2 2,0 1.00 0.1061 2.339 335,62 3.93

8 2,0 2,0 1.00 0.1101 2.226 320,03 3.94

Para experimentos por lotes, el 10% del cultivo de semillas en crecimiento activo, cultivado con CO como única fuente de carbono, se

transfirió asépticamente a viales de suero de 200 ml que contenían 75 ml de medio a pH = 6. El medio contenía (por litro de agua destilada):

NaCl, 0.9 gramo; MgCl 2 · 6H 2 O, 0,4 g; KH 2 correos 4, 0,75 g; K 2 HPO 4, 1,5 g; FeCl 3 · 6H 2 O, 0,0025 g; 0,1% de resazurina, 0,5 ml; y solución

SL-10, 1,0 ml. NUEVA HAMPSHIRE 4 4 Cl, YE o trypticase se agregaron en los mismos viales según el diseño experimental (Tabla 1). Para

eliminar el oxígeno, el medio se hirvió y se lavó con N 2) Después de enfriar, se añadieron 0,75 g de cisteína-HCl como agente reductor, y el

pH se ajustó a 6 usando soluciones acuosas de HCl 2 M o NaOH 2 M. Luego se sellaron las botellas con tapones de Viton y se taparon con

rizos de aluminio antes de esterilizarlas en autoclave durante 20 minutos a 121 ° C. La configuración experimental y el método utilizado para

la preparación de medios se describen en otra parte [15]. Las botellas se mantuvieron en condiciones anaeróbicas. Se presurizaron con

100% de CO para alcanzar una presión de espacio de cabeza total de 1,2 bares y se agitaron a 150 rpm en un orbital.
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agitador, dentro de una cámara de incubación a 30 ° C. Se usaron muestras de espacio de cabeza de 0.2 mL para las mediciones de CO, y se

extrajo periódicamente 1 mL de muestra líquida de los viales, una vez cada 24 h, para medir la densidad óptica (OD λ = 600 nm), que está

directamente relacionado con la concentración de biomasa. Posteriormente, esa misma muestra de 1 ml se filtró utilizando un filtro de jeringa

de PTFE de 0,22 µm y se usó para verificar las concentraciones de productos solubles. Todos los experimentos de bioconversión se realizaron

por duplicado, alcanzando resultados estadísticamente altamente reproducibles. Las variables de respuesta (Y) que se analizaron fueron las

concentraciones máximas de productos (g / L) así como las concentraciones de biomasa (mg / L) obtenidas de los diferentes ensayos

experimentales.

Tres experimentos separados con NH 4 4 También se realizaron por duplicado Cl (1.1 g / L), YE (0.55 g / L) o tripticasa (1.1 g / L), como única

fuente de nitrógeno, para comprender el efecto individual de cada fuente de nitrógeno en la promoción del crecimiento o formación de producto en

CO. También se realizó otro conjunto de experimentos, en las mismas condiciones que anteriormente pero sin ningún tipo de CO, para verificar

cualquier formación de producto a partir de YE y tripticasa sola. Las concentraciones de fuentes de nitrógeno utilizadas en estos conjuntos de

experimentos son los valores centrales de los respectivos rangos de factores considerados en el diseño factorial completo anterior. Los experimentos

y el análisis de muestras se realizaron de la misma manera que se mencionó anteriormente.

2.2.2. Experimentos continuos de biorreactor alimentado por gas

Se llevaron a cabo tres experimentos de biorreactor en biorreactores BIOFLO 110 de 2 l (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, EE. UU.)

Utilizando las siguientes condiciones: (1) pH = 5,75 e YE 1 g / L (denominado EXP1); (2) pH = 4.75 e YE 1 g / L (EXP2) y (3) pH = 5.75 e YE

0.2 g / L (EXP3). Esos experimentos se realizaron con 1,2 l de medio líquido discontinuo y CO (100%) como sustrato gaseoso, alimentado

continuamente a una velocidad de 15 ml / min utilizando un controlador de flujo másico (Aalborg GFC 17, Müllheim, Alemania). El biorreactor

con el medio se esterilizó en autoclave y se añadió cisteína-HCl (0,75 g / L) después de enfriar, junto con la alimentación de nitrógeno para

garantizar condiciones anaeróbicas. La composición del medio utilizado en estos estudios de biorreactores fue la misma que en los

experimentos con botellas, con YE como única fuente de nitrógeno. El biorreactor se mantuvo a una temperatura constante de 30 ° C con una

velocidad de agitación constante de 250 rpm a lo largo de los experimentos. El 10% de un cultivo en crecimiento activo, que se cultivó

durante 48 h con CO como única fuente de carbono, se utilizó como inóculo y se transfirió asépticamente al biorreactor. El pH del medio se

mantuvo automáticamente a un valor constante de 5,75 o 4,75, mediante la adición de una solución de NaOH 2 M o una solución de HCl 2

M, alimentada por medio de una bomba peristáltica. Se tomaron muestras de gas de 0.2 mL de los puertos de muestreo de entrada y salida

del biorreactor para monitorear el CO y el CO 2

concentraciones De forma similar, se extrajeron periódicamente muestras líquidas de 2 ml del reactor, una vez cada 24 h, para
medir la densidad óptica (DO λ = 600 nm), permitiendo estimar la concentración de biomasa. Posteriormente, la muestra se filtró con una
jeringa usando un filtro de PTFE de 0,22 µm antes de analizar las concentraciones de productos solubles en agua.
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2.3. Equipos analíticos y protocolos de medición

Las concentraciones de CO en fase gaseosa se midieron usando un cromatógrafo de gases HP 6890 (GC, Agilent Technologies, Madrid,

España) equipado con un detector de conductividad térmica (TCD). El GC se equipó con una columna HP-PLOT Molecular Sieve 5A de 15 m

(ID: 0,53 mm, espesor de película: 50 μm). La temperatura del horno se mantuvo inicialmente constante a 50 ° C, durante 5 min, y luego se

elevó a 20 ° C · min −1 durante 2 min, para alcanzar una temperatura final de 90 ° C. La temperatura del puerto de inyección y el detector se

mantuvieron constantes a 150 ° C. Se utilizó helio como gas portador. Del mismo modo, CO 2 se analizó en un cromatógrafo de gases HP 5890,

equipado con un TCD. Las temperaturas de inyección, horno y detección se mantuvieron a

90, 25 y 100 ° C, respectivamente. Para la identificación de 2,3-butanodiol, se utilizó un sistema GC-MS de cuadrupolo simple
Thermo Scientific ISQ ™ (Thermo Fischer Scientific, Madrid, España) a 70 eV. Estaba equipado con una columna HP-5ms (30 m
× 0.25 mm × 0.25 µm de espesor de película). Los productos solubles en agua en el caldo de cultivo, es decir, Se analizaron ácido
acético, etanol y 2,3-butanodiol utilizando una HPLC (HP1100, Agilent Technologies, Madrid, España) equipada con una columna
Hypersil ODS de 5 μm × 4 mm × 250 mm y un detector UV a una longitud de onda de 284 nm. . La fase móvil era una solución de
ácido orto-fosfórico al 0,1% alimentada a un caudal de 0,5 ml / min. La temperatura de la columna se ajustó a 30 ° C. La masa
celular se calculó midiendo la absorbancia de la muestra, a una longitud de onda de 600 nm, utilizando un espectrofotómetro
UV-visible (Hitachi, Modelo U-200, Pacisa y Giralt, Madrid, España). La absorbancia medida se comparó luego con una curva de
calibración generada previamente, para calcular la concentración de biomasa correspondiente (mg / L). Además, el potencial
redox fue monitoreado continuamente usando un electrodo de referencia Ag / AgCl conectado a un transmisor (M300, Mettler
Toledo, Inc., Bedford, MA,

3. Resultados y discusión

3.1. Experimentos por lotes de botellas

En los experimentos con botellas, etanol y ácido acético. la producción comenzó de inmediato, sin ninguna fase de retraso (Figura S1).

Se podría concluir que en estos experimentos la Clostridium la cepa sigue la ruta metabólica que convierte acetil-CoA en acetaldehído,

seguido de reducción a etanol a través de una acetaldehído / etanol deshidrogenasa bifuncional (Figura 1) [1]. Por lo tanto, en esta

fermentación de CO, no hubo fases acetogénicas o etanógenas diferenciadas. Las concentraciones máximas de biomasa (335.6 mg / L) y

ácido acético (2.3 g / L) se produjeron en la ejecución No. 7 (Tabla 1) cuando se usaron las concentraciones más altas de YE y tripticasa.

La concentración más alta de etanol (0.3 g / L) se obtuvo en la operación No. 2. Concentraciones menores de subproducto, es decir, También

se detectaron 2,3-butanodiol, que alcanzaron 0.017-0.101 g / L en el último día de los lotes. Los ensayos por lotes se detuvieron después

de aproximadamente 10 días, cuando todo el CO agregado inicialmente se agotó y no se formaron más biomasa ni productos finales.

3.1.1. Trama de efectos principales

La gráfica de efectos principales para las respuestas experimentales se muestra en la Figura 2. Representa los valores medios de respuesta en cada

nivel de los parámetros de diseño. Un efecto principal se considera presente cuando la respuesta media cambia a través del nivel del factor. De la gráfica

de efectos principales para la biomasa (Figura 2a), es claramente

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observó que NH 4 4 Cl no ejerce ningún efecto significativo sobre la biomasa. Sin embargo, se observó una concentración de biomasa

ligeramente más alta siempre que el bajo NH 4 4 Las concentraciones de Cl se utilizaron en este estudio. Este efecto está de acuerdo con

estudios previamente reportados con Clostridium aceticum y Rhodospirillum rubrum utilizando CO como único sustrato de carbono [16]. La

presencia de ambos NH 4+ y el acetato podría presumiblemente dar lugar a la formación de acetato de amonio que es inhibidor de algunos

clostridios, ya a bajas concentraciones [17].

Figura 1. Vía Wood-Ljungdahl y formación de metabolitos a partir de acetil-CoA. Abreviaturas: THF,

tetrahidrofolato; CFeSP, proteína corrinoide de hierro-azufre.

Según el gráfico de efectos principales (Figura 2a), el crecimiento celular de C. autoethanogenum obviamente se vio afectado por las

concentraciones iniciales de YE y tripticasa en el medio. La cantidad de biomasa aumentó con un aumento de las concentraciones iniciales de

YE y de tripticasa dentro del rango de concentraciones estudiadas en este trabajo. Esto se puede atribuir al valor nutricional de YE y el caldo de

tripticasa de soja, ya que ambos contienen varios aminoácidos, vitaminas y otros compuestos estimulantes del crecimiento.

Del análisis ANOVA, se observó que de todos los efectos individuales de cada fuente de nitrógeno, los efectos debidos a la

concentración de YE se encontraron estadísticamente significativos ( p < 0.05) para la producción de etanol y ácido acético. Para la

producción de etanol (Figura 2c), la presencia de YE mostró la mayor

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efecto negativo, mientras que NH 4 4 Cl y trypticase ejercieron un efecto ligeramente positivo o ligeramente negativo, respectivamente. El efecto

positivo de NH 4 4 Cl sobre la producción de etanol también fue informado por Guo et al.

El diseño de Plackett-Burman se usó en sus estudios, seleccionando NH 4 4 Cl como uno de los factores importantes que afectan la producción de etanol,

junto con MgSO 4 4 y pH [13]. El crecimiento mejorado en los medios limitados por YE se ha informado en estudios anteriores. La presencia de YE da

como resultado un medio más rico, que es favorable para el crecimiento de la biomasa. El crecimiento de la biomasa generalmente está relacionado

con la formación de acetato, mientras que la producción de etanol generalmente no es un metabolito relacionado con el crecimiento. Barik et al. sugirió

que un nivel mínimo de aproximadamente 0.01% YE sería esencial para proporcionar nutrientes traza para el crecimiento celular. Sin embargo, se

observó una mejora de hasta el 300% en la relación etanol / acetato cuando el YE se eliminó por completo [18].

Medios de datos Medios de datos

NH4Cl Trypticase
NH4Cl Trypticase
2,25
300

2.10
275

250
1,95

225

1,80
200
Media
Media

0.2 0.2 1.1 2,0 0.2 0.2 1.1 2,0 0.2 0.2 1.1 2,0 0.2 0.2 1.1 2,0

S.M
S.M
2,25
300

275 2.10

250
1,95

225

1,80
200

0,10 0,55 1.00 0,10 0,55 1.00

( UNA) ( C)
Medios de datos

NH4Cl Trypticase

0,20

0,15

0,10
Media

0.2 0.2 1.1 2,0 0.2 0.2 1.1 2,0

S.M

0,20

0,15

0,10

0,10 0,55 1.00

( C)

Figura 2. Gráfico de efectos principales para ( una) Biomasa, ( si) Ácido acético y ( C) Etanol.

Se espera que el efecto negativo de YE sobre la producción de etanol se deba a la vitamina B12, entre otros. YE contiene vitamina

B12, que juega un papel importante en las bacterias acetogénicas. La metil transferasa sintasa (MeTr) en acetógenos es una enzima

dependiente de cobalamina y cataliza la transferencia del metilo

En t. J. Environ. Res. Salud pública 2015, 12 1037

grupo de metil-H4folato al centro de cobalto de la proteína corrinoide hierro-azufre (CFeSP). Se propone que al reducir la tasa del ciclo

de H4folate, NAD (P) H puede acumularse dentro del sistema con un aumento posterior en la producción de etanol [9]. En otro estudio

realizado con Alcalibaculum bacchi cepa CP15, en un fermentador de 7 L, se observó un efecto similar; es decir, un medio sin YE produjo

13% más de etanol que un medio que contiene YE. Sin embargo, se observó una disminución en la producción de ácido acético y masa

celular, que alcanzó hasta 40% y 15%, respectivamente, en el medio libre de YE [19].

3.1.2. Trama de efectos de interacción

La gráfica de los efectos de interacción para la biomasa, el etanol y el ácido acético producidos a partir del CO se muestra en la Figura 3

y proporciona la respuesta media de todas las combinaciones posibles de bajo a alto nivel de cada uno de los dos factores. Es decir, el efecto

de cada factor depende del segundo factor. Las líneas no paralelas representan una interacción entre esos dos factores (YE, tripticasa y / o

NH 4 4 Cl). A partir de la gráfica de interacción para biomasa y etanol (Figura 3a, c), se puede observar que existe una fuerte interacción entre

cada dos factores. Sin embargo, no existe una interacción notable entre los pares de factores para la producción de ácido acético (Figura 3b).

Las concentraciones máximas de biomasa y ácido acético alcanzadas fueron superiores a 290 mg / L y

2.1 g / L, respectivamente, en todos los experimentos en los que se usó una concentración de YE de 1 g / L, independientemente de las

concentraciones de tripticasa y NH 4 4 Cl en el medio (Figura 3a, b). Las cantidades de etanol producidas alcanzaron sus valores máximos

cuando YE estaba presente a una baja concentración de

0.1 g / L, independientemente de las concentraciones de los otros dos factores (tripticasa y NH 4 4 Cl) (Figura 3c). Esto muestra la influencia

de la concentración de YE en el espectro de productos obtenidos de la conversión de CO en C. autoethanogenum. Considerando la

interacción entre NH 4 4 Cl y trypticase, se encontró que se producía una mayor cantidad de biomasa a una concentración más alta de

trypticase de 2 g / L, en ambos niveles de NH 4 4 Cl, que puede atribuirse a los nutrientes complejos presentes en la tripticasa (Figura 3a).

3.1.3. Efecto de las fuentes individuales de nitrógeno en el crecimiento y la formación de productos

Los experimentos se realizaron con NH 4 4 Cl (1.1 g / L), tripticasa (1.1 g / L) o YE (0.55 g / L), como la única fuente
de nitrógeno. Se observó que no hay crecimiento ni formación de producto en botellas que contienen solo NH 4 4 Cl. En
los frascos con YE o tripticasa, se observaron comportamientos similares, con un crecimiento de hasta
aproximadamente 230 mg / L, y concentraciones de producto de alrededor de 0.07 g / L para etanol y 2 g / L para
ácido acético. Sin embargo, también vale la pena recordar que la cantidad de YE utilizada en la preparación del
medio es la mitad de la cantidad de tripticasa. A partir de estas observaciones, en los estudios posteriores en
biorreactores continuos, se eligió YE como la única fuente de nitrógeno. Dado que YE y la tripticasa también
contienen otros compuestos además de los que contienen nitrógeno, se verificó su uso potencial como sustratos para
la producción de metabolitos finales. En ese sentido, en experimentos realizados sin ningún tipo de CO,
En t. J. Environ. Res. Salud pública 2015, 12 1038

( una) ( si)

( C)

Figura 3. Tramas de efectos de interacción para ( una) Biomasa, ( si) Ácido acético y ( C) Etanol.

3.2. Experimentos continuos de biorreactor alimentado por gas

Experimentos de biorreactor con flujo continuo de gas, es decir, suministro continuo de CO, se realizaron durante hasta dos semanas cada uno.

El crecimiento celular y la producción de diferentes metabolitos en tres conjuntos diferentes de experimentos se muestran en la Figura 4. El

potencial redox se monitorizó constantemente para cada corrida experimental. Está relacionado con la transferencia de electrones que se produce

dentro de las células y, por lo tanto, es muy sensible incluso a cambios delicados en el metabolismo. Tanto EXP1 como EXP3 tenían un instrumento

que leía el valor del potencial de oxidorreducción (ORP) de -87 ± 10 mV, mientras que era -43 ± 5 mV para EXP2. Los valores de ORP dependen

directamente del pH del medio. Un pH más bajo de la fase líquida dará como resultado valores negativos más bajos del potencial redox. Las

oscilaciones de los valores de potencial redox en el medio de cultivo podrían deberse al crecimiento microbiano y las variaciones en el perfil

metabólico en cada punto de la ejecución experimental y también han sido reportados por otros investigadores en otros estudios de bioconversión

[20,21]. Redox intracelular

En t. J. Environ. Res. Salud pública 2015, 12 1039

La homeostasis se ve profundamente afectada por los altibajos del potencial redox extracelular que puede cambiar significativamente el tipo

de fermentación en bacterias acidogénicas [22].

La biomasa en EXP1 (Figura 4a) comenzó a crecer después de una fase de retraso más corta en comparación con EXP2 y EXP3, debido a las

condiciones de crecimiento favorables ( es decir, pH óptimo y valor nutricional de YE) que prevalecen dentro del biorreactor, alcanzando una

concentración de biomasa de aproximadamente 302.4 mg / L en menos de 100 h de experimento. La fase de retraso fue de aproximadamente 70 h

tanto en EXP2 como en EXP3, alcanzando concentraciones máximas de biomasa de 113.76 y 151.37 mg / L, respectivamente; eso es 62% y 50%

menos que en EXP1. Esto confirma que el pH y la concentración de YE son parámetros importantes y juegan un papel clave en el logro de altas

concentraciones de masa celular. Una disminución drástica en el crecimiento ocurrió después de 89 h en EXP1. Esto podría estar relacionado con

la acumulación de altas cantidades de ácido acético (~ 2 g / L) en el caldo de fermentación. Dos enzimas son responsables de la conversión de

acetil CoA durante la síntesis de acetato,

es decir, fosfotransacetilasa (PTA) y acetato quinasa (AK). Durante la etapa de producción de acetato, ambas enzimas están activas y se
produce ATP como parte de su reacción. Sin embargo, se informó que la actividad de estas enzimas disminuye considerablemente con un

aumento en la concentración de acetato en el caldo en la fermentación con C. acetobutílico [ 23]. En el último estudio, el AK fue

biosintetizado dentro de la célula de

C. acetobutílico, con la acumulación de concentraciones de acetato de hasta 3 g / L en el caldo, lo que resulta en una disminución rápida de la

actividad de AK con el aumento de la cantidad de acetato [23]. Sin embargo, una explicación clara para la detención del crecimiento y la producción

de metabolitos en EXP2 y EXP3 después de un cierto período de tiempo aún no está clara.

No se observaron fases acidogénicas y solventogénicas separadas para C. autoethanogenum durante estos estudios de biorreactor

utilizando las composiciones de medios informadas y las condiciones de fermentación. Tampoco se observó la conversión de ácido acético en

etanol en la fase tardía del estudio, aunque observamos ese tipo de conversión de acetato en etanol en diferentes condiciones operativas

(manuscrito en preparación). El ácido acético fue el metabolito predominante formado durante la fermentación de CO en cada uno de los tres

experimentos descritos aquí (Figura 4b). Como se mencionó anteriormente, cambiar las condiciones experimentales permitiría un cambio a la

acumulación de etanol en lugar de acetato. Se obtuvo una concentración máxima de ácido acético de 2.1 g / L después de 137 h en EXP1,

que es aproximadamente 294% y 95% más alta que las cantidades máximas producidas en EXP2 y EXP3, respectivamente. Es interesante

observar que ambos experimentos, EXP1 y EXP3, que se realizaron a pH alto, produjo más ácido acético que en estudios a pH más bajo,

independientemente de las concentraciones de YE utilizadas. Un estudio previo usando C. ragsdalei a dos valores de pH diferentes, se informó

de manera similar una mayor producción de ácido acético a pH alto [24].

Aunque la cantidad máxima de etanol se obtuvo en EXP1, la relación etanol / ácido acético fue mayor en EXP2 caracterizada por un

pH bajo. El pH de la fermentación es uno de los parámetros más influyentes que afecta el metabolismo de las bacterias acetogénicas.

Bajar el pH parece causar un cambio en el espectro del producto de la fase acidogénica a la fase solventogénica. La explicación radica en

la permeación del ácido débil no disociado, el ácido acético, a través de las membranas celulares, lo que resulta en un pH interno más bajo

debido a la entrada de iones H +. Las bacterias superan este estrés fisiológico produciendo solventes [25].
En t. J. Environ. Res. Salud pública 2015, 12 1040

( una) ( si)

( C) ( re)

Figura 4. Masa celular ( una) y perfiles de productos, ácido acético ( si); Etanol ( C) y butanodiol ( re) en tres
experimentos diferentes: EXP1 (pH = 5,75 y YE 1 g / L); EXP2 (pH = 4,75 y YE 1 g / L); EXP3 (pH = 5,75 y YE 0,2
g / L).

Como se puede ver en la Figura 4c, se obtuvo una producción máxima de etanol máxima en EXP1 que en EXP2, aunque el pH

externo bajo indujo una mayor producción de solvente. Esto podría deberse a la alta concentración de biomasa lograda en EXP1. Las

fermentaciones produjeron 352,6 mg / L, 264,51 mg / L y

156.95 mg / L de etanol respectivamente en EXP1, EXP2 y EXP3. Por otro lado, se obtuvo una relación máxima de etanol a ácido acético para

EXP2 con un valor de 0,54. Se puede ver que un pH bajo (EXP2) provocó un alargamiento de la fase de retraso y redujo la concentración final

de biomasa, aunque mejoró significativamente la relación etanol / ácido acético. Por lo tanto, la limitación de nutrientes combinada con un pH

de fermentación bajo mejoró dicha proporción del producto. Varios estudios informaron que los biorreactores de tanque agitado en dos etapas,

con un pH diferente en cada recipiente, podrían mejorar la relación de etanol a ácido acético [26,27]. De este estudio se observa que usar un

pH inicial bajo y mantenerlo constante también podría mejorar la relación etanol / ácido acético, aunque hay una fuerte disminución en la

productividad general de los metabolitos. Un gran obstáculo en CO

En t. J. Environ. Res. Salud pública 2015, 12 1041

la fermentación, cuando se enfoca en la producción de etanol, es que bajar el pH reduce el crecimiento celular; reduciendo así la

productividad general del etanol en el proceso. También se produjeron cantidades menores de 2,3-butanodiol en los tres experimentos

(Figura 4d). La concentración de butanodiol aumentó a un máximo de

81.8, 41.8 y 71.6 mg / L en EXP1, EXP2 y EXP3, respectivamente.

4. Conclusiones

De los experimentos se observa claramente que alterar la composición del medio y el pH altera el espectro del producto y el

crecimiento de la biomasa. De los estudios por lotes, se encontró que la concentración de YE tiene un efecto significativo en la

producción de etanol. EXP1, a pH = 5,75 y una concentración YE de 1 g / L, produjo una cantidad máxima de biomasa (302,4 mg / L) y

concentraciones máximas de productos,

es decir, ácido acético (2147.1 mg / L), etanol (352.6 mg / L) y butanodiol (81.8 mg / L), en comparación con los otros dos estudios. Un
etanol máximo se obtuvo una relación de ácido acético de 0,54 en EXP2
(pH = 4,75; YE 1 g / L). Aunque mantener un pH bajo constante desde el principio mejoró la relación de etanol a ácido acético, afecta

drásticamente la productividad general del proceso como resultado de un crecimiento de biomasa más débil.

Expresiones de gratitud

La presente investigación fue financiada a través del proyecto CTM2010-15796-TECNO del Ministerio de Ciencia e

Innovación de España y a través de fondos europeos FEDER.

Contribuciones de autor

Haris Nalakath Abubackar realizó los estudios experimentales. Christian Kennes y María C. Veiga obtuvieron apoyo financiero
para realizar la investigación y supervisaron el trabajo experimental. Haris Nalakath Abubackar preparó el primer borrador del
documento. Todos los autores contribuyeron a la redacción final y la revisión del manuscrito.

Conflictos de interés

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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© 2015 por los autores; licenciatario MDPI, Basilea, Suiza. Este artículo es un artículo de acceso abierto distribuido bajo
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