PRACTICA DE LABORATORIO – EXTRACCIÓN DE ADN

INTRODUCCIÓN

La extracción de ADN es un procedimiento muy útil y básico en numerosos

análisis. En general requiere una serie de pasos básicos. En primer lugar tienen
que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al
núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la membrana nuclear
para dejar libre el ADN. Por último hay que proteger el ADN de enzimas que
puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol.

La extracción de ADN de una muestra celular mediante este protocolo, se basa en

el hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del
ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza por
lisar (romper) las células mediante un detergente, vaciándose su contenido
molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN.

En ese momento, el tampón contiene ADN y toda una mezcla de restos

moleculares y celulares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en
menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán
fraccionado en cadenas más pequeñas y se habrá separado por acción del
detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y
detergente, para lo cual se utiliza alcohol isoamílico.

El producto filamentoso obtenido con este protocolo de extracción no es ADN puro

ya que quedan fragmentos de ARN. Una extracción "profesional" se realiza
añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN e impiden que se unan
al ADN.

MATERIALES
• Muestra tejido (1 taza • Licuadora
EXTRACTO)* • Nevera
• Agua (destilada o mineral) • Colador filtro o
• Sal de mesa centrífuga
• Bicarbonato sódico • Beaker
• Detergente líquido o • Tubo de ensayo
shampú • Varilla de vidrio
• Alcohol Isoamílico a 0ºC
• Ablanda carnes, zumo de
piña o papaya o solución
limpiadora de lentes de
contacto

* Para este experimento usaremos extracto de hígado, traerlo licuado.

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PROCEDIMIENTO

En Casa:
1. Preparar el tampón con los siguientes reactivos y mantener en
la nevera. PREPARARLO EN CASA, MANTENERLO FRÍO Y
TRAERLO LISTO PARA USAR (EN LO POSIBLE
TRANSPORTARLO EN NEVERA PORTATIL PARA
MANTENER BAJA TEMPERATURA).
o 120 ml de agua, si es posible destilada o mineral.
No usar agua del grifo.
o 1,5 g de sal de mesa, preferiblemente pura.
o 5 g de bicarbonato sódico.
o 5 ml de detergente líquido o champú.

2. El hígado que va a proporcionar el ADN y cortarlo en cuadraditos.

3. Triturar la muestra con un poco de agua en la licuadora a alta
velocidad, 15 segundos. Así se romperán muchas células y otras
quedarán expuestas a la acción del detergente. PREPARARLO EN
CASA MÁXIMO 1 HORA ANTES DEL LABORATORIO, TRAERLO
LISTO PARA USAR.

En el laboratorio:
4. Mezclar en un beaker limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampón frío
y agitar vigorosamente durante al menos 5-10 minutos.
5. Separar los restos de la muestra más grandes del caldo molecular haciéndolo
pasar por un colador lo más fino posible o filtrarlo. Lo ideal es centrifugar a baja
velocidad 5 minutos y después pipetear el sobrenadante.
6. Retirar 5 ml del filtrado en un tubo de ensayo
7. paso opcional: agregar 1 cucharadita de ablanda carnes o 2 cucharaditas de
zumo de piña o papaya o de solución limpiadora de lentes de contacto
8. Añadir con pipeta 10 ml de alcohol isoamílico enfriado a 0ºC. Se debe dejar
escurrir lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente, teniendo éste
inclinado. El alcohol deberá quedar flotando sobre el tampón.

+ Deja reposar durante 2 ó 3

minutos hasta que se forme una
zona turbia entre las dos capas.

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 9. Se introduce la punta de una varilla estrecha de vidrio hasta justo debajo de
la separación entre el alcohol y el tampón. Remover la varilla girándola y
poco a poco se irán enrollando los fragmentos de mayor tamaño de ADN.
10. Pasado un minuto retirar la varilla atravesando la capa de alcohol el ADN
quedará adherido a con aspecto de un copo de algodón mojado

CUESTIONARIO

1. Por que la molécula del ADN tiene carga neta negativa?

2. Porque se emplea detergente para lisar las células? Que otros compuestos
se pueden emplear para este fin?
3. Que es una solución tampon y porque se debe usar en este experimento?
4. Que función cumple el alcohol en el proceso?
5. Para que se usa ablanda carnes, sumos de piña o papaya o la solución
limpiadora de lentes de contacto en el paso opcional
6. Investigue que procedimientos se utilizan para purificar el ADN obtenido en
Este experimento