Objetivo:

Separar e identificar los aminoácidos en una mezcla por cromatografía en capa fina.

Cromatografía

La cromatografía es, con mucho, el grupo general más útil de técnicas disponibles para la
separación de compuestos estrechamente relacionados en una mezcla. Aquí la separación se
efectúa por diferencias en la distribución de equilibrio de los componentes entre dos fases
inmiscibles, a saber, las fases estacionarias y móviles. Estas diferencias en la distribución de
equilibrio son el resultado de la naturaleza y el grado de interacción de los componentes con estas
dos fases. La fase estacionaria es un medio poroso como sílice o alúmina, a través del cual la
mezcla de muestra se filtra bajo la influencia de un disolvente en movimiento (la fase móvil). Hay
una serie de interacciones entre la muestra y la fase estacionaria y estas han sido bien explotadas
para efectuar la separación de compuestos.

Cromatografía en capa fina [TLC]:

La técnica de cromatografía de capa fina (TLC) proporciona fácilmente información cualitativa y

con cuidadosa atención a los detalles, es posible obtener datos cuantitativos. La cromatografía en
capa fina es una técnica utilizada para separar e identificar compuestos de interés. Una placa de
TLC está hecha de una capa delgada de sílice adherida al vidrio o al aluminio para soporte. El gel
de sílice actúa como la fase estacionaria y la mezcla de disolvente actúa como la fase móvil. En el
sistema disolvente ideal, los compuestos de interés son solubles en diferentes grados. La
separación resulta del equilibrio de partición de los componentes en la mezcla.
En la forma más simple de la técnica, se aplica una zona o punto estrecho de la mezcla de muestra
a separar cerca de un extremo de la placa de TLC y se deja secar. Luego se coloca la tira o placa
con este extremo sumergido en la mezcla de solvente, teniendo cuidado de que la zona / zona de
la muestra no se sumerja en el solvente. A medida que el solvente se mueve hacia el otro extremo
de la tira, la mezcla de prueba se separa en varios componentes. Esto se llama como el desarrollo
de placas de TLC. La separación depende de varios factores; (a) solubilidad: cuanto más soluble
es un compuesto en un disolvente, más rápido se moverá hacia arriba de la placa. (b) atracciones
entre el compuesto y la sílice, cuanto más interactúa el compuesto con sílice, menos se mueve,
(c) tamaño del compuesto, cuanto más grande es el compuesto, más lento sube por la placa.

La placa se retira después de un tiempo de desarrollo óptimo y se seca y las manchas / zonas se
detectan utilizando un reactivo de localización adecuado. Una característica importante utilizada
en la cromatografía en capa fina es el valor de Rf.

La placa se retira después de un tiempo de desarrollo óptimo y se seca y las manchas / zonas se
detectan utilizando un reactivo de localización adecuado. Una característica importante utilizada
en la cromatografía en capa fina es el valor de Rf.
Separación cromatográfica de aminoácidos:

El presente experimento emplea la técnica de cromatografía en capa fina para separar los
aminoácidos en una mezcla dada.

Los 20 aminoácidos comunes [aminoácidos estándar] son aminoácidos a. Tienen un grupo

carboxilo y un grupo amino unido al mismo átomo de carbono (el carbono α). Se diferencian entre
sí en sus cadenas laterales, o grupos R, que varían en estructura, tamaño y carga eléctrica. La
interacción de los aminoácidos con la fase estacionaria como la sílice varía según sus grupos 'R'. El
aminoácido que interactúa fuertemente con la sílice será transportado por el solvente a una
pequeña distancia, mientras que el que tenga menos interacción se moverá más. Al ejecutar
controles [compuestos conocidos] junto, es posible identificar los componentes de la mezcla.
 Como los aminoácidos son compuestos incoloros, la ninhidrina se usa para detectarlos. Para
identificar esto, después del desarrollo, la placa de TLC se rocía con reactivo de ninhidrina y se
seca en un horno, a 105 ° C durante aproximadamente 5 minutos. La ninhidrina reacciona con
los aminoácidos α que producen manchas de color púrpura [debido a la formación del complejo:
el púrpura de Rheuman] [http://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=63&sim=156&cnt=1]. Los
valores de Rf se pueden calcular y comparar con los valores de referencia para identificar los
aminoácidos. [El valor de Rf para cada compuesto conocido debe permanecer igual siempre que
el desarrollo de la placa se realice con el mismo solvente, tipo de placas de TLC, método de
detección y exactamente en las mismas condiciones].

Materiales necesarios:
Reactivos:

1. Solución al 2% de aminoácidos individuales.

2. Mezcla solvente de butanol normal, ácido acético y agua en la proporción 12: 3: 5 en volumen.
3. Reactivo de ninhidrina.

Requisitos:

1. Placa de TLC.
2. Cámara de TLC.
3. Tubos capilares.
4. Botella de spray reactivo.
5. Matraces Cónicos.
6. Vasos de precipitados.

Procedimiento:
1. Vierta la mezcla de solvente en la cámara de TLC y cierre la cámara.
2. La cámara no debe perturbarse durante aproximadamente 30 minutos para que la atmósfera en
el frasco se sature con el solvente.
3. Corte el plato al tamaño correcto y con un lápiz (nunca use un bolígrafo) dibuje suavemente una
línea recta a través del plato aproximadamente a 2 cm de la parte inferior.
4. Usando un tubo capilar, se observa una pequeña gota de aminoácido en la línea.
5. Permita que la mancha se seque.
6. Encuentra el segundo aminoácido en la placa [se debe proporcionar suficiente espacio entre las
manchas].
7. Repita el paso anterior para detectar el ácido desconocido.
8. Coloque la placa en la cámara de TLC de la manera más uniforme posible y apóyela contra el
costado (sumerja la placa de manera que la línea quede por encima del solvente). Permita la
acción capilar para extraer el solvente de la placa hasta que esté aproximadamente a 1 cm del
extremo.
9. Retire la placa e inmediatamente dibuje una línea de lápiz sobre la parte superior del solvente.
10. Debajo de una campana, seque la placa con la ayuda de un secador de pelo.
11. Rocíe la placa seca con reactivo de ninhidrina.
12. Seque las placas en horno de aire caliente a 105 ° C durante 5 min. [La ninhidrina reaccionará
con las manchas desvaídas de los aminoácidos y los hará visibles como manchas de color púrpura.]
13. Después de un tiempo, marque el centro de los puntos, luego mida la distancia del centro de los
puntos desde el origen y calcule los valores de Rf.

El valor de Rf se puede calcular usando la fórmula:

Los valores de Rf con disolvente de butanol-ácido acético-agua son los siguientes: alanina 0.24,
ácido glutámico 0.25, glicina 0.2, leucina 0.58, valina 0.4, lisina 0.58, tirosina 0.42.

Diferencias encontradas en un
laboratorio real:
En un entorno de laboratorio real, hay ciertos pasos importantes que no son necesariamente
aplicables en un laboratorio virtual.

1. Siempre use bata de laboratorio y guantes cuando esté en el laboratorio. Cuando ingrese al
laboratorio, encienda el extractor y asegúrese de que todos los reactivos necesarios para el
experimento estén disponibles. Si no está disponible, prepare los reactivos utilizando los
componentes que se muestran en la preparación de reactivos.
2. Se debe tener cuidado al manipular reactivos como el reactivo de Ninhidrina. Este reactivo es un
agente oxidante fuerte y no debe inhalarse ni derramarse sobre las manos u otras partes del
cuerpo. El derrame accidental de este reactivo causará sensación de picazón severa. Lave el área
derramada con agua fría e informe al asistente de laboratorio de inmediato.
3. Mantenga las placas de TLC a su lado. Asegúrese de no tocar la parte en desarrollo de la placa
TLC, ya que sus huellas digitales también se desarrollarán, lo que hará que el resultado no sea
claro.
4. Asegúrese de que las manchas aplicadas a la placa estén por encima de la superficie del disolvente
de elución.
5. Antes de aplicar el segundo punto, asegúrese de que el punto aplicado previamente esté seco.
6. Encuentra los componentes con el espacio adecuado en el medio.
7. Asegúrese de que la cámara esté saturada con el vapor de disolvente antes de colocar la placa de
TLC en ella.
8. Dé suficiente tiempo para que el solvente avance por la placa.
9. La parte superior del solvente no debe avanzar hasta o más allá del borde de las placas.
PREGUNTAS

1. ¡Cuáles son algunos criterios que deben tenerse en cuenta en la elección de

absorbente en una separación cromatográfica determinada?

2. ¿En qué consiste la cromatografía de CCD preparativa?

3. Usted tiene un compuesto impuro y quisiera saber cuántas sustancias están

contaminando su compuesto. Explique cómo lo haría utilizando cromatografía
de capa delgada o de papel.

4. Entregue un dibujo que presente los resultados obtenidos, los Rf

experimentales, los compuestos encontrados en el medicamento y un breve
comentario sobre los reveladores utilizados.

5. Investigue el nombre que reciben los reveladores de yodo y ácido sulfocrómico.

Porque?