Copia de CAPITULO 29 Transcripción

— Capitulo 29 TRANSCRIPCION 1. Papel det RNA en Ia sintesis proteica A. Induecién enzimatica B. RNA mensajero 2. RNA polimera: A. Estructura del enzima B. Uni6n al molde ©. Iniciacion de cadenas D. Elongacién de cadenas E. Terminacion de cadenas F. RINA polimerasas eucariéticas 3. Control de la transcripcién en procariotas A. Promotores B. Represor lac C. Represion de los catabolitos: un ejemplo de activacién génica D. Operén araBAD: controles positive y negativo por la misma proteina E. Operén trp: atenuacion F. Regulacion de la sintesis del RNA ribosémico: la respuesta severa 4. Procesamiento postranscripcional A. Procesamiento del RNA mensajero B. Procesamiento del RNA ribos6mico ©. Procesamiento del RNA de transferencia Existen tres clases principales de RNA, todas las cuales participan en la sintesis proteica: RNA ribo- sémico (FRNA), RNA de transferencia (tRNA) y RNA mensajero (mRNA). Todos estos RNAs se sintetizan en presencia de moldes de DNA, proceso conocido como transcripcién. La implicacién del RNA en la sintesis proteica que- do establecida al final de la década de 1930, gracias a las investigaciones de Torbjom Caspersson y Jean Brachet. Caspersson, utilizando técnicas microsc6pi- cas, descubrié que el DNA eucaridtico se encuentra confinado casi exclusivamente en el nticleo, mientras que el RNA se encuentra principalmente en el citosol. Brachet, que habia disefiado métodos para el fraccio- namiento de los organulos celulares, llego a conclu- siones similares basadas en andlisis quimicos directos. Encontré, ademas, que las particulas citosdlicas que contenian RNA son también ricas en proteinas. Am- bos investigadores observaron que la concentracién de estas particulas de RNA y proteina (que posteriormente serian denominadas ribosomas) se correlaciona con la velocidad de sintesis de protefnas por la célula, deduciendo entonces que existia una relacién entre el RNA y la sintesis proteica. Brachet lleg6 a sugerir que las particulas de RNA y proteina son el sitio donde tiene lugar la sintesis proteica ‘Se demostré la validez de la sugerencia de Brachet cuando, mediada la década de 1950, pudo disponerse de aminoacidos marcados radiactivamente. Poco tiempo después de inyectar una rata con un aminoaci do marcado, la mayor parte del marcaje que se habia incorporado a proteinas se encontraba asociado conRepicacion Transerieién ( Figura 29-1 EI dogma central de la biologia molecular. Las flechas Continuas indican los tipos de transferencia de la informacion genética que tienen lugar en todas las células. Las transterencias especiales se indican con las flechas discontinuas: la RNA polimerasa dirigida por RNA est presente en ciertos virus de RNA y en algunas plantas (donde su funcién es desconocida); la DNA polimerasa dirigida por RNA (transcriptasa inversa) esta presente en ‘otros virus de RNA; y la especificacion directa de DNA a proteinas es desconocida, pero no parece una posibilidad ajena al universo de lo posible. Sin embargo, las flechas erdidas son transferencias de informacién que el dogma ‘central postula que nunca tienen lugar: proteina: ‘especificando tanto DNA como RNA u otras proteinas. En otras palabras, jas proteinas sdlo pueden ser receptoras de ia informacion genética. (De Crick, F., Nature 227, 562 (1970),) os ribosomas. Este experimento establecié también que Ia sintesis proteica no se ve afectada directamente por el DNA debido a que, al menos en eucariotas, los ribosomas y el DNA no estén en contacto nunca, En 1958, Francis Crick resumia las ideas atin confu- sas sobre las relaciones entre DNA, RNA y proteina en un diagrama de flujo que él describié como el dogma central de la biologia molecular: el DNA dirige su propia replicacién y su transcripcién a RNA, el cual a su vez dirige su propia traduccion a proteinas (Fig 29-0. La utilizacion peculiar de la palabra “dogma”, una de cuyas definiciones es la de doctrina religiosa que no admite dudas para el verdade- ro creyente, tiene su origen en un malentendi- do, Cuando Crick formuld el dogma central, su ‘dea era que dogma significaba “una idea para la cual no existe una evidencia razonable’ Comenzamos este capitulo discutiendo experimentos que Hlevaron al esclarecimiento del papel central del mRNA en la sintesis proteica. Después estudiare- mos el mecanismo de transcripcién y su control en organismos procariotas. Finalmente, en la ultima sec- cin, consideraremos el procesamiento postranscripcional del RNA tanto en procariotas como en eucariotas. La traduccion es el tema que se trata en el Ca- pitulo 30, Capitulo 29. Transcripcién 909 1. PAPEL DEL RNA EN LA SINTESIS PROTEICA Las proteinas son especificadas por el mRNA y son sintetizadas en los ribosomas. Esta idea surgi6 del estudio de la induccién enzimética, un fendmeno por el cual las bacterias varian las velocidades de sintesis de enzimas especificos en respuesta a cambios ambienta- les. Veremos mas adelante que la induccién enzimatica es una consecuencia de la regulaciin de la sintesis de mRNA por proteinas que especificamente se unen a los moldes de DNA de los mRNAs. A. Inducci6on enzimatica E, coli es capaz de sintetizar un namero estimado de 3000 polipéptidos diferentes (Seccién 27-1D). Sin ‘embargo, existe una variacién enorme en las cantidades que se producen de estos diferentes polipeptidos. Por ejemplo, cada una de las diversas proteinas ribosomales puede estar presente en unas 10 000 copias por célula, mientras que el nimero de copias por célula de ciertas proteinas reguladoras (véase mas adelante) es por lo general inferior a 10. Muchos enzimas, particularmente aquellos que participan en funciones celulares basicas, denominadas ‘constituti- vas" (“housekeeping”), se sintetizan a velocidades mas o menos constantes; reciben la denominacién de enzimas constitutivos. Otros enzimas, denominados adaptativos o inducibles, se sintetizan con velocidades que varian en funcién de las circunstancias de la célula, Los enzimas del metabolismo de Ia lactosa son enzimas inducibles Las bacterias, como ha sido reconocido desde 1900, se adaptan a sus ambiente produciendo enzimas que metabolizan ciertos nutrientes, por ejemplo lactosa, nicamente cuando estas sustancias se encuentran disponibles en el medio. Si se cultiva E. coli en un ‘medio carente de lactosa, estas bacterias son en principio incapaces de metabolizar este disacirido. Para poder hacerlo requieren la presencia de dos proteinas: B-galactosidasa, que cataliza la hidrOlisis de lactosa a los monosacaridos que la compone1 CH,OH cH,OH HO 0. H 0. on H a H ou oH oH rn H H HOW Hon Lactosa B-Galactosidasa cH,on ' Hon HO O. on u O. on i . i oH HW oH " H HO HOH Hon Galactosa GlucosaM0 Seccién 29-1. Papel del RNA en Ia sintesis proteica y la galactésido permeasa (también conocida como lactosa permeasa; Seccion 18-4B), que transporta lactosa al interior de la célula. Bacterias E. coli crecidas en ausencia de lactosa contienen muy pocas molécu- las de estas proteinas. Sin embargo, pocos minutos después de la adicién de lactosa al medio, E. coli inctementa la velocidad de sintesis de estas proteinas en un factor de ~ 1000, y mantiene este ritmo hasta que la lactosa deja de estar disponible. La tasa de sintesis vuelve entonces a su escaso nivel original (Fig. 29-2). Esta capacidad para producir una serie de proteinas tinicamente cuando las sustancias que metabolizan se encuentran presentes permite que las bacterias se adapten a sus ambientes sin debilitarse sintetizando continuamente grandes cantidades de sustancias innece- sarias. La lactosa, o bien alguno de sus productos metabo- licos, debe disparar de alguna manera la sintesis de las proteinas ya mencionadas. Este tipo de sustancia ¢5 un inductor. El inductor fisiolégico del sistema de Ja lactosa, el isémero de la lactosa 1,6-alolactosa, CHOW oH, HO 0. on 0. On HW H OH OH oH OH H H HO HOH Hoon 1,6-Alolactosa aparece por la transglicosilacion ocasional de la lactosa por parte del enzima B-galactosidasa. La mayoria de los estudios del sistema de la lactosa utilizan iso- propiltiogalactésido (IPTG), cuon HO 0. s—C—-H iH i on HL Cie H HOW Isopropiitiogalactésido (IPTG) que es un inductor parecido en sit estructura a la alolactosa, pero que no es degradado por la B- galactosidasa. Los inductores del sistema de la lactosa estimulan también la sintesis del enzima tiogalactésido transacetilasa, que transfiere in vitro un grupo acetilo del acetil-CoA al grupo C(6)-OH de un B-tiogalactosido, como puede ser el IPTG. Sin embargo, el papel fisio- ogico de este enzima es desconocido, dado que en su ausencia la fermentacién de la lactosa tiene lugar de manera normal. Los genes del sistema Jac constituyen un operén Los genes que especifican las variantes silvestres de la B-galactosidasa, de la galactésido permeasa y de la tiogalactosido transacetilasa se designan respectivamente Z*, Y* y A’. El cartografiado genético de los mutantes defectuosos Z", Y y A~ indica que estos Eliminacion del inductor | Proteina Brgalactosidasa (ug) 10 2 30 40 60 6 70 8 Proteina bacteriana (wg) Figura 29-2 Cinética de induccién de la f-galactosidasa en E. coll. [De Cohn, M., Bacteriol. Rev. 21, 156 (1957).] genes estructurales Iac (genes que especifican poli- péptidos) se encuentran uno a continuacion de otro en el cromosoma de E. coli (Fig. 29-3; el cartografiado genético se revisa en la Seccién 27-1), Estos genes, junto con los elementos de control P y O, constituyen una unidad genética denominada operén, concretamente el operén lac. La naturaleza de los elementos de control se discutira mas adelante. El papel de los operones en la expresion génica procaristica se exa- mina en la Seccién 29-3. El represor Jac inhibe la sintesis de las proteinas del operén lac Una mutacién que provoca que las proteinas del ‘operén lac sean sintetizadas en grandes cantidades en ausencia de inductor proporcioné una importante pis- ta sobre la forma en que E. coli sintetiza proteinas. Esta mutacién, que corresponde a lo que se denomina una mutacin constitutiva, afecta a un gen, el gen I, que es diferente de los genes que especifican los enzimas lac, aunque se encuentra estrechamente ligado a ellos (Fig. 29-3). ¢Cudl es la naturaleza del producto del gen I? El problema fue resuelto gracias a Figura 29-3 Mapa genético del operén Jac de E. coll. Comprende a los {genes que codifican para las proteinas que median en el ‘metabolismo de a lactosa y a los sitios génicos que ccontrolan su expresién. Los genes Z, Yy A codifican, respectivamente, para la (-galactosidasa, la galactosido ermeasa y la tiogalactésido transacetilasa,z ssn : fo cer i do i bo i Nointcor o oo v9 Fgura 29-4 Demostracion do la existencia del represor lac através de aren do igalactosidasa en los merozigotos ttanstorio (dplodes parciales), formados por e! apareamiento de donantes Kir 1*2" con receptores ("ZF tambien resistente tanto al bacteriofago TS streplomicina, mientras que la cepa Hr era ‘senaible a estos agentes. Ambos tipos de cblulas fueron ‘rocdas y apareadas en ausencia do inductor. Después ‘ue hubiera pasado tempo sufiiente para la translerencia {e los genes ac, as céllas Hit fueron eliminadas ‘selectivamente por la adcion de estreptomicina y fago T6. En ausencia de inductor curva iferon, la sintosis [-galactosidasa comenzaba aproxmadamente tiempo que loa genes lag entraban on las collas F-, pero se detenia ~ 1 9 mas tarde. Si se aad el inductor poco tiempo después de la eliminacién de las donantes Kir esis Gel enzima continuaba ‘eblulas no inducidas no se Prgpactosicasa en ‘na percida itrinseca de la capacidaa de sintesis de este ‘enzima, sino que se dabia@ la produoclon de un represor ‘especticado por el gen *. [De Pardee, A.B, Jacod, F. y Monod, 0, J. Mol Biol. 1, 178 (1959) ‘un ingenioso experimento realizado por Arthur Par~ dee, Francois Jacob y Jacques Monod. Se aparearon, bacterias Hit, de genotipe 1'Z", con una cepa F- de genotipo [-Z-, en ausencia de inductor y al tiempo ‘que se registraba la actividad B-galactosidasa del cul- tivo (Figura 29-4; el apareamiento bacteriano se des- caibe en la Seccién 27-1D). Al principio, como era de esperar, mo se registraba actividad B-galactosidasa, debido a que las bacterias donantes Hit carecian de inductor y las receptoras F- eran incapaces de producir la actividad enzimatica (los puentes citoplasmati- ‘cos que conectan las bacterias que se aparean perm ten nicamente el paso del DNA). Pero, aproximadamente I h tras el comienzo de la conjugacion, cuando los genes 1°Z" justo comenzaban a entrar en las célu- las F-, comenzaba la sintesis de B-galactosidasa, que sélo se detenia aproximadamente una hora despues. La explicacion para estas observaciones es que el gen. Z: donado, tras entrar en el citoplasma de la célula I", dlirige la sintesis de la B-galactosidasa de una forma constitutiva, Solo cuando el gen I" ha tenido tiempo suficiente para expresarse comienza a ser capaz de ejercer su efecto represor sobre la sintesis de B- CCapttlo 28, Tanscripcién 941 galactosidasa, En consecuencia, el gen I* debe dar lugar 4 un producto difusible, el represor lac, que inhibe la sintesis de la B-galactosidasa (y de las otras proteinas lac). Inductores ‘como el IPTG inactivan temporal- mente al represor lac, mientras que las células sintetizan los enzimas lac de forma constitutiva debi- ddo a que carecen del represor funcional. El represor lac, como veremos en la Seccion 29-38, es una protei- B. RNA mensajero La naturaleza de la molécula diana del represor lac fue deducida en 1961 por Jacob y Monod utilizando tun potente andlisis genético. Existe un segundo tipo de mutacion constitutiva en el sistema de la lactosa, denominado O° (por operador constitutivo), que se- jgun los analisis de complementacién es independiente del gen J, Esta mutacion esté situada entre los genes I'y Z (Fig. 29-3). En la cepa diploide parcial F (OZ: /FO°2", la actividad B-galactosidasa es inducible por IPTG, mientras que una cepa O°Z" /FO'Z: sintetiza el enzima de forma constitutiva (en las bacterias F, cl factor plasmidico F contiene un segmento del cro- ‘mosoma bacteriano, en este caso una parte del operin lac; Seceion 27-1D). Un gen O”, por tanto, slo es capaz (a) hasencla de inductor om ~~) [+ overén ac ———~ ‘rgdendo la varsereen dd opatan ae Sg ae ‘© = Tenn a ‘nn Sct omen Breboty mm Powe 08 Expresion del operén lac. () En ausencia de inductor Fepresor, producto det gon, se une al operador impiciendo la tanscripcion del operén la. (2) Tras la union al inductor, €l represor so disocia del operador, Io cual permite la trangeripoon y la posterior waduccién de los genes fetructueles Gel operén lacill Begs eie1RNA y las proteinas fagicas de nueva sintesis. Gran parte del RNA marcado con *P se encontraba asociado, como se habia predicho para el mRNA, con los ribosomas ‘pesados’ preexistentes (Fig. 29-6). De la misma manera, las proteinas marcadas con ™S se encontraban asociadas de forma transitoria con los ribosomas, y por tanto eran sintetizadas por ellos. Sol Spiegelman desarrollé la tecnica de hibridacion RNA-DNA (Seccién 28-3A) en 1961 para caracterizar el RNA sintetizado por E. coli infectada con T2. En- contro que este RNA derivado del fago hibrida con el DNA de T2 (Fig. 29-7), pero ni lo hace con el DNA de ‘élulas de E, coli no infectadas, ni con DNAs de fagos zo relacionados. Este RNA, por tanto, debe ser com- plementario al DNA de T2, de acuerdo con la predic- ion de Jacob y Monod; esto es, el RNA especifico del fago es un RNA mensajero. Los estudios de hibrida- cidn demostraron también que los mRNAs de células E.coli no infectadas son complementarios a parte del DNA de E. coli, De hecho, ottos RNAs, como el RNA de transferencia y el RNA ribosémico, poseen sus correspondientes ‘secuencias complementarias en el DNA del mismo organismo, En consecuencia, todos los RNAs celulares se transcriben a partir de moldes de DNA. 2. RNA POLIMERASA La RNA polimerasa, el enzima responsable de la sintesis de RNA dirigida por DNA, fue descubierta independientemente en 1960 por Samuel Weiss y Jerard Hurwitz, El enzina une entre silos ritonucleési- dos trfosfato ATP, CTP, GTP y UTP, utilizando moldes de DNA, en una reaccién que es posible gracias a la liberacion e hidrblisis posterior de PP, (RNAs ees + NTP == (RNAs ot sats Nuclessido “rifostaco +PP, ‘Todas las células contienen RNA polimerasa. En las bacterias, una variedad de este enzima sintetiza todos los RNAS celulares exceptuando los cortos cebadores utilizados en la replicacién del DNA (Seccién 31-1D), ‘Varios bacteridfagos sintetizan tambien RNA polimerasas que s6lo producen RNAs especificos de fago. Las células eucarioticas contienen cuatro 0 cinco RNA. ppolimerasas, cada una de las cuales sintetiza una clase diferente de RNA. En esta seccién consideraremos primero las caracteristicas del enzima de E. coli debido a que es la RNA polimerasa mejor caracterizada; ‘otras RNA polimerasas poseen propiedades similares. Finalmente consideraremos los enzimas eucarioticos. A. Estructura del enzima La también denominada holoenzima de la RNA polimerasa de E, coli es una proteina de unos 480 KD con una composicién de subunidades «,06'6. Sin em- Capitulo 28. Transcripcin 913 bargo, una vez que ha comenzado la sintesis de RNA Ja subunidad 0 (también denominada factor 0) se separa del néicleo del enzima, o,)8', que es la estuc- tra que realmente lleva a cabo el proceso de poline- rizacion (véase mas adelante). La subunidad f’ contiene dos atomos de Zn, que se piensa que partici pan en la funcion catalitica del enzima, El enzima Activo requiere también de la presencia de Mg" La estructura de la RNA polimerasa de E.coli ha sido determinada hasta una resolucion de ~ 27 A por el andisis de microscopia electronica de cistales bid mensionales de esta proteina que fueron ablenidos sobre capas lipidicas cargadas positivamente. La for- ta del enzima es iregular, de ~ 100 x 100 x 160 A, Su caracteristica mas notable es una proyeccin digit forme que rodea un canal ciindrico que tiene un dismetro de ~ 25 A y una profundidad de 55 A. Esta estructura tiene las dimensiones adecuadas para la union del DNA bihelicoidal. Existe una similtud sig- nifcativa entre este canal y la hendidura de unin al DNA detectada en la estructura de rayos-X del fragmento mayor (Klenow) de la DNA polimerasa I de E Coli (Fig. 31-10). El canal posee un tamafo suficiente para acomodar unos 16 pares de bases de B-DNA, lo {ue no es suficente para explicar los 50 a 60 pares de bases de B-DNA que se sabe que se encuentran aso ciados simultaneamente a la RNA polimerasa durante Ia transripcion. Este segmento de B-DNA de ~ 170 2s 2 a aos - oO eee Fura 287 Hibrdacién de RNA marcado con ®°P producido por céulas {de E, coll infectadas con T2, con el DNA do 72 marcado ‘80n SH. Como consecuencia dela desintegracion ‘adactiva. el =P y 01 *H emton parveulas f con ener Caracteristicas diferentes, de forma que ambos is6topot ‘bueden ser detectados de manera independiente. A pes {de que el RNA libre (izquierda) en un gradiente de ‘densidad de CsCi es mas denso que el ONA, gran parte ‘dol RNA bandea con ol DNA (derecha). Esto indica que los ‘dos polinyledtidos han hibridado ene ellos, y que por tanlo gus secuencias son complementaias. [De Hall B.D. y Spiegelman, S., Proc. Natl. Acad. Sol. 47,181 (1961)promotoras varian considerablemente respecto de la secuencia consenso (Fig. 29-9). No obstante, una mu- tacién en una de las regiones parcialmente conserva das puede incrementar o disminuir enormemente la eficiencia de iniciacion del promotor afectado. Las velocidades de transcripcion de los genes, que cubren un rango de tres érdenes de magnitud, varfan directamente con ta velocidad de formaciOn de complejas de iniciacion stables de sus promotores con el holoenzima La iniciacion requiere la formacién de un complejo abierto Las regiones promoioras en contacto con ¢l holoenzima han sido identificadas determinando las posicio- res en las que la union modifica la susceptibilidad det DNA a la alquilacién con reactivos como el dimetil sulfato (DMS). Este procedimiento recibe el nombre de anilisis de huellas (‘footprinting’, Seccién 33- '3B). Estos experimentos demostraron gue el holoen: ‘ma contacta con el promotor solamente alrededor de la caja de Pribnow y de la region de ~35. Los modelos indican que estos sitios protegidos se encuentran ambos sobre el mismo lado de la doble hélice, lo cual sugiere que la RNA polimerasa se une a una sola de las caras del promotor bihelicoidal. EI DMS, ademds de metilar los residuos G en la posicion N(7) y los residuos A en la posicion N@) (Geccién 28-68), metila también el N(1) de las A y el N@) de las C. Sin embargo, dado que estas altimas posiciones participan en las interacciones que tienen lugar en el apareamiento entre bases, sélo reaccionan Capitulo 29, Transripcién AS con el DMS cuando el DNA se encuentra en forma de cadena sencilla. Esta metilacion diferencia del DNA segan este en forma de cadena sencilla o doble pro pporciona una prueba sensible pata la separacion, 0 usin (‘melting’), de las hebras de DNA. Los anliss de huellas indican que la unién del holoenzima “fun~ de" (en el sentido de que desenrola a la doble hélice Separando las cadenas) al DNA en una region de l'bp que se extiende del centro de la caja de Prionov hasta justo despues del sitio de iniciacion (posicicio- res -9 a +2), La necesidad de formar este “complejo abierto” explica por qué la eficencia del promotor fiende a disminulr conforme aumenta el nimero de pares de bases G -C en la caja de Pribnow; probable. zrente esto aumenta la difcultad para abrir la doble hélice en la forma necesaria para la iniiacion de la cadena (vale Ia pena recordar que los pares GC son ‘mis ftertes que'los pares AT) El nicieo del enzima, que no se une al promotor de ‘manera especifica, se une estrechamente al DNA catenari (la constante de disociacion del complejo es KS 5 x 10-"M y su vida media es ~ 60 min). El holoenzima, al contrario, se une al DNA no promoter comparativamente muy suelto (K ~ 10-’M y vida ‘media > 1's). Aparentemente, la subunidad o perm te que el holoensima se desplace rapidamente a lo largo de una hebra de DNA buscando el promotor correspondiente & la subunidad o de que se trate. Una ‘vez que se ha iniiado la transcripcion y la subunidad G ha sido desechada, la fuerte union entre el nicleo del enzima y el DNA estabiliza aparentemente el ‘complejo texnario enzima-DNA-RNA. Opersn Region de Cala de Pritnow sito de (eaién de 10) _inicacén ¢+1) lec ACCCCAGSOTTTAGACTATGeTrcceccTCGTATeMTGTercéAATTaTGAGcas lel COATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTC slp) APPTATTCCATGTCACACTTTCOCATCTTTGTPATGORATGGTTATITCATACCAT tmBAD GGATCCTACCTGACGOTTTTTATCGCAACTCTCTACTGRTTCTCCATACCCGTTTTT GC GCCGTGATTATAGACACTITTGTTACGCGTTTTTGTCATGGCTTTGETCCCGCTTTG tp _ AAATGAGCTOPTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTA, bled TTCCAAAACGRGMTTPTGMGTTAATTCOOTOTAGACTTOTAAACCTAAATCTTTT bob CATAATCGAGTTGTAAAGCAAATTGAAAAGATTTAGGTITACAAGTCTACACCGAAT IRA CAACGTAACACTITACAGCEGCGCGTCATTTGATATGATGCOCCCCOCTTCCCAATA rmDI_ CAANANAATACTTGTGCAAAAAATTOGGATCCCTATAATGCGCCTCCGTTGAGA TmBI CAATTTTTCTATTECGGCCTGCGGAGAACTCCCTATAATOCGCCTCCATCGACACGG imal _ AAAATAAATGOPPGACTOTOTAGCOGGAAGOCOTATTATGCACACCOOGCECCGOTS Sito de Resin de 06 ala de Peitnow Ineiacn Secuencia ps MM TCETACUANTT:... 11-18 bp on PA RUATIAN «5-8 bp +i consenso: 49-95 82 64 19 G4 69 45 41 79 95 48 59 51 96 ‘ Figura 28-8 ‘Seouencias de nucedtidos de la hebra no codiicante de promotores de Ecol seleccionados. La cala de Pritnow {combroado rojo), que os una region de 6 bp centrada ‘alrededor oe la posiion ~10, y una secuencia de 8 a 12 bp sitvada sobre la region de ~85 (sombreado azu) estan ‘onservadas. Los sitios de iniiacion dela transcripcion (G1), que en muchos promotores estan representados por un Unico nucletido de purina, estan sombreados en verde. {La pant inferior de i figura muestra la secuencia, ‘consenso de 112 promotores, con el porcentale de ‘aparicion debajo de cada base. [De Rosenberg, M. y Court, D,, Annu. Rev. Genet. 19, 921-829 (1979). La sscuencia ‘consenso esta tomada de Hawley, D.K. y McClure, WA, ‘Nucleic Acids Res. 11, 2244 (1988)@ NON: | on 1 ee fe Lae le = om [on pref my Capitulo 28. Transcripcion 917 Ny ee \ Lon fox oa }-on Crecente 8° 3 a i ee rN on ox fon bow on Low Fo . |- OH — iN ‘OH + PP, wo | om “|. on od, crite $8 Figura 20-10 Las dos posibles formas de crecimiento dela cadena de FRNA: (a) por la adcion de nucledtidos al extrema 3 sintesis de RNA, de manera que la cadena con sentido pueda ser transcrita a su hebra de RNA complementaria, Durante este proceso, la cadena de RNA forma cortos segmentos bicatenarios hibridos RNA-DNA, ‘aunque solo de manera transitoria, Esto se deduce de la observacion de que la transcripcion deja intacto al DNA bicatenario original, con Ia liberacion de RNA de cadena sencilla. La “butbuja’ de DNA no apareado de los complejos de iniciacion abiertos se desplaza aparentemente a lo largo del DNA junto con la RNA. ppolimerasa. Esto podria ocurrir de dos maneras (Fig 29-11): 1. Sila RNA polimerasa acompaia a la hebra molde en su ruta helicoidal alrededor del DNA, éste no ganara mas superhelicidad debido a que l duplex de DNA nunca sera desenrollado en mas de una vuelta, Sin embargo, el transcrito de RNA se enro- lard en tomo al DNA, una vez por cada vuelta del duplex. Este modelo no es posible debido a que no parece probable que la marana de DNA y RNA sea deshecha de manera sencilla. EI RNA no se desen- rollaria espontaneamente en un tiempo razonable del largo DNA, a menudo en forma circular, y no existen topoisomerasas conocidas que aceleren este proceso. 2. Si la RNA polimerasa se desplaza en linea recta ‘mientras que es el DNA el que rota, entonces el RNA y el DNA no se enredaran. En lugar de ello, las vueltas de hélice del DNA serin empujadas hada adelante de Ja burbuja de transcripcion en movimiento, de forma que el DNA situado por delante de la burbuja quedara entollado mas fuer- temente (cosa que promueve el sobreentollamiento (0) por la adion de nuctestidos a extremo 5’ La ANA ppolimerasa cataliza ia primera reaccién, ppositivo), mientras que el DNA situado por detras de la burbuja sera desenrollado de forma equivalente (y esto promueve el sobreenrollamiento negativo; obsérvese que el ntmero de ligamiento del DNA completo permanece inalterado). Este modelo esta apoyado por las observaciones de que la ‘transcripeién de plasmidos en E.coli mutantes para Ia girasa (incapaces de relajar sobreenrollados po- sitivos; Seccién 28-5C) genera plismidos sobreenrollados positivamente, mientras que un experi- ‘mento similar en mutantes para la topoisomerasa T incapaces de relajar sobreenrollados negativos) ‘genera plasmidos sobreenrollados negativamente, Cualquiera que sea el caso, cabe resaltar que una superhelicidad inadecuada detiene la transcripcion (Geccion 28-5C), Quizas la tension torsional en el DNA, generada por la superhelicidad negativa detras de la burbuja de transcripcion, es necesaria para im- pulsar el proceso de transcripcidn, mientras que si esta tension es excesiva impide la apertura y el man- tenimiento de la burbuja de transcripcion. La transcripcién tiene lugar de manera rapida y precisa La velocidad de transcripcion in vivo es de 20 a 50 nucledtidos/s a 37 °C, tal y como lo indica la velocidad de incorporacién al RNA de nucledsidos marca dos con ‘H (las células son incapaces de incorporar rucledsidos trifosfato del medio). Una vez que una ‘molécula de RNA polimerasa ha iniciado la transcripion y se ha desplazado del promotor, otra RNA. ppolimerasa puede ocupar su lugar. La sintesis de RNAs que son necesarios en grandes cantidades, por918. Seccién 29-2. RNA polimerasa RNA rcierte e— 3) Figura Elongacion de la cadena de RNA por la RNA polimerasa. En la region que esta siendo transcrta, la héice de DNA es desenraliada en aproximadamente una vuelta, para posibiltar que fa hebra oon sentido dal DNA forme un corto ‘Segmento de doble nélce hora DNA-ANA con el extreme 3 dol RNA. A medida que la RNA polimerasa avanza sobre ‘21 DNA moide (on la figura, hacia la derecha), el DNA se. ‘esenralla por delante dol extromo 3" en crecimiento det NA, y se vuelve a enrolar por detris, donde desplaza ‘al RNA recien sintetizado dela hebra con sentigo (2) Una forma de realizar este proceso poctia ser que la RNA polimerasa siguier la ruta mareada por la hebra con Sentido a fo largo dela doble helice de DNA, con to qu ejemplo los RNAs ribosbmicos, s¢ inicia tantas veces como las restricciones estéricas lo permiten, aproximadamente una vez cada segundo (Fig. 29-12) a frecuencia de errores en la sintesis de RNA, cestimada a partir del analisis de transcritos de moldes sencillos como polid(A7)] polifd(AT)}. es de una in- corporacion de base erronea por cada ~ 10 transcri- tas. Esta tasa es tolerable debido a la transcripcion repetida de la mayoria de los genes, porque el codigo genético contiene numerosos sindnimos (Seccion 30- TE), y debido también a que las sustituciones de amindacidos en las proteinas son a menudo inocuas desde el punto de vista funcional Los agenies intercalantes inhiben tanto las RNA como las DNA polimerasas. La daunomicina y Ia adriamicina, dos moléculas estrechamente relacionadas que son valiosos agentes quimioterapéuticos en el tratamiento de ciertos cin- ceres humanos, se unen especificamente al DNA bicatenario de manera que inhiben tanto su trans ‘cripcién como su replicacién. Se supone que estos, antibi6ticos actian interfiriendo el paso tanto de la RNA como de la DNA polimerasa, La estructura crista~ lina de rayos-X de un complejo de daunomicina con el NA owners a Suu ae ‘romero Seed, —— transcrito acabaria envoiviendo al ONA una vez por cada ‘ueita det diplex. (6) Una sogunda posbiidad, mas plausible, es que el RNA se desplace en linea recta al tiempo que el ONA gjra por debalo. En este caso, el RNA, no se onrollriaalredecar del DNA, sino que el DNA ‘tuado por delante de la burbuja de tanscripcion se Sobreenrolaria a medida que esta va avanzando, y so ia ‘esenrollando por detras (consisérese por ejempio e! tfecto que tendria colocar los dedos entre ias hebras entrelazadas del DNA, y de moverios hacia la derecha) ‘modelo supone que Ios extremos del DNA, asi como ls FRNA polimerasa, no pueden rotar debido @ que estén Unidos a puntos interores de la célua (Darras negra). (De Futcher, B, Trends Genet. 4, 271,272 (1988) hexanuclestide autocomplementario d(CGTACG) revela que el sistema plano de anillos aromaticos de la daunomicina (anillos B-D) se encuentra intercala- do entre los pares G-C a ambos lados del fragmento bihelicoidal (Fig, 29-13). El anillo A, no plano, se extiende hacia el surco menor, donde sus grupos laterales estabilizan el complejo a través de interac ciones de puentes de hidrogeno con el DNA.Figura 29-12 Microgratia electenica y su dlagrama interpretativo de dos {genes ribosomicos contiguos de E. col en proceso de anseripeion. Las estructuras de ‘cabeza de lecha” surgen ‘como consacuenela de los tamarios recientes de las La actinomicina D g i mmf * {a Rabe wea fu Ge He en es et fit Gl “ey suri Hcy = 7 etek wef OP mT ‘ny du, mig =o ot ch, pp on ae nd Ne wy Sony feo ont gu-fx me aon bx, aN Gti é. 0 Nig sistema de [ nis de laters o ‘0 Gh bit Aetinomicina es un antibidtico producido por Streptomyces antibioti- cus, y es tambien un potente inhibidor de la sintesis de dcidos nucleicos. Actia intercalando su anillo de Capitulo 29. Transeripcién 919 tector ste oe ram? ae AN Sta de serninason sted ‘cadenas de RNA naclentes a medida que las moléculas de NA polimorasa que las sintetizan se desplazan hacia el Sito de terminacion desde el sito do inico de la transeripcion on el DNA. [Cortesia de Oscar L. Miler, J. Universidad de Virginia) fenoxazona entre dos pares sucesivos G -C del DNA Dicatenario, de una forma similar a la de la daunomi- ina. Esta interaccién se ve estabilizada a través de contactos especificos con la doble hélice, establecidos por los dos grupos ciclicos pentapeptidicos idénticos, de composicion poco habitual, de la molécula de actinomicina, Otros agentes intercalantes, como el etidio y la proflavina (Seccién 28-4C), por ejemplo, también inhiben la sintesis de dcidos nucleicos, probablemente a través de un mecanismo similar. E, Terminacién de cadenas Las micrografias electrénicas como la de la Fig. 29-12 sugieren que el DNA contiene sitios especificos fen los cuales se detiene la transcripcion. Las secuen- ‘das de terminacién de la transcripcion de varios ge~ nes de E, coli comparten dos caracteristicas (Fig, 29- Vay 1. Una serie de 4 a 10 pares A. T consecutivos, con la ‘A sobre la cadena molde, El RNA transcrito acaba dentro o justo después de esta secuencia. 2, Una region rica en G + C con una secuencia palin dromica (de simetria doble) que precede inmedia- tamente a la serie de pares AT. El transcrito de RNA de esta region puede por tanto, formar una estructura autocomplementaria, de “hor- ‘quilla’, que acaba en varios residuos U (Fig. 29-14) La estabilidad de una horquilla terminadora rica en G+ Cy el débil aparcamiento entre las bases de su cola oligertD y el molde de DNA parecen ser factores importantes a la hora de asegurar una terminacién correcta de Ja cadena, De hecho, los estudios de modelos han.@ Region lea Region rea enG-C enAT. 5 -++ NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCTTEPPTNNN ++ 3 s+ NNTP CGCGGENNNNGGCC NNAAGCGCCaNNNNECGGeECUUULUU-O Figura 29-14 Secuoncia de bases de un hipottico terminador fuerte (Gliciente), deduoda de las secuencias do varios ttansentos, (a) La secuercia de DNA completa con su correspondiente RNA, Las secuoncias reas en AT y en G-C se muestran en azul y en roo, respectivamente. EI Coble eje do simetria(simbole lenticuan esta relacionado dado a conocer que tuna secuencia oligo(dA - rU) forma una hélice hibrida particularmente inestable, mientras que una oligo(4A - dT) forma una hélice de ‘stabilidad normal. La formacion de la horquilla rica en. G + C provoca que la RNA polimerasa interrumpa su avance durante unos segundos en el sitio de termina- ion, Se ha propuesto que esto induce un cambio conformacional en la RNA polimerasa, lo cual permi te que la hebra no codificante del DNA desplace la union debil de la cola oligo(U) de la hebra molde, acabando por tanto la transcripcion, La observacion de que mutaciones que modifican la fuerza de estas asociaciones reducen la eficiencia de terminacion de cadenas y a menudo la eliminan es consistente con esta idea, La terminacién tambien disminuye cuando la transcripcion in vitro se lleva a cabo zeemplazando el GTP por inosina trifosfato (ITP). on On Inosina tritostato (ITP) Los pares I- C son mas débiles que los pares G-C, dobido a que la base hipoxantina de la 1, que carece del grupo 2-amino de la G, s6lo es capaz de establecer dos puentes de hidrégeno con la C, por lo que disminuye la estabilidad de la horquilla. La sustitucion del UTP por 5-bromo-UTP tambien disminuye la terminacion de cadenas, debido a que el SBr-U forma pares de bases mas fuertes con la A que los que forma el U, ‘por Io que inhibe el desplazamiento del RNA nacien” te de la hebra molde del DNA. GAAAAAANNN +++ Capito 29. Transcripcin 921 ” eNy N Neo Ged c.g 8 wotge cee de DNA ea ‘Transento ce de RNA Co Aeu Aeu -oNNNN' * “UUUU-on 3 on os segmentos sombreados tlanqueantes que forman luna repeten invertiga. (0) Estructura de norqulla en el FRNA y la cola de pollU) que cspara la terminacion de la ‘ranscripcion. [De Pritnow, D., an Goldberger, RF. (Ed), Biological Regulation and Development, Vol. 1, p. 253, Plenum Press (1979), La terminacion requiere a menudo de la asistencia del factor rho Las secuencias de terminacién antes indicadas indu- cen la terminacién espontinea de la transcripcion. Sin ‘embargo, existen otros sitios de terminacién que carecen de similitudes obvias con éstas, y que son incapaces de formar horquillas fuertes; estos sitios requieren la participacion de una proteina conocida como factor rho para la terminacign de la transcripcién. La existen cia del factor rho fue sugerida por la observacion de gue los transcritos in vitro son a menudo mis cortos, gue los correspondientes transcritos in vivo. El factor ho, un hexamero de subunidades idénticas de 419 residuos, aumenta la eficiencia de terminacion de los transcritos que terminan de manera espontinea, asi como también induce la terminaciOn de transcritos que no terminan de manera espontinea. Existen varias observaciones clave que han levado un modelo de la terminacién dependiente de rho: 1. El factor tho es un enzima que cataliza el desonro- amiento de dobles hélices formadas por RNA- DNA 0 por RNA-RNA. Este proceso recibe su energia de la hidrolisis de nucledsidos trifosfato (NTPs) a nucledsidos difosfato + P,, con poca pre- erencia por la identidad de la base hidrolizada, La actividad NTPasa es necesaria para la terminacién dependiente de tho, tal como lo demuestza la inhi- bicion in vitro de la terminacién cuando se sustitu- yen los NTPs por sus cortespondientes andlogos Bry-imido, °° eed [Bese] “0—P—NH—P-0-P 0-H, aaa a o 8 6 ee i oH on iyinido nuclesatde tifosfato922 Seccidn 29-2, RNA polimerase que son sustancias que pueden ser utilizadas como sustrato por la RNA polimerasa pero que no pueden ser hidrolizadas por el factor tho. 2. Las manipulaciones genéticas indican que la terminacion dependiente de rho requiere la presencia de tuna secuencia de reconocimiento especifica situada hacia 5° del sitio de terminacién, La secuencia de reconocimiento debe estar situada sobre el RNA. naciente, en lugar de sobre el DNA, tal y como lo. demuestra el que tho sea incapaz. de terminar la transcripcion en presencia de RNasa A, Las caracteristicas esenciales de este sitio de terminacién no han sido alin determinadas completamente: 1a construccién de sitios de terminacién sintéticos indica que estin compuestos por entre 80 y 100 nuclestidos, sin estructura secundaria estable y que probablemente contienen multiples regiones seas en C. Estas observaciones sugieren que el factor tho se une al RNA naciente por su secuencia de reconocimiento, y que entonces migra en direccién 5° —» 3° hasta que ‘encuentra a la RNA polimerasa, detenida en el sitio de terminacién (sila RNA polimerasa no se detuviera, rho seria incapaz de alcanzarla). Alli, rho desenrolla el segmento bicatenario RNA-DNA formado en la burbuja de replicacién, por lo que acaba liberando el transerito de RNA. La existencia de estos sistemas de terminacion (la espontanea y la dependiente de rho) plantea la cues~ tion de cual es la funciOn o la ventaja de poseer un sistema dual de terminacion de este tipo. Una posibi- Hidad es que el factor tho distingue los mRNAs que estan siendo traducidos activamente de aquellos que se encuentran relativamente libres de ribosomas (cabe recordar que los ribosomas se unen a los mRNAS nacientes poco tiempo después de la iniciacién de st transcripeién), y que por tanto hace que la traduccion, continuada del mRNA naciente sea dependiente de st utilizacién funcional. Se piensa que muchos genes contienen sitios latentes de terminacion dependiente de rho, que solo son accesibles al factor si el mRNA se tencuentra libre de ribosomas. Cuando los nutrientes eescasean, la velocidad de sintesis de proteinas se ve necesariamente disminuida, y esto implica que los bosomas se encuentran distribuidos de manera mas ddispersa sobre los mRNAs. En estas cizcunstancias, el factor rho terminaré la transcripcion de los transcrtos incompletos por sus sitios latentes, consezvando asi Jos recursos energéticos que de otra forma serian, consumidos en la sintesis de estos mRNAs poco utilizados. F. RNA polimerasas eucariéticas El nicleo eucaridtico contiene tres tipos de RNA poli- rmerasas, que difieren en los RNAS que sintetizan: 1. RNA polimerasa I, localizada en el nucleolo (cuerpos granulares densos del nucleo que contie- ren los genes ribosomales; Seccién 29-4), sintetiza los precursores de la mayoria de RNAS ribosd- 2, RNA polimerasa IL, que esta situada en el nucleoplasma, sintetiza los precursores del mRNA y de ciertos RNAs pequenios nucleares estables. 3. RNA polimerasa III, que también esta presente en el nucleoplasma, sintetiza los precursores del RNA ribosomico de 5S, de los tRNAs y de una variedad de otros RNAS pequenos nucleares y citosélicos. ‘Ademis de estos enzimas nucleares (que también son conocidos como RNA polimerasa A, B y ©), las células eucariéticas contienen RNA polimerasas mitocondriales y de cloroplastos que son indepencientes. ‘Las RNA polimerasas eucarioticas tienen masas moleculares comprendidas entre 500 y 700 KD, y se ‘aracterizan por poser una composicion de subunidades de una complejidad extrema. Cada tipo de enzima contiene dos subunidades ‘grandes’, no idén ticas, de masa superior a los 100 KD, ademés de un conjunto de hasta 12 subunidades “pequenas” dife rentes, de pesos inferiores a 50 KD. Algunas de las subunidades pequenas esta presente en 2 0 en las 3 RNA polimerasas nucleares. Hasta el momento s° conoce poco acerca de sus funciones 0 de las intrac- clones que establecen, pese a que, cutiosamente, las subunidades mayores de las RNA polimerasas I IL de la levacura presentan una gran homologia entre ellas y con la subunidad mayor (B}) de la RNA polimerasa de E.coli RNA polimerasa It Es el enzima eucari6tico que transcribe los genes que especifican proteinas y también algunos peque- os RNAs nucleares estables. La RNA polimerasa Il de la levadura posee una masa molecular de ~ 550 KD, y contiene 10 subunidades diferentes. Las tres subunidades mayores son homologas a las subunidades B, B’ y a de la RNA polimerasa procaristica, y por tanto se piensa que constituyen el nucleo estructaral y funcional del enzima, Existen otras tres subunidades «que tambien estan presentes en las RNA polimerasas Ty Ill Tres de las cuatro subunidades que restan no son esenciales para la viabilidad de la levadura, aun- {que se piensa que intervienen en el ajuste fino del aparato de transcripcion, Es interesante que una de ‘estas subunidades no esenciales posee un segmento de 102 residuos que es idéntico en un 30 % a un segmento equivalente en el factor 6 predominante en los procariotas, el factor o®, Las secuencias de las, subunidades de la RNA polimerasa Il de otras espe cies eucarioticas revelan que casi un 40 % de los aminodcidos que las componen se mantienen invaria bles, La subunidad mayor de la RNA polimerasa II con: tiene un dominio repetido no habitual, que no esta presente en otros tipos de RNA. polimerasas. Este dominio carboxilo terminal, CTD (de “carboxy-terminal domain’) 0 “cola”, esta compuesto por repeticiones en tindem de la’ secuencia consenso de 7 tesiduos Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser, Este hepta~ péptido esta repetido 52 veces en el raton, 45 veces en. Drosophila y 26 0 27 veces en la levaduraS. cerevisiae. Evidentemente, el nimero de estas repeticiones en un CTD varia con la complejidad del organismo que lo produce. La naturaleza repetitiva del CTD y su gran ‘numero de residuos Pro sugiere que adopta una con- formacién no habitual que no contiene ni helices a ni laminas B, Las mutaciones que eliminan todo el CTD ‘una gran parte de él en el ratén o la levadura, o que climinan de forma importante su naturaleza repetiti- vva, son letales. En consecuencia, parece que el CTD tiene un papel esencial en la transcripcion o en unit algun otro proceso al aparato de transcripcién, aun- ‘que la naturaleza de este papel esencial sigue siendo, Pura conjetura Fl promotor de la RNA polimerasa I esti formado por regiones de control imbricadas El promotor de la RNA polimerasa I ha sido identificado determinando las velocidades de transcripeién de una serie de genes de sRNA mutados de Xenopus laevis (una rana africana). Las mutaciones de estos genes consistian en deleciones cada vez mas largas ‘que comenzaban o bien en su extremo 5” 0 bien en el 3°. (No es posible deducir el promotor de la RNA polimerasa Ia partir de las homologias de secuencia fe los genes transcritos por el enzima ya que, como vveremos mas adelante en la Seccion 29-4B, solo existe un tipo de gen de rRNA.) La expresion optima del FRNA hace necesaria la presencia del segmento del gen de tRNA que se extiende desde la posicion ~142 hasta la +6, Sin embargo, la minima secuencia de bases necesaria para que la iniciacion sea precisa est comprendida entre los nucleotides -7 y +6. Parece tentonces que este altimo elemento del promotor actia guiando a la RNA polimerasa Ia su sitio correcto de iniciacion, mientras que el resto del promotor ac Ovoalbimina e poo ‘Tarlo de aadenovirus Bectobina de cone Principal Pslobina de ratsn ToAnTaAst Ant Figura 20-15, Secvencias do los promotores de gones estructuralos seleccionados de eucarotas. El segmento homologo, a Caja TATA, esta sombreado en rojo, con la base de la posicién ~27 subrayada y el nuclebtido inci que sera transento (+1) sombreado en verde, La fla inferior indica la GcoecraTadsacacacreccct Capitula 28, Transcripcion 923, ta uniendo proteinas conocidas como factores de transcripcién (véase mas adelante). Los promotores de la RNA polimerasa I son complejas y diversos Los promotores reconocidos por la RNA polimerasa Il, que son considerablemente mas largos y diver sos que los de los genes procaristicos, han sido hasta el momento sélo superficialmente descritos. Los ge nes estructurales que se expresan en todos los tejidos, también denominados ‘constitutivos’ ("housckee ping’, en inglés), se piensa que son transcritos de forma constitutiva, Estos genes poseen una o més copias dela secuencia GGGCGG 0 de su complementaria (la eaja GC) situadas hacia 5’ de sus inicios de ‘ranscripcion, El analisis de deleciones y de mutacio- res puntuales en virus eucariéticos como el SV40 indica que las cajas GC actian de manera ansloga a los promotores procariditicos. Por otra parte, los genes estructurales que se expresan de manera selectiva en luno 0 pocos tipos de células carecen a menudo de estas secuencias ricas en GC. En lugar de ello, contie- men una secuencia rica en AT situada entre 25 y 30 bp hacia 5° de sus sitios de inicio de transcripcion (Fig, 29-15), Esta secuencia recibe la denominacion de caja TATA 0 caja de Goldberg-Hogness (de Michael Goldberg y David Hogness, que dedujeron sut existencia en 1978). Recuerda a la caja de Pribnow de los genes procatiéticos (TATAAT), aunque su posicion respecto del inicio de transcripcion es diferente (—27 contra ~10). Sin embargo, las funciones de estos dos ‘elementos promotores no son estrictamente analogas, dado que la delecion de la caja TATA no elimina recesariamente la transcripcion. En lugar de ello, Ia delecion o mutacidn de la caja TATA genera hetero- ‘geneidades en el sitio de iniciacion de la transcripcidn, To cual indica que la caja TATA participa en la seleccion de este sitio. Li regidn génica gue se extiende entre ~50 y -110 también contiene elementos promotores. Por ejemplo, GAGGCTATATATTCCCCAGGECTeAGccAGTaTeTETACA Geccarrcercercgcre TRGGGCATAAAAGGCAGAGCAGGGCAGCTGCTGCTARCACT GAGCATATAAGGTGAGGTAGGATCAGTTGCTECTCACATTT secuencia consenso de muchos promotores do este tipo, siendo los subindices e! porcentaje de aparicion dela ba Correspondlente en esa posicion. [De Gannon, F O'Ha i, Pern, F, LePennec. ¥.P., Benois, ©. Cochel, M. Broathnach, R., Royal, A, Garapin, A. Cami, B. Chambon, &. Nature 278, 483 (1878)Sonor PeeLa c-amanitina, . gla oten, eAmaniting representativa de las amatoxinas, forma un complejo 1:1 muy fuerte con la RNA polimerasa If (K = 10°) y uno. mas débil con la RNA. polimerasa Il (& ="To-M), de manera que bloquea la elongacon Catalizada por ella. La -amanitina, por tanto, es una herramienta muy ati para estudios del mecanismo de accion de estos enzimas. La RNA polimerasa I, asi como las RNA polimerasas mitocondiales, de cloroplastos yprocariticas, son todas insensibles a famanitina 'A pesar de su clevada toxicidad (5-6 mg, presentes fen unos 40 g de setas frescas, son suficientes para matar a un hombre adulto), las amatoxinas actian lentamente. La muerte, normalmente producto de tuna disfuncién hepatica, no ocurre hasta varios dias espués de la ingestion del hongo (y tas la recupera- clon del efecto producido por otras toxinas del hon- £0). Este hecho refleja en parte el recambio lento de los mRNAs y de las proteinas eucarioticas 3. CONTROL DE LA TRANSCRIPCION EN PROCARIOTAS Los procariotas responden a cambios repentinos en et ambiente, tales como ta disponibilidad de mutrientes, induciendo la sintesis de las proteinas adecuadas. Este proceso lleva solo unos minutos debido a que la transcripcion y la traduccin en los procariotas son procesos estrechamente acoplados: los ribosomas co- ‘mienzan Ia traduccion cerca del extremo 5° de los ‘mRNA nacientes muy poco tiempo después de dejar de estar protegidos por la RNA polimerasa (Fig. 29-16) Ademas, la mayorfa de los mRNAs procaridticos son ‘egradados enzimaticamente entre 1 y 3 minutos después de ser sintetizados, eliminandose gracias a esto el gasto adicional que supondria la sintesis de proteinas inne- ‘esarias tras un cambio en las condiciones ambienta- les (la degradacion proteica se discute en la Seccién 30-6). De hecho, los extremos 5’ de algunos mRNAs son degradados antes de que los extremos 3° de los mismos hayan sido sintetizados, Capitulo 29, Transripeiin 925 Sagres comesons Dress se loamtese fe oroteas (radiasen) Figura 20-16 Microgratia electronica y su diagrama intrprotativo ‘mastranco la transcripelén y traduccion simultanea de un {gen de cof, Las moléculas de FINA polmerasa estan Iranserbiondo el ONA de dorecha a izqulerda,mintras que los rbosomas estén traducienco los NAS nacientes (fundamentalmente desde abajo hacia arriba) (Cortesia de Oscar L Miler, Je, Universidad de Virgina En contraste, la induccion de nuevas proteinas en las células eucaristicas lleva con frecuencia horas 0 dias, debido a que la transcripcién tiene lugar en el niicleo, y los mRNAs resultantes deben ser transpor- tados hacia el citoplasma, donde tiene Iugar su tr3- duccion. Sin embargo, las células eucarioticas, particularmente las de los onganismos pluricelulares, poseen ambientes relativamente estables; los cambios en sus patrones transcripcionales ocurren por lo general solo durante la diferenciacion celular. En esta seccidn examinaremos algunas de las vias de regulacion de la expresién génica procarictica a nivel de control transcripcional. Los eucariotas, al ser criaturas enormemente mas complejas, poseen un sistema de control de la transcripcion considerablemente mas complicado, cuyas caracteristicas generales estan comenzando a ser conocidas. En consecuencia dejaremos la discusin del control transcripcional en ‘eucariotas hasta la Seccién 33-3, en donde pod ser considerado y estudiado a la luz de lo que sabemos acerca de la estructura y la organizacién del eromoso- ‘ma eucariotco.Tee siees Se SSR TE ELS tomer abhi Known saa ome eesntebieemredsseers Figura 29-18 Secuencia de nuciedtidos de la region promotor ‘peradora del operén lac de E. col, desde la region (Cerminal de fac! Pzquorda) hasta ia region N-terminal de La constante de velocidad de union observada para la unién del represor lac al operador lac es de K, = 10°Ms", Esta velocidad es muy superior a la calculada para el proceso de difusién controlada en solucion: fy = 10M"'s"' para moléculas del tamano del represor lac. Dado que es imposible que una reaccion tenga lugar més deprisa que su tasa de difu- sién controlada, el represor lac no podria encontrar a su operador en una solucién en la que tuviera que busearlo en un espacio de tres dimensiones. En lugar de ello, parece que el represor lac encuentra a su opera fior uniéndose primero de forma no especifica al DNA, y despues difundiéndose alo largo de ta molécula en busca fe una sola dimension que es mucho ms eficiente. El operador lac posee una secuencia casi palindromica ‘La disponibilidad de grandes cantidades del represor lac hizo posible la caracterizacion del operador lec, EI DNA de E. coli que habia sido sonicado hasta dejar pequetios fragmentos, se mezcl6 con el represor lac y se paso a traves de un filtro de nitrocelulosa. La proteina, con o sin DNA unido, se pega a la nitrocelu- Tosa, mientras que el DNA bicatenario, por si mismo, ro lo hace. El DNA fue liberado de la proteina unida al filtro lavando éste con una solucion de IPTG, se volvio a poner en presencia del represor lac y el ‘complejo resultante fue tratado con DNasa I. El frag- ‘mento de DNA el cual esta protegido de la degradacion ‘por nucleasa por el represor lac es un segmento de 26 bp que esté incluido en una secuencia de 35 bp que presenta una simetria doble casi perfecta (Fig, 29-17, parte superior) Esta simetria palindrémica es una carac~ teristica comin de los DNAs a los que se wnen especificamente proteinas; cabe recordar que las dianas de las endonucleasas de restrccién tambien son secuencias palindromicas (Secci6n 28-64), Se ha propuesto que la simetria del operador lac se acopla a la de su represor; esto es, el operador se une ‘al represor en una hendidura de simetria doble que se ‘encuentra entre dos subunidades, de manera similar a la union de la endonucleasa de restriccién EcoRI con. su diana de reconocimiento (Seccion 28-6A). Sin em- Capitulo 29. Transcripciin 927 +10 20430 lacZ (serecha}. Las secuoncias paindromicas del operador Y¥ Gel sito de unidn @ CAP (Secci6n 29-30) so encuontran Senaladas por ineas verdes. [De Dickson, F.C., Abelson, Si Barnes, WM. y Reznketl, WA, Science 187, 32 (1878) ‘argo, los experimentos de proteccion a la metilacion no van a favor de esta propuesta. Existe un patron de diferencias asimétrico en la susceptibilidad de las ba~ ses a la reaccién con DMS (Fig. 29-17), segan se trate del operador libre o unido al represor. Ademés, las ‘mutaciones puntuales que transforman al operador en constitutivo (09, que invariablemente debilitan la union del represor al operador, pueden tanto incre: ‘mentar como disminuir el grado de doble simetria de la secuencia (Fig. 29-17) op o 2 4 6 8 w nator va ain ae ITE Figura 29-19 ‘Cinetica dela sintesis del mRNA del oporén Jac tras su induooion con IPTG, y de su degradacion tras la accion de lucosa, Se cultvé Ecol en un medio que contenia ‘lcera! como dnica fuente de carbono y uridina marcads on 1H. Se ahads IPTG al medio al comienzo del fexpermento para induct la sintesis de los enzimas lac: ‘Tras 3 min, e afadio glucosa para detene’ la sinesis. La Ceanisad de RNA lac marcado Gon °H fue detorminada por hibridacion con DNA quo conten los genes lacZ y lac. {be Adesnik, My Levithal,C., Cola Spring Harbor Symp. (Quant. Biot 85, 487 (1970)Simeone45° enel DNA entre las bases 5 y 6 fuera del doble eje de simetria del complejo, en ambas direcciones, ia intra provcn ques ere es a jor'y que el sureo menor en esta zona sufra tn nosme ensanchamient, Esta curvatura provocs- da por la union a CAP pestraalmacenat ener fia elistica que puede ser uilizada posteriormente nla transcnpdon, Datos de movildad electofo- ‘etica andmala del complejo CAP-AMPe y de la Capitulo 29, Transcripcin 929 awe ge de Figura 29-20 Estructura e inleracciones de CAP. (a) Diagrama do cintas {ol dimero CAP. Los dominios de union a AMPe, ‘terminates, que contonen los contactos del dimero, ‘estan coloreados en vorde y on amarillo, mieriras que los ‘dominos C-terminales estan coloreados en azul y en ro}, ‘con sus dominios héico-vuoltahlce de union al DNA de Color mas oscuro, Las héices estén marcadas allabéticamente, comenzando por el extremo amino. [Besado en un dibujo de Jane Richardson, Duke Unversity] (6) Modelo propuesto para la asociacion ene os dominios de union al DNA de CAP y sus sites de union fen el operén lac visto desde abajo del dobe oie de ‘simetria de la protoina. Obsérvese cémo las dos hélioes de “reconacimiento" simétvicas de a protena estan separadas 0 manera que puedan ajustarse a vuetas sucesivas de! 'surco mayor del DNA. El sitio de unidn en el DNA fue. Ientficado ubizando estudios de modificacién quinyca, fenzimatica y mstagénica. Los puntos sefialan los Tosfatos cuya etlacion imide la unién Ge CAP, las G que resultan protegidas de la metiacion cuando CAP se une al OA. estén sefaladas a través de un circu, y el simbolo * indica los sitos de lac mutados que disminuyen la afnidad de CAP. [De Weber, IT-y Stetz, T.A, Proc. Natl Acad. ‘Sol 81, 3975 (1984)) secuencia diana de DNA de 30 bp en geles de poliacrilamida también estén a favor de que la tunién induce una curvatura de por Io menos 90° fen este segmento de DNA, EI mecanismo por el cual el complejo CAP-AMPe activa la RNA polimerasa para que transcriba el ope- rn lac sigue siendo un enigma. Sin embargo, parece probable que la curvatura del DNA inducida por laFigura 29-22 Estructura de rayos X do a proteina Cro de 434, de 72 estos, formando un complejo can el mimo DNA de 20 bp que se muestra en la Fig. 29-21, desde una perspectva perpendicular al doble ojo do simetra del Complejo, Son visiles Unicamente [os primeros 64 restos Ge ia proteina, Las Partes (a) 2) y(c)corresponden a las, Figura 29-23 Estructura de rayos-X de un complejo represor-operador trp. en E. coll La imagen es estéreo, con la perspectva erpendicular al doble ee de simetria. Se muestra ol ‘Sequaleto de C, (a2u) junto con las cadenas laterales (verde) que estatecen puentes de hidrégeno (ines [punteadas) con el operador paindrémico de 18 bp {mario}. La proteina solo so uno a su operador si ot [riptotane (rojo) esta Unido a ella. Obsérvese que las Capit 29, Transcripcin 991 e la Fig. 19-21, con la proteina de la Parte () Tepresentada en azul caro, Observese la correspondencla proxima, aunque no identica, entre las dos estructuras, [Las Partes (2) y (4 son cortesia de Alfonso Mondragén, (Cynthia Wolberger y Stopnen Harrison, Harvard Univesity La Parte (b) de Wolberger, C., Dong, ¥, Ptashne, My Harrison, S.C, Nature $95, 791 (1988); hlloas de “reconocimiento” de la protsina se unen, como 0 esperaba, a surcos mayores sucesivos dol DNA. pero ‘Que se extienden perpendicularmente al je del DNA Beatenario. En contrast, las helices de “reconocimiento™ Gel represor 434 y de Cro se Unen en paraelo al surco mayor de sus DNAS (Figs. 29.21 y 28.22). Para observar los chagramas en estéreo veance Tas intrucsiones del Apendige al Capitulo 7. (Cortesia de Paul Sigler, Yale Unwersity)~ 65 A, de forma que comprime al surco menor por ~ 25 A cerca de su centro (entre los. dos Inonémeros proteices)y lo ensancha en ~ 25 A hhacia sus extemos [la distancia entre fsfatos & través del surco menor, en el B-DNA cannico (idea, es de 11.5 Al En contraste, ef DNA acom- Plejado con Cro (Fig. 29-22), a posar de que tam bien esté curvado, es pricticamente recto en centro y posee un sureo menor menos comprimido {comparense las Figs. 29-212 y 29-220). Esto expi- fa por qué la susttacin simultanea de tres resi- dlags dela hetice de “reconocimiento" del represor por los residos equivalentes que aparecen en Cro ho genera la proteina hibida gue se ne al DNA Con afinidad parecida a Ia de Cro: las conformacio- ses diferentes de! DNA en Tos complejos com el repre- for con Cro inpiden que cualquier cadena lateral particular de les dos profinas iterate de la misma manera con el DNA. Paul Sigler determing la estructura de rayos-X del represor trp de E.coli formando un complejo con tun DNA palindrémico de 18 bp que se parece ‘mucho al operador frp (SecciOn 29-38). La proteina dimerica contacta con el DNA relativamente recto a través de 24 puentes de hidrogeno directos y de 6 ‘mediados por elsolvente (puentes acuosos) que se establecen con los grupos fosfato del DNA (Fig 28-23). Los detalles estereoquimicos del complejo represor-operador trp han sido ampliados de forma sustancial gracias ala extension de su estructura de rayos-X desde una resolucion de 2,4 A a 119 A. La mejor més importante que esto aporta al ‘modelo estructural es la Visualizacin de las molé- clas de agua. Existen tres moléculas de agua, situadas en el surco mayor del DNA, que establecen contactos de puentes de hidrogeno tanto con la proteina como con las bases cuya identidad es Importante para la especifcidad de la. union del represor. Dado que dos de estas moléculas de agua establecen contactos similares con Ja proteina en ausencia de DNA, deben ser consideradas exten- siones no covalentes de la superficie interactiva de la proteina. En otros estudios macromoleculares se hran detectado asociaciones de puentes de hidroge- ro especificas mediadas por agua como estas des- crits, Sorprendentemente, sin embargo, no existent puentes de hidrbgeno directos 0 contactos no polares ‘que puedan explicar ta especificdad del represor por Su operador (los pocos contactos de este tipo en la estructura se establecen con bases que son toleran- tes a las mutaciones). Evidentemente, el represor Inp reconoce su operador a través de una “lectura indirecta: la secuencia del operador permite que el DNA adopte una conformacion que establece con- tacts favorables con el represor. Los modelos indican que el B-DNA canonico sélo puede establecer una pequena parte de los contactos que el ‘operador establece con el represor. Otras secuen- clas de DNA podrian, en teoria, adoptar la confor Capitulo 29, Transcripcn 938 macién del operador unido al represor, pero con tn costo energetic demasiado elevado para que pedan formar un complejo estable (ia preferencia Gel represor frp por su operador, cuantifiada en 10! veces més que por ols seciendas de DNA, supone una diferencia de ~ 23 4) = mol" en sus tnergias Hoves de union) Ast, la expecifiidad surge hls en el DNA especies de secuenci, en lar de {er consecencia de tnteracciones de puetes de hi- Srigenoespecifins de secuenciaenre DNA y protel- Ast pues tenemos que no hay rela simples que indi fuer como Tos restos ie amindcidos.deteminadcs interaction con bases. Al contri, a especfiidad de Secuencia esl resultado de un conjunto de inferacciones utuamente favorable entre una protelna y su DNA diana D. Operén araBAD: controles positivo y negativo por la misma proteina Los seres humanos son incapaces de metabolizar © de absorber intestinalmente el aziicar vegetal Larabinosa, En consecuencia, las E.coli que normal mente pueblan los intestines humans son agasaja- das periodicamente con un banquete de esta pentosa Tres de los cinco enzimas de E.coli que metabolizan Ja Larabinosa son productos del operén araBAD, ‘operdn que forma parte del grupo de los reprimidos e los catabolites (Fig. 29-24). La transcripcion del operén araBAD esté regulada tanto por CAP-AMPe como por la proteina que se une a [a L-arabinosa, denominada AraC (es el producto del gen araC; las proteinas seran escritas con el nombre Gel gen que Tas codifica en letras en redonda con la primera letra maytiscula; Fig. 29-25): 1. En ausencia de AraC, la RNA polimerasa inicia la transcripcion del gen araC en direccién opuesta a la de su vecino de 8’, araBAD. El operén araBAD permanece reprimido, 2. Cuando AraC esta presente, con 0 sin L-arabinosa, pero no hay CAP-AMPe (glucosa alta), AraC se line a tres sitios génicos diferentes: ara, situado justo antes del promotor de araBAD; ara0,, que se solapa con el promotor de araC; y ara0,, situado sorprendentemente en una region no codificante de la region 5° del gen araC, alrededor de la posi- ign ~280 respecto del sitio de inicio de araBAD. ‘ara0, es el operador del gen araC; su asociacion. ‘con AraC bloquea la transcripcién de araC, Io que significa que este proceso es autorregulatorio. Una serie de mutantes por delecién indica que tanto ara0, como aral deben estar presentes para que araBAD sea reprimido en presencia de AraC. La ‘gran separacion que existe entze 4720, y el promo: tor de araBAD sugiere, entonces, que el DNA se encuentra formando un lazo de forma tal que unaenaior $$ res esewte Capitulo 29, Transripciin 935 é | j mn | | SOE et ai at } | : ‘Componente ‘Componente T | yunidad de] Subunidad a de Sater [stot wemeet| |Patnaie ie ‘in = my | —o ‘Nae-Fostorbosi) | ‘Triptétano sintasa pega fey eames) corsa Ze Anan Noosa zanna Ghtansto PRP. PR, Figura 28 Mapa genético del operén rp de Ecol indicando los tenzimas para los que coottica y las reacciones que éstos to de 5 pares de bases colocado entre araO; y aral interfiere de manera importante con la represion, mientras que un inserto de 11 pares de bases no rovoca efectos importantes, El sitio aral esti formado por dos subsitios, aral, y aral;, El lazo de DNA se forma por la unién de la proteina AraC a araO, y tinicamente al subsitio aral,, ‘Sin embargo, cuando la union de arabinasa provoca ‘que la proteina AraC libere el sitio ara, el complejo ‘AraC-arabinosa resultante también se une al subsitio fal,, Esta observacion sugiere que la apertura del Tazo esta determinada fundamentalmente por un cambio conformacional inducide por la arabinosa sobre el dimero AraC, que modifica la orientacién relati- vva de sus dos subunidades. La funci6n de la formacion de bucles 0 lazos en el DNA es poco clara, aunque se ha demostrado su cexistencia en numerosos sistemas eucarioticos y bac terianos. Quizas permita que varias proteinas regula- CGAACTAGTTAROTAGTAGGCARG GerrearcaaTreatcaracertc t 1 1 20 Figura 29-27 ‘Secuencia de bases cel operador tp. La secvencia casi palindromica esta encerrada en el recuacro y la caja ce Pripnow esta sefalada por la raya superior. -10 “ t Te en.rccaoe fesoe Ap resaeae 7 cee co, Serine Getalaendo 3° ‘catalzan. Ei producto génico de t1pC eataliza dos Teacclones secuenciaes en la sinless del tiptSfano. [De Yanotsky,C., J) Am. Med. Assoc. 218, 1027 (1871),] doras y/o sitios reguladores en una proteina influyan, simultaneamente en la iniciacion de la transcripcién por la RNA polimerasa, De hecho, como ha sido demostrado por estudios recientes, el operén lac contiene un segundo operador relativamente débil situa do 400 bp hacia 3° del inicio de transcripeién (dentro del gen lacZ), Este operador secundario (0.) coopera ‘con el operador primario (que ahora se denomina O,) para formar un complejo de represion que es més fuerte que con cualquier operador por separado. Se piensa que durante una represion severa, ambos ope- radores se unen a un tinico tetramero del represor lac para formar un complejo que contiene un lazo de DNA. Estructuras de los represores met y are Elrepresor met, de Ecol, eprime la transcripion de su propio gen y de los que codiican para engimas implicados en a sntsis de metionina (Fig. 24-45) y S-adenosiimetionina (SAM; Figura 24-14) La estructura de rayosXX del represor met, ligado 0 no a su correpresor, SAM, revela que se tata de un dimero de tnonbmeros entrelazados el cusl earece del motvo de unién a DNA hilice-vueltahilice earacerisico de otros muchos represoresy activadoresbacteranos. En lugar de ello, el represor mmc! se une a au secuencia diana en el DNA’ través de un par de laminas Bde dos cadenas antiparaelas, de simetia parecida, que se insertan en surcos mayoressucesivos en el DNA.La estructura de rayos-X del represor met fue deter- ‘minada primero en ausencia de DNA. Los modelos pretendian elucidar como se unia el represor met a su DNA diana, una secuencia palindrémica, suponiendo que los dobles ejes de rotacion de ambas moléculas Serian coincidentes, de la misma manera que lo son en todos los compiejos de proteina-DNA conocidos. Existian, por tanto, dos opciones razonables: (1) la proteina podia estar unida al DNA con los ya mencio- nados pares de laminas B penetrando en surcos ma- yyores sucesivos, o bien (2) dos hélices a protuberantes Ge simetria parecida podian desempenar la misma fancion, de Gna manera similar a la de la hélice de reconocimiento del motivo helice-vuelta-helice de las proteinas que interactian con el DNA, Muchos erite- Fos estructurales sugerian que las hélices @realizaban contactos significativamente mejores con el DNA que Jos que podian hacer las laminas B. De esta forma, la observacién de que son estas tltimas las que interac- conan con el DNA proporcioné una leccién importante: los resultados de los estudios de elaboracién de ‘modelos deben ser tratados con precaucién extrema. Esto se debe a nuestro conocimiento impreciso de la ener- sética de las interacciones intermoleculares (Seccio- nes 7-4 y 28-3), que impide que podamos predecir de manera fiable la conformacion de macromoléculas que se asocian unas con otras, El represor arc es una proteina que participa en el cambio entre la liss y la lisogenia en el bacteri6fago P22, de Salmonella (en la Seccién 32-3D se discute este cambio para el bacteriofago 3). La estructura de 2-D de NMR del represor arc indica que esta proteina forma un dimero cuyos segmentos N-terminales se asocian en laminas fi antiparalelas de dos cadenas [Los represores arc y met poseen estructuras secundarias similares y exhiben una débil homologia de se- ccuencia en sus regiones de lamina B. Dado que se ha demostrado que el represor arc se une al DNA en forma de tetramero, parece que las dos laminas Pde este dimero se unen a surcos sucesivos en el DNA de Ja misma forma que las laminas B del dimero del represor met. Por tanto, la lista de motivos proteicos de union a DNA deberia inclu la lamina B antipara- Tela de dos cadenas, junto con la hélice-vuelta-hélice y el dedo de zine (Seccibn 33-38). E, Operén trp: atenuacion En los parrafos siguientes discutiremos un sofistica- do mecanismo de control transcripcional denominado atenuacién, a través del cual las bacterias regulan la expresin de ciertos operones implicados en la biosintesis de aminodcidos. El mecanismo fue descubierto durante el estudio del operén trp, de E. coli (Fig, 29-26), que codifica para cinco polipéptidos que gene- ran tres enzimas que median en la sintesis de triptofano a partir de corismato (Seccion 24-58). Charles Yanofsky establecié que los genes del operén trp se Capitulo 22. Transcripcion 937 expresan coordinadamente bajo el control del represor frp, una proteina dimérica de subunidades idénti- eas de’ 107 restos, que esta codificada por el gen ‘rpR (el cual forma un operdn independiente). El represor trp se une a L-triptéfano, el producto final de ta ‘a, para formar un complejo que se une especificamente al operador trp (trpO; Fig, 29-27, capaz de reducir 70 veces 1a velocidad de transcripcién del opersn trp. La estructura de rayos-X del complejo represor-operador ‘rp (Seccién 29-3C) indica que la unién del tript6fano ‘orienta alostéricamente las dos “cabezas de lectura del DNA’ del represor trp (sus dos segmentos helice- vuelta-hélice simétricamente parecidas), de manera ‘que puedan actuar simultaneamente uniéndose a #rp0 (Fig. 29-28; véase tambien la Fig. 29-23). Ade- ‘mis, el tript6fano unido forma un puente de hidrogeno con un grupo fosfato en el DNA, reforzando la ‘asociacién entre el represor y el operador. El tript6fa- Ro, por tanto, actia como un correpresor; su presen ‘Ga impide la que seria, en esas condiciones, una Diosintesis superflua de triptofano, El represor trp también controla la sintesis de como minimo otros: dos operones: el operén frpR y el operon aroH (que codifica para un isozima de tres que catalizan la reac- cién inicial de la biosintesis de los aminodcidos aro- iticos: Seccién 24-58) La biosintesis del tript6fano esta regulada también por la atenuacion ‘Al principio se pensaba que el sistema represor- operador trp era suficiente para explicar completa- ‘mente la regulacién de la biosintesis del triptofano en. E, coli. Sin embargo, el descubrimiento de la existencia de mutantes por delecién de trp, situados en tegio- nes hacia ¥ de rpO, que incrementaban seis veces la expresion del operon frp indicaba la existencia de un. elemento de control de la transcripcién adicional. Los anilisis de secuencia establecieon que tpE, el gen festructural situado a 5° del operon trp, esta precedido por tna secuencia guia ("Ieader’)(trpL). Los analisis ‘genéticos indicaron que el nuevo elemento de control ‘esti situado dentro de trpL, entre 30 y 60 nucleotides hacia 5 de t7pE (Fig. 29-26) Cuando el triptofano escasea se sintetiza la secuen- ia completa, de 6720 nucledtidos, del mRNA policis- tronico del operdn frp, incluyendo a la secuencia trpl. ‘A medida que aumenta la concentracion de triptofano, la velocidad de transcripcion de tp disminuye como consecuencia del incremento paralelo en la abundancia de complejos represor-correpresor trp. ‘Sin embargo, aumenta la proporcion de un segmento de solo 140 nucledtidos dentro del conjunto de mRNA transcrito, que corresponde al extremo 5° de trpL. La disponibilidad de triptofano, por tanto, provoca 1a terminaciOn prematura de la transcripcin del operén trp. El elemento de control responsable de este efecto recibe en consecuencia la denominacién de atenua- dor.rene =transcripcién y continie en consecuencia hasta trans- crbir el operén trp completo. De esta forma, la célula se dota de un mecanismo regulador sensible a los niveles de triptofanil-tRNAT, niveles que, a su vez, dependen de la velocidad de sintesis de proteinas asi como de la disponibilidad de triptofano, Existen muchas evidencias que apoyan el modelo de atenuacion anterior. El transcrito trpL es resistente fla digestion limitada con RNasa T1, Io cual indica {que posee una extensa estructura secundaria. La im: portancia del tandem de codones de Trp en el trans- ito de trpL queda confirmada por su presencia en las regiones gula de frp de otras varias especies bacteria~ nas, Ademés, los péptidos guia de otros cinco operones de biosintesis de aminoicidos regulados por ate- ‘nuacién (algunos de ellos de forma casi exclusiva) son todos ellos ticos en sus correspondientes residuos de aminoacidos (Tabla 29-1). Por ejemplo, el operon his, de E.coli, que codifica para los enzimas que sintetizan histidina, posee siete residuos His en tandem en su. ‘péptido guia; andlogamente, el operon ilo, que codi ‘ca para enzimas que intervienen en la sintesis de isoleucina, leucina y valina, contiene cinco residuos Ile, tres Leu y seis Val en su péptido guia. Finalmente, todos los transcritos guia de estos operones compar ten con el del operon trp la capacidad para formar dos estructuras secundarias alternativas, una de las cuales contiene una estructura de terminacion situada al final de la secuencia. F, Regulacién de Ia sintesis de RNA ribosémico: la respuesta severa Cuando E. coli erece en condiciones optimas se je una Ver cada 20 min. Estas células contienen aproximadamente 10 000 ribosomas, Pese a ello, la RNA polimerasa es capaz de iniciar la transcripcion de un gen de sRNA con una velocidad no superior a uuna vez cada segundo. Si el genoma de E. coli contu- viera slo una copia de cada uno de los tres tipos de genes de RNA (los que especifican los tRNAs de 235, de 168 y de 58; Seccion 30-3A), no podrian ‘Tabla 29-1 Capitulo 28, Transcripcién 939 hhaber més de ~ 1200 ribosomas por célula. Sin em- Dargo, el cromosoma de E. coli contiene siete operanes de PRNA situados en posiciones diferentes, todos fos cuales contienen una copia casi idéntica de cada tipo de gen de RNA, con lo que se explica la velocidad observada de sintesis de rRNA. Las células poseen la destacable capacidad de coor- dinar las velocidades de sintesis de sus miles de com- ponentes. Por ejemplo, E, coli ajusta su contenido de Hibosomas de manera que se adapte ala velocidad ala que es capaz de sintetizar proteinas en las condiciones, imperantes de crecimiento, La velocidad de sintesis de rRNA es, por tanto, proporcional ala velocidad de sintesis de proteinas, Un mecanismo que permite que festo sea asi es conocido como el de la respuesta severa (‘stringent response’): la falta de cualquier IRNA cargado con aminoécido (normalmente fruto de condiciones de crecimiento “severas” o pobres) que limite la velocidad de sintesis de proteinas dispara un reajuste metabdlico general. Un aspecto principal de este cambio es una reduccion abrupta, de 10 a 20 veces, en la velocidad de sintesis de RNA y de tRNA. Este control severo, ademas, disminuye otros muchos proce- 05 metablicos (ineluyendo la replicacién del DNA y la biosintesis de carbohidratos, lipidos, nucleotides, ‘glucoproteinas e intermediarios glucoliticos), a la vez. que estimula otros tales como la biosintesis de aminodcidos. De esta forma la célula queda preparada para soportar las limitaciones nutricionales. EL ppGpp media en la respuesta severa La respuesta severa esta correlacionada con una acu- mulacién intracelular ripida del nucledtide poco fre- ccuente ppGpp y su rapida desaparicion cuando los aminoacidos ouelven a estar disponibles, La observacion de que ciertos mutantes, denominados relA-, no presen- taban la respuesta severa (se dice que estén bajo un control laxo) y carecian de ppGpp, sugiere que esta sustancia hace de intermediario en la respuesta severa, Esta idea fue comprobada en estudios in vitro, en os que se demostraba, por ejemplo, que el ppGpp. inhibe la transcripcién de los genes de RNA pero Secuencias de aminoscidos de algunos péptidos guia en operones regulados por atenuacién Operon Secuencia de aminoscidos* tp ‘Met-Lys-Ala-le-Phe-Val-Leu-Lys-Gly-TRP-TRP.-Arg-The-Ser hea [Met-Lys-His-Ie-Pro-PHE-PHE-PHE-Ala-PHE-PHE-PHE-Thr-PHE-Pro his (Met-The-Arg.Val-Gin-Phe-Lys-HIS-HIS-HIS-HIS-HIS-HIS-HIS-Pro-Asp Tew ‘Met-Ser-His-le-Val-Arg-Phe-Thr-Gly-LEU-LEU-LEU-LEU-Asn-Ala-Phe-e-Val-Arg-Gly-Arg-Pro- ‘Val-Gly-Giy-Te-Gin-His thr (Met-Lys-Arg-ILE-Ser-THR-THE-ILE-THR-THR-THRILE-THR-ILE-THR-THR-Gln-Asn-Gly-Ala-Gly ‘to ‘Met-The-Ala-LEU-LEU: Arg: VAL-ILE-See-LEU-VAL-VAL-ILE Ser-VAL-VAL-VALILE-ILELE-Pro- ro-Cys-Gly-Ala-Ala-Leu-Gly-Arg-Gly-Lys-Al Loe restos en maydrculas son sintetizados en leva catalizada por los productos del propio operén -uete:Yanofsky, C, Nature 29, 753 (1981),estar O(2"-metilada en el primer nucleésido del transcrto (eap-1, el tipo de estructura predominante en los organismos pluricelulares), o bien en sus dos primeros nucleésidos (cap-2), o en ninguna de estas, posiciones (cap-O, la estructura predominante en los eucariotas unicelulares). Si el primer nucleosido es adenosina (normalmente es una purina), también puede hallarse N*-metilado. Los mRNAs eucariéticos tienen colas de poli(A) Los mRNAs eucariticos, en contraste con los proca~ ridticos, son siempre monocistronicos. Pese a ello, las secuencias que indican la terminacion de la transcripcion en los eucariotas no han sido identificadas. Esto se debe fundamentalmente a que el proceso de terminacion es impreciso; esto es, Jos transcritos primarios de un gen estructural dado poseen secuencias 3’ hete~ rogeneas. No obstante, los mRNAs eucaridticos maduros tienen extremos 3’ bien definidos: casi todos ellos poseen colas de politA) en el extremo 3° que tienen de 100 « 200 nucledtidos de iongitud. Las colas de poli(A) se afaden enzimaticamente a los transcritos primarios en dos reacciones: 1, Un transcrito es cortado entre 10 y 30 nuclestidos hacia 3 de una secuencia AAUAAA, muy conservada, cuya mutacién suprime tanto el corte como la poliadenilacion, y dentro de los 50 nuclestidos anteriores a una secuencia menos conservada rica en Uo en GU. 2, La cola de poli(A) se ahade subsecuentemente, a partic de ATP y por la accion secuencial de la poli(A) polimerasa. La precisin de la reaccion de corte ha eliminado, aparentemente, la necesidad de una terminacion de la transcripcion precisa; dicho de otro modo, todo esta bien si acaba bien ‘Los estudios i vitro indican que la cola de poli(A) no es necesaria para la traduccion del mRNA. En lugar de ello, las observaciones de que la cola de poli(A) de un mRNA se acorta a medida que envejece en el citosol, y de que los mRNAs no adenilados tienen la vide media citosdica reducia, sugieren que las colas de poli(A) desempenan un papel de protec- cldn, De hecho, los nicos mRNAs maduros que care- en por regla general de cola de poli(A), los mRNAS de las histonas (los cuales, con muy pocas excepcio- nes, carecen de la senal de corte y poliadenilacion ‘AAUAAA), poseen tiempos de vida inferiores alos 30 ‘min en el citosol, mientras que la mayoria de los otros mRNAs duran horas o dias El enzima pol(A) polimerasa, que sinttiza las co- Jas de poli(A) a partir de ATP, es activado para ello por un factor de especificidad que actia tras el reco- rocimiento por parte de esta proteina de la seaal ‘AUUAAA, cosa que realza sin practicamente toleran- cia por varlacones en la secuencia, Una vez que la cola de poli{A) ha erecido unos 10 restos, la se- uencia AUUAAA deja de ser necesaria para una Capitulo 29, Transcripein 941 Figura 29-92 Micrograia electronica y su dibujo interpreta de un hiridd entre fa nebra con sentido del gon de la ‘ovoalbumina de pollo (obtenido por metedos de clonacion molecular; Seccion 31-5) y su correspondiente mANA. Los Segmentos complementarios del DNA (ines purpura en ef ‘ibujo)y el MANA (linea roa) Nan Pibridaco, fo ual permite la observacion de las posiiones de los exones (L, 1-7) Los sogmentos que forman lazos no apareados (iV) no seen secuencias complementaias con el mRNA. Estos Son los intrones. (De Chambon, P., So. Am. 2448): 61 (1981)) mayor elongacion, Esto sugere que el factor de espe- Gita se Hbera de su sitio de reconocimiento de tina manera parecida a como el factor @ ef libero del sito_deinicacon dela nanscripcion una vee que ha comenzado laelongacion del miRNA procasitco (Seccion 29-20), No se sabe con certeza qué eso que limita Ta longtua de las colas de pol), aunque parece poco probable que ts sea una, propiedad Intinsea de fa poll) polimerasa, La maguinara de poliadenlacion forma parte de tun comple de 500 2 000 KD, que tambien contene al menos ies pote nas necesarias para el corte del mRNA xsten muchas evidencasa favor del papel protec tor de las colas de pola) de los mRNAS eucaiotcos dest degradacon Gtoplasmaticn, Las clas de pol(A) tstanformando complsjos espectico en el copia” ta con una proteina de union a politA) (PABE), la cual organize 2 fos mRNAs en ribonucleoproteinas similares a los nucleosomas, Se piensa que la PABP protege lot mRNAs de la degradacin, como sugere EThetho de que, por ejemplo, Ia adicion de PABP a tan sistema Hive de cellas que contene mRNACopitulo 29, Transcripcion 943 x60 te» trig), + en 2 promana 5 Paneer nr esc en or daz Figura 29-35 Secuencia de reacciones de transesterificacion que permite ‘al empaime oe los exones de los pre-mRINAS aucaritioas {los exones y os intrones se dibujan an azul y en narania, Fespectvamente; la Fy la Y representan residuos de fina (R) 0 da primidina (1): (1) Ei grupo 2-OH de una A peciica det intron atace nuceofiicamente el fosfato de los intrones en los genes de los vertebrados varian, desde ~ 65 a mas de 100 000 nucléotidos, sin ninguna periodicidad obvia, De hecho, los intrones corres- ppondientes de genes homélogos de dos especies de vertebrados diferentes pueden variar tanto en longitud como en secuencia, de forma que acaban pare- ‘iéndose muy poco uno a otro. Investigaciones adicionales establecieron que la for- macién del mRNA eucariético comienza con la transcripcion de un gen estructural completo, incluyendo sus intrones, para formar el pre-mRNA (Fig. 29-33), Entonces, tas la adicién de la caperuza y quizés tambien de la poliadenilacion, se eliminan los intrones y los exones flanqueantes son unidos entre si para generar el mRNA maduro. Este proceso recibe la denominacién de corte y empalme (‘splicing’). La caracteristica mds notable del corte y empalme es su precisién; sila reaccin afectara en exceso o por defecto a Aalguria base, el mRNA no podria ser traduetdo correcta~ ‘mente (Secci6n 30-1B). Ademas, Ios exones nunca se ‘mezclan; su orden en el mRNA maduro es exactemente ef ‘mismo que el que tenian en el gen del que derivan. En las siguientes subsecciones discutiremos el mecanismo de este proceso de corte y empalme. veroaime 9 3 Union de cote y empire wiles Com el residuo 8’ terminal de! exon de 8, unendo asia los {08 exones ylberando el intron en forma de azo, El corte y empalme de los exones tiene Iugar en dos etapas Las comparaciones de secuencia entre las uniones exén-intron de un diverso grupo de eucariotas indi can que poseen un alto grado de homologia (Fig, 29-34), incluyendo, como sefialaran primero Richard Breathnach y Pierre Chambon, un GU invariable en Ia frontera 5° del intron y un AG invariable en su frontera 3% Estas secuencias Son necesarias y suficientes para ° on ou | ’ A i: ¢ 5° pppAUGGUUAUCAGUUAAULGAG © e ule 4 ole secs oie otk oie cle cle bie oie : cle eee Gec eee cams cle GEGCGy yo Procesamiento y ’ cecaceR é Sea ccocemne Va D Rie aS om =e c+a ACU Pp pad atu ore acu c ae oo a co a 0 mo u ef RNA madaro ee (ence) ‘Transeo primario RNA? (108 mcestidos) Figura 29-42 Procesamiento postranscripconal del !RNATv do levadura, Una secvoncia Intermecta de 14 nucieticos y una. Secuencia 5-terminal de 19 nucledtidos son escindiéas del ttanserto primar, un ~CCA es afadido al extremo &°y pproteinas, pero nunca al revés; Fig. 29-1). Sin embar~ 0, en este sistema se ha identificado recientemente ‘una nueva clase de transcritos mitocondriales, denominados RNAs guia @RNAs), de 60 a 80 nuclestidos de longitud. Estos gRNAs poseen colas 3'-oligo(U), tun segmento interno que es precisamente comple- rmentario ala porcion corregida del mRNA si se consi- dera que los pares G - U pueden ser complementarios, y una corta secuencia también llamada secuencia de Anclaje, proxima al extremo 5’, que es extensamente complementaria en el sentido de Watson y Crick a un segmento del mRNA que no esta corregido. Se supo- varias bases se modiican sus simbolos se definen en la Fig, 30-13) para formar el NA maduro. El antcogén ests sombroaco, [De DeRloberts, EM. y Olsen, M.V., Nature 278, 142 (1989)) ‘ne que un transcrito no corregido se asocia con su correspondiente gRNA a través de su secuencia de anclaje y que, en un proceso mediado por los enzimas adecuados, el segmento interno del gRNA se utiliza como molde para la “correccion” del transcrito, dando lugar en consecuencia al mRNA ya corregido. De esta forma, la informacion genética que especifica un mRNA corregido deriva de al menos dos genes diferentes, La ventaja funcional de un proceso tan com: plicado, tanto en la actualidad como mas probable: ‘mente para algin organismo ancestral, queda aiin por ser determinada,snRNPs que tiene lugar en Jos espiceosomas, El transerito primario de los rRNAs de £. coli contiene los tres TRNAS junto con algunos tRNAs, Estos son escindidos y recortados por endonucleasas y exonucleasas especificas. Los rRNAs fstin también modifcados por la metilacin de nucledsidos especificos. Los RNAs eucaridticos de 185, de 5,85 y de 28S son transcrtos de manera similar a los procariéicos, en tun precursor de 455 que es procesado de forma analoga a los RNAs de E.coli El intron del pre-zRNA de Tetrahymens Bibliografia General Lewin, B, Genes (34 ed), Captulos 811 y 22-24, Wiley 0987, Watson, J.D, Hopkins, N. H., Roberts J. W. Stet, J.A.y Weiner, A. M., Molecular Biology ofthe Gene (4 e4), Capit tulos 16 y 20, Benjamin /Cummings (1987) La funcién genética del RNA Brenner, S, Jacob, F.y Meselson, M,, An unstable interme diate carying information from genes to ribosomes for protein synthesis, Nature 190, 576-581 (1960). [La verifica- ‘don experimental de la existencia del mRNA Brachet, J, Reminiscences about nucleic acid cytochemistry and biochemistry, Trends Biochem. Sci. 12, 244-246 (1987). Crick, B., Central dogma of molecular biology, Nature 227, 561-563 (1970), Hall, B.D. y Spiegelman, S., Sequence complementarity of TRDNA and T2specific RNA, Proc. Nail Acad. 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