Capitulo 18 TRANSPORTE A TRAVES DE MEMBRANAS |. Termodinamica del transporte . Cinética y mer A. Transporte no mediado B. Cinética del transporte mediado: transporte de glucosa hacia el interior de los eritrocitos ©. lonétoros . Mecanismo del transporte mediado pasivo de glucosa ismos de transporte . Transporte activo impulsado por ATP A. La (Na"-K*}-ATPasa de membranas plasmaticas B.La Ca®-ATPasa C.La(H*-K")-ATPasa de mucosa gastrica D. Transiocacién de grupo |. Transporte activo impulsado por un gradiente de jones ‘A. Simporte de Na*-glucosa B. Lactosa permeasa ©. Translocador de ADP-ATP EI metabolismo tiene lugar en el interior de las células, que estan separadas de sus alrededores por las membranas plasmaticas. Las células eucari6ticas, ademas, estan compartimentadas por membranas in- tracelulares que forman los limites y las estructuras internas de varios orgénulos, Los micleos apolares de las membranas biolégicas los hacen altamente imper- meables a la mayoria de las sustancias iénicas y pola- res, de modo que estas sustancias pueden crizar las membranas sélo mediante la accién de proteinas de transporte especificas. Se requieren, por tanto, este tipo de proteinas para mediar todos los movimientos a través de las membranas de iones como Na’, K', Ca** y Cl-, asi como de metabolitos como piruvato, aminoacidos, azticares y nuclestidos. Las proteinas de transporte son también responsables de todos los fe- némenos electroquimicos biol6gicos. En este capitulo, se discute la termodinémica, la cinética y los mecanis- mos quimicos de estos sistemas de transporte de membrana. 1. TERMODINAMICA DEL TRANSPORTE Como se vio en la Secci6n 3-44, la energia libre de un soluto, A, varia con su concentracion: Gq — Gi’ = RT In [A] [18.1] donde G, es el potencial quimico (energia libre mo- lar parcial) de A (la barra indica cantidad por mol) yse ante ee ae AG a522, Secci6n 18-2. Cinética y mecanismos de transporte Is Pendiente = Pa we (Rena ~ (Also Figura 18-1 Relacion lineal entre el flujo de difusion (dq) y (Alera ~ lgenro) @ través de una membrana semipermeabie; ver Ec. [18.6]. wo 2 os g 3 3 & a 2 2 cnt, bn @ § we eel 0 0.0001 Figura 18-2 Cooficientes de permeabilidad de diferentes moléculas organicas en membranas plasmaticas del alga Nitella ‘mucronata frente a sus coeficientes de particion entre aceite de oliva y agua (una medida de la polaridad de una molécula). Esta representacién doble logaritmica, con una Ja 0,001 Coeficiente de particién aceite-agua difunde en Ia direccién en que elimina su gradiente de concentracién, d [A]/dx, a una velocidad proporcional a Ia magnitud de dicho gradiente. Para una membrana de espesor x, la Ec. [18.5] se puede calcular aproximadamente a partir de 8 GA) ca [Aino = Pa((A] re (Ares) [18.6] donde D, es el coeficiente de difusion de A dentro de la membrana y P, = D,/x se denomina coeficiente de permeabilidad de la membrana para A. El coeficiente de permeabilidad es indicativo de la tendencia del soluto a transferirse desde un disolvente acuoso al niicleo apolar de la membrana. Debe variar, pues, con la telacion de la solubilidad de un soluto en un disol- vente apolar, similar al nticleo de la membrana (por ¢j., aceite de oliva), respecto a la solubilidad del mis- mo en agua, cantidad que se conoce como el coefi- concen, Tt nsec, a Preperemda bd s L£ ne \ eo. Hae % secede i cricrty-a0n 6 cH,08, HNO ? HN—C—NH-CHCH, res 01 ‘gréfica mas 0 menos lineal, indica que la etapa limitante de velocidad, para la entrada no mediada de una molécula al interior de una célula, es el paso a través del nucleo hidrofébico de la membrana. [Basado en los datos de Colander, R., Physiol. Plant. 7, 433-434 (1954),]ciente de particién del soluto entre dos disolventes. En efecto, los flujos de muchos no electrélitos a través de membranas de eritrocitos varian linealmente con su diferencia de concentraci6n a través de la membra- na, como predice la Ec. [18.6] (Fig. 18-1). Por otra parte, sus coeficientes de permeabilidad, obtenidos de las pendientes de graficas como las de la Fig. 18-1, se cortelacionan bastante bien con sus coeficientes de particion medidos entre disolventes apolares y agua (Fig. 18-2) B. Cinética del transporte mediado: transporte de glucosa hacia el interior de los eritrocitos A pesar del éxito del anterior modelo para predecir la velocidad con la que muchas moléculas pasan a través de las membranas, existen numerosas combi- naciones de solutos y membranas que no obedecen la Ec, [18.6]. El flujo en estos sistemas no es lineal con la diferencia de concentraciones de soluto a través de la correspondiente membrana (Fig. 18-3) y, ademéds, el coeficiente de permeabilidad del soluto es mucho mayor que el esperado basandose en su coeficiente de particién. Este comportamiento indica que estos solu- tos son levados a través de las membranas formando un complejo con moléculas portadoras, es decir, experimen- tan un transporte mediado, El sistema que transporta glucosa a través de la membrana de los eritrocitos proporciona un ejemplo bien caracterizado de transporte mediado pasivo: transporta invariablemente la glucosa a favor de su Tyucra (TIM + om + 5-8 108) 2 4 6 a 10 {Giucosa] mu Figura 18-3 Variacién del fluo de glucosa hacia el interior de eritrocitos humanos con la concentracion externa de glucosa a 5 °C. Los puntos son datos determinados experimentalmente, mientras que la linea continua se calculé a partir de la Ec. [18.7], tomando Upqx = 1,0 x 10°% mM cm Sy Ky = 0,5 mM. El flujo no mediado de glucosa aumenta linealmente con la (glucosal (Fig. 18-1), pero no seria visible en la escala de este dibujo. [Basado en datos de Stein W.D., Movement of Molecules Across Membranes, p. 194, Academic Press (1967).] Capitulo 18. Transporte a través de membranas 523 Tabla 18-1 Coeficientes de permeabilidad de membranas naturales y sintéticas a la D-glucosa y al D-manitol, a 25 °C Coeficientes de permeabilidad (em « 5") Preparacion de membranas -Glucosa__D-Manitol Bicapa lipidica 24x10 44x 10-7 sintética i Difusion no mediada 4x 10° 3x 10% caleulada i Eritrocitos humanos 2,0 x10 5x 104 intactos Fuente: jung, C.Y., en Surgenor, D. (Ed.), The Red Blood Cell, Vol. 2, p. 709, Academic Press (1975). gradiente de concentracién pero no a la velocidad predecida por la Ec. [18.6]. Ademas, el transportador de glucosa de eritrocitos presenta cuatro caracteristi- cas que diferencian el transporte mediado de! no me- diado: (1) velocidad y especificidad, (2) cinética de satu- raci6n, (3) susceptibilidad a la inhibicion competitiva, y (4) susceptibilidad a 1a inactivacién quimica, En los siguientes parrafos, veremos como el transportador de glucosa de eritrocitos muestra estas cualidades. Velocidad y especificidad La Tabla 18-1 indica que los coeficientes de per- meabilidad de D-glucosa y D-manitol, en bicapas sin- téticas, y del D-manitol, en membranas de eritrocitos, estan en razonable acuerdo con los valores calculados a partir de los coeficientes de difusin y particin de estos aziicares en aceite de oliva, Sin embargo, el coeficiente de permeabilidad determinado para la D-glucosa en la membrana de eritrocitos es cuatro ordenes de magnitud mayor que su valor predicho. La membrana de eritrocitos debe contener, por lo tanto, un sistema que transporta glucosa rapidamente y que puede distinguir la D-glucosa del D-manitol. Cinética de saturaci6n La dependencia del transporte de glucosa con la concentracién indica que su flujo obedece la relacion: In Esta funcién de saturaci6n tiene una forma hiperbo- lica familiar (Fig. 18-3). La hemos visto en la ecuacin que describe la union del O, a la mioglobina (Ec. (9.2) y en la ecuacién de Michaelis-Menten, que des- cribe las velocidades de las reacciones enzimaticas (Ec. [13.24)). Aqui, como antes, la Ky, puede definirse operativamente como la concentracién de glucosa ‘cuando el flujo del transporte es la mitad de la veloci- dad maxima, Jnuu./2. Esta observacién de cinética de saturaci6n para el transporte de glucosa fue la primera [18.7]524 Scion 18-2. Cindtica y mecaniemos de transporte 1. Fiscisn A Gera) Sesee SEER eae Figura 16-4 Esquema cinético general para el transporte de membrana {que comprende cuatro etapas:tacin, transport, ‘sociacon y recuperacion, Tesla protena de transporte fuyo sito 6 aclon para el souto A esta locaizada en ©! lado intorioro anal exterior dela membrana en un instante Setermnnado, prueba de que un niimero especifico de sitios saturables en la membrana participaba en el transporte de alguna sustancia, El proceso de transporte puede describitse por un simple esquema cinético de cuatro etapas que incluye: fijacion, transporte, disociacion y recuperacion (Fig 18-4), Las etapas de fijacion y disociacion son andlo~ ‘gas al reconocimiento de un sustrato y la liberacién del producto por un enzima. Los mecanismos de transporte y xecuperacion son objeto de una activa investigacién y se discuten en la Seccién 18-2D. ‘Susceptibilidad a la inhibicién competitiva “Muchos compuestos estructuralmente similares ala Deglucosa inhiben el transporte de glucosa. Una re- ppresentacién doble reciproca (Seccién 13-2B) para el ujo de la glucosa en eritrocitos, en presencia o a sencia de 8-O-bencil-p-galactosa (Fig, 18-5) muestra, el comportamiento tipico de la inhibicion competitiva, dl transporte de glucosa (en la Seccidn 13-3 A se dliscute la inhibicion competitiva). La susceptbilidad a la inhibicion competitiva indica que hay un nimero Limitado de sitios disponibles para el transporte mediado, Susceptibilidad a la inactivacion quimica Fl tratamiento de eritrocitos con HgCl,, que reac- ciona con los grupos sulfhidrilo de las proteinas (Sec- ‘ion 6-2) y, por lo tanto, inactiva muchos enzimas, ‘causa la desaparicion del flujo rapido, saturable de slucosa, de modo que su constante de permeabilidad Se aproxima a la del manitol. La susceptibilidad del sistema de transporte de glucosa de evitrocitos @ dichos Wyo iy 7G) Figure 18-5 Representaciones dob recirocas para elo neto de ‘lucosa hacia el interior de os entrectos, en presencia y jena de 6-O:Denci-o-galactosa. El comportamiento le a inhibin competiva, [Segin Barnet, JEG, Homan. GD. Chakly. R.A, y Munday, KA, Biochim. J 1148, 422 (1975)), agentes modificadores de proteinas indica que, de hecho, se trata de una proteina Todas las observaciones anteriores indican que el transporte de giucosa a través de la membrana de eritro- cites es mediado por un niomero limitado de portadores proteicos. Antes de discutir el mecanismo de dicho sistema de transporte, sin embargo, debemos exami- nar algunos modelos mas sencillos de difusion facili- tada, C. Ionéforos Nuestra comprensin del transporte mediado ha aumentado con el estudio de los ionéforos, sustan- cas que aumentan enormemente la permeabilidad de Jas membranas a unos determinados tones, Los iondforos pueden ser portadores 0 formadores de canales Los jon6foros son moléculas organicas de diversos tipos, muchas de las cuales son antibioticos de origen bacteriano. Las células y organulos mantienen activa- ‘mente los gradientes de concentracion de varios jones a través de sus membranas (Seccién 18-3A). Las pro- piedades antibidticas de los ionoforos se deben a st tendencia a descargat estos gradientes de concentra- cién vitales, Existen dos tipos de ionoforos: 1. Portadores, que aumentan las permeabitidades de ‘membrana a sus iones caracteristicos mediante su union ellos, difundiéndose através de la membrana y liberan-526. Secon 18-2 Cinética y mecanismos de transporte Figura 18-8 Estructura de rayos-X de fa valinomicina. (a) Compleo con IK" Los sos dtomos de oxigeno quo complejan ‘ciaédricamente al ion K” son de color 70 mas oscuro ‘ue ls otros atomos. [Sogun Neupert-Laves, Ky Dobler, efecto, ninguna otra sustancia conocida discrimina tan finamente entre Na* y K* El ion6foro fijador de Na‘, monensina (Fig. 18-9a), tun acido carboxilico poliéter lineal, es quimicamente. diferente de la valinomicina, Sin embargo, el analisis por rayos-X revela que el complejo de Ia monensina ‘con Na* posee las mismas caracteristicas generales que el complejo de la valinomicina con K*, ya que la ‘monensina coordina al Na’ octaédricamente, de ‘modo que lo recubre con una envoltura apolar (Fig, 18.90). Otros ionsforos portadores tienen caracteristi cas similares, @ « wh OXY HA, estructural, con lo seis atomos de ‘oxigen que complojan ociaéaicamente al Na" indicados fen rojo (6) Estructura de rayos-X del complejo con Na (8. ‘tomos Jo hcrogeno no se muestran) [De Duan, WL Smith. y Song, P.0., J. Am. Chem Soe. 102, 6728 (1980) IM, Holy. Chim. Acta 58,439 (1975) (t) Vatinomicina no ‘ompleada. [De Smith, G.., Duax, WL, Langs, DA. Defitta, 6.T., Edmonds, F.C, Rohrer, O.C., y Weeks CM. ‘J. Am. Chem. Soe. 97,7242 (1975) Los atomos de Fidrégeno:no se muestran La gramicidina A forma canales transmembrana en forma de hélice La gramicidina A es un ion6foro,aislado de Bacillus brevis, que forma canales, permitiendo el paso de protones y cationes alealinos pero que se bloguea con, ‘Ca. Es un polipeptido lineal de 15 restos, alternando restos Ly D, que se bloquea quimicamente por formi- Jacion en su amino terminal y por un enlace amido con etanolamina en su carboxilo terminal (Fig, 18-10) Obsérvese que todos sus residuos son hidrofobicos como se espera de un polipéptide transmembrana Pequefo. Estudios realizados mediante NMR y crista-528 Sercidn 18-2 Cinética y meceniomos de transporte cadena principal revisten el canal central, facilitando, por tanto, el paso de los iones. El modelo esta de acuerdo con los resultados de medidas espectroscopi- ‘eas y de NMR de la gramicidina A en bicapas lipii- D. Mecanismo del transporte mediado pasivo de glucosa Las proteinas integrales de membrana se hallan o bien expuestas a solo una superficie de la membrana, 6, en el caso de proteinas transmembrana, orientadas solo en una direccién con respecto a la membrana (Gecci6n 11-34). Puesto que las velocidades de rota- cidn de las proteinas en las membranas son insignifi- cantes, ef modelo del portador mévil que describe el ‘mecanismo de ionéforos como la valinomicina (Fig. 18- 6a) no es aplicable al transporte mediado por proteinas; més bien, parece mis aplicable algsin tipo de mecanismo de canal 0 poro E] transporte de glucosa ocurre mediante un mecanismo de poro con puerta Fl transportador eritroctario de glcosa es una ghi- coproteina de 55 kD que, de acuerdo con el analisis, de su secuencia, posee tres dominios principales: (1) tun haz de 12 helices a que atraviesan la membrana y {que se cree forman un cilindro hidrofobico, que rodea tun canal hidrofilico a través del cual se transporta la sglucosa; (2) un gran dominio citoplasmatico, con un elevado ntimero de cargas; y (3) un dominio externo ‘menor que contiene carbohidratos. El transportador de glucosa constituye un 2 % de todas las proteinas dde membrana de los eritrocitos y se separa como la banda 4.5 en geles de SDS-PAGE, a partir de las ‘membranas de eritrocitos (Seecién 11-3C; no es vis ble en el gel representado en la Fig, 11-32, debido a ue la heterogeneidad de sus componentes oligosaci- ‘dos hace que la banda de proteina aparezca difusa) Dos observaciones apoyan la hipotesis de que el transportador eritrocitario de glucosa esti dispuesto asimétricamente en la membrana 1. La galactosa oxidasa oxida las unidades de galac- tosa de los carbohidratos del transportador de glu- «cosa, sélo cuando la oxidasa se encuentra fuera de Jos eritrocitos, Las unidades de galactosa del trans portador deben, pues, localizarse en la superficie externa de la célula del exitrocito, 2, La tripsina solo interrumpe el transporte de ghico- sa cuando actia desde el interior de eritrocitos fantasmas. Los restos de aminodcidos del transpor tador sensibles a 1a tripsina deben, por lo tanto, localizarse silo en la superficie citoplasmatica de la ‘membrana plasmatica de los eritrocitos. Los sitios de fijacion de glucosa, a ambos lados de a membrana de los eritroctos, satisfacen tambien distintas condiciones estericas. John Barnett observ que la adicion de un grupo propilo al C(I) de la ae i tng mya 12 Modelo de la conformacon aterna para el transporte de ‘lucosa, Dich sistama se conoce tambin como "pore con puerta. (Seguin Baldwin, S.A.y Lennard, Ge, Trends ‘Biochem. Se: 6, 210 (1981) slucosa impide la union de la glucosaa a superficie Exema dela membrana, mientras que la adition de tun grupo proplo al C(6) impide la union ala super fie interna. Por To tanto, propuso que esta protlna transmembrana pose dos’ onformaciones alterna vas" una con el sto de la glucosa mirando hacia la Superie celular externa, que requiee un contacto on O(1) y dea el O(6) ibe: la ota con el sitio de la slucosa mirando hacia la superficie celular interna, fue requlere un contacto con O46) y dea el OG) ibe (Gig. 18-13). Al peecer, ef transporte ene lager por tintin deta glucosa a a protina en una cara deta ‘membrana, sguido por un cambio conformacona que Ciera el primer so mientras expone el oto. A cont nuacion la glicosa puede disoGarse de a proeina, Con lo que habré sido translocada a taves. de la membrana. Elciclo de transporte se completa con el regreso del transportador de glucosa a su conforma: {lon nia en ausenca de ghicosa unida, Puesto que ste ciclo puede ocurt en ambas direcciones, la di Feccin del transporte eto de glacosa se produce de alts bajas concentaciones de glucosa, El anspor tador de glicosa proporciona, pues, an medio para quilbra a conctntcion de gucosa a taves dela ‘membrana de los ertoctos, sin otro paso de molecu Tas pequeias ofones que la acompafien,al all Hi aL ‘ea ce a ith #530 Secidw 18:3 Transporte activo imputsado por ATP A yuera) Acdomro) Ungar fuera) Adem Segoe Bfuera) Beaentr) Acfuerad Alden) peupate Bcnera) Bueno) Fioura 18-18. ‘slomas de transtocactn uniporte,simpore y antiporte, 1, Un uniporte supone el movimiento de una anica moléeula a la vez. El tansportador de glucosa de eritrocitos es un sistema uniporte 2. Un simporte transporta simultineamente dos mo- leculas diferentes en la misma direccion, 3. Un antiporte transporta simultineamente dos mo- leculas diferentes en direcciones opuestas El caricter eléctrico del transporte ionico se especifica ademis como: 1, Blectroneutro (cléctricamente inexistente), cuando hay una neutralizacion simultanea de cargas, sea por un simporte de iones de carga opuesta 0 por tun antiporte de iones de similar carga. 2, Blectrogénico, cuando el proceso de transporte resulta en una separacion de cangas a través de la ‘membrana, Puesto que la concentracién de glucosa en el plas ma sanguineo es generalmente mayor que en las células, el transportador de glucosa de eritrocitos nor~ ‘malmente transporta glicosa hacia el interior de los eritrocitos, donde se metaboliza a través de la glucoli- sis, Muchas sustancias, sin embargo, se encuentran en. tun lado de Ja membrana en menor concentracion que la que se requiere en ef otro lado de la membrana Estas sustancias deben transportarse activa y selecti- vamente a través de la membrana. EI transporte activo es un proceso enderginico gue cesté a menudo acoplado a ta hidrélisis de ATP. ;Como tiene lugar este acoplamiento? En las reacciones bio sinteticas, éste ocurre a menudo medjante la fosforla- cion directa de una sustancia por ATP; por ejemplo, la cartoon Sitios de incién ‘cin de ATE uct dimérica de la (Na"-K")-ATPasa que ‘musstra su orontacon en la membrana plasmétca, formacion de UTP en la sintesis del glucogeno (Sec- ion 17-2). No obstante, el transporte de membrana, normalmente, es mas un proceso fisico que quimico; Ja molécula transportada no resulta alterada quimica- ‘mente. La determinacion del mecanismo por el cual la cenergia libre de la hidrdlisis del ATP se acopla a un proceso endergonico ha constituido, pues, un proble- ima dificil de resolver. En esta seccion, estudiaremos las proteinas de transporte de células animales que son, de hecho, directamente fosforiladas por ATP durante el proceso de transporte. También examina~ zemos un proceso de transporte activo bacteriano, en €l cual las moléeulas transportadas son fosforiladas al ‘mismo tiempo. En la seccion siguiente, estudiaremos los sistemas de transporte, que acoplan la descarga ‘exergonica de los gradientes de potencial electro ‘ico al transporte de iones y de moléculas neutras en contra de sus gradientes de concentracin, A. La (Na‘-K*)-ATPasa de las membranas plasmaticas [Uno de los sistemas de transporte activo mas am- pliamente estudiados es la (Na'-K')-ATPasa de las ‘membranas plasmaticas. Esta proteina transmembra~ nna se aisl6 por primera vez en 1957 por Jens Skou, Hasta hace poco, se creia que constaba de dos tipos de subunidades: una subunidad @ no glucosilada de 110 KD, que contiene la actividad catalitca del enzi- ima y los sitios de fijacion de iones, y una subunidad sglucoproteica de ~ 55 kD de funcion desconocida, Se ‘cree que la proteina posee una composicion de subu- nidades (a), (Fig. 18-16), pero no esta claro si esta estructura dimérica es furcionalmente necesaria. Re- Cientemente, se ha descrito un polipéptido de 10 kD, denominado subunidad 7, como componente de la (Na"-K:)-ATPasa de membrana plasmatica, con lo que probablemente Ia composicion de subunidades seria a,fh7. La subunidad parece no ser esencial para la actividad ATPasa aunque puede tener una582, Secién 18-3. Transporte activo impulsade por ATP. 41. E,-3Na’, que adquiere su Na* dentro de la célula, se une al ATP para rendie el complejo ternario E, ATP 3Nat 2. El complejo temario formado reacciona para dar fl intermedio aspartil fosfato de ‘alta ‘energia” E, ~ P-3Na’ Este intermedio de ‘alta energia” se relaja.a st conformacion de “baja energia’, E, ~ P+ 3Na*, y libera su Na’ unido al exterior de la célula, es decir, el Na’ se transporta a través de la membrana, ELE, ~P se une a2 K* del exterior de la célula para formar F, ~ P- 2K’ 5, Bl grupo fosfato se hidroliza rindiendo E; » 2K" 6. BLE, - 2K" cambia su conformacién, libera sus 2K" cen el interior de la célula, y los remplaza con 3Na’, para completar asi el ciclo del transporte El orden obligatorio de la reaccion requiere que el ATP se pueda hidrolizar solo cuando el Na se trans- porta “cuesta arriba. Analogamente, el Na* solo pue- de transportarse “euesta abajo” si se sintetiza ATP al ‘mismo tiempo. En conclusion, a pesar de que cada luno de los pasos de las reacciones anteriores es, de hecho, individualmente reversible, el ciclo, tal como se representa en la Fig, 18-18, circula solo"en el sentido de las agujas del reo}, en condiciones fsiol6- gicas normales. Se cree que el enzima sélo tiene un. tipo de sitio de fljacion de cationes, que cambia apa. rentemente tanto su orientacién como su afinidad durante el curso del ciclo de transport. La desestabilizacién mutua es responsable de la velocidad de transporte de Na* y de K* El anterior mecanismo cinetico ordenado responde s6lo al acoplamiento del transporte activo con Ta hi drolisis de ATP. Para mantener una velocidad de trans eee oer dt 1. Finclon de ATP Nat (dentro 8K (dentro), 6 Transporte eK porte razonable, las energias libres de todos sus interme dios deben ser aproximadamente iguales, Si uno de los intermediarios fuera mas estable que oto, el mas estable se acumularia con una notable reduccion de ta velocidad global de transporte. Por ejemplo, para que el Na* se transporte fuera de la célula, cuesta arriba, su union a E, debe ser fuerte en el interior y débill a E, en el exterior. Una unin fuerte significa una mayor-estabi- lidad y un “cuello de botella” potencial Esta dificul- tad se contrarresta por la fosforilacion de E, « 3Na* y su cambio conformacional subsiguiente para rendir E,~ P, de baja afinidad para el Na* (Pasos 2 3, Fig. 18-18). De modo similar, la fuerte union del K* al E,~P en el exterior se ateniia con su desfosforilacion ¥ cambio conformacional para rendi E,, de baja afi- nidad para el K* (Pasos 5 6, Fig. 18-18), Son estas utuas desestabilizaciones las que permiten que el Nat y el K" se transporten a una velocidad ripida, Los glucdsidos cardiacos inhiben especificamente Ia (Na’-K*}-ATPasa I estudio de la (Na’-K')-ATPasa se ha facilitado ‘enormemente gracias al uso de glucésidos eardiacos (tambien amados esteroides cardioténicos), pro- ductos naturales que aumentan la intensidad de la contraccién del musculo del corazon. Ademas, la gitalina, un extracto de las hojas de la Digitalis pur- urea (Fig. 18-192), que contiene una mezela de glu- ésidos cardiacos, se ha usado para tratar fallos cardiacos durante siglos. Dos de estos esteroides, die gitoxigenina y ouabaina (Fig, 18-198), aun se en- uentran entre Jos farmacos de accion cardiaca mas cominmente recetados. Estas sustancias inhiben la (Na"-K")-ATPasa, uniendose fuertemente a una por- ion del enzima expuesta al exterior (estos farmacos no son efectivos cuando se inyectan al interior de las células), de modo que bloguean el Paso 3 de la Fi 18-18. El consiguiente aumento de la (Na’] intracela- EP aa “ata enereo™ ay Macin de Na HOHOOG OOOOIR OOOODOO eODODOK fae ake SES yo oak Eequoma cindtico para ol ransporte active de Na*y de K* mediante la (Na’-K'}-ATPasa,lar causa un aumento de la actividad del sistema antiporte (Na‘-Ca™) cardiaco, que bombea el Na* hacia fuera y el Ca’ hacia dentro de la célula (Seccion 20-1B). Puesto que el Ca* provoca la contraccién muscular (Seccién 34-3C), el aumento de la [Ca*] intracelular da lugar a un aumento de la fuerza de la contraccién muscular cardiaca, B. La Ca**-ATPasa EI Ca actiia a menudo como segundo mensajero, de forma similar al AMPc. Un incremento transitorio de la [Ca®*] citosolica provoca numerosas respuestas celula- res, incluyendo la contraccién muscular (Seccién 34- 30), liberacion de neurotransmisores (Seccién 34-4C) y, como hemos visto, la degradacién del glucogeno (Geccién 17-3C). Ademas, el Ca®* es un importante activador del metabolismo oxidativo (Seccion 19-4). En espacios extracelulares, la [Ca**] (~ 1500 uM) es cuatro érdenes de magnitud superior que en el citosol (~ 0,1 uM), Este importante gradiente de concentra- cion se mantiene mediante el transporte activo de Ca®* a través de la membrana plasmatica, el reticulo endoplasmatico (reticulo sarcoplasmic en masculo), y la membrana mitocondrial interna. Trataremos el sistema mitocondrial en la Seccién 20-1B. La mem- brana plasmatica y el reticulo endoplasmatico contie- ‘nen ambos una Ca*-ATPasa que bombea activamen- te el Ca** fuera del citosol a expensas de la hidrolisis de ATP. Sus mecanismos cinéticos (Fig. 18-20) son muy similares a los de la (Na*-K*)-ATPasa (Fig. 18- 18). De hecho, hay una similitud significativa entre estas proteinas, sugiriendo que provienen de un ante- pasado comin, La calmodulina regula la bomba de Ca** Para que una célula se mantenga en su estado fisiologico caracteristico, debe regular las actividades de sus bombas iénicas con precision. La regulacién de la bomba de Ca®* en la membrana plasmética se controla por et nivel det Ca, mediado por calmodulina (CaM). Esta proteina eucaristica ubicua, que une Ca”, parti- cipa en numerosos procesos reguladores celulares, seialando el nivel de Ca®* a una gran variedad de proteinas, incluyendo las bombas calcio, las proteina quinasas (Seccién 17-3C) y las proteinas responsables de la motilidad (Seccién 34-3), La secuencia de 148 restos de la CaM, muy conservada, presenta el rasgo caracteristico de que la Lys 115 esta trimetilada, de modo que su amina cuaternaria se encuentra siem- pre cargada positivamente. La proteina, cuya estruc- tura de rayos-X fue determinada por Charles Bugg, tiene una curiosa estructura en forma de pesas, que consiste en dos dominios globulares conectados por una hélice a con siete vueltas (Fig. 18-21). La calmodulina tiene cuatro sitios de fijacién de Ca®* de elevada afinidad, dos en cada uno de sus dominios globulares. Todos ellos estén formados por motivos hélice-lazo-hélice casi superponibles, conoci- dos como manos EF (Fig. 18-22), también presentes Capitulo 18, Transporte a través de membranas 533 HCL CH, ¢ wl aL) on Digitoxigenina HO t ) HO OH Figura 18-19 (@) Las hojas de la planta Digitalis purpurea (dedalera purpura) son fuente del estimulante de musculo cardiaco igitalina, (Derek Fell.] (6) Dos de los componentes. principales de la digitalina son los glucosidos cardiacos ouabaina y digitoxigenina.534 Seccién 18-3, Transporte activo impulsado por ATP y formacién del Intermedio de “alta energia” } 1. Fijacién de ATP. | | Interior | 4. Recuperacion 2. Tansporte | Ge cat Exterior 3. Hidrélsis ~> 2Ca** (fuera) | de fostato b+] P I Figura 18-20 Mecanismo cinético de la Ca**-ATPasa. En este caso, (dentro) se refiere al citosol y (fuera) se refiere a la parte exterior de la célula para la Ca’*-ATPasa de la membrana plasmatica o al lumen del reticulo endoplasmatico (reticulo sarcoplésmico) para la Ca®*-ATPasa de dicha membrana, en otras proteinas fijadoras de Ca" de estructuras conocidas. En cada uno de estos sitios, el ion Ca** esta coordinado octaédricamente por dtomos de oxigeno de la cadena principal y de las cadenas laterales de la regién del lazo, asi como de una molécula de agua asociada a la proteina. La union del Ca?” a cualquiera de los dominios de la CaM induce un cambio confor- macional en dicho dominio, de forma que resulta expuesta una regién hidrofébica rica en Met, que de otto modo se hallaria oculta. Esta region, a su vez, se tune con elevada afinidad, aunque con amplia especi- ficidad de secuencia, a las hélices a basicas anfifilicas de las proteinas diana y, con ello, modula las activi- dades de estas proteinas. De hecho, segmentos de estas hélices de ~ 20 restos, asi como hélices anfifili- cas compuestas s6lo de restos de Leu, Lys, y Trp, se unen a la CaM tan fuertemente como las mismas proteinas diana. La amplia especificidad de secuencia de la CaM se explica, en parte, por la flexibilidad de sus cadenas laterales de Met, que se cree permiten que sus fragmentos hidrofdbicos se adapten a una variedad de cadenas laterales hidrofdbicas en las héli- ces anfifilicas de las proteinas diana A pesar de la apariencia extendida de la CaM, en su estructura de rayos-X (Figura 18-21), varios estudios recientes indican que sus dominios globulares pueden unirse simultaneamente a una tinica hélice diana. Evidentemente, la hélice a central de la CaM sirve mas como una atadura flexible que como un espacia- dor rigido, propiedad que probablemente hace crecer aiin mas la variedad de secuencias diana a las cuales puede unirse la CaM. La Ca*-calmodulina activa la Ca’*-ATPasa de las membranas plasméticas, La activacién, tal como se de- duce del estudio de la ATPasa aislada, da lugar a una disminucién en su Ky para el Ca* desde 20 a 0,5 uM. Ahora podemos ver cémo el Ca** regula su propia concentracién citoplasmatica: a niveles de Ca’* por debajo de la constante de disociacion de la calmoduli na para el Ca®*, ~ 1 4M, la Ca**-ATPasa es relativa- mente inactiva. Sin embargo, si la [Ca*] aumenta hasta este nivel, el Ca®* se une a la calmodulina que, a su vez, se une a y activa la bomba de Ca”: Ca** + CaM == Ca?*-CaM* + bomba (inactiva) = Ca?*-CaM*-bomba (activa) (CaM? indica calmodulina activada). Esta interaccion disminuye la K,, de la bomba para el Ca** hasta un valor por debajo de la [Ca**] del ambiente, haciendo, asi, que el Ca** sea bombeado fuera del citosol. Cuan- Figura 18-21 Estructura de rayos-X de la calmodulina de testiculos de rata, Esta proteina monomérica de 148 restos contiene dos dominios globulares notablemente similares separados por tuna hélice « con siete vwueltas. Los restos aparecen coloreados segun los angulos de conformacién de la ‘cadena principal (¢ yy: Fig. 7-7): azul claro, angulos de hélice a; verde, angulos de hoja B; amarillo, entre hélice y hoja: y purpura, hélice arrollada a la izquierda. Los restos, de Gly son blancos y el N-terminal, azul oscuro. Los dos sitios de fijacion del Ca’* en cada dominio se representan con esferas blancas. [Por cortesia de Michael Carson, University of Alabama at Birmingham. Estructura de rayos-X determinada por Charles Bugg.)Figura 18-22 . Los sitios de fijacién de Ca®*, en muchas proteinas cuya funcion es sensible a los niveles de Ca*, estan formados por motivos hélice-lazo-hélice, denominados manos EF. [Seguin Kretsinger, R.H. Annu. Rev. Biochem. 45, 241 (1976).] do la (Ca*'] disminuye suficientemente, el Ca®* se disocia de la calmodulina y esta serie de sucesos se invierte, inactivando asi la bomba. El sistema comple to es, por tanto, andlogo a la bomba del sumidero de un sotano, que se activa automaticamente mediante una boya cuando el agua alcanza un nivel determina- do. C. La (H*-K+)-ATPasa de la mucosa gastrica Las células parietales de la mucosa gastrica de los ‘mamiferos secretan HCI a una concentracién de 0,15M (pH 0,8). Puesto que el pH citosdlico de estas células es 7,4, ello representa una diferencia de 6,6 unidades de pH, la mayor conocida en células eucaridticas. Los protones secretados proceden de la hidratacién intra- celular del CO, por accion de la carbonico anhidra: CO, + H,O == HCO; + Ht La secrecion de H’ comporta la participacién de una (H'-K*)}-ATPasa, un antiporte electroneutro con propiedades similares a las de la (Na*-K*)-ATPasa. De modo parecido a las (Na*-K*)- y Ca?*-ATPasas, con las que esta relacionada, se fosforila durante el proce- so de transporte. En este caso, sin embargo, el K*, que entra en la célula cuando el H* se bombea hacia fuera, se externaliza seguidamente mediante su cotransporte Capitulo 18, Transporte a través de membranas 535 electroneutro con Cl producto transportado. El HCI es, en definitiva, el Durante muchos afios, el tratamiento efectivo de las uilceras pépticas, una afeccion frecuente- mente fatal causada por el ataque del acido del estomago sobre la mucosa gastrica, requiere a menudo la extraccion quirirgica de las porcio- nes afectadas del estémago. El descubrimiento, por James Black, de la cimetidina, N~ ON H Hy CHy-~ S—~Clty~- CH N= C= N= = wh N Cimetidina (CH,—CH,—NH} HN UN Histamina «que inhibe la secrecién acida del est6mago, ha eliminado casi por completo la necesidad de esta peligrosa y debilitadora intervencidn. La (H'-K*)-ATPasa de la mucosa gastrica se activa por estimulacién con histamina del receptor de la superficie celular, en un proceso mediado por AMPe. La cimetidina (nombre comercial: Tagamet) y sus andlogos, que inhiben compe- titivamente la union de histamina a este recep- tor, son actualmente los farmacos mas comin- ‘mente recetados en los Estados Unidos. D. Translocacién de grupo La translocacién de grupo es una variacién del transporte activo impulsado por ATP que usan las bacterias gram-negativas para importar determinados azticares; difiere del transporte activo en que las molé- culas transportadas son, al mismo tiempo, modificadas quimicamente, El ejemplo de translocacién de grupo més extensamente estudiado es el sistema fosfo- transferasa dependiente de fosfoenolpiruvato (TS) de E. coli, descubierto por Saul Roseman en 1964. El fosfoenolpiruvato (PEP) es un dador de fos- fato para este sistema (recordar que el PEP es un dador de fosfato de “alta energia” para la sintesis de ATP en la reaccién de la piruvato quinasa de la glucdlisis; Seccién 16-2)). El PTS transporta y fosforila azticares, simulténeamente. Puesto que Ia membrana ce- lular es impermeable a aziicares-fosfato, una vez han entrado en Ia célula, permanecen alli. Los azicares transportados se detalian en la Tabla 18-2. El sistema PTS esta constituido por dos proteinas citoplasmaticas, el Enzima I (E 1) y la HPr, que parti- cipan en el transporte de todos los aziicares (Fig. 18-23), Ademas, para cada azticar que transporta el sistema, existe una proteina de transporte transmem- brana especifica E Il y, en algunos casos, una proteina536 Seccién 18-3, Transporte activo impulsado por ATP PP, + AMP: AP 1, Fosforllacién 2. Transferencia ée EL dol fosforilo del fostorilo or PEP aher aem Pievato YX eI ae Her PEP. er Her P Figura 18-23 Transporte de glucosa mediante el (PTS). HPr y E | son proteinas citoplasmaticas comunes transportados. ciclasa se activa en presencia de E Ill, ~ P. especifica de azicar E III que, para algunos aziicares, se encuentra unida a la membrana y, para otros, en el citoplasma. El transporte de glucosa, por ejemplo, requiere la participacion de E ll, y E Ill, El transporte de glucosa, que se parece al de otros azticares, tiene lugar como sigue (Fig 18-23): 1. El PEP fosforila a E 1, formando un aducto de fosfohistidina reactivo. Fosfohistidina . El grupo fosforilo se transfiere del N(1) de un resto de His a la HPr. Al parecer, la His es un aceptot preferido del grupo fosforilo en las reacciones de transferencia de fosforilo. Participa también en la reaccidn de la fosfoglicerato mutasa de la glucélisis (Seccién 16-2H). Tabla 18-2 Aziicares transportados por el sistema fosfotransferasa dependiente de PEP (PTS) de E. coli Glucosa Manitol Fructosa Sorbitol Manosa Galactito! N-Acetilglucosamina Lactosa 3. Transferencia Inteoe Q ® todos los azucares Il, y E lll, son proteinas especificas para la glucosa. La adenilato 3. La HPr ~ P contintia la cadena de transferencia del fosforilo, fosforilando a E Ill,. 4. El grupo fosforilo se transfiere finalmente desde E Ill, a la glucosa que, durante este proceso, se transporta a través de la membrana por accién de E IL. La glucosa es liberada en el citoplasma sola- mente después de fosforilarse a glucosa-6-fosfato (G6P). De este modo, el transporte de glucosa es impulsado a través de 1a fosforilaci6n exergénica indirecta por medio del PEP. El PTS es un sistema eficiente desde el punto de vista energético, ya que s6lo se requiere un equiva- lente de ATP para el transporte y la fosforilacion de glucosa. Cuando las etapas de transporte activo y fosforilacion tienen lugar separadamente, como octi- re en muchas células, se hidrolizan dos ATPs por cada glucosa procesada, El transporte bacteriano de azticar esta regulado genéticamente EI PTS es mas complejo que los otros sistemas de transporte que hemos visto, probablemente porque es parte de un complicado sistema regulador que gobier- na el transporte de aziicares. Cuando alguno de los azticares transportados por el PTS se encuentra en abundancia, el transporte activo de los azticares que entran en la célula a través de otros sistemas de transporte se inhibe. Esta inhibicion, denominada re- presién por catabolito, esta mediada por la concen- tracion de AMPe (Seccién 29-3C). El AMPc activa la transcripcién de los genes que codifican varias protei- nas de transporte de azticar, incluyendo 1a lactosa permeasa (Seccién 18-48). La presencia de glucosa dalugar a una disminucién en la [AMPc] que, a su vez, reprime la sintesis ale estas otras preteinas de trans- parte dle aziicaz. El mecanisme de central de la [AMIc} se cree que reside en E Ill,, que se fesferila transiteriamente en el Pace 2 del pracese de transpsrte ade PTS (Fig. 18-23), En ausencia de glucesa, este enzima se acumula en su farma fesferilada, Se cree que E Il, ~ P activa la adenilate ciclass, que da lugar a elevadas concentra- canes de AMMc, Cusnds In glucese es sbundente, le cancentracién de E Il, ~ P en el estade estaciensria disminaye, al farmarse G6P durante el precese de trans parte mediante el PTS. Le adenilate ciclase, por tents, se desactivg, disminuye In cancentraciin de AMBc, y se reduce le sintesis de lactecn permense, esi come de aires proteinas enwueltes en el metabslisme de lactesa, Para la célula, ésta es una forma de censervar energia. Per qué sintetizar las preteinas necesarias para el trans- pacts y el metabalisme de tedes les aziicares cuande selamente tendré lugar a la vez el metabslisme de un tinice aziicar? 4, TRANSPORTE ACTIV®. IMPULSAB® P®R UN GRABDIENTE ®E I®@NES Les sistemas come la (Na’-K*)-ATPasa, discutides previamente, ulllizan la energla libre de la hisrélisis del ATP para generar graslientes de patencial electre- ice a través de Iss membranas. A la inversa, It energin libre almacenade en un grasiente de petencial clectrequlmice puede aprevecharse pare impulsar variss pracesas fisialégicas endergi ‘Ademés, la sintesis () rhmsinw dead Velie epiciaoe colurmnares (can verde en forma se copie) Capiares Velawiades " Intestinal Figure 18-26 ‘Tranggacts ae gluceea en ef epiieile intestingl. Las volissidasea, 2n ferme de copie, gus revistsn el interisr sol iniestine selgade, aumenien snermemsnte al gree aupectiois, faciltanss par tante Ia avgercién ae nutrientse. Las oblulas own bards en ferma de copille, & partir de as Capitule 18, Transparte « través de membranes $37 die ATP por la mitecenszia y lee cleceplastes est impulsada mediante la disipacién de gradlenies de pretén generadas a través del transparte electzénice y la fetesintesis (Seccienes 28-3C y 22-28). En esta seccién, discutimes les precesss de transparte active impulsades por la disipacién de gradientes itnicas. Censideramas tres ejemples: captura de glucesa testinal per el simparte de Na'-glacesa, captura de lactesa par la lactesa permeasa de E, coli y transieca- dor de ABF-ATP mitecendri A, Simperte de Na*-glucesa La glucesa precedente de la nutricién s¢ concentra activamente en lao célules con miccevellasidades, con barde en ferme de cepilla, del epitelie intectinal mediante un simparte dependiente de Ne* (Fig. 18- 24), Se transperta deode estas células al sistema circu- laterie, a través ae un uniparie de gluceca mediade pasive lecalizade en el lade capilar de la oflula, y que cs similar al de la memibrana ae les eritrecites (Sec- cin 18-28), @botrvece que, « peser de que le fuente inmedinte de energin pare el transperie de glucese en el intestine es el grediente de Ne‘, en realidad es lx energin libre de le histrblisis del ATP ln que impulse este pracese, 4 través del mantenimiente del gradiente de Ne par le (Na*-K)-AT Pest Les transporiaderes actives y pasives de glucrsn precentan diferentes suscepiibilidades frente a dragas Les des sistemas de transperte de glucesa sen inhi- isles par distintas dregas: 1. La flecicine inhilse el tranoperte de glucess depen- diente de Na‘. (0) Tearsperia ds gueeca lumen intestinal <-——————> Capieres Smmparts de Nev-gueess Cuts ards fan forms de capile cules 20 fermen tas vellesidasins, canceniran scilvemants Ip giucesa dal lumen intesting! en un prewzae simperts oan, Na’, impuissde per In (NaY-K*)-ATPass. La gluceea 28 cxparta a [a cartisnts senguines a través os etre sisters Lnigarte mesiege pasive, cur oi as (ws eritracties.538 Seccidn 18-4. Transporte activo impulsade por wn gradiente de ivnes 2. La ci indepe: calasina B inhibe el transporte de glucosa iente de Na*. “or O bGlucosa-f Floricing Citocalasine B Ambos inhibidores se unen sélo a la superficie exter- na de sus respectivas proteinas diana, lo que ademas indica que estas proteinas estan insertadas asimétrica- mente en las membranas. El uso de estos inhibidores permite poder estudiar separadamente la accion de los dos transportadores de glucosa en células intactas. Les estudies cinéticos realizades indican que el simporte de Na*-glucosa une sus sustratos, Nat y glucosa, sin un orden determinado (Fig. 18-25). Sin embargo, sélo cuando se unen ambes sustratos, la proteina cambia de conformacién, exponiende su si- tio de fijacién al interior de la célula. Este requisite indispensable para el transperte concomitante de Na* y glucosa evita el despilfarre que supondria la disipa- cin del gradiente de Na’. B. Lactosa permeasa Las bacterias gram-negativas como E. coli contie- nen varios sistemas de transporte active para concen trar aziicares, Ya hemos discutido el sistema PTS. Figura 18-25 Net Gh Er sistema simporte de Na*-glucosa, i representade come un mecanisme cinético Pens boi bi estadlistico, T, y T, representan la protsing de transperie con sus sitios de fijacién expuestos a las superticies exterior e interior de la membrana, respectivamente. T, [Segun Crane, R.K., y Borando, F. Martenesi, A.N. (Ed), Membranes and Transport, Val. 2, p. 164, Plenum Press (1882) Gle +t Fllecién E2616 sciees Figura 18-26 Mecanisme cinétice de a lactesa permeasa en E. coll. La lactosa y el H’ se unen a E-2 fuera de la célula y se iberan do E-1 dentro de la célula, siguiende un orden al azar. E-2 ‘debe unir tante lactosa come H" para que su conformacién cambie a E-1, cotransportando asi estas sustancias hacia, ol interior de ia célula. E-1 cambia su conformacién a E-2 ‘cuando ne estan unides ni a lactosa mi el H°, completande asi el ciclo de transporte. Gtro sistema ampliamente estudiade, la lactesa flac) permeasa (también conocida como galactéside per- meaga) es una proteina transmembrana que media el cotzansporte de un unico protén con una molécula de un B-galactéside, come el disacérido lactesa. Para ello, utiliza el gradiente de protin a través de le meni brane de Ie célula bacteriana (Fig. 18-26). El gradiente de protén se genera metabélicamente a través del metabolismo oxidative, de forma similar al de la mi- tocendria (Seccién 20-38). El gradiente de petercial electroquimico creado por estos dos sistemas se usa principalmente para impulsar la sintesis de ATP. 4Céme sabemes que el transporte de lactesa re quiere la presencia de un gradiente de protén? Ron: Kaback ha establecide ios requisites de este gradiente gracias a las siguientes observaciones: fr, + Gle + Nat Gle = Glucesa1 La velocidad del transporte de lactosa hacia el terior de as bacterin aamentaenormemente con sdici de Olaf, una fuente de energla para [a generasion del gradiente de proton transmer bana la invers, los inhibidores del metabo. to oxidatvo, com el danuro, loguean tao la {Geraci dei gradients de proton coma el tans porte de actos 2. H12.¢-inirofeno, un iondforo de proton qu dis Tos gradients de proton tansmembrana (Se ‘on 20°3D) inhe el wansporte de actos hac el interior, tanto en bacon ilalas come en ese Ine de las membranas 4 La Muoresconcia det dansilaminoctiltiogalactsi- Kory analingus un nhbidor competitive del transporte de lacoss, sensible «la polsdad de su entomo ¥, Por Tanto, cambia al unime ala lctos permease. Las medidas de fuorescenca indian que, en asencs ‘dun gradient de protin ransmembrana, nose {inca fae vesculas de Toe membranas ge cone nen actos permeass 1a lactosa permeasa presenta ds estados ‘onformacionsies i Tactosapermeasa, al igual que la (Na-K')- [ATPasa, es un protein tansmembrana con dose {aos conformaconales (Fg. 18-265 1. Es que ene un io de fjacion de lactosa de baja ‘ida mando hacia el interior de a la, 2-2 que ene n so de fjacion de Iactosa de alta frida mando hacia el exterior dela clu E-1 y E-2 pueden inteconverise solamente cian do sts sitios de fain de Hy lacors eatin o bien mos llenos o bien ambos vacos Elle dmpie tanto in disipacion det gradiote de I, sin eotansporte delactoa hacia el interior del la, como el ans poste de lctsa hala el exterior de nel. sn 0 FRansporte de Hen conta de su gradiente de concen Diseccion funcional de Ia lactosapermesss Medidas de diroisno tula indcan gua ess pro teinn de 417 restos sene mas dean BO de conte So ebcidal las prediciones de estructura secun- ‘Sri unto con lon estudios de manspelacion genet ‘a, supleren que la proeina conta, en su mayor parte de 12 halles w ransmembrana ‘Ta mutagenesis dingida de la is 922 a Arg, Asn, Gln Lys ealuce de mancra espectacular vlosdad del traneporte activo de lactons permeas, micnzas fe Ta ststtucon de cualguera de Tos tos tes estos de His de a protein no ene singer efecto ore a actividad de In permesna Es interesante ob Serve que, a alas concentracones de lactsa la per teas mada en La is 322 media el transporte de Taetosa cust amb sn la consguientetansocacion de proton. De modo sila la permeasa con el Ct 528 mutado a Ala, Cys, Gin, Hi Typo Val eataiza ls fnfrada cesta abajo de lactosa peo no cataliza Utansporte activ os slidn. Ese renstado ests de ‘suerdo cone xquema cndico, en el cual el "la Tata se nena Is permeasa enn orden indeterms ‘nado, enol exterior de aclu, yl Tactosa se ibera ‘dela proteins antes que el HY em el inteor de la ‘Hula (observese qu el pie de Ta Figura 16-26 hace onstat que la unin y Uberacon ociren ambas en tan orden al azar Los estos anteriores sugieren que la His. 322 yt (Gs 325 son pate de un sistema de relevo de proto ese ual ambien requiee la Arg 302 seg indian ‘nsevon etdion de mutagenesis Ademds, 1s ests ios de modelado, sobre las dos poibleshies gue ‘ontenen estos tes restos, siete gue pueden for ‘marrens cadena de enlaces de Riroeno, en cual {grupo guanidino dela Arg 302 forma un enlace de Fidrogeno con el grupo imadaol dela His 322 que. a ss ver forma un enlace de hidrogeno con el grspo ‘arbonilto del Glu 325, formando una ordenacin que recerds la feada catalitn de Ie sernproensas (gure 142. . Translocador de ADP-ATP EL ATP generado en Ia matiz mitocondeal (ou ompartimento interna, Secon 1-2A)-a través dela Tesfonlacon exdativa(Seccion 20-3C), se utilza en ‘tr mayor pate en ef cltowol para imple proces ‘Endemic come, por eempo, a sins el tans pte ative y Ts contaceon mutclae. La membrana Ehtocondea interna contene un sistema que tan porta ATP fuera de ls mates a cambio del ADP po Enc en el ctoplasma por hidroliss del ATE EL Sntipore es electogenico, ya que interambia ADP" por ath "Varios productos naturales inhben a translocacion de ADP-ATP. Fi atractilonido y sr devado carb Slatactigeda inhiben el proctso solo dee la s- Deri extema de a membrana mitocondal intern Er keldo Bongeréquico jece ss ele solo en la Supertice nternaCH, Acide vangeréantce Estes inhibideres, que actian de ferma diferente, han side herramienias valiesas para la purificasién de la proteine tanspestadera y In elusidacion de su mece- nisms de accién. Per ejemple, el transiecader se ha purificads per somal de afinidad (Seccién 5-30), usande derivades del atractiléside come ligan- dos de afinidad. La unién a akactiléside es tambien un edie para identéficar el teanslecader. Bi translecader de ABY-ATP, un dimere de subu- nidades idénticas de 30 KD, tiene semejanzas con ‘tras preteinas transpertaderas, Tiene un sie de fija- cién para el que compiten ABP y ATP. Pesee des cenfermacienes, una cen el sitie de Sjacieén de ATP- Resumen del capitulo Las molécules polares y les isnes se transpertan a través de las membranas bislégicas mediante preteinas de tans- porte iransmembrana espesificas. El cambis de energia libre de las especies wanspertadas depende de la relaién entre sus concentrasisnes en les des lades de la membrana ‘ys si las especies estin cargadas, del petencial de membra- na AY. Le velesided de la difusién ne mediada a kavés de una membrana es una funcién lineal de la éiferensia de cencentracién de las especiss entre les des lades de la ‘membrana, tal ceme erdena Ia primera ley de Fick de la di- fusien, La velosidad del transporte mediade se caracteriza par una cinélica de saturacién ripida y por la espeaifisidad para la sustancia transpertada, También esté sujeta a inhibi- cién céinpetitiva y a inactivacién quimica. Les ienéferes wanspartan ienes a través de las membranas, Les ienéferes periaderes, come la valinemiaina, le hacen envelviende un ion determinads cen una cubierta hidrefébica, seluble en ii Figqurs 18-27 Mecanisme senfermacisnal del transiecadsr de ABP-ATP. Un site de fjacién €e nuclestiges de adenina, lecelizads en ‘#1 dren de cantacte entre las subunidades el simere transleceder, os expusste alternativamente a tes des ledes ‘de la membrana. A eiferencia del transpertader de giueesa (Fig. 18-13), el transiocadsr de ABP-ATP séis pucas ‘cambiar su senfermacién cuands se une al ABP e al ATP. ADP erientade hasia el interier de la mitecendria y el etre con el sitio erientade haeia el exterier (Fig. 18- 27), El translecader es un antiperte perque deve unir- se al ligande para cambiar de un estads cenfermacis- nal al ole a una velecidad fisislégicamente razenable. El translecader de ABP-ATP ne es en si misine un sistema de transporte active, Sin embargs, su exparia- sign electregénica de una carga negativa per cada sicle de transparte, en la direceién de expertacién de ATP-importacién de ABP, es impulsada mediante la diferensia de peteneial de membrana AY, 2 través de la membrana mitecendrial interna (pesitiva fuera). Elle da lugar a una fermasién de gradientes de ATF y ADP a través de ia membrana. las membranas, que puede difundir libremente a través de Ja membrana, Les ienéferes fermageres de canales, come la ‘eamicidina A, ferman un pore transmembrana a través del cual pueden difundirse selectivamente les ienes. El tans- porte de glucesa a través de la membrana de les eritresites esta mediade per una glucepreteina transmembrana dimé- ica que puede adeptar des cenfermasianes: una cen un sitio de Gjasion de glucssa srientade hacia Ia superficie externa de la célula y la otra con el sitio de fjasi¢n de lucesa erientade hasia el eitesel. El transpsrte acurre me- ante Ia unién de glucesa a le preteina en una cara de la membrana, seguide per un carnbie cenfermacienal que cie- ra este site y expene el etre (un pers cen puerta), El transporte active de meléculas 6 ienes en centra de un te de cencenteacién requiere un apatie de energia libre. La energia libre de la hirélisis del ATP se acepla al transperte de tres ienes Na* haeia fuera y des ienes Kthacia dentre de la célula mediante la (Na‘-K*)-ATPasa, Este precese electregénice comperta la fesferilacién de un reste de Asp en presencia de Na’ y su desfesferilacién en presen- cia de K*. La fesferilasién y desfesferilasién se acompafian de cambies cenfermacisnales que aseguran la répida inter- conversién de tedes les intermedies a le large de la ruta de transporte. El transperte impulsade per ATP, de Ca”, me- diante la Ca#*-ATPasa activada per la Ca**-calmedulina, y el de H’, mediante la (H’-K*)-ATPasa, tienen lugar per mnecanismes similares de fesferilacién-desfesferilacién. Las bacterias transpertan azticares per translecacién de grupe, un procese en el cual la sustancia transpertada se medifica quimicamente. El sistema PTS fesferila aziicares al transper- tarles, ulilizande fesfeenelpiruvate come dader de festates. El transperte active puede ser impulsade per la energia Libre almacenada.en gradientes iénices. La glucesa se trans- Bibliegrafia Capitulo 18. Transporte « través de membranas 511 Porta, en las células de epitelie intestinal, en centra de su gradiente de cencentracién a través del simperte de Na’ slucesa, Este precese esta impulsade per la energia libre de a hidrélisis del ATP, ya que el gradiente de Na’ es repueste la (Na*-K*)-ATPasa, El sistema se ajusta a un mecanis- me sinétice bi bi estadistice, le que implica que tante el Na” come la glucesa deben estar unides al transpertader para que se preduzca el cambie cenfermacienal. La lactesa se transperta hacia el interier de E. celi, mediante la lactesa permeasa, un simperte de H'-lactesa. Este pracese es im- pulsade per el gradiente electrequimice de H de la célula que, a su vez, se mantiene per una bemba de protencs aceplada con el metabolisme oxidative, El sistema antiperte de ABP-ATP mitecendtrial interacciena también con el pa- tencial de membrana en el transperte asimétrice de ATP hacia fuera y de ADP hacia dentre de la mitecendria. General Finean, J. B., Coleman R., y Michell, R. H., Membranes and their Cellular Functions (3.* e8.), Capitules 3 y 4, Blackwell Scientific Publications (1984). Franklin, H. M., The Vital Ferce: A Study of Bisenergetics, Capitules 9 y 18, Freeman (1986) Martenssi, A. N. (Ed.), The Enzymes of Bielegical Membranes 2+ ed), Vels. 3 y 4, Plenum Press (1985). [Centiene revi- siones auterizadas de varias prateinas de transperte.] Martenesi, A. N. (Ed.), Membranes and Transpert, Vols. 1 y 2, Plenum Press (1982). [Una celeccién de revisienes certas de muches de les aspectes discutides en este capitule.] Stein, W. 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Si una disolucién de una macromolécula iénica se equi- libra con una disolucién salina, que se separa por una membrana a través de la cual pasan los iones salinos pero no las macromoléculas, se genera un potencial de membrana a través de la membrana. El llamado equi brio Donnan se alcanza porque la impermeabilidad de Ia membrana a algunos iones pero no a otros impide la igualacién de las concentraciones iénicas en los dos lados de la membrana. Para demostrar este efecto, su- poner que el Cl” de la proteina monocatidnica, P*, se component of gastric acid secretion, Curr. Top. Membr. Transp. 16, 135-159 (1982). Lactosa permeasa Kaback, H. R., Active transport in Escherichia coli: passage to permease, Annu, Rev. Biophys, Biophys, Chem. 15, 279-319 (1986). Kaback, H. R., From membrane to molecule with the lac permnease of Escherichia coli, Curr. Top. Cell. Regul. 26, 137- 148 (1985). Kaback, H. R., Bibi, E. y Roepe, P. 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Suponer que las bombas de Na* del eritrocito son inoperantes. . La (Nat-K*)-ATPasa se inhibe con concentraciones del orden de nanomolar de vanadato, el cual forma un ion pentavalente, VOF, con simetria bipiramidal trigonal. Explicar el mecanismo de esta inhibicion. (Indicacién: vvease Seccién 15-28). La (HY-K*}-ATPasa secreta H*, a una concentracion de 0,18M, en células que tienen un pH interno de 7. {Cual es la AG requerida para transportar 1 mol de H’ en estas condiciones? Suponiendo que la AG de la hidrolisis de ATP es ~31,5 kJ- mol", en estas condiciones, y que el potencial de membrana es 0,06 V, negativo en el inte- rior, jcudnto ATP debe hidrolizarse por mol de H* transportado para que este transporte sea exergonico? . Una membrana de 100 A de espesor tiene un potencial de membrana de 100 mV. ;Cual es la magnitud de esta diferencia de potencial en V - cm”? Comentar la magni- tud de este potencial en términos macroscépicos. . El potencial de membrana en reposo (A'Y) de una neu- rona es ~60 mV (negativo en el interior). Si el cambio de energia libre asociado con el transporte de un ion Nat, desde el exterior al interior, es de ~1,9 KJ: mol y la [Na] fuera de Ia célula es de 260 mM, cual es la [Na*] dentro de la célula? Se ha aislado una nueva cepa bacteriana y se quertia saber si la leucina y el etilenglicol entran en las células por difusién mediada o s6lo por una ruta no mediada Para ello, se miden las velocidades iniciales de incorpo- racién de estas moléculas en funcién de la concentra cin extema y se obtienen los datos mostrados a conti- Capitulo 18. Transporte a través de membranas 543 nuacién. 2Qué compuesto(s) entra(n) por una ruta mediada? {Qué criterios se han utilizado para llegar a esta conclusion? Velocidad inicial Compuesto — Coneenrracion de incorporacion (unidades arbitrarias) Leucina 1x 10° 110 2x 10° 220 5x 10% 480 1x 105 830 3x10 1700 1x 104 2600 5x 10+ 3100 1x 103 3200 Etilenglicol 1x 107 1 5x 10% 5 0,01 10 0.05 50 on 100 05 500 10 1000 9. Dibujar las estructuras de los siguientes compuestos y predecir si pueden atravesar una membrana sin media- cion o si requieren facilitacion, Indicar en cada caso el criterio empleado para hacer estas predicciones. (a) Eta- nol, (b) glicina, (c) colesterol y (4) ATP. 10, Escribir un esquema cinético para la (H*-K*}-ATPasa que incluya la hidrélisis acoplada de ATP con el trans- porte de H*. Discutir el orden de adicién de sustratos necesario para el acoplamiento. Identificar los pasos en los que la desestabilizacion mutua produce velocidades de transporte aceptables.