Capitulo 5 TECNICAS DIE PURIFICACION DIE LAS PIRROTEINAS 1. Aislamiento de una proteina ‘A. Seleccion de la fuente de proteina B. Métodos de solubilizacion C.Estabilizacion de las proteinas D. Determinacién de las proteinas E. Estrategia general en la purificacién de proteinas 2, Solubilidades de las proteinas ‘A. Efecto de las concentraciones salinas B. Efectos de los disolventes organicos C. Efectos del pH D.Cristalizacion 3. Separaciones cromatograticas A. Cromatogratia de intercambio iénico 8, Cromatografia sobre papel ©. Cromatogratia de filtracién por gel D. Cromatogratia de afinidad E. Otras técnicas cromatograticas 4. Electrotores A Electroforesis sobre papel B.Electroforesis en gel C. SDS-PAGE D. Enfoque isoeléctrico 5. Ulracentritugacién A. Sedimentacion 8. Uttracentrifugacién preparativa Una parte importante de la mayor parte de las investigaciones bioquimicas incluye la purificacion de los materiales que se estén considerando ya que estas sustancias deben hallarse, relativamente libres de contaminantes si se han de caracterizar adecuada- mente. Ello constituye, con frecuencia, una tarea for- midable porque una célula tipica contiene millares de sustancias diferentes, muchas de las cuales guardan una semejanza estrecha en sus propiedades fisicas y quimicas con otros constituyentes celulares. Ademas, el material que interesa puede ser inestable y existir en cantidades casi evanescentes. Es tipico que una sustancia que representa una cantidad < 0,1 % del peso de tejido seco sea purificada hasta ~ 98 % de pureza. Los problemas de purificacion de esta magni- tud serian considerados irrazonablemente dificiles por la mayor parte de los quimicos dedicados a la sintesis. Por ello es dificil que sorprenda que nuestra comprensi6n de los procesos bioquimicos ha mante- nido un paralelismo con nuestra capacidad de purifi- scar los materiales biolégicos. Este capitulo presenta una panorémica de las técni- cas empleadas mas corrientemente para el aislamien- to, purificacion y, en cierta extensiOn, la caracteriza- cin de las proteinas asi como de otros tipos de moléculas biolégicas. Estos métodos son las herra- mientas basicas de la bioquimica cuyo empleo domi- na los esfuerzos diarios del bioquimico practico. Ade- més, muchas de estas técnicas se emplean rutinaria- mente en aplicaciones clinicas. En realidad, una comprension basica de los métodos que se describen aqui resulta necesaria para una apreciacién del significado y de las limitaciones de gran parte de la informacion quei it ue te vat Hf Hiie ce ce ue A a a a a a a ee a a i ee ull al et ae . alniaing | i i a Ht . a Hi Fd a nTi i L 4 | e Tas iindirectamente por determinacion del grado de com- petencia con un estandar marcado radiactivamente al unitse al anticuerpo (Seccién 34-4), En un método que emplea un enzima unido a un inmunoadsor- bente (ELISA; Fig, 5-1): 1. EI anticuerpo frente a la proteina de interés se inmoviliza sobre un s6lido inerte tal como poliesti- reno. 2, La disolucién que va a ser investigada para la determinacién de proteina se aplica a la superficie recubierta de anticuerpo en las condiciones que el anticuerpo se une a la proteina, 3. El complejo anticuerpo-proteina que resulta se hace reaccionar ulteriormente con un segundo an- ticuerpo especifico para la proteina, al que se ha unido por covalencia un enzima que pueda deter- minarse con facilidad. 4, Después de eliminar por lavado el exceso de anti- cuerpo con enzima unido, se efectia la valoracin del complejo anticuerpo-proteina-anticuerpo-enzi- ma, con lo que se conoce la cantidad de proteina presente. El radioinmunoensayo y el método ELISA son em- pleados ambos con profusion, para detectar cantida- des pequeftas de proteinas especificas y otras sustan- cias biolégicas, tanto en el laboratorio como en aplicaciones clinicas. Por ejemplo, una determinacion del embarazo asequible corrientemente, que es positi- vamente segura al cabo de pocos dias después de la concepcién, emplea un ELISA para poner de mani- fiesto la hormona placentaria, gonadotropina cori6- nica (Seccién 34-44) en la orina de la madre. E, Estrategia general en la purificacion de proteinas El que las proteinas son sustancias bien definidas no fue completamente aceptado hasta después de 1926, cuando James Sumner cristaliz6 por primera vez un enzima, la ureasa de la soja. Con anterioridad, se crefa que las elevadas masas moleculares de las proteinas procedian de una agregacion coloidal o mas bien de sustancias misteriosas mal definidas de masas moleculares bajas. Una vez que se comprobé que era posible, en principio, el purificar las proteinas comen- 26 seriamente el trabajo para conseguirlo. En la primera mitad de este siglo los métodos de purificacién de las proteinas de los que se disponia eran muy burdos respecto de los niveles actuales. La purificacion de una proteina constituia mas un arte que una ciencia. Habitualmente el desarrollo de un procedimiento de purificacion para una proteina con- qreta constituia un asunto de afos de trabajo que demandaban cantidades grandes de material de parti- da, A pesar de todo, hacia 1940, se habian obtenido ~ 20 enzimas en forma pura. Desde entonces se han purificado y caracterizado, Capitulo 5. Técnicas de purificacién de las proteinas 83 en diversa extensién, millares de proteinas. Las técni- cas modernas de separacién poseen un grado tan alto de discriminacién que pueden obtenerse ahora, en cantidad, una serie de proteinas que hace unos afios solamente se crefa que su mezcla era una sustancia pura. No obstante, el desarrollo de un procedimiento eficaz de purificacién de una proteina constituye to- davia una tarea que desafia intelectualmente y consu- me tiempo. Las proteinas se purifican mediante procedimientos de fraccionamiento, En una serie de etapas independien- tes, se emplean las diversas propiedades fisicoquimi- cas de las proteinas que interesan para separarlas progresivamente de las demés sustancias. La idea que preside aqui no es, necesariamente, el reducir las pérdidas de la proteina deseada, sino mas bien el climinar selectivamente a los demas componentes de Ja mezcla de modo que la sustancia que se busca per- manezca. Puede no ser posible filos6ficamente el probar que una sustancia es pura. Sin embargo, el criterio operativo para establecer la pureza adopta la forma del método de agotamiento: la demostracién, por todos los métodos di ponibles, de que la muestra que interesa esté constituida por un solo componente. Por ello, cuando se formulan técnicas de separacién nuevas, hay que revisar los estandares de pureza. La experiencia ha demostrado que cuando se somete a una técnica de separacion nueva una muestra de material que se consideraba previamente como pura se encuentra, en ocasiones, que se trata de una mezcla de varios componentes. Las caracteristicas de las proteinas y de otras bio- moléculas que se emplean en los diversos procedi- mientos de separacién son solubilidad, carga iénica, tamario molecular, propiedades de absorcién y capa- cidad de unién a otras moléculas biol6gicas. En el testo de este capitulo expondremos estos procedi- mientos de separacién. 2. SOLUBILIDADES DE LAS PROTEINAS Los miltiples grupos 4cido-base de una proteina determinan que sus propiedades de solubilidad de- ~ pendan de la concentracién de las sales disueltas, de la polaridad del disolvente, del pH y de la temperatu- ra. Las diferentes protefnas varian mucho en sus solu- bilidades bajo un conjunto dado de condiciones. Cier- tas proteinas precipitan de su disolucién en condicio- nes en las que otras permanecen completamente solu- bles. Este efecto se emplea rutinariamente como base de la purificacién de una proteina. A. Efecto de las concentraciones salinas La solubilidad de una proteina en disolucion acuo- a es una funcién sensible a las concentraciones de las sales disueltas (Figs. 5-2-5-4). La concentracién de sal,a | nue iH ou a . r He inn al itteit ue | a 4 | ue | an HM Ae — Hi il ee aa fe int | ae i itie ine t lt !92 Seccién 5-3. Separaciones cromatograficas distancia recorrida por la sustancia 1, 4 distancia recorrida por el frente 4] del disolvente R Para un sistema disolvente dado y un tipo de papel, cada sustancia exhibe un valor de R, caracteristico. La cromatografia en papel puede emplearse como técnica preparativa para la purificacion de cantidades pequeiias de materiales. La disolucién que contiene la sustancia de interés se aplica en una linea (raya) a través del fondo de una hoja de papel de filtro y se ‘cromatografia toda la hoja, tal como se ha descrito. La sustancia de interés se localiza en el cromatograma empleando un método de deteccién adecuado a una tira pequefta que se ha cortado del cromatograma a lo largo de la linea de emigracién del disolvente, 0 de acuerdo con su valor conocido de R,. Finalmente, se corta la banda de la sustancia purificada y se recupera ésta al eluirla del papel con un disolvente apropiado. Una mezcla compleja que se separa incompleta- mente en una sola cromatografia sobre papel puede resolverse completamente, con frecuencia, por una cromatografia bidimensional sobre papel (Fig. 5- 11). En esta técnica se desarrolla un cromatograma tal como se ha descrito previamente, excepto que la muestra se deposita en una esquina del papel de filtro y el cromatograma corre paralelo a un borde del papel. Después que se ha completado el recorrido y se ha secado el papel, se hace girar 90 ° el cromato- grama y se efectia la cromatografia paralelamente al segundo borde pero empleando otro sistema di- solvente. Como cada compuesto emigra con una relaci6n caracteristica en un sistema disolvente deter- minado, la segunda etapa cromatografica deber fa- -vorecer mucho la separacién de la mezcla en sus com- ponentes. C. Cromatografia de filtracién por gel En la cromatografia de filtracién por gel, que tam- bién se Hama cromatografia de exclusion por tama- fios 0 cromatografia de tamiz molecular, las molécu- las se separan de acuerdo con sus tamafios y sus formas. En esta técnica la fase estacionaria se halla constituida por granulos de un material esponjoso hidratado, que contiene poros que comprenden un intervalo de ta- majios, relativamente reducido, de dimensiones mo- leculares. Si por una columna que contenga estos . “tamices moleculares’’ se hace atravesar una disolu- ci6n acuosa que contenga moléculas de varios tama- tos, las moléculas que son demasiado grandes para atravesar los poros quedaran excluidas del volumen de disolvente contenido en el interior de los granulos del gel. Estas moléculas més grandes atravesarén, por tanto, la columna més répidamente, es decir, en un volumen de eluyente menor que las moléculas que circulan a través de los poros (Fig. 5-12). La masa molecular de la molécula més pequefia que es incapaz de penetrar en los poros de un gel determinado se dice que es el limite de exclusién del Dreccdn de | fe dl per | aisovente ‘Separacion si ‘blo se empee segundo, disonente . Separacion si 2+ AL setempiean ambos . aT Gisoventes secuencialmente a Separacion sisdio se ‘emplea e! timer SesoWvente Figura 8-11 ‘Cromatogratia bidimensional sobre papel. gel. Esta cantidad es, en cierta extension, funcién de la forma molecular ya que las moléculas alargadas, como consecuencia de su radio de hidratacion mayor, es menos probable que penetren en un poro del gel concreto que las moléculas esféricas del mismo volu- men molecular. El comportamiento de una molécula sobre una co- lumna de gel particular puede caracterizarse cuantita- tivamente. Si V, es el volumen ocupado por los gré- nulos del gel y V) el volumen vacio, que es el volumen del disolvente del espacio que rodea a los, granulos, luego V,, el volumen de lecho total de la columna es simplemente la suma V,=Vp+ Vo Vo es tipicamente ~ 35 % de V,. El volumen de elucién de un soluto determinado, V,, es el volumen de disolvente que se necesita para eluir el soluto desde la columna después que ha esta- blecido su primer contacto con el gel. El volumen vacio de una columna se mide con facilidad como volumen de elucién de un soluto cuya masa molecu- lar es mayor que el limite de exclusion del gel. El comportamiento de un soluto determinado sobre un gel concreto se caracteriza, por tanto, por la relacion V,/Vo, que es el volumen de elucién relativo, una cantidad independiente de la columna particular que se emplea. . Las moléculas con masas moleculares comprendidas por debajo del limite de exclusién de un gel se eluirin desde el gel en el orden de sus masas moleculares siendo las de mayor masa las que eluyen en primer lugar. Ello es debido a que los tamafios de poro en cualquier gel varian en un intervalo limitado de modo que las moléculas mayores disponen de menos volumen en. el interior del gel que las moléculas menores, Este efecto es la base de la cromatografia de filtracion por gel. 635]96 Seccién 5-3. Separaciones cromatogréficas molécula conocida como ligando, a la que se une especificamente la proteina que interesa, se une por covalencia a una matriz inerte y porosa. Cuando se hace atravesar a través de este material cromatogréfico una disoluci6n de proteina impura, la proteina deseada se une al ligando inmovilizado mientras que las demés sustancias son eliminadas de la columna con el tampén. La proteina deseada puede recuperarse entonces, en for- ‘ma muy purificada, variando las condiciones de elucién de modo que se libere la proteina de la matriz cromato- grifica. La gran ventaja de la cromatografia de afini- dad es su capacidad de aprovechar las propiedades bioquimicas singulares de la proteina deseada en lu- gar de las pequenas diferencias entre las propiedades fisicoquimicas de las proteinas que utilizan otros mé- todos cromatograficos. En la cromatografia de afinidad la matriz. cromato- grafica debe ser inerte quimicamente, tener porosidad elevada y gran numero de grupos funcionales capaces de formar enlaces covalentes con los ligandos. De los pocos materiales asequibles que se adaptan a estos riterios, la agarosa, que dispone de numerosos gru- pos hidroxilo libres, es, con mucho, la empleada con mayor profusién. Si el ligando es portador de un grupo amino que no es esencial para su union a la proteina de interés, puede unirse por covalencia a Ja agarosa en un proceso en dos etapas (Fig, 5-16): 1. Se hace reaccionar la agarosa con bromuro de cianégeno a fin de preparar un intermediario “ac- tivado” pero estable (que es asequible comercial- mente). 2. El ligando reacciona con la agarosa activada y forma un producto unido por covalencia. Muchas proteinas son incapaces de unirse a sus ligandos acoplados con bromuro de ciandgeno debido a interferencias estéricas con la matriz. El problema puede superarse mediante la unin del ligando a la agarosa empleando un grupo “espaciador” flexible. Un modo conveniente de conseguirlo aparece en el esquema de la Fig. 5-17. Una diamina apropiada, como la hexametilendiamina, se acopla, mediante el bromuro de cianégeno, a la agarosa por «-aminoal- quilacién. El producto resultante se acopla al ligando en una reaccién que depende de los grupos funciona- les del ligando. La Fig. 5-17 muestra la reaccién glo- bal de acoplamiento de un ligando que posee un grupo carboxilo al extremo del espaciador mediante el empleo de una carbodiimida soluble en el agua, tal como la 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil) carbodii- mida (EDA), para activar el grupo carboxilo. Se han desarrollado muchas reacciones de acoplamiento di- ferentes, de modo que casi cualquier clase de ligando puede unirse a la agarosa. De hecho muchos de estos derivados de agarosa portadores de ligandos se hallan en el comercio. El ligando empleado en el aislamiento por cromato- grafia de afinidad de una proteina determinada debe poser una afinidad bastante alta para inmovilizar la + N=C—Br Bromuro de clandgeno apa | ont” Y Ho 0 °. 0. On —o ‘Agarosa “nctivada” Btapa 2 |— RNI + 120 O + NH, + HBr ‘on Figura 5-16 Formacion de agarosa activada con bromuro de cianégeno (Superior) y su reaccién con una amina primaria para formar un ligando unido por covalencia para cromatogratia de atinidad (inferior) proteina sobre el gel de agarosa, pero no tan alta que impida la liberacion subsiguiente. Si el ligando es un sustrato para un enzima que esta siendo aislado, las condiciones cromatograficas deben ser tales que el enzima no funcione cataliticamente, de lo contrario el ligando seria destruido. Después de que se ha unido una proteina a una columna de cromatografia de afinidad y se ha libera- do de impurezas, hay que separarla de la columna. Un método de conseguirlo es el de eluir la columna con una disolucién de un compuesto que tiene afini- dad mayor por el sitio de union de la proteina que la que exhibe el ligando unido. Otro es el de alterar las condiciones de la disolucién de modo que el complejo proteina-ligando ya no sea estable; por ejemplo, por cambios en el pH, la fuerza iénica y la temperatura Sin embargo, debe cuidarse que las condiciones de la disolucién no sean tan inhéspitas que la proteina que esté siendo aislada resulte daftada irreversiblemente. La cromatografia de afinidad se ha empleado para aislar sustancias como enzimas, anticuerpos, protef- nas de transporte, receptores de hormonas, membra- nas y aun células completas. Un ejemplo lo propor- ciona la insulina, una hormona proteica (Seccion 25-2) que se ha unido de modo covalente a la agaro-TEL RE eames a a i idl a il Re i Mi i - ae i re Ge ( a a al EE a; a il on He a ey HE102 Seccién 5-4. Electroforesis q dis cH,=CH + cH Acrilamida 2 2 xb yar—cay—a— bono, eee C-NHy e & ‘NH; O: ane, i I I cH, —CH—CHy—CH—CH,—CH—CH,— CH—CHs—CH—CH,— CH C-NH at ° Figura 5-21 Polimerizacion de acrilamida y N,N-metilenbisactllamida para formar un gel de poiacrilamida con enlaces Pntrecruzados. La polimerizacién es inducida por los radicales libres que aparecen en la descomposicion {Guimica del persulfato de amonio (SO 250; ) ola {otodescomposicion dela riboflavina en presencia de Op En cualquier caso, la N,N,N; Ntetrametiletilenodiamina (TEMED), establizador de racicales libres, se afiade por electroforesis bidimensional, empleando un tam- pon de pH diferente para cada dimension y asi se consigue separarlas de acuerdo con sus cargas ionicas ‘a dos valores de pH. B, Electroforesis en gel La electroforesis en gel se halla entre los métodos més resolutivos y convenientes empleados en la sepa- racién macromolecular. Los geles de uso corriente, la poliacrilamida y la agarosa, poseen poros de dimen- siones moleculares, cuyos tamafios pueden espec carse. Las separaciones moleculares se basan, por tanto, sobre Ia filtracion en gel asi como en las movilidades electroforéticas de las moléculas que se estan separando. En la electroforesis en gel, sin embargo, los geles retrasan las moléculas grandes con respecto a las menores, lo contrario de lo que ocurre en la filtracion en gel cromatografica, ya que en la electroforesis en gel no hay espacio de disolvente analogo al que existe entre los granulos del gel en la cromatografia de filtracion en gel (los geles para la electroforesis se forman directamente en el dispositivo de electrofore- sis). El movimiento de las moléculas de tamafio ma- yor se halla impedido, por ello, con relacion al de las moléculas menores al emigrar las moléculas a través del gel. En la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), se confeccionan los geles por la polimeriza- cién inducida por radicales libres de acrilamida y de N,N’-metilenbisacrilamida, en el tampon escogido habitualmente a la mezcla del gel. Las propiedades fisicas del gel y el tamafio de su poro estan controlados por la proporcion de poliacrilamida en el gel y su grado de entrecruzamiento. Las concentraciones de poliacrilamida ‘empleadas mas corrientemente se hallan comprendidas en el intervalo de 3 a 15% con la cantidad de N.N-metilenbisacrilamida fijada habitualmente al 5 % del total de acrilamida presente. (Fig. 5-21). En la forma més sencilla de PAGE, se suspende verticalmente un tubo de 3 a 10cm de Iongitud, en el que se ha polimerizado el gel, entre un recipiente superior y otro inferior que contienen tam- pon (Fig. 5-22). Puede confeccionarse también el gel en forma de lamina rectangular delgada, en la que pueden analizarse varias muestras simultineamente colocandolas en paralelo (Fig. 5-23; lo que constituye ‘un buen método para comparar muestras semejan- tes). El tampén, que es el mismo en ambos recipientes y en el gel, es de un pH (habitualmente ~ 9 para las, proteinas) al que las macromoléculas tienen carga neta negativa y, por tanto, emigran hacia el anodo situado en el recipiente inferior. Cada muestra, que puede contener cantidades tan pequerias como 10 11g de material macromolecular, se disuelve en una canti- dad de disolucién, relativamente densa, de glicerina 0 de sacarosa, para impedir que se mezcle con el tam- pon del recipiente superior, y se aplica en la parte superior del gel. En los geles en forma de lamina, las muestras se aplican en ranuras 0 muescas preforma- das en la parte superior del gel (Fig. 5-23). Otra alter- nativa consiste en que la muestra puede estar conteni- da en un gel de longitud reducida, cuyos poros son demasiado grandes para que puedan obstaculizar la emigracion de las macromoléculas. Se hace atravesar tuna corriente de ~ 300 V por el gel durante un inter- valo de tiempo suficiente para separar los componen- tes macromoleculares en una serie de bandas discre- tas (30-90 min). Se separa el gel del recipiente que lo contiene y se ponen de manifiesto las bandas por un104 Seccién 5-4. Electroforesis Figura -25 Fotografia de las bandas que aparecen en una columna de 0,5 x 4,0.om de gel de poliacrilamida después de la electroforesis discontinua de suero humano. La proteina fue teftida con negro amido. [Por cortesia de Robert W. Hartley, NIH.) rior y los del gel concentrador. A medida que los iones macromoleculares penetran en el gel separador, su movimiento se hace més lento como consecuencia de los efectos de la filtracién por gel. Esto permite a los iones del recipiente superior alcanzar a las bandas macromoleculares y, como el gel separador posee un pH mis elevado, asumir su forma cargada plenamen- te cuando, igualmente, penetran en el gel. La defi- ciencia de carga que existia desaparece, segiin lo ex- puesto, y desde este punto la separacién electroforéti- ca transcurre normalmente. Sin embargo, la compaci- dad de las bandas macromoleculares que penetran en el gel separador aumenta mucho la resolucion de las sepa- raciones macromoleculares (por ej., Fig. 5-25). Los geles de agarosa se emplean para separar electroforéticamente moléculas de gran tamafio Los poros muy grandes que se necesitan para efec- tuar PAGE de compuestos de masa molecular grande (> 200 kD) precisan de geles con concentraciones de poliacrilamida tan bajas (< 2,5 %) que son demasia- do blandos para que puedan emplearse. Puede supe- rarse esta dificultad empleando agarosa (Seccion 5- 3C) sola o mezclada con poliacrilamida. Por ejemplo, se emplea un gel de agarosa al 0,8 % para la separa- cién electroforética de acidos nucleicos con masas moleculares de hasta 50 000 KD. Las bandas de un gel pueden detectarse por teftido o mediante cuenta radiactiva Las bandas resultantes de una separacion por elec- troforesis en gel pueden localizarse por varias técni- cas. Las proteinas se ponen de manifiesto, frecuente- mente, por tefido. El tinte o colorante empleado con mayor profusién es el Coomassie brilliant blue (azul brillante Coomassie), que se aplica mojando el gel en una disolucién alcohdlica, acida, que contiene el colo- rante; éste se fija a la proteina en el gel, desnaturali- zandola y formando un complejo con ella. El exceso de colorante se elimina por un lavado prolongado del gel con una disolucién acida o por destenido electro- forético. De este modo pueden detectarse proteinas en fracciones de microgramo. Las bandas de gel que contienen cantidades de proteina menores que la an- tes mencionada pueden hacerse visibles por teftido con plata, que es ~ 50 veces mas sensible, pero algo més dificil de aplicar. La fluorescamina, un tipo alter- nativo de tinte para proteinas, es una molécula no fluorescente que reacciona con las aminas primarias, como la lisina, y rinde un producto de adicién que es muy fluorescent bajo la radiacion UV. + ne [on coon Fluorescamina (no fluorescente) Adueto de fluorescamina (muy fuorescente) Las proteinas, asi como otras sustancias, pueden po- nerse de manifiesto mediante la absorcion UV de un gel a lo largo de su longitud. Si la muestra es radiacti- va, puede desecarse el gel en vacio para obtener un material como celofana, o también recubrir el gel con tuna cubierta de plastico y luego adherirlo a una hoja de pelicula de rayos X. Después de transcurrido un tiempo (desde unos pocos minutos a muchas semanas segin la intensidad de la radiacién) se desarrolla el filme y la autorradiografia resultante muestra las posiciones de los componentes radiactivos por el en- negrecimiento de la pelicula [de un modo alternativo puede emplearse un detector de radiacién sensible a la posicién (filme electronico) para revelar las posicio- nes de los componentes radiactivos en unos pocos segundos]. Pueden obtenerse secciones del gel, en toda su longitud, obteniendo muchas secciones y el nivel de cada seccién puede determinarse mediante un contador de escintilaciones. Este tltimo método proporciona resultados mas exactos que la autorradio- gratia, Los materiales de la muestra pueden eluirse también de las laminas del gel para proceder a su identificacion o bien a un tratamiento ulterior. C. SDS-PAGE Los jabones y los detergentes son moléculas anfipa- ticas (Seccion 2-1B), que se comportan como agentesay HEHE Ht eb i106 Seccién 5-5. Ultracentrifugacién — CHiN (CH —N—CH2— (CHa R 1 NR, n=203 R= H 0 (CH), —COOH Figura 5-28 Formula general de los anfolitos transportadores ‘empleados en el enfoque isoeléctrico. la separacién de moléculas cargadas, normalmente es tun proceso que dura varias horas y es dificil de cuan- tificar y automatizar. Estas desventajas se superan en gran parte gracias a la CE, una técnica en la que la electroforesis se leva a cabo en el interior de tubos capilares muy delgados (de 1 a 10 um de diémetro interno), fabricados en cuarzo, vidrio o plastico. Estos capilares tan estrechos disipan el calor rapidamente, permitiendo asi la aplicacion de campos eléctricos elevados (normalmente de 100 a 300 V - cm-, aproxi- madamente diez veces mas que en otras técnicas electroforéticas), 1o que reduce los tiempos de separa- cién a unos pocos minutos. Estas separaciones api das, a su vez, minimizan el ensanchamiento de las bandas debido a la difusion, dando lugar a separacio- nes extremadamente definidas. Los capilares pueden lenarse de tampon (como en la electroforesis de fren- te mévil, aunque en este caso el estrecho calibre del capilar casi elimina el mezclado por convecci6n), con un gel de poliacrilamida con SDS (separaci6n segén la masa molecular; Seccién 4-4C), o polianfolitos (en- foque isoeléctrico; Seccién 5-4D). Las técnicas de CE poseen una resolucion extremadamente elevada y pueden ser automatizadas de forma similar a la HPLC, es decir, con aplicacion de muestra y deteccion de fracciones automaticas. Dado que la CE puede separar solamente pequefias cantidades de material, su aplicacién esta limitada, en gran parte, como técni- ca analitica E. Enfoque isoeléctrico Una proteina posee grupos cargados con ambas polaridades y, por ello, exhibe un punto isoeléctrico, que es el pH al que permanece inmévil en un campo eléctrico (Seccién 4-1D). Si se somete una mezcla de proteinas a electroforesis a través de una disolucion que posee un gradiente de pH estable, en Ia que el pH aumenta suavemente desde el anodo al cétodo, cada proteina emigraré a Ia posicion en el gradiente de pH que corresponda a su punto isoeléctrico. Si una molécu- la de una proteina se difunde fuera de esta posicién, su carga neta cambiaré a medida que se desplaza en una region de pH diferente y las fuerzas electroforéti- cas resultantes la devolverdn a su posicion isoeléctri- ca. Cada especie de proteina es, por tanto, “enfocada”” en una banda estrecha en torno a su punto isoeléctri- co, que puede ser tan reducida como de 0,01 unidades de pH. Figura 5-29 Autorradiogratia que muestra la separacién de las proteinas de E. coli empleando el enfoque isoeléctrico en tna dimensién y el método SDS-PAGE en la segunda dimension. Una muestra de proteinas de E. col, de 10 ug, que habia sido marcada con ['4C] aminodcidos, fue sometida a enfoque isoeléctrico en un tubo de urea de 2,5 130 mm, que contenia, ademas, gel de poliacrilamida, ‘A continuacién se efectué la extrusion del gel contenido en el tubo y se colocd en uno de los bordes de una lamina de gel de SDS-poliacrilamida y se sometié a electroforesis. Se Contaron unas 1000 manchas sobre el autorradiograma original, después de una exposicion de 825 h. [Por cortesia de Patrick O'Farrell, University of California at San Francisco.) Un gradiente de pH confeccionado por mezcla de dos tampones conjuntamente en relaciones que va- rian de un modo continuo es inestable en un campo eléctrico debido a que los iones del tampon emigran hacia el electrodo de polaridad opuesta. En su lugar, el gradiente de pH en el enfoque isoeléctrico esta formado por una mezcla de oligomeros de masa mo- lecular baja (300-600 D) que son portadores de gru- pos amino alifaticos y grupos de Acido carboxilico (Fig. 5-28) que poseen un intervalo de puntos isoeléc- tricos. Bajo la influencia de un campo eléctrico, una disolucién de estos polianfolitos se segregaran de acuerdo con sus puntos isoeléctricos, de tal modo que los més acidos se escalonan desde el 4nodo mientras que los més’ basicos se escalonan progresivamente hacia el catodo. El gradiente de pH, que es mantenido por el campo eléctrico, procede de la accién tampon de estos polianfolitos El gradiente de pH puede estabilizarse frente a la convecci6n si se prepara en un gradiente de concen- tracion de sacarosa, de modo que la densidad de esta disolucién viscosa aumente desde la parte superior hasta el fondo. La conveccién puede eliminarse, asi- mismo, mediante el empleo de un gel de poliacrilami- da con una proporcién pequefa de enlaces entrecru- zados, dispuesto en forma de tubo o de una lamina delgada. Con frecuencia el gel contiene urea ° i H,N—C—NHy UreaCapitulo 5. Técnicas de purificacién de las proteinas 107 Tabla 5-5 Constantes fisicas de algunas proteinas Volumen Coeficiente de Masa esp. parcial sedimentacién —_Relaci6n de molecular (cm? -g) tan friccién Proteina (kD) Van © f/fo Lipasa (leche) 67 0714 14 1,190 Ribonucleasa A (pancreas bovino) 126 0,707 2,00 1,066 Citocromo ¢ (corazén de buey) 134 0,728 7 1,190 Mioglobina (corazén de caballo) 169 0,741 2,08 1,105 -Quimotripsina (pancreas bovino) 216 0,736 2,40 1,130 Crotoxina (serpiente cascabel) 29,9 0,704 3,14 1221 Concanavalina B (judia) 425 0,730 3,50 1,247 Toxina Diphtheria 704 0,736 4,60 1,296 itocromo oxidasa (P. aeruginosa) 89,8 0.730 5,80 1,240 Lactato deshidrogenasa H (pollo) 150 0,740 731 1,330 Catalasa (higado de caballo) 222 0,715 11,20 1,246 Fibrinogeno (humano) 340 0,725 7.63 2,336 Hemocianina (cefal6podo) 612 0724 19,50 1,358 Glutamato deshidrogenasa (higado bovino) 1015 0,750 26,60 1,250 Proteina del virus mosaico del nabo amarillo 3013 0,740 48,80 1,470 Procedencia: Smith, M. H., en Sober, H. A. (Ed.), Handbook of Biochemistry and Molecular Biology (2 ed), p.C-10, CRC Press (1970). ‘una concentracién ~ 6M. Este potente agente des- naturalizante de proteinas, a diferencia del SDS, no posee carga y, por tanto, no puede afectar directa- mente a la carga de una proteina. El hecho de que el enfoque isoeléctrico separe las proteinas en bandas agudas lo convierte en una he- rramienta ttil con fines analiticos y preparativos. Mi chas preparaciones de proteinas que se crefa previa- mente que eran homogéneas se han resuelto en varios componentes mediante el enfoque isoeléctrico. La combinacién de las técnicas de enfoque isoeléctri- co y electroforesis proporcionan una técnica de sepa- racién bidimensional extremadamente resolutiva ig. 5-29). ULTRACENTRIFUGACION Si se agita un recipiente que contiene arena y agua y despues se le deja en reposo, la arena se sedimenta- 14 rapidamente en el fondo del recipiente debido a la accién de la gravedad de la tierra (aceleracion g = 9,81 m-s%), Pero las macromoléculas en disolucion, que experimentan el mismo campo gravitatotio, no exhiben sedimentacion perceptible debido a su movi- miento térmico anarquico (browniano) que las man- tiene distribuidas uniformemente en el conjunto de la disolucion. Solamente cuando se hallan sometidas a aceleraciones enormes el comportamiento de las macro- moléculas frente a la sedimentacion comenzard a pare- cerse al de los granos de arena. La ultracentrifuga, que fue ideada en 1923 por el bioquimico sueco The Svedberg, puede alcanzar velo- cidades de rotacién tan elevadas como 80000 rpm (revoluciones por minuto) de modo que genera cam- pos centrifugos que superan 600 000 g. Con el empleo de este instrumento, Svedberg demostré, en primer lugar, que las proteinas son macromoléculas con com- posiciones homogéneas y que muchas proteinas se hallan compuestas por subunidades. Més reciente- mente, la ultracentrifugacion se ha convertido en una herramienta indispensable para el aislamiento de pro- teinas, 4cidos nucleicos y particulas subcelulares. En esta seccion esbozaremos la teoria y la practica de la ultracentrifugacion. A. Sedimentacion La velocidad a la que una particula sedimenta en la ultracentrifuga esté relacionada con su masa. La fuer- 2A, Fresimeniacin (Ue acttia para sedimentar una particula de masa m, que esta situada a una distancia r alrede- dor de la cual se halla girando con velocidad angular @ (en rad - 5), es la fuerza centrifuga (mar) sobre la particula menos la fuerza de flotacién (V,pq*r) ejerci- da por la disolucién: sedsmentacion= MOD*r — V,pen?r {5.10} En la que V, es el volumen de la particula y p la densidad de [a disolucién, Sin embargo, el movimien- to de la particula en el seno de la disolucion, como se[IO Seccién 5-5. Ultracentrifugacién la — ae | || Gradiente de sacarose ‘estabizante centrifugacién Figura 5-32 Representacion de un diagrama de ultracentrifugacién de zona. La muestra se deposita en forma de capa sobre un gradiente de sacarosa (izquierda). Por centrifugacién (en medio) cada particula sedi velocidad que depende en su mayor parte de su masa. Después de la ‘operacién, el tubo de centrifugacion se perfora mediante uns adecuada y se recogen (derecha) las particulas separadas (zonas). de las que se sabe por los estudios estructurales que son relativamente compactas y esferoidales (Sec- cin 7-3), exhiben relaciones de friccién comprendi- das hasta el valor de ~ 1,5. Las moléculas fibrosas, como las de los DNA y del fibrinégeno, proteina que forma los coagulos sanguineos (Seccién 34-1), po- seen relaciones de friccion mayores. Por desnaturali- zaci6n, los coeficientes de friccién de las proteinas globulares aumentan hasta que Megan a duplicarse, ya que las protefnas desnaturalizadas adoptan con- formaciones de arrollamientos al azar, flexibles y fluctuantes, en las que todas las partes de la molé- cula se hallan en contacto con el disolvente (Sec- ion 7-1D). B. Ultracentrifugacion preparativa Las ultracentrifugas preparativas, como indica su nombre, estén ideadas para la preparacion de mues- tras; difieren de las ultracentrifugas analiticas en que carecen de dispositivos para la observacin de las muestras. Los rotores preparativos contienen tubos cilindricos para las muestras, cuyos ejes pueden ser patalelos, formar un cierto angulo o ser perpendicula- res al eje de rotacién del rotor, dependiendo de la aplicacién concreta (Fig. 5-31). Al deducir la Ec. [5.15], se supuso que la sedimen- tacion transcurre en un medio homogéneo. La sedi- mentacién puede llevarse a cabo, sin embargo, en una disolucion de una sustancia inerte, tales como sacaro- sa 0 CsCl, en las que la concentraci6n, y por tanto la densidad de la disolucién, aumentan desde la superfi- cie hasta el fondo del tubo de centrifuga. La utiliza- cién de este tipo de gradientes de densidad aumen- ta en gran medida la capacidad de resolucion de la ultracentrifuga. Se utilizan corrientemente dos tipos de aplicacién de los gradientes de densidad: (1) ultracentrifugacion de zona y (2) ultracen- Componente | [— esedmena . Ietamente racconaminto | tamer . | <=} — componente | cue sediments on rier imenta a una a agua trifugacion con gradiente de densidad en equili- brio. La ultracentrifugacion de zona separa las particulas de acuerdo con sus coeficientes de sedimentacion En este tipo de centrifugacién, se deposita cuidado- samente una capa de la disolucién macromolecular sobre la parte superior de un gradiente de densidad, que ha sido preparado empleando un dispositivo se- mejante al que corresponde el diagrama que aparece en la Fig. 5-7. El propésito del gradiente de densidad es el de permitir una circulacién suave de las diversas zonas macromoleculares amortiguando la mezcla de la disolucion por conveccion. La sacarosa, que forma una disolucién siruposa y benigna bioquimicamente, se emplea corrientemente para establecer un gradien- te de densidad en la ultracentrifugacién de zona. El gradiente de densidad es mas bien poco significativo, ya que la densidad maxima de la disolucion debe ser inferior que la de la macromolécula menos densa que interesa separar. No obstante, la consideracién de la Ec, [15.5] indica que la velocidad de sedimentacién de una macromolécula es una funcién mas sensible del tamafio molecular que de la densidad. Por consi- guiente, la ultracentrifugacién de zona separa las ma- cromoléculas basandose ampliamente en sus masas mole- culares. Durante la centrifugacién cada especie de macro- molécula se desplaza a través del gradiente a una velocidad determinada, en gran medida, por su coefi- ciente de sedimentacién y, por ello, viaja como una zona que puede separarse de otra de tales zonas, tal como se muestra en la Fig. 5-32. Después de la centri- fugaci6n, el fraccionamiento se efectia habitualmente perforando el fondo del tubo de centrifuga (de mate- rial adecuado) con una aguja, permitiendo que su contenido gotee hacia el exterior y recogiendo las zonas individuales para el analisis subsiguiente.ae i oe Hi aut112 Bibliografia Resumen del capitulo Las macromoléculas presentes en las células se solubili- zan por ruptura de las células por diversos métodos quimi- cos 0 mecénicos, tales como el empleo de detergentes o de trituradores. La purificacién parcial por centrifugacion dife- rencial se emplea después de la lisis celular a fin de separar los residuos celulares o bien aislar un componente subcelu- lar deseado. Cuando las proteinas y otras macromoléculas se hallan fuera del entorno protector de la célula, deben tratarse de modo que se impida su destruccion por influ cias tales como pH y temperatura extremos, degradacion enzimética y quimica y manipulacion mecénica burda. El estado de pureza de una sustancia que se esta aislando debe seguirse a lo largo del procedimiento de purificacién me- diante un método analitico especifico. Las proteinas se purifican convenientemente en gran ¢s- cala por precipitacién fraccionada en la que las solubilida- des de la proteina varian al cambiar la concentracién de la sal o el pH. La cromatografia de intercambio iénico emplea materia les de soporte tales como resinas de poliestireno 0 celulosa. Las separaciones se basan en las interacciones electrostati cas diferentes entre los grupos con carga de los materiales de intercambio ionico y los de las sustancias que se estan separando. En la cromatografia sobre papel, los compuestos se separan por distribucién entre una fase movil de disol- vente no polar y una fase acuosa estacionaria, que se halla unida a las fibras del papel. La separacion puede mejorarse repitiendo la separacion cromatografica en una segunda dimension, utilizando un sistema disolvente diferente. Las moléculas pueden localizarse mediante el empleo de tefi- dos especificos, tales como la ninhidrina para los aminoaci- dos y para los polipéptidos, o mediante el marcado radiacti- vo. En la cromatografia de filtracién por gel, las moléculas se separan de acuerdo con su tamafio y forma, mediante el empleo de lechos de dextrano, de poliacrilamida 0 de aga- rosa, que poseen enlaces entrecruzados y cuyos potos exhi- ben dimensiones moleculares. Para determinar las masas moleculares de las macromoléculas puede emplearse una columna de filtracién por gel, calibrada adecuadamente. La cromatografia de afinidad separa las biomoléculas de acuer- do con sus propiedades bioquimicas singulares que les per- miten unirse a otras moléculas de modo especifico. La cromatografia liquida de resolucién elevada (HPLC) emplea cualquiera de las técnicas de separacién ya menciongdas Bibliografia General Burgess, R. R,, Protein purification, en Oxender, D. L. y Fox, C.F, (Eds,), Protein Engineering, pp. 71-82, Liss (1987). Cooper, T. G., The Tools of Biochemistry, Willey -Interscien- ce(1977), [Un manual de cémo efectuar técnicas biofisicas.] Freifelder, D., Physical Biochemistry (2*ed.), Freeman (1983). [Un texto acerca de las técnicas empleadas en andli- sis biofisico.] Jakoby, W. B. (Ed.), Enzyme Purification and Related Tech- niques, Part C, Methods Enzymol. 104, (1984) pero emplea materiales cromatograficos de gran resolucién, presiones de disolvente elevadas y sistemas de mezcla de disolventes automaticos, as{ como de seguimiento del pro- ceso de separacién, de modo que se obtienen grados de separacién mucho mayores que los que se consiguen me- diante el empleo de los procedimientos cromatograficos més convencionales. La cromatografia de adsorcién, la cro- matografia en capa delgada (TLC) y la cromatografia gas- liquido (GLO), tienen, también, aplicaciones bioquimicas valiosas. En la electroforesis, las moléculas con carga se separan de acuerdo con sus velocidades de emigracién en un campo eléctrico, sobre un soporte sélido tal como papel, acetato de celulosa, geles de poliacrilamida con enlaces entrecruzados © de agarosa, La electroforesis sobre papel puede combinar- se con la cromatografia sobre papel en la técnica bidimen- sional de huellas. La electroforesis en gel emplea soportes de geles de poliacrilamida con enlaces transversales 0 geles de agarosa; las moléculas se separan aqui de acuerdo con su tamatio, por la filtracién por gel, y de acuerdo con su carga. El detergente anidnico dodecil sulfato de sodio (SDS) des- naturaliza a las proteinas y las recubre uniformemente de modo que confiere a la mayor parte de ellas una densidad de carga y una forma similares. La técnica SDS-PAGE puede emplearse para determinar masas macromoleculares. En el enfoque isoeléctrico las macromoléculas se hallan inmersas en un gradiente de pH estable y sometidas a un campo eléctrico que las impulsa a emigrar hacia sus posicio- nes isoeléctricas. En la ultracentrifugacion las macromoléculas se separan al someterlas a campos gravitatorios lo suficientemente ‘grandes para contrarrestar las fuerzas de difusiOn. Pueden separarse las moléculas y determinar sus masas moleculares a partir de sus velocidades de sedimentacién en un disol- vente 0 en gradiente formado previamente de un material inerte de masa molecular pequena, tal como la sacarosa, Un método alternativo lo constituye la separacion de las molé- culas de acuerdo con sus densidades aparentes en una disolucién. con un gradiente de densidad obtenido por Ja utilizacion de una sustancia densa la cual sea difun- dida con rapidez, tal como CsCl. La desviacién de la re- lacién de friccion de una molécula de valor unidad consti- tuye un indicio de sus grados de solvatacion y de alarga- miento. Robyt, J. F. y White, B.J., Biochemical Techniques, Brooks / Cole (1987). Scopes, R., Protein Purification: Principles and Practice (2 ed.), Springer-Verlag (1987). Tinoco, I, Jr Sauer, K., y Wang, J. C., Physical Chemistry. Principles and Applications in Biological Sciences (2*ed.), Capitulo 6, Prentice-Hall (1985). van Holde, K.E,, Physical Biochemistry (2* ed.), Prentice- Hall (1985). [Introduccién al tratamiento tedrico,] Walker, J. M., Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Proteins,‘Humana Press (1984). [Colecci6n de procedimientos précti- cos] Solubilidad y cristalizacion Arakawa, T., y Timasheff, S.N., Theory of protein solubi- lity, Methods Enzymol, 114, 49-77 (1985). Edsall, J.T, y Wyman, J., Biophysical Chemistry, Vol. 1, ‘Academic Press (1958). 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[Los Capituos 1-3 describen varios ‘métodos electroforéticos. El Capitulo 4 trata de la deteccién inmunolégica de proteinas.] Gordon, A. H., Electrophoresis of proteins in polyacrylami- de and starch gels, en Work, T. S. y Work, E. (Eds.), Labora- tory Techniques In Biochemistry’ and Molecular Biology, Vol. 1, Parte I, edicién revisada, North-Holland (1975). Grossman, P.D., Colbum, J.C, Lauer, H.H., Nielsen, R.G,, Riggin, R-M,, Sittampalam, G.S., y Rickard, E.C., Application of free-solution capillary electrophoresis to the analytical scale separation of proteins and peptides, Anal. Chem. 61, 1186-1194 (1989), Hames, B.D. y Rickwood, D. (Eds.), Gel Electrophoresis of Proteins. A Practical Approach (2* ed.), IRL Press (1990). Karger, B.L,, High-performance capillary electrophoresis, Nature 339, 641-642 (1990). Righetti, R.G., Isoelectric focusing: theory, methodology and applications, en Work, T.S. y Burdon, R.H. 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Una disolucién salina isot6nica (una que posee la misma concentracion salina que la sangre) es 0,9 % en NaCl. {Cual es su fuerza ionica? dEn qué orden se eluiran los siguientes aminodcidos de ‘una columna de resina de intercambio inico Dowex 50, empleando un tampon de pH 6: arginina, cido aspartico, histidina y leucina? an qué orden se eluiran las proteinas siguientes de tuna columna de intercambio iGnico de CM-celulosa, al aumentar el gradiente de sal a pH 7: fibrinégeno, hemoglobina, lisozima, pepsina y ribonucleasa A (véa- se Tabla 5-1)? {Cual es el orden de los valores de Ry de los siguientes aminodcidos en la cromatografia sobre papel con un sistema disolvente constituido por agua/butanol/ acido acético, en el que el pH de la fase acuosa es 45: alanina, acido aspartico, lisina, écido glutamico, fenilanina y valina? {Cudl es el orden de elucion de las proteinas siguientes desde una columna de Sephadex G-50: catalasa, a~ quimotripsina, concanavalina B, lipasa y mioglobina (véase Tabla 5-5)? Determinese la masa molecular de una proteina desco- nocida que eluye desde una columna de Sephadex G-50 entre citocromo ¢ y ribonucleasa A (véase Ta- bla 5-5), Se hace fluir una columna de filtracién por gel, rellena de Bio-Gel P-30, cuyo volumen de lecho es de 100 mL. EL volumen de elucién de la proteina hexoquinasa (96 kD) en esta columna es de 34 mL. El de una protei- na desconocida es de 50mL. Cul es el volumen vacio de la columna, el volumen ocupado por el gel y el volumen de elucién relativo de la proteina desco- nocida? 1. {Qué método cromatografico seria el adecuado para 10. nn. separar los siguientes pares de sustancias? (a) Ala-Phe- Lys, Ala-Ala-Lys; (b) lisozima, ribonucleasa A (véase Tabla 5-1) y (c) hemoglobina, mioglobina (véase Ta- bla 5-1)? Se cree que el acido y-aminobutitico, un neurotransmi- sor, se une a proteinas receptoras especificas en el tejido nervioso. Idear un procedimiento para la purifi- cacion parcial de tal proteina receptora, Una mezcla de aminoacidos, constituida por arginina, cisteina, dcido glutamico, histidina, leucina y serina, se aplica a una tira de papel y se somete a electroforesis empleando un tampon de pH 7,5. {Cuales son las direcciones de emigracién de estos aminodcidos y cua- les son sus movilidades relativas? "12. Representar el aspecto de las huellas de los siguientes tripéptidos: Asn-Arg-Lys, Asn-Leu-Phe, Asn-His-Phe, Asp-Leu-Phe y Val-Leu-Phe. Supongase que la etapa de cromatografia sobre papel se lleva a cabo emplean- do un sistema disolvente de agua /butanol/Acido acéti- co (pH 83), y que la etapa electroforttica fiene lugar cen un tampon de pH 655. 13, {Cual es la masa molecular de una proteina cuya ‘movilidad electroforética relativa es de 0,5 en gel de SDS-poliacrilamida tal como el de la Fig. 5-27. 14. Expliquese por qué la masa molecular del fibrinogeno arroja valores inferiores cuando se mide empleando tuna columna calibrada de filtracién por gel (Fig. 5-13), pero puede determinarse con exactitud razonable a partir de su movilidad electroforética sobre un gel de SDS-poliacrilamida (véase Tabla 5-5). 15. {Cual seria la ordenacion relativa de las siguientes proteinas despues de que se han sometido a un enfo- que isoeléctrico: insulina, citocromo ¢, histona, mioglo- bina y ribonucleasa A (véase Tabla 5-1)? 16, Calcilese la aceleracién centrifuga, en gravedades (g) dé una particula localizada a 6,5 cm del eje de rotacion de una ultracentrifuga que esta girando a 60.000 rpm (1g=9,81m-s), 17, En una disolucién de tampén diluida a 20 °C, la aldo- asa de miisculo de conejo posee un coeficiente de friccion de 8,74 x 108g -s-!, un coeficiente de sedi- mentacion de 7,35 S y un volumen especifico parcial de 0,742 cm? g"!, Caleilese la masa molecular de la aldolasa suponiendo que la densidad de la disolucion es de 0,998 g-cm™. 18. El coeficiente de sedimentacion de una proteina se midié observando su sedimentacién a 20°C, en una ultracentrifuga que giraba a 35 000 rpm. Tiempo, t Distancia del frente desde (min) el centro de giro, r (cm) 4 5,944 6 6,966 8 5,987 10 6,009 n 6,032 La densidad de la disolucion es de 1,030 g- cm’, el volumen especifico parcial de la proteina es de 0,725cm3-g"!_y su coeficiente de friccién es 3,72 x 10" g- s"!. Caleiilese el coeficiente de sedimen- tacion de la proteina, en Svedbergs, y sui masa mo- lecular.