Capitulo 28 ESTRUCTURAS Y MANIPULACION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS Estructura quimica y composicion de bases Estructuras en doble h ‘A. La estructura de Watson-Crick: B-DNA B. Otras hélices de Acidos nucleicos ©. EI tamafo del DNA Fuerzas que estabilizan las estructuras de los acidos nucleicos. A. Desnaturalizacion y renaturalizacion B. Conformaciones de la cadena de azUcar-fostato CC. Apareamiento de bases D. Apilamiento de bases e interacciones hidrofébicas E. Interacciones iénicas |. Fraccionamiento de los acidos nucleicos ‘A. Métodos en solucion B. Cromatografia ©. Electroforesis D. Ultracentritugacion >. DNA superenrollado A. Topologia de la superhélice B. Medidas del superenrollamiento, C. Topoisomerasas . Secuenciacion de acidos nucieicos ‘A. Endonucleasas de restriccién B. Método de la fragmentacién quimica C. Método del terminador de cadena D. Secuenciacién del RNA 7. Sintesis quimica de oligonuclestidos 8. Clonaje molecular A. Vectores de clonaje B. Corte y empaime («splicing») de genes C. Bibliotecas genémicas D. Amplficacion del DNA mediante la reaccion en cadena de la polimerasa Produccién de proteinas F. Consideraciones sociales Existen dos clases de dcidos nucleicos, el acido deso- xirribonucleico (DNA) y el Acido ribonucleico (RNA). El DNA es la molécula de la herencia en todas las formas de vida celulares, ast como en muchos virus. Solo tiene dos funciones: 1. Dirigir su propia replicacion durante la division ce- lular. 2. Dirigir la transcripcién de moléculas de RNA complementarias. EI RNA, en cambio, realiza funciones biolégicas mas variadas: 1. Los transcritos de RNA, a partir de secuencias de DNA que especifican polipéptidos, o RNA mensa~ jero (mRNA), dirigen la sintesis ribosémica deCapitulo 28. Estructuras y manipulacion de los dcidos nucleicos 843 dichos polipéptidos en un proceso conocido como traduccién. 2. Los RNAs de los ribosomas, que estén constituidos por cerca de dos terceras partes de RNA y una fercera parte de proteina, desempefian probable- mente papeles tanto funcionales como estruc- turales. 3. Durante la sintesis de proteinas, los aminodcidos son transportados al ribosoma por moléculas de RNA de transferencia (tRNA). 4. Ciertos RNAs estan asociados con proteinas espe- cificas formando ribonucleoproteinas que partici- pan en el procesamiento postranscripcional de otros RNAs. 8, En muchos virus, el RNA, no el DNA, es el porta- dor de la informacion hereditaria. En este capitulo, examinaremos las estructuras de los acidos nucleicos haciendo énfasis en el DNA (la estructura del RNA se detalla en la Seccién 30-2A), y comentaremos métodos de purificacién, secuencia- cién y sintesis quimica de los acidos nucleicos. Termi- naremos dando una idea general de cémo la tecnolo- gia del DNA recombinante, que ha revolucionado el estudio de la bioquimica, se utiliza en la manipula- cin, sintesis y expresion del DNA. 1, ESTRUCTURA QUIMICA Y COMPOSICION DE BASES Las estructuras quimicas de los acidos nucleicos fueron elucidadas a principios de los afios 1950, prin- cipalmente gracias a los esfuerzos de Phoebus Levine seguidos por los de Alexander Todd. Los dcidos nu- cleicos son, con pocas excepciones, polimeros lineales de Figura 28. (2) El tetranuclestido adenil-3"5'-uridil-3' 5'-citidl-3'.5"- guanill-3'-fosfato. Los numeros de los étomos de azucar llevan el superindice “prima” para distinguirlos de las posiciones atémicas de las bases. Por convenio, las ‘secuencias polinucleotidicas se escriben con sus extremos 5! a la izquierda y sus extremos 3 a la derecha. Asi pues, al leer de izquierda a derecha, el enlace fosfodiéster une residuos de ribosa vecinos en la direccién 5’ -+ 3’. La, secuencia anterior puede abreviarse ApUpCpGp 0 tan sélo ‘AUCGp (donde una "‘p" a la izquierda y/o a la derecha del simbolo del nucledsido indica un enlace fosforilo en 5° y/o en 3', respectivamente; véase la Tabla 26-1 para otras, definiciones de simbolos). El desoxitetranucledtido correspondiente se abrevia d(ApUpCpGp) 0 d(AUCGp). (b) Representacion esquematica de AUCGp. En este caso, la linea vertical denota un residuo de ribosa, la base unida a él se indica con la abreviatura de la letra correspondiente, y la linea diagonal junto a la “p" opcional representa un enlace fosfodiéster. La numeracion de los atomos de los residuos de ribosa, aunque se indica en este caso, normalmente se omite. La representacion equivalente de os desoxipolinucledtidos se diferencia sélo en la ausencia de los grupos 2'-OH. nucledtidos cuyos grupos fosfato unen las posiciones 3° y 5 de residuos de azticar consecutivos (por ¢j., Fig. 28-1). Los fosfatos de estos polinuzledtidos, los grupos fos- fodiéster, son acidicos, por lo que, a pH fisiolégico, los ‘cidos nucleicos son polianiones. ® NH,844 Seccién 28-1. Estructura quimica y composicién de bases La composicién de bases del DNA esta gobernada por las leyes de Chargaff EI DNA posee el mismo niimero de residuos de adeni- na que de timina (A = T) y el mismo niimero de residuos de guanina que de citosina (G = ©). Estas relaciones, ‘conocidas como las leyes de Chargaff, fueron descu- biertas hacia el final de los afios 1940 por Erwin Chargaff, que fue el primero en idear métodos cuant tativos fiables para la separacién (mediante cromato- grafia en papel) y el andlisis de hidrolizados de DNA. Chargaff hallé también que la composicion de bases, del DNA de un organismo determinado es una carac- teristica de dicho organismo; es decir, es indepen- diente del tejido del que se ha obtenido el DNA, asi como de la edad del organismo, su estado nutricional © cualquier otro factor ambiental. La base estructural de las leyes de Chargaff se deriva del carécter de doble hebra del DNA (Secci6n 28-2A). La composicion de bases del DNA varia extensa- mente entre organismos diferentes, Oscila entre ~ 25 y un 75% G + C en distintas especies de bacterias. Sin embargo, permanece mas o menos constante en- tre especies relacionadas; por ejemplo, en los matiife- ros, G + C varia entre el 39 y el 46%. ELRNA, que normalmente se encuentra como mo- Iécula monohebra, no presenta limitaciones evidentes en su composicién de bases. Sin embargo, el RNA de doble hebra, que incluye el material genético de di- versos virus, obedece las leyes de Chargaff. Por el contrario, el DNA monohebra, que se encuentra en ciertos virus, no sigue las leyes de Chargaff. Sin em- bargo, cuando este DNA penetra en el organismo huésped, se replica para formar una molécula de doble hebra que si obedece las leyes de Chargaff. Las bases de los cidos nucleicos pueden ser modificadas Algunos DNAs contienen bases que son derivados quimicos de las cuatro bases tipicas. Por ejemplo, en. Jos DNAs de muchos organismos, dA y dC son susti- tuidas parcialmente por N‘-metil-dA y 5-metil-dC, respectivamente. Estas bases alteradas se generan por HL CH, NS NH, cH SAK 7 A Ls N LM) I aR ar NoMetLaa 5-Metihac. modificacion enzimatica especifica del DNA normal (Secciones 28-6A y 31-7). Los DNAs modificados obedecen las leyes de Chargaff siempre que las bases derivadas se tomen como equivalentes a las bases de las que proceden. De la misma forma, aparecen deri- vadas muchas bases en el RNA y, especialmente, en el RNA (Seccion 30-2). By Bust o. 40 OH \ 7 \ ene 0” So ° a xo Nuclestido 2',3°illeo 4H, °y x" 8, 8, a o—Pot on on 8 opoy 2-Nuclestido Nuclestido Figura 28-2 Mecanismo de hidrélisis del RNA catalizada por base. La desprotonacion del grupo 2’-OH inducida por la base facilita el ataque nucleofilico en el atomo de fosforo adyacente, rompiendo el esqueleto de RNA. El grupo fosfato 2',3'-ciclico resultante se hidroliza, después, a fosfato en 2’ 0 en 3'. Notese que la hidrélisis del RNA catalizada por la RNasa sigue una secuencia de reacciones casi idéntica (Seccion 14-14), EI RNA, aunque no el DNA, es susceptible a la hidrolisis catalizada por base EI RNA es muy susceptible a la hidrélisis catalizada por base, mediante el mecanismo de reaccién que se presenta en el esquema de la Fig. 28-2, dando lugar a una mezcla de 2’ y 3’ nucledtidos. En cambio, el DNA, que carece de grupos 2’-OH, es resistente a la hidrélisis catalizada por base y, por tanto, es mucho més estable quimicamente que el RNA. Esta es proba- blemente la raz6n por la que el DNA, y no el RNA, evolucioné para convertirse en el archivo genético ce- lular.Capitulo 28. Estructuras y manipulacion de los dcidos nucleicos 645 L sor As dha don 1 | I I we wt (forma ceto o lactama) (forma enol o lactima) HY, ® 6 © eS N, fF N x La = | HN Sy N HN7S; AN Sy" WN SN R Guanine Guanina (forma ceto o lactama) (forma enol o lactima) Figura 28-3 ‘Algunas posibles conversiones tautoméricas de los residuos de (a) uracilo y (b) guanina. La citosina y la ‘uanina pueden experimentar desplazamientos de protones similares a éstos. 2, ESTRUCTURAS EN DOBLE HELICE Se ha dicho a menudo que la determinacién de la estructura del DNA por parte de James Watson y Francis Crick en 1953 marco el nacimiento de la biologia molecular moderna. La estructura de Watson-Crick del DNA tiene una gran importancia porque, ademas de proporcionar la estructura de lo que sin duda es la molécula central de la vida, sugirié el mecanismo molecular de la herencia. La hazafia de Watson y Crick, que figura como una de las mayores conquistas intelectuales de la ciencia, aglutin6 los resultados, por aquel entonces no tan aceptados uni- versalmente, de varios estudios diferent 1. Las leyes de Chargaff. En su época, estas relacio- nes resultaban totalmente oscuras porque su signi- ficado no era evidente. De hecho, ni siquiera Char- gaff les dio excesiva importancia. 2. Las formas tautoméricas correctas de las bases. Las investigaciones de rayos-X, NMR y espectroscépi- cas han establecido firmemente que las bases de los acidos nucleicos se encuentran mayoritaria- mente en sus formas tautoméricas cetonicas, que se muestran en la Fig. 28-1. Sin embargo, en 1953, esta opinion no era generalizada. De hecho, la creencia mas extendida era que la guanina y el uracilo se encontraban en sus formas endlicas (Fig. 28-3) porque se pensaba que, asi, la estabilidad por resonancia de estas moléculas aromaticas seria ma- xima. El conocimiento de las formas tautoméricas’ predominantes, lo que constituia una condicién previa para la prediccion de los enlaces de hidroge- no correctos en la asociacién de las bases, fue proporcionado por Jerry Donohue, companero de laboratorio de Watson y Crick y un experto en estructuras de rayos-X de moléculas organicas pe- quenias, 3. La informacion de que el DNA es una molécula helicoidal. Esta fue suministrada por una fotografia de difraccion de rayos-X de una fibra de DNA, tomada por Rosalind Franklin (Fig. 28-4; el DNA, al ser una molécula en forma de hilo, no forma cristales pero, en cambio, puede estirarse en fibras constituidas por haces paralelos de molécu- las; Seccién 7-2), Una descripcién de la fotografia permitié a Crick, experto en cristalografia ‘de ra~ yos-X y que habia deducido anteriormente las ecuaciones que describian la diftaccién debida a moléculas helicoidales, deducir que el DNA (a) es una molécula helicoidal y (b) que sus bases aroma- ticas planas forman una pila de anillos paralelos que es paralela al eje de la fibra, Esta informacin proporcioné solamente unas pocas pistas rudimentarias que guiaron la elucidacién de la estructura del DNA; ésta nacié en su mayor parte de la imaginacion de Watson y Crick gracias a sus estu- dios de construccién de modelos. Sin embargo, des- pués de la publicacion del modelo de Watson-Crick, Figura 28-4 Fotogratia de ditraccién de rayos-X de una fibra de Na* DNA en la conformacion B orientada verticalmente. Esta es la fotografia que proporcioné la informacion crucial para la elucidacion de la estructura de Watson-Crick. La estructura {de manchas centrales en forma de X indica que se trata de ‘una hélice, mientras que los arcos mas densos y oscuros fen la parte superior e inferior del patrén de difraccion ‘corresponden a una distancia de 3,4 A e indican que la estructura del DNA se repite principalmente cada 3.4 A a lo largo del eje de la fibra. [Por cortesia de Maurice Wilkins, King's College, Londres.]846 Seccidn 28-2, Estructuras en doble hélice Tabla 28-1 Caracteristicas estructurales de los A, B y Z-DNA ideales A B z? Sentido de la hélice Arrollada hacia la Arrollada hacia la_——_Arrollada hacia la izquierda derecha derecha Didmetro ~26A ~20A ~18A Pares de bases por vuelta 11 10 12 (6 dimeros) de hélice Giro de la hélice por par 33° 36° 60° (por dimero) de bases Paso de rosca dela hélice 28 A 34 45A (elevacién por vuelta) Elevacion de la hélice por. 2,6, 344 374 par de bases Inclinacion de las bases, 20° 6 r normal respecto del eje de la hélice Surco mayor Estrecho y profundo Ancho y profundo Plano Surco menor ‘Ancho y poco Estrecho y profundo _Estrecho y profundo profundo Atomo desplazado en el —_C(3"endo Ce2)-endo C(2}-endo para pisimidinas; C(3’)-endo aziicar para purinas Enlace glucosidico Anti Anti ‘Anti para pirimidinas; sin para purinas su simplicidad combinada con su evidente importai cia biolgica condujo a su rapida aceptacion. Invest gaciones posteriores han confirmado la exactitud, en lo esencial, del modelo de Watson-Crick, si bien ha sido modificado en algunos detalles. Actualmente, se sabe que el DNA y el RNA de doble hélice pueden adoptar diversas estriscturas, de- pendiendo de factores tales como la humedad y la identidad de los cationes presentes, asi como de su secuencia de bases. En esta seccion se describen di- chas estructuras. A. La estructura de Watson-Crick: B-DNA Cuando el contraién es un metal alcalino como el Na’ y la humedad relativa es del 92%, las fibras de DNA adoptan la llamada conformacién B, tal como indican sus patrones de diftaccién de rayos-X. El B-DNA es considerado como la forma nativa debido a que su patrén de rayos-X es parecido al del DNA que se halla en cabezas de espermatozoide intactas, La estructura de Watson-Crick del B-DNA posee las siguientes caracteristicas principales (Tabla 28-1): 1. Esté constituido por dos hebras polinucleotidicas que se enrollan alrededor de un eje comtin con giro hacia la derecha, para formar una doble hélice de ~ 20 A de didmetro (Fig. 28-5). Las dos hebras son antiparale- las (se extienden en direcciones opuestas) y se en- vuelven mutuamente de forma que no pueden se- pararse sin desenrollar la hélice (fenémeno conoci- do como enrollamiento plectonémico). Las bases ocupan el niicleo de la hélice, mientras que sus cadenas de azticar-fosfato estan enrolladas en la periferia con objeto de minimizar las repulsiones entre grupos fosfato cargados. 2. Los planos de las bases son casi perpendiculares al eje de la hélice. Cada base esta unida por un enlace de hidrégeno a otra base en la hebra opuesta, forman- do un par de bases plano (Fig. 28:5). Son estas interacciones por enlace de hidrogeno, fenémeno conocido como apareamiento de bases comple- mentarias, las responsables de la asociacin espe- cifica de las dos cadenas de la doble hélice. 3. La hélice de B-DNA “ideal” posee 10 pares de bases (bp) por vuelta (un giro helicoidal de 36° por bp) y, como las bases aromaticas tienen espesores de van der Waals de 3,4 A y estan parcialmente apiladas una encima de otra (apilamiento de ba- ses; Fig. 28-50), la hélice presenta un paso de rosca (elevacion por vuelta) de 34 A. La caracteristica mas notable de la estructura de Watson-Crick es que solamente permite dos tipos de pares de bases: cada residuo de adenina debe aparearse con unt residuo de timina y viceversa, y cada residuo de guanina debe aparearse con un residuo de citosina y viceversa. Las geometrias de dichos pares de bases A-T y G-C, los llamados pares de bases de Watson-Crick, se muestran en la Fig. 28-6. PuedeFigura 28-5 Estructura del B-DNA representada por dibujos de bolas y varilas y los correspondientes modelos de espacio leno generados por ordenador. La hélice peribdica esta basada en la estructura por rayos-X del dodecamero autocomplementario d(CGCGAATTCGCG) determinada por Richard Dickerson y Horace Drew. (a) Vista perpendicular al eje de la hélice. En el dibujo, los esqueletos de azucar-fosfato, que se enrollan alrededor de la periferia de la molécula, son azules, y las bases, que ocupan el centro, son rojas. En el modelo de espacio lleno, los dtomos de C, N, Oy P son blancos, azules, rojos y verdes, respectivamente. Los atomos de H se han omitido en ambos dibujos para mayor claridad. Notese que las dos cadenas de azucar-fosfato se extienden en direcciones opuestas. (b) (pag. siguiente) Vista en direccién del eje de la hélice. En el dibujo, los atomos de O del anillo de ribosa son rojos y el par de bases mas proximo es blanco. Notese que el eje de la hélice pasa a través de los pares de bases, con lo que la hélice posee un nucleo denso, [Copyright © de los dibujos por Irving Geis. Graficos por ordenador por cortesia de Robert Stodola, Fox Chase Cancer Center.}848 Seccidn 28-2. Figura 28-5 (b) observarse que ambos pares de bases son intercamb bles, en el sentido de que pueden sustituirse entre sien la doble hélice sin cambiar las posiciones de los dtomos G(1) del esqueleto de aziicar-fosfato. Igualmente, la doble hélice permanece inalterada cuan reambian tre si los integrantes de un par de bases de Watson-Crick, es decir, cambiando G+ C por C-GoA-T por TA. Por el contrario, cualquier otra combinacién de bases dis- torsionaria notablemente la doble hélice, ya que la formacion de un par de bases distinto de los de Watson-Crick requeriria una reorientacién importante de la cadena de azticar-fosfato. Los dos surcos profundos que envuelven el B-DNA entre las cadenas de azticar-fosfato son de tamarios distintos (Fig. 28-52) debido a que: (1) el borde supe- rior de cada par de bases, tal como se ve en la Fig. 28-6, es estructuralmente distinto del borde inferior; y (2) los residuos de desoxirribosa son asimétricos. El surco menor es aquel en que el angulo C(1')-eje de la hélice-C(1’) es <180° (abierto hacia la parte inferior en la Fig. 28-6; en el B-DNA, el eje de la hélice pasa por el centro de cada par de bases), mientras que el surco mayor se abre hacia el extremo opuesto de cada par de bases (Fig. 28-6) Figura 26-6 Pares de bases de Watson-Crick. La linea que une los atomos C(1") tiene la misma longitud en ambos pares de bases y forma angulos idénticos con los enlaces lucosidicos de las bases. Ello confiere al DNA una serie de ejes de simetria pseudobinarios (llamados a menudo ‘ejes de diada) que pasan por el centro de cada par de bases (linea roja) y que son perpendiculares al eje de la hélice, Nétese que los pares de bases AT se asocian mediante dos enlaces de hidrégeno, mientras que los pares de bases C-G se unen mediante tres enlaces de hidrogeno. [Segun Amott, S., Dover, S.D. y Wonacott, A) ‘Acta Cryst. B25, 2196 (1969)] La estructura de Watson-Crick puede acomodar cualquier secuencia de bases en una de las hebras polinucleotidicas siempre que la hebra opuesta con tenga la secuencia de bases complementaria. Ello ex plica inmediatamente las leyes de Chargaff. Aun mas,Capitulo 28. Estructuras y manipulacién de los dcidos nucleicos 849 sugiere que la informacion hereditaria viene codifica- da por Ia secuencia de bases de cualquiera de las dos hebras. EI auténtico DNA se desvia de la estructura de Watson-Crick ideal ‘A finales de los afios 1970, los avances en la quimi- ca de los Acidos nucleicos permitieron la sintesis y cristalizacién de oligonuclestidos de secuencia defini da cada vez més largos (Seccién 28-7). Por con: guiente, unos 25 aftios después de formularse la estructura de Watson-Crick, fueron visualizadas cla- ramente las estructuras cristalinas de rayos-X de frag- mentos de DNA por primera vez (los estudios de fraccion de fibras s6lo proporcionan imagenes de baja resolucién en las que la densidad electronica del par de bases es la densidad electronica media de to- dos los pares de bases de la fibra). Richard Dicker- son y Horace Drew han demostrado que el dodeca- mero autocomplementario d(CGCGAATTCGCG) cristaliza en la conformacién B. La molécula presenta una elevacién media por residuo de 3,4 A y posee 10,1 bp por vuelta (un giro helicoidal de 35,6° por bp), que es casi idéntico a lo visto para el B-DNA ideal. No obstante, los residuos individuales se apartan considerablemente de esta conformacién media de una forma que parece ser dependiente de la secuencia (Fig. 28-5). Asi, por ejemplo, en este dodecémero el giro helicoidal por par de bases oscila entre 28 y 42°. Cada par de bases se desvia atin mas de su conformacin ideal debido a deformaciones como el giro de hélice (rotacién de las bases apareadas en sentidos opuestos, alrededor del eje mayor del par de bases; en el ante- rior dodecémero, estos valores varian entre 10 y 20°) y el balanceo del par de bases (inclinaci6n del par de bases como un todo alrededor de su eje mayor). En efecto, estudios recientes de otros olig6meros de DNA de doble hélice, mediante NMR y rayos-X, han demostrado fuera de toda duda que la estructura del DNA es sorprendentemente irregular, en una forma que depende de la secuencia. Este fenémeno, como veremos mas adelante (Secciones 29-3C y E), es importante para la union al DNA, especifica con la secuencia, de las proteinas que procesan 1a informacion genética Variaci6n de la conformaci6n con la secuencia en el B-DNA Las estructuras de rayos-X de diferentes segmentos de B-DNA demuestran que la conformacién local del B-DNA cambia con su secuencia de bases. Se encuen- tran ejemplos especialmente ilustrativos de este fend- meno en los B-DNAs que contienen varios pares de bases A - T sucesivos. Estos pares de bases poseen un giro de hélice tan acentuado, que el grupo N(6)-H de la adenina, que forma un enlace de hidrogeno de Watson-Crick con el O(4) de la timina, forma simulta- neamente un enlace de hidrégeno con el O(4) del par A: Tadyacente, resultando en un enlace de hidroge- no bifurcado (véase, por ejemplo, la Seccién 29-3C). Algunos DNAs que se encuentran en la naturaleza, y que contienen segmentos ricos en A - T espaciados Tegularmente, adoptan una conformacién curvada en solucién, como se desprende de sus movilidades anormalmente pequerias en electroforesis en gel de poliacrilamida. Sin embargo, la base estructural de este fenmeno no puede determinarse facilmente mediante el anélisis de la estructura cristalina porque, tal como indican los estudios de rayos-X, la curvatura global del B-DNA en los cristales puede estar influen- ciada fuertemente por las fuerzas de empaquetamien- to cristalinas. El significado biol6gico de la curvatura del B-DNA es igualmente oscuro, aunque existen cada vez mas evidencias de que la flexibilidad del DNA dependiente de la secuencia contribuye nota- blemente a la especificidad de secuencia de las protei- nas que se unen al DNA. EI DNA se replica semiconservadoramente La estructura de Watson-Crick sugiere también cémo puede dirigir su propia replicacién el DNA. Cada hebra polinucleotidica puede actuar como mol- de para la.formacin de su hebra complementaria, mediante interacciones por apareamiento de bases. Para ello, las dos hebras de la molécula paterna de- ben separarse, de forma que una hebra hija comple- mentaria pueda sintetizarse enzimaticamente en la superficie de cada hebra paterna. El resultado son dos moléculas de DNA duplex (de doble hebra), cada una constituida por una hebra polinucleotidica procedente de la molécula paterna y una hebra complementaria recién sintetizada (Fig. 1-16). Este modo de replica- cin se denomina semiconservador, para diferenciar- lo de la replicacin conservadora que, de suceder, resultaria en una copia daplex, sintetizada “de novo”, de la molécula de DNA original, y en la molécula de DNA paterna que permaneceria intacta. El mecanis- mo de la replicacion del DNA sera el tema principal del Capitulo 31. La naturaleza semiconservadora de la replicacién del DNA fue demostrada elegantemente en 1958 por Matthew Meselson y Franklin Stahl. Se aumenté la densidad del DNA marcndolo con "SN, un is6topo pesado del nitrogeno (""N es el isétopo del nitrogeno més abundante en la naturaleza). Ello se logré culti- vando E. coli durante 14 generaciones en un medio, que contenia "NH,CI como nica fuente de nitroge- no. A continuacion, las bacterias marcadas fueron transferidas rapidamente a un medio que contenia WN y se midi6 la densidad de su DNA en funcién del crecimiento bacteriano mediante ultracentrifugaci6n con gradiente de densidad en equilibrio (Seccién 5-5B; técnica que Meselson, Stahl y Jerome Vinograd habian desarrollado con el propésito de distinguir el DNA marcado con '"N del DNA no marcado). Los resultados del experimento de Meselson-Stahl se presentan en la Fig. 28-7. Después de una genera- cion (duplicacién de la poblacién de células), todo el DNA tenfa una densidad exactamente igual a la me- dia de las densidades de! DNA marcado integramente con !=N y del DNA no marcado. Por ello, dicho DNAaN, uN 5N DNA DNA DNA DNA DNA NA ibrido hibrido Figura 28-7 Demostracién de la naturaleza semiconservadora de la, replicacion de! DNA en E. coli. El DNA, en una disolucion de CsCl de 1,71 g- cm” de densidad, se sometio a ultracentrifugacién con gradiente de densidad en equilibrio a 140 000 gen una ultracentrifuga analitica (aparato en el ue la muestra puede ser observada por medios dpticos mientras gira). La enorme aceleracion centrifuga provocé la formacion de un gradiente de densidad de CsCl en el que el DNA migré hasta la posicion correspondiente a su densidad de flotacion. Los paneles de la izquierda son fotogratias de la absorcién UV por las células de la ultracentrifuga (el DNA absorbe intensamente a luz UV) y estan colocadas de forma que las regiones con la misma densidad se encuentran sobre la misma vertical. Los paneles centrales son trazos del microdensitometro de las Generaciones 2 %& = 25N DNA (pesado) =, 2, oe fo ae ) oi 88 fe fotografias correspondientes, en las que el desplazamiento vertical es proporcional a la concentracién de DNA. La ‘densidad de flotacion del DNA aumenta con su contenido ‘en '®N. Las bandas que aparecen mas hacia la derecha, {mayor radio y densidad) son debidas al DNA que esta totalmente marcado con ‘SN, mientras que el DNA no ‘marcado, que es 0,014 g-cm-$ menos denso, forma las ‘bandas que aparecen mas hacia la izquierda. Las bandas ‘que aparecen en la posicién intermedia se deben al DNA duplex en el que una hebra esta marcada con 15N y la otra ‘no lo esta. Los dibujos (derecha) indican el numero relativo de hebras de DNA que, en cada generacién, proceden de Jas hebras paternas originales (en azul, marcadas con '*N) y sintetizadas por las generaciones subsiguientes (en rojo, no marcadas). (De Meselson, M. y Stahl, F.W., Proc. ‘Natl. Acad. Sci. 44, 674 (1958),]Capitulo 28, Estructuras y manipulacion de Bey surco BP ivenor Figura 26-8 Dibujos de bolas y varillas y los correspondientes modelos {de espacio lleno del A-DNA, visto (a) desde una posicion Perpendicular al eje de la hélice, y (0) (pag. siguiente) en la direccién del eje de la hélice. EI significado de los colores €@s el mismo que en la Fig. 28-5. La hélice periédica fue generada por Richard Dickerson, basandose en la estructura de rayos-X del octémero autocomplementario ficidos nucleicos 8 d{GGTATACC), determinada por Olga Kennard, Dov Rabinovitch, Zippora Shakked y Mysore Viswamitra Notese que los pares de bases estan inclinados hacia e! fe de la hélice y que la hélice tiene un nucleo hueco. Compérese esta figura con la Fig. 28-5. [Copyright © de los, ibujos por Irving Geis. Graficos por ordenador por cortesia de Robert Stodola, Fox Chase Cancer Center.)Figura 28-8 (0) debia contener cantidades idénticas de “N y ™N, como seria de esperar después de una generacion de replicacin semiconservadora. En cambio, la replica cin conservadora del DNA habria resultado en la conservacién del DNA paterno, que mantendria su densidad original, y en la generacién de una cantidad equivalente de DNA no marcado. Después de dos generaciones, la mitad de las moléculas de DNA eran no marcadas y el resto eran hibridos “N-!N, Este resultado también es consistente con las predicciones del modelo de replicacién semiconservadora, pero esta en desacuerdo con el modelo de replicacién con servadora, En las generaciones sucesivas, la cantidad de DNA no marcado aument6 en relaci6n a la canti- dad de DNA hibrido, aunque el hibrido nunca desa parecié completamente. Ello esta de acuerdo una vez més con la replicacién semiconservadora, pero refiido con la replicacion conservadora, la cual predice que el DNA paterno completamente marcado estar siempre presente y que el DNA hibrido no se forma nunca, Meselson y Stahl también demostraron que el DNA posee dos hebras. El DNA de E. coli marcado con '°N, que habia crecido en un medio con “N durante una generacién, fue desnaturalizado térmicamente a 100 °C (lo que provoca la separacién de las hebras Seccién 28-3A) y, a continuacion, sometido a ultra- centrifugacién con gradiente de densidad. Se obser varon dos bandas, una correspondiente a la densi dad del DNA marcado con "N y la otra a la densidad del DNA no marcado. Ademés, la masa molecular del DNA en dichas bandas, estimada a partir de los tama os de sus picos de densidad éptica, era la mitad de la del DNA no desnaturalizado (la amplitud del pico varia con la masa molecular). Por ello, el DNA nativo tiene que estar compuesto por dos hebras del mismo tamano que se separan durante la desnaturalizacion termica B. Otras hélices de acidos nucleicos EI DNA de doble hebra es una molécula variable en su conformacién. En los siguientes apartados analizare- mos sus principales estados conformacionales distin- tos del B-DNA, asi como aquéllos del RNA de doble hebra Los pares de bases del DNA estan inclinados hacia el eje de 1a hélice Cuando la humedad relativa se reduce al 75 %, el B-DNA sufre un cambio conformacional reversible a la Hamada forma A. Los estudios de fibras por ra- yos-X indican que el A-DNA forma una hélice arrolla- da a la derecha, mas ancha y més aplastada que la del B-DNA (Fig. 28-8; Tabla 28-1), El A-DNA posee 11 bp por vuelta y un paso de rosca de 28 A, lo que produce tun hueco axial en el A-DNA (Fig. 28-86). Sin embar. go, la caracteristica mas sorprendente del A-DNA es que los planos de sus pares de bases estan inclinados 20° con respecto al eje de la hélice. Por ello, el A-DNA posee un surco mayor profundo y un surco menor muy poco profundo; podria describirse como cinta plana enrollada alrededor de un hueco ci ndrico de 6 A de didmetro. La mayor parte de oligo- nucleotidos auto-complementarios de <10 pares de bases, por ejemplo, d(GGCCGGCC) y d(GGTA- TACC), cristalizan en la conformacién del A-DNA. Al igual que el B-DNA, estas moléculas muestran una considerable variacién conformacional que es especi- fica de cada secuencia. No se ha demostrado si existe el A-DNA in vivo, aunque algunas observaciones ex-Capitulo 28. Estructuras y manipulacién menor Figura 28-9 Dibujos de bolas y varillas y los correspondientes modelos de espacio lleno de! Z-DNA, visto (a) desde una posicion perpendicular al eje de la hélice y (b) (pag. siguiente) en la direccién del eje de la hélice. E! significado de los colores es el mismo que en la Fig. 28-5. La hélice periddica fue generada por Richard Dickerson, basandose en la estructura de rayos-X del hexamero auto-complementario {CGCGCG), determinada por Andrew Wang y Alexander los acidos nucleicos 853 Rich. Notese que la hélice esta arrollada hacia la izquierda y que las cadenas de azucar-fosfato siguen un curso Zigzagueante (os residuos alternados de ribosa se encuentran en radios diferentes en la Parte b), indicando que e! motivo repetitivo del Z-DNA es un dinucledtido. Comparese esta figura con las Figs. 28-5 y 28-8. (Copyright © de los dibujos por Irving Geis. Graficos por ordenador por cortesia de Robert Stodola, Fox Chase Cancer Center.}Capitulo 28. Estructuras y manipulacién de los acidos nucleicos 855 des inesperadas. Unos 25 aftos después del descubri. miento de la estructura de Watson-Crick, la determi- nacién de la estructura cristalina de d(CGCGCG) por Andrew Wang y Alexander Rich revelé, con gran sorpresa, una doble hélice arrollada a la izquierda (Fig. 28-9; Tabla 28-1). Una hélice muy parecida es la for- mada por d(CGCATGCG). Esta hélice, que se ha deno- minado Z-DNA, posee 12 pares de bases de Watson- Crick por vuelta, un paso de rosca de 45 A y, a diferencia del A-DNA, un surco menor profundo y un surco mayor imperceptible. Asi pues, el Z-DNA se parece a una broca, arrollada a la izquierda, de una taladradora. En el Z-DNA, los pares de bases se desplazan 180° con relacién a los del B-DNA (Fig. 28-10), siguiendo los cambios conformacionales que se comentan en la Sec- cién 28-3B. Como consecuencia de ello, la unidad repetitiva del Z-DNA es un dinuclestido, d(XpYp), en. lugar de un solo nuclestido como ocurre en las otras hélices de DNA. En este caso, X es normalmente un residuo de pirimidina e Y es normalmente un residuo de purina, debido a que el nuclestido purinico puede adoptar una conformacién que, en el caso de un nuclestido pirimidinico, seria estéricamente desfavo- rable. Asi pues, la linea que une los grupos fosfato contiguos en una hebra polinucleotidica de Z-DNA sigue una trayectoria zigzagueante alrededor de la hélice (Fig. 28-9; de aqui el nombre de Z-DNA) en lugar de la curva suave que forma en los A y B-DNAs (Figs. 28-5a y 28-82). Estudios de difraccion de fibras y de NMR han demostrado que los polinuclestidos complementarios con purinas y pirimidinas alternantes, tales como poli (GC) - poli (GC) o poli d(AC) - poli d(GT), adoptan la conformacin de Z-DNA a concentraciones salinas elevadas. Naturalmente, la conformacién de Z-DNA la adoptan preferentemente los segmentos de DNA con se- cuencias de bases purinicas-pirimidinicas alternantes (por las razones estructurales explicadas en la Seccion 28-3B). Una concentracién salina elevada estabiliza el Z-DNA en relacién al B-DNA, al reducir las repulsio- nes electrostaticas (que de otra forma serian mayores) entre los grupos fosfato de hebras opuestas mucho més cercanos (8 A en el Z-DNA frente a 12 A en el B-DNA). La metilacién de residuos de citosina en la posicin C(5), una modificacién biolégica comén (Seccién 31-7), también promueve la formacion de Z-DNA, debido a que un grupo metilo hidrofébico en esta posicién esta menos expuesto al disolvente en el Z-DNA que en el B-DNA. cTiene el Z-DNA algtin significado biol6gico? Rich propuso que, en circunstancias apropiadas, la conver- sion reversible de segmentos especificos de B-DNA a., Z-DNA actuaria a modo de interruptor que regularia” la expresion genética. No obstante, la existencia del Z-DNA in vivo ha sido dificil de probar. Uno de los problemas mayores es demostrar que una determina- da sonda para Z-DNA, por ejemplo un anticuerpo especifico contra Z-DNA, no induce por si misma al B-DNA a adoptar la conformacion Z -una especie de principio de incertidumbre biolégico (el acto de la medida perturba inevitablemente el sistema que esté siendo medido). Sin embargo, recientemente, se ha demostrado que el Z-DNA est presente en E. coli, utilizando un enzima de E. coli que, in vitro, metila una secuencia de bases especifica siempre que el DNA se encuentra en la forma B pero no en la forma Z. In vivo, la metilacién de esta secuencia de bases es inhibida cuando es clonada en E. coli (mediante las técnicas descritas en la Seccién 28-8) dentro o en la proximidad de un segmento de DNA que puede for- mar Z-DNA. Por otra parte, in vivo existe un equili- brio entre las formas B y Z de estos DNAs, que se cree esta influido por factores ambientales tales como la concentracién salina y la union de proteinas. Sin em- bargo, la funcién biolégica del Z-DNA, si existe, per- manece desconocida. EI RNA-11 y los hibridos de RNA-DNA poseen una conformacién parecida al A-DNA EI RNA de doble hélice no puede adoptar una conformacién parecida al B-DNA debido a los impe- dimentos estéricos entre sus grupos 2’-OH. En cam- bio, normalmente, adopta una conformacion parecida al A-DNA (Fig. 28-8), ‘conocida como A-RNA o RNA-11, que posee 11 bp por vuelta de hélice, un paso de rosca de 30 A, y sus pares de bases inclinados hacia el eje de la hélice en ~ 14°. Muchos RNAs, por ejemplo, los RNAs de transferencia y ribosémicos (cuyas estructuras se detallan en las Secciones 30-2A. y 30-3A), contienen secuencias complementarias que forman vastagos en doble hélice. Las dobles hélices hibridas, constituidas por una hebra de RNA y otra de DNA, también poseen una conformacién parecida al A-DNA. Tanto en la transcripcién de RNA sobre moldes de DNA (Secci6n 29-2), como en la inicia- cién de la replicacion del DNA mediante fragmentos cortos de RNA (Seccién 31-1D), se producen, sin lugar a duda, pequeftos segmentos de hélices hibridas RNA - DNA. C. El tamafio del DNA Por lo general, las moléculas de DNA son enormes (Fig. 28-11). La masa molecular del DNA ha sido determinada mediante diferentes técnicas, incluyendo métodos hidrodinamicos, medidas de longitud por microscopia electronica y autorradiografia [Fig. 28-12; un par de bases de Na* B-DNA posee una masa molecular media de 660 D y una longitud (espesor) de 3,4 A], El numero de pares de bases y las longitu- des de contorno (la longitud entre los extremos de las moléculas nativas completamente extendidas) de los DNAs de algunos organismos seleccionados de com- plejidad creciente se presentan en la Tabla 28-2. No es.sorprendente que la cantidad haploide (cantidad 13 12 Absorbancia relativa a 260 nm Porcentaje de hipercromicidad LL 10 TCO Figura 28-15 Ejemplo de una curva de fusi6n del DNA. La absorbancia relativa es la relacion de la absorbancia (normalmente medida a 260 nm) a la temperatura indicada con respecto a la medida a 25°C. La temperatura de fusion, T,, 6s la ‘temperatura a la que se alcanza la mitad de la absorbancia maxima, 100 NaCl 0,154 + [Na citrato 0,018a g o ° 60. 70 80 90 100 lo Tm (10) Figura 28-16 Variacién de las temperaturas de fusién, T,, de diferentes DNAs en funcién de su contenido G + C. Los DNAs fueron disueltos en una solucién que contenia NaCI 0,15M y Na citrato 0,015M. [Segun Marmur, J. y Doty, P., J. Mol. Biol. 5, 113 (1962) mar, pero de modo que no se fundan tramos comple- mentarios muy largos. Bajo estas condiciones de hibridacion o templado (“annealing”), tal como Ju lius Marmur descubrié en 1960, el DNA desnaturali zado, al final, se renaturaliza completamente. And: logamente, las hebras complementarias de RNA y DNA, en un proceso conocido como hibridacién, forman dobles hélices hibridas de RNA-DNA que son s6lo ligeramente menos estables que las correspon- dientes dobles hélices de DNA. B. Conformaciones de la cadena de azicar-fosfato La conformacion de una unidad nucleotidica, como indica la Fig. 28-18, viene determinada por los seis angulos de torsion del esqueleto de azticar-fosfato y el Angulo de torsién que describe la orientacion de la base con respecto al enlace glucosidico [el enlace que une C(1’) a la base]. Podria parecer que estos siete grados de libertad para cada nucledtido deberian dar lugar a polinuclestidos muy flexibles. Y sin embargo, como veremos, los angulos de torsion estan sujetos a una variedad de limitaciones internas que restringen en gran manera su libertad conformacional. Los angulos de torsién con respecto a los enlaces glucosidicos poseen una o dos posiciones estables La rotacién de una base con respecto a su enlace glucosidico es muy dificil, tal como se descubre al manipular un modelo molecular de espacio lleno. Los residuos purinicos poseen dos orientaciones con res-Capitulo 28. Estructuras y manipulacién de los dcidos nucleicos 859 ——— Aaregacion intramolecular Aregacion intermolecular Figura 28-17 Representacién esquematica de las estructuras, con apareamiento de bases incorrecto, que adopta un DNA que ha sido desnaturalizado por calor y, despues, enfriado rapidamente. Notese que puede producirse tanto la agregacién intramolecular como la intermolecular. pecto al azticar estéricamente permitidas, conocidas como las conformaciones sin (del griego: con) y anti (del griego: contra) (Fig. 28-19). Las pirimidinas sola- mente pueden adoptar con facilidad la conformacion anti porque, en la conformacién sin, el residuo de aziicar interfiere estéricamente con el sustituyente de la pirimidina en C(2). En la mayor parte de los Acidos nucleicos de doble hélice, todas las bases se encuentran en la conformacién anti. La excepcion es el Z-DNA (Seccin 28-2B), en el que los residuos pirimidinicos y purinicos estan en anti y en sin, res- pectivamente. Ello explica la alternancia pirimidina- purina del Z-DNA. En efecto, los giros de pares de bases que permiten la conversion del B-DNA en Z-DNA (Fig, 28-10) se producen por rotacién de cada NH, NH, Cr ee BONN: HOCH, 9 Dy HOCH, Cas Ry H for ou co Ou sin Adenosina anti Adenosina Unigad ucleoticiea Figura 28-18 La conformacién de una unidad nucleotidica viene determinada por los siete angulos de torsién indicados base purinica con respecto a su enlace glucosidico desde la conformacién anti hasta la conformaci6n sin, mientras que en los nuclestidos pirimidinicos son los azticares los que giran, manteniendo asi sus confor- maciones anti. El arqueo del anillo de azticar esta limitado a sélo algunas de sus conformaciones posibles El anillo de aziicar posee un cierto grado de flexibi lidad que afecta significativamente a la conformacion del esqueleto de aziicar-fosfato. Los angulos de los vértices de un pentagono regular son de 108°, valor muy proximo al del angulo tetraédrico (109,5%), por lo que podria esperarse que el anillo de ribofuranosa fuera casi plano. Sin embargo, los sustituyentes del anillo estén eclipsados cuando el anillo es plano. Con el objeto de aliviar el amontonamiento resultante, que incluso se produce entre atomos de hidrégeno, el anillo se arquea en forma de bolsa; es decir, deja de set plano, reorientando sus sustituyentes (Fig. 28-20; NH, Figura 28-19 Orientaciones estéricamente permitidas de las bases purinicas y pirimidinicas ‘con respecto a sus correspondientes unidades de ribosa.860 Seccién 28-3. Fuerzas que estabilizan las estructuras de los acidos nucleicos @ Cy (ectipsado ‘ +H (eclipsado) O) Base Figura 28-20 Los sustituyentes de (a) un anillo de ribosa plano [aqui vistos desde la direccién del enlace C{3'}-C(4’)} aparecen todos eclipsados. La tensién estérica resultante es mitigada, en parte, al doblarse el anillo, tal como se muestra en (b), conformacién de “media sila" en la que (3') es el atomo que se encuentra fuera del plano, esto se observa de inmediato mediante la manipula- cién de un modelo molecular de esqueleto). En general, cabria esperar que de los cinco tomos de un anillo de ribosa solo tres estuvieran en el mis- mo plano, ya que tres puntos definen un plano. Sin embargo, en la gran mayoria de las > 50 estructuras cristalinas de nucledsidos y nuclestidos que se cono- cen, cuatro de los 4tomos del anillo se encuentran en el mismo plano, con desviaciones del orden de unas centésimas de A, y el atomo restante se aparta de este plano en varias décimas de A (conformacién de me- dia silla). Si el atomo que se encuentra fuera del plano se desplaza hacia el mismo lado del anillo que el atomo C5’), se dice que tiene la conformacion endo (del griego: endon, dentro de), mientras que el desplazamiento hacia el lado opuesto del anillo res- pecto a C(5’) se conoce como la conformacién exo (del griego: exo, fuera de). En la gran mayoria de las estructuras nucleosidicas y nucleotidicas, el stomo que se encuentra fuera del plano es o bien el C(2’) o el (3) Fig. 28-21). La “bolsa” de ribosa mas frecuente es la C(2’-endo, aunque la C(3’}endo y -exo son también comunes. Son raras otras combinaciones de ribosas. La “bolsa” de ribosa es conformacionalmente impor- tante en los dcidos nucleicos porque gobierna las orienta~ ciones de los sustituyentes de fosfato con respecto a cada residuo de ribosa. Por ejemplo, resulta dificil construir un modelo de Acido nucleico de doble hélice a menos que los azéicares sean C(2')-endo o C(3’)-endo. De he- cho, el B-DNA pose la conformacién C(2’)-endo mien- tras que el A-DNA y el RNA-11 son C(3’)-endo, En el Z-DNA, los nucledtidos purinicos son todos C(3’)-endo y los pirimidinicos son C(2')-endo, lo que constituye una raz6n adicional por la que la uw dad repetitiva del Z-DNA es un dinucledtido. Ob- servemos que las “bolsas” de azticar mas comunes de los nucledsidos y nuclestidos aislados, moléculas que no estén sujetas a las limitaciones conformacionales de las dobles hélices, son las mismas que las de las dobles hélices. El esqueleto de aziicar-fosfato esta limitado conformacionalmente Si los angulos de torsion de la cadena de aziicar- fosfato (Fig. 28-18) pudieran girar con libertad, proba- blemente no existiria una estructura estable para los Acidos nucleicos. Sin embargo, la comparacién, reali- zada por Muttaiya Sundaralingam, de unas 40 estruc- turas cristalinas de nucledsidos y nucledtidos revelé @ 5A Cy-endo © 704 Cy-endo Figura 28-21 ‘Nucledtidos en (a) la conformacién (8"}-endo fen el mismo lado del anllo de azicar que C(S))] y (b) la contormacion ©(2"-endo, tal como se encuentran en el A-DNA y el B-DNA, respectivamente. Se indican las distancias entre atomos de P adyacentes en e! esqueleto de azticar-fostato [Seguin Saenger, W., Principles of Nucleic Acid Structure, p. 237, Springer-Verlag (1983).]Capitulo 28. Estructuras y manipulaci6n de los dcidos nucleicos 861 He) Posicion de 014) 05) Figura 28-22 Rueda conformacional que muestra la distribucion del Angulo de torsion alrededor del enlace C(a')-CiS') (y en la ‘con relacion a los sustituyentes de C(5'), visto en la direcoién de C(5') a C(4’). Notese que la mayor parte de los valores de los angulos de torsion observado: ‘encuentran dentro de un margen relativamente estrecho. [Segun Sundaralingam, M., Biopolymers 7, 838 (1969).] que los valores que pueden tomar esos angulos estén muy restringidos. Por ejemplo, el angulo de torsion alrededor del enlace C(4’)—C(5’) (y en la Fig. 28-18) tiene una distribucion mas bien reducida, de forma que O(4’) tiene normalmente una conformacién “gau- che” con respecto a O(5’) (Fig. 28-22). Ello es debido a que la presencia del anillo de ribosa, junto con algunas interacciones no covalentes del grupo fosfato, hace més rigida la cadena de azticar-fosfato al restrin- git el rango de angulos de torsion. Estas restricciones son atin mayores en los polinucledtidos debido al impedimento estérico entre los diferentes residuos. Todos los angulos conformacionales de azticar- fosfato de diferentes dobles hélices estén razonable- ‘mente libres de tensi6n. Por lo tanto, las dobles hélices son ordenaciones conformacionalmente relajadas del es- queleto de aziicar-fosfato. No obstante, el esqueleto de aziicar-fosfato no es en modo alguno una estructura rigida, ya que, cuando se separan las dos hebras, adopta la conformacién de ovillo estadistico. C. Apareamiento de bases El apareamiento de bases se asemeja a un “pega- mento” que mantiene unidos a los acidos nucleicos de doble hebra. En las estructuras cristalinas de oligo- nucle6tidos autocomplementarios solamente se pro- ducen pares de Watson-Crick. Por ello, es importante comprender como se distinguen los pares de bases de Watson-Crick de las ordenaciones de bases con enla- ces de hidrogeno dobles y que poseen geometrias razonables (por ej., Fig. 28-23), Los pares de bases A-T no ligados adoptan la geometria de Hoogsteen Cuando se cristalizan conjuntamente derivados de adenina y timina monomeéricos, los pares de bases A T que se forman tienen invariablemente el N(7) de la adenina como aceptor del enlace de hidrogeno (geometria de Hoogsteen; Fig. 28-23b) en vez del (1) (geometria de Watson-Crick; Fig. 28-6). Ello su- giere que la geometria de Hoogsteen es intrinseca- mente mas estable para los pares A - T que la geome- tria de Watson-Crick. Al parecer, factores estéricos y «@ ) © RAN Figura 28-23 ‘Algunos pares de bases que no son de Watson-Crick. (2) Apareamiento de los residuos de adenina en la estructura cristalina de la 9-metiladenina. (b) Apareami de Hoogsteen entre residuos de adenina y timina estructura cristalina de 9-metiladenina - 1-metitimina (6) Apareamiento hipotético entre residuos de citosina862 Seccién 28-3. Fuerzas que estabilizan las estructuras de los acidos nucleicos (@) © 6 0,008 @ 0.0008M 24 3 tc o000em ‘A 0.0008 i +e OCOI6M f\ _—Sumacaluiada | +A 0.0016M omnes ‘ Ceserado | Suma caleuada L 3500 3400-3300 3500 Numero de onda (em) Espectro IR, en la regién del enlace N-H, de derivados de guanina, citosina y adenina, por separado y en las mezclas, indicadas. El disolvente, CDCl, no forma enlaces de hhidrogeno con las bases y es relativamente transparente en el rango de frecuencias de interés. (a) G + C. La linea en el espectro inferior, que es la suma de los dos espectros superiores, es el espectro tedrico de G + C para moléculas otras influencias del entorno hacen de la geometria de Watson-Crick el modo preferido de apareamiento de bases en las dobles hélices. Sin embargo, los pares A-T con geometria de Hoogsteen poseen su impor- tancia biolégica; por ejemplo, participan en la estabi: lizacion de estructuras terciarias de los tRNAs (Sec- ion 30-28). En cambio, los pares G - C monomeéricos siempre cocristalizan con la geometria de Watson- Crick como consecuencia de sus estructuras con enla- ces triples de hidrégeno. Los pares de bases que no son de Watson-Crick poseen una estabilidad baja ‘Como hemos visto anteriormente (Seccién 28-24), las bases de una doble hélice se asocian de manera que una determinada posicién puede ser ocupada indistintamente por los pares de bases A-T, T- A, G-C,0C-G sin afectar a las conformaciones de las cadenas de azticar-fosfato. Con razén, se podria supo- ner que este requisito de complementariedad geo- métrica de los pares de bases de Watson-Crick, A con Ty GconC, es el nico motivo por el que otros pares de bases no se producen en el entono de la doble hélice. De hecho, esto es lo que se creyé durante los afos que siguieron al descubrimiento de la doble hélice de DNA. Finalmente, el fracaso en la deteccion de pares diferentes de los de A con T (0 U) y de G con C en medios no helicoidales llevé a Richard Lord y Rich a demostrar, mediante estudios espectroscépicos, que {que no interaccionen. La banda proxima a 3600 em” en @l espectro de G + C observado indica una asociacion ‘especifica por enlace de hidrégeno entre G y C. (b) G + A. La estrecha superposicién entre los espectros tedrico y observado de la mezcla G + A indica que G y Ano interaccionan significativamente. [Segun Kyogoku, Y., Lord, R.C. y Rich, A., Science 154, 5109 (1966).] sélo las bases de los pares de Watson-Crick poseen una elevada afinidad mutua. La Fig. 28-242 muestra el espectro de infrarrojo (IR) en la regién del enlace NH de derivados de guanina y citosina, ambos por separado y mezclados. La banda en el espectro de la mezcla G + C, que no esta presente en ninguno de los, espectros de sus componentes, indica una interaccion especifica por enlace de hidrégeno entre G y C. Este tipo de asociacion, que puede suceder tanto entre moléculas idénticas como distintas, puede describirse por las ecuaciones corrientes de accion de masas. (By-Ba) (Bi }[Ba) A partir de los anélisis de espectros de IR, tales como los de la Fig. 28-24, se han determinado los valores de K para diferentes pares de bases. Las cons- tantes de autoasociacién de las bases de Watson- Crick aparecen en la parte superior de la Tabla 28-3 (la asociacién de moléculas idénticas por enlace de hidrogeno se indica por la aparicién de nuevas ban- das de IR, ya que aumenta la concentracion de molé- culas). La parte inferior de la Tabla 28-3 enumera las constantes de asociacién de los pares de Watson- Crick. Obsérvese que cada uno de estos valores es mayor que las constantes de autoasociacién de sus bases constituyentes, de modo que los pares de bases de Watson-Crick se forman preferentemente a par- tir de sus componentes. En cambio, los pares de bases B, +B,—=B,-B, K [28.1]Capitulo 28. Estructuras y manipulacién de los dcidos nucleicos 863 Tabla 28-3 Constantes de asociacién para la formacién de pares de bases Par de bases KM) Autoasociaci6n ACA 5 U-U 61 cc 28 G-G 10°-10* Pares de bases de Watson-Crick AU 100 Gc 108-10° «Datos medidos en cloroformo deuterado a 25 °C. Fuente: Kyogoku, Y., Lord, R.C. y Rich, A. Biochim. Biophys. Acta 179, 10 (1969). que no son de Watson-Crick, A:C, A-G, C-U y G.-U, independientemente de sus geometrias, poseen constantes de asociacion que son despreciables en comparacién con las constantes de asociacién debidas al autoapareamiento de sus componentes (por ej., Fig. 28-24b). Naturalmente, la segunda razén por la cual los pares de bases que no son de Watson-Crick no se encuen- tran en las dobles hélices de DNA, es que tienen poca estabilidad. A la inversa, la presencia exclusiva de pares de bases de Watson-Crick en el DNA es debido, en parte, a la complementariedad electronica por la cual A se empareja con T y G con C. La base te6rica de esta complementariedad electronica, que constitu- ye una observacion experimental, es oscura. Ello se debe a que las aproximaciones, inherentes a los trata- mientos tedricos actuales, son incapaces de explicar con exactitud las pequefas diferencias de energia en kJ - mol entre las asociaciones especificas y no espe- cificas por enlace de hidrogeno. Sin embargo, los segmentos de doble hélice de muchos RNAs, presen- tan, a veces, pares de bases que no son de Watson- Crick, sobre todo G - U, que es importante funcional y estructuralmente (por ej., Secciones 30-2B y D). Los enlaces de hidrégeno no estabilizan el DNA Es evidente que los enlaces de hidrégeno son indis- pensables para la especificidad del apareamiento de bases en el DNA que, finalmente, es el responsable de Ia gran fidelidad necesaria para replicar el DNA casi sin ningun error (Seccion 31-3D). Y sin embargo, al igual que sucede en las proteinas (Seccién 7-48), los enlaces de hidrégeno contribuyen poco a la estabilidad de In doble hélice. Por ejemplo, cuando se ariade eta- nol, que es relativamente apolar, a una solucién acuo- sa de DNA, se hacen més fuertes los enlaces de hidrogeno, pero se desestabiliza la doble hélice como lo indica su menor T,,. Ello ocurre porque las fuerzas hidrofdbicas, que son las principales responsables de la estabilidad del DNA (ver Seccion 28-3D), son de- sorganizadas por los disolventes apolares. En cambio, los enlaces de hidrogeno entre los pares de bases del =, Br Figura 28-25 Apilamiento de anillos de adenina en la estructura cristalina de la 9-metiladenina. El solapamiento parcial de los anillos es tipico en la asociacion entre las bases en las, estructuras cristalinas y en los acidos nucleicos de doble hélice. (Segun Stewart, R.F. y Jensen, L.H., J. Chem. Phys. 40, 2071 (1964).] DNA nativo son sustituidos en el DNA desnaturalizado por enlaces de hidrdgeno mas 0 menos energéticamente equivalentes entre las bases y el agua. D. Apilamiento de bases e interacciones hidrofébicas Las purinas y pirimidinas tienden a formar pilas alar- gadas de moléculas planas y paralelas. Ello ha sido observado en las estructuras de los acidos nucleicos (Figs. 28-5, 8 y 9) y en los varios centenares de estructuras cristalinas de rayos-X que contienen bases de acidos nucleicos. En estas estructuras, normalmen- te, las bases parecen parcialmente solapadas (por ¢j., Fig. 28-25). De hecho, las estructuras cristalinas de bases relacionadas quimicamente presentan a menu- do patrones de apilamiento similares. Al parecer, las interacciones por apilamiento, que en el estado sdlido son una forma de interaccion de van der Waals (Sec- cion 7-4A), poseen cierta especificidad, aunque no tanta como el apareamiento de bases. Las bases de los acidos nucleicos se apilan en disolucién acuosa Las bases forman agregados en disolucién acuosa, como se ha demostrado por la variacion de la presion osmética con la concentracién. La ley de van’t Hoff de la presin osmética es a= RTm 28.2]864 Seccién 28-3. Fuerzas que estabilizan las estructuras de los acidos nucleicos donde x es la presin osmotica, m es la molalidad de! soluto (mol soluto/kg disolvente), R es la constante de los gases y T es la temperatura. La masa molecular M, de un soluto ideal puede determinarse a partir de su presion osmética, ya que M = c/m, donde c = g, soluto/kg disolvente Si la especie que esta siendo investigada posee una masa molecular conocida pero forma agregados en disolucién, la Ec. [28.2] debe escribirse: n= ORTm 28.3] donde 4, el coeficiente osmético, indica el grado de asociacion del soluto. varia entre 1 (no asociacion) y 0 (asociaci6n infinita). La variacion de $ con m para las bases de los acidos nucleicos en solucién acuosa (por ¢j., Fig. 28-26) es coherente con un modelo en que las bases se agregan en etapas sucesivas: AtAS=A,tA==2A, +A - + =A, donde 7 es como minimo igual a 5 (si la reaccin es completa, ¢ = 1/m). Esta asociacin no puede ser el resultado de enlaces de hidrégeno, ya que la N¢,N‘-dimetiladenosina, HAC. CHy Ny A N, q LS SS N Ls 1 bans N®, N®-Dimetiladenosina que no puede formar enlaces de hidrégeno entre las bases, posee un mayor grado de asociacion que la adenosina (Fig. 28-26). Aparentemente, la agregacién, nace de la formacién de pilas de moléculas planas. Este modelo se ha corroborado por estudios de NMR de proton: las direcciones de los desplazamientos quimi- cos de los agregados son compatibles con un modelo de apilamiento pero no de enlaces de hidrogeno. Las asociaciones de bases monoméricas apiladas no se observan en disoluciones no acuosas. Los polinuclestidos monohebra también presentan interacciones por apilamiento. Por ejemplo, el poli(A) muestra un notable aumento de la absorbancia UV con la temperatura (Fig. 28-272). Esta hipercromici- dad es independiente de la concentracién de poli(A), por lo que no puede ser consecuencia de la agre- gacién intermolecular. Igualmente, no es debida a enlaces de hidrogeno intramoleculares porque el poli(N',Né-dimetil A) posee un mayor grado de hiper cromicidad que el poli(A). Por lo tanto, la hipercromi cidad debe surgir de cierta clase de asociaciones por apilamiento en el interior de la Gnica hebra que se deshacen al aumentar la temperatura. Este no es un proceso muy cooperativo, como lo indican la ampli- tud de la curva de fusion y la observacién de que los polinucleotidos cortos, incluyendo fosfatos de dinu- 10 ‘Adenosina 2-0-Metiladenosina 4 & Coeficiente osmtico, N®Metladenosina ‘NS-Meti-2"desoxiadenosina oa ‘NS, NE.Dimetiladenosina On 02 03 Figura 28-26 Variacién del coeficiente osmético ¢ con tas concentraciones molales m de los derivados de adenosina fen H,O. La disminucion de ¢ al aumentar m indica que estos derivados forman agregados en disolucion. [Segun Broom, A.O., Schweizer, MP. y Ts'o, P.O.P., J. Am. Chem. Soc. 88, 3618 (1967), cleésidos como ApA, presentan curvas de fusion pa- recidas (Fig. 28-276). Las estructuras de los 4cidos nucleicos estan estabilizadas por fuerzas hidrofobicas Las asociaciones por apilamiento en las disoluciones ‘acuosas estan estabilizadas en su mayor parte por fuerzas hidrofébicas. Se podria suponer, no sin razon, que en los acidos nucleicos las interacciones hidrofobicas son similares en su cardcter a las que estabilizan las es- Ed ca Poie (a : 3 i _— 2 i 0 20 4 6 9 10 0 20 «0 6 aD 100 Temperatura 0) Figura 28-27 El amplio intervalo de temperatura de los desplazamientos hipercromicos a 258 nm de (a) poii(A) y (b) APA indica cambios conformacionales no cooperativos en estas sustancias. Comparese esta figura con la Fig. 28-15. [Segun Leng, M. y Felsenfeld, G., J. Mol. Biol, 15, 457, (1968)Capitulo 28. Estructuras y manipulacién de los acidos nucleicos 865 tructuras proteicas. Sin embargo, un examen detenido revela que estos dos tipos de interacciones son cuali- tativamente distintas en su caracter. El andlisis termo- dinamico de las curvas de fusion de fosfatos de dinu- cleosidos en términos de la reaccin Fosfato de dinucledsido (no apilado) = fosfato de dinucledsido (apilado) (Tabla 28-4) indica que el apilamiento de bases es favorecido entélpicamente y desfavorecido entropica- mente. Ast pues, las interacciones hidrofobicas responsa- bles de Ia estabilidad de las asociaciones por apilamiento en los dcidos nucleicos tienen un caracter diametralmen- te opuesto a las que estabilizan las estructuras proteicas (que son desfavorecidas entalpicamente y favorecidas entrépicamente; Seccién 7-4C). Ello se refleja en las diferentes propiedades estructurales de estas interac- ciones. Por ejemplo, las cadenas laterales arométicas de las proteinas no estén casi nunca apiladas y las estructuras cristalinas de los hidrocarburos aromati- cos como el benceno, que se asemeja a esas cadenas laterales, estan desprovistas de modo caracteristico de interacciones por apilamiento. En los dcidos nucleicos, las fuerzas hidrofobicas no se comprenden muy bien, Sin embargo, no es sorprenden- te la observacidn de que son diferentes en cardcter de las fuerzas hidrofobicas que estabilizan las proteinas, ya que las bases nitrogenadas son considerablemente mas polares que los residuos hidrocarbonados de las proteinas que participan en los enlaces hidrofébicos. No obstante, no existe ninguna teoria que explique adecuadamente la naturaleza de las fuerzas hidrofo- bicas en los acidos nucleicos (se recordara que nuestra comprension de las fuerzas hidrofobicas en las protei- nas es igualmente incompleta). Son interacciones complejas en las que el apilamiento de bases es pro- bablemente un componente importante. Cualquiera que sea su origen, las fuerzas hidrofobicas poseen una importancia central en la determinacién de las estruc- turas de los acidos nucleicos. E. Interacciones ionicas Cualquier teoria sobre la estabilidad de las estructu- tas de los acidos nucleicos debe tener en cuenta las interacciones electrostaticas de sus grupos fosfato car- gados. Desgraciadamente, la teoria de los polielectro- litos es hasta ahora incapaz de realizar predicciones fiables sobre conformaciones moleculares. Podemos, sin embargo, hacer observaciones experimentales. La temperatura de fusion del DNA diplex aumenta con la concentracion de cationes porque estos iones apantallan electrostaticamente los grupos fosfato anio- nicos entre si. La relacién observada para el Na* es: Tp, = 41,1 Xeve + 16,6 log{Na*] + 81,5 [28.4] donde Xq,c es la fraccién molar de pares G - C (recor- dar que T,, aumenta con el contenido de G + C); la Tabla 28-4 Parametros termodinimicos para la reaccién Dinucleésido fosfato dinucledsido fosfato (no apilado) (apilado) Dinucledsido — AH ptemiegs ——~TASaptamiento fosfato dgj*mol") (kj mol"? 425°C) ApA 22,2 249 ApU -35,1 39,9 Gpc -32,6 349 CpG -20,1 212 UpU 32,6 362 Fuente: Davis, RC. y Tinoco, L, JR., Biopolymers 6, 230 (1968). ecuacién es valida en los margenes 0,3| J besnaturaizar con | | ona o RNA de J nao yatsorser | | secuenca (= | conto de | epecticn | —— ff nitrocetulosa —— | marcado con 32P- a ee | == = [eo — Electroforetograma Gel gel que contiene secuencias de interés Replica en ritrocelulosa el electroforetograma del gel Figura 28-30 by |= wee | | — iT i 2 Ato ce 1 ona CASE) tener ie | tere con 2° * Autorradiograma Deteccién de secuencias de bases especificas en el DNA mediante la técnica de transferencia Southern La transferencia Southern identifica DNAs con secuencias especificas Un DNA con una secuencia de bases especifica puede identificarse por medio de un procedimiento desarrollado por Edwin Southern conocido como téc- nica de transferencia Southern o més coloquialmen- te como “Southern blotting” (Fig. 28-30). Este proce- dimiento aprovecha la valiosa propiedad de la nitro- celulosa, que une fuertemente el DNA monohebra pero no el DNA daplex. Después de la electroforesis, de DNA de doble hebra, el gel se sumerge en una solucién de NaOH 0,5M, que convierte el DNA a la forma de monohebra. A continuacién, el gel se cubre con una hoja de papel de nitrocelulosa que, a su vez, es cubierta por una capa gruesa de toallas de papel y todo el montaje se comprime con una placa de vidrio pesada. De este modo, el liquido del gel es empujado (absorbido) a través de la nitrocelulosa, de forma que el DNA monohebra se une a ella en la misma posi- ion que ocupaba en el gel (alternativamente, la transferencia a la nitrocelulosa puede conseguirse me- diante un proceso electroforético denominado “elec- troblotting”). Después de que la nitrocelulosa se seca en el vacio a 80 °C, lo que fija el DNA permanente- ‘mente en su lugar, el filtro de nitrocelulosa se hume- dece con una cantidad minima de una solucién que contiene DNA monohebra o RNA complementario en secuencia al DNA de interés (la “sonda”), marcados con ™P. El filtro humedecido se mantiene durante varias horas a una temperatura de renaturalizacion adecuada que permita la hibridacién de la sonda con su(s) secuencia(s) diana, se lava para eliminar la son- da radiactiva no unida, se seca y se autorradiografia colocéndola durante un tiempo sobre una pelicula de rayos-X. Las posiciones de las moléculas que son complementarias a las secuencias radiactivas son in- dicadas por un ennegrecimiento en la pelicula revela- da, De esta forma, puede ser detectado y aislado un segmento de DNA que contenga una secuencia de bases determinada (por ej., un gen que codifique para una cierta proteina). Igualmente, los DNAs especifi- cos pueden detectarse acoplando la sonda a un enzi- ma que genere un depésito coloteado o fluorescente sobre el filtro. Estas técnicas de deteccién no radiacti- vas son deseables en un entomo clinico debido a los riesgos de salud, problemas de desecho y la naturale- za mas engorrosa de los métodos autorradiograficos, Las transferencias northern y western detectan RNAs y proteinas, respectivamente Las variantes de la transferencia Southern, que ha- ciendo un juego de palabras se llaman transferencia northern (“northern blotting”) y transferencia wes- tern (“western blotting”), sirven para detectar, res- pectivamente, RNAs y protefnas especificos. En la transferencia northern, el RNA es inmovilizado sobre papel de nitrocelutosa y se detecta mediante el uso de sondas de RNA o DNA complementarios marcadas radiactivamente. En la transferencia western, se une al papel de nitrocelulosa una mezcla de proteinas, y las protefnas especificas se identifican por la unién de anticuerpos que han sido producidos contra ellas. Sin ‘embargo, la nitrocelulosa une las proteinas tan fuerte- mente que, en algunos casos, puede interferir con su identificacion inmunoquimica. En tales casos, el papel de nitrocelulosa puede sustituirse por papel derivado con grupos diazobenciloximetilo, los cuales reaccio- nan con los grupos amino primarios de las proteinas, de forma que éstas quedan unidas covalentemente al papel.CCupitaly 28. Estructures y maniputacin de los dcidos nucleices 869 RA RA ? oes sacra Damn ' S Rn cy een eh Pun 20-01 Separacion @ DNAs segun su composicion de bases meciante Perot conten Mayor conendio 6 + one contri G + C Concentzc oe ON Numero de faceiin——Bovde (dersaaa dereiene) del tubo tracentfugacion con gradiente de densidad en equitbrio ‘en una solusion de CECI. Una solucién de C3Gi que iniciaimente es 844 forma un gradient de densidad que varia linealmente desde ~ 1,80 g cm en el fondo del tubo de la centrifuga hasta ~ 1,36 q om en el borde superior. Un eantidad de DNA en cada fraccion se estima a partir de su absorbancia UV, normalimente a 260 nm. Grupo diazobenciloximetito Ny cocoa Y Proteins D. Ultracentrifugacion La ultracentrifugacion con gradiente de densidad en equilibrio (Fig. 28-31; Seccidn 5-5B) en CsC1 cons tituye uno de los procedimientos mas corrientes para la separacion de DNA. La densidad de flotacién, p, del Cst DNA de doble hebra depende de su composi- cion de bases: P= 1,660 + 0,098 Xove ps3] de forma que un gradiente de densidad de CsCl frac- ciona el DNA de acuerdo con su composicion de bbases, Por ejemplo, los DNAs eucaridticos contienen ‘a menudo fracciones minoritarias que forman bandas separadas de las especies mas abundantes. Algunas, de estas bandas satélites estin constituidas por DNAs mitocondriales y de cloroplastos. Otra clase importante de DNA satelite esta compuesta por se- ‘cuencias repetitivas que son segmentos cortos de DNA dispuestos en tandem (uno detras de otro) y repetidos cientos, miles, y en algunos casos, millones, de veces en un cromosoma (Seccién 33-28). Igual- ‘mente, los phismidos pueden separarse del DNA cro- ‘mosmico bacteriano mediante ultracenteifugacion con gradiente de densidad, ET DNA monohebra es ~ 0,018 g cm”? mas denso que el DNA de doble hebra correspondiente, de for- ‘ma que ambos pueden separarse mediante ultracen- ‘tifugacion con gradiente de densidad en equilibrio. EI RNA es demasiado denso como para formar ban- das en CsCl, aunque si lo hace en soluciones de Cs,S0,, Los hibridos de RNA-DNA forman bandas cen CsCl, pero a una densidad més elevada que el correspondiente DNA daplex E] RNA puede fraccionarse por ultracentrifugacion zonal mediante un gradiente de sacarosa (Fig, 28-32; ‘Seccién 5-5B). Esta técnica separa los RNAS en gran. parte dependiendo de su tamano, De hecho, el RNA. ibosémico, que constituye Ia mayor porcion del RNA celular, se clasifica segiin su velocidad de sedi- mentacién; por ejemplo, el RNA de la subunidad sibosomica pequena de E. coli se conoce como RNA, 165 (Seccion 30-34), 5. DNA SUPERENROLLADO’ Los mapas genéticos circulares de virus y bacterias |hacen suponer que sus eromosomas son asi mismo circulares. Esta conclusion ha sido confirmada por tmicrografias electronicas en las que se ven DNAs circulares (Fig. 28-33). Algunos de estos DNAs circu- lares presentan un peculiar aspecto retorcido, un fe- omeno que se conoce indiferentemente como super-870 Seccién 28-5. DNA superenrollado Aplicar solucién de RNA sobre el gradiente Preparar sradiente de densidad Figura 28-32 Separacion de RNAs ribosémicos eucariéticos mediante ultracentrifugacion zonal a través de un gradiente de densidad en sacarosa preformado. Los RNAs migran a través del gradiente de sacarosa a velocidades que dependen, en gran parte, de sus tamafios moleculares. enrollamiento, superretorcimiento o superhelici- dad. El superenrollamiento surge de una propiedad topologica, biolégicamente importante, del DNA da- plex circular cerrado covalentemente, que es el tema de esta seccion. En ocasiones, se hace referencia a ello como la estructura terciaria del DNA. A. Topologia de la superhélice Consideremos una molécula de DNA de doble héli- ce en la que las dos hebras se juntan covalentemente Figura 28-33 Micrografias electrénicas de DNAs duplex circulares hasta fuertemente superenroliado (derecha). (Microgr RNA se separa en zonas después de centrfugacion 5S RNA Perforar el tubo y Sd recolectar 18S RNA \qem| su contenido 28S RNA = igs 8 58 & 8 Fondo ‘Numero de fraccién Borde del tubo (velocidad de sedimentacién decreciente) del tubo para formar una molécula duplex circular como se ve en el diagrama de la Fig. 28-34 (cada hebra sdlo puede juntarse consigo misma porque las hebras son antiparalelas). Una propiedad geométrica de esta estruc- tura es que el nimero de espirales no puede modificarse sin antes cortar al menos una de sus hebras polinucleoti- dicas. Cualquiera puede demostrarse esto facilmente utilizando un cinturén con hebilla, en el que cada borde del cinturén representa una hebra del DNA. El niimero de veces que el cinturén puede torcerse antes de abrocharlo no puede cambiarse sin desabrocharlo varian en sus conformaciones desde no superenrollado (izquierda) ‘electronicas de Laurien Polder. De Kornberg, A., DNA Replication, p. 29, W.H. Freeman (1980). Reproduccién autorizada,}Capitulo 28. Estructuras y manipulacin de los dcidos nucleicos 871 Figura 26-34 Diagrama esqueméitico de un DNA duplex circular cerrado covalentemente con 26 vueltas de doble hélice. Se dice que sus dos hebras polinucleotidicas estan enlazadas topolégicamente entre si porque, aunque no estan unidas covalentemente, no se pueden separar sin romper enlaces covalentes, © cortarlo (cortar una hebra polinucleotidica). Este fenémeno se expresa matematicamente LeT+w (28.6) donde: 1. L, el ntimero de enlace, es el numero de veces que una hebra de DNA rodea a la otra. Este namero entero se mide mas facilmente cuando se fuerza al eje daplex de la molécula a situarse sobre un plano (véase mas adelante). Sin embargo, el niimero de enlace es invariable, independientemente de como esta enrollada o deformada la molécula circular, siem- pre que sus hebras polinucleotidicas permanezcan co- valentemente intactas; el niimero de enlace es pues una propiedad topologica de ta molécula, 2. T, el gito, es el mimero de revoluciones completas que una hebra polinucleotidica realiza alrededor del eje daplex en la conformacion particular que se estd considerando. Por convenio, T-es positiva para gitos daplex arrollados a la derecha, con lo que, para el B-DNA en soluci6n, el giro es normalmente el nimero de pares de bases dividido por 10,5 (el niimero de pares de bases por vuelta de la doble hélice de B-DNA en condiciones fisiologicas; (véa- se Seccion 28-5B). 3. W, el mero de torsién, es el ntimero de vueltas que el eje duplex realiza alrededor del eje de la superhélice en la conformacién de interés. Es una medida de Ia superhelicidad del DNA. La diferencia entre torsin y giro se ilustra por el ejemplo fami- iar de la Fig. 28-35. W = 0 cuando el eje duplex del DNA es forzado a permanecer en un plano (por e}., Fig. 28-34); entonces L = T, con lo que L puede calcularse contando las vueltas daplex del DNA. Las dos conformaciones que aparecen en la derecha del diagrama de la Fig. 28-36 son topologicamente equivalentes; es decir, poseen el mismo numero de enlace, L, pero difieren en sus giros y mimeros de torsion. Obsérvese que T y W no necesitan ser enteros, solamente L. Como L es constante en un circulo de DNA duplex intacto, para cada nuevo giro de la doble hélice, AT, debe producirse un giro de la superkélice, igual y de sentido contrario; es decir, AW = -AT. Por ejemplo, un DNA circular cerrado sin superenrollamientos (Fig. 28-36, arriba a la derecha) puede ser convertido en una con- formacién superenrollada negativamente (Fig. 28-36, abajo a ta derecha) enroscando la hélice duplex el mismo nimero de vueltas positivas (hacia la dere- cha). Los superenrollamientos pueden ser toroidales 0 trenzados Un daplex superenrollado puede adoptar dos for- mas topolégicamente equivalentes: | Namero de torsion grande, giro pequeno| Numero de torsion pequeto, Biro grande Figura 28-35 La diferencia entre torsién y giro demostrada por un cable telefonico en espiral. En su estado relajado (izquierda), el cable se encuentra en una forma helicoidal que posee un Umero de torsién grande y un giro pequerio. A medida que la espira se estira (centro) hasta que es practicamente recta (derecha), su nlimero de torsion se hace pequefio y SU giro se hace grande,872. Seccidn 28-5. DNA superenrollado Desenrolpr‘una welta Figura 28-36 “Topoligicamente equivalentes Dos maneras de introducir un superenroliamiento en un DNA con 10 vueltas diplex. Las dos formas circulares cerradas que se muestran (derecha) son equivalentes topolégicamente; es decir, se puede pasar de una a otra sin romper ningun ‘enlace covalente. Para cada forma, se indican el numero de enlace L, él giro Ty el numero de torsién W. En rigor, el numero de enlace sélo se define para un circulo cerrado covalentemente. 1. Una hélice toroidal en la que el eje duplex se enrosca como si fuera alrededor de un cilindro (Fig. 28-372). 2. Una hélice trenzada en la que el eje duplex se enrosca alrededor de si mismo (Fig. 28-37). Obsérvese que estas formas superhelicoidales inter- convertibles muestran tendencias (a la derecha o a la izquierda) opuestas. Dado que los giros toroidales hacia la izquierda pueden ser convertidos en giros duplex hacia la izquierda (véase Fig. 28-35), los giros toroidales a la izquierda y los giros trenzados a la derecha poseen nimeros de torsion negativos. Asf, un duplex poco retorcido (T 100 especifi- cidades diferentes y obtenidas a partir de una gran variedad de bacterias. Algunas de las especies mas utilizadas se enumeran en la Tabla 28-5. Una endo- nucleasa de restriccién se nombra con la primera letra Tabla 28-5 Sitios de reconocimiento y de corte de algunos enzimas de restriccin del Tipo II Secuencia de Enzima _reconocimientot _Microorganismo Alu AGICT _Arthrobacter luteus Bamiil — GYGATC*C Bacillus amyloliquefaciens H Bil GCCNNNN} Bacillus globigii NGcc Bgill A\GATCT Bacillus globigit EcoRI GJAA*TIC Escherichia coli RY13 Bort yccr(A\cG Escherichia coli R245 FruDi GGycc Fusobacterium nucleatum D Haell — PuGCGC\Py Haemophilus aegyptins Haellt GGyere Haemophilus aegyptius Hind = A*}AGCTT Haemophilus influenzae Ry Hpall c}C"GG Haemophilus parainfluenzae Pott CTGCAYG ——_—Providencia stuartii 164 salt GHICGAC Streptomyces albus G Tagl TICGA* ‘Thermus aquaticus _ Xhol CYTCGAG Xanthomonas holcicola * La secuencia de reconocimiento esta abreviada de forma que s6lo se muestra una hebra, leida en la direccion de 5’ a 3’. El sitio de corte se representa por una flecha (}) y la base modificada, cuando se conoce, se indica por un asterisco (A* es Né-metiladenina y C* es S-metilcitosina). Pu, Py y N representan un nucleotido purinico, tun nucleétido pirimidinico y cualquier nucleotido, respectivamente, Fuente: Roberts, RJ., Methods Enzymol. 68, 27-41 (1979). del género de la bacteria que la produce y con las dos primeras letras de su especie, seguido de su serotipo 0 nombre de la cepa, si lo hay, y un mimero romano si la bacteria contiene mas de un tipo de enzima de restriccién. Por ejemplo, EcoRI se produce en E. coli, cepa RY13. La mayor parte de las endonucleasas de restriccién reconocen secuencias de DNA palindrémico La mayoria de los sitios de reconocimiento de los enzimas de restriccién poseen simetria rotacional bi- naria, como se muestra en el diagrama de la Fig 28-45. Estas secuencias se conocen como palindro- mas. Un palindroma es una palabra, verso 0 frase que puede set leido indistintamente hacia la derecha 0 hacia la izquierda sin cambiar su significado. Por ejemplo, “Dabale arroz a la zorra el abad.” Muchos enzimas de restriccién, como EcoRI (Fig. 28- 452), catalizan la ruptura de las dos hebras de DNA en posiciones que estan situadas simétricamente con respecto al centro de la secuencia de reconocimiento palindrémica. Ello produce fragmentos de restriccién con extremos monohebra complementarios, de longi- tud comprendida entre uno y cuatro nucledtidos. Los fragmentos de restriccion con estos extremos cohesi- vos 0 pegajosos pueden asociarse, mediante el apa- reamiento de bases complementarias, con otros frag- mentos de restriccion generados con el mismo enzima de restriccién. Algunos de los cortes de restriccion, como los de Alul (Fig. 28-456), siguen el eje binario del palindroma, dando lugar a fragmentos de restric- cion con extremos romos y bases completamente apareadas. Dado que una determinada base tiene una probabi- lidad de encontrarse en una posicién nucleotidica determinada igual a un cuarto (suponiendo que el DNA posee todas las bases en igual proporcién), un enzima de restriccién con un sitio de reconocimiento (@ BeoRt @® Atut n—o-te—1=s joel. 1 > Efe de simetria binaria | cio coe Figura 28-45 ‘Secuencias de reconocimiento de las endonucleasas de restriccién (a) EcoRI y (b) Alu, mostréndose su simetria binaria (palindrémica) e indicandose sus sitios de corte(a) Figura 28-46 Estructura de rayos-X del complejo endonucleasa EcoR|- DNA. (a) Modelo de espacio lleno que muestra el DNA duplex unido a la proteina dimérica, visto en la direcci6n del eje de simetria binaria del complejo. Las dos subunidades de la proteina dimérica se muestran en ‘amarillo y anaranjado, mientras que las hebras ‘complementarias del DNA se muestran en verde y azul, (b) Dibujo de cintas de una subunidad de la endonucleasa EcoRI que interacciona con el surco mayor del DNA. Vista desde una posicién desplazada ~ 90° con respecto @ la de de n pares de bases produce fragmentos de restriccién que tienen, en promedio, 4" pares de bases de longi- tud. Asi pues, los fragmentos de restriccion de Alul (Secuencia de reconocimiento de 4 bp) y EcoRI (se- cuencia de reconocimiento de 6 bp) deberian tener una media de 4¢ = 256 y 4° = 4096 bp de longitud respectivamente La estructura de rayos-X del complejo EcoRI DNA revela la base molecular de su especificidad de reconocimiento La estructura de rayos-X de la endonucleasa EcoRI en complejo con un segmento de B-DNA que conte nia el sitio de reconocimiento del enzima fue determi nada por John Rosenberg. El DNA se une a la hendi- dura con simetria binaria situada entre las dos subunidades idénticas de 276 residuos del enzima dimérico (Fig. 28-46), explicdndose, asi, la secuencia de reconocimiento palindromica del DNA. La protei na induce al DNA a doblarse en tres puntos de forma que se desenrolla parcialmente, ensanchandose el surco mayor en el sitio de reconocimiento. La espec ficidad de reconocimiento viene dada por la fuerte asociacién complementaria de la proteina con el surco mayor del DNA, en la que participan 12 enlaces de hidrogeno entre las cadenas laterales de Glu 144, Arg 145 y Arg 200 de ambas subunidades proteicas y las bases purinicas del sitio de reconocimiento pa lindromico. Revisién de la estructura de la endonucleasa EcoRI Una nueva investigacion de la estructura de ra yos-X del complejo endonucleasa EcoRI - DNA, basa da en nuevos datos de difraccion de rayos-X, ha apuntado la necesidad de una profunda revision del modelo estructural que habia sido publicado previa- () la Parte (a). (¢) Modelo de esqueleto del complejo visto desde arriba, en la direccién del eje de la hélice del DNA, ue muestra el esqueleto polipeptidico de la proteina y todos los atomos de! DNA a excepcion de los de hidrégeno. Las dos subunidades proteicas estan dibujadas en color amarillo, mientras que el DNA esta en azul [Partes (a) y (c), por cortesia de John M. Rosenberg. University of Pittsburgh. Parte (b), segun Rosenberg JIM., McClarin, J.A., Frederick, C:A., Wang, B.-C., Grable, J., Boyer, H.W. y Greene, P., Trends Biochem. Sci. 12, 396 (1987).) mente. Aunque se describieron correctamente la con: formacién del DNA y la forma de la proteina en st conjunto (Figura 28-462), el plegamiento del esquele: to polipeptidico (Figuras 28-46b y c) y las posiciones de las cadenas laterales de sus aminoacidos a lo largo del esqueleto han sido modificadas sustancialmente. ABCDEFGHI Figura 28-47 Fotogratia de una electroforesis en gel de agarosa del plasmido pAgK84 de Agrobacterium radiobacter digerido con los enzimas de restriccién (A) BamHI, (B) Pstl, (C) Bgill, (0) Hae Ill, (E) Hindll, (F) Sact, (G) Xbal y (H) Hpal. El carl ()) contiene DNA del fago 2 digerido con Hind!ll, que se usa como patron porque sus fragmentos tienen tamafios conocidos. (De Slota, J.E. y Farrand, S.F., Plasmid 8, 180 (1982). Copyright © 1982 por Academic Press.]