Clase Práctica Nº 16

Tinción, observación y cultivo de

mohos y levaduras.
Diagnóstico micológico: indirecto:
observación de colonias y estructuras;
directo: observación de pelos.
 Diagnóstico
Micológico
Cultivo e identificación de
mohos y levaduras
 Toma de Muestras:
• Micosis Superficiales

• Micosis Profundas
 Toma de muestras
• El tipo y la calidad de la muestra remitida al
laboratorio de micología es un factor
determinante para lograr con éxito el
aislamiento y la identificación de los agentes
fúngicos etiológicos de infecciones. Cada
muestra que se recibe debe ser examinada en
relación a su calidad.
• La recolección adecuada de la muestra, el
contenedor apropiado y la forma de remitirlo,
son responsabilidades del Médico Veterinario
actuante.
• Los pasos más importantes para el aislamiento
del agente etiológico de una micosis son:
 Recolección de las muestras
• Cuando se tenga que proceder a la toma de material, se
tendrá en cuenta si se trata de lesiones superficiales o
profundas, húmedas o secas, ya que las técnicas para
recoger el material a investigar serán distintas. En ambos
caso suspender la medicación.
• Las muestras deben ser recolectadas asépticamente,
colocadas en recipientes estériles, enviadas al laboratorio,
procesadas e inoculadas en los medios primarios tan pronto
como sea posible después de la recolección. Si el
procesamiento se realizara después de varias horas se
recomienda mantener las muestras en refrigeración a 4° C,
a excepción de la sangre y líquido cefalorraquídeo que se
mantendrán a 30- 37° C y las muestras dermatológicas
(donde se sospecha de Dermatofitos) que serán remitidas a
temperatura ambiente.
En caso de Micosis Superficiales, la limpieza de las zonas
afectadas se realizará con alcohol de 70° o solución fisiológica
estéril, luego se secará la zona con gasa. NO utilizar algodón, ya
que sus fibras pueden confundirse en el microscopio.
- En las lesiones de piel que presenten escamas, se procede al
raspado de las mismas con portaobjeto o bisturí desafilado,
dejando caer el material sobre otro portaobjeto estéril o caja de
Petri.
- De las zonas pilosas afectadas se tomarán los pelos enfermos
(cortados, grisáceos, debilitados) igual que en el caso anterior o
con pinza de depilar estéril, traccionando los pelos, tratando de no
destruir el bulbo piloso.
-Las uñas enfermas serán sometidas a raspado, pudiendo
asimismo obtener cortes de las mismas.
- En caso de sospechar de levaduras como Malassezia
pachydermatis, se puede utilizar una cinta adhesiva, dando 2 o 3
suaves toques con la parte pegajosa de la misma sobre la zona
afectada, para después pegar la cinta sobre un portaobjeto.
 Criptococosis
Coccidiomicosis

Esporotricosis
Histoplasmosis
Los hisopos se utilizan para la recolección de muestras de ciertas
partes del cuerpo como ser: canal ótico, nasofaringe, vagina y
cérvix, donde no puede realizarse la recolección por otros
métodos.

• Cuando el material procede de otras lesiones u órganos, como

esputos, supuraciones profundas o exudados se adoptarán las
técnicas habituales, utilizando jeringas, pipetas, etc. Efectuando
todos los procedimientos con la más rigurosa asepsia para evitar
contaminaciones externas.
 Transporte de las muestras
• Las muestras de micosis profundas deben ser transportadas
en un contenedor estéril, húmedo, de cierre hermético, y
refrigeradas a 4º C. Los medios de transporte no deberían ser
utilizados a menos que la muestra pueda ser recuperada de
forma fácil y completa del medio.
• Las muestras dermatológicas (cuando se sospecha de
micosis superficiales producidas por Dermatofitos) sin
embargo, se transportarán en un contenedor seco, como
placas de Petri, frascos estériles, o entre dos portaobjetos
limpios y estériles, sellando los bordes con cinta adhesiva
para evitar pérdida de material. Se envían al laboratorio a
temperatura ambiente.
• Las muestras en donde se sospecha de micosis superficiales
producidas por levaduras (Candida, Malassezia) y que se
hayan tomado con hisopo (canal vaginal, auditivo, etc., se
remitirán en refrigeradas a 4ºC.
 Observación Directa:
• Aclaramiento con OH.K o OH.Na

Ectotrix Endotrix
 Observación microscópica:
Observación directa
• Examen directo (sin colorear): Es un procedimiento rápido y útil para
tener una idea preliminar. Se debe tener en cuenta que a excepción de
algunos hongos, la mayoría de las veces sólo podrán observarse ciertas
estructuras fúngicas como ser levaduras, pseudohifas, hifas septadas o
cenocíticas, artroconidios, esporas, etc.
• Los líquidos purulentos o serosos, de consistencia fluida, se examinarán
directamente entre porta y cubreobjeto, pero en el caso de pelos, uñas o
escamas epidérmicas deberán ser sometidos previamente a un proceso
de aclaramiento, que consiste en colocar la muestra sobre un
portaobjeto, cubrirla con Hidróxido de Sodio o de Potasio al 20 %; se
coloca un cubreobjeto y se calienta ligeramente sobre un mechero de
Bunsen. Esta técnica permite reblandecer y aclarar por maceración el
tejido para visualizar con mayor precisión las estructuras fúngicas, en
particular las esporas.
En las dermatofitosis (conocidas vulgarmente con el nombre
de tiñas), las esporas del hongo se pueden presentar con una
disposición alrededor del pelo (Ectotrix) o en el interior
(Endotrix).
 Medios de Cultivo:
• Agar Sabouraud: cloranfenicol + cicloheximide.

• Agar papa glucosado: agua de papas hervidas

(Hongos saprófitos).

• Lactrimel: miel de abejas, harina de trigo y leche

(Hongos dermatofitos).

• Agar semilla de girasol: ácido cafeico (extracto

semilla de girasol) Para Cryptococcus spp.

• Dixon: Tween 40, ácido oleico y glicerol (levaduras

lipofílicas como Malassezia spp.)
 Medios de cultivo
La composición de los medios de cultivo utilizados en micología es muy
variada, ya que deben contemplar las necesidades nutricionales de los
hongos, que son heterótrofos. En todos los casos tendrán un pH
ligeramente ácido, y pueden o no tener antibióticos y fungistáticos.

• Agar Sabouraud: Es uno de los medios más utilizados para el primo

aislamiento. Posee en su composición peptona, una alta concentración
de dextrosa o glucosa (40 g por litro), más el agregado de cloranfenicol
que evita el desarrollo bacteriano y cicloheximide como inhibidor de los
hongos saprófitos.
• Agar papa glucosado: Cuyo componente principal es el agua del colado
de las papas hervidas. Se utiliza para mohos saprófitos.
• Lactrimel: Que lleva en su composición miel de abejas, harina de trigo y
leche. Es utilizado para dermatofitos.
• Dixon: Para levaduras lipofílicas (Malassezia spp.), contiene en su
composición Tween 40, ácido oleico y glicerol.
• Agar semilla de girasol: posee ácido cafeico (extracto semilla de girasol).
Se utiliza para Cryptococcus spp.
 Siembra e Incubación
• En los casos de muestras secas, se siembra el material
separadamente, en varios puntos de las placas o tubos.
• Si la muestra fue obtenida con un hisopo, sembrar en todo el
tubo o en un tercio de la placa y después estriar con ansa.
Los medios se incuban en aerobiosis entre 25 y 37° C (25° C
o temperatura ambiente para los hongos filamentosos o
mohos y 35-37° C para las levaduras).
 Colonias de Mohos

Microsporum canis
 OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA
El estudio y la taxonomía de los hongos se efectúa en base
a los caracteres morfológicos, macro y microscópicos. Para
evaluar las características macroscópicas del hongo se toma
en cuenta el aspecto de la colonia desarrollada en medios
sólidos, tales como forma, tamaño, textura, color y
superficie.
En el caso de los hongos filamentosos o mohos, es muy
importante la coloración que desarrollan en sus medios
sólidos, tanto en anverso como en reverso, porque puede
darnos una idea aproximada del agente etiológico.
 Levaduras:

Malassezia pachydermatis
 Observación de levaduras
Las colonias de levaduras (Cándida, Malassezia), son muy
parecidas a las colonias bacterianas, por lo que es muy
importante realizar una observación microscópica tomando
una anzada y colocándola en un portaobjeto con una gotita
de agua destilada. Se puede hacer una observación
microscópica directa, sin coloración, o se puede dejar secar
el preparado, fijar a la llama y colorear (Giemsa, Gram), para
observar las características de la célula fúngica.
 Tinciones:
• Azul de Lactofenol

• Giemsa

• Gram

• Tinta china
 Tinciones
Para la observación microscópica se utilizan diferentes coloraciones:
• Tinción de Gram, Giemsa, Azul de metileno: en muestras líquidas,
secreciones y excreciones (improntas, frotis y extendidos). Las
levaduras se observan en las muestras clínicas teñidas con la
tinción de Gram y reaccionan como positivas.
• Tinta china: en LCR (líquido cefalorraquídeo) si se sospecha la
existencia de levaduras capsuladas, como el criptococo. Se
deposita en el portaobjeto una gota de material, y se añade una
gota de tinta china a/a con agua destilada, lo que permite
observar la cápsula alrededor de la levadura (coloración de
contraste).
• Azul de lactofenol: se utiliza en preparados que se desean
conservar. El ácido láctico fija las estructuras fúngicas, hifas,
esporas, cabezas conidiales, etc, y pueden guardarse y observar
varias veces.
Microsporum canis
 Identificación

• Los hongos filamentosos se identifican

microscópicamente, observando sus
estructuras reproductivas, realizando
disgregados de las colonias obtenidas, se
coloca la misma entre porta y cubre con
una gota de azul de lactofenol.
 Rhizopus spp.

Aspergillus spp. Penicillium spp.

• Cada hongo filamentoso o moho posee
estructuras reproductivas que le son
propias, por lo que con esta observación,
vamos a poder determinar género y
especie.
Producción de tubo germinativo por Candida albicans
 Identificación de Candida albicans

• Para la identificación de C. albicans se utiliza la

Prueba de Producción (o Formación) de Tubo
Germinativo.
• Se debe realizar una suspensión con un cultivo de
24 hs, de la cepa en estudio, en 0,5 ml de suero o
plasma (bovino, equino). Incubar a 37° C y mirar al
microscopio a las 2 hs, entre porta y cubre.
• Si la levadura es C. albicans se observa una
extensión filamentosa de la levadura, sin punto de
constricción, que se denomina tubo germinativo.