La ciencia

del diagnóstico
de laboratorio
Segunda edición
 La ciencia

del diagnóstico
de laboratorio
Segunda edición

John Crocker
Department of Cellular Pathology,
Birmingham Heartlands Hospital,
Bordesley Green East, Birmingham, UK

David Burnett
Micropathology, LTD
University of Warwick Science Park
Sir William Lyon´s Road
Coventry CV4 7EZ, UK

Traducción:
QFB Carina Amador Vázquez

Revisión técnica:
Dr. Cs. Ismael Vásquez Moctezuma

MÉXICO • BOGOTÁ• BUENOS AIRES • CARACAS • GUATEMALA • LISBOA

MADRID • NUEVA YORK • SAN JUAN • SANTIAGO • SAO PAULO
AUCKLAND • LONDRES • MILÁN • MONTREAL • NUEVA DELHI
SAN FRANCISCO • SINGAPUR • ST. LOUIS • SYDNEY • TORONTO
Director Editorial: Marco Antonio Tovar Sosa
Editor Sponsor: Fausto Acosta García
Editor de desarrollo: Camilo Heras Martínez
Supervisor de producción: Olga Sánchez Navarrete
Diseño de portada: Utopía visual

NOTA
La medicina es una ciencia en constante desarrollo. Conforme surjan nuevos conocimientos, se
requerirán cambios de la terapéutica. El(los) autor(es) y los editores se han esforzado para que
los cuadros de dosificación medicamentosa sean precisos y acordes con lo establecido en la
fecha de publicación. Sin embargo, ante los posibles errores humanos y cambios en la medicina,
ni los editores ni cualquier otra persona que haya participado en la preparación de la obra ga-
rantizan que la información contenida en ella sea precisa o completa, tampoco son responsables
de errores u omisiones, ni de los resultados que con dicha información se obtengan. Convendría
recurrir a otras fuentes de datos, por ejemplo, y de manera particular, habrá que consultar la hoja
informativa que se adjunta con cada medicamento, para tener certeza de que la información de
esta obra es precisa y no se han introducido cambios en la dosis recomendada o en las contra-
indicaciones para su administración. Esto es de particular importancia con respecto a fármacos
nuevos o de uso no frecuente. También deberá consultarse a los laboratorios para recabar infor-
mación sobre los valores normales.

LA CIENCIA DEL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

Prohibida la reproducción total o parcial de esta obra,

por cualquier medio, sin la autorización escrita del editor.

DERECHOS RESERVADOS © 2007 respecto a la primera edición en español por

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ISBN-13: 978-970-10-6200-5
ISBN-10: 970-10-6200-0

Translated from the Second English edition of

The science of laboratory diagnosis
By: John Crocker and David Burnett
Copyright © 2005 by: John Wiley & Sons, Ltd.
The Atrium, Southern Gate, Chichester,
West Sussex PO 19 8SQ England
All rights reserved

ISBN (original): 0-470-85912-1

1234567890 09865432107
Impreso en México Printed in Mexico
A nuestras familias con amor
 “Faith” is a fine invention
When Gentlemen can see–
But microscopes are prudent
In an Emergency

Emily Dickinson
 Contenido
Prefacio a la primera edición xv Métodos indirectos 35
Métodos de múltiples etapas 35
Prefacio a la segunda edición xvii Aplicaciones de la inmunohistoquímica 41
Lista de colaboradores xix Control de calidad 41
Automatización 41
Proyección de imagen 41
Lecturas adicionales 42
SECCIÓN 1 HISTOPATOLOGÍA 1
Editor de sección John Crocker
5 Microscopia electrónica en patología 43
Brian Eyden
1 Manipulación y preparación de la muestra
para el diagnóstico histopatológico Introducción
Principios de la técnica y de la organización de la ME 44
de rutina 3
Aplicaciones de la microscopia electrónica
P.J. Smith y J.L. Warfield
de transmisión 48
Introducción 3 Técnicas y procedimientos especializados 54
Sistemas para manipular la muestra 4 Resumen 59
Recepción y manipulación de la muestra 4 Reconocimientos 59
Fijación y descalcificación 5 Bibliografía 60
Preparación e inclusión del tejido 7 Lecturas adicionales 60
Microtomía 11
Técnicas especiales 13 6 Microscopia de luz 61
Lectura adicional 15 Brian Boullier
Reconocimientos 15
Introducción 61
Diseño básico del microscopio 61
2 Tinciones generales 17 Tipos de microscopia 63
Barrie Sims Micrografía 66
¿Por qué la tinción? 17 Lecturas adicionales 67
Mecanismos básicos de tinción 17
Métodos comunes de tinción 20 7 Métodos cuantitativos en la patología
Conclusiones 25 tisular 69
Lecturas adicionales 25 Peter W Hamilton y Derek C Allen
Agradecimientos 25
Introducción 69
Métodos 69
3 Histoquímica de la enzima 27
Aplicaciones de la medición en la patología
Trevor Gray y Neil Hand
diagnóstica 75
Introducción 27 Automatización en histología 79
Estructura y clasificación 27 Conclusión 81
Conservación y preparación 28 Lecturas adicionales 81
Técnicas histoquímicas 29
Aplicaciones diagnósticas de la histoquímica 8 Marcadores de la proliferación
enzimática 31 en histopatología 83
Conclusión 34
Cheryl E Gillett y Diana M Barnes
Referencias 34
Introducción 83
4 Inmunohistoquímica 35 Marcadores de proliferación 83
Uso práctico de marcadores 88
Jane Starczynski y John Crocker
Método de evaluación 89
Introducción 35 Conclusión 92
Métodos directos 35 Lecturas adicionales 92
viii CONTENIDO

SECCIÓN 2 CITOLOGÍA 93 12 Identificación de bacterias 135

Editor de sección Adrian T Warfield Andrew J Hay
Introducción 135
9 Citopatología 95 Identificación directa 135
Adrian T Warfield Identificación después del cultivo 136
Identificación de bacterias de importancia médica 140
Introducción 95
Lecturas adicionales 144
Tipos de muestra citológica 95
Técnicas para la preparación de frotis 99
Fijación de la muestra 99 13 Pruebas automatizadas en bacteriología 145
Técnicas de concentración celular 99 Paul C Boreland
Métodos de tinción 103
Introducción 145
Citodiagnóstico 104
Sistemas de cultivo sanguíneo 145
Citomorfología 105
Comprobación de la sensibilidad antimicrobiana
Exactitud y limitaciones de la citología 112
y sistemas de identificación 146
Citopatología ginecológica y exploración cervical 113
Sistemas de examen de la orina 148
Aseguramiento de la calidad en la citología
Sistemas de identificación y
diagnóstica 119
sensibilidad antimicrobiana para micobacterias 149
Lecturas adicionales 119
Comentario 150
Lecturas adicionales 150

SECCIÓN 3
14 Técnicas de bacteriología molecular:
MICROBIOLOGÍA - BACTERIOLOGÍA 121
preparación y aplicación de la muestra 151
Editor de sección Darrel Ho-Yen
Richard E Holliman y Julie D Johnson
10 Microscopia en bacteriología: Necesidad de métodos moleculares 151
aplicación y preparación de la muestra 123 Preparación de la muestra 151
Amplificación 152
Dugald R Baird
Control de calidad 153
Introducción 123 Práctica actual 153
Microscopia de luz 123 Epidemiología y tipificación 156
Microscopia de fluorescencia 123 Problemas con los métodos moleculares 156
Muestras para microscopia 124 Aplicación futura 157
Examen de muestras sin teñir por Lecturas adicionales 157
transmisión de luz 124
Examen de muestras sin teñir mediante 15 Otras pruebas en bacteriología 159
iluminación de fondo oscuro 125 Darrel Ho-Yen
Tinción de las muestras 125
Lecturas adicionales 128 Introducción 159
Pruebas para el anticuerpo 159
11 Medios de cultivo en bacteriología 129 Pruebas para el antígeno 162
Prueba del complejo inmunitario específico
Eric Y Bridson
del antígeno 162
Medios de cultivo en microbiología 129 Otras pruebas 163
Formulación de los medios de cultivo 130 Desarrollos futuros 164
Enriquecimiento y selección en medios fluidos 131 Lecturas adicionales 164
Medios de cultivo químicamente definidos
medios complejos indefinidos 131 16 Control de la quimioterapia
Factores ambientales de crecimiento 132
antimicrobiana 165
Actividad del agua (aw) 132
Almacenaje de los medios de cultivo 132
Ian M Gould
Pruebas de calidad 133 Introducción 165
El futuro de los medios de cultivo 134 Principios generales del control del laboratorio
Microbiología cuántica 134 de la quimioterapia 167
Lecturas adicionales 134 Comprobación de la sensibilidad 168
 CONTENIDO ix

Automatización 169 21 Pruebas automatizadas en virología 207

Control del hospital y enlace clínico 170 Roger P Eglin
Conclusión 171
Lecturas adicionales 171 Introducción 207
Automatización en el laboratorio
de diagnóstico 209
SECCIÓN 4 MICROBIOLOGÍA, VIROLOGÍA, ¿Debe automatizarse el Laboratorio? 210
Otros desarrollos en la automatización 212
MICOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA 173 Conclusiones 212
Editor de sección Darle Ho-yen Lecturas adicionales 212

17 Microscopia en virología: aplicación

22 Técnicas moleculares en virología 213
y preparación de la muestra 175 Paul E Klapper
Marie M Ogilvie
Introducción 213
Introducción 175 Técnicas de amplificación del ácido nucleico 213
Histopatología: cuerpos de inclusión y células Análisis de la secuencia 220
multinucleadas gigantes 175 Resumen 222
Virología 176 Lecturas adicionales 222
Inmunofluorescencia 177
Examen microscópico de los cultivos celulares 178
Desarrollos 180 23 Virología: otras pruebas 225
Reconocimientos 180 Alex WL Joss
Lecturas adicionales 180
Detección de la enfermedad por prion 225
Diagnóstico 227
18 Microscopia electrónica en virología 181 Pruebas de susceptibilidad antivírica 228
Hazel Appleton Inmunidad mediada por células 231
Introducción 181 Lecturas adicionales 232
Métodos 181
Usos de la microscopia electrónica 182 24 Micología 233
Laboratorio de virología 187 David W Warnock
Reacción rápida de urgencia 187
Virus de nueva aparación 188 Introducción 233
Conclusiones 188 Examen microscópico 234
Lecturas adicionales 189 Cultivo 235
Identificación 236
Pruebas serológicas 237
19 Cultivo tisular 191 Nuevas direcciones en el diagnóstico 238
William L Irving y Alan Pawley Lecturas adicionales 238
Introducción 191
Selección de los cultivos celulares 191 25 Parasitología 239
Preparación de cultivos celulares 192 Robert WA Girdwood
Especímenes clínicos para el aislamiento de virus 193
Identificación del crecimiento vírico 193 Introducción 239
Conclusiones 196 Microscopia 239
Lecturas adicionales 196 Montajes húmedos 240
Extendidos y frotis 240
20 Pruebas serológicas en virología 197 Histopatología 241
Fluorescencia 241
Goura Kudesia
Microscopia electrónica 241
Introducción 197 Cultivo 242
Principios 197 Infección animal 242
Técnicas 198 Xenodiagnóstico 242
Interpretación y uso de las pruebas serológicas 203 Serología 243
Futuro de la serología 204 Métodos moleculares 243
Lecturas adicionales 205 Lecturas adicionales 244
x CONTENIDO

SECCIÓN 5 HEMATOLOGÍA 245 Adherencia plaquetaria 291

Editor de sección Peter E Rose Investigaciones de la agregación plaquetaria 291
Analizador PFA-100 para la función plaquetaria 292
Investigaciones sobre la liberación plaquetaria 292
26 Morfología de las células sanguíneas Citometría de flujo 292
y de la médula ósea 247 Tromboelastograma 293
Supratik Basu Lecturas adicionales 293

Morfología de la sangre periférica 247

31 Servicio transfunsional del hospital 295
Examen y morfología de la médula ósea 249
Células no hematopoyéticas y parásitos en sangre
Steven Walton y Peter E Rose
y médula ósea 263 Identificación del grupo sanguíneo 295
Lecturas adicionales 263 Métodos para identificar el grupo sanguíneo 296
Tamizaje de anticuerpos 297
Compatibilidad cruzada 300
27 Principios de los contadores
Práctica de la transfusión 301
automatizados de células sanguíneas 265 Lecturas adicionales 301
Graham Martin
Introducción 265 32 Citometría de flujo y biología molecular
Medición de la Hb 265 en la hematología 303
Mediciones de los eritrocitos 265 Ian Chant
Medición de los reticulocitos y RBC nucleados 267
Eritrocitos nucleados 268 Introducción 303
Mediciones de los leucocitos 269 Citometría de flujo e inmunofenotipificación 304
Lecturas adicionales 271 Valoración de la función plaquetaria por citometría
de flujo 307
Biología molecular en la hematología 307
28 Métodos para la identificación Resumen 310
de hemoglobinopatías 273 Lecturas adicionales 311
Nick Jackson y Anne Sermon
Introducción 273 33 Investigaciones hemáticas 313
Técnicas de tamizaje 273 Frank Wells
Diagnóstico de laboratorio de hemoglobinopatías Cobalamina (vitamina B12) y folato 313
y de talasemias 274 Hierro 317
Detección, identificación y cuantificación Resumen 322
de hemoglobinopatías 274 Lecturas adicionales 322
Agradecimientos 279
Lecturas adicionales 279
34 Investigación del laboratorio
de la hemólisis 323
29 Investigaciones especiales del factor Paul Revell
von Willebrand 281
Mohammad S. Enayat Introducción 323
Características clínicas 323
Introducción 281 Desórdenes hemolíticos 326
Pruebas fenotípicas 282 Segmento final 332
Pruebas genotípicas para identificar la mutación 285 Lecturas adicionales 332
Lecturas adicionales 287
35 Investigaciones de laboratorio
30 Análisis de plaquetas 289 de la hemostasis 333
Steven Walton y Peter E Rose Peter E Rose y Catherine Caveen
Introducción 289 Introducción 333
Estructura y función 289 Tiempo de protrombina 333
Conteo plaquetario 290 Tiempo parcial de tromboplastina activada (APTT) 335
Anticuerpos plaquetarios 291 Tiempo de trombina 337
Tiempo de sangrado 291 Tiempo de reptilasa 338
 CONTENIDO xi

Fibrinógeno 338 Marcadores 375

Ensayos del D-dímero y de los FDP 339 Ensayos homogéneos 376
Ensayos del factor 339 Métodos de separación 376
Marcadores de la coagulación activada 340 Automatización 377
Evaluación automatizada de la coagulación 341 Miniaturización 377
Lectura adicional 341 Cálculo de los resultados 377
Exactitud y precisión 378
Control de calidad 378
SECCIÓN 6 CITOGENÉTICA 343 Especificidad, reactividad cruzada e interferencia 379
Editor de sección Brian Boullier “Efecto de gancho” por dosis alta 380
Lecturas adicionales 380
36 Bandeo y análisis cromosómico 345
Mervyn Humphreys 40 Electrodos ion-selectivos 381
Alan D Hirst
Introducción 345
Bandeo cromosómico 345 Introducción 381
Análisis cromosómico 352 Teoría 381
Lecturas adicionales 355 Especificidad: cómo los electrodos se hacen
selectivos 384
Reacciones electroquímicas 386
37 Hibridización in situ Electrodos de glucosa 389
fluorescente 357 Detectores electroquímicos 390
Ivor Hickey Electrodos complejos 390
Otros electrodos complejos mediados
Elección de la sonda 357
por las enzimas 391
Marcación de las sondas 357
Comprobación en los puntos de cuidado (POCT) 392
Hibridación 358
Respaldo 393
Detección de la sonda hibridada 358
Reconocimientos 394
Aplicaciones en la investigación básica 358
Lecturas adicionales 394
Aplicaciones en la genética médica 360
Aplicaciones en el diagnóstico e investigación
del cáncer 361 41 Absorción de la luz, dispersión
Lecturas adicionales 362 y técnicas de luminiscencia
en bioquímica clínica rutinaria 395
Bernard F Rocks
SECCIÓN 7 QUÍMICA CLÍNICA 363
Introducción 395
Editor de sección William J Marshall
Técnicas de absorción de la luz 395
Turbidimetría y nefelometría 397
38 Adquisición, aplicaciones Luminescencia 399
e interpretación de los datos Lecturas adicionales 403
bioquímicos clínicos 365
William J Marshall 42 Espectrometría atómica analítica 405
Introducción 365 Andrew Taylor
Recolección y análisis de la muestra 366 Introducción 405
Interpretación de los datos de laboratorio 367 Principios 405
Bioquímica clínica basada en evidencia 371 Instrumentación 407
Conclusión 371 Aplicaciones 413
Lecturas adicionales 371 Aseguramiento de la calidad 414
Conclusiones 414
39 Inmunoensayo en bioquímica Referencias 415
clínica 373
Joan Butler y Susan M Chambers 43 Técnicas químicas del reactivo seco 417
JA Schroeder, JC Osypiw y GS Challand
Introducción 373
Diseño del ensayo 373 Introducción 417
Condiciones del ensayo y calibradores 374 Principios de la metodología 418
xii CONTENIDO

Ejemplos específicos 419 49 Tipificación de HLA 481

Control de calidad de la química del reactivo seco 423 Mark Hathaway
Resumen 427
Lecturas adicionales 427 Introduction 481
Estructura y función de HLA 481
Genética del complejo principal de
44 Técnicas de separación 429
histocompatibilidad (MHC) 482
Roy Sherwood La mecánica de tipificación HLA 482
¿Por qué separar? 429 Tipificación molecular 483
Cromatografía 429 Resumen 486
Cromatografía de capa fina (TLC) 429
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) 431
Cromatografía de gases (GC) 433 SECCIÓN 9 PATOLOGÍA MOLECULAR 487
Electroforesis 434 Editor de sección John O’Leary
Lecturas adicionales 436
50 Microdisección por láser y captura
de tejido 489
SECCIÓN 8 INMUNOLOGÍA 437 Orla Sheils, Paul Smyth, Esther O’Regan,
Editor de Sección David Burnett Stephen Finn, Richard Flavin y John O’Leary
LCM-PixCell® y AutoPix® de Arcturus 489
45 Ensayos proteicos 439 Microdisección con microrrayo láser 492
David Burnett Leica AS LMD 493
Lecturas adicionales 493
Introducción 439
Una breve perspectiva histórica 439
Técnicas cualitativas 440
51 Análisis del gen por reacción en cadena
Métodos cuantitativos 443 de la polimerasa (PCR) en tiempo real 495
Conclusión 446 Cara M Martin, Orla Sheils y John O ’Leary
Reconocimientos 446 Introducción 495
Lecturas adicionales 446 Química de la reacción en cadena de la
polimerasa en tiempo real 495
46 Ensayos del complemento 447 Química de la TaqMan de PCR (ensayo de la
J North y K Whaley 5’nucleasa) 496
Sondas TaqMan de unión al surco menor del DNA 498
Introducción 447
Iniciador TaqMan y diseño de la sonda 498
Ensayos de los niveles séricos del complemento 449
Detección del amplicón 499
Lecturas adicionales 453
Detección por TaqMan en tiempo real 500
Cuantificación absoluta 500
47 Inmunología celular 455 Cuantificación relativa 500
Aarnoud Huissoon Genes housekeeping 500
Aplicaciones de TaqMan PCR en patología 501
Introducción 455
Referencias 504
Pruebas cuantitativas y cualitativas 455
Estudios funcionales 459
El futuro de la inmunología celular 463
52 Reacción en cadena de la polimerasa
Lecturas adicionales 463 en la célula 505
John O’Leary, Cara M Martin y Orla Sheils
48 Enfermedades del complejo Introducción 505
inmunitario y crioglobulinas 465 Visión general de la metodología 505
Siraj A Misbah Tecnologías de PCR celular: definiciones 506
Amplificación del DNA en la célula 508
Introducción 465 Detección de los amplicones 510
Ensayos para los complejos inmunitarios circulantes 466 Reacción de amplificación, controles y detección
Enfermedad sérica 467 en el tejido para uso en ensayos de PCR DNA
Lupus eritematoso sistémico 468 en la célula 510
Crioglobulinemia 477 Amplificación del RNA en la célula 511
Lecturas complementarias 480 Problemas de la amplificación por PCR en la célula 511
 CONTENIDO xiii

Trabajo futuro con los ensayos basados en la PCR Apreciación global de hibridación genómica
en la célula 513 comparativa 524
Referencias 513 Aplicaciones clínicas 525
Microarreglos 525
53 Análisis de SNP de alta densidad Conclusión 528
Referencias 528
y de arreglos de cDNA 515
Orla Sheils, Cara M Martin, Paul Smyth,
Jon Sherlock, Stephen Finn, Esther O’Regan, 55 Secuenciación de ácidos
Steve Picton y John O’Leary desoxirribonucleicos 531
Cara M Martin, Steven J Picton,
Introducción 515 Orla Sheils y John O’Leary
Tecnología Affymetrix GeneChip 515
Perfil de SNP y matrices de DNA 517 Introducción 531
Sistema de expresión con microarreglo de Applied Historia de la secuenciación del ácido
Biosystems 517 desoxirribonucleico 531
Ilumina, “microarreglo de ordenamientos®” 519 Secuenciación química del ácido
Manejo de datos y análisis secundario 521 desoxirribonucleico 532
Referencias 521 El método dideoxi de secuenciación del DNA 532
Secuenciación automatizada 534
54 Análisis por microarreglo de la Proyecto del Genoma Humano 536
Áreas que avanzan en la secuenciación
hibridación genómica comparativa de los ácidos nucleicos 537
de los tejidos humanos 523 Referencias 538
Esther O’Regan, Paul Smyth, Stephen Finn, Lecturas adicionales 538
Cara M Martin, Orla Sheils y John O’Leary
Antecedentes de hibridación genómica comparativa Índice alfabético 539
(CGH) y de su microarreglo 523

ERRNPHGLFREORJVSRWFRP
 Prefacio a la primera edición
Tanto nosotros como nuestros colegas hemos encontrado
en nuestra experiencia de muchos años que las personas de
todos los niveles que trabajan en nuestros laboratorios no
tienen experiencia en algunos aspectos. Nos hemos dado
cuenta que existe la necesidad de un libro que una todas
las disciplinas de la patología, el cual pueda explicar los
porqué y para qué de la medicina de laboratorio. Debemos
enfatizar que este material no intenta ser un libro de re-
cetas; nuestro objetivo es mucho mayor que explicar los
principios básicos de las técnicas de laboratorio y la inter-
pretación de los resultados que se obtienen de ellos. Hemos
tratado de asegurar que este libro lo puedan utilizar varios
tipos de lectores. Estos podrían incluir estudiantes, patólo-
gos, cirujanos y médicos, así como técnicos de laboratorio.
Los contenidos son multidisciplinarios y existe coinciden-
cia entre algunos capítulos y secciones. Esto es intenciona-
do y refleja el estado verdadero de la patología moderna.
Sentimos que es importante que los patólogos de cada sub-
especialidad muestren más interés por la actividad de sus
colegas de laboratorio. Este libro tiene la intención de pre-
sentar los métodos más comunes y sus avances más recien-
tes. Otra vez se enfatiza que la unión entre la patología y la
medicina de laboratorio es forzada aunque con frecuencia
conveniente. Sin embargo, esperamos que los profesiona-
les de una especialidad lean otras secciones. Por ejemplo,
para trabajar el campo de los linfomas, los histopatólogos
necesitan entender bien la hematología y la microbiología.
Lo anterior, por supuesto, interviene en el tratamiento del
linfoma en los pacientes, como la microbiología cuando se
presentan infecciones oportunistas después de la quimiote-
rapia. Además, los químicos necesitan relacionar sus descu-
brimientos a los procesos hematológicos.
Otra característica de este libro es que en algunas partes,
existen coincidencias entre capítulos y secciones; esto es
completamente intencional y refleja una vez más el esta-
do actual del laboratorio clínico. Así, la aplicación, con-
textos e interpretación de varios métodos inevitablemente
serán diferentes dependiendo de la disciplina. El lector será
avisado de esta particularidad en las secciones cubriendo
temas como la microscopia de electrones y técnicas mo-
leculares, que son metodologías que forman parte de mane-
ra extensa de diferentes disciplinas. Es más, los problemas
de comunicación producen un efecto de deterioro evitable
en los avances de metodologías de uso común y de in-
vestigación. En nuestro conocimiento este libro es único
y esperamos que dé los elementos a mucha gente capaci-
tada o en capacitación en medicina de laboratorio no sólo
en su propio campo sino también en otros. La mayoría de
los capítulos incluye una lista de las principales referencias
aunque en algunos casos lo hemos creído innnecesario;
además, algunos capítulos tienen una lista de referencias
grande que puede reflejar su complejidad o su contenido
de gran alcance. Por supuesto, deseamos expresar nuestra
garatitud a todos nuestros editores de sección y los autores
de los capítulos. Naturalmente, también estamos en deuda
con nuestro editor John Harrison y su equipo. Extende-
mos nuestro agradecimiento a Ruth Fry, Vivien Garland y
Valerie Griffiths por su ayuda en la asistencia y respuesta a
las interminables llamadas telefónicas.
John Crocker
David Burnett
 John Crocker (1952-2004)

John Crocker demostró en su relativa corta vida un conocimiento agudo y un profundo in-
terés en la ciencia de muchas formas. Fue premiado en el King´s College, Cambridge, a
la edad de 16 años. Después, estudió medicina. Su primer libro, de cerca de 250 páginas,
lo realizó en su tercer año en Cambridge, los resultados de su tesis de patología. Ahí fue en
donde John conoció a su pareja de toda la vida y esposa, Kate. Después de su examen, John
decidió estudiar patología. Su primer puesto fue en el East Birmingham Hospital (ahora el
Birmingham Heartlands Hospital), del cual regresó como colaborador después de siete años
en el Departamento de Patología en la University of Birmingham, durante los cuales obtuvo
su M.D. Fue ahí donde desarrolló su interés por la investigación de linfomas.
John disfrutaba su trabajo en el Departamento de Histopatología en el Heartlands Hospital,
especialmente gracias a su buena relación con sus colaboradores. A pesar de haber contri-
buido al diagnóstico usual, servicios de enseñanza y administrativos del departamento, John
trató de mantener una carrera activa de investigador, colaborando con otros patólogos y cien-
tíficos, especialmente de las universidades de Warwick, Birmingham y Wolverhampton; sus
dos últimas cátedras. Con Jane Starczynski y sus colaboradores, desarrolló técnicas únicas
en la disciplina. Sus aportaciones a la patología fueron reconocidas en un evento de admisión
poco usual, en 1995, como miembro honorario del Royal College of Physicians. Con gran
interés que incluía astronomía, música, literatura contemporánea, biología marina, compu-
tación, arte, fotografía, química y geología, es claro que John fue polifacético. Su naturaleza
ecléctica fue parte de su trabajo y sus creencias que los patólogos de todas las disciplinas
tienen mucho que aprender del otro, y efectivamente, de otras disciplinas científicas, fue el
filósofo detrás del libro que tiene en sus manos. Por desgracia, John murió antes de que su
segunda edición se publicara. Todos sus familiares, amigos y colegas lo recordaremos no
sólo como un científico extremadamente inteligente y entusiasta, sino también como un hom-
bre jovial y bondadoso con un profundo sentido de compasión. Deseo dedicar este segunda
edición a su memoria.

David Burnett, marzo 2005

 Prefacio a la segunda edición
Han pasado seis años desde la primera edición de este libro
y actualmente tenemos un nuevo editor, John Wiley & Sons,
que convino que era oportuno poner al día este volumen.
Los autores siempre están entusiasmados de tener la
oportunidad de mejorar lo que escribieron y esto se refleja
aquí. También es la oportunidad de actualizar ciertas áreas
debido al rápido desarrollo en esos campos, aunque, inevi-
tablemente, hay algunos capítulos a los que se les ha cam-
biado el título. Algunos capítulos ahora tienen nuevo autor
o incluyen otros. Las razones son varias. En algunos casos,
los autores han recibido apoyo de nuevos colaboradores y
otros se han retirado desde la publicación de la primera edi-
ción. De forma trágica, un autor, Graeme Bird, murió. No
obstante, la esencia del libro continúa, aunque el estilo ha
cambiado inevitablemente a consideración de los editores
actuales, quienes quieren agradecer todo su apoyo, espe-
cialmente al Dr. Joan Marsh. También queremos agradecer
a Ruth Fry por su asistencia.
John Crocker
David Burnett
 Lista de colaboradores
Derek C Allen Histopathology Laboratory, Belfast City
Hospital, Belfast BT9 7AD, UK
Hazel Appleton Health Protection Agency, Specialist
and Reference Microbiology Division, 61 Colindale Ave-
nue, London NW9 5TH, UK
Dugald R Baird Formerly Department of Microbio-
logy, Lanarkshire Acute Hospitals NHS Trust, Hairmyres
Hospital, Eaglesham Road, East Kilbride G75 8RG,
UK
Diana M Barnes Hedley Atkins/Cancer Research UK
Breast Pathology Laboratory Guy’s Hospital, St. Thomas
Street, London SE1 9RT, UK
Supratik Basu Pathology Laboratory, Warwick Hospi-
tal, Lakin Road, Warwick CV34 5BJ, UK
Paul C Boreland Microbiology Department, Ulster Hos-
pital, Dundonald, Beifast BT16 1RH
Brian Boullier Illuminate Communications, The Bea-
cons, Leeds Road, Lightcliffe, Halifax HX3 8NU, UK
Eric Y Bridson Formerly Oxoid Ltd, 3 Bellever Hill,
Camberley, Surrey BU15 2HB, UK
David Burnett Micropathology Ltd. University of
Warwick Science Park, Sir William Lyon’s Road, Coventry
CV4 7EZ, UK
Joan Butler Honorary Lecturer, Guy’s, King’s and St.
Thomas’s School of Medicine, London
Catherine Caveen Department of Haematology, Warwick
Hospital, Lakin Road, Warwick CV34 5BJ, UK
G S Challand Department of Clinical Biochemistry,
Royal Berkshire Hospital, Reading, Berkshire RG1 5AN,
UK
Susan M Chambers Department of Clinical Biochem-
istry, Kings College Hospital, Denmark Hill, London SE5
9RS, UK
Ian Chant Department of Heamatology, Warwick Hospi-
tal, Lakin Road, Warwick CV34 5BJ, UK
John Crocker Department of Cellular Pathology, Bir-
mingham Heartlands Hospital, Bordesley Green East,
Birmingham B9 5SS, UK
Roger P Eglin National Transfusion Microbiology La-
boratories National Blood Service, Colindale Ave Colin-
dale, London NW95BG
Mohammad S Enayat Molecular Heamostasis La-
boratory, Birmingham Children’s Hospital NHS Trust,
Ladywood, Birmingham B16 8ET, UK
Brian Eyden Department of Histopathology, Christie
Hospital NHS Trust, Manchester M20 4BX, UK
Stephen Finn Department of Histopathology, Trinity
College, Dublin, Dublin, Ireland
Richard Flavin Department of Histopathology, Trinity
College, Dublin, Dublin, Ireland
Cheryl E Gillett Hedley Atkins/Cancer Research UK
Breast Pathology Laboratory, Guy’s Hospital, St. Thomas
Street, London SE1 9RT, UK
Robert WA Girdwood formerly Scottish Parasite Diag-
nostic Laboratory, Stobhill Hospital, Balornack Road,
Glasgow, G21 3UW
Ian M Gould Department of Medical Microbiology,
Medical School, Foresterhill, Aberdeen AB9 2ZB, UK
Trevor Gray Histopathology Department, Queen’s Me-
dical Centre, University Hospital NHS Trust, Nottingham
NG7 2UH, UK
Peter W Hamilton Department of Pathology, The
Queens University of Belfast, Grosvenor Road, Belfast
BT12 6BL, UK
Neil Hand Histopathology Department, Queen’s Medi-
cal Centre, University Hospital NHS Trust, Nottingham
NG7 2UH, UK
Mark Hathaway National Blood Service, Vincent Drive,
Selly Oak, Birmingham B15 2SG, UK
Andrew J Hay Department of Microbiology, Raigmore
Hospital, Old Perth Road, Inverness IV2 6DJ, UK
xx LISTA DE COLABORADORES
Ivor Hickey School of Biology and Biochemistry, Medi-
cal Biology Centre, Queen’s University Belfast, 97 Lisburn
Road, Belfast BT9 7BL, UK
Alan D Hirst Department of Biochemistry, Bradford
Royal Infirmary, Duckworth Lane, Bradford BD9 6RJ,
UK
Richard E Holliman Department of Medical Micro-
biology, St. George’s Hospital and Medical School,
Blackshaw Road, London SW17 0QT, UK
Darrel Ho-Yen Department of Microbiology,
Raigmore Hospital, Old Perth Road, Inverness IV2
6DJ, UK
AP Huissoon Regional Immunology Department, Bir-
mingham Heartlands Hospital, Bordesley Green East,
Birmingham B9 5SS, UK
Mervyn Humphries Northern Ireland Regional Gene-
tics Centre, Leukaemia Cytogenetics Laboratory, Floor A,
Belfast City Hospital, Tower Block, Lisburn Road, Belfast
BT9 7AB, UK
William L Irving Department of Virology, University of
Nottingham, Nottingham, UK
Nick Jackson Department of Heamotology, University
Hospital Coventry and Warwickshire NHS Trust, Clifford
Bridge Road, Coventry, UK
Julie D Johnson Department of Medical Microbiolo-
gy, St. George’s Hospital and Medical School, Blackshaw
Road, London SW17 0QT, UK
Alex WL Joss Microbiology Department Raigmore
Hospital NHS Trust, Perth Road, Inverness IV2 3UJ,
UK
Paul E Klapper Department of Virology, Health Pro-
tection Agency, Leeds Laboratory, Bridle Path, York Road,
Leeds LS15 7TR, UK
Goura Kudesia Department of Virology, Northern
General Hospital NHS Trust, Herries Road, Sheffield S5
7BQ, UK
William J Marshall Consultant Clinical Biochemist,
The London clinic, 20 Devonshire Place, London W79
6BW
Cara M Martin Department of Histopathology, Trinity
College Dublin, Dublin, Ireland
Graham Martin Heamotology Department, Glouces-
ter Hospitals NHS Trust, Great Westerm Road, Gloucester
GL1 3NN
Siraj A Misbah Department of Immunology, Churchill
Hospital, Old Road, Headington, Oxford OX3 7LJ, UK
Jonathan North Department of Immunology, City Hos-
pital, Dudley Road, Birmingham B18 7QH, UK
Marie M Ogilvie Division of Medical Microbiology,
College of Medicine and Veterinary Medicine, University
of Edinburgh, Edinburgh, UK
John O’Leary Department of Pathology, The
Coombre Women’s Hospital Dublin, Ireland; and Depar-
tment of Histopathology, Trinity College Dublin, Dublin,
Ireland
Esther O’Regan Department of Histopathology, Trinity
College Dublin, Dublin, Ireland
Jacqueline C Osipiw Department of Clinical Bioche-
mistry, Royal Berkshire Hospital, Reading, Berkshire RG1
5AN, UK
Alan Pawley Virology Laboratory, Queen’s Medical
Centre Trust, Nottingham, UK
Steven J Picton Affymetrix UK Ltd, Wooburn Green,
Hight Wycombe HP10 0HH, UK
Paul Revell Department of Haematology, Stafford-
shire General Hospital, Weston Road, Stafford ST16
3SA, UK
Bernard F Rocks Department of Clinical Pathology,
Royal Sussex County Hospital, Brighton, Sussex BN2
5BE, UK
Peter E Rose Department of Haematology, Pathology
Laboratory, Warwick Hospital, Lakin Road, Warwick CV34
5BJ, UK
Jessica Schroeder Department of Clinical Biochemis-
try, Royal Berkshire Hospital, Reading, RG1 5AN
Anne Sermon Department of Haematology, Notting-
ham City Hospital, Hucknall Road, Nottingham NG5
1PB, UK
Orla Sheils Department of Histopathology, Trinity Co-
llege Dublin, Dublin, Ireland
Jon Sherlock Applied Biosystems, Applera, UK
Roy A Sherwood Department of Clinical Biochemis-
try, King’s College School of Medicine and Dentistry,
Bessemer Road, London SE5 9PJ, UK
Barrie Sims Department of Histopathology, Stafford-
shire General Hospital, Weston Road, Stafford ST16
3SA, UK
 LISTA DE COLABORADORES
Paul J Smith Department of Cellular Pathology, Bir-
mingham Heartlands Hospital, Bordesley Green East,
Birmingham B9 5SS, UK
Paul Smyth Department of Histopathology, Trinity Co-
llege Dublin, Dublin, Ireland
Jane Starczynski Department of Cellular Pathology,
Birmingham Heartlands Hospital, Bordesley Green
East, Birmingham B9 5SS, UK
Andrew Taylor Trace Element Laboratory, School of
Biological Sciences, University of Surrey, Guildford, Su-
rrey GU2 5XH, and Clinical Laboratory, Royal Surrey
County Hospital, Guildford Surrey GU2 5XX, UK
Steven Walton Department of Haematology, Warwick
Hospital, Lakin Road, Warwick CV34 5BJ, UK
xxi
Adrian T Warfield Department of Histopathology,
Birmingham Heartlands Hospital, Bordesley Green
East, Birmingham B9 5SS, UK
Janine L Warfield Birmingham Heartlands Hospital,
Bordesley Green East, Birmingham B9 5SS, UK
David W Warnock Division of Bacterial and Mycotic
Diseases, National Center for Infectious Diseases, Center
for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333,
USA
Frank Wells Biochemistry Department Warwick Hospi-
tal, Lakin Road, Warwick, CV34 5BJ
Keith Whaley Department of Immunology, Leicester
Royal Infirmary, Leicester LE1 5WW, UK
 SECCIÓN 1
HISTOPATOLOGÍA
 1
Manipulación y preparación de la muestra
para el diagnóstico histopatológico de rutina
PJ Smith y JL Warfield
Introducción
La histopatología diagnóstica es una especialidad que, in-
cluso hoy en día, no ha dejado de ser una labor en particu-
lar intensa, sobre todo si se considera que en esta área el
desarrollo de la tecnología automatizada ha sido discreto
y aún toman tiempo sus procedimientos. Las máquinas que
procesan y tiñen cortes, como parte integral de cualquier
laboratorio de histología común, son cada vez más com-
plejas en términos de su aplicación y contribución a un am-
biente de salud y seguridad. El registro manual de casetes
para procesar tejidos y el portaobjetos del microscopio se
ha vuelto en poco tiempo obsoleto desde la introducción
de sistemas de transcripción independientes conectados a
una computadora. Los sellos herméticos y automatizados
también son comunes en muchos laboratorios y hacen po-
sible minimizar la exposición del personal a los solventes
orgánicos; en consecuencia, los laboratoristas pueden con-
centrarse en las tareas manuales del departamento y no en
las labores de montaje.
El moderno laboratorio de histopatología, aunque se ha
beneficiado en cierto grado con la automatización y el con-
tinuo desarrollo de mejoras del equipo estándar, es todavía
un área sensible a las cargas de trabajo. La posibilidad de
renovación se relaciona de manera directa, primero, con
la capacidad de procesamiento y, segundo, con el personal
disponible para realizar las tareas requeridas para obtener
los cortes histopatológicos teñidos necesarios para el exa-
men microscópico subsiguiente y el diagnóstico patoló-
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker,
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
gico. Muchos laboratorios modernos han experimentado
aumentos notables de la carga de trabajo en los últimos
años, como resultado de nuevos lineamientos y fusiones,
sin un aumento correspondiente de la contratación de per-
sonal. De manera inevitable, estos laboratorios han mejo-
rado sus metodologías y técnicas para no sucumbir a las
exigencias del alto rendimiento y proporcionar un servicio
de calidad eficiente.
La intención de este capítulo es proporcionar una si-
nopsis de la preparación de tejidos en el moderno laborato-
rio de histopatología, con énfasis en la eficiencia y calidad
del servicio. Rebasa los límites de este estudio explicar, en
cualquier grado, la química o los pormenores de la prepa-
ración del tejido. La descripción debe ser suficiente para
conocer de forma general las técnicas y estandarizar la
histopatología de rutina en el diagnóstico de laboratorio.
La preparación de las muestras de tejido para el diag-
nóstico se analiza bajo los siguientes títulos:
1. Sistemas de control de la muestra.
2. Recepción y manipulación de la muestra.
3. Fijación y descalcificación.
4. Procesamiento e impregnado.
5. Microtomía.
6. Técnicas especiales.
4 CAP. 1 MANIPULACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO DE RUTINA
Sistemas para manipular la muestra
La mayor parte de los laboratorios modernos de histopa-
tología tiene su propia tecnología de información depar-
tamental para almacenar y obtener los datos demográficos
y muestrales del paciente. El sistema de registro manual o
computarizado del enfermo se debe situar dentro del área de
reserva del laboratorio. Esta ubicación debe separarse del
cuarto de “corte” y, en condiciones ideales, localizarse en
un ambiente de oficina, integrada al área administrativa del
laboratorio.
Sistemas de información computarizados
Una de las funciones esenciales de un sistema de control
computarizado de la muestra consiste en facilitar la asig-
nación de los identificadores específicos del hospital y de
la muestra: número de registro hospitalario y número del
laboratorio de referencia. El primero debe tener el formato
de solicitud histológica y colocarse en la muestra de acom-
pañamiento. El segundo lo asigna de manera automática
el sistema, pero también es posible el procedimiento ma-
nual. El número del laboratorio permanece con la muestra
en todo el proceso histológico y se transfiere a la forma
de solicitud, el (los) contenedor(es) de la muestra, el (los)
casete(s) del tejido, el portaobjeto(s) del microscopio y
el informe final del diagnóstico.
Los patólogos, el responsable del laboratorio, las secre-
tarias y las áreas del laboratorio requieren terminales para
facilitar el ingreso y la codificación de los informes diag-
nósticos, datos muestrales, generación de la lista de traba-
jo, procedimientos técnicos adicionales, seguimiento de la
muestra (fases del procedimiento), relación específica de
tejido, y trastornos y recolección de datos para determinar
la carga de trabajo, las condiciones laborales y los costos.
Ingreso manual de datos
El ingreso manual de datos, mediante un libro diario qui-
rúrgico, y el etiquetado de los casetes del tejido y los por-
taobjetos del microscopio tienen más desventajas que un
sistema de laboratorio computarizado. Los sistemas ma-
nuales confían en la letra legible y clara, y la asignación
exacta de los números progresivos del laboratorio para una
persona. Los errores de transcripción pueden ocurrir du-
rante la transferencia del número de laboratorio a los ca-
setes del tejido y portaobjetos del microscopio si la letra
asentada en el libro diario, o en la solicitud, es confusa.
El marcado impreciso o ilegible de los casetes del tejido
puede ocasionar que los bloques del tejido se vinculen mal
con las formas de solicitud y portaobjetos, y por lo tanto, es
posible, en el mejor de los casos, establecer un diagnóstico
equívoco si dos tejidos son similares o perder un tiempo
valioso en el laboratorio mientras se resuelve la situación.
Es esencial en todos los laboratorios, tanto si se utiliza un
sistema manual o uno computarizado, que medidas de con-
trol rigurosas garanticen la integridad del informe diag-
nóstico final.
Los sistemas manuales requieren la disposición de un
archivo de referencia cruzada, un registro diagnóstico y
amplias instalaciones para almacenar los informes y las
formas de solicitud.
La calidad de la información que procesa el departa-
mento de servicio depende de la solicitud o los informes
que proporcione la administración hospitalaria (o los siste-
mas de comunicación si es que se dispone de una red por
computadora).
Al realizar el ingreso de datos, manual o computari-
zado, las formas de solicitudes se anexan a su respectivo
contenedor(es) de la muestra y los recipientes se marcan
de modo indeleble con el número de laboratorio. Algunos
centros asignan el número de laboratorio, antes de asentar-
lo en el registro, mediante rollos preimpresos de números
secuenciales autoadhesivos.
Marcadores de casete y portaobjetos automáticos
Los marcadores de casete y portaobjetos están disponibles
en el comercio y pueden utilizarlos todos los laboratorios.
Las instituciones que efectúan el ingreso manual de los da-
tos confían también en el ingreso manual de estas máquinas,
del mismo modo que los laboratorios que tienen sistemas
informáticos genéricos menos comunes. Los laboratorios
con sistemas más complejos pueden interconectarse con
estas máquinas, de tal modo que el marcado del casete y el
portaobjetos se convierte en un procedimiento automático
ligado, por ejemplo, al registro de datos y la generación
de la lista de trabajo, respectivamente. El advenimiento de
estas máquinas ha permitido el etiquetado preciso de ca-
setes y portaobjetos y reducido el error de transcripción a
márgenes mínimos (fig. 1-1).
Recepción y manipulación de la muestra
Cuarto de corte
La estancia diseñada para la práctica de los cortes debe es-
tar disponible para la recepción y manipulación de todas las
muestras tisulares que requieren un diagnóstico histopato-
lógico. Esta sala debe estar por completo separada de otras
adaptaciones del laboratorio, contar con buena iluminación
y ventilación y proporcionar las áreas para el desempaque,
 FIJACIÓN Y DESCALCIFICACIÓN
Figura 1-1 Marcadores Leica IP C e IP S para casete y portaobjetos.
correlación y disección de la muestra. El almacenamiento
de los tejidos fijados con formalina (“mojados”), después de
la disección, puede también ser una función del cuarto
de “cortes”. Los almacenadores para muestras construidos
a la medida y ventilados están disponibles en el mercado y
se pueden incorporar a las salas de “corte” más grandes o
alojarse de modo conveniente en un área separada, usada
de forma específica para guardar las muestras.
Las precauciones con el formaldehído son la primera
preocupación en esta área y se legislan de manera conjun-
ta en las secciones Health and Safety Act (1974) y Con-
tainment of Substances Hazardous to Health (COSHH)
Regulations. El formaldehído es el fijador más usado en
el laboratorio moderno de histología y se discute más ade-
lante. Hasta la fecha, el área de corte de la muestra debe
contar con un equipo de extracción que incluya un banco
de disección adaptado a un sistema de extracción que haga
circular los humos lejos del usuario. El banco debe incluir
un lavabo integral, con agua corriente caliente y fría, para
lavar las muestras y limpiar el área después de la desinfec-
ción con el agente químico apropiado. El área de disección
del banco debe inclinarse hacia el lavabo para facilitar el
drenaje de la formalina lejos de las muestras fijadas e in-
cluir un tablero de disección de polipropileno, o resistente
al corte, para el examen y corte de las biopsias fijadas y de
órganos enteros.
Un equipo estándar de corte debe incluir una regla de
acero inoxidable, un bisturí y un mango con hojas de cor-
te intercambiables y láminas PM40, cuchillos de mano de
5
acero, un cuchillo cerebral, tijera, tijeras intestinales, son-
das, una fuente de luz amplificadora, pinzas atraumáticas
intestinales y pinza de disección para la manipulación de
biopsias y cortes de tejido. El equipo de protección per-
sonal debe incluir batas u overoles, mandiles, guantes qui-
rúrgicos y resistentes al corte, gafas, viseras, cubrebocas y
respiradores (usados en la etapa de desechar la muestra).
La sala de corte puede, donde hay espacio disponible,
alojar las máquinas que procesan tejidos. Los procesadores
pueden ser por completo cerrados, aprobados por Health
and Safety, o “abiertos”, y deben incluirse en un gabinete
ventilado para contener los vapores del solvente.
Fijación y descalcificación
Cuando se retiran los tejidos del cuerpo experimentan di-
versos cambios degenerativos, como la autólisis y la putre-
facción. La primera es la descomposición de las células y
los componentes del tejido por acción de enzimas propias
del cuerpo; la segunda es el cambio degenerativo del tejido
como consecuencia de la acción bacteriana.
Objetivos de la fijación
La fijación debe detener la autólisis y la putrefacción y pre-
servar las células y los componentes tisulares en un estado
tan “natural” como sea posible. El fijador no debe propiciar
la contracción, inflamación o endurecimiento del tejido y
debe estabilizarlo pese al rigor del proceso. Por último, el
fijador debe complementar y mejorar los subsecuentes pro-
cedimientos histológicos de tinción, inmunohistoquímicos
y de biología molecular. En términos amplios, éstas son las
exigencias de un fijador “ideal”. Sin embargo, la fijación
depende en realidad de la conjunción de estos requisitos.
Fijadores
Los fijadores simples son soluciones de un solo químico,
por ejemplo metanol, etanol, ácido acético glacial y for-
maldehído; éstos, que carecen de aditivos, pueden indu-
cir algunos de los artefactos ya mencionados si se usan
solos. Los fijadores compuestos son mezclas de fijadores
simples que se han formulado para compensar y reducir
al mínimo los artefactos de la fijación, como el líquido
de Carnoy (etanol-cloroformo-ácido acético), que se reco-
mienda para la fijación de ácidos nucleicos.
Ambos tipos de fijadores reaccionan con las proteínas
de dos maneras. Los coagulantes, como lo sugiere su nom-
bre, coagulan la proteína del tejido, por ejemplo el etanol.
Los fijadores no coagulantes, como el formaldehído, for-
6 CAP. 1 MANIPULACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO DE RUTINA
man enlaces cruzados (reticulaciones) con la proteína del
tejido.
Duración de la fijación
La fijación adecuada es esencial para todas las técnicas
histológicas posteriores. Una demora en la colocación de
un tejido en el fijador o la infiltración inapropiada del fija-
dor antes del proceso pueden afectar la interpretación mor-
fológica y el análisis histoquímico o inmunohistoquímico.
La extensión de la fijación depende de la densidad del te-
jido y la velocidad de penetración del fijador. Tejidos más
blandos y menos densos se penetran en menos tiempo que
los tejidos fibrosos y óseos. El grado de penetración de los
fijadores varía entre uno y otro; por ejemplo, el glutaralde-
hído y el líquido de Carnoy son más rápidos en su acción
que el formaldehído. Para facilitar la fijación minuciosa, en
los laboratorios de histología es común describir primero y
seccionar después muestras densas grandes. De modo al-
ternativo, el fijador se puede inyectar en un órgano entero y
se calienta en un horno de microondas o una incubadora.
Formaldehído como fijador de rutina
El fijador utilizado de forma más extensa en los depar-
tamentos de histopatología es la formalina al 10% (formal-
dehído al 4%) y sus derivados. El formaldehído es soluble
en agua a un máximo de 40% por peso (formalina al 100%)
y está disponible en el comercio como solución al 40%, con
la adición de 10 a 14% de metanol como estabilizador. En
condiciones normales se diluyen 10 partes de formalina al
100% con 90 partes de agua, amortiguador salino fisiológi-
co o de fosfato para obtener la solución de trabajo al 10%.
La formalina no amortiguada puede adquirir acidez perma-
nente debido a la formación de ácido fórmico. Éste reac-
ciona con la sangre en tejidos muy vascularizados, como el
bazo, para producir un pigmento negro llamado hematina
formalina ácida. Esto ocurre casi siempre después de una
fijación prolongada; las soluciones amortiguadas de forma-
lina resuelven este artefacto de la fijación.
La formalina tiene un olor acre y es un intenso irritante
de los ojos, la piel y las membranas mucosas; en algunos
trabajadores puede causar dermatitis por contacto. El per-
sonal que manipula esta sustancia debe someterse a una
valoración respiratoria anual de sensibilización. Los lími-
tes máximos de exposición recomendados son una parte
por millón y los grados de exposición deben supervisarse
con regularidad. Las soluciones de formalina deben ma-
nipularse de forma cuidadosa en cuartos bien ventilados
que dispongan de extractores para vapores; asimismo, debe
usarse ropa protectora, como guantes, capas de laboratorio,
gafas y respiradores.
La formalina reacciona para formar enlaces cruzados (re-
ticulaciones) entre las proteínas. Las proteínas solubles se fi-
jan a las estructurales y ello suministra fuerza al tejido y hace
posible el proceso siguiente. La formalina no fija los carbo-
hidratos sino el glucógeno cuando se adhiere a una proteína
fijada. Es un buen fijador para los lípidos complejos.
El calor y la agitación aceleran el proceso de fijación. El
tiempo recomendado para la fijación de tejidos en forma-
lina es de 24 a 48 horas; el tiempo óptimo es de siete a 10
días. Las máquinas modernas cerradas que procesan tejido
pueden calentar los reactivos (40 a 45°C) durante el procedi-
miento y, por lo tanto, el proceso de fijación puede acelerar-
se. Los tejidos recibidos en el laboratorio se deben sumergir
por completo en el fijador cinco a 10 veces su volumen.
No existe un fijador ideal, pero la formalina al 10%
tiene la ventaja de preservar una amplia variedad de te-
jidos. La formalina es tolerable y permite llevar a cabo
con posterioridad una histoquímica adecuada. El tejido
se puede almacenar por largos periodos sin sufrir efectos
dañinos en el núcleo, el citoplasma o la morfología total
de la muestra. No es el fijador de elección para la inmu-
nohistoquímica o biología molecular, pero muchos de los
problemas derivados de su uso pueden superarse con
los pretratamientos apropiados del tejido.
Otros fijadores de uso general
• El glutaraldehído es a menudo el fijador de elección
para el tejido que requiere la microscopia electrónica, ya
que proporciona una buena preservación de la ultraes-
tructura celular. Es un sensibilizador respiratorio y tiene
un vínculo evidente con la denominada asma industrial.
Deben observarse las medidas de seguridad adecuadas
al usar glutaraldehído. Su uso como desinfectante en las
cañerías se ha proscrito en muchos hospitales.
• El tetraóxido de osmio se emplea como fijador secun-
dario en microscopia electrónica, por lo regular des-
pués de la fijación primaria en glutaraldehído. Fija los
lípidos y también preserva la estructura fina de la célula.
El tetraóxido de osmio es tóxico y exige también la ins-
titución de medidas de seguridad adecuadas.
• El dicromato de potasio se puede utilizar para identi-
ficar tumores medulares suprarrenales, macroscópicos
y microscópicos. Reacciona con las catecolaminas me-
dulares suprarrenales y produce un precipitado negro
o marrón que es insoluble en agua. No conviene como
fijador general cuando penetra el tejido lentamente y
causa contracción.
• El alcohol penetra el tejido con rapidez y se puede usar
junto con otros fijadores para aumentar la velocidad de
 PREPARACIÓN E INCLUSIÓN DEL TEJIDO
la fijación. El etanol absoluto preserva al glucógeno,
pero distorsiona el contorno nuclear y altera la contrac-
ción del citoplasma. El fijador de Carnoy es un buen
fijador para los ácidos nucleicos, si bien propicia la con-
tracción del tejido y la lisis de los eritrocitos; consiste en
etanol absoluto, cloroformo y ácido acético glacial.
• Pueden emplearse diversos aditivos en los fijadores. Por
ejemplo, las soluciones de ácido tánico, fenol o metales
pesados se pueden adicionar a la formalina para incre-
mentar el grado de penetración y de esa manera mejorar
la preservación o favorecer los procedimientos subse-
cuentes de teñido.
• La fijación por vapor mediante fijadores volátiles per-
mite la retención de sustancias solubles in situ y las
convierte en productos insolubles antes de que entren
en contacto con los solventes. Este método es de uso
frecuente junto con la liofilización. Los fijadores con-
venientes para esta técnica incluyen al formaldehído, el
tetraóxido de osmio y el alcohol.
• Los hornos de microondas son recursos en la fijación
para conservar el tejido mediante la acción del propio
calor o acelerar el proceso de fijación, como se descri-
bió con anterioridad.
Descalcificación
El hueso o los tejidos que contienen material calcificado
requieren la descalcificación antes del proceso para per-
mitir la microtomía estándar (es posible realizar el corte
en huesos aún calcificados cuando es necesario cuantificar
este elemento). Se pueden emplear varios líquidos descal-
cificantes, incluidos ácidos como el nítrico, agentes quelan-
tes como el ácido diaminotetraacético de etileno (EDTA),
una combinación de ambos, o soluciones disponibles en el
comercio. El calor aplicado a las soluciones descalcifican-
tes, mediante un horno de microondas o la incubadora, se
puede aplicar para acelerar el proceso de la descalcifica-
ción. El tiempo prolongado en un líquido descalcificante,
en especial en las soluciones ácidas, puede dañar la mor-
fología del tejido y afectar de manera adversa la calidad de
las técnicas subsecuentes. El límite de la descalcificación
puede determinarse con la prueba química de la solución,
los rayos X o, con más frecuencia, la evaluación manual.
Preparación e inclusión del tejido
El tejido fijado y estabilizado se somete a continuación a la
microtomía, que implica la preparación de cortes gruesos
de 1 a 6 µm del tejido para el examen microscópico. Para
7
facilitar este proceso, el tejido debe apoyarse de modo in-
terno y externo. Aunque los protocolos congelantes están
disponibles para las muestras fijadas y sin fijar de tejido, es-
tos métodos se emplean casi siempre para la demostración
de componentes de fijación lábil o las técnicas de diagnós-
tico rápidas. Para el diagnóstico histopatológico general,
los tejidos se someten a diversos reactivos, a su infiltración
y por último al recubrimiento con un medio de apoyo rígi-
do. Casi todos los fijadores son variaciones de la formalina
acuosa al 10% y, en consecuencia, son el objetivo de la pre-
paración del tejido para sustituirlos, dentro de la muestra,
por la cera de parafina inmiscible en agua. Para lograr esto,
el espécimen se somete a las etapas siguientes:
1. Deshidratación: el alcohol sustituye al fijador acuoso
dentro del tejido.
2. Clarificación: un antimedio, como el xileno, reemplaza
al alcohol.
3. Infiltración: la cera de parafina sustituye a la sustancia
clarificante y se infiltra en el tejido.
4. Inclusión: la cera de parafina encapsula al tejido infil-
trado y le proporciona un soporte rígido para la micro-
tomía.
Para asegurar una buena preparación del tejido es esen-
cial que los cortes no sean mayores de 2 a 3 mm de gro-
sor para las programaciones rápidas o urgentes y de 3 a
5 mm para las programaciones comunes durante la noche
o el fin de semana. Es posible una preparación deficiente si
el tejido se acumula en el casete del procedimiento, lo que
impide a los reactivos circular con propiedad. Las biopsias
minúsculas se pueden colocar en bolsas o casetes de malla
para biopsia, disponibles en el mercado, que pueden dejar-
se dentro del casete (fig. 1-2a, b).
Factores que afectan el proceso tisular
Temperatura
Los reactivos para la preparación a bajas temperaturas son
más viscosos y por tanto su difusión tisular es más lenta.
Una temperatura de proceso elevada aumenta la energía
cinética de las moléculas del reactivo, disminuye la vis-
cosidad del reactivo e incrementa la difusión del reactivo
en el tejido. La calefacción ligera de los reactivos para la
deshidratación y la clarificación, en límites de 37 a 45°C,
acorta en proporción sustancial los tiempos de preparación,
pero puede aumentar la contracción del tejido debido al
efecto del calor sobre la colágena.
8 CAP. 1 MANIPULACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO DE RUTINA
(a)
Figura 1-2 a) Casete y bolsa de biopsia para la preparación tisular. b) Contenedor seguro de biopsia celular.
Las temperaturas elevadas en la etapa de la infiltra-
ción pueden provocar la contracción y el endurecimiento
indebidos del tejido. Esto puede prevenirse con el uso de
temperaturas de 2 a 3°C sobre el punto de fusión de los me-
dios de la infiltración para reducir al mínimo estos efectos.
Sin embargo, la sangre y el músculo pueden aún tornar-
se frágiles durante la infiltración y, en consecuencia, debe
también considerarse el efecto combinado del tratamiento
de la fijación, el deshidratante y el tipo de tejido.
Vacío y presión
Las máquinas modernas de preparación tisular incorporan
un ciclo intercambiable de vacío y presión. En la práctica,
la aplicación de presión durante la deshidratación y la cla-
rificación ejerce poco efecto sobre la difusión de los reacti-
vos, aunque puede tener un efecto creciente en la etapa de
la infiltración. No obstante, la aplicación de vacío mejora la
deshidratación, la clarificación y la infiltración.
Agitación
El área superficial máxima del tejido debe estar disponible
para el intercambio y la circulación de líquido y reactivo
durante el procedimiento. Éste no es el caso cuando los
casetes tisulares permanecen en el fondo del recipiente, se
hallan estáticos en el reactivo o se envasan de forma hermé-
tica en la cesta de procesamiento. El área superficial máxi-
ma para el intercambio de líquido se daña y es imposible la
circulación del reactivo alrededor del tejido; el efecto es el
estancamiento, es decir, el reactivo que circunda al tejido
permanece a una concentración más baja y se requiere un
tiempo mucho mayor para la preparación satisfactoria.
Para conseguir resultados constantes, los casetes tisula-
res se deben envasar, suspender y agitar en el reactivo para
(b)
prevenir la inmovilización y posibilitar la circulación del
medio. La agitación se puede facilitar con los agitadores y
rotores magnéticos para el procesamiento manual, mientras
que las máquinas modernas aplican cualquier movimiento
rotatorio, de arriba abajo, de lado a lado o de marejada.
Deshidratación, clarificación,
infiltración e inclusión
Deshidratación
La mayor parte de los fijadores tisulares se elabora en so-
lución acuosa y la función del deshidratante es eliminar las
moléculas de agua libres y unidas de la muestra. El des-
hidratante más empleado para el procesamiento de rutina
en parafina es el etanol al 99.85% que, en virtud de su alto
costo, los laboratorios adquieren en la forma menos costo-
sa de alcohol desnaturalizado industrial (IMS, por sus si-
glas en inglés) al 99%, que contiene metanol al 2%. Ciertos
lípidos y proteínas solubles en agua se eliminan del tejido
durante esta etapa.
Los tejidos se procesan por medio de una concentra-
ción creciente de etanol hasta 99% de IMS (etanol abso-
luto). El método de fijación empleado y el tipo de tejido
determinan la resistencia del primer baño con IMS. Las
programaciones comunes del proceso histológico emplean
IMS al 70% como el primer paso en la deshidratación
del tejido. Los tejidos delicados pueden necesitar IMS al
50% para un proceso lento, mientras que los tejidos fijados
en un reactivo alcohólico, como el fijador de Carnoy, se
pueden sumergir directamente en varios cambios de IMS
al 99%.
El tiempo de deshidratación depende del tamaño y el
tipo de muestra tisular. En general, los bloques de tejido de
1 mm de espesor requieren 30 minutos en cada gradua-
 PREPARACIÓN E INCLUSIÓN DEL TEJIDO
ción de alcohol y los bloques de tejido de 5 mm hasta 90
minutos.
Clarificación
El agente clarificador es un reactivo que puede mezclarse
con la cera de parafina y actúa como un enlace entre el des-
hidratante (no miscible) y la cera de parafina. Los agentes
clarificadores más empleados para las técnicas habituales
son los hidrocarburos, como el xileno, el tolueno, el clo-
roformo y los solventes del petróleo. Estos reactivos, que
regula el COSHH, son sustancias inflamables, eliminan la
grasa de la piel y tienen grados variables de toxicidad. El
tolueno es un posible agente carcinógeno, el cloroformo
tiene un efecto narcótico y el xileno, aunque no está de-
mostrado que sea un carcinógeno, puede causar dolores de
cabeza como efecto secundario de la inhalación del vapor,
cuando el laboratorio carece de las instalaciones adecuadas
de extracción (sobre todo en áreas desprotegidas y de tin-
ción manual).
Por tales razones, el xileno es quizá el agente clarifica-
dor más utilizado. Pueden usarlo todos los procesadores
tisulares importantes y es relativamente barato. El xileno
se debe adquirir como reactivo libre de benceno (carcinó-
geno) y azufre. La exposición prolongada al xileno puede
causar endurecimiento tisular excesivo y deben formular-
se las programaciones del procesamiento para reducir al
mínimo este efecto. Los tejidos de 1 a 2 mm de espesor
requieren dos o tres cambios de xileno en 30 a 60 minutos
y los bloques de 3 a 5 mm de espesor exigen tres cambios
en un lapso de dos a cuatro horas para el proceso normal.
Las funciones de calor y vacío en las máquinas modernas
reducen de forma sustancial estos tiempos.
Infiltración
La cera de parafina es el medio de elección para la infil-
tración e inclusión en la histopatología común. Es una
mezcla de hidrocarburos policristalinos de cadena lineal
producida a partir de la destilación y separación del aceite
mineral crudo. La cera de parafina se caracteriza por su
punto de fusión, que refleja la mezcla de pesos moleculares
de sus hidrocarburos constitutivos. Los puntos de fusión,
aunque no son exactos del todo, se hallan en los límites
de 39 a 68°C; como regla general, cuanto más alto sea el
punto de fusión, más dura es la cera. Los tejidos más blan-
dos se benefician con la infiltración de ceras con puntos de
fusión más bajos y los tejidos más duros, con la infiltración
de aquéllos con un punto de fusión más alto. Empero, el
procesamiento histopatológico de rutina es en parte una di-
ficultad debido a la variación de tamaño y la dureza de las
muestras tisulares y el agente clarificador elegido. Para este
9
fin se emplea la cera de parafina con un punto de fusión
de 56 a 58°C. Los tiempos de la infiltración se ilustran en
el cuadro 1-1. Estos tiempos se reducen de forma consi-
derable si se utiliza vacío, el que resulta esencial para las
muestras del pulmón, en las cuales el vacío fuerza a las mo-
léculas de aire atrapadas a abandonar el tejido.
En algunas ceras de parafina se incluyen aditivos para
mejorar su consistencia cristalina, atenuar su dureza y fra-
gilidad y, por lo tanto, mejorar las características de corte
(microtomía). Entre estas sustancias figuran, entre otras,
las resinas termoplásticas, los polímeros plásticos y el sul-
fóxido de dimetilo, que ayuda a la infiltración y permite un
corte fino.
Inclusión
La cera de parafina para la inclusión tisular debe estar lim-
pia, filtrada y mantenida a 2 a 4°C alrededor de su punto
de fusión. Al término de la técnica, la cesta del tejido se
transfiere a un depósito calentado o un baño fijo libre de
cera. Los tejidos se remueven de sus casetes, uno a la vez,
con pinza calentada y la cara colocada abajo en un mol-
de con cera de parafina fundida. El molde se aplica en una
superficie refrigerada o un recipiente congelado para faci-
litar la adhesión del tejido a su base. Está disponible una
gran variedad de moldes, entre ellos los moldes de acero
inoxidable de capacidades graduadas que reciben el casete
del procesamiento/inclusión que actúa como la platafor-
ma de soporte del tejido; las piezas L de Leuckhart; los re-
cipientes congelados; los botes de metal, y los recipientes
de plásticos desmoldables. Los moldes se dejan en la placa
fría hasta que la cera se solidifica; si no se cuenta con una
forma de refrigeración, se puede sumergir en agua fría
una vez formada una corteza bastante gruesa en la super-
ficie de la cera. En la actualidad están disponibles los cen-
tros de infusión comerciales, que combinan un almacén de
molde calentado, un depósito/dispensador de cera fundida
y una placa fría (fig. 1-3). Una vez que la cera se solidifica,
los bloques del tejido se pueden desprender con suavidad
de sus moldes y prepararse para la microtomía.
Para la orientación apropiada de las muestras de teji-
do, una regla general señala que la superficie inferior del
tejido en el casete debe colocarse cara abajo en el molde.
La orientación es en extremo importante para el diagnós-
tico efectivo. Una biopsia de piel se debe impregnar en
sentido perpendicular a su superficie para suministrar un
plano correcto de corte. El tejido cilíndrico/tubular, como
las trompas de Falopio o los vasos deferentes, se debe im-
pregnar en su extremo, de modo que puedan practicarse
cortes transversales a sus paredes y luz. Es posible utilizar
tinturas especiales para marcar los planos de la resección y
observar la orientación correcta del tejido.
10 CAP. 1 MANIPULACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO DE RUTINA

(a)

Figura 1-3 Centro de impregnación tisular Shandon Histocentre 3 ⫻.

Procesadores tisulares automáticos

Los procesadores tisulares tipo carrusel “abiertos” (fig. 1 -4a)
se han sustituido sobre todo con los “cerrados” (fig. 1-4b), esto
es, máquinas de procesamiento que satisfacen los linea-
mientos de Health and Safety y tienen capacidades ma- (b)
yores para casetes. Los procesadores abiertos liberan los
vapores del reactivo a la atmósfera cuando la cesta del te-
jido se mueve entre las fases y, por lo tanto, deben estar
instalados en un área de extracción bien ventilada. La agi-
tación se efectúa por un movimiento rotatorio o de riego y
el vacío está disponible en la impregnación final de la infil-
tración de cera. Los tejidos se procesan mediante solventes a
temperatura ambiente.
Los procesadores cerrados son las unidades indepedien-
tes (modulares) que retienen por completo los vapores del
reactivo durante el procedimiento del tejido por medio de
trampas de agua o vapor y filtros de adsorción con carbón.
Los reactivos se bombean hacia dentro y fuera de un com-
partimiento/retorta del procesamiento. La agitación se pro-
porciona bajo la forma de flujo de marejada de los reactivos
dentro y fuera del recipiente o mediante un movimiento
rotatorio de lado a lado. El ingreso de los reactivos se pue-
de mejorar si se alternan los ciclos programables de vacío
y presión, de los cuales el primero es el más eficaz. Las eta-
pas de deshidratación y clarificación se pueden reducir en
grado notorio por la capacidad para calentar los reactivos
(25 a 45°C). La tecnología de microprocesadores permite
que múltiples programaciones del procesamiento se alma-
cenen y recuperen y, en algunas máquinas, hacen posible
el uso simultáneo de unidades adicionadas para diversas Figura 1-4 a) Procesador de tejido Leica TP1020. b) Procesa-
programaciones bajo el control de un módulo regulador. dor de tejido cerrado Shandon Excelsior.

Programaciones “de rutina durante la noche”

y “rápidas” del procesamiento tisular
El cuadro 1-1 muestra una comparación de las programa-
ciones “de rutina durante la noche” y “rápidas” para los pro-
cesamientos tisulares automáticos abierto y encerrado. El
reabastecimiento de los reactivos y los medios de infiltra-
ción de la técnica son dependientes del volumen de reac-
tivo usado por etapa y el número de casetes procesados.
 MICROTOMÍA 11

Cuadro 1-1 Programaciones “de rutina durante la noche” y “rápida” para el procesamiento de tejidos

Procesador de tejido abierto Procesador de tejido cerrado

Rutina durante Rápida Rutina durante Rápida

Reactivo la noche (minutos) (minutos) Vacío la noche (minutos) (minutos) Vacío
Formol salino al10% 60 30 No 30* 15 Sí
Alcohol al 70% 60 0 No 30* 0 Sí
Alcohol al 95% 60 0 No 30* 15 Sí
Alcohol al 100% 60 15 No 30* 15 Sí
Alcohol al 100% 60 15 No 30* 15 Sí
Alcohol al 100% 60 30 No 60* 15 Sí
Alcohol al 100% 60 30 No 60* 15 Sí
Xileno 30 15 No 30* 10 Sí
Xileno 60 15 No 30* 15 Sí
Xileno 60 30 No 30* 15 Sí
Cera de parafina 60 30 No 30* 15 Sí
Cera de parafina 60 30 Sí 60* 30 Sí
Cera de parafina 90 30 Sí 60* 30 Sí
* La temperatura del procesamiento es de 45°C.

Deben considerarse medidas de seguridad apropiadas y es de consumir demasiado tiempo, algo inadecuado en una
esencial el uso del equipo de protección personal al decan- era en la que las cargas de trabajo exigen la fluidez de los
tar estas soluciones. servicios de histopatología.

Procesamiento por microondas Micrótomos

La utilización de la tecnología de microondas para el pro- El micrótomo rotatorio (fig. 1-5) es una máquina de uso
cesamiento rápido de los tejidos se adoptó hace ya tiempo. general para la producción de cortes de tejido semifinos
Es en particular útil en procedimientos simples, cuando se
requiere un resultado diagnóstico expeditivo de la biopsia,
antes que el paciente egrese de la institución. Las biopsias
urgentes y las del mismo día también se benefician de esta
tecnología y, lo que es de gran importancia, sin perder la
calidad de la preparación final.

Microtomía
La microtomía es la ejecución de cortes finos, de uno a
cinco micrones (µm) de grosor, a partir de bloques de teji-
do embebidos en cera de parafina. Este proceso emplea
un micrótomo y un cuchillo o una hoja de micrótomo de-
sechable, además del mango de la hoja. Los micrótomos
son de la variedad “rotatoria” o “de base deslizable” y es-
tán disponibles en el comercio por innumerables provee-
dores de equipos de laboratorio. La hoja desechable del
micrótomo ha reemplazado al cuchillo del micrótomo en
las prácticas de los departamentos de histopatología. Estos
instrumentos deben estar afilados, sea de modo manual (un
procedimiento calificado) o por máquina; esta última pue- Figura 1-5 Microtómo rotatorio Shandon Finesse E.
12 CAP. 1 MANIPULACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO DE RUTINA
para microscopia ligera. La rotación manual de la rueda
montada en un plano lateral hace que el mecanismo de
avance mueva al sostenedor del bloque hacia el cuchillo fi-
jado rígidamente a un espesor preestablecido de corte (gro-
sor). El bloque se mueve de arriba abajo contra el cuchillo
en un plano vertical con la ejecución de cortes planos, casi
siempre de un espesor de 3 a 5 µm para propósitos histoló-
gicos de rutina. La velocidad del bloque contra el cuchillo
la controla el ritmo al que gira la manivela. Los micróto-
mos rotatorios y motorizados de uso industrial también es-
tán disponibles para usarse en cortes semifinos (0.5 a 1 µm)
impregnados en resina para la microscopia de luz; en estos
casos la velocidad constante del bloque contra el cuchillo
puede controlarse de forma automática. Por lo general, los
límites de grosor del corte de estos micrótomos fluctúan
entre 0.5 y 60 µm.
El micrótomo de deslizamiento, aunque es más conve-
niente para el corte de tejidos duros y algunas resinas más
blandas, es también útil para el corte y formación de tiras
de tejidos y biopsias blandas. La pesada estructura de es-
tas máquinas impide la vibración y el mango del cuchillo
puede angularse lejos de la dirección del corte, lo cual re-
sulta de utilidad en caso de tejidos duros. El sostenedor
del bloque se monta sobre dos corredores paralelos y el
sostenedor del bloque discurre por el avance manual de la
muestra sobre la misma manivela o por una palanca ensam-
blada sobre el borde del transportador del bloque, que se
mueve contra un soporte estático. El bloque se pasa hacia
delante y atrás contra el cuchillo, mediante movimientos
de empuje y tracción. Los cortes son de 3 a 5 µm para la
histología común.
Cuchillos del micrótomo
En general, las hojas desechables para la práctica histopa-
tológica de rutina reemplazaron a los cuchillos convencio-
nales de acero del micrótomo.
Los cuchillos de acero se fabrican a partir de un car-
bón de alto grado o acero de gran calidad y deben estar
libres de impurezas y ser inoxidables. Los cuchillos se tem-
plan (endurecimiento) de un extremo al otro y el grado de
dureza se mide mediante la escala de Vickers (casi siempre
400 a 900). Los grados de dureza pueden variar entre los
fabricantes y entre los propios cuchillos del mismo fabri-
cante. Se recomienda una dureza de 700; la de 400 es muy
blanda y la de 900 demasiado quebradiza para el uso de
rutina. Los cuchillos de acero pueden dividirse en perfiles,
según sea el uso para el que estén destinados (fig. 1-6):
• El perfil A corresponde a dispositivos bicóncavos y se
emplean para el corte de tejidos impregnados en celoi-
dina. Rara vez se usan en histopatología común.
Figura 1-6 Perfiles de los cuchillos de micrótomo.
• El perfil B incluye instrumentos planos y cóncavos y
pueden utilizarse para seccionar tejidos blandos embe-
bidos en cera y tejidos y muestras botánicos impreg-
nados en celoidina. Este perfil y el anterior poseen los
bordes más afilados.
• El perfil C se refiere al dispositivo acuñado y es el cu-
chillo de acero de empleo más común en histopatolo-
gía de rutina. Los cuchillos son más rígidos respecto de
los perfiles A y B y se utilizan para el corte de cera
de parafina de todos los tejidos y en los crióstatos para el
corte de material congelado (véase más adelante). Los
instrumentos de esta categoría no son tan afilados como
los de los perfiles A y B.
• El perfil D corresponde a herramientas más anchas y
planas y se usa para seccionar materiales duros, como
resinas, y bloques de tejidos en cera de parafina de ex-
trema dureza. Este cuchillo produce el borde menos
agudo cuando se aplica.
Se sugiere la consulta de varios métodos manuales y auto-
matizados disponibles para el afinado y afilado de los cu-
chillos mencionados.
Las hojas desechables se modificaron y engrosaron a
partir de hojas de afeitar; se fabrican con acero inoxidable
de alta calidad y permiten hacer cortes reproducibles, sin
compresión y de buena calidad. La hoja fina se sujeta con
rigidez en su propio sostenedor especial para minimizar la
vibración durante la microtomía. Las hojas pueden recu-
brirse con platino o cromo para otorgarles una vida más
larga. Hoy en día, estas hojas son la primera opción para la
histopatología común.
Otros cuchillos incluyen carburo de tungsteno para
trabajar la resina y cortar hueso sin descalcificarlo; los
cuchillos de vidrio, diamante y zafiro se usan con materia-
les tratados con araldita y resina epóxica en microscopia
electrónica o para obtener bloques pequeños y estrechos de
tejidos impregnados en acrílico o resina de poliéster para
la microscopia de luz.
 TÉCNICAS ESPECIALES 13

Corte de la cera de parafina Corte de un macrobloque

Para la práctica de un corte se requiere un cuchillo recién El informe del laboratorio y el suministro de un mínimo
afilado del micrótomo o una hoja desechable nueva con de datos establecen la base del diagnóstico histológico. El
un borde agudo sin defectos. Todas las operaciones refe- muestreo, procesamiento y cortes transversales enteros de
rentes a la colocación o retiro del bloque dentro y fuera un tumor son ahora técnicas histológicas adoptadas y pro-
del sostenedor del bloque se deben efectuar con firmeza porcionan información más precisa sobre la naturaleza del
y seguridad. Las hojas son en extremo peligrosas y deben tumor y las distancias de los márgenes de resección. El mé-
tratarse con mesura. Debe sujetarse el mango de los mi- todo tiene una aplicación extensa, pero es en particular útil
crótomos rotatorios; el transportador del bloque se coloca en las afecciones de la mama, próstata e intestino.
en los micrótomos de deslizamiento y se sujeta de donde El procesamiento de macrobloques requiere megaca-
se disponga en el extremo del micrótomo, lo más alejado setes, portaobjetos grandes e instalaciones especiales.
de la lámina. Los tiempos de la técnica se incrementan y las muestras
Algunos laboratorios emplean un micrótomo de “corte se resecan con micrótomos rotatorios o de deslizamiento
áspero” para recortar el bloque del tejido hasta obtener un modificados. La tinción se facilita sobre todo de manera
área representativa seccionada de forma transversal. Las manual.
muestras se remueven en intervalos de 10 a 15 µm, hasta
que la faz del tejido está disponible; luego se practican va-
rios cortes a 4 o 5 µm para asegurar un bloque de superficie Técnicas especiales
lisa (que evita el artefacto del corte burdo). El sostenedor
del bloque del cortador burdo se coloca en el mismo plano Corte por congelamiento de tejidos frescos
que el resto de los micrótomos del laboratorio. El corte bur- La mayor parte de los laboratorios histológicos de rutina
do puede realizarse con el mismo micrótomo o incluso con incluye en su inventario un servicio de diagnóstico que re-
la misma lámina. El corte de la sección se debe efectuar en curre al corte por congelamiento para pacientes con sospe-
un área separada de la hoja o el cuchillo utilizados para los cha de tumor. El diagnóstico puede notificarse al cirujano
propósitos del corte general. por teléfono 10 a 20 minutos después de tratar la muestra
Los bloques extraídos para el diagnóstico se preenfrían del tejido; por consiguiente, es de gran ayuda para la aten-
en un recipiente congelado o una placa más fría antes del ción clínica del paciente. Para este procedimiento se utiliza
corte. El enfriamiento propicia la compresión del bloque y el crióstato (fig. 1-7), un micrótomo rotatorio u oscilatorio
opone una faz más rígida del bloque al cuchillo para faci-
litar el corte. El grosor de la sección es casi siempre de 3 a
5 µm. Cuando el filo del cuchillo pasa a través de la super-
ficie del bloque, los cortes del tejido se desplazan hacia
arriba (micrótomo de deslizamiento) o abajo (micrótomo
rotatorio) de la cara del cuchillo. Cuando el bloque golpea
el filo del cuchillo, la fricción producida crea una “superfi-
cie que se derrite” en la cera y, en consecuencia, las seccio-
nes subsecuentes se adhieren una a otra y forman una cinta.
Ésta se sostiene, se retira del filo del cuchillo y se hace
flotar sobre un baño de agua a 48 a 50°C con la pinza cor-
tante. Las secciones se separan de sus puntos de adhesión y
se fijan a los portaobjetos de vidrio del microscopio por su-
mergimiento parcial del portaobjetos en el agua. El exceso
del agua se elimina del portaobjetos, que se deja secar so-
bre una placa caliente a 60°C, no en contacto directo, hasta
que todos los restos de agua se eliminen. Sólo entonces el
portaobjetos se pone en contacto con la placa caliente por
cinco a 10 minutos para facilitar la adherencia de la sección
de cera de parafina al cristal. Los cortes quedan listos para
la tinción con hematoxilina y eosina o un sinfín de méto-
dos de tinción e inmunocitoquímica que el histólogo tiene
a su disposición. El montaje, como se mencionó con ante-
rioridad, puede ser automatizado. Figura 1-7 Crióstato Leica CM3050S.
14 CAP. 1 MANIPULACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO DE RUTINA
alojado dentro de una cámara refrigerada. La temperatura
de la muestra y el sostenedor del espécimen, el cuchillo y la
cámara pueden fijarse de modo independiente o bien puede
seleccionarse una sola temperatura para todo el conjunto.
El tejido fresco para diagnóstico rápido se envía desde el
quirófano, congelado en el contenedor de la muestra con
dióxido de carbono, nitrógeno líquido o un aerosol conge-
lante, y se transfiere al crióstato para cortarlo. Si las condi-
ciones tisulares son óptimas, es posible obtener cortes tan
delgados como de 1 µm. Los tejidos frescos se deben dise-
car y congelar en un gabinete de seguridad microbiológica.
La mayoría de los crióstatos modernos incorpora un ciclo
de descontaminación de cuatro horas con formalina para
la desinfección de la cámara después de casos de cortes
infecciosos insospechados (algunas lesiones tuberculosas
pueden parecer a simple vista tumoraciones).
El micrótomo congelante (fig. 1-8) puede aplicarse para
cortes semifinos de tejidos frescos, cuando apremia demos-
Figura 1-8 Micrótomo congelante Leica 1325.
trar sustancias que de manera habitual se eliminan duran-
te el procesamiento de rutina (p. ej., lípidos). Este tipo de
micrótomo tiene un recipiente estático para la muestra y
el propio cuchillo discurre de forma manual a través de la
superficie del tejido tanto como el sostenedor de la mues-
tra avanza de acuerdo con un espesor preestablecido. El
tejido se congela in situ por medio de un cilindro adjunto
de dióxido de carbono o un refrigerante que circula. Los
cortes delgados consistentes son difíciles de obtener.
Cortes de hueso sin descalcificar
Este procedimiento exige la producción de cortes de 4 a
5 µm de hueso sin descalcificar embebidos en una resina
acrílica o de poliéster. Aunque un micrótomo de desliza-
miento puede usarse para este propósito, es más común
emplear un micrótomo motorizado industrial (fig. 1-9).
Los cuchillos del perfil D (herramienta con filo), de tungs-
teno, vidrio o diamante, se emplean con frecuencia para los
cortes de ese tejido.
Figura 1-9 Micrótomo rotatorio motorizado de uso industrial
Leica RM2255.
Microscopia electrónica
La microscopia electrónica requiere practicar cortes ul-
trafinos impregnados de resina y usar un ultramicrótomo.
Las resinas epóxica o de araldita se usan con regularidad
y el grosor de la sección se mide en nanómetros (nm). El
corte se facilita con el uso de cuchillos de vidrio o dia-
mante y el grosor de la sección se vigila al observar el color
de la interferencia que produce la sección en contacto con
el agua, es decir, oro (90 a 120 nm), plata (60 a 90 nm) y
gris (< 60 nm). Los cortes se recuperan y tiñen sobre reji-
llas especiales de cobre o rodio. Las tinturas emplean sales
 RECONOCIMIENTOS
de metales pesados, como el citrato de plomo y el aceta-
to de uranilo, que impregnan a ciertas estructuras tisulares.
Estos metales pesados desvían un haz de electrones que
emite el microscopio electrónico. Esto crea áreas de to-
nos negros y grises dentro del corte tisular, donde los ele-
mentos ultraestructurales se impregnaron de metales pesa-
dos. El microscopio electrónico incorpora un sistema de
cámara que puede fotografiar áreas de interés dentro de la
sección; el resultado final es la micrografía electrónica.
Ésta es una revisión en extremo general de la microscopia
electrónica.
15
Lectura adicional
Bancroft JD, Gamble M. Theory and Practice of Histological
Techniques, 5th ed. Edinburgh: Churchill Livingstone 2002.
Reconocimientos
Fotografías por cortesía de Thermo Electron Anatomical
Pathology, Leica UK Ltd, y Dr AT Warfield, Histopatholo-
gy, University Hospital Birmingham, UK.
 2
Tinciones generales
Barrie Sims
¿Por qué la tinción?
Cuando se examinan al microscopio, los cortes finos de te-
jido muestran una diferenciación muy sutil entre las estruc-
turas compuestas. La tinción de los tejidos con colorantes
contrastantes permite que las estructuras se visualicen bajo
el microscopio de luz. Además, la demostración de varios
productos, inclusiones o microorganismos celulares exige
el uso de procedimientos de tinción especializados.
La mayor parte de la histopatología diagnóstica de rutina
se realiza sobre tejidos impregnados en cera de parafina.
Los cortes por congelamiento son una excepción. Estos
procedimientos son necesarios para el diagnóstico de ur-
gencia o para demostrar sustancias perdidas, destruidas o
inhibidas en el proceso de fijación e impregnación.
Después de la microtomía, el corte en parafina aún está
infiltrado con cera. La cera presente en las secciones os-
curece la estructura del tejido y es impermeable en grado
notable a los colorantes. Casi todos los métodos de tinción
se basan en agua o alcohol y, por lo tanto, la remoción de
la cera es imprescindible. Una vez que los cortes se secan
sobre el portaobjetos, las secciones se tratan con xileno
para eliminar la cera. Clarificar las muestras en alcoholes
graduados elimina el xileno y hace posible la hidratación
de los especímenes. Este proceso se conoce a menudo en la
metodología con diversos términos: cortes desencerados,
secciones al agua, hidratación de muestras.
Mecanismos básicos de tinción
En la histopatología diagnóstica, los métodos de tinción se
pueden agrupar en cuatro procesos principales (la tinción
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker,
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
vital, es decir, cuando el colorante se aplica a tejidos vivos,
se utiliza sólo de modo ocasional, si acaso).
Solubilidad electiva
Éste es el mecanismo por el cual los colorantes disueltos en
un solvente son más solubles en el componente del tejido
que en el solvente mismo. Este mecanismo se emplea sobre
todo en la demostración de grasa en cortes congelados. Por
lo general, los tintes usados son del tipo Sudán (III, IV).
Impregnación metálica
Es posible la aplicación de plata metálica a los elementos
del tejido para demostrar una amplia variedad de estructu-
ras y sustancias.
Las células que tienen la capacidad de reducir una so-
lución amoniacal de plata, sin la necesidad de un agente
de reducción externo, se conocen como “argentafines”. La
melanina y las células de Kultschitzky del aparato digesti-
vo son ejemplos típicos.
Las células o las estructuras que requieren un agente de
reducción externo se llaman “argirófilas”. Se recurre con
regularidad a la impregnación metálica en la demostración
de fibras reticulares, membranas basales, hongos, inclusio-
nes celulares y células nerviosas y sus axones.
Reacciones histoquímicas
Éstos son los métodos en los cuales existe una comprensión
clara de los mecanismos que intervienen. La reacción final
18 CAP. 2 TINCIONES GENERALES
puede usar un colorante o inducir por sí misma una reacción
coloreada. Por ejemplo, el reactivo de Schiff, utilizado en
la demostración de aldehídos, emplea la fucsina de tinción
básica en la reacción, que tiñe de magenta los sitios que
tienen aldehído; por su parte, en la reacción de Perl para
los depósitos de hierro férrico (fig. 2-1), la interacción entre
el ferrocianuro de potasio (un componente de la solución de
Perl) y el hierro férrico en los tejidos produce el pigmento
azul de Prusia en el sitio donde se halla el hierro férrico.
Figura 2-1 Reacción de Perl para el hierro férrico. Los depósitos
de hierro férrico están teñidos de azul.
Muchas enzimas se pueden demostrar por la incubación
de los cortes (congelados o en cera) en los sustratos que con-
tienen una sustancia con la cual reacciona la enzima, lo que
induce un producto de reacción primaria. A continuación, un
segundo reactivo interactúa con el producto de reacción primaria
para formar un depósito coloreado en el sitio de la actividad.
Las muestras de control que tienen o no la sustancia (positivas
o negativas) se usan para determinar la especificidad de la re-
acción. Las sustancias que inhiben la reacción también pue-
den emplearse para mejorar la especificidad de la reacción.
Tinción con colorantes
Casi todos los procedimientos de tinción en patología diag-
nóstica pertenecen a este grupo. En muchos casos, la com-
prensión del mecanismo de tinción no es completa y los
resultados dependen con frecuencia de la capacidad y el
conocimiento del clínico.
Clasificación
Los colorantes se pueden clasificar como naturales o sinté-
ticos. Los primeros incluyen a la hematoxilina; los segun-
dos comprenden a la gran mayoría de los colorantes usados
en las técnicas histológicas (p. ej., eosina, azul de metileno
y fucsina básica). Los colorantes se pueden también agru-
par como ácidos, básicos o neutros.
Colorantes ácidos y básicos
De forma sinóptica, los colorantes ácidos (aniónicos) su-
fren atracción de los elementos del tejido con propieda-
des básicas, por ejemplo el citoplasma de las células. Los
colorantes básicos (catiónicos) experimentan atracción de
las estructuras que poseen una naturaleza ácida, como el
DNA del núcleo celular. Mediante una combinación de co-
lorantes ácidos y básicos de un color contrastante pueden
diferenciarse el núcleo y el citoplasma. Ésta es la base de la
tinción con hematoxilina y eosina (H-E), un método de tin-
ción usado en la mayor parte de los laboratorios de histopa-
tología diagnóstica para demostrar la estructura general.
Colorantes neutros
Los colorantes neutros se elaboran al combinar soluciones
ácidas y básicas. El producto resultante de la combinación
tiñe las estructuras ácidas y básicas con una solución úni-
ca. Los colorantes de Romanowsky, aplicados por ejemplo
en la demostración de células de la médula ósea, son una
combinación de azul de metileno y eosina.
Metacromasia
Los colorantes que se combinan con ciertos elementos
tisulares y que producen un color que es diferente al del
colorante original se denominan “metacromáticos”. Los
métodos de tinción metacromática se pueden emplear para
la demostración de mucinas, gránulos de mastocitos, ami-
loides y cartílago del tejido conectivo. La metacromasia se
pierde casi siempre durante la deshidratación de los espe-
címenes antes del uso de los cubreobjetos. Por lo regular,
lo anterior puede prevenirse con la utilización de un medio
acuoso para el montaje. Existen algunas variaciones en los
métodos metacromáticos que conservan la metacromasia
durante la deshidratación.
Fluorescencia
Casi todos los métodos de tinción se observan con la luz
visible. Los colorantes que tienen la capacidad de absorber
la luz ultravioleta y luego transmitirla dentro del espectro
visible se conocen como “fluorescentes”. Éstos pueden
utilizarse para demostrar el amiloide de Mycobacterium
 MECANISMOS BÁSICOS DE TINCIÓN
tuberculosis (y antígenos tisulares cuando se aplican en las
técnicas inmunocitoquímicas). Para ver las preparaciones
se requieren microscopios fluorescentes y un cuarto oscuro
para conseguir una claridad óptima. La tinción fluorescente
es a menudo de breve duración y en tal caso se recurre a la
fotografía para proporcionar un registro permanente.
Colorantes directos
Los colorantes que tienen la propiedad de combinarse
con las estructuras tisulares a partir de soluciones acuosas
simples o alcohólicas se llaman colorantes “directos”. La
eosina y muchos otros colorantes anilínicos poseen esta
característica.
Colorantes indirectos
Los colorantes que no poseen ninguna afinidad directa por
las estructuras tisulares y requieren una sustancia interme-
diaria para permitir la tinción se llaman colorantes “indirec-
tos”. La sustancia intermediaria se conoce como “mordiente”
(similar a un catalizador). El colorante se combina con el
mordiente y a su turno con el elemento del tejido, lo que
produce un complejo colorante-mordiente-tejido. La hema-
toxilina, sin el uso del mordiente, es un colorante tisular
débil. La adición de metales a la solución de hematoxilina,
como el sulfato de aluminio y potasio o el cloruro férrico,
puede crear colorantes potentes para usos diversos.
Tinción con hematoxilina
Las soluciones de hematoxilina necesitan oxidarse (algu-
nas veces se dice “madurarse”) antes de emplearlas para
teñir tejidos. La oxidación se puede realizar por medios
químicos con la adición de agentes oxidantes, como yo-
dato de sodio o, desde luego, mediante la luz solar (lo que
puede tomar varios meses). El proceso de la oxidación con-
vierte a la hematoxilina en hemateína. Por lo general, las
preparaciones de hematoxilina se oxidan sólo en parte y
la oxidación adicional prosigue con el tiempo. El uso de la
oxidación incrementa la vida de la solución.
Según sea el mordiente utilizado, la hematoxilina puede
demostrar diversas estructuras.
Hematoxilinas de alumbre
Éstas se producen por la adición de sulfato de aluminio y
potasio o amonio a la solución de hematoxilina. Las hemato-
xilinas de alumbre se usan para teñir de azul a los núcleos
19
celulares. Hay varias formulaciones disponibles, por ejem-
plo las de Harris, Ehrlich, Mayer, Delafield, Cole y Gill.
Las hematoxilinas de alumbre deben ser “azuladas” (véase
más adelante) para que los núcleos se tiñan de azul.
Hematoxilinas de hierro
Se obtienen tras agregar cloruro férrico o sulfato férrico y
amonio a la solución de hematoxilina. La solución resultan-
te produce un colorante negro e intenso que se puede utili-
zar para demostrar núcleos celulares, elastina, estriaciones
musculares y mielina. El colorante es más resistente a la
extracción ácida que las hematoxilinas de alumbre y está
indicado cuando se emplean las contratinciones ácidas, por
ejemplo en el método de Gieson para tejidos conectivos.
La estructura demostrada depende del reactivo usado para
diferenciar (eliminación del exceso de colorante del fondo
de la muestra hasta que sólo se delinea la estructura reque-
rida). Los diferenciadores ácidos eliminan el colorante ne-
cesario para perfilar los núcleos de la célula. Al reaplicar la
solución mordiente a la sección se observa una eliminación
progresiva de hematoxilina de la muestra; esto permite que
puedan observarse la mielina, elastina y estriaciones muscu-
lares. Las hematoxilinas de alumbre se pueden convertir a
hematoxilinas de hierro mediante el tratamiento del corte
con una solución de hierro antes de la hematoxilina. Un
ejemplo es la secuencia azul celeste-hemalum.
Hematoxilina de plomo
Las soluciones de hematoxilina que contienen plomo reve-
lan células endocrinas.
Hematoxilina de ácido fosfotúngstico
Esta tinción perfila estriaciones musculares, fibrina, núcleos,
mielina, cilios, células neurogliales y amebas. El ácido fos-
fotúngstico se utiliza tanto como el mordiente y la hemateí-
na o la hematoxilina como colorante. El uso de la hemateína
elimina la necesidad de la oxidación.
Preparaciones comerciales
Ahora están disponibles muchas soluciones de hematoxili-
na en el comercio. Esto evita la necesidad de la preparación,
que consume tiempo en el laboratorio y la manipulación
de sustancias tóxicas. Las nuevas fórmulas eliminan el uso de
sustancias dañinas o tóxicas (p. ej., mercurio) de la prepara-
ción y se elaboran soluciones menos perjudiciales.
20 CAP. 2 TINCIONES GENERALES

Tinciones regresivas y progresivas

Regresivas

Una tinción regresiva se aplica casi siempre al corte por un

periodo que tiña de manera inicial todas las estructuras del
tejido. Al eliminar de modo selectivo el exceso de coloran-
te se revelan los elementos de interés. El retiro del exceso
del colorante se llama “diferenciación”. Esto puede con-
seguirse con el uso de solventes (alcohol), ácido diluido y
soluciones ácidas o alcohólicas o la solución mordiente.

Progresivas

Una tinción progresiva tiñe de manera creciente elementos
del tejido, de acuerdo con el tiempo en la solución de tin-
ción. Las tinciones progresivas no tiñen los tejidos de modo
excesivo y el periodo de impregnación se suspende des-
pués de un lapso determinado. La hemalum de Mayer es
una tinción nuclear progresiva de uso frecuente como con-
tratinción nuclear en otras técnicas, por ejemplo el método
del ácido peryódico de Schiff (PAS).
Figura 2-2 Corte de riñón teñido con hematoxilina y eosina
que muestra un glomérulo de situación central. Los núcleos es-
tán teñidos de azul (las intensidades que difieren dependen de la
cantidad de cromatina nuclear presente) y la estructura general de
rosa. Los eritrocitos son de color rosa salmón.
Cuadro 2-2 Protocolo para la tinción de H-E

Métodos comunes de tinción 1. Desencerar los cortes con xileno, tratar con alcoholes gra-
duados y lavar en agua
2. Teñir los núcleos con una hematoxilina de alumbre (p. ej.,
Los métodos de tinción habituales se pueden agrupar en
Harris, Gill, etc.)
nueve categorías (véase el cuadro 2-1). 3. Clarificación en agua para eliminar el exceso de colorante
4. Eliminar el exceso de colorante de los tejidos (diferenciar)
hasta que sólo se delineen los núcleos (se utiliza con fre-
Cuadro 2-1 Categorías de los métodos comunes de tinción cuencia una mezcla de ácido clorhídrico al 0.5 a 1.0% en
alcohol al 70%)
5. Lavar las muestras hasta que los núcleos sean azules. El
Estructura general
término “azulado” se utiliza para describir el proceso por el
Fibras de tejido conectivo
cual los núcleos celulares teñidos con una hematoxilina de
Carbohidratos y mucosustancias
alumbre se lavan en agua o un álcali débil hasta que los
Pigmentos
núcleos cambian del rojo al azul. La reacción es análoga a
Microorganismos
los cambios de color mostrados por el tornasol
Sustancias extracelulares (fibrina, amiloide)
6. Teñir el citoplasma celular con la eosina (hay un buen nú-
Lípidos
mero de formulaciones que se pueden utilizar para ajustar
Gránulos citoplásmicos
las condiciones locales y el pH del agua)
Células neurológicas
7. Después de una breve clarificación en agua (o directamente
en alcohol) las muestras se devuelven al xileno y se aplica
un cubreobjetos

Estructura general

El método con hematoxilina y eosina (designado a menudo
como H-E) es uno de los más utilizados para la tinción de
estructuras generales en histopatología diagnóstica (véase
fig. 2-2). El procedimiento sigue el orden mostrado en el
cuadro 2-2. Los procesos de lavado y deshidratación efec-
tuados luego de la tinción con eosina eliminan a ésta de
la muestra. El control cuidadoso de este proceso permite
que varias estructuras (músculo, colágena y eritrocitos) se
muestren de forma selectiva en diversas intensidades, des-
de el rosa hasta el rojo.
 MÉTODOS COMUNES DE TINCIÓN
Soluciones simples para tinción
Una solución acuosa al 0.5 a 1% de azul de metileno, por
ejemplo, tiñe de azul todas las estructuras del tejido. La
eliminación selectiva del colorante mediante clarificación
y alcoholes revela los elementos tisulares en intensidades
que se diferencian del azul.
Colorante de Romanowsky
Se trata de un colorante neutro (véase antes) que puede in-
ducir una reacción de tinción similar a la de H-E cuando se
aplica a los cortes con cera de parafina.
Fibras y músculos del tejido conectivo
Colágena y músculo
van Gieson van Gieson y sus variantes son los colorantes
más comunes para colágena y músculo. La solución que
tiñe es una mezcla de ácido pícrico y fucsina ácida. Debido
a la naturaleza ácida de la solución de van Gieson, se uti-
liza una hematoxilina de hierro para la tinción nuclear. El
músculo y los eritrocitos se tiñen de amarillo, mientras que
la colágena lo hace de rojo; los núcleos son negros.
Tricromos Delinean la colágena y el músculo de manera
diferenciada (fig. 2-3). El músculo teñido es rojo, en tanto
que la colágena puede adoptar un tono azul o verde, de
acuerdo con el orden de tinción usado. Por lo regular, la fi-
Figura 2-3 Para la demostración de los tejidos conectivos se uti-
liza un método de tricromo (o tricrómico). Las fibras del músculo
se tiñen de rojo, la colágena de azul, los núcleos de negro y las
células sanguíneas rojas de rojo brillante.
21
jación basada en mercurio produce mejores resultados que
los del formaldehído. La tinción requiere habilidad para su
práctica. Los principios teóricos del tricromo son comple-
jos y rebasan los alcances de este capítulo.
Hematoxilina fosfotúngstica ácida (PTAH) De uso fre-
cuente en la demostración de tejidos musculares, la tinción
PTAH tiñe las estriaciones y las miofibrillas musculares de
azul. La colágena se delinea en rojo.
Fibras reticulares
Impregnación con plata Las fibras reticulares se de-
muestran en particular con los métodos de impregnación
en plata (fig. 2-4). Existe una amplia variedad disponible
Figura 2-4 Impregnación de plata de fibras reticulares en una
sección del hígado. Una fina red negra de fibras envuelve a las
células. El teñido más burdo (derecha inferior) es colágena.
de estas técnicas; empero, su metodología es similar (véase
el cuadro 2-3). La contratinción de los núcleos es opcio-
nal. Se ennegrecen las fibras reticulares y otras estructuras
emiten sombras de tono marrón (a menos que de suyo sean
oscuras). También pueden impregnarse los núcleos. La pre-
paración de la solución de plata amoniacal debe estar fres-
ca y requiere habilidad. La reacción del ácido peryódico de
Schiff (PAS) también perfila fibras reticulares.
Membranas basales Es necesaria la demostración de
membranas basales glomerulares durante el diagnóstico
de la enfermedad glomerular. Los cortes se oxidan con ácido
peryódico y se impregnan con una solución de metenamina
de plata. La reacción es progresiva y se detiene en el punto
22 CAP. 2 TINCIONES GENERALES

Cuadro 2-3 Protocolo para la tinción con impregnación de plata Glucógeno

1. Desencerar los cortes y clarificar en agua destilada La reacción de PAS se usa con frecuencia para la demostra-
2. Oxidar con permanganato de potasio ción del glucógeno. Para identificar los sitios de acumulación
3. Blanquear con ácido oxálico del glucógeno es necesario pretratar un corte duplicado con
4. Sensibilizar con el alumbre de hierro diastasa. Ésta extrae el glucógeno y, cuando se tiñen ambas
5. Impregnar con una solución de nitrato de plata amoniacal muestras, la digerida señala una ausencia de PAS al teñir los
6. Reducir con formaldehído sitios del glucógeno.
7. Fijar con el tiosulfato de sodio La metenamina de plata se puede utilizar de una manera
8. Tonificar (opcional) con ácido cloroáurico (cloruro de oro) similar y reconoce al glucógeno como producto ennegre-
9. Lavar, deshidratar con alcohol, tratar con xileno y montar cido. El carmín de Best es otro método difundido para el
glucógeno.

Mucosustancias
deseado de impregnación. Se requiere el corte de las mues-
tras en 1 a 2 µm para que se visualicen las estructuras finas Por lo general, las mucosustancias se encuentran en la forma
de la membrana basal. La reacción con PAS también puede de mezclas de tipos diversos e incluyen a las mucinas. Éstas
emplearse para delinear las membranas basales. se localizan en muchos sitios tisulares (p. ej., tejidos glan-
dular y conectivo). La demostración de las diversas mucinas
Elastina Varios colorantes se pueden usar para demostrar depende de sus propiedades particulares. Las mucinas neu-
tejido de elastina, entre ellos la hematoxilina (método de tras se pueden teñir por la reacción de PAS (fig. 2-5), mien-
Verhoeff), fucsina de rescorcina (método de Weigert o Mi- tras que las mucinas ácidas lo hacen con el azul alciano.
ller) y aldehído de fucsina y orceína. El método de Ver-
hoeff, aunque es común, tiene dificultades para demostrar
fibras gruesas y finas en el mismo corte. La variante de
Miller de la tinción de Weigert para la elastina produce
resultados buenos y confiables de modo consistente. Las
calificaciones de este método son superiores de manera
constante respecto de otros métodos en estudios de calidad
(United Kingdom National Quality External Quality As-
surance Service for Cellular Pathology Technique [UKN-
EQAS-CPT]; portal: www.ukneqas-cpt.co.uk). La orceína
tiene éxito razonable para demostrar la elastina de la piel.
Se usa con frecuencia la tinción de van Gieson del tejido
conectivo para la contratinción de la elastina.

Carbohidratos y mucosustancias

Reacción de ácido peryódico de Schiff (PAS)

La reacción del PAS se emplea en patología para demostrar
una amplia gama de sustancias. El ácido peryódico rompe
los enlaces de carbono de los grupos adyacentes de glicol
1:2 por oxidación y forma aldehídos. Éstos inducen al reac-
tivo incoloro de Schiff para recolorear y teñir los sitios de
actividad de un tono magenta oscuro. Dado que muchas
sustancias contienen grupos glicol 1:2, la tinción no es muy
selectiva. Para mejorar la selectividad de la reacción para
algunas sustancias es necesario extraer o bloquear esa sus-
tancia en una muestra duplicada mediante enzimas o pro-
ductos químicos.
Figura 2-5 Demostración de mucina que se tiñe mediante una
combinación del método de ácido peryódico de Schiff (PAS) y
azul alciano. Las mucinas neutras se tiñen de magenta, las muci-
nas ácidas de azul y las mezclas, de azul púrpura intenso.
El azul alciano, preparado a diferentes pH, diferencia
las mucinas ácidas generales de las sulfatadas. Esta tinción
preparada con concentraciones que difieren del cloruro de
magnesio revela mucosustancias como el ácido hialuróni-
co, el sulfato de condroitina, el sulfato de queratina y la
heparina.
 MÉTODOS COMUNES DE TINCIÓN 23

Las mucinas del tejido conectivo se pueden también re-
conocer con colorantes metacromáticos como el azul de
toluidina, en tanto que la mucicarmina de Southgate perfila
las mucinas carboxiladas o débilmente ácidas.
Las técnicas de bloqueo para prevenir la tinción de gru-
pos químicos particulares (p. ej., carboxilo) se aplican para
mejorar la especificidad por la ausencia de tinción en las
secciones tratadas.
Demostración de pigmentos
Los pigmentos se pueden encontrar en material normal y
patológico y se forman de modo natural o como artefactos
de la fijación o la tinción del tejido.
ta algunos pigmentos comunes y los métodos usados para
demostrarlos.
Microorganismos
Los microorganismos que pueden delinearse en el plano
histológico incluyen bacterias, inclusiones víricas, hongos
y espiroquetas. Los colorantes simples como el azul de me-
tileno proporcionan a menudo medios rápidos y fáciles de
identificar la presencia de agentes patógenos dentro de una
muestra; sin embargo, el azul de metileno suministra infor-
mación sólo en relación con la morfología.
Bacterias

Artefactos Las bacterias se dividen en grampositivas o gramnegativas,

Por lo regular, los artefactos ocurren durante la fijación y
pueden deberse a las soluciones ácidas del formaldehído
que reaccionan con la sangre (pigmento de formalina).
Pueden evitarse con el uso de soluciones neutrales amor-
tiguadas de formalina. Los fijadores basados en el mercu-
rio (p. ej., Zenker) dejan un depósito de sales de mercurio
dentro de los tejidos. Ambos pigmentos se eliminan con
facilidad antes de aplicar la tinción. El cuadro 2-4 enlis-
según sea su reacción de tinción con el colorante cristal
violeta de Gram. Las bacterias grampositivas conservan la
tinción después de la diferenciación en acetona o alcohol,
mientras que las bacterias gramnegativas se decoloran.
Luego de aplicar el colorante cristal violeta, en el cual el
yodo se utiliza como mordiente o “agente atrapador”, que
precipita el colorante dentro del citoplasma de las bacterias
grampositivas, se emplea una contratinción roja para mos-
trar las bacterias gramnegativas. La técnica requiere destreza,
dado que es posible una sobrediferenciación del cristal vio-
leta que produce bacterias grampositivas rojas.

Cuadro 2-4 Demostración de algunos pigmentos comunes

Bacilos rápidos para el ácido y el alcohol
Pigmento Método de demostración
Estos patógenos se demuestran casi siempre mediante el
Hemosiderina Azul prusiano de Perl método de Ziehl-Neelsen (ZN). La fucsina básica y el fe-
Pigmento de la bilis Gmelina nol se mezclan para producir “carbol fucsina intensa”. La
Melanina Masson Fontana siguiente tinción (con o sin el uso de calor) de la muestra se
Lipofucsinas Ferrocianuro férrico de Schmorl diferencia con una solución de alcohol ácido hasta decolo-
PAS rar el espécimen. Una contratinción (azul o verde) demues-
Masson Fontana tra otros microorganismos y la estructura general.
Negro de Sudán También es posible emplear un método fluorescente
Ziehl-Neelsen largo (auramina-rodamina). Visto bajo un microscopio fluores-
Digestión del precursor de Hematoxilina de plomo cente, el microorganismo emite luz fluorescente amarilla
la amina y descarboxilación Masson Fontana o verde. Este método es más sensible que el ZN estándar
de gránulos celulares en Diazo puesto que los agentes patógenos aislados se identifican
células neuroendocrinas Grimelius
con mayor facilidad. Casi siempre es necesario desarrollar
Bodian
el método con un ZN estándar una vez que se identifica la
Células cromafines Reacción cromafín localización de los microorganismos.
Giemsa
Cobre Ácido rubeánico
Rodanina Inclusiones víricas
Asbesto Azul prusiano de Perl
Birrefringencia No hay métodos de tinción específicos para las inclusiones
víricas ya que muchas de las técnicas tiñen a otras estructu-
24 CAP. 2 TINCIONES GENERALES
ras. Se ha usado la tartracina floxina para demostrar cuerpos
víricos en la inclusión y la orceína para la identificación
de la hepatitis B. Los métodos inmunocitoquímicos han
reemplazado en buena medida al reconocimiento de las in-
clusiones víricas.
Hongos
Los hongos pueden ser evidentes en muestras teñidas con
H-E, pero pueden teñirse de forma más selectiva mediante
PAS, metenamina de plata de Grocott (fig. 2-6), mucicar-
mina de Southgate (para Cryptococcus), tinción de Gram,
Ziehl-Neelsen y Giemsa.
Figura 2-6 Impregnación de plata de hifas micóticas. Método
de Grocott.
Espiroquetas
Quizá las espiroquetas sean los microorganismos más difí-
ciles de demostrar en cortes tisulares. El método de Leva-
diti se realizó en bloques de tejido impregnados con plata.
La impregnación y el corte subsiguientes revelaron que las
espiroquetas aparecían en tonalidad negra.
Se han descrito varios métodos con plata para demostrar
espiroquetas en muestras tisulares. Todos requieren un gra-
do sustancial de habilidad para obtener buenos resultados.
Algunos de ellos se han adaptado para revelar Helicobacter.
Sustancias extracelulares (fibrina y amiloide)
Fibrina
La fibrina se tiñe de forma intensa con eosina y es positiva
al PAS en grado moderado. La fibrina fija con solidez el
colorante a la hematoxilina fosfotúngstica ácida. “Fibri-
noide” es un término aplicado a una sustancia hialina que
induce reacciones de tinción similares a las de la fibrina.
El método azul de escarlata de Matius-Lendrum delinea
a los eritrocitos en tono amarillo, a la fibrina y fibrinoide
en rojo y a la colágena y fibrina menos reciente en azul. El
método requiere una hábil diferenciación. El método origi-
nal recomendó la fijación basada en el mercurio; empero,
pueden alcanzarse resultados aceptables con soluciones de
formaldehído sin mercurio.
Amiloide
El amiloide se tiñe de rosa en cortes con H-E, es positivo
en moderada medida al PAS y se tiñe de amarillo o marrón
con la tinción de van Gieson. El amiloide se revela de ru-
tina si se utiliza el rojo Congo. Un gran número de formu-
laciones tiñe al amiloide en tonos rosados a rojos. Bajo luz
polarizada, el amiloide teñido con rojo Congo es dicroico y
emite birrefringencia amarilla o verde.
El violeta de metilo o el azul de toluidina tiñen al ami-
loide de manera metacromática (rojo púrpura a violeta).
La tioflavina T es un colorante fluorescente que posee
fluorescencia amarilla brillante. Este método no es especí-
fico pero sí muy sensible.
Lípidos
Los lípidos se pueden encontrar en tejidos normales y pa-
tológicos.
En condiciones normales, los lípidos simples se pier-
den durante el procesamiento con cera de parafina y se
requieren cortes congelados para probar su presencia. Se
demuestran los lípidos simples mediante colorantes solu-
bles en grasa (p. ej., colorantes de Sudán). El principio de
la tinción se basa en la presunción de que el colorante es
más soluble en la grasa que en el solvente del que está com-
puesto (solubilidad electiva).
Los lípidos compuestos, en los cuales están presentes
otros productos (p. ej., fosfolípidos), pueden resistir el pro-
cesamiento y los revelan diversos métodos en cortes de pa-
rafina. La mielina (fosfolípido) se puede perfilar con azul
Luxol rápido o colorantes basados en hematoxilina.
Gránulos citoplásmicos
Gránulos de mastocitos
Los gránulos de mastocitos son metacromáticos y se pue-
den demostrar mediante azul de toluidina, tionina o azul ce-
 AGRADECIMIENTOS
leste A. Los gránulos poseen metacromasia púrpura o roja
con los núcleos y otras estructuras teñidas de azul. También
pueden reconocerse otros tejidos conectivos y algunas mu-
cinas epiteliales. De igual modo, puede emplearse el azul
alciano para reconocer los gránulos. Bancroft recomendó
la esterasa de cloracetato como el método de elección.
Gránulos celulares de Paneth
Los gránulos celulares de Paneth son acidófilos y se obser-
van con facilidad y diferenciación en muestras teñidas con
H-E. El método de tartracina floxina de Lendrum tiñe los
gránulos rojos contra un fondo amarillo.
Gránulos celulares pancreáticos
Los más específicos métodos inmunocitoquímicos sustitu-
yeron en gran medida a la tinción de las células insulares
del páncreas. Algunos métodos tradicionales incluyen he-
matoxilina con alumbre-cromo y aldehído de fucsina para
las células B, Grimelius para las células A y el método de
Hellerström y Hellman para las células D.
Gránulos celulares pituitarios
De nueva cuenta, los métodos inmunocitoquímicos reem-
plazaron en buena medida a los métodos tradicionales de
tinción. El PAS-anaranjado G era un método aceptado y se
realizaba lo mejor posible sobre fijadores basados en di-
cromato (líquido de Helly). El PAS teñía a los basófilos
pituitarios de magenta, el anaranjado G a los acidófilos de
anaranjado y los cromófobos permanecían sin tonalidad.
Los tricromos también se han utilizado para reconocer los
tipos celulares.
Eosinófilos
Los eosinófilos son acidófilos y la tinción de H-E los deli-
nea y diferencia con claridad. También se han empleado las
tinciones Cromotrope y de Romanowsky.
Tejidos neurológicos
En la histopatología diagnóstica de rutina, la demostración
de elementos neurológicos por métodos de tinción conven-
cionales se reduce a las neuronas, axones y mielina. Los
métodos inmunocitoquímicos reemplazaron en gran parte
a algunas de las técnicas más difíciles de impregnación en
plata (cuadro 2-5).
25
Cuadro 2-5 Algunas tinciones neurológicas comunes
Estructura Método
Neuronas y axones Impregnación en plata
Sustancia de Nissl Cristal violeta rápido
Mielina Azul Luxol rápido
Cianina solocrómica
PTAH
Hematoxilina de hierro
Conclusiones
Los métodos convencionales de tinción aún tienen una
función relevante en el diagnóstico de la patología tisular.
En la actualidad, los laboratorios de diagnóstico usan una
combinación de tinción y tinción inmunocitoquímica para
proporcionar la información necesaria que permita esta-
blecer un diagnóstico informado. El aspecto morfológico
del tejido teñido con H-E representó el precursor para las
investigaciones subsecuentes.
Aunque la inmunocitoquímica ha sustituido a un núme-
ro notorio de métodos de tinción históricos, existe todavía
una gran cantidad de investigaciones que confían sólo en la
tinción habitual con colorantes.
Lecturas adicionales
Este capítulo sólo proporciona una introducción muy sinóptica a
los aspectos relacionados con las tinciones. Para una información
más profunda se recomiendan los siguientes libros:
Bancroft JD, Gamble M. Theory and Practice of Histological Te-
chniques. 5th ed. Edinburgh: Churchill-Livingstone, 2002.
Culling CFA, Allison RT, Barr WT. Cellular Pathology Techni-
que. 4th ed. London: Butterworths, 1885.
Lectura avanzada
Horobin RW, Kiernan JA (eds.), Conn’s Biological Stains. A Hand-
book of Dyes, Stains and Fluorochromes for use in Biology and
Medicine. 10th ed. Oxford, UK: Bios Scientific, 2002.
Agradecimientos
Quisiera expresar mi agradecimiento al Dr. Stephen Harris,
consultor histopatólogo del Staffordshire General Hospital,
por su ayuda durante la preparación del manuscrito, y a
Jim Elsam de HTEQA Services por facilitar las imágenes
digitales.
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Histoquímica de las enzimas
Trevor Gray y Neil Hand
Introducción
Las enzimas son grandes proteínas terciarias que actúan como
catalizadores de la mayor parte de las reacciones biológicas y
son vitales en el metabolismo celular, puesto que mantienen
la homeostasis en el hombre. Existen alrededor de 700 enzi-
mas conocidas y cada una cataliza una reacción particular al
actuar sobre moléculas específicas (sustratos). El producto
de la reacción puede actuar como un nuevo sustrato para una
enzima diferente, según lo ilustra el ciclo de Krebs. Después
de cada reacción metabólica, la enzima de cada caso perma-
nece inalterada para intervenir en reacciones futuras.
Los bioquímicos estudian de rutina las concentraciones
enzimáticas de las soluciones derivadas de líquidos corpo-
rales, cultivos tisulares y tejidos resecados con fines de diag-
nóstico y durante las investigaciones. Esto suministra eviden-
cia valiosa en la detección y vigilancia de los procesos de la
enfermedad y la evaluación de los cambios fisiológicos que
induce un medicamento. Sin embargo, los resultados obteni-
dos por análisis bioquímicos se relacionan con una población
heterogénea de las células que se encuentran en los tejidos
y no proporcionan valores celulares específicos. Es posible
llevar a cabo una valoración más precisa de la localización
intracelular de la enzima y su actividad biológica si se recurre
a la histoquímica de la enzima. Ésta se basa en la aplicación
de un sistema de detección enzimático en los cortes de tejido
o en un frotis. La técnica ofrece el producto final de una reac-
ción coloreada que se localiza en las células con una intensi-
dad proporcional a la actividad de la enzima. A diferencia de
los métodos bioquímicos, esta intensidad es difícil de cuanti-
ficar, pero los aspectos microscópicos cualitativos como los
que observa un patólogo experimentado son más relevantes
en la detección y determinación histológicas de los procesos
patológicos.
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker,
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
El principal problema con la histoquímica enzimática es
la retención de la función de la enzima durante la prepara-
ción del tejido y la tinción histoquímica. Se han desarrollado
numerosos métodos histológicos para enzimas específicas,
y si bien estos métodos no son difíciles, los procedimientos
no estandarizados de manipulación de los tejidos requeridos
han obligado a realizar con regularidad estas técnicas en la-
boratorios especializados.
Otros métodos histoquímicos no enzimáticos para la de-
tección de la enzima en cortes estándar de parafina incluyen
la inmunohistoquímica y la hibridación in situ del mRNA.
Estos métodos pueden identificar la presencia o producción
de enzimas celulares, pero ninguno puede mostrar la activi-
dad biológica de la enzima.
Estructura y clasificación
Estructura
Las enzimas son proteínas globulares de alto peso molecular
que pueden hallarse libres dentro del citoplasma (lisoenzi-
mas) o fijarse en las membranas celulares (desmoenzimas).
Los componentes no proteínicos (grupos prostéticos) pue-
den unirse a la enzima, lo cual puede ayudar a formar una
estructura cuaternaria activa. La propiedad funcional de la
enzima depende de mantener la forma y carga de su “sitio
activo” en el punto de la interacción enzima/sustrato.
Se necesitan varios cofactores para la mayor parte de las
reacciones. Activadores como los iones de calcio, magne-
sio, manganeso, sodio, potasio y otros ayudan a transferir
el electrón durante la reacción enzimática. Las coenzimas
son moléculas que se combinan con una “apoenzima” in-
activa y crean un sitio activo en términos estéricos por la
28 CAP. 3 HISTOQUÍMICA DE LAS ENZIMAS
alteración de la estructura cuaternaria de la apoenzima. La
coenzima puede también combinarse con el sustrato y des-
empeñar una parte activa en la reacción metabólica. Casi
todas las vitaminas B son coenzimas.
Clasificación
Se puede clasificar a las enzimas de varias maneras; la más
precisa se basa en el código de cada una, de acuerdo con el
nombre sistemático de la enzima. Éste contiene el nombre
del sustrato específico sobre el que reacciona, seguido por
una palabra con el sufijo “-asa”, y se especifica el tipo de
reacción participante. En el diagnóstico histoquímico de la
enzima se utiliza un nombre más corto debido al pequeño
número de enzimas investigado.
Los seis grupos mayores de enzimas se clasifican según
sea su efecto sobre el sustrato: oxidorreductasas, transfe-
rasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Probable-
mente, los grupos más importantes para el diagnóstico
histoquímico de la enzima son las oxidorreductasas (antes
conocidas como oxidasas y deshidrogenasas) e hidrolasas.
Éstas se llaman a menudo enzimas “oxidativas” e “hidrolí-
ticas”, respectivamente.
Conservación y preparación
Conservación de la enzima
Los efectos acumulativos de las etapas del procesamien-
to requeridas en la producción de un bloque de tejido
impregnado en parafina, como la fijación, deshidratación
e inclusión en cera de parafina, no son favorables para la
preservación funcional de las enzimas. Por lo general, es-
tos procedimientos dan lugar a la pérdida completa de la
actividad enzimática, aunque la esterasa de cloracetato y
la peroxidasa son resistentes en grado suficiente al daño
del procesamiento de la parafina. Por lo tanto, las demos-
traciones de la mayor parte de las enzimas se llevan a cabo
casi siempre en cortes congelados, pero también pueden
emplearse otras preparaciones como los frotis.
Es importante recordar que diversas enzimas reaccionan
de manera diferente a las influencias externas, pero la ma-
yor parte de las enzimas se pierde con rapidez si el tejido
fresco se deja a temperatura ambiente. Muchas enzimas
oxidativas que poseen relevancia diagnóstica para inves-
tigar una enfermedad del músculo se localizan en la mi-
tocondria. Cuando se sustrae el oxígeno del tejido fresco,
las membranas mitocóndricas se dañan en poco tiempo y
se observa la reducción de la actividad de la enzima. En
consecuencia, es importante congelar a la brevedad el teji-
do, que está fresco, ya que casi ninguna enzima oxidativa
puede soportar la fijación convencional. Las enzimas hidro-
líticas están contenidas en los lisosomas, pero se alteran por
el congelamiento y el subsiguiente descongelamiento de los
bloques o cortes con liberación de enzimas. La difusión de
las enzimas hidrolíticas puede minimizarse y la localización
mejorarse si el tejido se trata con un fijador antes de la crio-
tomía, aunque es posible alguna pérdida de la actividad enzi-
mática. En la práctica, la tinción histoquímica de la enzima se
efectúa sobre las muestras desmontables del crióstato, sobre
todo en circunstancias clínicas en las que un retraso diagnós-
tico es indeseable o cuando se necesita reconocer diferentes
enzimas en la misma muestra. Empero, la localización de
algunas enzimas puede resultar un poco mejor si se fija el
espécimen de tejido después de la criotomía.
Si se recurre a la fijación, los fijadores deben estar a 4°C y
utilizarse por el menor tiempo posible. Con frecuencia se re-
comienda el formol de calcio para los bloques de tejidos, ya
que ayuda a mantener la integridad de la membrana celular,
aunque la formalina amortiguada o la salina formal son satis-
factorias en casi todos los casos. La criotomía y la actividad
de la enzima pueden mejorarse al lavar el tejido fijado en una
solución amortiguadora de sucrosa antes del congelamiento.
Para resultados óptimos es importante mantener estas solu-
ciones cercanas al pH fisiológico del tejido. Se ha empleado
una variedad de fijadores, además del formol de calcio, en
frotis y secciones de crióstatos, entre ellos acetona, vapor
de formalina y mezclas de formalina-alcohol. La opción del
fijador depende de la enzima particular investigada y de la
relación entre la actividad enzimática y el aspecto morfoló-
gico. Aun después de tiempos de fijación cortos, la mayoría
de las enzimas oxidativas se torna inactiva pero, según se
mencionó ya, la fijación puede emplearse en la demostración
de estas enzimas al ayudar a preservar la morfología celular
y la localización del producto final de la reacción.
Preparación del tejido
Varios métodos están disponibles para el examen de las en-
zimas, pero en este capítulo sólo se consideran los cortes
congelados, frotis y secciones de parafina. Como se ha se-
ñalado, las enzimas que deben revelarse determinan el tipo
de preparación empleada.
Cortes congelados
La preparación más común de la muestra en la histoquímica
de la enzima es el uso de cortes congelados, casi siempre
practicados con un crióstato. Es necesario que el tejido se
congele con rapidez, ya que el congelamiento lento induce
artefactos de cristal de hielo: el congelamiento más rápido
forma cristales de hielo más pequeños. Las biopsias muscu-
 TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS
lares se consideran para la mayoría de las muestras his-
toquímicas de la enzima de diagnóstico, aunque son muy
propensas a los artefactos de cristal de hielo. El método
óptimo para el congelamiento del músculo incluye el uso
del isopentano congelado con nitrógeno líquido y el des-
congelamiento gradual. La fracción sólida actúa como un
amortiguador térmico y mantiene la temperatura de la frac-
ción líquida estable (–150°C) durante el congelamiento del
tejido. El tejido (fijado o sin fijar) se orienta sobre un disco
de corcho en gel de OCT y se sumerge en el isopentano
descongelado hasta que el gel y la muestra se congelan. De
igual modo, el corcho se une al bloque sostenedor median-
te el compuesto de OCT y entonces se coloca dentro del
crióstato listo para la sección a –23°C. El nitrógeno líquido
solo no puede emplearse, ya que tiene un índice bajo de
conductividad térmica y produce una barrera térmica ga-
seosa alrededor del tejido, lo cual provoca daño celular al
permitir la formación de grandes cristales de hielo.
Frotis
Los frotis pueden prepararse por varios métodos a partir de
suspensiones de sangre, médula ósea y células de tejido. Los
frotis impresos de tejido, por ejemplo los ganglios linfáti-
cos, son también útiles si el tejido fresco se corta y la nueva
superficie se coloca suavemente otra vez en un portaobjetos
limpio. La mayor parte de los frotis se seca al aire y se fija
(según sean las enzimas requeridas) por pocos segundos,
casi siempre con acetona fría, antes de la tinción citoquímica
de las células.
Secciones de cera de parafina
Casi ninguna enzima resiste los efectos del procesamien-
to de cera de parafina estándar, por lo cual este modo de
preparación no suele ser útil. La peroxidasa y la esterasa
de cloracetato son lo suficiente fuertes para sobrevivir a
la inclusión en cera de parafina y pueden demostrarse con
facilidad. Algunas otras enzimas pueden preservarse de
modo parcial al usar medidas especiales con ceras de bajo
punto de fusión, pero esto sólo es ocasional.
Técnicas histoquímicas
Estos métodos histológicos son los únicos en los que las
enzimas nunca se tiñen; sólo los productos de reacción se
delinean. Para obtener resultados relevantes son esenciales
la cuidadosa optimización de la reacción de la enzima y la
coloración del producto de reacción.
El proceso implica el desdoblamiento de un sustrato por
la enzima ligada al tejido para formar un producto de reac-
29
ción primario (PRP). Este PRP puede entonces reaccionar con
un químico conocido como agente de captura para formar un
producto de reacción final (PRF), que debe ser insoluble y
estar en el sitio de la enzima. Numerosos factores modifican
las reacciones y todos deben controlarse de manera cuidado-
sa. El pH de las soluciones de incubación es crítico para la
mayoría de las reacciones de la enzima y debe mantenerse
con los amortiguadores apropiados. Al cambiar la tempera-
tura puede alterarse la tasa de reacción de la enzima; algunos
métodos requieren incubación a 37°C, mientras que otros se
realizan a temperatura ambiente. La temperatura ambiente
subóptima permite más tiempo para la terminación de la for-
mación del PRF y el agente de captura, lo cual mejora la lo-
calización del PRF en el sitio de la enzima y reduce la tasa de
reacción. Los sustratos y los agentes de captura deben ele-
girse para prevenir interacciones y ambos deben difundirse
con facilidad a través de las membranas celulares. El sustrato
y el agente secuestrador deben usarse a una concentración
que prevenga el agotamiento durante la rápida actividad de
la enzima, pero no a una concentración que podría inhibir la
reacción de la enzima. La selección de un agente de captura
depende del método enzimático utilizado y el tipo de tejido
en el cual se encuentra la enzima. Por ejemplo, cuando se usa
el método de precipitación de metal sobre el músculo, se
prefiere la sal de calcio a la sal de plomo, dado que la segun-
da puede ligarse de modo inespecífico al músculo. Además,
muchas veces hay una elección de sustratos, aunque muchos
sustratos que ocurren de forma natural, si bien económicos,
pueden ser inespecíficos o producir PRP que no sean del
todo insolubles. Los sustratos especialmente sintetizados
casi siempre ofrecen resultados superiores.
Es importante incluir un control positivo del tejido du-
rante la tinción histoquímica de modo que puedan exami-
narse la calidad de los reactivos y la exactitud del protocolo
empleado. La omisión del sustrato del medio de incuba-
ción o la inclusión de inhibidores específicos actúan como
un control negativo.
Métodos de reacción de la enzima
En histopatología, la mayor parte de las enzimas se de-
muestra mediante: a) acoplamiento simultáneo o b) aco-
plamiento posincubación.
Acoplamiento simultáneo
El acoplamiento simultáneo sólo requiere una solución que
contenga el sustrato y un agente secuestrador con el cofac-
tor requerido. La enzima ligada al tejido reacciona con el
sustrato en la solución para producir un PRP. Éste puede
ser insoluble o soluble, ya que el agente secuestrador (tam-
30 CAP. 3 HISTOQUÍMICA DE LAS ENZIMAS
bién en solución) se liga con el PRP de forma instantánea
para formar un PRF. Este PRF insoluble se liga al sitio de la
enzima y puede colorearse o permanecer incoloro, aunque
lo último podría requerir un paso de coloración adicional
para la visualización.
Acoplamiento posincubación
Algunas veces no es posible tener el sustrato y el agente se-
cuestrador en una solución, ya que las condiciones necesarias
para la producción del PRP pueden ser diferentes respecto de
las requeridas para la elaboración del PRF. En ocasiones, el
agente secuestrador puede además interferir con la función
de la enzima o inhibirla. En los métodos de acoplamiento
posincubación, la solución inicial sólo contiene al sustrato
y algunos cofactores necesarios. El PRP debe ser insoluble
puesto que son posibles falsos negativos o la difusión den-
sa del PRF. Una solución secundaria que contiene al agente
secuestrador se aplica entonces para producir el PRF, como
se indicó. En la práctica es difícil encontrar los sustratos con-
venientes para los métodos de acoplamiento posincubación,
con un resultado que se utiliza rara vez.
Métodos de demostración
En condiciones normales, los PRF coloreados se producen
por uno de los siguientes métodos:
1. Precipitación del metal.
2. Diazo.
3. Sal de tetrazolio.
4. Método indigogénico.
Otros métodos incluyen:
5. La oxidación de 3,3-diaminobencidina (DAB) por la
oxidasa de citocromo o las peroxidasas para formar un
pigmento marrón.
6. El metabolismo del glucógeno por la fosforilasa para
producir un polisacárido que se colorea de azul/negro
con yodo.
Métodos de precipitación de metal
Los métodos de precipitación de metal se usan de rutina para
identificar fosfatasas, por ejemplo fosfatasa ácida, fosfata-
sa alcalina y trifosfatasa de adenosina (ATPasa; fig. 3-1).
Figura 3-1 Los cortes congelados muestran la tinción diferen-
cial de fibras musculares para ATPasa tras la incubación a pH 4.2
con una técnica de precipitación de metal.
Éstos dependen de la liberación de iones de fosfato del
sustrato, que entonces reaccionan con el plomo o las sales
de calcio en la solución (agente de captura) para formar el
PRF insoluble de plomo o fosfato de calcio.
El fosfato de plomo es incoloro pero se ennegrece con
solución de sulfuro de amonio para formar sulfuro de plo-
mo. El fosfato de calcio es insoluble a un pH alcalino y
debe convertirse en fosfato de cobalto con solución de clo-
ruro de cobalto, tratado antes con sulfuro de amonio para
formar sulfuro de cobalto negro. Con el tiempo, estos mé-
todos son propensos a desteñirse, pero pueden recolorearse
con sulfuro de amonio.
El método con la acetilcolinesterasa que usa el sustrato
acetilcolina puede considerarse un método de precipitación
metálica que produce un PRP de tiocolina, el cual reaccio-
na con el sulfato de cobre y el ferrocianuro de potasio, res-
pectivamente, para formar ferrocianuro de cobre marrón.
Métodos diazo
Los métodos diazo se utilizan para identificar las fosfata-
sas alcalinas y ácidas, la esterasa inespecífica y la esterasa
de cloracetato. Los diferentes sustratos contienen un grupo
naftol que puede atacar a una de las enzimas anteriores.
Varias sales de diazonio o la pararrosanilina hexazotizada
se emplean para reaccionar con el grupo naftol y formar
un diazo insoluble coloreado. De manera característica, las
sales de diazonio usadas incluyen rojo rápido TR, azul rá-
pido RR, azul rápido B y Garnet rápido GBC, que deben
montarse en medio acuoso. El diazo, formado a partir de la
pararrosanilina hexazotizada, es el método de opción, ya
que puede practicarse en una resina sintética, lo que mejora
la localización óptica en la microscopia de luz. Las sales
 APLICACIONES DIAGNÓSTICAS DE LA HISTOQUÍMICA ENZIMÁTICA
de diazonio pueden usarse con métodos simultáneos o de
acoplamiento posincubación.
Métodos con sales de tetrazolio
Las sales de tetrazolio, que son incoloras y solubles en
agua, aceptan hidrógeno liberado de modo enzimático del
sustrato para formar depósitos microcristalinos coloreados
insolubles en agua, los llamados formazanes. Muchas enzi-
mas oxidativas, como la deshidrogenasa succínica, se iden-
tifican mediante sales de tetrazolio, como el metil-tiazolil-
difenil tetrazolio (MTT; fig. 3-2) y el tetrazolio nitroazul
(NBT). Como en el caso de las sales de diazonio, varios
Figura 3-2 Corte congelado de músculo teñido para diaforasa de
NADH con la sal de tetrazolio MTT.
factores modifican su selección, pero el NBT se usa más a
menudo que el MTT, de modo que puede montarse en una
resina sintética.
Método indigogénico
Los sustratos contienen un grupo indoxilo, que se libe-
ra como un PRP; éste, a su vez, se oxida por acción del
agente de captura ferrocianuro de potasio para formar PRF
turquesa (fig. 3-3). La solución de incubación también in-
cluye ferrocianuro de potasio, que previene la sobreoxida-
ción del PRF.
Aplicaciones diagnósticas
de la histoquímica enzimática
La histoquímica de la enzima puede ser de utilidad en va-
rias aplicaciones diagnósticas, entre ellas las siguientes:
1. Tipificación de la fibra muscular esquelética.
31
Figura 3-3 Corte congelado de yeyuno que muestra la actividad
de la lactasa sobre la microvellosidad, teñida de turquesa median-
te el método indigogénico.
2. Sospecha de enfermedad de Hirschsprung en nervios y
ganglios.
3. Valoración de la malabsorción del tejido gastrointestinal.
4. Demostración de células linfoides y mieloides.
5. Identificación de degeneración temprana del hígado.
Las dos primeras aplicaciones son las más comunes, pero
se remiten inusualmente a los centros de diagnóstico espe-
cializados.
Músculo esquelético
Se ha establecido con firmeza el uso de la histoquímica enzi-
mática en el diagnóstico de las enfermedades neuromuscu-
lares y miopatías congénitas; en realidad, muchos aspectos
histopatológicos sólo se reconocieron y describieron después
de la introducción de la histoquímica de las enzimas.
La tinción tradicional del músculo estriado es suficiente
para mostrar las reacciones inflamatorias y la variación del
tamaño de la fibra, pero es incapaz de diferenciar entre los
diversos tipos de fibra muscular. Esto es importante porque
muchas enfermedades se limitan a tipos específicos de fi-
bras musculares o muestran alteración de éstas. La anomalía
puede asumir la forma de atrofia o hipertrofia y, en ciertas
afecciones, de alteración de la estructura celular interna. La
aplicación de los métodos de histoquímica enzimática al
músculo esquelético cortado en sentido transversal facilita la
distinción de los tipos de fibras; esto, junto con el examen de
su distribución y tamaño, puede ser de utilidad diagnóstica.
En general, las fibras del músculo estriado pueden dividirse
en los tipos 1 y 2, de acuerdo con el nivel de actividad de la
ATPasa mostrada a un pH de 9.4. Si la tinción de la ATPasa
se aplica después de la preincubación en un amortiguador a
32 CAP. 3 HISTOQUÍMICA DE LAS ENZIMAS

un pH de 4.2 o 4.6, es posible establecer una diferenciación
adicional de las fibras de tipo 2 en los subtipos 2A, 2B y
2C (fig. 3-1). Otra enzima importante para demostrar es la
fosforilasa, que en la enfermedad de McArdle es deficien-
te en las células del músculo estriado, pero no desaparece
del músculo liso de los vasos sanguíneos, y por tanto es
útil como control. La diaforasa de NADH (dinucleótido de
nicotinamida y adenina reducido) se utiliza para el estudio
de la estructura interna de las células musculares, dado que
delinea a la mitocondria y a la red del retículo sarcoplás-
mico (fig. 3-2). Cuando esto se compara con la distribu-
ción miofibrilar de la ATPasa pueden reconocerse varias
anomalías. Los patrones anormales de la distribución de la
enzima se describen a menudo en términos de sus aspectos,
que son específicos de una enfermedad particular, como
“fibras objetivo”, “fibras anulares” y “núcleos centrales”.
La oxidasa del citocromo, deshidrogenasa succínica y des-
hidrogenasa de lactato son más específicas para la mito-
condria y pueden proporcionar ayuda en la identificación
de miopatías mitocóndricas. En el cuadro 3-1 se muestra
un resumen de la tinción diferencial enzimática del múscu-
lo esquelético.

Cuadro 3-1 Histoquímica enzimática diagnóstica

Tejido Enzima Método Sustrato pH Color Identificación

Músculo ATPasa Precipitación metálica Trifosfato de adenosina 9.4 Negro/marrón Fibras tipo 1: pálidas
estriado miofibrilar (cloruro de calcio) (ATP) Fibras tipos 2a, 2b y 2c:
oscuras

Preincubación de Fibra tipo 1: oscuras

precipitación metálica Fibras tipos 2b y 2c: in-
(cloruro de calcio) termedias
@ pH 4.6 Fibras tipo 2a: pálidas
Preincubación de Fibras tipo 1: oscuras
precipitación metálica Fibras tipo 2c: interme-
(cloruro de calcio) dias
@ pH 4.2 Fibras tipos 2a y 2b: pá-
lidas

NADH Sal de tetrazolio (MTT) NADH 7.0 Negro Mitocondria (fibras tipo
diaforasa 1: más oscuras)
Retículo sarcoplásmico

Deshidrogenasa Sal de tetrazolio (MTT) Succinato de sodio 7.0 Negro Para mitocondria (fibras
succínica tipo 1: más oscuras)

Oxidasa de Oxidación de DAB Citocromo c 7.4 Marrón Anormalidades mitocón-

citocromo dricas

Miofosforilasa Metabolismo de Glucosa-1 fosfato 5.9 Púrpura/negro Tinción negativa de las

glucógeno (yodo) fibras musculares en la
enfermedad de McArdle

Desaminasa de Sal de tetrazolio (NBT) Adenosina 5- 6.1 Azul Ausente en algunos tras-
mioadenilato monofosfato (AMP) tornos metabólicos

Aldolasa Fructosa disódica 8.6

1,6 difosfato

Fosfofructocinasa Fructosa 6-fosfato 7.0

Nervios Acetilcolinesterasa Ferricianuro de potasio Yoduro de acetiltiocolina 6.0 Rojo/marrón Fibras y células del nervio
—reacción de sulfato de En recto, colon (Hirsch-
cobre (precipitación sprung) y enfermedades
metálica) musculares

Yeyuno Lactasa Método indigogénico d-Fucosida de 5-bromo- 6.0 Turquesa Reducido o negativo con
(ferrocianuro de potasio) 4-cloro-3-indoxil-␤ malabsorción
Sucrasa Diazo (pararrosanilina) d-Glucosida de 6-bromo- 6.0 Rojo
2-naftil-␣
 APLICACIONES DIAGNÓSTICAS DE LA HISTOQUÍMICA ENZIMÁTICA 33

En fecha reciente, los métodos inmunohistoquímicos se

han desarrollado para la tipificación confiable de la fibra
muscular del tejido procesado con parafina. Si bien éste
puede tener un importante potencial diagnóstico para tales
tejidos procesados, no permite la identificación de las otras
enzimas relevantes desde el punto de vista diagnóstico o la
capacidad para mostrar su actividad metabólica.

Nervios y ganglios

En el colon y recto normales, las células ganglionares y

nervios relacionados se encargan de la motilidad del colon.
En la enfermedad de Hirschsprung infantil se reconoce
la ausencia ganglionar en la unión de las capas circular y
longitudinal del músculo liso (plexo mientérico) y en la
submucosa. Existe también un incremento marcado del
número y grosor de las fibras nerviosas no argirófilas en la
submucosa y la lámina propia. En la actualidad, las células
ganglionares pueden identificarse sobre un corte con H-E,
pero esto es mucho más difícil con las fibras del nervio. Las
células ganglionares y las fibras del nervio contienen coli-
nesterasa, la cual puede reconocerse con el método rápido
de la acetilcolinesterasa. En condiciones normales se re-
quiere la identificación de la enfermedad de Hirschsprung
para confirmar el diagnóstico inicial y más tarde, durante
la operación correctiva, cuando los límites de la resección
deben precisarse antes de la eliminación del intestino anor-
mal. Como ésta se lleva a cabo durante la intervención me-
diante biopsias pequeñas de aspiración rectal, la rapidez Figura 3-4 Corte congelado de tejido rectal con enfermedad de
es esencial. Las muestras obtenidas con crióstato y teñidas Hirschsprung teñido para acetilcolinesterasa que demuestra las fi-
con H-E suelen ser suficientes para detectar la presencia bras engrosadas del nervio.
o ausencia de células ganglionares grandes; no obstante,
puede utilizarse cualquier biopsia superficial que no des- detectar deficiencias primarias de lactasa o sucrasa, aunque
carta el método de la acetilcolinesterasa para mostrar las en clínica la prueba bioquímica de estos disacáridos es más
fibras del nervio anormales en la lámina propia (fig. 3-4). importante que la identificación histoquímica.
El mismo método puede usarse para demostrar anorma- La fosfatasa ácida encontrada en los lisosomas de los
lidades motoras de la placa terminal en biopsias de múscu- enterocitos y en macrófagos de la lámina propia puede
lo estriado. también ser una enzima útil para demostrar malabsorción.
Para evaluar y vigilar de modo apropiado la malabsorción se
requiere que el yeyuno se oriente de tal forma que las ve-
Tejido gastrointestinal
llosidades se seccionen en sentido longitudinal.
Para determinar un diagnóstico definitivo en las biopsias
gastrointestinales con sospecha de mala absorción, la in- Células linfoides y mieloides
formación morfológica es insuficiente. Varias enzimas en
el contorno de la vellosidad son útiles, pero las disacari- Diversas enzimas, incluidas la esterasa inespecífica, la fosfa-
dasas, lactasa, trehalasa y sucrasa son en particular impor- tasa ácida y la esterasa de cloracetato, se usan para la identi-
tantes. Estas enzimas reflejan cambios observados al da- ficación citoquímica y evaluación de células en preparacio-
ñarse el enterocito; la lactasa (fig. 3-3) es la más sensible, nes para frotis, como se muestra en el cuadro 3-2. Además
mientras que la sucrasa es la más resistente y por lo tanto de la actividad enzimática, las células específicas pueden
la tinción histoquímica para estas dos disacaridasas es de diferenciarse por su patrón de tinción, es decir, focal o difu-
utilidad. Estos métodos pueden también emplearse para so. La inmunohistoquímica es ahora el método optativo para
34 CAP. 3 HISTOQUÍMICA DE LAS ENZIMAS

Cuadro 3-2 Tinción histoquímica enzimática de los leucocitos

Enzima Método Sustrato pH Color Comentario

Esterasa de cloracetato Diazo (pararrosanilina) Cloracetato de 6.3 Rojo Primero se tiñen las células ceba-
naftol AS-D das, luego los eosinófilos y neu-
trófilos
Fosfatasa ácida Diazo (pararrosanilina) Fosfato de naftol 5.0 Rojo Las células T de los monocitos di-
AS-BI fusamente teñidos tienen una sola
mancha pequeña
Fosfatasa alcalina Diazo (rojo rápido TR) 8.0 Rojo Neutrófilos
Esterasa inespecífica Diazo (pararrosanilina) Acetato de ␣-naftilo 7.6 Rojo Monocitos

la identificación de estas células en la histopatología, pero Conclusión

algunos departamentos de hematología todavía utilizan los
métodos enzimáticos histoquímicos. La esterasa de clora-
cetato, que resiste la inclusión en parafina, como se men-
cionó con anterioridad, puede distinguir células linfoides y
mieloides. Los mastocitos se reconocen con facilidad por
su tinción intensa, morfología y granularidad mediante este
método histoquímico de la enzima (fig. 3-5).
La histoquímica de la enzima todavía desempeña un papel
vital en la histopatología, sobre todo en la detección y diag-
nóstico de la enfermedad muscular, incluso si están ahora
disponibles nuevos métodos inmunohistoquímicos. En la
inmunocitoquímica y la biología molecular, las técnicas his-
toquímicas de la enzima se utilizan de rutina en los sistemas
de detección. El método del formazán para la deshidrogena-
sa succínica se ha usado de manera exitosa en macrocortes
frescos del corazón tras identificar post mortem el infarto
del tejido. El científico forense también ha usado los méto-
dos histoquímicos de la enzima para determinar la fecha y
el tiempo en que se cometió una herida. En la investigación
se estudia un espectro mucho más amplio de enzimas con
técnicas diversas, entre ellas microscopia electrónica y cito-
metría de flujo, además de la microscopia de luz.

Figura 3-5 La muestra en parafina de la piel muestra mastocitos
de la dermis teñidos de rojo para esterasa de cloracetato con clo-
racetato de naftol AS-D y pararrosanilina de hexazonio.
Degeneración hepática
La ausencia de actividad enzimática en los cortes congela-
dos de hígado puede ser útil en la identificación temprana
del daño al hepatocito y los cambios cirróticos. Donde existe
un cambio cirrótico notorio, es importante el control de la
muestra en ausencia de algunos hepatocitos normales pre-
sentes que actúen como control interno. La redistribución de
la actividad enzimática, como la fosfatasa ácida localizada
en los núcleos, es también una señal temprana de daño celu-
lar y necrosis eventual debido a la degeneración lisosómica.
Referencias
Bancroft JD. Enzyme histochemistry and its diagnostic applicatio-
ns. In: Theory and Practice of Histological Techniques, 5th ed.
Bancroft JD, Gamble M (eds). London: Churchill Livingstone
2002:593-620.
Bancroft JD, Hand NM. Enzyme Histochemistry. RMS Microscopy
Handbook No. 14. Oxford: Oxford University Press 1987.
Behan WMH, Cossar DW, Madden HA, McKay IC. Validation of a
simple, rapid, and economical technique for distinguishing type
1 and 2 fibres in fixed and frozen skeletal muscle. J Clin Pathol
2002;55:375-380.
Dawson IMP. Fixation: what should the pathologist do? Histochem
J 1972;4:381-385.
Filipe MI, Lake BD. Histochem in Pathology. 2nd ed. Edinburgh:
Churchill Livingstone 1990.
Hayhoe FGJ, Quaglino D. Haematological Cytochemistry. 2nd
ed. Edinburgh: Churchill Livingstone 1988.
 4
Inmunohistoquímica
Jane Starczynsky y John Crocker
Introducción
En términos de la función normal y los estados de enferme-
dad, el estudio de la morfología simple de cortes o células
casi siempre es suficiente para el análisis. Según se describe
en los capítulos 3 y 5, las técnicas auxiliares como la histo-
química, histoquímica enzimática y microscopia electrónica
pueden ser las más provechosas para entender mejor la natu-
raleza y el estado funcional de una célula o un tipo de teji-
do. Sin embargo, en el decenio de 1970 resultó evidente que
era necesaria y posible una valoración más detallada de los
productos de la función celular. En histopatología, el adve-
nimiento de la inmunohistoquímica (IHQ) fue emocionante
y abrió grandes y nuevas perspectivas en la investigación de
biopsias y las muestras quirúrgicas de escisión. El principio
que subyace a la IHQ es la demostración del antígeno por
medio de su enlace a un anticuerpo que, a su vez, se une
a una marca que puede visualizarse en forma histológica
(fig. 4-1). En consecuencia, puede delinearse el sitio del an-
tígeno en cuestión. Los métodos de IHQ se pueden clasificar
en tres grupos principales, directos, indirectos y complejos,
desde aquellos que usan la fluorescencia ultravioleta activa-
da hasta los cromógenos. Además, el material particulado,
como el metal pesado, se puede utilizar en los microscopios
de luz y electrónico.
Métodos directos
En los métodos directos, el anticuerpo dirigido contra cierta
molécula o parte de ella (epitopo) se une a un espécimen. El
anticuerpo tiene un “agente indicador” unido a él y entonces
se visualiza de manera directa. El método es relativamente
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker,
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
insensible en tanto que no haya ninguna “amplificación”
de la señal antigénica. La técnica directa se ha abandonado
en gran parte en los procedimientos IHQ; empero, aún es
el método de elección para la citometría de flujo (véase
cap. 8).
Métodos indirectos
Los métodos indirectos implican el uso de capas del an-
ticuerpo para demostrar el antígeno en cuestión. Esto lo
ilustra de forma típica la acumulación de estratos de anti-
cuerpos dirigidos contra antígenos de especies que difieren
en especificidad, lo que crea un “cono invertido” de mo-
léculas, de tal modo que se amplifica en grado notable la
señal original. Por ejemplo, como primer paso se reactiva
mejor el antígeno de conejo antihumano con un anticuerpo
de cerdo anticonejo marcado. Esto proporciona mayor sen-
sibilidad que los métodos directos, pero los métodos más
complejos lo han reemplazado en gran proporción.
Métodos de múltiples etapas
Estos métodos emplean capas de anticuerpos y marcas para
amplificar la señal en el sitio de enlace del anticuerpo. Son
ejemplos los métodos del puente enzimático, la peroxidasa-
antiperoxidasa (PAP) y las técnicas de la fosfatasa alcalina-
antifosfatasa alcalina (APAAP), además de los basados en
avidina/estreptavidín-biotina. En todas estas reacciones la
sensibilidad de la señal es mucho mayor que en las técnicas
directas e indirectas y el “cono invertido” de la amplificación
es mucho más grande con las capas múltiples de moléculas.
36 CAP. 4 INMUNOHISTOQUÍMICA

Figura 4-1 Diagrama esquemático para mostrar algunas de las secuencias más comunes en IHQ. a) Método directo: el anticuerpo primario
marcado reacciona con el antígeno del tejido. b) Método indirecto de dos pasos: el anticuerpo secundario marcado en forma enzimática
reacciona con el anticuerpo primario unido al antígeno del tejido. c) Método indirecto de tres pasos: el anticuerpo terciario marcado de modo
enzimático reacciona con el anticuerpo secundario marcado. d) El complejo APAAP reacciona con el anticuerpo secundario. El anticuerpo
primario y el anticuerpo del complejo inmunitario deben ser de la misma especie. e) En el método CAB, el complejo avidina o estreptavi-
dina-biotina-enzima reacciona con el anticuerpo secundario biotinilado. f) En la secuencia catalizada de la amplificación de la señal (CSA),
el anticuerpo primario antecede a un anticuerpo secundario biotinilado, luego sigue el complejo (estrept)avidina, después el reactivo de la
amplificación y, por último, el complejo (estrept)avidina-enzima. g) Tinción dual para dos epitopos mediante la metodología CSA. Se aplica
el primer anticuerpo, le sigue la primera molécula de la “espina” y a continuación un cromógeno apropiado. Después se aplica un agente de
bloqueo. Se utiliza luego el segundo anticuerpo primario, con una segunda molécula “espina” y un segundo cromógeno. h) Simbología para
a) a f). Reproducido con autorización de DAKO Cytomation Ltd.
 MÉTODOS DE MÚLTIPLES ETAPAS
Anticuerpo primario
Anticuerpo secundario
Anticuerpo secundario (anticonejo)
Anticuerpo secundario (antirratón)
Antígeno tisular primario
Antígeno tisular secundario
Enzina PR
Enzima FA
Bloqueo de tinción doble
Rojo sensible
Polímero (molécula espinal)
Figura 4-1 (Continuación)
“Moléculas indicadoras y de acoplamiento”
Para visualizar el antígeno, si bien de modo indirecto, es
necesario producir una señal visual para localizar el sitio
de unión en las células o los tejidos. Por consiguiente, se ha
desarrollado una gama de sistemas “indicadores” a través
de los años. Éstos se describen a continuación en un orden
cronológico aproximado.
37
Moléculas fluorescentes
El indicador original fue la tinción fluorescente, que marca-
ba al anticuerpo apropiado. A continuación se podía visua-
lizar el antígeno por microscopia fluorescente (véase cap.
6). Una limitación del uso de las moléculas fluorescentes
indicadoras es su fotoinestabilidad, esto es, la señal se de-
colora de manera gradual al exponerse a la luz del día. Debe
advertirse que las propiedades antigénicas, no tanto las fluo-
rescentes, de la fluorescencia se utilizan ahora por el buen
efecto sobre los sistemas de detección que no se basan en la
biotina por IHQ. En la actualidad se dispone de fluoróforos
múltiples con diversas frecuencias de excitación y emisión
que puedan emplearse para permitir el marcado simultáneo
de antígenos múltiples dentro del mismo tejido.
La inmunofluorescencia tiene un uso relativamente limi-
tado en el laboratorio de diagnóstico, pero todavía se con-
sidera en la valoración de las biopsias de riñón (fig. 4-2) y
Figura 4-2 Micrografía de un glomérulo de una biopsia renal.
El paciente padecía una glomerulopatía IgA y la delicada inmuno-
tinción se puede reconocer en este corte congelado, reactivado
con IgA (verde fluorescente). Reproducido por cortesía del Dr.
Aarnoud Huissoon.
piel, quizá porque el material favorece la demostración del
antígeno lineal o membranoso. Todavía se utiliza extensa-
mente para la localización del antígeno en la investigación;
además, con la capacidad simultánea de localizar los antí-
genos múltiples dentro del mismo tejido o célula, propor-
ciona la información útil sobre las interacciones celulares
y proteínicas.
Peroxidasa
La peroxidasa de rábano (PR) es una molécula que se adap-
ta de modo extraordinario para la investigación de la enfer-
medad humana. En primer lugar, no es de origen mamífero,
38 CAP. 4 INMUNOHISTOQUÍMICA
sino que se deriva, por supuesto, de una planta. Esto significa
que las oportunidades de una reacción cruzada antigénica se
reducen; no obstante, debe notarse que la actividad enzimá-
tica de la PR es similar a la de los mamíferos y esto puede
causar problemas cuando la enzima se demuestra en tejidos
o células (véase más adelante). En segundo lugar, puede re-
velarse con facilidad a través de su reacción con diversos
sustratos y se forma un producto teñido de la reacción que
puede visualizarse al microscopio, por ejemplo la 3,3’-dia-
minobencidina (DAB) en presencia de peróxido de hidróge-
no. Por último, es una molécula que puede usarse en el plano
ultraestructural. El marcado de PR se ha utilizado en técni-
cas directas, indirectas y de múltiples etapas. Por algunos
años, la principal técnica de los laboratorios de histopato-
logía fue el método de la peroxidasa-antiperoxidasa (PAP).
Sin embargo, la técnica de la avidina-biotina (CAB) “más
amplificadora” ha desplazado en buena medida a aquélla.
Un problema con el uso de la PR es que arroja resultados
falsos en presencia de actividad peroxidásica endógena en
tejido humano u otros, lo que conduce a una reacción po-
sitiva; por ejemplo, los neutrófilos polimorfonucleares tie-
nen actividad peroxidásica endógena. Afortunadamente, esta
actividad se puede “bloquear” en gran parte mediante pre-
tratamiento de la muestra con reactivos bloqueadores, sobre
todo peróxido de hidrógeno o ácido clorhídrico en metanol
y azida de sodio. Incluso con esta medida, ciertas células, en
particular neutrófilos polimorfonucleares y mastocitos, que
son muy ricos en peroxidasa, pueden expresar resultados po-
sitivos falsos.
Fosfatasa alcalina
La fosfatasa alcalina (FA) es otra enzima que ha encontrado
amplio uso en la IHQ, en especial en las preparaciones celu-
lares. Esto último se debe en gran medida a la gran sensibili-
dad de la interacción fosfatasa alcalina-antifosfatasa alcalina
(APAAP) resultante. La FA puede proporcionar productos
de reacción de color vivo con ciertos sustratos, pero en ge-
neral éstos manifiestan el problema de que, al contrario del
producto de reacción de la DAB, son solubles. Esto signi-
fica que las muestras se deben montar en medios acuosos;
anteriormente, éstos eran líquidos y creaban problemas con
el almacenamiento por largo tiempo, pero en la actualidad
se dispone de montajes permanentes. Una vez más, puede
haber problemas con la fosfatasa alcalina endógena tisular,
pero esto puede bloquearse con agentes como el levamisol.
Oro-plata
Los anticuerpos se pueden unir a los agregados uniformes
y finos del oro elemental y éste reacciona de forma alter-
nada con la plata a partir de compuestos argentosos, en vir-
tud de la diferencia de electropositividad. Esto suministra
una secuencia muy sensible de la reacción, que encontró un
uso extendido en la microscopia de luz hace unos 10 años,
cuando se utilizó en estudios como método de marcado para
los epitopos de baja expresión, como aquellos de superficies
celulares. Sin embargo, debe indicarse que el método nunca
encontró una amplia aplicación diagnóstica y sólo se limitó
a su uso en investigación. Además, lo ha sustituido en bue-
na medida la serie de métodos del complejo avidina-biotina
(CAB). Pese a ello, un uso importante de la técnica inmu-
noáurica se reconoce en el campo de la microscopia inmuno-
electrónica, en la cual las partículas metálicas se pueden ver
al localizarse en sitios antigénicos; en realidad, es posible
demostrar más de un antígeno en la misma preparación con
los anticuerpos ligados a las partículas de oro de tamaños
diversos.
Avidina-biotina
Los métodos de avidina-biotina se basan en la unión de al-
ta afinidad entre avidina (o estreptavidina) y biotina. Esta
afinidad en extremo elevada es esencial para su aplicación
como una etapa intermedia de los métodos de amplificación
y extrema sensibilidad, como el CAB (fig. 4-3). Los anti-
Figura 4-3 Micrografía de un linfoma folicular, inmunoteñido
para la oncoproteína bcl-2, mediante la metodología CAB.
cuerpos secundarios se biotinilan, con la capa terciaria de
avidina conjugada a una molécula indicadora, por ejemplo
PR o FA. El método CAB ha encontrado un uso extenso en
laboratorios de diagnóstico e investigación y es tal vez el
estándar actual. Un problema potencial con los sistemas ba-
sados en CAB es que la avidina y la biotina se pueden en-
 MÉTODOS DE MÚLTIPLES ETAPAS
contrar en tejidos normales. Es importante considerar esto
cuando se analizan estos especímenes y puede recurrirse
al uso de los bloques de avidina/biotina para contrarrestar
este problema.
Amplificación de la señal de la tiramina
Este método muy sensible amplifica en grado notable la
señal, hasta 103 veces más respecto de otros métodos. En
este sistema, la PR actúa como catalizador en la sedimen-
tación de la tiramida, ligada a un fluorocromo o la biotina
en las reacciones directas e indirectas. Lo anterior es de
gran valor cuando el antígeno objetivo se expresa en grados
bajos y puede ser inferior al umbral para la detección con
métodos estándar de IHQ.
Sistemas sin biotina
Se ha observado ya que puede haber problemas con la activi-
dad enzimática endógena y moléculas endógenas dentro del
tejido normal. Se han desarrollado métodos más recientes
mediante marcas que no se encuentran habitualmente en el
tejido normal. La fluoresceína encontró aceptación reciente
como reactivo acoplador, no en virtud de su fluorescencia
sino como antígeno: esta molécula presenta la ventaja obvia
de que carece de un análogo humano.
Un acercamiento novedoso para la amplificación de la se-
ñal ha sido la introducción de sistemas basados en polímeros.
Éstos permiten que las marcas múltiples enzimáticas (PR/FA)
se unan al anticuerpo secundario a través de la columna ver-
tebral del polímero. Este tipo de sistema es un procedimiento
de dos etapas y de ese modo ahorra tiempo en relación con
los sistemas convencionales de avidina/biotina, mientras que
las marcas múltiples enzimáticas mantienen la sensibilidad.
Enlace inespecífico del anticuerpo
Los lectores deben observar que los anticuerpos primarios pue-
den ligarse de forma inespecífica a muestras de tejido, en gran
parte por medio de sus fracciones Fc. Es mucho más proba-
ble que el problema se suscite con policlonales y menos con
reactivos monoclonales. Esto puede superarse casi siempre por
medio del “bloqueo” con el suero no inmunitario apropiado.
Métodos de “recuperación de antígeno”
Pretratamiento de la enzima
A finales de la década de 1970 se reconoció que la inmuno-
tinción se podía mejorar con el pretratamiento de las mues-
tras con ciertas enzimas proteolíticas, como la pronasa o la
39
tripsina. La base exacta de tales procesos es incierta, pero
se admite que ciertos grupos antigénicos son “desenmasca-
rados” en términos bioquímicos por la eliminación de las
cadenas laterales que oscurecen, lo cual hace posible el ac-
ceso del anticuerpo primario. Las enzimas son muy líticas
y la “titulación” antes del uso regular es esencial para evitar
la alteración del tejido.
Pretratamiento con microondas
En el decenio de 1990 resultó evidente que ciertos epitopos
se podían “desenmascarar” con el uso de la radiación de
microondas controlada de las secciones del tejido en medio
acuoso. Como en el caso del pretratamiento de la enzima,
el mecanismo que subyace a esto se encuentra lejos de ser
claro; no obstante, esta técnica encontró una aplicación
muy amplia en los últimos años. Como los métodos enzimá-
ticos, el tratamiento con microondas no sólo mejora la vi-
sualización en algunos casos de ciertos antígenos, sino que
también puede permitir la detección, cuando antes ninguna
era posible. Como en el tratamiento enzimático, es necesa-
ria la “titulación” de la sincronización de la microonda.
Otro desarrollo reciente ha sido el uso del cocimiento
a presión de las secciones para mejorar la inmunotinción.
Esto es algo más peligroso que el uso cuidadoso de los hor-
nos de microondas. En algunos centros también se utilizan
el cocimiento a presión mediante hornos de microondas, la
esterilización, el cocimiento con vapor y ebullición simple.
Con la metodología de la recuperación, es esencial uti-
lizar portaobjetos microscópicos precubiertos para evitar
la pérdida de tejido de la superficie del portaobjetos. Los
portaobjetos cargados de modo positivo están disponibles
en el comercio; las alternativas incluyen recubrimiento de
los portaobjetos con poli-l-lisina, APES o Vectabond.
Controles
Es muy importante instituir ciertos controles esenciales an-
tes de probar cualquier anticuerpo nuevo y, en condiciones
ideales, por lo menos algunas de estas exigencias se deben
aplicar sobre una base de diagnóstico diario. Los controles
positivos implican la inclusión de las muestras conocidas
para tener elementos reactivos con el anticuerpo en cues-
tión. Éste es el control más importante y usado con regu-
laridad en el diagnóstico diario IHQ. Es útil algunas veces
preparar un bloque tisular compuesto incluido en cera de
parafina que contenga una combinación de piezas peque-
ñas de los controles positivos conocidos y montarlo en el
mismo portaobjetos como la muestra de prueba. Esto per-
mite al patólogo ver ambas estructuras teñidas, de forma
positiva o negativa, al mismo tiempo.
40 CAP. 4 INMUNOHISTOQUÍMICA

Figura 4-4 Cortes teñidos de forma doble para demostrar la reactividad citoplásmica en marrón (DAB, Menarini) para la cadena ligera
 de Ig y la actividad citoplásmica (Vector SG) de gris acero para la cadena ligera . En a), las células plasmáticas en una amígdala
“reactiva” muestran una mezcla de células, en la que algunas contienen una cadena y otras la restante. En b), todas las células plasmáticas
(en una biopsia de piel) contienen la cadena  y son, por lo tanto, clonales.

Cuando un anticuerpo nuevo se halla bajo evaluación
antes de su uso diagnóstico o de investigación, se requiere
una gama de controles más rigurosos, entre ellos los si-
guientes: “bloqueo” con el antígeno/epitopo puro (es de-
cir, el anticuerpo preadsorbente con su antígeno objetivo);
la omisión del anticuerpo primario (o reemplazo con un
control igualado de modo isotópico) u otros anticuerpos en
la secuencia y aplicación de la reacción cromógena sola.
Tales controles comprueban la especificidad de la unión
primaria del anticuerpo y la necesidad de su presencia en el
resultado positivo de la reacción.
Métodos de marcación dual
A menudo es importante poder demostrar más de un an-
tígeno o epitopo en una célula o tejido particular. Un ejem-
plo es la demostración de las cadenas ligeras  (kappa) y
 (lambda) para determinar la clonalidad en una lesión lin-
focitoide (fig. 4-4). La pregunta es, por supuesto, “¿se trata
de una muestra de tejido linfoide benigno o maligno?” La
exposición de monoclonalidad en las células o sobre ellas
de un corte debe indicar malignidad; la capacidad para de-
mostrar esto debe modificar el control del paciente. Para
identificar más de un antígeno/epitopo se utilizan los sus-
tratos cromógenos de diversos colores y por consiguien-
te se determina la preparación. La IHQ también se puede
combinar con otras técnicas, como el método de “AgNOR”
(véase cap. 8), histoquímica convencional e hibridación
in situ.
Anticuerpos policlonales y monoclonales
El trabajo inicial sobre IHQ se llevó a cabo mediante an-
tisueros policlonales inoculados en mamíferos contra pre-
paraciones antigénicas. Estos antisueros fueron politípicos
y por tanto tendieron a proporcionar patrones de tinción
que no estaban muchas veces “claros” en los cortes, con la
unión de diversos anticuerpos constitutivos a sitios micros-
cópicos más bien variables. El método de “purificación de
afinidad”, en el cual el anticuerpo policlonal se hizo pasar
a través de una columna que contenía el antígeno objetivo
unido a la matriz, mejoró la especificidad de los reactivos.
Con el advenimiento de los anticuerpos monoclonales re-
sultó posible la localización mucho “más clara” y específi-
ca de epitopos y por consiguiente una mejor delineación de
las especies celulares y tisulares.
Pese a ello, un problema inicial de peso fue que, a dife-
rencia de muchos anticuerpos policlonales, la mayor parte de
los anticuerpos monoclonales no podía aplicarse con éxito
de forma regular a las muestras incluidas en cera de parafina
guardadas. Por consiguiente, la mayoría de los estudios ini-
ciales dependió de la disponibilidad de material congelado
de la sección, con su preservación morfológica relativamente
pobre. Sin embargo, hoy, con la llegada de los anticuerpos
 PROYECCIÓN DE IMAGEN 41

monoclonales de afinidad más alta, muchos se pueden aplicar tad (p. ej., la tinción de las cadenas ligeras superficiales
a los cortes en parafina, sobre todo tras el uso de los méto- de Ig sobre las células que presentan antígeno). Esto debe
dos de recuperación del antígeno. No obstante, las secciones permitir a los laboratorios mejorar y estandarizar su técnica
congeladas pueden ofrecer una ventaja sobre las muestras en a la luz de las revisiones.
cera de parafina dado que pueden suministrar una mejor vi-
sualización de los antígenos de superficie.
Automatización
Aplicaciones de la inmunohistoquímica La inmunohistoquímica llegó al campo de la automati-
zación relativamente tarde (fig. 4-5), quizá porque pocos
Rebasa los límites de este libro delinear una explicación
comprensiva de los innumerables usos de la IHQ en el la-
boratorio de diagnóstico. Basta con señalar que esta tecno-
logía se puede utilizar en el diagnóstico y como indicador
del pronóstico en patología celular común. La IHQ ha per-
mitido distinguir entre los linfomas y carcinomas celulares
pequeños, melanomas y seminomas, mesoteliomas y adeno-
carcinomas, y linfomas de células B y T. Además, es posible
identificar microorganismos muy diversos, desde Cytomega-
lovirus hasta Toxoplasma y, como se discute en el capítulo
8, se puede determinar la proliferación celular y el estado
apoptósico. Además, pueden demostrarse las hormonas, los
receptores de la hormona, los factores del crecimiento, las
moléculas de adhesión y los productos oncógenos, al igual
que los ligandos para ciertas moléculas. No obstante, como
advertencia debe subrayarse que los epitopos compartidos
no indican en todos los casos orígenes comunes. Por ejem-
plo, las células de Reed-Sternberg de la enfermedad de
Hodgkin y las células del adenocarcinoma expresan CD15, Figura 4-5 Aparato automático de inmunotinción del fabricante
sin que ello indique que estos tipos de célula posean un linaje Dako Cytomation Ltd. Reproducido con autorización de DAKO
Cytomation Ltd.
común. Un campo cada vez más importante para el uso de la
IHQ se sitúa en la valoración del pronóstico, que puede ayu-
dar al clínico a prescribir con mayor precisión el tratamiento anticuerpos que eran convenientes para su uso de rutina
más conveniente para una enfermedad maligna en particular. estaban disponibles. No obstante, en poco tiempo cualquier
Los ejemplos se hallan en la valoración de la fracción del laboratorio dispondrá de un panel grande de reactivos apli-
crecimiento por medio del anticuerpo Ki67. Asimismo, la cados a numerosos cortes en cualquier procedimiento diag-
expresión de la oncoproteína bcl-2 confiere un pronóstico nóstico; la automatización sólo es cuestión de tiempo.
relativamente pobre en linfomas de alto grado. La investi- Los dispositivos anteriores eran semiautomatizados
gación del receptor de estrógeno y progesterona y el estado y servían en gran parte para ahorrar tiempo y manipular
HER2 son también de gran importancia en el tratamiento de grandes volúmenes de reactivos; esto atenuaba, por ejem-
los carcinomas de mama. plo, el tedio de los lavados múltiples con amortiguadores.
Más adelante aparecieron en el mercado máquinas más
automatizadas, por supuesto mucho más costosas que sus
Control de calidad precursoras. Los aparatos recientes poseen microproce-
sadores, controlados y programables a las exigencias del
En el mundo actual que exige estándares de laboratorio usuario, que permiten procesar de modo simultáneo mues-
cada vez más estrictos, son del todo recomendables el con- tras que emplean distintos tipos de tinción.
trol externo de la calidad y la vigilancia interna de rutina.
Muchos países cuentan con esquemas externos de asegura-
miento de la calidad que, en general, dependen de la eva- Proyección de imagen
luación de la tinción de los antígenos seleccionados por el
laboratorio “objetivo”. Las muestras son una combinación Hoy en día cada vez más es posible cuantificar la tinción
de casos directos indudables y cortes de ineludible dificul- IHQ. En el pasado, ello resultaba difícil debido al pobre
42 CAP. 4 INMUNOHISTOQUÍMICA
Figura 4-6 Applied Imaging’s Ariol SL-50. Reproducido con
autorización de Applied Imaging.
entendimiento de la estequiometría de las reacciones IHQ,
en particular en la unión cromógena. Sin embargo, ahora
se cuenta con sistemas como el Applied Imaging’s Ariol
SL-50 (fig. 4-6), que permite la cuantificación y análisis
de portaobjetos IHQ con instrumentos de alta eficacia de
procesamiento y programas de análisis de imagen. Esto
también permite crear una “red virtual” gracias a la cual
los patólogos pueden evaluar paneles de portaobjetos que
analizan el sistema y poner a disposición los resultados de
manera directa en los sistemas del hospital.
Lecturas adicionales
Leong AS-Y, Cooper K, Leong FJW-M. Manual of Diagnostic
Antibodies for Immunohistology. London: Greenwich Me-
dical Media 2003.
Polak JM, van Noorden S. Introduction to Immunocytochemistry.
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Boenisch T (ed.). Immunochemical Staining Methods, 3rd ed. Ca-
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Dabbs DJ. Diagnostic Immunohistochemistry. New York: Chur-
chill Livingstone 2002.
 5
Microscopia electrónica en patología
Brian Eyden
Introducción
Los tejidos o líquidos humanos que contienen células se
muestrean sobre todo con propósitos diagnósticos, es de-
cir, para la identificación de las categorías patológicas que
pueden reconocerse y tratarse. A menudo es necesario un
diagnóstico microscópico para optimizar el control del pa-
ciente y, cuando menos en el campo del cáncer, muchos
diagnósticos clínicos se modifican tras la investigación mi-
croscópica histopatológica.
El examen microscópico de luz de las muestras teñidas
con hematoxilina y eosina (H-E) de tejidos embebidos en
cera de parafina es el procedimiento técnico más importan-
te para el diagnóstico sólido de especímenes humanos. En
este punto, un patólogo determina aspectos de la célula y
la matriz, incluida la estructura, en el contexto de hallaz-
gos generales y datos clínicos para precisar un diagnósti-
co. Mientras que la microscopia de luz de los cortes con
H-E es aún la base del diagnóstico histológico, técnicas más
nuevas, como la microscopia electrónica (ME), inmunohis-
toquímica, tinción AgNOR, citometría de flujo, además de
las técnicas citogenéticas y “moleculares” (análisis de re-
configuración génica, hibridación de fluorescencia in situ
y la reacción en cadena de la polimerasa [PCR]), pueden en
la actualidad proporcionar información adicional para de-
purar el conocimiento de la enfermedad y el diagnóstico.
La microscopia electrónica de diagnóstico ha resultado
importante desde finales de la década de 1960 y principios
del decenio de 1970. Sin embargo, a partir de los inicios de
los años de 1980, la inmunohistoquímica en particular se
ha convertido en una técnica imprescindible y ha propicia-
do cierta declinación en la práctica de la ME. Dado que
la inmunohistoquímica se reconoce como la técnica más
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
conveniente y útil, atrajo recursos que antes se destinaban
a la ME. Empero, la ME proporciona una información úni-
ca (sobre la morfología subcelular) y puede proporcionar
por tanto nuevos datos sobre la enfermedad, parte de los
cuales tienen aplicaciones diagnósticas. Esto es así porque
en algunas afecciones bastan las características puramente
morfológicas para establecer el diagnóstico (cuadros 5-1 y
5-2), aunque también porque la inmunohistoquímica tie-
ne limitaciones, si bien es una técnica de particular impor-
tancia en el diagnóstico oncológico.
La bibliografía actual atestigua el valor de la conti-
nuación de la ME en la investigación y el diagnóstico de
los casos de la enfermedad humana que son problemáticos
para la microscopia de luz (Dar et al., 1992; Hashimoto,
1994; Kandel et al., 1998; Mierau, 1999; Eyden, 1999,
2002; Lloreta-Trull et al., 2000; Tucker, 2000; Al-Sarraj et
al., 2001). La carencia de información ultraestructural dis-
minuye el rendimiento de un departamento de diagnóstico,
puesto que la ME puede confirmar o descartar de modo
continuo las interpretaciones de los patólogos basadas en
la microscopia de luz; de esa manera aumenta la confianza
con la cual se sustenta un diagnóstico. Se suele decir con
cierta razón que la ME hace mejores a los patólogos.
El grado al cual se emplea la ME en un departamen-
to de diagnóstico de rutina depende de la experiencia dis-
ponible (técnica e interpretación) y, en grado notorio, de
los lineamientos y antecedentes del jefe de servicio. Al-
gunos utilizaron la ME en el pasado, pero ahora no con-
fían más en ella y prefieren la inmunohistoquímica y las
técnicas moleculares nuevas para solucionar los proble-
mas diagnósticos (pese a que la inmunohistoquímica con-
tinúa su transformación en términos tecnológicos y existen
dudas acerca de la especificidad de muchos de los anticuer-
44 CAP. 5 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA

Cuadro 5-1 Marcadores ultraestructurales de diferenciación celular usados en la identificación de tumores

Tipo celular Características ultraestructurales

Epitelio escamoso Desmosomas, tonofibrillas, lámina basal
Epitelio glandular Complejo apical conjuntivo, microvellosidades, gránulos mucígenos
Neumocito tipo 2 Cuerpos amortiguadores (mielinosomas)
Mesotelio Microvellosidades lisas, largas, sinuosas
Célula neuroendocrina Gránulos neuroendocrinos (“núcleo denso”)
Célula de Schwann Proyecciones finas cubiertas con lámina externa
Adipocito Gotas de grasa, lámina
Célula del músculo estriado Sarcómeros consistentes en formaciones de actina y miosina y discos Z
Célula del músculo liso Miofilamentos finos con densidades focales, lámina externa
Miofibroblasto Retículo endoplásmico rugoso, miofilamentos, articulaciones fibronexales
Fibroblasto Retículo endoplásmico rugoso, gránulos con secreciones de colágena
Endotelio Cuerpos de Weibel-Palade
Neurona Gránulos neuroendocrinos, retículo endoplásmico liso, microtúbulos, conexiones
sinápticas
Melanocito Melanosomas
Célula yuxtaglomerular Gránulos romboidales
Célula de Leydig Cristales, lípidos, retículo endoplásmico liso, crestas tubulares
Célula granulosa Desmosomas
Célula de Langerhans Gránulos de Birbeck
Célula plasmática Aparato de Golgi, retículo endoplásmico rugoso
Macrófago Lisosomas, proyecciones filopodiales
Linfocito Célula “indiferenciada” (organelos indistinguibles)
Adaptado según Cameron and Toner (1998).

pos usados). Por el contrario, otros recurren a la ME en Principios de la técnica

mayor grado y ocupan casi siempre posiciones en las insti-
tuciones grandes o especializadas en las cuales la carga de
trabajo ingente o la referencia de muchas de las muestras
representan números más grandes de casos difíciles.
La cuantificación del valor de la ME es difícil. Se ha di-
cho que hasta 5% de todos los tumores, por ejemplo, puede
ser bastante problemático para beneficiarse de la investi-
gación con ME, mientras que 25% de las muestras renales
no neoplásicas puede necesitar ME (Pearson et al., 1994).
Cualesquiera que sean los números, la ME debe aplicarse
siempre que haya una dificultad en la interpretación del corte
con H-E. La ME es siempre digna de practicarse en estas
circunstancias porque nunca es posible predecir en un caso
individual qué resultados pueden obtenerse y algunas veces
se experimenta el placer de reconocer hallazgos del todo in-
esperados y nuevos. Además, la ME y la inmunohistoquími-
ca (y todas las técnicas más recientes) se deben considerar
como complementarias; es una idea generalizada admitir
que la información proveniente de la inmunohistoquími-
ca y la ME pueden delinear un cuadro más completo de
una lesión que cualquier técnica sola. El cuadro se complica
a veces por el uso de ambas técnicas (pueden ser excluyen-
tes), pero esto puede considerarse un estímulo para la inves-
tigación suplementaria.
y la organización de la ME
Microscopia electrónica de transmisión:
energía de resolución
Casi todo el trabajo de diagnóstico ultraestructural utiliza la
microscopia electrónica de transmisión (MET) para demos-
trar las propiedades celulares específicas o las característi-
cas de la matriz, que pueden contribuir a la comprensión y el
diagnóstico de la enfermedad (cuadros 5-1 y 5-2). Además
de la MET existen algunas aplicaciones, aunque no dema-
siadas, que pueden denominarse técnicas “especializadas”,
por ejemplo la ME “de barrido”, que es otra clase “morfo-
lógica” de ME, y otras técnicas que suministran informa-
ción sobre el contenido elemental (microanálisis de rayos
X) o la composición biomolecular (inmunocitoquímica
e histoquímica ultraestructurales) (cuadro 5-3). También se
han desarrollado las “versiones” ME de los procedimien-
tos de la microscopia de luz, como la morfometría, para
proporcionar la información cuantitativa ultraestructural
(p. ej., la irregularidad nuclear en los linfomas).
Pese al desarrollo de las técnicas “funcionales” ultraes-
tructurales más recientes, la ME es aún un método esen-
cialmente morfológico, como la histopatología con H-E.
 PRINCIPIOS DE LA TÉCNICA Y LA ORGANIZACIÓN DE LA ME 45

Cuadro 5-2 Aplicación de la microscopia electrónica en trastornos no neoplásicos

Enfermedad renal
Padecimientos neuromusculares
Trastornos cutáneos
Enfermedades del tejido conectivo
Alteraciones hematopoyéticas
Errores innatos del metabolismo
Biopsias pediátricas hepáticas
Biopsias endomiocárdicas
Enfermedades respiratorias
Trastornos del sistema nervioso
central y periférico
Medicina reproductiva
Agentes infecciosos
*Arteriopatía cerebral autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía.
Adaptado según Cameron y Toner (1998).
Espesores de la membrana capilar basal (p. ej., enfermedad de la membrana basal delgada)
Presencia y localización de depósitos inmunitarios (p. ej., glomerulonefritis [GN]
membranosa)
Presencia de fibrillas extracelulares (p. ej., amiloide), inclusiones celulares (p. ej., figuras
de mielina en la enfermedad de Fabry), estadificación de ciertas enfermedades (p. ej.,
GN membranosa), procesos de apoyo (la fusión extensa puede ser indicativa de GN
de cambio mínimo)
Mitocondrias, miopatías congénitas y metabólicas
Afecciones de queratinización
Dermatosis mecanobulosa
Defectos del cabello y las uñas
Trastornos estrómicos que incluyen alteraciones de la colágena, proteoglucanos y
amiloidosis de la elastina
Enfermedades plaquetarias
Anomalías granulocíticas
Acumulación de metabolitos
Potencial para la detección prenatal
Enfermedad metabólica del hígado
Síndrome de Reye
Cardiomiopatías, amiloidosis
Anormalidades ciliares
Identificación de partículas pulmonares
Demencias, neuropatías, CADISIL*
Anormalidades de los espermatozoides
Virus, bacterias, protozoarios, hongos

Cuadro 5-3 Técnicas y procedimientos ultraestructurales consecuencia, pueden proyectarse detalles estructurales de
especializados la célula y la matriz tan pequeños como de tan sólo algunos
nanómetros en tamaño, lo cual rebasa de forma notable la
• Microscopia electrónica de barrido capacidad de la microscopia de luz. Por lo tanto, a través
• Microscopia inmunoelectrónica de los años se han identificado las estructuras celulares
• Histoquímica ultraestructural y de la matriz que son distintivas o específicas de una cé-
• Microanálisis por rayos X y difracción electrónica lula o enfermedad, y esta abundancia acumulada de infor-
• Fractura y delineado por congelación mación representa la base de la microscopia electrónica de
• Hibridación in situ ultraestructural diagnóstico en los tumores y la enfermedad no neoplásica
• Morfometría ultraestructural
(cuadros 5-1 y 5-2).

Como la microscopia de luz, la ME utiliza muestras so- Formación de la imagen

metidas a una forma de radiación para observarlas. La ra-
diación (haz electrónico) interactúa con el material interno
del corte para emitir una imagen, que se puede interpretar
para obtener información sobre la naturaleza de la muestra.
La importancia de la ME radica en que utiliza un haz elec-
trónico. Puesto que la energía de resolución depende de la
longitud de onda de la radiación, la energía de resolución
de un microscopio electrónico es en la práctica cerca de
100 veces mayor respecto de un microscopio de luz. En
En la MET, los electrones en el haz que ilumina (“inci-
dente”) producen un número importante de interacciones
al entrar en contacto con la muestra. Muchos pasan simple-
mente a través del espécimen casi sin cambio alguno. Otros
se desvían de su trayectoria (“se dispersan”) por áreas o
puntos de mayor densidad electrónica en el corte y se fil-
tran hacia afuera del haz incidente final por una abertura
(fig. 5-1a). Por consiguiente, el haz incidente final posee
46 CAP. 5 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA

Figura 5-1 Formación de la imagen en el microscopio electrónico de transmisión. Los electrones en el haz incidente entran en contacto
con el corte ultradelgado (a). Algunos pasan sin desviarse a través de su trayectoria incidente (a), mientras que los que se impactan sobre
un punto denso de la muestra (p. ej., un átomo de metal pesado) se desvían fuera de la trayectoria incidente (dispersados de forma elástica)
y no avanzan hacia la pantalla de visualización por una abertura del metal (a). Por lo tanto, el haz incidente final contiene la información
que resulta de la combinación de electrones sin desviar y de otros que sufrieron dispersión elástica (b). Representación de Paul Chantry.

áreas que carecen de electrones en comparación con el haz
incidente inicial (fig. 5-1b) y esta diferencia establece la
base de la imagen. La densidad dentro de una muestra pue-
de ser natural, como en un concentrado de mineralización,
o el tratamiento químico del tejido en el espécimen puede
introducirla. Por lo general, lo anterior se lleva a cabo con
la solución de tetraóxido de osmio (véase la técnica más
adelante), en la cual los átomos del osmio se unen de mane-
ra selectiva a los materiales biológicos, como las membra-
nas. En consecuencia, una fila de átomos de osmio unidos
a una membrana celular produce una imagen que refleja
esta línea de electrones “ausentes” en el haz incidente final
(fig. 5-1b), que a su vez se convierte en una línea sobre la
pantalla del microscopio electrónico cuando los electrones
chocan con el recubrimiento fluorescente de la pantalla que
se visualiza y se convierten en luz visible.
Técnica
Las técnicas empleadas para preparar el tejido para la MET
de corte fino se han estandarizado bastante en los últimos
 PRINCIPIOS DE LA TÉCNICA Y LA ORGANIZACIÓN DE LA ME
años. Como en la microscopia de luz, el tejido necesita fi-
jarse con rapidez para evitar la autólisis y primero se fija en
un aldehído, es decir, un fijador con el que predominan las
uniones cruzadas con proteínas. Se acepta que el glutaral-
dehído, entre una variedad de aldehídos disponibles en el
comercio, ofrece el mejor desempeño para la conservación
ultraestructural. No obstante, la fijación de una biopsia o
una muestra de resección en glutaraldehído requiere perso-
nal y tiempo para atender un problema quirúrgico. Según
sean las condiciones del laboratorio, puede ser necesario
recuperar tejido de la muestra principal en formalina his-
tológica. Resuelto lo anterior, se amortigua a un pH fisio-
lógico; la muestra es bastante pequeña y no debe recoger-
se para la ME de la profundidad de un espécimen grande
(donde la autólisis puede alterar la estructura del tejido);
la conservación puede ser muy buena. La opción de mues-
treo del tejido en formalina histológica imposibilita la in-
clusión de la muestra entera en cera y requiere una pieza
representativa pequeña para retenerse, dado que es posible
la eventualidad de un problema diagnóstico identificado
en la investigación con H-E. Esto puede no ser factible en
una institución con grandes cargas de trabajo.
La muestra fijada en glutaraldehído o recuperada a par-
tir de formalina necesita cortarse en piezas pequeñas (“mi-
límetros cúbicos”), puesto que los reactivos del proceso
subsecuentes tienden a penetrar con lentitud. Las muestras
pequeñas disponibles para el estudio constituyen una de las
limitaciones principales de la ME. Después de la fijación en
aldehído, el contraste selectivo se incorpora mediante una
solución de tetraóxido de osmio y algunas veces también
con una solución de acetato de uranilo. Estos átomos del
metal pesado se unen de modo selectivo a las estructuras de
la célula y proporcionan la energía de dispersión electrónica
y el contraste. Aunque las reacciones de estos reactivos con
los componentes biológicos son complejas, el tetraóxido de
osmio se conoce por ser un fijador de lípidos y una de sus
funciones principales es delinear las membranas al deposi-
tar los átomos de osmio en los intersticios bimoleculares.
El acetato de uranilo es un fijador de fosfolípidos y también
realza la delineación de la membrana, aunque fija además
los ácidos nucleicos y de este modo proporciona densidad
a los ribosomas y a la desoxirribonucleoproteína (“croma-
tina”) nuclear.
Después de la tinción y fijación en bloque, el tejido se
deshidrata en etanol o acetona y se infiltra con una resina
epóxica líquida, en ocasiones con un solvente transitorio
como el óxido de propileno, tolueno o el limoneno, que es
el menos usado pero también el menos tóxico. El bloque
del tejido infiltrado en resina epóxica entonces se polime-
riza por medio de calor a un estado sólido. Los pasos de la
infiltración se pueden realizar de forma manual con el tejido
en frascos pequeños, encapsulados, de cristal, con reactivos
47
recolocados con pipeta o mediante un procesador automa-
tizado de tejido. Los instrumentos basados en microondas,
de reciente introducción, pueden procesar el tejido hasta
un bloque polimerizado en cuestión de algunas horas, algo
comparable con los procedimientos típicos de la inmuno-
histoquímica.
Los bloques de resina epóxica tienen las propiedades
físicas que permiten que las secciones se corten con un ul-
tramicrótomo manual sobre el cristal disponible o con
cuchillas permanentes de diamante. Las secciones con un
espesor de alrededor de 80 nm son bastante delgadas para
el paso de los electrones requeridos para la formación de la
imagen, y aun bastante fuertes para soportar el efecto térmi-
co de la exposición a electrones de alta energía. Las seccio-
nes se recolectan casi siempre en rejillas de malla de cobre
de 3 mm de diámetro, teñidas para el contraste adicional en
soluciones de acetato de uranilo y citrato de plomo (Mauns-
bach y Afzelius, 1999) y entonces se encuentran listas para
el examen en el microscopio electrónico.
Manipulación de los tejidos antes de la fijación
Los procesos de muestreo y manipulación del tejido pre-
vios a la fijación pueden ser cruciales para obtener un tejido
bien seleccionado y preservado. Esto es de lo más impor-
tante, puesto que la interpretación se facilita en gran medi-
da por la calidad de la conservación estructural. A pesar de
los deseos de usar el glutaraldehído o incluso la formalina
histológica amortiguada, a veces es necesario recuperar el
tejido a partir de un bloque de cera. Ésta es la directriz
de rutina en algunas instituciones de diagnóstico, es decir,
conformar todo en bloques en cera, lo cual se aplica en es-
pecial a las muestras pequeñas, un tratamiento en particular
inapropiado para la muestra de ME con el fin de no poner
en peligro el examen con la microscopia de luz.
El tratamiento bastante radical con xileno y cera calien-
tes daña de modo inevitable algunas ultraestructuras, pero
ciertos componentes de la célula pueden sobrevivir en la
cera: desmosomas, tonofibrillas, miofilamentos, filamentos
intermedios, luces, gránulos de Birbeck, gránulos neuroen-
docrinos y melanosomas. Ciertas estructuras exclusiva-
mente membranosas, como el retículo endoplásmico liso y
la mitocondria, suelen preservarse mal, pero algunas mem-
branas del plasma se pueden conservar o delinear bien y
así reconocerse. Una variación en la recuperación de cera
es el método llamado “pop-off”, en el cual una sección de
H-E se puede procesar para la microscopia electrónica, so-
metida al osmio, deshidratada e infiltrada con resina sobre
el portaobjetos de cristal. La muestra se puede entonces
tratar (“popped-off”) en un molde convencional con resi-
na epóxica para el corte ultrafino subsiguiente (véase la
sección de Lecturas adicionales). Esta técnica se puede
48 CAP. 5 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA
también aplicar a los frotis, pero es exigente desde el punto
de vista técnico.
El tejido secado o congelado sin agentes criopreserva-
dores, o dejado durante la noche antes de la fijación, pue-
de ser inútil para la ME (con la salvedad de que ciertos
microorganismos pueden sobrevivir; véase la fig. 5-7b).
Sin embargo, el tejido crioprotegido, que se congela y des-
pués se descongela, puede suministrar buenos resultados
ultraestructurales. Muchas otras muestras pueden o nece-
sitan fijarse en glutaraldehído. Los especímenes de sangre
periférica, semen, de cepillados nasales y bronquiales y los
fragmentos pequeños de tejido que pueden verse en una
muestra aspirada con aguja fina en una jeringa se fijan con
facilidad, desde el punto de vista del proceso, se trate de
glutaraldehído o formalina. Algunas muestras no necesitan
fijarse. El síndrome de Hermansky-Pudlak, una afección
compleja que implica disfunción plaquetaria, puede de-
mostrarse tan sólo al secar una preparación de la plaqueta
en una rejilla revestida con película y examinarla de forma
directa en el microscopio electrónico para reconocer los
gránulos distintivos y el número de gránulos anormales
(véase fig. 5-9d).
Preliminares para examinar cortes ultrafinos
En la histopatología tisular, rara vez se realiza la ME sin te-
ner en cuenta otras fuentes de información diagnóstica. El
patólogo necesita disponer de toda la información clínica
apropiada, conocer los aspectos histológicos detallados de
la lesión y, en el caso de tumores, contar con los hallazgos
inmunohistoquímicos a la mano cuando se efectúa la ME.
La idea de ejecutar la ME antes de la inmunohistoquími-
ca para eliminar inmunotinciones innecesarias puede ser
útil y tal vez lógica, pero carece al parecer de aceptación
general.
Es usual realizar la ultramicrotomía con cortes “semifi-
nos”. Por lo general, éstos son de 1 a 2 µm de espesor, se
tiñen con azul de toluidina o una tinción similar y se exami-
nan en el microscopio de luz. Las muestras confirman que
el tejido posee una morfología comparable a la obtenida con
H-E o que las células son las esperadas a la luz del antece-
dente clínico cuando no hay muestras con H-E de una con-
traparte sólida del tejido (p. ej., en un espécimen de líquido
corporal). Con este procedimiento pueden evitarse los focos
indeseados de colágena o necrosis hallados a menudo en los
tumores. Por último, los cortes semifinos pueden suministrar
información sobre la calidad de la conservación del tejido.
La tinción pálida de células y núcleos indica casi siempre
una buena preservación, mientras que los núcleos delinea-
dos de forma aguda con espacios interiores claros sue-
len señalar una pobre conservación (Eyden, 2002). Por lo
tanto, en la investigación de un tumor los cortes semifinos
de varios bloques deben dividirse y el más apropiado se eli-
ge con base en el contenido celular del tumor y la calidad
de la preservación. En lesiones complejas es deseable cortar
muestras ultrafinas a partir de los bloques que representen a
todas las áreas histológicamente diferentes.
Al asegurar la selección apropiada para ultramicroto-
mía, el patólogo o bien el científico examinan los cortes ul-
trafinos para las estructuras celulares o los componentes
de la matriz considerados como característicos o especí-
ficos de ciertos padecimientos. La identificación de estas
estructuras depende de una interpretación detallada de la
ultraestructura de la célula y el tejido, así como de un cono-
cimiento de las características ultraestructurales de las en-
fermedades específicas: ésta es una experiencia que tiende
a acumularse a través de los años. Cuando los científicos
clínicos o los biomédicos examinan cortes ultrafinos bajo la
instrucción de patólogos, son esenciales el enlace y la co-
municación cercanos entre estas partes, como sucede en
el Reino Unido. En el trabajo arduo de un tumor complejo
las ideas diagnósticas pueden cambiar en el curso de pocos
días a medida que las inmunotinciones se hallan disponibles.
Aplicaciones de la microscopia
electrónica de transmisión
Tumores
En el diagnóstico de una tumoración, la caracterización
acertada de la neoplasia depende del hallazgo de las es-
tructuras distintivas de la célula o la matriz. Debe determi-
narse si son iguales o no respecto de las encontradas en la
“célula normal correspondiente”. En tal caso, por ejemplo,
un carcinoide intestinal se puede diagnosticar por los grá-
nulos neuroendocrinos hallados en las células enteroendo-
crinas normales (fig. 5-2); un carcinoma mamario por los
desmosomas, tonofibrillas, lámina basal, luces y gránu-
los de mucígeno (figs. 5-3a y 5-5), como en el epitelio nor-
mal de la mama, y un melanoma maligno por el hallazgo de
los melanosomas típicos de los melanocitos normales (fig.
5-3b). Esto no significa que estos procesos malignos se ori-
ginen a partir de esas células normales diferenciadas; más
bien se piensa que proceden de las células embrionarias
diferenciadas de forma más primitiva. Una amplia variedad
de tumores se puede identificar con base en su ultraestruc-
tura distintiva o específica (cuadro 5-1). Los ejemplos de
los organelos específicos útiles en el diagnóstico del tumor
se muestran en las figuras 5-2 a 5-5.
Hay obstáculos en el diagnóstico ultraestructural de los
tumores. Desde luego, muchos tumores pierden las propie-
dades esperadas y se vuelven menos diferenciables. En un
protocolo de revisión típico se examina de forma cuidadosa
un bloque (una rejilla de cortes ultrafinos) por una hora. No
 APLICACIONES DE LA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN 49

Figura 5-2 a) Célula normal enteroendocrina del intestino delgado humano normal. Las inclusiones muy electrodensas cerca del polo
basal de la célula (*) son gránulos neuroendocrinos que contienen hormonas. Obsérvense los gránulos redondeados y en forma de barra
(8 700 ⫻). b) Tumor carcinoide del intestino delgado (hace metástasis a un ganglio linfático mesentérico). Nótese la misma clase de
morfología del gránulo neuroendocrino (60 700 ⫻).

obstante, los tumores con grados decrecientes de diferen-
ciación pueden ameritar una valoración más extensa (va-
rias horas y múltiples bloques, según sean la percepción del
patólogo, la necesidad clínica, el resultado del diagnóstico,
etc.). Como complicación adicional, los tumores pueden
también expresar características inesperadas y mostrar así
una diferenciación “divergente” o “anómala”. Por lo tanto,
el clínico debe tener un conocimiento de estas propiedades
tumorales a partir de la experiencia personal y bibliográfi-
ca. No obstante, la ME es de un valor mayor respecto de la
sección H-E, en la cual los tumores aparecen apenas dife-
renciados y revelan casi siempre una inmunotinción tenue
o negativa para los marcadores previstos; en consecuencia,
la confirmación inmunohistoquímica de un diagnóstico con
H-E puede ser incompleta. La ME es también en extremo
importante cuando la inmunotinción no puede reconocer un
fenotipo definido con claridad, sea por la especificidad in-
cierta del anticuerpo, la incertidumbre interna si la tinción
es levemente positiva o negativa o una tinción inesperada
(“aberrante”). Por ejemplo, las variantes del melanoma, el
linfoma y el sarcoma malignos son tales que se tiñen de
modo positivo el filamento epitelial intermedio y la citoque-
ratina y, en consecuencia, puede ser necesaria la investiga-
ción ultraestructural para dilucidar la diferenciación.
Es importante considerar la posibilidad de encontrar cé-
lulas no neoplásicas en el tejido tumoral. En la bibliografía
se notifican micrografías de células y pericitos endotelia-
les en paredes vasculares, malinterpretados como células
tumorales. Deben también distinguirse como no neo-
plásicas las células de los tejidos normales invadidos por
el tumor o las células normales del tejido que se regeneran
(p. ej., células estriadas del músculo), además de las célu-
las inflamatorias o reactivas (p. ej., macrófagos, linfocitos,
células del plasma, miofibroblastos). Estas células tienden
a diferenciarse bien y se deben observar con sospecha, en
particular si se localizaron en un tumor de escasa diferen-
ciación.
Aunque cualquier tumor que demuestre cierta incerti-
dumbre por microscopia de luz merece la valoración por
ME, la técnica ha demostrado utilidad particular en un
buen número de grupos tumorales (tumores “anaplásicos”
epitelioides de células redondas; tumores de células redon-
das pequeñas; tumores de células falciformes, y la extensa
categoría de lesiones mesenquimatosas o del tejido blando,
incluidos los sarcomas). Uno de estos últimos lo repre-
sentan las neoplasias fibroblásticas y puede esperarse que
muestren poca inmunopositividad, con excepción de la vi-
mentina, un marcador bastante inespecífico. La microscopia
electrónica puede también ayudar a sugerir el sitio prima-
rio de una masa metastásica, mientras que en los tumores
del sistema nervioso central la identificación de las ca-
racterísticas de tumoraciones meníngeas, schwannomas y
50 CAP. 5 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA

Figura 5-3 Sistemas membranosos intracitoplásmicos 1. a) Gránulos de mucígeno en un carcinoma ductal de mama. Tienen un centro denso
proteináceo en un espacio claro. En concordancia con su naturaleza exocrina, se encuentran a menudo cerca de la luz, en la cual descargan
su contenido (24 000 ⫻). b) Los melanosomas constituyen el sello ultraestructural para la diferenciación melanocítica. Este melanosoma es
un melanoma maligno de células fusiformes sin pigmento y se encuentra libremente en la matriz citoplásmica (98 000 ⫻). Los melanosomas
múltiples dentro de un lisosoma secundario (un melanosoma compuesto) son evidencia de la digestión de melanosomas sometidos a exoci-
tosis y se encuentran a menudo dentro de macrófagos o fibroblastos. c) Los lisosomas son marcadores de macrófagos pero muchos tumores
(“tumores de células granulares”) pueden mostrar lisosomas secundarios abundantes. Esta figura delinea lisosomas secundarios en un tumor
estrómico gastrointestinal (36 000 ⫻). d) Gránulo de Birbeck en una granulomatosis de las células de Langerhans (69 000 ⫻).
 APLICACIONES DE LA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN 51

Figura 5-4 Sistemas membranosos intracitoplásmicos 2. Adenoma negro de la corteza suprarrenal en un paciente con síndrome de Cushing.
El fenotipo esteroidogénico consiste en lípido (a), retículo endoplásmico liso (* en b) y mitocondria con crestas tubulares (véase la mitocon-
dria gigante en b), y se encuentra sobre todo en las células de Leydig, células hiliares y tumores adrenocorticales. La lipofuscina es también
común en estos tumores y a ella se atribuye la pigmentación en este tumor. Nótense también los apilados cortos del retículo endoplásmico
rugoso (a, 10 000 ⫻; b, 30 000 ⫻).

cánceres neuronales, gliales o ependimarios por ME es im-
portante para el neuropatólogo, puesto que la inmunohisto-
química tiene un valor limitado para discriminar entre estos
tumores (Cameron y Toner, 1998; Al-Sarraj et al., 2001).
Por último, no debe subestimarse el valor de la ME
en la confirmación simple de un diagnóstico sospechoso.
Diagnosticar una lesión no es una edición en blanco y ne-
gro: los patólogos efectúan diagnósticos con cierto grado
de seguridad y éstos pueden incrementarse por hallazgos
ultraestructurales.
Enfermedad no neoplásica
En la actualidad, la ME aplicada a la enfermedad no neoplá-
sica está quizás en una posición más segura que la ME apli-
cada a los tumores, ya que en la patología oncológica las
técnicas inmunohistoquímicas y moleculares se apropiaron
del territorio ultraestructural. Mientras que en el diagnós-
tico del tumor el objetivo primario es a menudo la de-
terminación de la diferenciación celular de la masa, en la
enfermedad no neoplásica hay muchas aplicaciones en las
cuales se pueden identificar las múltiples formas del cam-
bio estructural dentro de un solo organelo, célula o tejido
(cilio, epitelio glomerular, célula del músculo estriado, ner-
vio periférico), que son indicativas de diversas afecciones.
Por lo tanto, en esta área la ME puede tener un papel más
crítico y quizás se dependa menos de la inmunohistoquími-
ca y la biología molecular. Las figuras 5-6 a 5-9 incluyen
ejemplos de la ME diagnóstica aplicada a la enfermedad no
neoplásica. Puntos similares del procedimiento son válidos
para examinar la enfermedad no neoplásica si el objetivo
es confirmar la presencia de células afectadas y su calidad
de conservación a partir de cortes semifinos, como en los
tumores. No obstante, muchas enfermedades no neoplá-
sicas se estudian a partir de líquidos y es preciso llevar a
cabo una valoración de las células esperables en los cortes
semifinos con base en el antecedente clínico.
La ME tuvo por mucho tiempo un valor en la identifi-
cación de microorganismos. Entre los más significativos en
clínica respecto de la incidencia numérica están los virus,
los cuales se identifican por tradición mediante la técnica
rápida y precisa de la tinción negativa (véase el cap. 18
para revisar más detalles). La ME puede reconocer otros
agentes patógenos microscópicos o detalles de su estructu-
ra, entre ellos bacterias como las espiroquetas (fig. 5-7a),
protozoarios como Cryptosporidium, microsporidios y
Leishmania (en el sida) y hongos como Candida y Pneu-
mocystis (fig. 5-7b).
52 CAP. 5 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA

Figura 5-5 Características ci-

toesqueléticas y superficiales.
a) Las tonofibrillas son la con-
traparte ultraestructural de in-
munotinción con citoqueratina
que pueden ayudar a reconocer
la diferenciación epitelial en los
tumores. Las tonofibrillas se po-
nen a menudo en contacto con
los desmosomas y promueven
de tal modo la cohesión celular,
una característica típica de los
carcinomas. Carcinoma celular
escamoso seudoangiosarcoma-
toso (31 900 ⫻). b) El desmo-
soma es la unión intercelular
más importante para identificar
la diferenciación epitelial. Tiene
placas submembranosas, una “línea intermedia” en el espacio entre las membranas opuestas del plasma, y las tonofibrillas adhieren
las placas al citoesqueleto perinuclear. Mesotelioma epitelial (99 000 ⫻). c) La lámina es una capa distintiva de células como el epitelio,
el endotelio, las células de Schwann y las perineuriales, los adipocitos y las células del músculo. Carece de fibroblastos, miofibroblastos,
condroblastos, osteoblastos y neuronas, y por tanto tiene importancia diagnóstica. En este schwannoma benigno, las capas múltiples
de lámina rodean a los procesos de la célula (30 000 ⫻). d) Los miofilamentos del músculo liso con sus densidades focales distintivas
son marcadores importantes de la diferenciación celular del músculo liso. También se reconocen en células mioepiteliales, pericitos,
miofibroblastos y células intersticiales de Cajal, y sus tumores. Obsérvense los miofilamentos más finos (flecha) en contraste con los
filamentos más gruesos de la citoqueratina que forman tonofibrillas en este carcinoma escamoso de células fusiformes (20 100 ⫻).
 APLICACIONES DE LA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN 53

Figura 5-6 Microscopia electrónica de una enfermedad no neoplásica: patología tisular. a, b) Glomerulonefritis membranosa. a) Depósitos in-
munitarios después de la microscopia de luz e inmunofluorescencia mediante un anticuerpo anti-IgG marcado con fluoresceína. b) Micrografía
electrónica de transmisión correspondiente a tejido fijado en glutaraldehído que demuestra los depósitos inmunitarios subepiteliales (flechas)
de una organización discreta que refleja la microscopia de luz. Nótese el engrosamiento de la membrana basal y la pérdida de las proyeccio-
nes de apoyo del podocito (25 000 ⫻). Fotografías cortesía del Dr. Alan Curry. c) Miopatía de bastones de nemalina en una mujer de 15 años.
La presentación clínica incluyó retraso en la motricidad, deambulación sobre los dedos del pie, caídas frecuentes y dolores de pierna después
del ejercicio. El bastón de nemalina es denso, demuestra las estriaciones transversales y se considera una anormalidad del disco Z. Los discos Z
normales y los sarcómeros se muestran para fines de comparación (60 000 ⫻). Fotografía cortesía del Dr. Liz Curtis. d) Síndrome de discinesia
ciliar primaria. Obsérvese la ausencia de brazos de dineína de los dobletes periféricos (160 000 ⫻). Fotografía cortesía de Ann Dewar.
54 CAP. 5 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA

Figura 5-7 Microscopia electrónica de una enfermedad no neoplásica: microorganismos infecciosos. a) Espiroquetosis en una biopsia
de intestino grueso (8 800 ⫻). b) Pneumocystis recuperado de la necropsia de tejido pulmonar. De forma inadvertida, este tejido se dejó
toda la noche sin fijación. Por lo tanto, aunque su mayor parte se preservó mal (según se esperaba), los agentes patógenos aún son
identificables por sus perfiles curvos distintivos. Aquí, el aspecto en un paciente inmunocomprometido con cáncer sugiere una infección
oportunista (7 500 ⫻).

La distinción entre el diagnóstico, por un lado, y el de-
sarrollo de la investigación tecnológica, por otro, es a veces
imprecisa y la ME posee una función en tal desarrollo. Tie-
ne utilidad, por ejemplo, en la determinación de la calidad
de la conservación estructural de los ovocitos en la corte-
za del ovario extirpado y criopreservado in vitro en las
mujeres jóvenes con cáncer durante la quimioterapia. El
diagnóstico prenatal se puede realizar a partir de las células
obtenidas del líquido amniótico (Cameron y Toner, 1998),
al tiempo que existe un interés cada vez mayor en la carac-
terización ultraestructural de las células embrionarias en el
campo emergente de la ingeniería tisular.
de la enfermedad. Son sin duda de un valor potencial en la
investigación y debe recordarse que los hallazgos de la in-
vestigación son en ocasiones precursores de pruebas diag-
nósticas. Estas técnicas suelen encontrarse en laboratorios
que efectúan también trabajos de investigación; en estos cen-
tros, la investigación genera experiencia con la técnica y se
dispone de personal con entrenamiento y experiencia en la
técnica para aplicar el procedimiento a casos diagnósticos
raros (véase la sección de Lecturas adicionales).
Microscopia electrónica de barrido (MEB)

La MEB suministra información tridimensional, en parti-

Técnicas y procedimientos especializados
El cuadro 5-3 enumera las técnicas señaladas como “es-
pecializadas” y que no se utilizan de modo tan amplio en
los laboratorios de diagnóstico como la MET, por lo cual
tienen pocas aplicaciones diagnósticas reales. En muchos
casos, las imágenes de estas técnicas confirman un diagnós-
tico bastante seguro que se basa sobre todo en resultados
clínicos e histopatológicos; empero, muchas veces ofre-
cen nuevos detalles que pueden mejorar la comprensión
cular de las características superficiales y, en consecuencia,
las imágenes son a menudo más fáciles de interpretar (fig.
5-8a) en comparación con las de la MET, en las cuales es
necesario extrapolar una interpretación a partir de cortes fi-
nos y es posible una interpretación difícil debido a la orien-
tación subóptima. Por lo general, el tejido se fija como en
la MET, pero al final de la fase de deshidratación el etanol
se sustituye por dióxido de carbono líquido, casi siempre
bajo presión en un secador de punto crítico. En el punto
crítico, el líquido y el dióxido de carbono gaseoso forman
 TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS ESPECIALIZADOS 55

Figura 5-8 Técnicas especiales 1. a) Microscopia electrónica de barrido. Eje del pelo humano. El paciente se valoró por cabello retor-
cido, afección en la cual el eje del cabello se tuerce y es frágil, pero el análisis de MEB indicó tricorrexis nudosa, con supuesto daño se-
cundario al traumatismo mecánico o químico (830 ⫻). b) Microscopia inmunoelectrónica. MET de doble tinción de la región mesangial
de un glomérulo de un individuo con nefropatía mesangial por IgA que demuestra doble inmunolocalización de colágena de tipo IV (10
nm de oro) dentro de la matriz e IgA mesangiales (20 nm de oro) dentro del depósito electrodenso (33 000 ⫻). Micrografías cortesía del
Dr. Jill Moss y Ian Shore.

una serie continua, que permite el secado del espécimen
de una manera que evita las distorsiones de la célula y la
estructura del tejido que de otra manera se presentarían con
el secado convencional. El espécimen seco se cubre enton-
ces con una capa delgada del metal evaporado (oro, pala-
dio, platino o cromo), que ayuda a eliminar la acumulación
de la carga durante la exposición al haz electrónico. El te-
jido, fijado habitualmente a una base metálica (un trozo), se
encuentra entonces listo para colocarse en el microscopio
electrónico de barrido. En contraste con el haz incidente en
la MET, el haz electrónico en la MEB se aplica al espéci-
men como rastreador. Esto da lugar a la emisión de electro-
nes secundarios, que recolecta un detector de electrones y
los convierte en una imagen observable en un tubo de rayos
catódicos. Además del contorno y el detalle superficiales,
los microscopios electrónicos de barrido ofrecen la ventaja
de suministrar una ampliación más baja (10 o 100 veces)
comparada con las técnicas tradicionales disponibles para
la MET y por tanto se pueden utilizar para los especímenes
patológicos completos.
Las aplicaciones diagnósticas de la MEB son limitadas.
Incluyen la valoración del cabello humano (fig. 5-8a) y la
identificación de las partículas respiratorias, en especial las
fibras de asbesto, que se pueden también estudiar por micro-
análisis con rayos X para identificar la composición química
o elemental. Los resultados pueden tener relevancia legal
respecto de la exposición industrial (Ingram et al., 1989).
La capacidad exigida para distinguir las células B
y T y el mesotelioma y el adenocarcinoma a partir de
la morfología diferenciada de la superficie celular no se
ha explotado de manera extensa en la práctica de rutina.
En el cuadro 5-4 se dan algunos de los múltiples ejemplos
de la MEB aplicada a las células y tejidos humanos que han
contribuido con datos para la comprensión de la enfermedad
sin conducir a la creación de pruebas diagnósticas.
Microscopia inmunoelectrónica
La microscopia inmunoelectrónica (inmunomarcación ul-
traestructural) proporciona de manera simultánea los datos
56 CAP. 5 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA

Figura 5-9 Técnicas especiales 2. Histoquímica ultraestructural. a) Procedimiento de uranafina para los gránulos neuroendocrinos en
un carcinoma mucoide de mama (25 700 ⫻). b) La tinción de Grimelius para ME distingue los gránulos neuroendocrinos de los gránulos
de secreción láctica en un carcinoma anficrino de mama (39 600 ⫻). c) Tinción de Warthin-Starry modificada para que la ME demuestre
la melanina en un melanoma maligno (45 000 ⫻). d) Plaquetas enteras, desmontadas y sin teñir en una rejilla revestida con Formvar. El
paciente tenía una anomalía similar al síndrome de Hermansky-Pudlak secundario a una enfermedad mielodisplásica. Los gránulos (fle-
chas) son ricos en calcio, que proporciona densidad electrónica inherente. La cuenta de los gránulos fue de 3.8 por plaqueta (valor nor-
mal, 5.3). Obsérvense los gránulos densos en una plaqueta y la ausencia en la plaqueta adyacente y un gránulo con “colas” (17 700 ⫻).
Micrografías cortesía de Bart E. Wagner.
 TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS ESPECIALIZADOS 57

Cuadro 5-4 Aplicaciones de la MEB en material morfológicos de la MET convencional y la información

clínico humano sobre la composición biomolecular, como en la inmunohis-
toquímica microscópica de luz. Los datos de la microscopia
• Fibras de asbesto y otras partículas respiratorias inmunoelectrónica, como los de la MEB, son casi siempre
• Distingue las células B y T a través de la morfología confirmatorios o se suman a la comprensión científica de
de la superficie celular un padecimiento clínico; empero, el potencial de la técnica
• Microvellosidades mesoteliales y adenocarcinomatosas para confirmar un diagnóstico, al eliminar incertidumbre
• Anormalidades de espermatozoides de interpretación y acentuar la probabilidad de un diagnós-
• Urotelio y carcinoma urotelial tico, es muy grande. Pero, en la práctica, los requerimientos
• Hiperplasia endometrial
de personal y financiamiento para la ME comprometen el
• Hiperplasia prostática benigna y cristales intraluminales
uso de la microscopia inmunoelectrónica diagnóstica, que
en carcinoma prostático
• Papilas renales/conductos de Bellini también exige más atención para su práctica. La gama de
• Superficies esofágicas e intestinales proteínas identificables en material clínico con la micros-
• Giardia lamblia en la superficie duodenal copia inmunoelectrónica se resume en el cuadro 5-5.
• Espiroquetosis Una de las formas más simples de microscopia inmuno-
• Cryptosporidium electrónica se observa al desparafinar y procesar una mues-
• Enfermedad de Crohn tra teñida por medios de microscopia inmunohistoquímica
• Apendicitis aguda a partir de un portaobjetos de cristal. Esto representa un
• Tejidos y células sinoviales en artritis reumatoide desafío técnico y tiende a ofrecer una preservación estruc-
y gota tural mala. Algunas veces también, al identificar la inmu-
• Cristales de pirofosfato de calcio en cartílago y tejido
notinción, que es densa en electrones como resultado de la
del menisco
• Mitocondria en oncocitos
exposición al tetraóxido de osmio, puede ser menos que
• Superficies de la célula leucémica (célula del cabello) clara. Las mejores técnicas utilizan un anticuerpo especí-
fico marcado con partículas de oro coloidal. Las partículas

Cuadro 5-5 Aplicaciones de la microscopia inmunoelectrónica en anormalidades

clínicas y patológicas

• Contenido hormonal en los gránulos neuroendocrinos en los tumores

• Depósitos de inmunoglobulinas y complemento en las células plasmáticas, linfoma, enfermedad renal y queratopatía cristaloide;
amiloide en plasmacitoma
• Proteínas citoesqueléticas (actina del músculo liso, actinina alfa, citoqueratina, vimentina, desmina y neurofilamento proteínico)
en células no neoplásicas y tumorales
• Fibronectina en la superficie de los miofibroblastos
• Laminina y colágena tipo IV en membranas basales
• Moléculas de adhesión intercelular (p. ej., ICAM-1, CD44) en células reactivas y neoplásicas
• Moléculas de superficie celular (CD4, CD8, CD56) en enfermedad de injerto contra huésped aguda
• El vasopresor y la proteína vasoconstrictora, endotelina 1, en glándula suprarrenal
• La diferenciación del antígeno, receptor de la urocinasa, en neutrófilos
• La proteína antiapoptósica, BCL2, en tumores tiroideos
• Factor de von Willebrand en cuerpos de Weibel-Palade en el endotelio
• Lisozimas y mucinas en lesiones epiteliales glandulares
• Lactoferrina y lisozima en leucemia mielomonocítica
• Mieloperoxidasa en leucemia mieloide
• Proteína cristalina de Charcot-Leyden (lisofosfolipasa) en basófilos
• Catepsina D en lisosomas en las células vasculares del músculo liso en anastomosis arteriovenosas
• Sintasa del óxido nítrico en la vesícula seminal humana
• Rotavirus en extractos fecales humanos
58 CAP. 5 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA
de oro son en su mayor parte de 5, 10 o 20 nm de diámetro
y, una vez localizadas en los cortes del tejido, se identifican
con facilidad en la pantalla del microscopio electrónico por
su contorno agudo, que también facilita el enfoque y la fo-
tografía (fig. 5-8b).
Es preciso tener precaución al aprovecharla para mejo-
rar la conservación del antígeno. Las proteínas varían en
grado considerable en la conservación de su inmunorreac-
tividad y, por lo tanto, en el grado al cual pueden demos-
trarse por microscopia inmunoelectrónica. El tejido que
acaba de obtenerse ha de fijarse en una solución de reciente
preparación de paraformaldehído. Aunque el tejido pueda
recuperarse del espécimen histológico principal, muchos
antígenos sobreviven en la formalina histológica. Los
fijadores de metal pesado no se usan para evitar la desna-
turalización adicional de la proteína, y a menudo la deshi-
dratación no se lleva a cabo con un etanol de más de 70%
antes de la impregnación en una resina hidrófila como LR
White®. Luego, la muestra se somete a una polimerización
térmica mínima antes de la sección de los cortes ultrafinos
y la aplicación de los reactivos apropiados que soportan el
oro. Lowicryl® es una resina hidrófila alternativa de cierta
demanda que proporciona conservación ultraestructural
superior; este agente, dado que es una resina hidrófila a
baja temperatura, conserva mejor al antígeno. La forma
más exigente de la microscopia inmunoelectrónica utili-
za los cortes ultrafinos congelados (crioultramicrotomía).
La microscopia inmunoelectrónica se puede también reali-
zar en cortes ultrafinos a partir de tejido impregnado en re-
sina epóxica procesado de modo convencional para MET,
a menudo con el uso de reactivos que develen la resina y
expongan sitios antigénicos.
Histoquímica ultraestructural
La histoquímica ultraestructural (histoquímica electrónica)
es análoga a la histoquímica de la microscopia de luz típica,
pero proporciona información sobre la naturaleza química o
bioquímica de células y tejidos en el plano ultraestructural.
Para ello, las técnicas requieren un marcador electrodenso,
las más de las veces un compuesto que contiene los átomos
del metal que dispersa a los electrones. Se ha identificado
una amplia gama de sustancias en las células y los tejidos,
incluidas las enzimas, mediante histoquímica ultraestructu-
ral (cuadro 5-6). Como en la microscopia inmunoelectróni-
ca, los estudios publicados que identifican estas sustancias
se sitúan en el campo de la investigación, en vez de tener
un valor real en la histopatología diagnóstica. Sin embar-
go, como en el caso de la microscopia inmunoelectrónica,
los individuos o los laboratorios con intereses, experiencia
o líneas de investigación tal vez encuentren aplicaciones
diagnósticas para estas técnicas.
Cuadro 5-6 Histoquímica ultraestructural: aplicaciones
en material clínico
• Reacción de uranafina (acetato de uranilo) para gránulos
neuroendocrinos
• Acetato de uranilo modificado-citrato de plomo para la
tinción selectiva de ácidos nucleicos
• Tinción de Grimelius (tinción con plata) para gránulos
neuroendocrinos
• Técnica de Warthin-Starry para la melanina
• Reacción L-DOPA modificada para ME y tirosinasa
y melanosomas
• Peroxidasa plaquetaria en el diagnóstico diferencial
de leucemias
• Ácido fosfotúngstico etanólico para sinapsis
• Procedimiento de ferrocianuro de osmio-potasio para
glucógeno
• Imidazol-tetraóxido de osmio amortiguado para lípidos
• Fosfatasa ácida para lisosomas (p. ej., en linfocitos
granulares grandes)
• Rojo de rutenio, azul cuprolínico, metenamina de plata,
diamina de hierro para porciones de polisacáridos
La práctica de las técnicas varía en grado considera-
ble, según sea la sustancia que se revela. Para las enzimas,
como la peroxidasa plaquetaria, pueden requerirse fijado-
res especializados (p. ej., uno que contenga ácido tánico,
formaldehído y una concentración baja de glutaraldehí-
do). Para el glucógeno, el fijador tetraóxido de osmio se
puede modificar con la adición de ferrocianuro de potasio,
mientras que para los lípidos, que se pierden durante el
procesamiento de MET típico, puede emplearse una so-
lución de imidazol-tetraóxido de osmio amortiguada. Por
el contrario, en la reacción de uranafina para los gránulos
neuroendocrinos (fig. 5-9a) es preferible el glutaraldehído
a la formalina histológica, puesto que las moléculas pue-
den perderse del tejido recuperado a partir de la formalina,
lo que genera una reacción débil.
El procedimiento con uranafina es una tinción útil de
la ME para los gránulos neuroendocrinos, dado que éstos
muestran heterogeneidad ultraestructural y pueden algunas
veces ser difíciles de distinguir de los lisosomas primarios,
gránulos pequeños de secreción láctica y gránulos peque-
ños serosos. La técnica se basa en la hipótesis según la cual
el centro granular neuroendocrino consiste en un complejo
de hormonas, proteínas y nucleótidos (Payne, 1993). Las
cargas negativas de los últimos se unen a los iones uranilo
de carga positiva para proporcionar electrodensidad. Todo
el fosfato libre debe eliminarse después de la fijación con
aldehído, antes que el tejido pase a la solución concentrada
de acetato de uranilo (hasta por dos días) y no debe usar-
se ninguna otra tinción que confiera electrodensidad. Los
 RECONOCIMIENTOS
ribosomas y la cromatina nuclear, en virtud de su conteni-
do de nucleótidos, pueden actuar como controles internos
positivos. Las técnicas de tinción con plata en el plano ul-
traestructural están también disponibles para gránulos neu-
roendocrinos y melanina (fig. 5-9b, c).
Microanálisis con rayos X y difracción electrónica
Una de las interacciones de los electrones con átomos de
un espécimen físico conduce a una reconfiguración de los
niveles energéticos en las órbitas del electrón alrededor de
los átomos, con la consecuente emisión de rayos X. Éstos
son característicos del número atómico y por tanto esta-
blecen la naturaleza química elemental del material bajo
investigación. Una variedad de elementos con importancia
clínica se puede identificar mediante esta técnica; los más
importantes son las partículas respiratorias, incluidas las
diversas formas de la fibra de asbesto (Ingram et al, 1989;
Cameron y Toner, 1998). Con frecuencia puede ser necesa-
rio digerir el tejido para liberar las fibras para el análisis.
La técnica de difracción electrónica puede ser útil para
demostrar una periodicidad y por consiguiente la naturaleza
cristalina dentro de un objeto expuesto a electrones, como
un resultado en el cual se observan los patrones de difrac-
ción, que consisten en puntos de alta intensidad dispuestos
con precisión en el espacio. Esta información puede discri-
minar sustancias de composición química diferente.
Fractura y delineado por congelación
En la técnica de fractura y delineado por congelación, el
tejido se congela con rapidez y después se fractura por
impacto con un borde agudo dentro de un instrumento es-
pecíficamente diseñado y disponible en el comercio. La
fractura plana pasa a través de sistemas membranosos y
proporciona una superficie para la observación posterior del
sombreado metálico. El sombreado puede retardarse des-
pués del delineado, para revelar áreas más grandes de
superficies reales de la membrana además de superficies
membranosas hendidas. No existen aplicaciones diagnós-
ticas reales, pero la técnica se aplica a células y tejidos
humanos para suministrar nueva información sobre la or-
ganización de la membrana celular, por ejemplo exocitosis
de los gránulos neuroendocrinos de las células y espacios
alterados y uniones estrechas en los tumores oncocíticos de
la tiroides humana (Cochand-Priollet et al., 1998).
Resumen
Este capítulo tiene como objetivo transmitir una perspectiva
contemporánea de la microscopia electrónica en el diagnós-
59
tico de rutina en el campo de la patología. Se han delineado
algunos principios de la teoría científica de estas técnicas
ultraestructurales prácticas para facilitar la interpretación
de las imágenes micrográficas electrónicas. A pesar del de-
sarrollo continuo de nuevas técnicas, sobre todo en la in-
munohistoquímica y la biología molecular, el microscopio
electrónico aún es valioso en el diagnóstico de lesiones
problemáticas en la investigación clínica o la microscopia
de luz. Es una cuestión de experiencia directa de quienes
practican la microscopia electrónica que las lesiones se
encuentren todavía donde los hallazgos clínicos e inmu-
nohistoquímicos son contradictorios o inútiles, al grado de
establecer un diagnóstico impreciso: esto se puede, en algu-
nas circunstancias, modificar por microscopia electrónica,
incluso a pesar de la propia limitación del muestreo de la
técnica. En el campo del diagnóstico tumoral, algunas de
estas dificultades se deben a las limitaciones de la inmuno-
histoquímica, en la que hoy día confía el patólogo tumoral;
es una técnica que, a diferencia de la microscopia electró-
nica, todavía no alcanza la etapa de estabilidad tecnológica.
En el campo más grande de las anomalías no neoplásicas
—enfermedad renal y neuromuscular, microorganismos
infecciosos, enfermedades ciliares, dermatopatología, para
mencionar quizás las principales— la microscopia electró-
nica ejerce una influencia más notoria dado que es menos
dependiente de la inmunohistoquímica; en este caso, la mi-
croscopia electrónica puede identificar una multiplicidad de
cambios estructurales dentro de una célula o tejido que se
pueden relacionar con diversas enfermedades.
En gran medida, la mayoría de las aplicaciones morfo-
lógicas tiene lugar en la microscopia electrónica de trans-
misión. Sin embargo, aunque existen diversas técnicas
especializadas que han contribuido a mejorar la comprensión
de la biología estructural de la célula, tejidos y lesiones hu-
manas, se conocen pocas aplicaciones reales al diagnóstico.
Por último, la microscopia electrónica es una técnica
esencial para el análisis diagnóstico de las lesiones humanas.
En este contexto, es necesario enfatizar que mientras el aná-
lisis de la expresión del gen es fundamental para compren-
der la enfermedad, dicha comprensión sólo será completa
si se acepta que las afecciones observadas en los cortes con
H-E o los ultrafinos resultan no sólo de la expresión del gen,
sino también de actividades posgenómicas: estas actividades
pueden constatarse de modo más efectivo con las técnicas
fenotípicas, como la demostración inmunohistoquímica de
proteínas funcionales y su elaboración dentro de las estruc-
turas funcionales de la célula por microscopia electrónica.
Reconocimientos
En la preparación de este capítulo merecen un reconoci-
miento especial los colegas siguientes por su inestimable
60 CAP. 5 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA
colaboración: Dr. Alan Curry (Manchester Royal Infirma-
ry), Dr. Liz Curtis (Queen Elizabeth Hospital, Birming-
ham), Ann Dewar (Royal Brompton Hospital, Londres), Dr.
Jill Moss y Ian Shore (Charing Cross Hospital, Londres), y
Bart E. Wagner (Northern General Hospital, Sheffield), por
proporcionar los micrógrafos electrónicos; y Paul Chantry
y Elizabeth White (ambos del Christie Hospital) por trazar
la figura 5-1 y la recopilación bibliográfica de investigación
y la impresión fotográfica, respectivamente. Asimismo, es-
tamos en deuda con el Dr. Jill Moss, Dr. Alan Curry y el
profesor Peter Toner por los comentarios valiosos sobre
el manuscrito y nuestro reconocimiento a la importancia
del capítulo original del Dr. Stuart Cameron y el profesor
Peter Toner como el punto de partida para este trabajo.
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Lecturas adicionales
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edn. 2000: Springer Verlag, Heidelberg.
Erlandson RA. Diagnostic Transmission Electron Microscopy of
Human Tumors, 1994: Raven, New York.
Eyden B. Organelles in Tumor Diagnosis: an Ultrastructural
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Ghadially FN. Ultrastructural pathology of the cell and matrix,
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Griffiths G. Fine Structure Immunocytochemistry. 1993: Sprin-
ger-Verlag, Berlin.
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Hemisphere, New York.
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tron Microscopy. Elsevier Science, Amsterdam.
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vingstone, London.
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try. Principles and Practice. 1992: Oxford University Press,
Oxford.
Schröder JM. Pathology of Peripheral Nerves. 2001: Springer-
Verlag, Heidelberg.
Society of Ultrastructural Pathology Handbook Committee. Hand-
book of Diagnostic Electron Microscopy for Pathologists-in-
training. 1996: Igaku-Shoin Medical Publishers, New York
and Tokyo, in conjuction with the Society for Ultrastructural
Pathology.
Artículos especiales de revistas dedicados
a la microscopia electrónica
• Curr Diagn Pathol 2002; 8(4): contiene un minisimposio sobre
microscopia electrónica de diagnóstico.
• Semin Diagn Pathol 2002; 20(1): se dedica a la microscopia
electrónica de tumores.
• Hum Pathol 1998; 29(12): contiene un simposio de la micros-
copia electrónica sobre tumores.
• Ultrastruct Pathol 1992; 16: contiene los artículos sobre técnicas
de ME especializadas, incluidas la microscopia inmunoelec-
trónica, hibridación in situ ultraestructural, técnica “pop-off” y
morfometría ultraestructural.
Artículos sobre técnicas ultraestructurales especializadas
Las técnicas y los procedimientos como los enumerados en el
cuadro 5-3 se pueden encontrar en diarios especializados, como
Ultrastruct Pathol, J Submicrosc Cytol Pathol y Med Electron
Microsc.
 6
Microscopia de luz
Brian Boullier
Introducción
El microscopio de luz apareció hace mucho tiempo, cuan-
do Hans y Zacharias Janssen crearon el primer microscopio
“compuesto”, en 1590. A diferencia de una simple lupa, el
instrumento consistía en un tubo con una lente particular
en cada extremo. Los científicos clínicos se beneficiaron de
forma subsecuente con las mejoras radicales en el diseño,
construcción y técnica del microscopio, en particular du-
rante los últimos 100 años.
El microscopio de luz compuesto es el caballo de batalla
de todo laboratorio clínico y con él se observa la mayor
parte de las muestras con la ayuda de la iluminación de
campo brillante. Sin embargo, la disponibilidad cada vez
mayor de herramientas diagnósticas, como los anticuerpos
monoclonales marcados con fluorescencia, obliga al cien-
tífico clínico a adquirir destreza con múltiples técnicas mi-
croscópicas en los años recientes.
Este capítulo introduce los conceptos básicos del dise-
ño del microscopio, explica de forma sinóptica los prin-
cipios que subyacen a los procedimientos actuales más
comunes del laboratorio clínico y discute varias áreas de apli-
cación. El lector puede consultar las referencias adiciona-
les (Bradbury y Bracegirdle, 1998; Determan y Lerpusch,
1988; Lacey, 1999) para una descripción más extensa y una
explicación más completa de cada técnica.
Diseño básico del microscopio
El más simple, el microscopio compuesto, se conforma
con dos sistemas de lentes, la lente objetivo, que forma una
imagen real de la muestra, y la ocular, la cual crea una ima-
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
gen al infinito que puede observar el operador. La amplia-
ción total es el producto de la magnificación de estos dos
grupos de lentes. En la práctica, el microscopio típico de
laboratorio contiene de forma adicional grupos de lentes,
prismas y divisores de la imagen, lo cual puede o no afec-
tar la ampliación total, pero en forma invariable mejora el
funcionamiento óptico del instrumento o la conveniencia
de operación, por ejemplo, al inclinar los oculares hacia el
operador.
El funcionamiento del microscopio se describe de modo
más correcto en términos de poder de resolución (la capa-
cidad del microscopio para distinguir dos puntos separados
por una distancia diminuta). En el mejor de los casos, el ojo
humano puede resolver sin ayuda dos puntos tan próximos
como 150 µm uno del otro. El límite de la longitud de onda
de la luz visible y la abertura numérica de las lentes del mi-
croscopio se combinan para precisar la resolución teórica
máxima del microscopio de luz a 0.22 µm, al margen de la
ampliación máxima.
Casi todos los microscopios modernos son modulares
en su construcción. Esto ofrece varios beneficios para el
usuario, incluida la facilidad para ampliar las capacidades
del microscopio y satisfacer demandas futuras. Lo más
importante es tal vez que el presupuesto inicial incline la
compra por la obtención de la más alta calidad óptica posi-
ble; después de todo, un microscopio completo es tan bue-
no como la calidad de sus sistemas de lentes. Las mejoras
futuras pueden incluir fuentes alternativas de iluminación
y sistemas ópticos accesorios o quizá la adición de una
computadora personal, programas y cámara digital fija o
de video (la integración de computadoras personales con
los microscopios ópticos facilita la optimización automa-
tizada de los ajustes del microscopio y la obtención de la
62 CAP. 6 MICROSCOPIA DE LUZ
Figura 6-1 Corte transversal de un microscopio típico de laboratorio (cortesía de Leica UK Ltd).
imagen conveniente, además del almacenamiento de datos
y el análisis de imágenes de gran alcance).
La figura 6-1 ilustra las partes principales del micros-
copio típico de laboratorio. Varias partes merecen explica-
ción: las lentes objetivo, los oculares, el condensador, el
diafragma de campo y la(s) fuente(s) de luz.
Las lentes objetivo son la parte más importante del mi-
croscopio, dado que determinan las diversas ampliaciones
posibles y definen la calidad óptica alcanzable. De manera
característica, las lentes objetivo de 10, 40 y 100 ⫻ están
sujetas a una torreta giratoria. Esto ofrece ampliaciones to-
tales de 100, 400 y 1 000 ⫻, respectivamente, cuando se
usan oculares de 10 ⫻.
Las propiedades de cada lente objetivo están casi siem-
pre inscritas sobre el cañón de la lente. Las marcas inclu-
yen lo siguiente:
• Nombre del fabricante.
• “Floutar”, “Fluor”, “Neofluar” o “UV”, lo cual significa
que la lente transmite luz ultravioleta y por lo tanto es
conveniente para la microscopia de fluorescencia.
• “Phaco”, “Phase” o “Ph”, que indica la presencia de un
anillo de fase y que la lente es conveniente para la mi-
croscopia de contraste de fase (un número lo acompaña,
p. ej., Ph 2, que especifica la abertura del condensador
de contraste de fase a usar).
• “Plan”, que señala que la lente produce una imagen de
“campo plano” en la cual todo se enfoca a través del
campo entero de visión.
• “Apo”, es decir, que la lente es corregible para aberra-
ción cromática, lo que de otra manera produce franjas
de color visible alrededor de los puntos finos en la
imagen.
• Ampliación de la lente y abertura numérica (en esen-
cia el poder de recolección de luz de la lente), como
“40 ⫻/0.85”.
• Longitud del tubo (que es la distancia efectiva entre el
ocular y el objetivo, casi siempre de 160 mm) y grosor
requerido del cubreobjetos (en mm), como “160/0.17”.
• “Oel”, “Imm” u “Oil”, esto es, que la lente está diseñada
para el uso con aceite de inmersión entre el elemento
final de la lente y el cubreobjetos.
• “CDI”, que significa que la lente está diseñada de ma-
nera específica para “contraste diferencial de interferen-
cia” de Nomarski.
 TIPOS DE MICROSCOPIA
Los oculares amplían además la imagen producida
por las lentes objetivo, por lo regular por un factor de 10⫻.
La imagen que producen se enfoca en el infinito, lo que
permite al operador verla como si estuviera en la distancia.
Los oculares son útiles para los usuarios de anteojos debi-
do a que se diseñan para permitir que la imagen completa
se observe desde varios centímetros arriba del ocular.
El condensador es una parte importante del sistema de
iluminación. Cuando se ajusta de forma correcta, enfoca
un cono uniforme de luz sobre la muestra (en ampliaciones
bajas, una lente “desplazable” situada por encima del con-
densador puede removerse respecto de la trayectoria de la
luz para asegurar que el campo de visión esté iluminado).
El ajuste correcto del diafragma del condensador asegura
un equilibrio óptimo de la resolución de la imagen, el con-
traste y la profundidad del campo.
El diafragma del campo se centra y su abertura se ajusta
para que sólo la región observada de la muestra se ilumi-
ne. Esto minimiza la dispersión de luz innecesaria, que se
produce dentro de las regiones exteriores inadvertidas de
la muestra.
La fuente de luz utilizada en los microscopios modernos
del laboratorio es un bulbo de tungsteno/halógeno de bajo
voltaje; éste proporciona iluminación intensa y estable en
el espectro visible. El bulbo puede alojarse dentro del cuer-
po del microscopio o en un bastidor externo. Por lo general,
la microscopia de fluorescencia explota las características
espectrales más adecuadas de la lámpara de arco de mercu-
rio de alta presión, que se emite con intensidad en la región
ultravioleta (UV) del espectro. Los láseres proporcionan
una fuente de luz monocromática de alta intensidad, que
en condiciones ideales satisface a la microscopia confocal,
así como también a varias técnicas de investigación como
el fotoblanqueamiento y la fluorescencia de reflexión in-
terna total.
Tipos de microscopia
La iluminación de campo brillante es aún la forma más em-
pleada de la microscopia en el laboratorio clínico. Otros méto-
dos, incluidas las microscopias fluorescente y la de contraste
de fase y, cada vez más, las microscopias de campo oscuro,
luz polarizada y de Nomarski, tienen diversas aplicaciones en
el diagnóstico de laboratorio. Sin embargo, el costo y la re-
lativa complejidad del microscopio confocal han restringido
mucho su uso para aplicaciones de investigación. Cada uno
de estos tipos de microscopia se comenta a continuación.
Como su nombre lo señala, la iluminación de campo bri-
llante presenta al observador una imagen del conjunto de
la muestra contra un fondo brillante. Para trabajar de ma-
nera eficiente, la muestra debe absorber suficiente luz para
producir un grado aceptable de contraste. Las tinciones se
63
emplean de manera habitual para incrementar el contraste
de la muestra y revelan además detalles estructurales.
La iluminación de Köhler, que introdujo de forma ini-
cial en el siglo pasado August Köhler, se ha convertido
en la forma universal utilizada de iluminación de cam-
po brillante debido a la calidad de la imagen producida.
No obstante, la calidad de la imagen óptima requiere el
reajuste regular del microscopio. Infortunadamente, mu-
chos instrumentos no se utilizan a su máxima capacidad
debido a que se soslaya la necesidad de reajustar el mi-
croscopio al cambiar las lentes objetivo y se desconoce en
general la técnica requerida.
En la iluminación de Köhler, dos conjuntos de rayos
de luz contribuyen a la imagen final, uno de ellos llama-
do “rayos iluminadores” y el otro “rayos formadores de
la imagen”. Ambos se derivan del filamento de la lámpara
incandescente (en la práctica, un filtro de vidrio molido se
fija frente al filamento de la lámpara para proporcionar una
fuente más uniforme de los rayos iluminadores).
La figura 6-2 ilustra las trayectorias separadas seguidas
por los rayos iluminadores y los rayos formadores de la
imagen en un microscopio dispuesto de modo correcto para
la iluminación de Köhler. Más notable aún es lo siguiente:
1. Los rayos que iluminan son paralelos al plano de la
muestra para proporcionar la amplia área de ilumina-
ción requerida.
2. Los rayos iluminadores se enfocan con precisión sobre
el cristalino antes de divergir para proporcionar una
gran área de iluminación sobre la retina.
3. Los rayos formadores de la imagen convergen sobre el
plano de la muestra y crean una imagen magnificada
pero invertida de la muestra en el plano de la imagen
primaria debajo del ocular.
4. Las lentes oculares invierten de nueva cuenta los rayos
formadores de la imagen de la muestra antes de que en-
tren al ojo y se enfocan sobre la retina para producir una
imagen de la muestra.
De esta manera, la iluminación de Köhler proporciona un
gran campo de visión iluminado de modo uniforme sobre
la retina del observador, junto con una imagen enfocada y
ampliada de la muestra.
La microscopia de fluorescencia aprovecha la propie-
dad de las moléculas llamadas fluorocromos para emitir luz
de una longitud de onda particular cuando se excitan por
luz incidental de longitud de onda más corta. Estos fluo-
rocromos pueden ser naturales de la muestra bajo estudio,
pero por lo regular la muestra se trata de manera directa
o indirecta con colorantes fluorescentes. Por ejemplo, el
4’6-diamidino-2-fenilindol específico de DNA (DAPI)
64 CAP. 6 MICROSCOPIA DE LUZ

Figura 6-2 Montaje de los componentes del microscopio para la iluminación de Köhler: a) trayectorias de los rayos formadores de
imagen; b) trayectorias de los rayos de iluminación.

puede usarse de forma directa para revelar la presencia

extracelular del micoplasma que contiene DNA, el que
contamina con frecuencia los cultivos celulares. Los com-
ponentes celulares, por ejemplo el citoesqueleto, pueden
teñirse de manera indirecta mediante sondas muy especí-
ficas creadas por la conjugación de fluorocromos, como el
isocianato de fluoresceína con anticuerpos monoclonales.
La microscopia de fluorescencia requiere una moderni-
zación relativamente simple del microscopio de luz con-
vencional. Las lámparas de arco de mercurio de alta presión
suelen utilizarse para proporcionar iluminación intensa en
la región ultravioleta (UV) del espectro, lo cual excita la
fluorescencia en muchos fluorocromos importantes. El
uso de UV también exige el empleo de lentes objetivo es-
peciales capaces de transmitir la UV. Esto se debe a que
en la configuración típica del microscopio de fluorescen-
cia, las lentes objetivo también sirven para enfocar los ra-
yos de iluminación sobre la muestra. Dado que los rayos de
iluminación pasan a través del objetivo e inciden sobre la
muestra (más que transmitirse a través de éste desde aba-
jo), esta técnica se conoce como epiiluminación.
Debe utilizarse una combinación apropiada del filtro de
excitación, el divisor del haz cromático y el filtro de barre-
ra para cada uno de los fluorocromos en uso (fig. 6-3). El
Figura 6-3 Trayectoria de la luz en un microscopio epifluores-
filtro de excitación está situado enfrente de la lámpara de
cente.
mercurio y se selecciona para permitir la transmisión de un
espectro estrecho de longitudes de onda de la luz, incluida
la longitud de onda necesaria para excitar la fluorescencia.
El divisor de haz monocromático debe reflejar las longi- Como su nombre lo sugiere, el filtro de barrera asegura que
tudes de onda excitatorias de la luz sobre la muestra y de- sólo la luz emitida por el fluorocromo alcance los oculares
tener la luz incidente reflejada que alcanzaría los oculares. (la luz UV puede dañar los ojos y la piel desprotegida).
 TIPOS DE MICROSCOPIA
La microscopia de contraste de fase permite el estudio
de muestras biológicas sin teñir con contraste inherente
pequeño (incluidas muestras vivas). La técnica explota las
diferencias de fase que se presentan entre la luz que pasa
a través de una muestra biológica y la luz que pasa de for-
ma ininterrumpida a través del medio circundante (en los
materiales biológicos esta diferencia es cercana a 1/4λ). El
microscopio de contraste de fase requiere un condensador
especial con una serie de aberturas anulares en su plano fo-
cal delantero y lentes objetivo alineadas con los anillos de
fase en su plano focal posterior (fig. 6-4). Estas disposicio-
nes introducen otro desplazamiento relativo de fase de 1/4λ
a la luz ya difractada a través de la muestra y el resultado
es un total de 1/2λ de retraso de fase en relación con la luz
de fondo. La interferencia destructiva producida da lugar
a que los detalles refractivos en la muestra aparezcan más
oscuros que el fondo, un efecto conocido como “contraste
de fase positivo”. Por el contrario, el “contraste de fase ne-
gativo”, en el cual los detalles de la muestra aparecen más
brillantes que el fondo, surge cuando se produce interferen-
cia constructiva al retardarse la luz de fondo por 1/4λ.
Los microscopios de contraste de fase son excelentes
para observar muestras vivas con la mínima distorsión,
incluidas las células animales cultivadas en contenedores
estériles y cerrados y la motilidad del espermatozoide en
cajas de Petri.
La microscopia de campo oscuro revela detalles estruc-
turales como objetos brillantes sobre un fondo oscuro. Se
usa un condensador especial para proporcionar ilumina-
ción oblicua que, si la muestra no la altera, no puede entrar
a las lentes objetivo. Sólo aquellas partes de la muestra que
desvían la luz hacia la lente objetivo presentan una ima-
gen a los oculares. Dos tipos de condensador facilitan la
Figura 6-4 Trayectoria de la luz en la microscopia de contraste
de fases.
65
Figura 6-5 Trayectoria de la luz en la microscopia de campo
oscuro.
iluminación de campo oscuro. Una simple “pieza de deten-
ción” puede usarse para oscurecer la porción central de la
iluminación que proporciona un condensador convencio-
nal y que deja sólo que los rayos oblicuos incidan sobre la
muestra (fig. 6-5). Los “condensadores de espejo” especia-
les proporcionan la mejor calidad de imagen, pero sólo son
apropiados para la iluminación de campo oscuro.
La microscopia de campo oscuro no proporciona una
imagen por completo representativa de la muestra (muchas
estructuras intracelulares pueden no ser evidentes). Sin em-
bargo, el método es útil para revelar detalles adicionales de
estructuras de borde fino que son difíciles de observar con la
iluminación de campo brillante debido a su carencia de con-
traste. Además, puesto que la tinción es innecesaria (como
con la microscopia de contraste de fase y de Nomarski), este
método de iluminación es útil para observar muestras vivas,
los espermatozoides y protozoos flagelados ofrecen imáge-
nes fascinantes cuando se observan de esta manera.
La microscopia de luz polarizada representa otra modi-
ficación del microscopio de luz convencional. La luz que
emana desde una fuente de luz puede ser el reflejo de las
numerosas ondas sinusoides que oscilan en alguno de los
planos de número infinito alrededor de un eje central; en
otras palabras, no está polarizada. El microscopio de po-
larización incluye dos filtros polarizantes: primero, el “pola-
rizador”, que por lo general puede rotarse, se localiza entre
la lámpara y el condensador y además proporciona rayos de
iluminación a la muestra que oscilan en un solo plano, y, se-
gundo, el “analizador”, que suele estar fijo, y se halla entre la
lente objetivo y el ocular. Si se asume que la muestra no está
en la trayectoria de la luz, entonces hay una sola posición
del polarizador donde coinciden los planos transmitidos y la
imagen aparece mucho más brillante. En cambio, a 90° de
esta orientación los dos planos transmitidos se cruzan y el
resultado es la extinción de la luz que alcanza los oculares.
El microscopio polarizante explota la característica “bi-
refringente” de las muestras para dividir la luz polarizada
66 CAP. 6 MICROSCOPIA DE LUZ

incidente en dos componentes, que oscilan en planos pa-

ralelos respecto de las dos direcciones del índice refractivo.
Los dos componentes se retardan de forma distinta den-
tro de la muestra, lo que introduce una diferencia de fase.
Puesto que estos componentes no comparten el mismo
plano no conducen a la interferencia. Sin embargo, al alcan-
zar el analizador, sólo los componentes paralelos al ana-
lizador se transmiten, y dado que comparten entonces el
mismo plano, pueden interferir. Rotar el portaobjetos de la
muestra permite que la cantidad de interferencia construc-
tiva se modifique, con el cambio consiguiente de la lumino-
sidad de las estructuras birrefringentes bajo observación.
Los objetos de birrefringencia conocidos, llamados
“compensadores”, incluidos el cuarzo y el filtro “placa roja
de primer orden”, se pueden insertar en la trayectoria de la
luz y usarse para calcular las características birrefringentes
de estructuras desconocidas, lo que contribuye a su identi-
ficación. El microscopio de polarización se beneficia tam-
bién del uso de las lentes objetivo especializadas “libres
de tensión”, que minimizan la cantidad de birrefringencia
introducida por el propio sistema óptico. La microscopia
polarizante ha encontrado aplicación, por ejemplo, en la
diferenciación entre el urato ácido de sodio y el de pirofos-
fato de calcio deshidratado del líquido sinovial; empero, casi
siempre las aplicaciones de la microscopia polarizante en el
diagnóstico de laboratorio son limitadas e infrecuentes.
La microscopia de contraste diferencial de interferen- Figura 6-6 Trayectoria de la luz en un microscopio confocal que
realiza el escrutinio con láser.
cia (CDI) de Nomarski representa una combinación de la
microscopia de polarización y la de contraste de fases y
es más adecuada para las muestras finas transparentes sin Esta última la proporciona un rayo láser enfocado, que se
teñir. La aplicación acertada requiere un instrumento dise- aplica a la muestra a una profundidad específica (fig. 6-6).
ñado especialmente, que incluye los filtros cruzados del La imagen que se produce es un compuesto generado por
polarizador y analizador y dos divisores de haz del prisma computadora formado por las intensidades que difieren de
de Wollaston. Junto con las diferencias de fase introduci- la luz emitida por las diferentes regiones de la muestra. En
das por los divisores del haz, el retardo adicional de luz consecuencia, la calidad de la imagen depende al final de
impuesto por la muestra produce una imagen en la cual el la sensibilidad de la luz y la resolución de la cámara elec-
fondo es gris, los bordes de la mano izquierda son brillan- trónica, así como también de la calidad de los elementos
tes, las áreas centrales son grises y los bordes de la mano ópticos del microscopio y el montaje del instrumento. La
derecha son oscuros. Esto da a los objetos en la trayecto- microscopia confocal puede proporcionar imágenes muy
ria de la luz un aspecto casi tridimensional, con organelos nítidas desprovistas de la imagen desenfocada relacionada
como la mitocondria y los núcleos definidos con claridad. con la observación convencional de fluorescencia y desde
En condiciones ideales, la microscopia de CDI satisface el el interior de muestras relativamente gruesas (<100 µm).
estudio de los organismos vivos. Asimismo, ha encontrado
apoyo en el estudio de rutina de muestras húmedas como el
sedimento urinario. Micrografía
La descripción de la técnica microscópica moderna no
estaría completa sin al menos hacer una referencia breve La buena micrografía es aún cierto objeto de arte en los la-
a la microscopia confocal, la cual representa una modifi- boratorios científicos y se describe de manera más detalla-
cación importante de la microscopia epifluorescente. La da en varios textos (Bradbury y Bracegirdle, 1998; Smith,
diferencia principal entre la microscopia confocal y los 1990; Rost y Oldfield, 2000; Olympus Microscopy Resour-
métodos ya explicados radica en que aquélla depende de la ce Centre, noviembre 2004). La capacidad para crear un
iluminación de punto más que de la iluminación de campo. registro conveniente y permanente de las imágenes deriva-
 LECTURAS ADICIONALES
das del microscopio es importante en muchos campos de la
patología diagnóstica y por lo tanto la mayoría de los labo-
ratorios posee uno o más fotomicroscopios. Por ejemplo, la
micrografía es en particular útil para registrar las muestras
teñidas con fluorescencia, que tienden a decolorarse con el
tiempo. Entre los instrumentos disponibles figuran los mi-
croscopios básicos de laboratorio con un cuerpo de cámara
convencional de 35 mm unido por medio de un adaptador
simple y los microscopios con complejos sistemas de medi-
ción de luz y una o más cámaras adjuntas. Mejoras recientes
en la sensibilidad de la luz, resolución y accesibilidad de las
cámaras electrónicas, sea las cámaras tradicionales de tubo
o las de dispositivo acoplado de carga y las de semicon-
ductor complementario de óxido metálico, le han conferido
aceptación para este propósito. Además, la rápida disponi-
bilidad de las poderosas computadoras personales y los pro-
gramas especializados satisfacen las necesidades del cada
vez más ocupado laboratorio clínico o de investigación en
relación con la automatización del microscopio, procesa-
miento de imágenes digitales y análisis, así como también
del cómputo de los datos.
A pesar de los cada vez más asequibles sistemas digitales,
muchos laboratorios clínicos todavía cuentan con cámaras
de película convencionales. La calidad del fotomicrógrafo
tradicional depende de varios factores. La resolución regis-
trada obviamente se afecta por la calidad de los componentes
ópticos del microscopio, pero también depende del tamaño
del “grano” de la película, lo que determina la nitidez de la
imagen fotográfica. Desafortunadamente, la sensibilidad de
la luz o “velocidad” del filme fotográfico se relaciona inver-
samente con el tamaño del grano; al elegir la opción correcta
del filme adecuado se consideran estos dos parámetros. La
interpretación exacta del color de la muestra exige atención
cuidadosa, sobre todo porque la sensibilidad espectral de las
emulsiones fotográficas difiere de la del ojo humano. Por lo
67
tanto, la selección cuidadosa de filtros que compensan el co-
lor respecto de la “temperatura del color” de la luz de ilumi-
nación (que varía cuando el voltaje de la lámpara se ajusta)
es también necesaria para registrar una representación fiel
del aspecto original de la muestra.
La micrografía digital y la microscopia de video cada
vez encuentran una función mayor en la consulta, edu-
cación e investigación remotas entre sitios geográficos
distantes. Basta señalar que la telepatología implica la
transmisión unidireccional de datos, incluidas imágenes
digitales, entre los sitios, quizás a través del correo elec-
trónico. Pese a ello, los desarrollos ya mencionados en la
automatización del microscopio, junto con las asequibles y
disponibles conexiones de internet de banda ancha, signifi-
can que la telepatología verdaderamente dinámica implica
el control interactivo de un microscopio remoto (incluidos
la posición de la muestra, enfoque, amplificación, ilumi-
nación, etc.) y enlaces en vivo simultáneos por videocon-
ferencia, los cuales se han convertido en una emocionante
realidad en la patología clínica de rutina.
Lecturas adicionales
Bradbury S. Bracegirdle B. Introduction to Lighy Microscopy.
1998: Bios Scientific, Oxford, UK.
Determan H, Lerpusch F. The Microscope and Its Application.
1998: Wild Leitz, Wetzlar.
Lacey AJ. Light Microscopy in Biology, 2nd ed. 1999: IRL Press,
Oxford, UK.
Smith RF. Microscopy and Photomicrography. 1990: CRC Press,
Boca Raton, FL.
Rost F, Oldfield R. Photography with a Microscope. 2000: Cam-
bridge University Press, Cambridge, MA.
Olympus Microscopy Resource Centre: http//www.olympusmicro.
com/ (accessed November 2004).
 7
Métodos cuantitativos en patología tisular
Peter W Hamilton y Derek C Allen
Introducción
La práctica de la medición es central para casi todos los as-
pectos de la investigación científica, ya que proporciona los
medios para comparar observaciones de una manera obje-
tiva, reproducible y confiable. Desde su inicio, la patología
diagnóstica se basa, en buena medida, en la determinación
visual de la morfología tisular por microscopia, el uso de
indicios diagnósticos visuales para clasificar la enferme-
dad y la utilización de criterios descriptivos y lingüísticos
para señalar la forma de alcanzar este proceso. Al tiempo
que se han observado enormes avances en la identificación
de signos morfológicos de relevancia clínica en histología
y citopatología, la patología diagnóstica es aún un proceso
subjetivo, que a menudo da lugar a una pobre reproducibi-
lidad en la clasificación del diagnóstico entre un patólogo y
otro e incluso entre uno mismo en ocasiones diversas.
La clasificación de una alteración maligna inicial, como
la displasia, proporciona un ejemplo. Los estudios demues-
tran valores de ␬ (kappa) tan bajos como 0.15 en la clasifi-
cación de la displasia cervical, 0.27 en la displasia bucal y
0.55 en las lesiones preinvasivas del bronquio. La ␬ es una
medida de consenso entre diversos observadores y sus lími-
tes son de 0 (ausencia de consenso) a 1 (consenso unánime).
En la citología cervical, los índices de error de 2% se han
cuantificado con valores de ␬ tan bajos como 0.46 y la cla-
sificación de la neoplasia intraepitelial cervical de cortes del
tejido demuestra la falta de consenso hasta en 36% de los
casos. Estos resultados destacan la dificultad de clasificar
con exactitud y consistencia los cambios morfológicos si se
usa tan sólo el ojo humano. Por lo tanto, existen oportuni-
dades de explorar los novedosos recursos diagnósticos que
proporcionan objetividad, consistencia y reproducibilidad.
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
Se ha reconocido por mucho tiempo que la medición
de las características histológicas y citológicas puede su-
ministrar datos objetivos para mejorar en grado notable la
capacidad de tomar decisiones diagnósticas. En patología,
la medición se conoce de muchas formas, entre ellas mor-
fometría, microscopia cuantitativa, patología cuantitativa,
análisis de imagen y morfología matemática. La cuantifi-
cación tiene diversas ventajas. Permite describir en térmi-
nos numéricos los cambios morfológicos que observa el
ojo. Esto revela, a partir de datos cuantitativos y objetivos,
la información que es reproducible y puede utilizarse de
modo estadístico para ciertas hipótesis sobre los cambios
morfológicos del tejido. Además, la medición permite la
detección de características sutiles, “subvisuales”, apenas
distinguibles para el ojo. En ambos casos, la medición pue-
de ser una herramienta invaluable para la interpretación
objetiva de anormalidades morfológicas y para la clasifica-
ción cuantitativa de la enfermedad humana.
Métodos
Existen diversos métodos disponibles que permiten obte-
ner información microscópica cuantitativa. Las mediciones
lineales simples se pueden realizar mediante un instrumen-
to graduado (una pieza plana de cristal que incluye una
regla o rejilla microscópica de dimensiones definidas que
puede insertarse en el tubo ocular de cualquier microsco-
pio). La regla se sobrepone a la imagen de la muestra y se
puede utilizar para registrar datos cuantitativos (ver figs.
7-1 y 7-11). Con un ajuste simple, esto puede emplear-
se para medir distancias lineales de profundidad o espe-
sor (ver figs. 7-11 y 7-12). Por otra parte, la estereología
70 CAP. 7 MÉTODOS CUANTITATIVOS EN PATOLOGÍA TISULAR
Figura 7-1 a) Uso de un marco reticulado para
determinar el porcentaje del área ocupada por
los núcleos. La rejilla consiste en 30 puntos, 14
de los cuales se hallan dentro de los núcleos, lo
que representa un valor de 47%. Esta técnica se
adopta en la estereología para obtener mediciones
bidimensionales y tridimensionales a partir de las
imágenes microscópicas. b) Gravado lineal para
inferir el área superficial de las microvellosidades
a partir de una biopsia de intestino delgado. (a)
es una aproximación que usa sondas de punto o lineales
que se sobreponen a la imagen (ver fig. 7-1). Esta técnica
antigua y bien establecida, aunque simple, todavía encierra
un valor considerable para obtener las medidas tridimen-
sionales (p. ej., volumen, área superficial, longitud) a partir
de imágenes de dos dimensiones (es decir, cortes de teji-
do). Dichos métodos se aplican rara vez en la investigación
y la práctica de la patología. Esto es así no porque sean
ineficaces, sino más bien porque la tendencia a la automa-
tización y el análisis de una gran cantidad de muestras ha
convertido a la computadora en el instrumento central para
la medición en patología, más aún por la gran disponibili-
dad de computadoras personales; éstas, con los programas
apropiados, tienen mayor capacidad de medir parámetros
morfológicos lineales, estereológicos y más complejos a
partir de imágenes microscópicas de muestras tisulares y
celulares.
Computadoras
Las computadoras han tenido un efecto esencial en mu-
chos aspectos de la práctica y la investigación médicas.
En patología, estas máquinas son parte importante de la
infraestructura del laboratorio y en tareas como los sis-
temas de información de los pacientes, la generación de
informes de patología, la identificación de la muestra y
la fotomicroscopia digital. Las computadoras también se
han convertido en la herramienta principal para la medi-
ción del tejido y la célula en la microscopia de luz. Cuan-
do se suministran las coordenadas del contorno de una
estructura tisular o celular, el programa puede efectuar
con rapidez una gran variedad de mediciones referentes al
contorno, como área, perímetro, diámetro máximo, diáme-
tro mínimo, morfología, etc. Esta información se puede
almacenar de manera electrónica en una base de datos y
se analiza de modo estadístico para comparar grupos de
(b)
diagnóstico, muestras de tejido de pacientes con pro-
nóstico diferente y cambios morfológicos posteriores al
tratamiento. A continuación se describen en extenso dos
técnicas computarizadas.
Medición interactiva automatizada
Esta modalidad confía por completo en el usuario humano
para trazar o marcar los límites de las estructuras tisulares
o celulares a medir. Consiste en una computadora con un
dispositivo de trazo (el ratón o una pluma digital), y una
tabla para efectuar dibujos más especializados. Al delinear
el límite de un objeto específico, el sistema registra las
coordenadas x y y (fig. 7-2). Éstas se pueden utilizar para
medir características del tamaño y la forma o definir el
límite dentro del cual pueden computarse las mediciones
densitométricas. Es posible trazar los límites a partir de las
microfotografías simples, las imágenes reales transmitidas a
la pantalla mediante una cámara de video o las imágenes di-
gitales almacenadas (véase la sección siguiente). Casi todas
las computadoras de escritorio se pueden fijar con facilidad
para que funcionen como aparatos de medición interacti-
vos. El programa para facilitar la medición está disponible
en el comercio. Un programa gratuito, que desarrollaron
los National Institutes of Health, está también disponible
en el portal de Scion Imaging (www.scioncorp.com). Esta
herramienta es por tanto económica, fácil de practicar y uti-
lizable en una amplia variedad de aplicaciones.
Imágenes digitales en patología
La capacidad de registrar imágenes microscópicas digita-
les ha tenido un efecto importante en el almacenamiento
electrónico de una gran cantidad de imágenes y también en
la rápida obtención de la información numérica a partir de
 MÉTODOS 71

Figura 7-2 Trazo interactivo de núcleos a partir de la imagen microscópica viva. El panel izquierdo muestra la imagen original. El panel
derecho demuestra cómo el contorno de la superficie de cada núcleo se traza con el ratón y se utiliza para computar el área nuclear. El
núcleo sobre la parte superior derecha está en proceso de delinearse. Estos valores nucleares se pueden almacenar y utilizar para calcular
con rapidez diversas mediciones estadísticas sobre la muestra, incluidas la media, la desviación estándar y la variación del tamaño nuclear.
Esta técnica ha demostrado ser muy útil en la caracterización de los cambios sutiles del tamaño y la forma nucleares en relación con
malignidad.

estas imágenes para la evaluación cuantitativa. Las cámaras
fotográficas digitales se pueden conectar a un microsco-
pio mediante un adaptador estándar. La cámara fotográfica
registra la imagen en una tarjeta de memoria interna, que se
transfiere después a una computadora para el procesamien-
to y análisis. De manera alternativa, las cámaras de video
digitales o análogas se pueden conectar a un microscopio
y la computadora digitaliza las imágenes de modo direc-
to a través de una tarjeta digital de imagen. Cualquier op-
ción puede ser satisfactoria, aunque para las aplicaciones
especiales es vital el control sobre los ajustes de la cámara
fotográfica, como la velocidad del obturador, el aumento y
la temperatura del color.
La mayor parte de las cámaras digitales, fijas o de video,
muestrean imágenes cuando menos a tres megapixeles.
Algunos equipos de captura de imagen especiales pueden
registrar imágenes solas hasta de seis megapixeles.
Dos factores determinan la calidad de la imagen: la
resolución espacial y la del color. La primera depende
del número de pixeles que representan un área definida del
campo. Cada pixel (contracción del inglés picture element)
representa una caja que define un punto en la imagen.
Cuantos más pixeles tenga una imagen, mayor es la resolu-
ción espacial (fig. 7-3).
Mientras que el número de pixeles en una imagen de-
termina su resolución espacial, también es necesario deter-
minar cuántos valores se permiten para la representación
de la densidad o el color. En la figura 7-4 se observa que
cada pixel se puede representar por un solo valor de gris. A
mayor número de valores de grises, mejor resolución de la
imagen. En tanto que el ojo humano sólo puede distinguir
de modo confiable cerca de 64 valores de grises, 256 valo-
res de grises suministran habitualmente una representación
exacta de la imagen original. Cada pixel puede asignarse a
cualesquiera de los 256 valores de grises posibles según sea
la densidad de ese punto en la imagen original (0 = negro
y 255 = blanco). En consecuencia, una imagen digital es
tan sólo una matriz de números que se puede almacenar y
recuperar para proyectarla en un monitor de computadora.
Las imágenes a color se realizan con pixeles de inten-
sidades diferentes de los colores primarios: rojo, verde
y azul. De nueva cuenta, el número de posibles valores
disponibles para representar las contribuciones rojas, ver-
des y azules a un color particular determina la resolución

Figura 7-3 La misma imagen con dife-

rentes resoluciones espaciales. Puede verse
que cuanto mayor es la resolución del pixel,
mejor es la definición de la imagen y sus es-
5⫻5 (25 pixeles) 25⫻25 (625 pixeles) 100⫻100 (10 000 pixeles) 500⫻500 (250 000 pixeles) tructuras.
72 CAP. 7 MÉTODOS CUANTITATIVOS EN PATOLOGÍA TISULAR
Figura 7-4 La misma imagen con diferen-
tes resoluciones de valores grises. En condicio-
nes normales, 256 valores grises representan el
número máximo de las densidades usadas para
representar una imagen. 2 valores grises
Figura 7-5 Cada imagen de color se realiza
con tres imágenes de valores grises que repre-
sentan los componentes rojos, verdes y azules.
Cada valor gris determina la contribución de ese
color a un pixel particular. A todo color
del color de la imagen final. Como en las imágenes de gri-
ses, cada color puede representarse por valores en límites
de 0 a 255, lo que supone un número posible de combina-
ción de 16 millones de colores (256 [rojo] ⫻ 256 [verde]
⫻ 256 [azul]). Cada imagen de color se puede por tanto
descomponer en tres imágenes de nivel de gris y cada una
representa los componentes rojos, verdes y azules de la
imagen a color (fig. 7-5).
Segmentación automática de la imagen
Tener una representación digital de una imagen histológica
permite efectuar numerosos procedimientos imposibles
con una imagen análoga. Al trazar un histograma de fre-
cuencia en el nivel de los grises se obtiene un resumen de
la densidad de información dentro de la imagen. Si se fija
un umbral en este histograma es posible excluir todos los
pixeles que rebasan por arriba o abajo el umbral. Éste es el
llamado umbral del nivel de gris y permite de forma espe-
cífica identificar los objetos dentro de la imagen que tiene
ciertas características de densidad, por ejemplo los núcleos
(fig. 7-6). La identificación de objetos de esta manera se de-
nomina segmentación. La computadora puede precisar de
manera automática el límite del contorno de los objetos
que segmenta y derivarse a partir de estas características
morfométricas.
Fijar sólo un umbral del nivel de gris no siempre posi-
bilita la segmentación exacta de todos los núcleos. En la
figura 7-6 se puede ver que algunos núcleos juntos se han
identificado como un objeto solo. Si la computadora midie-
ra el área de estos objetos de modo automático, los resul-
tados serían inexactos. Sin embargo, puesto que se dispone
de la información almacenada en un formato digital, existe
4 valores grises 16 valores grises 256 valores grises
Canal rojo Canal verde Canal azul
una variedad de procedimientos que pueden utilizarse para
resolver este problema. Cada contorno nuclear sospechoso
se puede examinar por separado en relación con sus carac-
terísticas morfométricas (tamaño, forma, etc.). Si éstas no
rebasan los límites definidos, entonces el objeto se puede
aceptar como núcleo. Si, pese a ello, las características del
objeto exceden el límite definido, puede procesarse más
para determinar si puede obtenerse un mejor resultado de
la segmentación. Por ejemplo, se puede buscar el contor-
no del objeto por transiciones destacadas en la dirección
(llamadas “cúspides”). Si se encuentra que ocurren dos
en los lados opuestos del objeto, puede activarse una fun-
ción divisora y el objeto se divide (fig. 7-7). Está disponible
un catálogo extenso de algoritmos que procesa la imagen
y ello permite que, en casi todas las circunstancias, se seg-
menten de manera confiable objetos o estructuras dentro de
una imagen histológica o citológica.
La capacidad de identificar componentes importantes de
la imagen mediante algoritmos de la computadora y medir
con rapidez características morfológicas, y utilizar éstas
para clasificar un caso dado, lleva a preguntar si esto se
puede hacer de una manera automatizada. La automatiza-
ción se ha desarrollado con rapidez en otras disciplinas del
laboratorio, como hematología y bioquímica clínica, pero
ha sido lenta en patología. La carencia de la automatiza-
ción en patología diagnóstica no está del todo injustificada
hasta la fecha. La patología de diagnóstico requiere la vi-
sualización directa de las estructuras tisulares y celulares
complejas con el microscopio de luz estándar, lo cual hace
de la automatización un proceso en extremo difícil en com-
paración con el uso de las pruebas bioquímicas o cuentas
celulares. Sin embargo, con los progresos del análisis de
imagen computarizada y la visión de una computadora, es
posible en teoría automatizar la tarea de la interpretación
 MÉTODOS
10 000
5 000
Valor de gris
10 000
5 000
Valor de gris
morfológica y la clasificación del diagnóstico. El mayor
esfuerzo en este campo se observa en el desarrollo de los
dispositivos de exploración cervical automatizados (discu-
tidos más adelante), pero en la actualidad se experimentan
las técnicas en la histología tisular.
Por supuesto, el desarrollo de un sistema por comple-
to automatizado con la visión de una computadora lleva
tiempo; una opción por la que se inclinan muchos es la de
utilizar una combinación de algoritmos de segmentación
de imagen y de trazo interactivo para asegurarse de que
todos los componentes de la imagen se identifiquen con
exactitud.
Densitometría y textura
Como se ha visto, cuando las imágenes se registran en for-
mato digital, la información cuantitativa se almacena en la
73
Figura 7-6 Uso del histograma de umbral para iden-
tificar objetos dentro de la imagen. A. Imagen original
del nivel de gris. B, Histograma del nivel de gris para la
imagen que muestra los límites de los valores de grises
del pixel de 0 a 255. C. Se define un umbral que instru-
ye a la computadora para seleccionar todos los pixeles
con valores a la izquierda de la línea del umbral. D. La
imagen ilustra regiones segmentadas que, debido a su
densidad más alta (valores grises más bajos), son sobre
todo núcleos.
Figura 7-7 Algoritmos de división para la
segmentación exacta del núcleo.
densidad de cada pixel dentro de la imagen. En patología,
esta información se puede utilizar con eficacia para cuanti-
ficar la densidad óptica (DO) de la reacción de una tinción
particular. Esto se consigue al medir el valor de gris de una
serie de filtros de DO y trazar una curva de calibración para
convertir el valor de gris en DO. Mientras que la informa-
ción geométrica es más fácil de estandarizar y no necesita
equipo especial para la captura de imagen, las medidas den-
sitométricas exigen la estandarización y el control de los
niveles de luz de una imagen a la siguiente, lo cual requiere
la calibración cuidadosa del microscopio y todo el aumen-
to automático, la temperatura del color y los ajustes del
obturador sobre la cámara fotográfica al apagarse. La me-
dición de la DO es la más eficaz cuando la reacción de tin-
ción es estequiométrica, es decir, cuando la densidad de la
tinción es proporcional al sustrato que se mide. Esto se en-
cuentra cuando se usa la reacción de Feulgen para marcar el
DNA, en la cual la medición de la densidad óptica nuclear
74 CAP. 7 MÉTODOS CUANTITATIVOS EN PATOLOGÍA TISULAR
Tinción de Feulgen
Células de control/diploides
DNA aneuploide
Densidad óptica
Figura 7-8 Citometría de DNA. Al cuantificar la densidad ópti-
ca de los núcleos teñidos para DNA puede obtenerse una medida
cuantitativa del contenido (ploidia) del DNA. Al comparar con las
células del control, cuyo estado de DNA diploide se conoce (p.
ej., linfocitos), pueden identificarse las desviaciones a partir de
valores normales de ploidia del DNA y medirse. Esto se conoce
a menudo como “DNA aneuploide” y es en particular evidente en
la neoplasia.
integrada por densitometría proporciona una medida cuan-
titativa del contenido de DNA. Como el contenido de DNA
se altera, en particular en la enfermedad maligna, esta me-
dición se ha explorado de forma extensiva como un indicio
cuantitativo útil en el diagnóstico y pronóstico. La identifi-
cación de distribuciones alteradas en el contenido del DNA
(fig. 7-8) tiende a vincularse con la inestabilidad del cro-
mosoma y ello se incrementa en las tumoraciones, casi
siempre con un pronóstico pobre. Otros métodos, como la
citometría de flujo, permiten una medición más rápida del
contenido del DNA y las alteraciones de ploidia en mues-
tras clínicas. No obstante, la citometría de DNA que usa
la proyección de imagen automatizada tiene en cuenta un
Figura 7-9 El análisis de la textura de la cro-
matina nuclear implica la revisión de las rela-
ciones espaciales de los valores de grises dentro
de un núcleo teñido. Esto se puede utilizar para
generar una huella nuclear de cromatina, que
proporciona indicios sutiles pero muy sensibles
de la patobiología fundamental de la célula.
análisis más específico de poblaciones definidas de células
dentro de una sección o frotis de tejido.
En el diagnóstico convencional, la distribución de
la cromatina nuclear o el fenotipo de la cromatina es un
indicio visual que suministra información vital sobre la ac-
tividad biológica de una célula. Al emplear la información
numérica proporcionada a través de imágenes digitales es
posible cuantificar la organización de la cromatina y deter-
minar la distribución espacial de los valores de gris dentro
de un núcleo (fig. 7-9). Puesto que una matriz de números
que representan la densidad de cada pixel delinea el núcleo
de modo digital, puede inferirse un grupo de característi-
cas estadísticas de tal manera que se puede medir la distri-
bución espacial de valores de gris dentro del núcleo (fig.
7-9). Este grupo de características se conoce como “textu-
ra” y proporciona una medida objetiva del fenotipo de la
cromatina. Asimismo, al suministrar apoyo cuantitativo
para los cambios visuales evidentes en la organización de la
cromatina, se ha demostrado que estas medidas ilustran las
propiedades de la cromatina que no son obvias para el ojo.
Estas características se han utilizado en la identificación
de los cambios vinculados con malignidad (CVM), que se
discuten más adelante.
Por convención, el análisis de la textura se ha realizado
sobre los núcleos teñidos de forma específica para el DNA
mediante la reacción de Feulgen. No obstante, en fecha
reciente se ha utilizado la hematoxilina para la medición
de la textura nuclear y ha demostrado ser muy eficaz. Esta
tinción es fácil de aplicarse y es la más usada en la pa-
tología diagnóstica de rutina. Pese a ello, no proporciona
una reacción estequiométrica y requiere estandarización y
control cuidadosos.
Mediciones espaciales nucleares
El aglomerado nuclear, las distancias entre los núcleos y
sus patrones dentro de los tejidos representan indicios
Escala de valores
 APLICACIONES DE LA MEDICIÓN EN LA PATOLOGÍA DIAGNÓSTICA
Imagen original Teselación de Veronoi
Figura 7-10 Mediciones espaciales nucleares generadas a partir de una citología de aspiración con aguja fina. Las posiciones nucleares
se identifican y se utilizan como puntos trazados sobre una gráfica. Las mediciones espaciales generadas de estas gráficas proporcionan
datos cuantitativos sobre la cohesión celular.
únicos de la extensión de la enfermedad fundamental y
en especial de la gravedad de las lesiones preinvasivas. Se
pueden usar diversas técnicas para medir el espaciamiento
nuclear, la mayor parte basada en la teoría gráfica que deter-
mina las características espaciales de un grupo de puntos en
el espacio bidimensional. De manera general se denominan
“análisis sintácticos de la estructura” o “sociología celular”.
Existe un número de métodos disponibles para el análisis
sintáctico de la estructura, incluidos la teselación de Vo-
ronoi, la triangulación de Delaunay y el árbol conector
mínimo. La triangulación de Delaunay es la formación de
triángulos entre cada grupo posible de puntos: se aceptan
sólo los triángulos en los cuales la circunferencia no con-
tiene otros puntos que los del triángulo (fig. 7-10). La te-
selación complementaria de la gráfica de Delaunay es la
teselación de Voronoi. A partir de estas gráficas puede ex-
traerse una variedad de mediciones, por ejemplo, el número
de puntos, la longitud lineal promedio del triángulo, la lon-
gitud total de líneas, la media, la desviación estándar, la
oblicuidad, la curtosis y la entropía de las longitudes linea-
les, el área del triángulo, las áreas del objeto incluidas, etc.
Por otra parte, el árbol conector mínimo es un gráfico sin
asas y conecta todos los puntos donde la suma mínima de la
longitud de las líneas vincula los puntos. Como se indicó,
diversas mediciones pueden obtenerse de esta gráfica, que
reflejan cambios adyacentes en la estructura aglutinada de
núcleos. Ejemplos de estos tres métodos se ilustran en la fi-
gura 7-10. Las aplicaciones de este tipo de técnica en la mor-
fología cuantitativa se han demostrado en la clasificación
de la displasia colorrectal, determinación de la atrofia gás-
trica y definición de los patrones de distribución nuclear en
muestras endométricas citológicas.
75
Triangulación de Delauney Árbol conector mínimo
Aplicaciones de la medición
en la patología diagnóstica
Para establecer el diagnóstico en la práctica diaria, los
patólogos utilizan con regularidad la cuantificación. Las
mediciones lineales simples del diámetro del tumor de-
terminan la progresión patológica en la clasificación in-
ternacional TNM (tumor/ganglios/metástasis) y también
suministran la información pronóstica en varios cánceres
comunes, como el de mama. La precisión de los márge-
nes quirúrgicos del tumor es importante para predecir la
posibilidad de recurrencia local del tumor y seleccionar a
los sujetos para quimioterapia o radioterapia coadyuvantes
posoperatorias en las neoplasias de mama y colorrectal. El
tratamiento óptimo del melanoma maligno y el carcinoma
cutáneos es la resección quirúrgica completa y la excisión
y delineación completa del margen, y debe determinarse en
la muestra patológica. Las técnicas básicas son apropiadas,
como el uso de la estadificación microscópica de Vernier,
una retícula o regla ocular. Son en particular útiles las lupas
(amplificadores) de cristal o Perspex que incorporan una
escala lineal. Los cálculos porcentuales semicuantitativos
del compromiso tumoral en la biopsia con aguja de centros
prostáticos son un buen indicador del volumen total de la
masa y la probabilidad de que el cáncer se extienda más
allá de la glándula.
Varias aplicaciones estándar se detallan más adelante,
pero algunos de los desarrollos potenciales más recientes
son:
• Cuantificación patológica de los trastornos neurodege-
nerativos, como la enfermedad de Alzheimer.
76 CAP. 7 MÉTODOS CUANTITATIVOS EN PATOLOGÍA TISULAR
• Distinción de lesiones melanocíticas benignas y ma-
lignas mediante una combinación de inmunoexpresión
cuantitativa con proteína S100, área nuclear y citome-
tría de DNA.
• Cuantificación de las poblaciones celulares y la distri-
bución del tejido en los padecimientos hematológicos
en biopsias de médula ósea.
• Análisis de la estructura del tejido en las fibrosis pulmo-
nar y hepática.
Medida de Breslow para el grosor del melanoma
Ésta es una de las mediciones de uso más general en la his-
topatología diagnóstica y cuantifica la profundidad de la in-
vasión del melanoma por debajo de la capa celular granular
de la piel (fig. 7-11). Breslow definió este método y su va-
lor pronóstico. Las mediciones se pueden efectuar con un
Figura 7-11 Medida de Breslow para calcular la invasión del me-
lanoma en la piel. Se muestra el ocular graduado (unidades princi-
pales en milímetros) sobrepuesto en la sección del tejido canceroso.
ocular graduado y hoy día se ha convertido en una práctica
aceptada para clasificar el melanoma maligno como fino
(< 0.76 mm), de grosor intermedio (0.76 a 1.5 mm) o grue-
so (> 1.5 mm), con un porcentaje de supervivencia libre de
enfermedad de 100, 70 y 40, respectivamente.
Biopsia del hueso
El análisis morfométrico puede suministrar datos en extre-
mo valiosos para el diagnóstico de la enfermedad meta-
bólica ósea. Las biopsias del hueso se toman de la cresta
iliaca y el análisis se realiza con cortes sin descalcificar
y microscopia con luz transmitida, polarizada cruzada y
ultravioleta. Se pueden realizar y utilizar las mediciones
del volumen trabecular y osteoide, superficies osteoides y
mineralizadas y el grosor del osteoide para diagnosticar
la osteoporosis y la osteomalacia (fig. 7-12). Son posibles
mediante rejillas de punto/línea y procedimientos estereo-
lógicos. En la actualidad, el uso del análisis computarizado
de imagen se ha convertido en un medio más atractivo para
medir esas características.
Biopsia muscular
La valoración de las características de la fibra muscular
en cortes longitudinales y transversales es central para el
diagnóstico de los trastornos neuromusculares, incluidas
las miopatías congénitas, metabólicas y destructivas y la
distrofia muscular. La medición morfométrica del tamaño
y el número de fibras del músculo se realiza sobre cortes
transversales, teñidos de modo diferencial para el tipo de
Figura 7-12 El cálculo cuantitativo del hueso, el osteoide y la mé-
dula en biopsias de hueso permite identificar el hueso normal (N), la
osteomalacia (Om) y la osteoporosis (Op).
 APLICACIONES DE LA MEDICIÓN EN LA PATOLOGÍA DIAGNÓSTICA
fibra mediante la reacción de la APTasa de miosina (fig.
7-13). La atrofia y la hipertrofia de la fibra se determinan
por la medición del tamaño de la fibra, que se toma por
convención como el diámetro de la fibra muscular que cru-
za la superficie menor del contorno.
Cáncer de mama
El método de Bloom y Richardson para clasificar el cáncer
de mama es un intento de introducir criterios “semicuan-
titativos” simples al diagnóstico histopatológico. Esto re-
quiere la clasificación subjetiva del pleomorfismo nuclear,
esto es, un cálculo del porcentaje del tumor que mues-
tra formación de túbulos y una cuenta de mitosis por 10
campos de alto poder. El número de mitosis parece ser en
particular relevante en el pronóstico de sujetos con cáncer
de mama (fig. 7-14). Se ha demostrado en ensayos clínicos
a gran escala que el cálculo de un índice pronóstico mul-
Porcentaje de pacientes sobrevivientes
IAM = 0
IAM = 4
IAM = 16
IAM = 36
IAM = 81
Meses después del diagnóstico
Figura 7-14 Esta figura ilustra el papel de las cuentas mitóticas
en la predicción de la supervivencia en pacientes con cáncer de
mama. Mientras el índice de actividad mitótica (IAM = número
de mitosis por 10 campos de alto poder) aumenta, el porcentaje de
los pacientes que sobreviven por periodos más largos dentro de ese
grupo disminuye.
77
Figura 7-13 Morfometría de la biopsia de músculo
en la valoración de los trastornos neuromusculares. La
imagen izquierda muestra una biopsia teñida con la
reacción de la ATPasa para distinguir las fibras muscu-
lares tipos I y II. No sólo puede contarse el número de
fibras, sino también se puede medir la superficie menor
de la fibra muscular (derecha) para determinar la hiper-
trofia y la atrofia de la fibra.
tivariado basado en cuentas mitóticas, tamaño del tumor y
estado linfático del ganglio puede proporcionar una medi-
da valiosa del pronóstico en el cáncer de mama, sobre todo
en mujeres premenopáusicas. El análisis cuantitativo de la
estructura del conducto y la valoración del patrón epite-
lial pueden también suministrar datos de utilidad para la
discriminación de la hiperplasia intraductal y el carcinoma
ductal in situ.
Endometrio
La medición del tamaño y la forma nucleares es de gran
valor en la diferenciación del endometrio normal respecto
de la hiperplasia atípica y el carcinoma endometrial. Estas
ventajas pueden completarse con el análisis cuantitativo
de las características estructurales que, en combinación,
permiten la identificación de casos de hiperplasia atípica
que progresan hacia una entidad maligna. Un sistema de
clasificación morfométrica multivariado ha demostrado
una correlación sólida con la profundidad de la invasión
miometrial y es más específico que los esquemas de clasifi-
cación subjetiva, como el de Kurman. En los Países Bajos,
el análisis de la morfometría endometrial por curetaje o de
muestras de histerectomía se efectúa de modo sistemático
en un intento por reducir el sobretratamiento de estas lesio-
nes. Se ha considerado que esto podría ahorrar alrededor
de 15 millones de dólares por año en Estados Unidos. La
combinación del eje nuclear medio más corto, ploidia del
DNA y profundidad de la invasión miometrial también ha
demostrado tener un valor pronóstico de importancia, en
especial en cánceres endometriales de etapa I de la FIGO
(International Federation of Gynecology and Obstetrics).
Citología cervical automatizada
La citología cervical automatizada representa uno de los
esfuerzos principales en los últimos 30 años para introdu-
cir la automatización en un proceso diagnóstico de gran
exigencia visual. Esta técnica se ha desarrollado luego de
78 CAP. 7 MÉTODOS CUANTITATIVOS EN PATOLOGÍA TISULAR
reconocer, primero, la notoria reducción de la mortalidad
del cáncer cervical tras la introducción de los programas
de detección de cáncer cervical y, segundo, la demandan-
te carga de trabajo que ésta propició. Resultó claro que
los técnicos con trabajo excesivo y los citólogos clínicos
podían diagnosticar casos difíciles de modo erróneo. El
desarrollo de dispositivos de escrutinio computarizados
comenzó a finales del decenio de 1950, pero sólo en fecha
reciente han salido al mercado sistemas con capacidades
automatizadas en esta área.
En esencia, estos sistemas se basan en el mismo princi-
pio: las imágenes se proyectan en un microscopio, se someten
a una exploración mecánica, se ordena en forma secuen-
cial y se graban en formato digital; las células se identifican
y segmentan, y después se sujetan al análisis cuantitativo
(fig. 7-15). Se registran múltiples propiedades, como tama-
ño, forma, densidad y textura nucleares. Cada núcleo se
Figura 7-15 Identificación automática de núcleos celulares
cervicales a partir de un frotis. La caracterización cuantitativa
permite la clasificación del tipo de célula y el reconocimiento de
células malignas.
clasifica entonces como normal o potencialmente anormal.
Esta información se puede procesar de varias maneras.
Algunos sistemas están diseñados para almacenar todas
las imágenes de anormalidades, que más adelante revisa
el citólogo para confirmar un diagnóstico de enfermedad
maligna. Esto requiere experiencia humana en el proceso
de tomar decisiones finales, pero reduce en grado significa-
tivo la carga de trabajo, dado que la máquina selecciona los
campos sospechosos de manera automática.
Como alternativa, el sistema puede determinar una cla-
sificación diagnóstica sin requerir la intervención humana.
Esta clasificación por completo automatizada de frotis cer-
vicales se puede utilizar con varios propósitos.
Control de calidad
La exploración de la citología cervical exige una valoración
de la calidad para la reexploración sistemática de al menos
10% de los portaobjetos o la rápida revisión de todos los
portaobjetos. Esto lo realizan por convención individuos ex-
perimentados del equipo de citología y es un proceso que
consume tiempo. Se puede utilizar un sistema de exploración
cervical automatizado para someter a escrutinio una propor-
ción de portaobjetos, lo cual exime al citólogo de efectuar
esta tarea. Se delinean discrepancias entre la clasificación
humana y la de la máquina del mismo caso y se formula una
explicación posible. Puesto que la máquina posee una exac-
titud definida de clasificación, se asegura el mantenimiento
de la calidad de los procedimientos diagnósticos.
Preescrutinio
Hasta 95% de los frotis cervicales es normal. Los sistemas
automatizados pueden seleccionar una gran proporción
de frotis normales y dejar las muestras visuales más com-
plejas para la valoración del citólogo humano. De nueva
cuenta, esto podría representar una reducción notable de la
carga de trabajo de un laboratorio y un enriquecimiento del
trabajo de exploración, dado que el citólogo sólo analizaría
los casos más conflictivos.
Automatización completa
Los dispositivos por completo automatizados, que propor-
cionan un diagnóstico definitivo de todos los frotis presenta-
dos, reclamados por tantos años, ahora son una posibilidad.
Existen aspectos medicolegales que deben superarse, pero la
automatización completa podría ser importante en el abaste-
cimiento de servicios de exploración cervical en los países
en los que no existe un programa de investigación.
Es probable que en los próximos años se desarrolle con
rapidez el uso de sistemas automatizados con proyección de
imagen en la citología diagnóstica del cervix y otros sitios.
Dichos sistemas se introdujeron ya en algunos laboratorios
como dispositivos del control de calidad y se promueven
ahora como sistemas de preescrutinio. Con los avances de
la tecnología informática, la detección de la computadora
y los procedimientos de clasificación, es probable que los
sistemas por completo automatizados funcionen a niveles
que superen las mejores cualidades humanas.
Fenotipo de la cromatina y cambios vinculados
con la malignidad (CVM)
Las características cuantitativas del fenotipo de la cromatina
se han demostrado en muchas situaciones para proporcionar
 AUTOMATIZACIÓN EN HISTOLOGÍA 79

indicios únicos de procesos celulares subyacentes y pueden los núcleos (fig. 7-16) y destacar a menudo las caracterís-
utilizarse como un medio objetivo para clasificar la enferme- ticas nucleares que no son evidentes al ojo humano. Por
dad y, más importante aún, para predecir resultados clínicos. ejemplo, se ha demostrado en citología cervical que en un
El análisis de la textura de la cromatina parece tener un papel análisis de tan sólo 30 células que parecían normales por
relevante en el diagnóstico, la clasificación y el pronóstico de muestra podría identificarse hasta 70% de muestras con
las neoplasias vesicales. Además, la evidencia sugiere que el displasia moderada o grave. Esto subraya su papel en los
análisis de la medición del fenotipo de la cromatina antes dispositivos cervicales automatizados de exploración y
del tratamiento se pueda emplear para anticipar la reacción muchos de los sistemas actuales emplean la textura nuclear
a la quimioterapia y radioterapia en el cáncer de vejiga. La como una característica diagnóstica. Los CVM también se
textura de la cromatina nuclear también se puede usar para han demostrado en el colon, la vejiga, la mama y el pulmón
discriminar entre los carcinomas de próstata, los sensibles a (fig. 7-16). No es del todo preciso si estos cambios en las
hormona y los resistentes a la misma, y ha demostrado ser células al parecer normales indican un cambio premalig-
útil en el pronóstico predictivo del cáncer metastásico de la no primario en la célula o si se trata de cambios secunda-
próstata. rios atribuibles a la exposición de células circundantes a
Las alteraciones sutiles de la configuración nuclear de los factores relacionados del tumor. El hecho que los CVM
la cromatina se han demostrado no sólo en las células ma- pueden desaparecer después de la eliminación de un tumor
lignas, sino también en las células de apariencia “normal” se inclina por esto último, al menos en algunos tejidos. El
de sujetos con un tumor maligno. Estas transformaciones trabajo reciente sugiere que los CVM se pueden emplear
se han llamado “cambios vinculados con la malignidad” o como un método potencial para la exploración del cáncer
CVM. Tales cambios pueden cuantificarse de modo con- de pulmón. El análisis de los CVM en biopsias histológicas
fiable mediante el análisis automatizado de la textura de normales del pulmón permitió la identificación correcta su-
perior a 80% de los pacientes con cáncer. Además, se ha de-
fendido en la exploración de los pacientes para el cáncer de
Índice del fenotipo de la cromatina

pulmón la identificación de texturas alteradas en células

que parecían normales a partir de muestras de esputo.

Automatización en histología

El análisis automatizado de las preparaciones en la citología

es una tarea exigente. Aún más difícil es la interpretación y
el análisis automatizados de las muestras histológicas debi-
do a la complejidad de las imágenes. Hasta hace poco tiem-
po, el análisis automatizado de las imágenes histológicas
se consideraba una tarea insuperable, excepto en las aplica-
Recto “normal”

Adenocarcinoma lejano

Adenocarcinoma
adyacente

Adenoma

Adenocarcinoma

ciones más simples. Sin embargo, con el desarrollo de los

poderosos procesos de computadora y el uso de la metodo-
logía experta del sistema, ahora es posible el desarrollo de
los sistemas con visión para las tareas complejas de pro-
yección de imágenes. Esto requiere la definición del cono-
cimiento referente a los componentes que comprenden la
imagen y sus interrelaciones. Éstos se definen en un archivo
Figura 7-16 Esta gráfica muestra el índice del fenotipo de la y se utilizan para conducir las acciones de un sistema exper-
cromatina cuantificado mediante el análisis de la textura en la to de la segmentación de la muestra. Los objetos se acep-
mucosa normal a una distancia (lejana) a partir del adenocarci- tan o rechazan como componentes histológicos con base en
noma colorrectal y en su contigüidad. Puede observarse que hay criterios cuantitativos explícitos. Los objetos rechazados se
una tendencia monotónica con el aumento de anormalidades a
pueden seleccionar para el proceso de imagen adicional y
medida que es mayor el acercamiento a la tumoración. Esto des-
taca los cambios vinculados con la malignidad (CVM) en la or-
facilitar su identificación. Una vez que se identifican todos
ganización de la cromatina en las células normales que circundan los objetos, la muestra histológica se reconstruye y ello per-
a una lesión maligna. La gráfica también muestra las alteraciones mite la medición de características histométricas relevantes.
principales de la organización de la cromatina dentro de adeno- Esta metodología ahora se aplica con éxito al análisis de
mas y adenocarcinomas. colon, próstata y mama (fig. 7-17).
80 CAP. 7 MÉTODOS CUANTITATIVOS EN PATOLOGÍA TISULAR

Figura 7-17 Automatización en histología. Con un sistema experto de visión se pueden identificar de manera automática las glándulas
colorrectales y sus componentes; se segmentan y se efectúan mediciones que pueden emplearse para medir de modo objetivo el grado
de displasia colorrectal.

Inmunohistoquímica cuantitativa sea capaz de identificar este color en preparaciones celu-

Uno de los avances principales en patología diagnóstica
durante los últimos 30 años es la visualización microscó-
pica de proteínas mediante métodos inmunocitoquímicos
(véase cap. 4). A pesar de ello, evaluar la reacción de tin-
ción es aún subjetivo, no sólo para evaluar el número de
células inmunopositivas sino también en la determinación
de la intensidad de la reacción de marcado. Las técnicas vi-
suales se basan en un sistema de marcación numérico para
el porcentaje de células positivas y la intensidad con la cual
se suman para proporcionar una inmunomarcación total en
casos específicos. Incluso este acercamiento bien defini-
do acusa una mala reproducibilidad cuando se compara la
marcación generada por un experto y la de otro clínico en
la misma muestra de tejido. Por esta razón, muchos fabri-
cantes del instrumento comercializan ahora equipos con
análisis de imagen, que pueden extraer datos cuantitativos
inmunohistoquímicos a través del análisis de la informa-
ción densitométrica de imágenes digitales de color. Como
la molécula indicadora primaria tiene un color específico,
es importante que el sistema de la proyección de imagen
lares y distinguirla de cualquier otra contratinción. Existen
también problemas relacionados con la estandarización y
el control de calidad en la inmunocitoquímica cuantitativa
y se recomienda el uso de controles sobre el portaobjetos
de inmunorreactividad definida. El punto principal en el de-
sarrollo de la inmunohistoquímica cuantitativa ha sido la
evaluación cuantitativa de los receptores de estrógeno y pro-
gesterona y positividad de HER2/neu en el cáncer de mama.
La automatización es también la fuerza impulsora principal
y ahora se dispone de muchos sistemas comerciales enfoca-
dos en el procesamiento rápido de las microconfiguraciones
de tejido para la identificación de biomarcadores inmunoci-
toquímicos potenciales para diagnóstico, pronóstico y res-
puesta a la terapia.
El portaobjetos digital
Los avances recientes en proyección de imagen digital
proporcionan la capacidad de analizar y registrar de forma
digital un portaobjetos microscópico completo (fig. 7-18).

Figura 7-18 Portaobjetos digital. A la izquierda se muestra la exploración de un corte completo de tejido de la próstata. La muestra
original del tejido era de 27 ⫻ 9 mm. Con exploración a 40 ⫻ se obtuvo una imagen digital de 58 877 ⫻ 42 336 pixeles en 24 bites de
color. La imagen final fue de 456 megabites de tamaño. La caja pequeña enmedio de la imagen se puede agrandar de manera electrónica
para mostrar el detalle en el cual se registró la imagen (derecha).
 LECTURAS ADICIONALES
Esto se puede realizar a gran amplificación para conservar
el detalle microscópico de la muestra y el portaobjetos pue-
de verse a cualquier amplificación digital si se agranda o
reduce la imagen sobre la pantalla. Las dimensiones com-
pletas de la imagen habrían hecho de esto una tarea impo-
sible hace apenas algunos años. En la actualidad, con el
procesamiento rápido se ha desarrollado el programa que
permite el análisis y la revisión rápidos de estas imágenes
en megapixeles. Esto permite que los casos de patología se
distribuyan entre los centros de forma digital, ya no más en
las diapositivas. El análisis de portaobjetos completos tam-
bién facilita el estudio automatizado de las características
del tejido y la célula con la observación de la computadora,
esto último cada vez más importante en la evaluación de
las microconfiguraciones de tejido. El análisis de imágenes
completas de esta manera todavía es exigente, pero con la
utilización automatizada de portaobjetos, dado que es posi-
ble sin la intervención humana, tiene un potencial enorme
para facilitar el análisis automatizado en la investigación y
la práctica de la patología.
Conclusión
Sin duda alguna, la medición en patología mejora la inter-
pretación visual convencional. Sin embargo, la incorpora-
ción de técnicas a la práctica común ha sido lenta y lo es
todavía. Esto se atribuye a diversos factores y a la carencia
de pruebas clínicas a gran escala para probar la eficacia de
la medición de problemas diagnósticos. La mayor parte
de los estudios se ha realizado en una cantidad relativamen-
te pequeña de casos bajo condiciones semicontroladas. Aun
cuando los estudios a gran escala han ilustrado el valor y
81
la relación costo-beneficio de la medición de la muestra
tisular, pocos centros han adoptado estas técnicas. Esto
se debe muchas veces a las restricciones financieras y de
tiempo impuestas a los patólogos, lo cual limita el esfuerzo
adicional necesario para generar datos numéricos a partir
de las muestras del enfermo. Las escasas instituciones que
ofrecen la medición en la patología de rutina (sobre todo
en los Países Bajos y Estados Unidos) cobran este servicio
adicional. Dicho costo lo absorbe el paciente, el asegura-
dor o el proveedor del cuidado médico y las mediciones
las efectúa sobre todo el personal técnico. La promoción
del fabricante de equipo y la introducción de técnicas más
automatizadas, en combinación con la necesidad de cuan-
tificar nuevos marcadores desarrollados por las compañías
farmacéuticas, pueden ser cuestiones que definan el futuro
de la medición en la patología diagnóstica de rutina. Esto
podría modificar en grado notable la forma de practicar la
patología y complementar la capacidad diagnóstica del pa-
tólogo; con ello se proporcionaría el soporte objetivo para
tomar decisiones diagnósticas y delinear el pronóstico.
Lecturas adicionales
Baak JPA, Janssen E. Expert Opinion: DNA Ploidy analysis in
Histopathology. Histopathology 2004; 44: 603.
Bartels PH. Future directions in quantitative pathology: digital
knowledge in diagnostic pathology. J Clin Pathol 2000; 53:
31-37.
Grohs HK, Husain OAN. Automated Cervical Cancer Screening
1994: Igaku-Shoin, New York.
Hamilton PW, Allen DC (eds). Quantitative Clinical Pathology.
1995: Blackwell Science, Oxford.
Marchevsky AM, Bartels PH (eds). Image Analysis. A primer for
pathologists. 1994: Raven Press, New York.
 8
Marcadores de proliferación en histopatología
Cheryl E Gillett y Diana M Barnes
Introducción
En los tumores, la tasa a la cual las células proliferan tie-
ne un efecto significativo sobre el pronóstico. Puesto que
la actividad proliferativa se calculó primero de modo muy
general al medir el cambio del tamaño de una masa du-
rante un periodo, el tema completo de la proliferación y
la forma de medirla han prosperado y ahora se dispone de
centenares de publicaciones sobre el tema. Existe una co-
rriente continua de trabajos que ha introducido nuevos mar-
cadores, combinado marcadores establecidos, modificado
las técnicas de demostración y promovido técnicas nove-
dosas de evaluación. Tal información es una perspectiva
desalentadora para la persona inexperta que desea medir
la proliferación y obliga a formular la pregunta: “¿cuál es la
mejor manera de hacerlo?”
Antes de describir algunas de las diversas maneras de
cuantificar la proliferación es importante tener una com-
prensión básica del ciclo celular, ya que todos los marca-
dores demuestran un aspecto particular. El ciclo celular
completo o la etapa “fracción de crecimiento” tiene cua-
tro fases: Gap 1 (G1), síntesis del DNA (S), Gap 2 (G2)
y mitosis seguida por citocinesis (M). Durante la fase del
ciclo celular completo, la célula produce de manera se-
cuencial las proteínas necesarias para posibilitar la réplica
del DNA y división nuclear y celular subsiguientes. Los
puntos de comprobación existen en todas las fases del ciclo
para determinar el estado de la célula antes de ingresar a
la fase próxima. En condiciones normales, sólo las células
con DNA normal progresan a la siguiente fase. Las célu-
las defectuosas de cierta manera se detienen hasta que se
repara el DNA o se dirigen hacia la muerte programada de
la célula (apoptosis). Todas las células pueden ingresar a
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
una fase de no proliferación o aciclicidad, que se conoce
como Gap 0 o (G0). Las células conservan su viabilidad y
pueden moverse de nueva cuenta dentro del ciclo cuando
sea necesario.
El término “tasa de proliferación” se utiliza con frecuen-
cia para describir la “cantidad” de un marcador de prolife-
ración en material clínico. Por lo regular, estas mediciones
se realizan en una pieza de tejido en un momento específi-
co y, por lo tanto, el término “tasa” es inadecuado. “Activi-
dad” proliferativa es una expresión más exacta de esta clase
de evaluación y el concepto “tasa” debe reservarse para los
métodos que miden el cambio respecto del tiempo.
Marcadores de proliferación
El número de los llamados marcadores de proliferación
sigue en aumento. Se describen a continuación los que es-
tán razonablemente bien establecidos y han proporcionado
información pronóstica.
Cuenta mitótica o índice de actividad mitótica (IAM)
Las mitosis son los únicos marcadores proliferativos
que se pueden identificar y cuantificar en un corte teñido
con hematoxilina y eosina (H-E) convencional (fig. 8-1).
Sin embargo, no son siempre fáciles de reconocer y pueden
confundirse con los núcleos hipercromáticos o los núcleos
en las fases iniciales de la apoptosis. La fijación inadecua-
da, corte deficiente de la sección y el sobreteñido pueden
conducir a dificultades en el reconocimiento de las mitosis
y pueden incluso afectar el número de las mitosis identifi-
cadas.
84 CAP. 8 MARCADORES DE PROLIFERACIÓN EN HISTOPATOLOGÍA
Figura 8-1 Figuras mitóticas en una muestra teñida con hema-
toxilina y eosina (H-E) convencional (400 ⫻).
Calcular la actividad proliferativa de una pieza de teji-
do de acuerdo con el número de mitosis presentes puede
parecer al principio una tarea sencilla. No obstante, se han
desarrollado varios métodos de evaluación a través de los
años, y a pesar del valor reconocido de las mitosis como
marcadores de la proliferación, no ha dejado de ser con-
troversial el método “correcto” de evaluación. El primer
método formal de evaluación usado fue una “cuenta” mi-
tótica, esto es, una escala de cálculo (0, +, ++) usada por
muchos patólogos. Una cifra mitótica cuenta el número de
mitosis presentes en un número de campos de alto poder
(CAP) y presenta los resultados como el número medio de
mitosis por CAP. Para hacer más reproducible el método
se han hecho algunas depuraciones, incluidas la evaluación
de las células en la periferia de la lesión, realización de la
cuenta en campos consecutivos y definición del área de los
CAP. La cuenta mitótica es una parte integral de la cla-
sificación de la infiltración de los carcinomas mamarios,
mediante los criterios modificados de Bloom y Richardson;
también se utiliza en la determinación del diagnóstico y el
pronóstico de los sarcomas de tejido blando.
Para superar algunas de las inconsistencias relacionadas
con una cuenta mitótica se introdujo el índice de la activi-
dad mitótica. Con este método de evaluación el número de
mitosis se expresa como una proporción del número de cé-
lulas en interfase. El número total de células en interfase y
las figuras mitóticas se cuentan en CAP consecutivos hasta
que el corte se muestrea lo suficiente. Puesto que el IAM
mide la proporción de mitosis en la lesión, no se relaciona
o lo afecta el área del CAP. También considera variaciones
de la celularidad de la lesión y el tamaño de la célula. Un
índice de actividad mitótica dura alrededor de 10 minutos
más que una cuenta mitótica, pero es una manera más exac-
ta de comparar la proporción de mitosis presentes en los
tumores.
Otra forma de identificar figuras mitóticas consiste en
emplear anticuerpos como el MPM2. Estos métodos se di-
rigen a reducir las ocasiones de incluir cuerpos apoptóticos
en una cuenta mitótica y también son susceptibles al análi-
sis automatizado.
Regiones organizadoras del nucleolo (RON)
Las RON son los sitios de los genes del rDNA y están pre-
sentes en grupos o asas sobre un número de cromosomas
específicos. Al tener varios sitios de transcripción, la célula
puede continuar con la demanda de los ribosomas siempre
que sea necesario. Las proteínas relacionadas con RON,
como lo indica su nombre, se sitúan muy cerca de las
RON y se ha demostrado que funcionan como marcadores
de la proliferación. Las proteínas relacionadas con RON
son argirófilas, se demuestran con una técnica de plata y
Figura 8-2 Las regiones organizadoras del nucleolo (AgNOR)
relacionadas con proteínas se demuestran mediante una técnica
de plata (1 000 ⫻).
se les conoce entonces como AgNOR. Éstas pueden verse
como puntos negros pequeños dentro del núcleo (fig. 8-2).
Se considera que el número de AgNOR presente refleja la
producción de ribosomas y por tanto la síntesis proteínica
dentro de la célula. La valoración de las AgNOR resultan-
tes se ha considerado no sólo como un marcador de la ac-
tividad proliferativa, sino también como un método para
distinguir entre lesiones benignas y malignas, una medida
del tumor ploide y del grado de malignidad.
Las AgNOR son en extremo difíciles de contar y al-
gunos autores anteriores también se refirieron a su patrón
dentro del nucleolo como “racimos” y “AgNOR satélites”.
La evaluación no era reproducible, lo que explicó en buena
medida la variación notificada de su valor pronóstico. Di-
versas publicaciones describen el uso de los analizadores de
 MARCADORES DE PROLIFERACIÓN 85

imagen para cuantificar la presencia de AgNOR y muchas fusa como ciclina en algunos trabajos) desempeñaba un
han demostrado que el área media ocupada por las AgNOR papel en la réplica del DNA y la reparación del DNA. Esta
dentro del núcleo proporciona información pronóstica. dualidad condujo a la gran variación en cuanto a su valor
como marcador de proliferación. Su expresión parece rela-
cionarse con la proliferación en tejidos que tienen células
Demostración inmunohistoquímica de la proliferación embrionarias activas, pero la relación es menos clara en
las lesiones epiteliales. La proteína también tiene una vida
El primer anticuerpo que se reconoció como marcador de la media larga y por tanto se detecta aún más tiempo des-
actividad proliferativa fue el Ki67 monoclonal (mKi67). El pués de su periodo funcional dentro del ciclo celular. Otro
significado funcional de la proteína Ki67 es aún impreciso, anticuerpo, KiS1, también se consideró de manera inicial
a pesar de que se la ha estudiado bien en el plano molecu- como sobresaliente contra el antígeno Ki67 y un equivalen-
lar. Pese a ello, se ha establecido que la proteína se expresa te resistente al fijador de mKi67. Pese a ello, la evaluación
durante todas las fases del ciclo celular, pero no durante subsiguiente del anticuerpo ha demostrado que detecta
la etapa de aciclicidad. El mKi67 se ha usado en muchos la topoisomerasa II alfa, una de las enzimas que controla
estudios y la medida resultante de la actividad proliferativa los rompimientos de trenzado simple y doble en el DNA
se equipara bien con otros marcadores establecidos para la durante la replicación y la transcripción. A pesar de este
proliferación, entre ellos las cuentas mitóticas y el índice nuevo hallazgo, el KiS1 todavía se utiliza como un mar-
de marcado con timidina (fig. 8-3a,b). No obstante, la des- cador de la actividad proliferativa cuando se expresa en
ventaja con el anticuerpo mKi67 consiste en que el área
del antígeno que reconoce es muy sensible a la fijación y
la antigenicidad se pierde después de los procedimientos
estándar de fijación con formaldehído e infusión en para-
fina. En consecuencia, es posible llevar a cabo de forma
prospectiva estudios pronósticos con mKi67 en muestras
de tejido fresco congelado.
El potencial del mKi67 como marcador de la prolife-
ración proporcionó el impulso para producir anticuerpos
similares a las proteínas que eran funcionales durante el
ciclo celular, pero lo suficientemente resistentes para so-
brevivir a la fijación con formalina y al procesamiento con
parafina, lo cual dotó al marcador de una aplicación mucho
más amplia. Cuando se desarrolló un anticuerpo contra el
antígeno nuclear de la célula en proliferación (PCNA), se
lo consideró el equivalente resistente al fijador de mKi67 Figura 8-4 El antígeno nuclear de la célula en proliferación se
(fig. 8-4). Sin embargo, después del entusiasmo inicial, se identificó por el anticuerpo de la PC10 en tejido fijado en forma-
encontró que el PCNA (también conocido de forma con- lina impregnado en parafina (400 ⫻).

Figura 8-3 El antígeno Ki67 se reconoce con el anticuerpo monoclonal Ki67 en tejido congelado a partir de un tumor que prolifera
con rapidez (a) y lentitud (b) (200 ⫻).
86 CAP. 8 MARCADORES DE PROLIFERACIÓN EN HISTOPATOLOGÍA

Figura 8-5 La topoisomerasa II alfa se detectó mediante el anticuepo KiS1 en tejido fijado en formalina impregnado en parafina a partir
de un tumor que prolifera con rapidez (a) y lentitud (b) (400 ⫻).

todas las fases del ciclo celular (fig. 8-5a,b). Sin embargo,
el KiS1 es apenas menos específico que el mKi67, dado
que detecta un cierto nivel de proteína después que la célu-
la completa el ciclo y se halla en una fase acíclica. Varias
publicaciones, que son necesarias para proporcionar una
información proliferativa más exacta y reproducible, han
notificado el uso de estos anticuerpos con modificaciones
para el método y el procedimiento de evaluación.
Los anticuerpos establecidos para detectar Ki67, y por
consiguiente las células en proliferación, son el Ki67 poli-
clonal (pKi67) y el MIB1 monoclonal. Ambos reconocen la
parte de la proteína estructural Ki67 y pueden continuar la
unión al antígeno después de la fijación y la impregnación
en parafina (fig. 8-6). El MIB1 y la expresión de pKi67 han
Figura 8-6 Antígeno Ki67 reconocido mediante anticuerpo
demostrado un nexo cercano con el anticuerpo mKi67 y
MIB1 en tejido fijado en formalina e impregnado en parafina de
su información de la actividad proliferativa se correlaciona un tumor que prolifera con rapidez (400⫻).
bien con otros marcadores. Se han añadido al desarrollo
de estos anticuerpos las mejoras recientes de los méto-
dos de recuperación del antígeno más allá de la digestión tras emplear la inmunocitoquímica con un anticuerpo anti-
proteolítica. La recuperación con mediación de calor del bromodesoxiuridina (fig. 8-8). Una desventaja es que am-
antígeno es esencial para el uso de ambos anticuerpos en bos métodos necesitan material viable para incorporar los
material embebido en parafina y fijado en formalina. Inclu- nucleótidos dentro del DNA. Además, la detección de la
so el mKi67 se puede utilizar en material impregnado en timidina radiomarcada trae consigo problemas de equili-
parafina después de la recuperación del antígeno, aunque brio con la velocidad del desarrollo de las autorradiografías
los resultados no son tan constantes como en los casos de y con aspectos de seguridad de la técnica. No obstante, los
pKi67 o MIB1. resultados son buenos cuando los realizan médicos expe-
rimentados y proporcionan una evaluación exacta de la
proporción de células en la fase S. Éstas son técnicas espe-
Índice de marcado con timidina (IMT) cializadas y no se incorporan con facilidad en laboratorios
y bromodesoxiuridina (IMB) de histopatología con cualquier grado de confiabilidad.
En fecha reciente se ha empleado el marcado de bro-
Ambas técnicas implican la incorporación de un nucleótido modesoxiuridina en combinación con la citometría de flujo
durante la fase S que puede demostrarse a continuación. para medir la proliferación in vivo y ha proporcionado una
En el caso del IMT, la timidina se gradúa y se demues- medida real de la “tasa” de proliferación. A los pacientes
tra su incorporación mediante autorradiografía (fig. 8-7). se les inyecta bromodesoxiuridina, que se incorpora en las
Para la bromodesoxiuridina, la incorporación se evidencia células durante la síntesis del DNA. De la lesión se recoge
 MARCADORES DE PROLIFERACIÓN
Figura 8-7 Detección autorradiográfica de la timidina incorpo-
rada dentro del núcleo de células en proliferación (200 ⫻).
Figura 8-8 Detección inmunohistoquímica de bromodesoxi-
uridina incorporada dentro del núcleo de células en proliferación
(400 ⫻).
una biopsia de varias horas después de la inyección y a
partir de este tejido se pueden medir en células individuales
la presencia de la incorporación de bromodesoxiuridina y
el contenido de DNA. La relación entre tiempo, inyección
y muestreo, incorporación de bromodesoxiuridina y con-
tenido de DNA determina la tasa a la cual las células en la
lesión proliferan para determinarse.
Citometría de flujo
La citometría de flujo es uno de los métodos más confiables
y reproducibles para medir la actividad proliferativa y se
puede usar en material citológico, fresco o fijado, impreg-
nado en parafina. Al cuantificar la cantidad de DNA en los
núcleos individuales separados de una muestra de tejido se
87
puede crear un histograma que revela los números de célu-
las con cantidades similares de DNA. El análisis automa-
tizado de estos histogramas permite calcular la proporción
de células en cada fase del ciclo celular. En consecuencia,
la información de la actividad proliferativa es la proporción
de células en la fase S, o la fracción de la fase S, que es de
enorme interés.
La citometría de flujo es uno de los métodos más objeti-
vos de evaluación de la actividad proliferativa, pero como el
tejido tiene que desagregarse antes del análisis, los resulta-
dos no se pueden relacionar con la morfología y la muestra
puede incluir elementos normales, benignos e inespecíficos
del tejido bajo estudio. Además, al usar el material incluido
en parafina, una proporción sustancial del tejido es necesa-
ria e incluso entonces el número de núcleos incompletos o
mal preservados en la muestra significa que alrededor de
una cuarta parte de los histogramas no se puede interpretar
con exactitud. Se han desarrollado en grado considerable
las capacidades del citómetro de flujo desde los inicios al
medir un solo parámetro, el contenido de DNA. Ahora se
dispone de instalaciones para realizar las mediciones múl-
tiples y su uso se ha especializado aún más. La medición
del contenido de DNA es más probable que se realice junto
con la medición de una o más proteínas inmunofluorescen-
tes detectadas, lo cual suministra información sobre la re-
lación entre la fase del ciclo celular y la expresión de la
proteína. La técnica de la citometría de flujo y el análisis
automatizado de los resultados sugieren un acercamiento
más “científico” para determinar la proliferación; empero,
un buen número de estudios ha demostrado que puede ob-
tenerse información similar por conteo cuidadoso de las
mitosis y positividad al Ki67 o MIB1, que se puede obtener
en laboratorios de histopatología sin equipo especial.
Otros marcadores
No han dejado de aparecer otros marcadores potenciales de
la proliferación; muchos de ellos son anticuerpos cultivados
contra las proteínas que presentan un nivel creciente de ex-
presión durante el ciclo celular. En una manera similar al
Ki67 y PCNA, se ha aceptado que si un antígeno está pre-
sente durante una fase específica o fases del ciclo celular,
entonces su detección significa que puede utilizarse para
identificar las células que se encuentran en proliferación.
Entre estos supuestos marcadores figuran diversos miembros
de la familia de la ciclina y sus cinasas dependientes de la
ciclina (cdks) y la proteína del retinoblastoma (pRb). Otras
proteínas relacionadas con la replicación del DNA también
se han identificado como marcadores potenciales, incluidas
proteínas de mantenimiento del minicromosoma (Mcm). Es-
tas proteínas Mcm (de las cuales hay seis, Mcm 2, 3, 4, 5, 6
88 CAP. 8 MARCADORES DE PROLIFERACIÓN EN HISTOPATOLOGÍA
y 7) intervienen en el inicio de la replicación del DNA y la
prevención de la re-replicación de un solo ciclo celular.
Infortunadamente, muchos de estos marcadores celula-
res relacionados con el ciclo poseen una expresión alterada
en células malignas, debido a los cambios del trayecto re-
gulador de las proteínas que controlan el ciclo celular y no
son marcadores convenientes de la actividad proliferativa.
Como consecuencia del gran interés en identificar las pro-
teínas que controlan el ciclo de la célula, se desarrollan con
frecuencia nuevos anticuerpos y se comercializan a gran
escala. Esto sobrepasa el ritmo al cual su potencial como
marcadores de la proliferación puede evaluarse del todo. Por
consiguiente, debe tenerse cuidado al usar cualquier anti-
cuerpo nuevo para asegurar una validación adecuada antes
de aceptarse como marcador de proliferación. No obstan-
te, muchos de los anticuerpos son de interés como blancos
relacionados con tratamientos biológicos específicos, no
tanto como herramientas para medir la proliferación.
La hibridación in situ también se utiliza para demos-
trar la actividad proliferativa. La expresión del mRNA de
la histona 3 (H3) se ha reconocido bien como tal marcador
por varios años y se equipara con otros marcadores que
proporcionan información pronóstica. Las histonas son el
componente proteínico principal de la cromatina y desem-
peñan la función de empaquetar filamentos de DNA en
una forma compacta, el nucleosoma. Como las histonas se
vinculan de modo tan estrecho con el DNA, también se
producen durante la síntesis del DNA. Por lo tanto, la de-
o) 2-7
luj AgNOR
de f NA MCM
a mR Topoisomerasa II
T
a3 í
ton etr
IM Ki-67 y KiS5
PC d e
NA
His itom
e dic
B e
c
IM
F(
SP
Cíclico
Figura 8-9 Relación de diferentes marcadores de proliferación con las fases del ciclo celular.
tección de niveles crecientes del mRNA de la H3 en la fase
S refleja la actividad proliferativa de los tejidos. Se conoce
que los valores del mRNA de H3 disminuyen con rapidez
durante la G2 y ninguna síntesis ocurre una vez que la cé-
lula entra a la fase G0, lo que las convierte en uno de los
marcadores más específicos de la actividad proliferativa.
Empero, este método no se emplea de forma extensa, sobre
todo porque la técnica de hibridación in situ requerida para
detectar el mRNA no es asequible para la mayor parte de
los laboratorios; además, tampoco los resultados son signi-
ficativamente mejores que los de otros marcadores que no
requieren un método de detección especializado. Las técni-
cas de hibridación in situ, y en especial las no isotópicas, se
han introducido de modo gradual en más laboratorios, así
que tal vez los datos de la proliferación se obtengan en el
futuro con más frecuencia mediante el mRNA de la H3.
La figura 8-9 muestra cómo los diferentes marcadores
de la actividad proliferativa se relacionan uno con otro y
con las diferentes fases del ciclo celular.
Uso práctico de marcadores
La elección del método de medición para la actividad pro-
liferativa depende en buena medida del tipo de material
que se evalúa. Si un estudio retrospectivo se conduce con
material impregnado en parafina, no pueden utilizarse los
métodos como IMT, IMB y mKi67.
M
Cu PM2
ent
am
itót
ica
/ín
Muerte
de
ac
tiv
id
ad
mi
tót
ica
G0
Acíclico
 MÉTODO DE EVALUACIÓN
Los puntos a considerar para la preparación del tejido
incluyen el tipo de fijador usado, puesto que éste influye en
todos los marcadores, y el efecto que puede causar un retra-
so de la fijación. Las figuras mitóticas son muy difíciles de
distinguir de los cuerpos apoptóticos en algunos fijadores
con base de alcohol; asimismo, también puede ser difícil
identificar la AgNOR. La expresión del antígeno se reduce
e incluso se pierde en algunas soluciones fijadoras, a pesar
del uso de la recuperación del antígeno regulada por calor.
Aun en la citometría de flujo los colorantes nucleares son
incapaces de ligar la cromatina cuando se utiliza un fijador
que contiene metal. Algunos estudios muestran que un re-
traso de la fijación reduce el número de mitosis en el tejido
y, por consiguiente, se subestima la actividad proliferativa.
Por último, casi nunca se considera que el espesor de la
muestra tenga un efecto importante sobre la demostración
y evaluación de los marcadores. No obstante, así como se
altera la calidad de la tinción, las cuentas mitóticas y de
AgNOR varían según sea el espesor de la sección y en la
inmunohistoquímica la tinción resultante cambia de inten-
sidad, un factor importante si ésta se incluye como parte de
la evaluación. Todos los cortes que se someten a la recupe-
ración del antígeno regulada por calor deben montarse en
portaobjetos cubiertos con adhesivo y calentarse; de otra
forma las muestras se levantan y algunas se desprenden por
completo.
Método de evaluación
Una vez que se selecciona el marcador más conveniente de
la proliferación y se pone en práctica el método, la siguiente
pregunta es: “¿cómo se efectúa la cuenta?” Esto se conside-
ra a menudo como la etapa final y más fácil de la técnica,
pero requiere un acercamiento metódico para obtener resul-
tados constantes y reproducibles. En esta fase la citometría
de flujo tiene una ventaja sobre otros marcadores, ya que
miles de células se pueden determinar con rapidez con un
grado satisfactorio de consistencia entre una muestra y otra.
El resto de los métodos en los cuales se demuestra un mar-
cador de proliferación en un corte histológico tiene varios
criterios similares que deben cumplirse.
Primero, el tiempo tomado para realizar la evaluación
debe equilibrarse contra el valor de la información obte-
nida. Sería inútil tomar 20 minutos para llevar a cabo una
cuenta formal sobre una muestra si puede conseguirse tal
información del pronóstico mediante un método semicuan-
titativo que toma una fracción de ese tiempo. En segundo
lugar, cualquier método de evaluación empleado debe ser
confiable y consistente.
Casi todos los métodos de evaluación usados con los
marcadores descritos aquí son cuentas o cálculos conven-
cionales, pero existe en el mercado un número creciente de
89
sistemas basados en el análisis de la imagen que usan un
método diferente de evaluación. Con métodos manuales,
varios criterios tienen que cumplirse para reducir la subje-
tividad relacionada con la evaluación, de tal modo que sean
posibles las comparaciones, sea entre las muestras o los
evaluadores. Los siguientes puntos siempre deben conside-
rarse antes de emprender cualquier valoración y no deben
soslayarse durante el curso del estudio.
¿Qué áreas de la muestra deben evaluarse?
Por tradición, el “borde creciente” de un tumor se consi-
dera el área más apropiada para la evaluación. Ésta tiende
a ser la más proliferativa y es con frecuencia el área en la
que se calcula la cuenta mitótica para un grado histológico.
Una alternativa consiste en utilizar el área “peor” o más
mal diferenciada, pero ello proporciona deficientes carac-
terísticas para el pronóstico. Seleccionar el borde creciente
es virtualmente imposible en algunas formas de prepa-
ración del tejido, como las biopsias con aguja fina o las
resecciones transuretrales de la próstata. Por otra parte, el
IMT y los métodos del IMB requieren que el tejido fres-
co esté cortado en piezas muy pequeñas para permitir el
acceso de los nucleótidos al núcleo. De nueva cuenta, es
casi imposible evaluar el “borde creciente”.
Si se lleva a cabo una cuenta formal, entonces debe eva-
luarse un número suficiente de células para ser representa-
tivo de la muestra y de ese modo se reduce el efecto de la
selección del área; si se realiza un cálculo de la frecuencia
del marcador, entonces se evalúa la sección completa. Los
sistemas automatizados tienen el beneficio de efectuar una
evaluación formal en áreas seleccionadas a través de la
muestra completa.
¿Qué método de valoración debe usarse?
Ya no es muy apropiado llevar a cabo una valoración de
proliferación sin definir los criterios utilizados para alcan-
zar el resultado final. Es importante decidir si la intensidad
de la tinción es una característica importante. Desde luego,
ésta no es una consideración para evaluar las mitosis o las
AgNOR, pero con marcadores basados en la inmunohisto-
química puede representar un aumento de la expresión de
la proteína sobre su nivel basal habitual, como en el caso
del PCNA. Si la intensidad de la tinción es relevante, en-
tonces debe combinarse con una cuenta o un cálculo de la
proporción de células teñidas.
La cuantificación exacta de cualquier marcador exi-
ge hacer una cuenta formal de las células que expresan
el marcador y de aquellas que no lo hacen, de tal mane-
ra que se obtiene un “índice proliferativo”. Una mirada
90 CAP. 8 MARCADORES DE PROLIFERACIÓN EN HISTOPATOLOGÍA
rápida a las publicaciones que notifican una cuenta revela
la considerable variación del número total de células eva-
luadas. Para ser estadísticamente correctos es necesario
evaluar suficientes números de células para reducir el
error de conteo a un nivel aceptable; en condiciones nor-
males, se considera que éste debe ser menor de 5%. Si tan
sólo se evalúan algunas células, el resultado podría so-
brestimar o subestimar en grado notorio la actividad pro-
liferativa verdadera. Al aumentar el número de las células
incluidas en la evaluación se reduce este error de manera
gradual. Una cifra universal para el número de células a
contar no puede aplicarse a todos los marcadores y a los
diversos tipos de tejido. En general, las cuentas necesitan
incrementarse en tejidos heterogéneos y cuando es baja
la incidencia de la demostración del marcador. Por ejem-
plo, el MIB1 detecta células en todas las fases del ciclo
celular excepto en la G0, mientras que un índice mitótico
“detecta”sólo en una parte limitada del ciclo celular. Por
lo tanto, en cualquier pieza del tejido la proporción de
células que expresan MIB1 es mucho más alta respecto
de las que experimentan mitosis. Por consiguiente, para
alcanzar el mismo nivel aceptable de error para ambos
marcadores, el número total de células evaluadas por el
índice de la actividad mitótica necesitaría ser más grande
en comparación con la cuenta MIB1.
Existe poco trabajo publicado enfocado en comparar
métodos de conteo, pero en general las cuentas superiores
a 1 000 células parecen reducir el error de conteo a már-
genes aceptables. Algunas veces, la cuenta de tantas cé-
lulas puede ser un problema en muestras muy pequeñas,
por ejemplo, biopsias de aguja fina, o cuando la lesión de
interés forma sólo una parte pequeña del tejido examina-
do, como el carcinoma ductal mamario in situ u otras neo-
plasias intraepiteliales. En tales casos puede ser necesario
evaluar muestras múltiples del tejido para conseguir un
registro exacto de la actividad proliferativa.
Como ya se mencionó, es importante equilibrar el tiem-
po gastado en evaluar un marcador proliferativo con la
cantidad de información proporcionada. Aunque la deter-
minación de más células incrementa la exactitud, muchas
veces no es práctico y desde luego no suscita la disposición
de un histopatólogo ocupado. Han ganado aceptación las
valoraciones semicuantitativas debido a su velocidad rela-
tiva de valoración y porque correlacionan bien con mar-
cadores evaluados de modo más cuantitativo. Por muchos
años se han contado y expresado las mitosis por campo de
alto poder, que es en verdad una valoración semicuantitati-
va. La información pronóstica para la mama y los tumores
de músculo liso ha mejorado con una técnica más rigurosa
para contar las mitosis, aunque conserva el uso de campos
de alto poder. Ahora existen pautas en cuanto a los CAP a
examinar y el área de la muestra bajo evaluación. También
se observa considerable variación del tamaño de los CAP
entre diferentes microscopios, por lo que es importante
citar el área del CAP utilizada para efectuar la cuenta mitó-
tica. Con apego a estas pautas generales se ha alcanzado una
reducción considerable de la variabilidad del observador.
Si se utiliza una valoración semicuantitativa, es impor-
tante recordar que tan sólo se trata de una estimación y que
los resultados no deben ser tan precisos; en condiciones
normales es suficiente el uso de cuartiles. La ventaja con
este tipo de evaluación radica en que puede hacerse con bas-
tante rapidez para el conjunto de la muestra que se evalúa,
sin la necesidad de definir el área del corte examinada. Si
es apropiado, una medida de intensidad de la tinción puede
combinarse con la proporción de células teñidas para sumi-
nistrar un registro total.
En el cuadro 8-l se muestra una comparación directa de
los diversos métodos de evaluación y el tiempo que toman
la técnica y la evaluación para marcadores establecidos.
Controles
Como en cualquier técnica, es importante tener controles
durante el procedimiento. No sólo se necesitan las mues-
tras de control metodológico sino también deben realizarse
revisiones para asegurar la consistencia de la demostración
y la evaluación de los marcadores entre las muestras.
El material de control debe siempre incluirse al demos-
trar un marcador de proliferación. Las mismas muestras de
control deben utilizarse a través de un estudio para supervi-
sar la consistencia del interanálisis. Los controles internos,
cuando se conocen los patrones de la tinción de los ele-
mentos específicos del tejido, también son muy útiles para
constatar la calidad de la demostración. Pueden emplearse
también para hacer ajustes al “registro” cuando los cortes
son más gruesos (y por lo tanto la tinción es más intensa) o
cuando el método de fijación es subóptimo.
La reproducibilidad del procedimiento de evaluación
también debe incluirse como parte del aspecto del “con-
trol de calidad” de cualquier estudio o caso individual.
Si se introduce un marcador o un método de evaluación
nuevo, o bien no se ha determinado antes la actividad pro-
liferativa, entonces un “evaluador” experimentado debe
realizar la valoración. La comparación de los datos de
ambos asesores proporciona una guía para la variabilidad
entre un clínico y otro. Cualquier valor discordante se
puede reexaminar con la consulta común. Las habilida-
des del evaluador tienden a mejorar con la práctica; por
lo tanto, lo que se determina al principio de un estudio
debe repetirse al final para asegurar que el resultado es
el mismo y que el método de evaluación ha permanecido
consistente.
 MÉTODO DE EVALUACIÓN 91

Cuadro 8-1 Comparación del tiempo consumido para demostrar y evaluar diferentes marcadores
de la actividad de proliferación

Tiempo para la
Marcador Método de evaluación Tiempo para la técnica evaluación (minutos)
Métodos de conteo
Mitosis Mitosis/10 CAP 5 minutos 5
Mitosis/2 000 células 5 minutos 15
pKi67/mKi67/MIB1/KiS5 Núcleos positivos/1 000 células 2 horas 5-10
KiS1 Núcleos positivos/1 000 células
PCNA Núcleos positivos fuertes/2 000 células 2 horas 15-20
IMT Núcleos marcados/2 000 células 10 a 14 días 15-20
IMB Núcleos positivos/2 000 células 3 horas 15-20
Histona 3 de mRNA Núcleos positivos/2 000 células 24 horas 15-20
AgNOR Número medio/100 células 15 a 45 minutos 20-35

Métodos automatizados
Fracción de fase S Cantidad de tinción nuclear/ 2 a 3 horas >5
(citometría de flujo) célula en > 10 000 células

Métodos de análisis de imagen Porcentaje de tinción positiva 2 horas 15-20

pKi67, MIB1 en relación con todos los no positivos en
un área seleccionada
AgNOR Área media de AgNOR que ocupan 15 a 45 minutos 15-20
núcleos en 150 células

Ahora existen diversos sistemas automatizados de análi-
sis de imagen disponibles en el comercio, con los programas
específicos diseñados para detectar y cuantificar marcadores
de proliferación relacionados con Ki67. Por otra parte, és-
tos pueden adaptarse para el uso con cualquier antígeno
nuclear detectado por medios inmunohistoquímicos. La
evaluación de los marcadores de proliferación puede ser
más exacta y confiable con la ayuda de sistemas automati-
zados, y la evaluación de AgNOR se ha beneficiado en par-
ticular del análisis semiautomatizado. Los AgNOR son en
extremo difíciles de contar con grado de confiabilidad y su
valor de proliferación se ha objetado. La medición del área
media total de sedimentación de plata por núcleo mediante
el análisis de imagen muestra una relación constante con la
actividad proliferativa medida por otros medios y ha mejo-
rado de modo considerable la credibilidad de los AgNOR.
El reconocimiento de células individuales en una
sección histológica es todavía una tarea difícil para un
analizador de imagen y para distinguir una célula débil-
mente inmunoteñida positiva de una célula negativa; aun-
que parezca fácil para el ojo humano, es difícil para un
sistema de análisis. Si una pieza se toma a través de una
esfera, por ejemplo cuando se secciona un núcleo, entonces
los bordes internos de la esfera son menos densos que las
áreas centrales. Si esto se considera en el contexto de un
núcleo teñido por medios inmunohistoquímicos, el núcleo
posee una intensidad de color reducida en la periferia, que
puede ser difícil de distinguir del citoplasma sin teñir. In-
fortunadamente, los programas que pueden reconocer las
diversas características vinculadas con los núcleos que ex-
perimentan mitosis todavía no están disponibles.
Uno de los problemas principales que debe superar
la progresiva adopción de los métodos automáticos de
evaluación es la necesidad de romper con la idea de que
el análisis de imagen debe proporcionar la información
en un formato idéntico al de una valoración visual. En
varios estudios, en los cuales los “marcadores” inmuno-
histoquímicos han demostrado ser útiles en términos del
pronóstico, los sistemas del análisis de imagen compa-
raron áreas de color. Por ejemplo, en cada CAP o área
específica marcada, el analizador compara el área total
de marrón, que revela DAB de un anticuerpo relacionado
con la proliferación, con el área total de azul, que muestra
los núcleos teñidos con hematoxilina. Estos parámetros
se miden dentro de esas áreas seleccionadas y la actividad
proliferativa resultante se muestra por el cociente del área
total del marcador de la proliferación en relación con el
área total de los núcleos. A condición de que sólo los gru-
pos de células malignas se seleccionen, algunos sistemas
de análisis transforman los resultados para presentarlos
en una forma convencional, es decir, como porcentaje de
células positivas.
92 CAP. 8 MARCADORES DE PROLIFERACIÓN EN HISTOPATOLOGÍA
Conclusión
La confusión inicial que padecen los principiantes en la
medición de la actividad proliferativa puede remediarse
con facilidad si se considera cada aspecto del procedimien-
to a un tiempo. En primer lugar, algunos de los marcadores,
como TLI o mKi67, pueden descontinuarse si los tejidos de
interés están fijados e impregnados en parafina. La elección
del marcador también depende de los recursos disponibles
en el laboratorio. Los proyectos específicos, con un núme-
ro limitado de casos, pueden emprenderse a menudo junto
con un laboratorio con instalaciones especializadas. Esto
permitiría aplicar métodos como el análisis citométrico de
flujo o la autorradiografía con timidina marcada. Sin em-
bargo, si la medición de la proliferación es una necesidad
continua, entonces el tipo de método usado para detectar
las células que proliferan debe satisfacer al propio labo-
ratorio. Por esta razón se observa una inclinación por los
métodos “morfométricos” más convencionales, como las
mitosis y AgNOR o los métodos inmunohistoquímicos,
para utilizarse en laboratorios de histopatología.
Los mejores métodos para medir la actividad prolife-
rativa en cortes histológicos se basan aún en el examen
de la proporción de mitosis o células que expresan MIB1.
Ambos están bien documentados en diversos trastornos,
son fáciles de demostrar en términos técnicos, y siempre
que las muestras estén bien preparadas, son relativamente
fáciles de determinar. También suministran resultados re-
producibles que se comparan bien con otros métodos más
laboriosos o dependientes de una máquina, como el IMT
y la citometría de flujo. Persiste la gran discusión acerca
de cómo las mitosis y el MIB1 sirven como marcadores de
la actividad proliferativa. Las mitosis demuestran sólo una
parte relativamente pequeña del ciclo celular y a partir de
la cuenta mitótica o índice mitótico resultante ninguna in-
ferencia puede hacerse alrededor del resto del ciclo celular;
empero, no hay problemas con la falta de especificidad con
este marcador. El MIB1 identifica una proteína presente a
lo largo del ciclo celular, aunque algunas células no expre-
san el antígeno con rapidez en G1 y este efecto represen-
taría de modo equívoco la actividad proliferativa en esos
tejidos particulares. Al igual que la detección de muchas
proteínas expresadas durante el ciclo de la célula, el MIB1
puede también detectarse si la célula ha dejado apenas el
ciclo celular. Se han realizado algunos intentos por desa-
rrollar nuevos marcadores, en particular anticuerpos, para
superar algunos de los problemas de especificidad. Estos
marcadores novedosos deben proporcionar datos de la pro-
liferación y el pronóstico, más allá de lo que proporcionan
las mitosis o el MIB1 si se aceptaran como alternativas via-
bles. Un desarrollo reciente consiste en que la mayoría de
los antígenos relacionados con el ciclo celular, que alguna
vez se evaluaron como marcadores de proliferación, ahora
se han examinado por su potencial como blancos relacio-
nados con terapias.
Al parecer, el debate de la evaluación continuará du-
rante algún tiempo más. Por ejemplo, las mitosis se han
reconocido como marcadores de proliferación por décadas
y aún se promueven nuevos métodos “mejorados” de evalua-
ción. Empero, no debe olvidarse que una vez que se aplica
alguno de los criterios de evaluación, sin importar cuál sea
el método de valoración elegido, la “regla de oro” consiste
en ser consistentes entre un caso y otro. Por supuesto, el
análisis automatizado mejora la exactitud y la consistencia
al cuantificar algunos marcadores de proliferación, pero
todavía no es conveniente para todos los casos. Mientras
tanto, pueden obtenerse resultados suficientemente exactos
mediante una cuenta formal o una evaluación semicuanti-
tativa, siempre que se practique una técnica consistente y
se utilicen los controles adecuados.
Lecturas adicionales
Baak JPA. Mitosis counting in tumors. Hum Pathol 1990; 21:
683-685
Rüschoff J, Plate KH, Contractor H et al. Evaluation of nucleolus
organizer regions (NORs) by automatic image analysis: a con-
tribution to standardization. J Pathol 1990; 161: 113-118.
Cattoretti G, Becker MHG, Key G et al. Monoclonal antibodies
against recombinant parts of the Ki67 antigen (MIB-1 and
MIB-3) detect proliferating cells in microwave-processed for-
malin-fixed paraffin sections. J Pathol 1992; 168: 357-363.
Quirke P. Flow cytometry in the quantitation of DNA aneuploidy
and cell proliferation in human disease. In JCE Underwood
(ed.) Current Topics in Pathology—Pathology of the Nucleus.
1990: Springer-Verlag, New York, 215-256.
 SECCIÓN 2
CITOLOGÍA
 9
Citopatología
Adrian T Warfield
El capítulo proporciona una sinopsis de los principios ge-
nerales de la citopatología diagnóstica. Éste es, en buena
medida, un tema visual y por lo tanto se incluyen abundan-
tes ejemplos e ilustraciones. No es de ninguna manera un
tratado técnico o diagnóstico. Para la cobertura sistemática
y detallada se remite al lector interesado a consultar uno de
los trabajos de referencia, algunos de los cuales se enume-
ran en la parte final de este capítulo.
Introducción
La citología es el estudio científico de la estructura y la
función celulares. La citopatología es una rama de la medi-
cina de laboratorio relacionada con el examen de células,
en la salud y la enfermedad, para propósitos de explora-
ción, diagnóstico e investigación. La exploración implica
la revisión de las muestras de individuos asintomáticos
para detectar cambios premalignos o malignos tempranos.
El trabajo diagnóstico supone la valoración del material de
los pacientes con signos o síntomas establecidos de enfer-
medad.
Es una premisa básica que el contenido de una muestra
de la citología debe representar de forma exacta y reprodu-
cible la población celular del tejido o la lesión. En realidad,
un buen número de variables de confusión atenta algunas
veces contra esta suposición en mayor o menor grado.
Una cuidadosa valoración citomorfológica por micros-
copia de luz es fundamental para la práctica de la cito-
patología de diagnóstico y mucha información se deriva
de la comparación directa de las muestras celulares con
las muestras histológicas correspondientes. Sin embargo,
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
ciertas limitaciones son inherentes en tales estudios de
extrapolación, incluso en muestras apropiadas, bien pre-
servadas y teñidas.
El cultivo celular utiliza líneas de células inmorta-
lizadas para detectar efectos citopáticos víricos y otros
tóxicos. Esto y las novedosas técnicas especializadas de
microscopia, microaspiración y microdisección permiten
el discernimiento en la fisiología dinámica del protoplas-
ma vivo. No obstante, en la actualidad éstas se consideran
marginales en la citopatología diagnóstica corriente y se
reservan por lo regular para el trabajo de diagnóstico o
investigación de virus.
Tipos de muestra citológica
La mayor parte de las muestras clínicas de la citología pro-
cede de uno de los procesos siguientes.
Exfoliación
Las células muestreadas se toman (exfoliadas) de una su-
perficie epitelial. Los ejemplos incluyen las células presen-
tes en esputo (expectorado), orina (expulsada o mediante
catéter o cistoscopio) y secreción del pezón (exprimido)
(figs. 9-1 y 9-2). De manera espontánea, las células exfo-
liadas difieren en su aspecto de las sustraídas por medios
mecánicos, que tienden a desagregarse y disponerse de ma-
nera individual o en racimos pequeños. Tales células adop-
tan a menudo una forma esférica, según sean los factores,
como la membrana celular, fuerzas citoesqueléticas inhe-
96 CAP. 9 CITOPATOLOGÍA

Figura 9-1 Muestra de esputo. a) Esputo mucoide teñido con sangre obtenido por aspiración directa (“trampa de esputo”). Esto ofrece
menos contaminación por secreciones bucofaríngeas que una muestra expectorada. b) Las células epiteliales bronquiales y los macrófagos
alveolares pulmonares indican un muestreo más bajo de las vías respiratorias. Las barras terminales y las microvellosidades superficiales se
pueden ver en los ápices de las células bronquiales en medio de un fondo mucoinflamatorio ralo (Pap, 250 ).

rentes, tensión de superficie, naturaleza del microambiente

local y tiempo transcurrido desde la obtención. Tales célu-
las son susceptibles a una serie de cambios degenerativos
que alteran al citoplasma y al núcleo, como se delinea más
adelante.

Abrasión

Las muestras celulares son el resultado del muestreo de cé-

Figura 9-2 Células transicionales superficiales normales en
orina. Estas células uroepiteliales exfoliadas muestran multinu-
cleación variable correspondiente a “células en paraguas” en cor-
tes histológicos. Obsérvese el fondo sin rellenar (“limpio”) (Pap,
100 ).
lulas a partir de la exfoliación por fuerza física (abrasión).
Ejemplos: cepillado (p. ej., bronquio, cervix), raspado
(p. ej., pezón, piel, cervix) o lavado (p. ej., bronquio); en
tales casos se instila una solución salina isotónica y el
líquido reaspirado se somete a revisión. En contraste con
las células exfoliadas de forma natural, estas células tien-
den a conservarse mejor, a menudo en grupos más grandes
o agregados cohesionados.
 TIPOS DE MUESTRA CITOLÓGICA
Aspiración
Existen pocos órganos o sitios del cuerpo que representan
un acceso difícil para recoger con aguja cierta clase de
material celular para su examen. Las técnicas radiológicas
de proyección de imagen pueden ayudar a localizar pe-
queñas lesiones profundas y móviles que de otra manera
es difícil delinear. Las células se obtienen a través de una
aguja, con o sin aspiración, de una cavidad llena de líquido
o un tejido sólido. Son ejemplos los tumores, los líquidos
pericárdico, pleural o peritoneal (paracentesis) y cefalorra-
quídeo (punción lumbar o cisternal) y el humor vítreo (figs.
9-3 y 9-4).
La aspiración con aguja fina utiliza un instrumento de
calibre fino (19 a 25) unido con firmeza a una jeringuilla y
se introduce en una lesión. El émbolo de la jeringuilla se
retira de modo parcial, de tal manera que se crea un vacío
y se aspiran las células de la lesión. Hay que realizar varios
movimientos en diferentes direcciones a través de la lesión
mientras dura la aspiración para aumentar la recolec-
ción celular. Al término de esto, el émbolo se libera para
97
Figura 9-3 Aspirados pleurales malignos. a) Muestra teñida con
sangre de un derrame pleural unilateral en un paciente sometido
a mastectomía por carcinoma de mama. La microscopia (b y c)
demuestra las células pleomórficas sin cohesión del adenocarci-
noma; muchas tienen una morfología de “sello anular” con abun-
dante mucina intracitoplásmica a la que indenta el núcleo peri-
férico (b, Pap, 100 ; c, MGG, 100 ).
igualar la presión anterior a la extracción de la aguja de
la lesión. Varios accesorios para “tomar la pistola”, dise-
ñados para facilitar la sujeción con una sola mano, están
disponibles en el comercio (la mano opuesta se libera para
la palpación; fig. 9-5). Algunos clínicos prefieren el mues-
treo por aguja sin aspiración para las lesiones localizadas
en un plano superficial. La aspiración con aguja fina ha ga-
nado gran aceptación, en gran parte porque es económica,
rápida y mucho menos traumática y, por lo tanto, se tole-
ra bien con pocas complicaciones y contraindicaciones.
Las lesiones percutáneas casi nunca requieren anestesia
local. Las vías transrectal, transvaginal, transpleural y
transperitoneal mediante un endoscopio también pueden
aspirarse.
Las aspiraciones de la médula ósea son el campo del
hematopatólogo de diagnóstico.
El fracaso para obtener una aspiración satisfactoria no
es atribuible en todos los casos a una técnica deficiente.
Las lesiones desmoplásicas, hialinizadas o vasculares, la
necrosis extensa, el cambio cístico o la hemorragia pueden
imposibilitar el muestreo celular adecuado (fig. 9-6).
98 CAP. 9 CITOPATOLOGÍA
Figura 9-5 Accesorio de la pistola para la aspiración con agu-
ja fina. Preparación de la jeringuilla desechable cargada con la
aguja de calibre 23; este dispositivo permite la manipulación con
una sola mano, de manera que se libera la otra mano para la pal-
pación.
Figura 9-4 Líquido ascítico. a) Alícuota de líquido ascítico turbio
y maloliente, aspirado de un paciente con peritonitis fecal poco
antes de morir. Las microscopias b y c muestran innumerables
bacterias variformes con células de pus. El detrito y el pigmento
son de origen estercoráceo (b, Pap, 100 ; c, MGG, 100 ).
Tumor
viable
Inflamación
perilesional
Necrosis
y cambios
quísticos Hemorragia
intralesional
Figura 9-6 Diagrama esquemático de un tumor durante la aspi-
ración con aguja fina. La porción sólida viable del tumor se per-
fora con la aguja 1 para proporcionar el material potencialmente
diagnóstico; la aguja 2 cruza áreas con necrosis, hemorragia o
cambios quísticos; la aguja 3, que recoge muestras de tejido peri-
lesional, es poco probable que se utilice de esta manera.
 TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN CELULAR
Técnicas para la preparación de frotis
El frotis ideal debe extenderse sin relieves, de modo uni-
forme, fino y liso, para permitir un secado y una fijación
rápidos y facilitar la penetración óptima del colorante. Las
técnicas directas para preparar un frotis implican extender
el material fresco a través de un portaobjetos, mediante otro
portaobjetos, instrumento punzante o espátula (fig. 9-7).
Las técnicas indirectas para preparar un frotis emplean el
material suspendido en líquido, por ejemplo una solución
salina o medio de transporte. Puede realizarse un procedi-
miento de concentración celular como un paso intermedio
para aumentar el rendimiento de una muestra hipocelular.
La formación de un coágulo puede retener en gran me-
dida el componente celular de una muestra y ello impide la
transferencia adecuada del material a un portaobjetos. Si
un coágulo no se puede dispersar por medios mecánicos,
debe procesarse como bloque celular o someterse a una
histología convencional y examinarse a fondo (fig. 9-8).
Los depósitos celulares de trasudados, lavados con
solución salina y de orina pueden no adherirse bien a los
portaobjetos de cristal. Los adhesivos, casi siempre del tipo
proteínico (p. ej., albúmina de suero bovino) o iónico (p.
ej., poli-l-lisina), pueden efectuar la adherencia y maximi-
zar el material celular para el examen.
Otras técnicas empleadas menos comunes incluyen las
impresiones de tacto, el raspado y las preparaciones con-
centradas; esta última tiene aceptación en el diagnóstico
neuroquirúrgico preoperatorio y se prefiere a la histología
convencional en cortes congelados.
Fijación de la muestra
Fijación húmeda
La fijación húmeda deshidrata el protoplasma y coagula las
proteínas, casi siempre con empleo de un líquido basado en
alcohol, sea por inmersión o cobertura. Tal fijación induce
un grado de contracción celular en la preparación final. El
líquido de Carnoy lisa de forma selectiva a los eritrocitos
y puede ser provechoso en muestras teñidas de sangre con
intensidad. Otros fijadores, como el glutaraldehído o la for-
malina, pueden preferirse bajo ciertas circunstancias. El
glicol de polietileno en alcohol proporciona una capa ce-
rosa protectora para el envío postal, que debe eliminarse
antes de una tinción subsiguiente.
Secado al aire
El secado al aire se basa en la evaporación, que debe ser
rápida, y se facilita con el movimiento del aire forzado
99
sobre el portaobjetos, más que de forma pasiva. Este mé-
todo tiende a aplanar las células con un alargamiento evi-
dente en comparación con la fijación húmeda (figs. 9-9 y
9-10). Las preparaciones secadas al aire se fijan después
casi de manera invariable en metanol luego de secarse para
prevenir peligros de infección cruzada.
Los materiales como el líquido de quiste o de lavados
con aguja fina por aspiraciones pueden recogerse en un me-
dio de transporte. Debe recordarse que cualquier muestra
biológica fresca constituye un peligro biológico potencial
para el personal del laboratorio y deben acatarse siempre
las medidas recomendadas de salud y de seguridad.
Técnicas de concentración celular
Centrifugación
Este método es aconsejable para muestras voluminosas,
como los derrames serosos, orina o muestras lavadas con
solución salina.
Citocentrifugación
La citocentrifugación utiliza alícuotas pequeñas de esputo
líquido sobre el portaobjetos del microscopio para formar
una monocapa localizada de células (figs. 9-11 a 9-13). Es
aconsejable para muestras de poco volumen con celulari-
dad moderada; no obstante, parte del material se pierde de
modo inevitable dentro de la tarjeta del filtro. Las muestras
viscosas o celulares son inapropiadas.
Filtración con membrana
La presión positiva o la filtración al vacío se emplean con
varios tipos de filtro y un poro de tamaño predeterminado,
por ejemplo acetato de celulosa o policarbonato. Es conve-
niente para una amplia gama de muestras de gran volumen
o líquido hipocelular y permite obtener mayor captura de
células que los métodos de centrifugación.
Preparación del bloque celular
Las células se agrupan en un estado parecido a un tejido
que permite cortar las secciones de forma similar a como se
hace en la histología convencional. Los métodos incluyen
coagulación con trombina plasmática y plasma y el bloque
celular con agar caliente. Son convenientes para la mayor
parte de las suspensiones celulares y hacen posible una tin-
ción especial, incluida la inmunocitoquímica.
100 CAP. 9 CITOPATOLOGÍA

Figura 9-7 A, Técnica directa para la preparación de frotis para

muestras mucoides. a) Una gota de la muestra se aplica sobre un
portaobjetos. b) Un segundo portaobjetos se coloca encima con
ligera presión para extender el líquido de manera uniforme. c) Los
portaobjetos se separan en un solo movimiento y se fijan de inme-
diato. d) Un método alternativo consiste en extender la muestra
tan uniformemente como sea posible con un instrumento agudo o
una espátula. B, Método de la película de sangre para muestras no
mucoides. a) Se aplica una gota de la muestra a un portaobjetos.
b) Un portaobjetos esparcidor se desliza hacia la muestra. c) El
frotis se realiza con suavidad. d) Los agregados celulares tienden
a distribuirse hacia la periferia y el extremo del frotis. C, Mé-
todo de la presión para muestras no mucoides. a) Una gota de la
muestra se aplica a un portaobjetos. b) Un portaobjetos esparcidor
se coloca encima de éste y con presión uniforme al extender el
frotis. c) Los agregados celulares tienden a distribuirse de modo
uniforme en toda la preparación.
 TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN CELULAR
Figura 9-8 Tumor mucinógeno benigno del ovario. Este coágu-
lo de fibrina secuestra virtualmente todo el epitelio aspirado
del líquido de este ovario quístico. Las citopreparaciones cor-
respondientes consistieron casi en forma exclusiva de sangre y,
en el aislamiento, se juzgaron poco satisfactorias para propósitos
diagnósticos. Esto ilustra la importancia de examinar cualquier
coágulo presente en líquidos aspirados (H-E, 25 ).
Citología basada en líquido
La depuración de las técnicas anteriores para el procesa-
miento y preparación de muestras citológicas ha sido gra-
Citoplasma
Núcleo
Figura 9-9 Efecto de la fijación húmeda y el secado al aire sobre
las células. a) Una célula desmontada en solución adopta a menudo
una forma esférica. b) La célula se coloca sobre un portaobjetos y se
aplana de manera parcial. c) Al final, la fijación húmeda contrae en
cierto grado a la célula. d) El secado al aire causa aplanamiento y ex-
tensión de la célula con el alargamiento evidente en su estado final.
Una célula esférica puede presentar un diámetro dos veces mayor
respecto de su tamaño original, mientras que una célula escamoide
madura revela poco aumento evidente de tamaño.
101
dual durante un largo periodo. No obstante, las mayores
expectativas en años recientes condujeron a la revaloración
de muchos aspectos de la metodología tradicional, sobre
todo en busca de formas de aplicar los últimos avances tec-
nológicos.
La citología basada en líquido se ha desarrollado al mar-
gen del deseo de aumentar la sensibilidad y la especifici-
dad de la citología, como una modalidad de investigación
y diagnóstico. En la actualidad están disponibles varios
sistemas basados en manuales específicos del fabricante,
protocolos semiautomatizados o por completo automa-
tizados. Pese a ello, los principios de operación son muy
similares, con el objetivo de que se produzca una muestra
homogénea, más limpia y plana, que cubra un área más
pequeña del portaobjetos. Esto facilita un examen más fácil
y rápido, con una atenuación concomitante de la frecuencia
de muestras insatisfactorias. La tecnología se ha adaptado
con éxito en ginecología y otras áreas médicas.
Por lo general, las muestras se recolectan de la manera
usual y se transfieren dentro del líquido especificado de trans-
porte o preservación para formar una suspensión celular. Al-
gunos sistemas emplean cepillos o escobas patentados, que
agitan el líquido, con lo cual se asegura la obtención de la
muestra completa, mientras que otros utilizan un procedi-
miento de depuración para recolectar la población celular
designada. En el laboratorio, el material se procesa para eli-
minar el exudado sanguíneo, inflamatorio y proteínico. Una
alícuota de la suspensión se deposita al final como una capa
fina y uniforme sobre un portaobjetos de cristal. La dispersión
uniforme, la buena preservación de la célula, la célula cons-
tante que se tiñe, el detalle microscópico mejorado y la dis-
minución de artefactos se comparan de manera favorable
con los frotis preparados por técnicas convencionales. Todas
las capas y grupos de la célula tienden a ser más pequeños y
hay menos imprecisión por los elementos de fondo.
El método ThinPrep (Cytyc Corporation) emplea un
tubo de plástico desechable abierto y forrado con un filtro.
La muestra se recolecta en un medio que contiene metanol
y se centrifuga. Una muestra del centrifugado celular se
transfiere entonces a un líquido preservador que contiene
metanol. Hay tres etapas principales más de la preparación:
primero, dispersión celular, en la cual la máquina inserta el
tubo filtrador en el vial de la suspensión celular y lo agita
para dispersar mucosidad y cualquier agrupación celular;
segundo, recolección celular, en la que un pulso leve de
vacío desplaza el líquido hacia el tubo a través del filtro,
sobre el cual se deposita una capa de material celular; un
poco de sangre, células inflamatorias y detritos celulares
pueden pasar a través del filtro y el flujo del líquido se vigi-
la para optimizar la captación celular; tercero, transferencia
celular, cuando el tubo del filtro se invierte y se presiona
con suavidad contra un portaobjetos cargado en sentido
102 CAP. 9 CITOPATOLOGÍA

Figura 9-10 Células apocrinas metaplásicas de un quiste de mama. Estas células epiteliales benignas estaban presentes en el líquido de
un quiste e ilustran la naturaleza complementaria de las tinciones de Papanicolaou y May-Grünwald-Giemsa. La disparidad evidente en
el tamaño de las células en la ampliación idéntica es por las fijaciones húmeda y seca, respectivamente (a, Pap, 50 ; b, MGG, 50 ).

electrostático. El portaobjetos se sumerge inmediatamen-
te en el fijador y queda listo para la tinción subsiguiente,
manual o automatizada. El procedimiento completo es re-
lativamente rápido, menor de 30 minutos, y requiere poco
tiempo técnico. El área de la sedimentación celular mide 1.9
cm de diámetro y contiene alrededor de 100 000 células.
El método SurePath Prep (TriPath Imaging Inc.) comien-
za con la recolección de la muestra en un medio con etanol.
En el laboratorio se agita el vial para dispersar las células
y la suspensión experimenta una fase de enriquecimiento
celular mediante centrifugación por gradiente de densidad.
Esto también elimina la sangre y otros detritos contaminan-
tes. Se elimina el líquido sobrenadante, el sedimento celu-
lar se suspende de nuevo y se centrifuga por segunda vez.
Una alícuota del sedimento celular se transfiere entonces
por medios robóticos a un compartimiento de asentamiento,
donde las células se sedimentan por gravedad para crear una
capa delgada en un portaobjetos de microscopio cubierto
con poli-l-lisina. La máquina tiñe a continuación los porta-
objetos de modo automático. Este proceso toma alrededor
de 60 minutos y requiere un grado de intervención manual.
El depósito circular mide más o menos 1.3 cm de diámetro
e incluye alrededor de 100 000 células.
El método de citoexploración es un proceso manual que
se basa en la fotometría para evaluar la celularidad de la
suspensión celular antes de la centrifugación sobre un por-
taobjetos de cristal. El Labonard Easy Prep es otro méto-
do manual en el que una alícuota de líquido de la muestra
se carga en un compartimiento de separación unido a un
portaobjetos de cristal, que contiene papel absorbente. Las
células se colocan en una capa delgada y la preparación se
tiñe mediante procedimientos normales de laboratorio.
 MÉTODOS DE TINCIÓN
Figura 9-11 Una moderna máquina citocentrifugadora.
La citología basada en medio líquido no utiliza la mues-
tra completa y en consecuencia ofrece la oportunidad de
efectuar procedimientos con pruebas auxiliares, por ejem-
Figura 9-12 Componentes de la cámara citocentrífuga. Cámara
de aspiración, tarjeta del filtro, portaobjetos de vidrio y gancho del
resorte antes del ensamblaje.
103
Tarjeta de filtro Portaobjetos
de vidrio
Dirección de
la fuerza
Suspensión centrífuga
celular
Burbuja de aire
Cámara para
la muestra
Figura 9-13 Diagrama esquemático del montaje de la citocen-
trífuga. La fuerza centrífuga conduce la suspensión celular a través
de la tarjeta del filtro y sobre el portaobjetos de cristal. Esto es incon-
veniente para las muestras mucoides.
plo hibridación in situ o técnicas de captación híbridas
para detectar virus del papiloma humano u otros agentes
infecciosos. Las preparaciones son tan favorables respecto
de otros procedimientos de tinción, como la inmunocito-
química, como las técnicas convencionales, con la venta-
ja adicional de que el fondo limpio es menos susceptible
de teñirse en falso. En ciertas muestras no ginecológicas,
en que la pérdida de material del fondo y la variación
de las características estructurales pueden ser un problema,
los procedimientos basados en medio líquido se pueden
emplear junto con técnicas tradicionales como un comple-
mento útil.
Métodos de tinción
Muchas técnicas aplicadas a los cortes tisulares se pueden
también realizar sobre las citopreparaciones. En general, la
tinción de Papanicolaou se emplea para el material fijado en
húmedo. El patrón diferencial de tinción es útil para muestras
ginecológicas y no ginecológicas y permite periodos prolon-
gados de microscopia con una tensión mínima del ojo.
Las tinciones de Romanowsky (May-Grünwald-
Giemsa [MGG], Diff Quik, etc.) se realizan casi siempre
en preparaciones secadas al aire y son favorables para am-
bas técnicas, automáticas y manuales rápidas. Este método
se emplea sobre todo en material no ginecológico.
La tinción con hematoxilina y eosina es mucho más co-
mún en cortes histológicos convencionales.
Puede utilizarse una amplia variedad de tinciones his-
toquímicas auxiliares, como se indicó antes. Los ejemplos
incluyen al ácido peryódico de Schiff, con o sin predigestión
con diastasa de las mucosustancias neutrales y glucógeno,
tinciones tricrómicas, tinciones de Ziehl-Neelsen, Gram y
metenamina de plata de Grocott, entre otras más.
104 CAP. 9 CITOPATOLOGÍA
Figura 9-14 Linfoma no Hodgkin de grado bajo. a) Este aspirado
de humor vítreo del ojo contiene innumerables linfocitos, mode-
radamente pleomórficos e inmaduros, con cantidades variables
de citoplasma (MGG, gran potencia). b) La inmunocitoquímica
confirma reactividad extendida de CD45 (antígeno común del
leucocito) (inmunoperoxidasa, gran potencia).
El repertorio de técnicas inmunocitológicas es compa-
rable al de las utilizadas en muestras tisulares. La inmu-
nocitoquímica puede ser inestimable para comprobar la
presencia de microorganismos o demostrar la diferencia-
ción celular del tumor (fig. 9-14).
Citodiagnóstico
El procedimiento citodiagnóstico es un proceso complejo. La
consecución de una conclusión depende de muchos factores,
entre ellos el conocimiento del sitio específico detallado jun-
to con la experiencia de la normalidad, la familiaridad con
los aspectos múltiples de muchos procesos patológicos, el
conocimiento de simuladores y artefacto y la conciencia de
las limitaciones de la técnica, además de los detalles especí-
ficos del paciente y el contexto clínico (véase el cuadro 9-1).
El material abundante y bien preservado siempre produce la
mejor oportunidad de alcanzar un diagnóstico definitivo. Sin
esta información de fondo, la citopreparación está en peligro
de convertirse en un artefacto de dos dimensiones, teñido
y brillante, que puede ser tan engañoso como útil. Algunas
veces puede ser mejor establecer un diagnóstico morfológi-
co inicial “a ciegas” a partir de los primeros principios para
evitar un sesgo preconcebido. Esto puede modificarse, si se
consideran tales variables como apropiadas, antes de deter-
minar un diagnóstico y formular cualquier consejo sobre el
próximo control del paciente.
En condiciones normales, una citopreparación es una
mezcla compleja de componentes en proporciones que
varían, según sean el tejido o la lesión muestreadas. Las
células normales y anormales pueden estar presentes y hay
que determinar de manera sistemática el contenido, la dis-
posición y la distribución celular dentro de una muestra.
 CITOMORFOLOGÍA
Cuadro 9-1 Variables que pueden modificar la interpretación
final de una citopreparación
Detalles específicos Edad y sexo
del paciente Estado hormonal, como embarazo
Impresión clínica
Tratamientos previos, como
radioterapia, operación
Material previo, como histología,
citología
Otras pruebas de laboratorio
Detalles específicos Conocimiento de la anatomía local
del sitio Características radiológicas
Conocimiento de los errores y
simulaciones
Limitaciones técnicas
Población celular Grado de celularidad
Células presentes, como población
bifásica o única
Poblaciones ajenas o naturales
Morfología normal o anormal
Citomorfología Antecedentes
Distribución y cohesión celulares
Morfología de la célula individual
Información auxiliar Microscopia electrónica
Tinciones histoquímicas
Inmunocitoquímica
Análisis de imagen
Citometría de flujo
Citogenética
No todas las características son relevantes para cualquier
muestra particular.
Citomorfología
Gran parte de la carga del trabajo diagnóstico en la mayoría
de los laboratorios se preocupa en diferenciar entre lesiones
no neoplásicas, preneoplásicas y neoplásicas. Las células
normales se caracterizan por su uniformidad morfológica.
La morfología nuclear refleja el estado de proliferación de
una célula y su capacidad reproductiva. El citoplasma de una
célula casi siempre ofrece una indicación de su origen, es-
tado funcional y grado de diferenciación.
La actividad creciente de la célula puede ser fisiológica,
como en la hiperplasia, debido a la modulación hormonal,
o reconstructiva y regeneradora en respuesta al daño. Un
estado de proliferación anormal y descontrolado implica
un proceso neoplásico.
La disminución de la actividad de la célula puede tam-
bién ser fisiológica debido a la atrofia, los cambios involuti-
105
vos secundarios a la influencia hormonal, el envejecimiento
o la degeneración, como en la apoptosis.
No hay un solo criterio citomorfológico o grupo limita-
do de criterios que por sí mismos permitan una distinción
confiable entre las condiciones biológicamente benignas y
malignas bajo todas las circunstancias. Las diferencias cito-
nucleares entre las células regeneradoras o hiperplásicas y
las células neoplásicas de grado inferior pueden ser sutiles
y en ocasiones indistinguibles. Los cambios posteriores a
la radioterapia o quimioterapia, los víricos y otros pueden
inducir aspectos que imitan en sumo grado los observados
en la neoplasia (fig. 9-15).
Figura 9-15 Atipia de radiación en un frotis de la bóveda vaginal.
Células escamosas gigantes anormales (“macrocitos”) después de
la radioterapia. Cambios extraños similares pueden aparecer tras
la quimioterapia y acompañan a la deficiencia de vitamina B12 o
folato y pueden ocurrir en los condilomas víricos. Obsérvense la
multinucleación y el aumento en ambas áreas, nuclear y citoplás-
mica. Las células inflamatorias del fondo y las escamas superfi-
ciales son características útiles de referencia (Pap, 100 ).
Celularidad de la muestra
El número y el tipo de células proporcionan información
importante sobre el tejido designado. Ambos están sujetos
a factores lesionales y no lesionales, en especial el método
de muestreo empleado. Por lo general, la hipercelularidad
incrementa el índice de sospecha para un proceso proli-
ferativo, hiperplásico o neoplásico. No obstante, de modo
inverso, la hipocelularidad no es en todos los casos una ca-
racterística inocua, debido que la ausencia de células anor-
males no excluye de ninguna manera una afección grave.
Las neoplasias de grado inferior pueden exfoliarse ape-
nas y producir células que muestran una desviación mínima
de la normalidad. Una escasez de material adecuado puede
ser un factor limítrofe crucial en el grado de confianza de
la interpretación de una muestra.
106 CAP. 9 CITOPATOLOGÍA

Modelos de citoestructura
Con frecuencia no se reconocen en las citopreparaciones
muchos de los indicios estructurales presentes en cortes his-
tológicos convencionales. Las acumulaciones más grandes
de células (microbiopsias), si bien presentes, a menudo
reproducen el modelo histológico del tejido designado (fig.
9-16). El epitelio normal de muchos sitios se caracteriza
Figura 9-16 Glándula parótida normal. Este aspirado con aguja
fina contiene una “microbiopsia” que comprende tejido conjun-
tivo adiposo sumamente mezclado con el tejido secretor acinoso
normal de un sujeto de mediana edad (Pap, 80 ).
hesión, pero pueden exhibir un contorno inusual, como una
configuración papiliforme, de rosetón o morular. La forma-
ción del sincitio con límites celulares mal definidos y alguna
orientación errática son sospechosas de neoplasia. Las célu-
las epiteliales malignas (carcinoma) se presentan habitual-
mente como células mal polarizadas, superpuestas, a veces
en grupos tridimensionales (esferas de proliferación), con
una tendencia a perder cohesión y desagregarse. Las células
linfoides normales poseen una cohesión intercelular escasa,
al igual que sus contrapartes neoplásicas (linfoma), y el mo-
delo celular dispersado del carcinoma mal diferenciado y el
linfoma de grado alto pueden ser indistinguibles sin recurrir
a las técnicas auxiliares. Las células estrómicas normales,
reactivas o neoplásicas (mesenquimatosas), pueden ser evi-
dentes y los adipocitos, tubos capilares u otros fragmentos
del tejido conjuntivo emanan a menudo de un sitio perile-
sional. Los elementos estrómicos benignos se manifiestan
las más de las veces como células ovoides o fusiformes, de
pobre cohesión o con núcleos desnudos (células centinelas
o bipolares), de acuerdo con las circunstancias particulares.
Las células estrómicas malignas (sarcoma) demuestran un
modelo similar pero con las características nucleares y cito-
plásmicas anormales sobrepuestas.
Características nucleares

por conservar la polaridad y la cohesión intercelular. El
epitelio glandular produce con regularidad hojas dispuestas
en monocapa; éstas, cuando se observan de frente, ofrecen
un aspecto de “panal”, y de perfil un modelo en paliza-
da o “vallado” (fig. 9-17a,b). El epitelio hiperplásico y el
neoplásico benigno casi siempre conservan también la co-
Las anormalidades de la morfología nuclear se conocen
como discariosis y pueden calificarse como menores o mo-
deradas a graves o bien como de grados alto y bajo según sea
el grado de desviación respecto de la normalidad. En la cé-
lula diferenciada como terminal normal (madura) el núcleo
es relativamente pequeño, en comparación con el volumen

Figura 9-17 Epitelio glandular gástrico normal. a) Las células epiteliales glandulares columnares altas semejan una palizada regular o
un “vallado” cuando se ve de perfil. Nótese la polaridad preservada y los núcleos redondos, espaciados con uniformidad, con uno o dos
nucleolos pequeños (Pap, 80 ). b) La monocapa del epitelio glandular cohesionado, bien orientada e isomórfica, muestra un modelo de
“panal” cuando se observa de frente. Una vez más, están bien delineados los núcleos espaciados de forma regular con nucleolos peque-
ños ocasionales y el contorno nuclear redondeado (Pap, 40 ).
 CITOMORFOLOGÍA
total de la célula, casi siempre de forma redonda u ovoi-
de con un contorno nuclear liso, distribuido de modo unifor-
me, con cromatina fina y granular y poca variación entre las
células de tipo similar (isomórficas o monomórficas).
En una citopreparación bidimensional el tamaño nuclear
es proporcional al área nuclear relativa y puede expresarse
como el índice citonuclear, cociente nuclear:citoplásmico
o cuantificarse como un porcentaje. Las células con pobre
diferenciación poseen núcleos agrandados (cariomegalia o
nucleomegalia) y dado que poseen el mismo volumen cito-
plásmico absoluto tienen por tanto un cociente nuclear:ci-
toplásmico elevado.
La mayoría de las células normales muestra una cromati-
na nuclear razonablemente homogénea con una distribución
fina y granular y una afinidad discreta por los tintes nuclea-
res. El aumento del contenido del DNA nuclear propicia
una mayor densidad de tinción nuclear (hipercromasia). La
cromatina distribuida de forma irregular con una textura
gruesa y rugosa y un envolvimiento nuclear engrosado se
denomina carioteca. La variación de tamaño y forma de los
núcleos entre las células se llama anisocariosis o anisonu-
cleosis y con el incremento de la anormalidad la membrana
nuclear puede ser irregular en el contorno, con estriación,
indentación o crenación. La constelación de variaciones
anormales de tamaño, forma e intensidad de la tinción nu-
clear se conoce como pleomorfismo nuclear (fig. 9-18).
Figura 9-18 Carcinoma celular escamoso con pobre diferen-
ciación. Estas células malignas de vellosidades bronquiales son
muy pleomórficas, con pobre polarización, y muestran una mem-
brana nuclear con macronucleolación. La queratinización fue más
evidente en las biopsias bronquiales acompañantes (Pap, 100 ).
Los núcleos normales pueden contener nucleolos peque-
ños, discretos y compuestos por RNA y proteínas relacio-
nadas. Se observan multinucleación y macronucleolos en
estados de proliferación, neoplásica y no neoplásica. La
cromatina degenerativa puede aparecer como una masa
densa, contraída (cariopicnosis), con fragmentos densos
107
(cariorrexis) o puede experimentar disolución (cariólisis o
cromatólisis). La citólisis puede producir remanentes nu-
cleares expuestos o descubiertos, a menudo hipocromá-
ticos, y la fragilidad de la membrana nuclear inherente a
algunas células ocasiona fluidez nuclear o artefacto en el
frotis. Esto afecta a menudo a las células linfoides o puede
ser una característica del carcinoma anaplásico de célula
Figura 9-19 Carcinoma anaplásico celular pequeño en esputo.
Las células apenas cohesionadas del carcinoma, en gran parte de-
generadas hasta “células de avena”, yacen dentro de una franja
mucosa. En algunas, la cromatina finamente dispersa (“sal y pi-
mienta”) es apenas perceptible, al igual que el moldeado nuclear
focal. En su mayor parte, poseen citoplasma mínimo con núcleos
hipercromáticos y cariopicnóticos. Las escamas superficiales, eri-
trocitos y linfocitos representan una indicación del tamaño rela-
tivo (Pap, 100 ).
pequeña (fig. 9-19). Lo anterior se puede delimitar de modo
estrecho por daño vorticoso cuando las células se expulsan
a través de una aguja de calibre fino sobre un portaobjetos.
La mayoría de las células posee un solo núcleo aunque
algunas, que experimentan actividad de regeneración o re-
paración, por ejemplo hepatocitos y condrocitos, pueden
ser binucleadas. Los osteoclastos y sincitiotrofoblastos son
casi siempre polinucleados. La multinucleación puede ser
una característica de anomalías inflamatorias y neoplásicas
(figs. 9-20 y 9-21).
Es inusual encontrar mitosis en citopreparaciones. Un
incremento del número de mitosis implica proliferación
celular y es difícil identificar formas anormales del huso
(tripolar, tetrapolar, etc.) en condiciones benignas.
Características citoplásmicas
La variación del tamaño y forma de células similares se
denomina anisocitosis. El volumen citoplásmico de una
célula anormal puede ser más grande o pequeño que su
contraparte normal, de tal modo que puede influir en el ín-
108 CAP. 9 CITOPATOLOGÍA

Figura 9-20 a) Célula gigante de Langhans en la tuberculosis. Esta célula gigante multinucleada en un aspirado con aguja fina es
de origen histiocítico. La orientación periférica en “herradura” de los núcleos es característica. Otros tipos de células gigantes pueden
observarse en diversos trastornos inflamatorios y neoplásicos (MGG, 250 ). b) Granuloma celular epitelioide en la tuberculosis. Este
grupo notoriamente arracimado de histiocitos epitelioides mal definidos del mismo aspirado con aguja fina es evidencia de una reacción
granulomatosa. La necrosis fibrilogranular fue obvia en otra parte y se aislaron bacilos resistentes al ácido y el alcohol a partir de una
muestra similar (MGG, 100 ).

dice nuclear:citoplásmico, con independencia de cualquier

Figura 9-21 Linfoma de Hodgkin. La célula central de Reed-
Sternberg muestra la binucleación en “imagen de espejo” con
macronucleolos de “ojo de búho” evidentes. El fondo variforme
de células plasmáticas polimorfas eosinófilas y neutrófilas, linfo-
citos e histiocitos es típico de esta tumoración (MGG, 100 ).
cambio nuclear acompañante. La composición ultraestruc-
tural del citoplasma, esto es, la concentración del aparato
de Golgi, ribosomas, retículo endoplásmico, mitocondrias
y cualquier producto del metabolismo, ejerce una impor-
tante influencia en la afinidad de varias reacciones de tin-
ción. Los productos almacenados, como mucina, lípidos,
carbohidratos, hormonas o cristaloides, se pueden destacar
por tinciones especiales y apropiadas. Los glóbulos de mu-
cina, microvacuolación espumosa, bordes en cepillo de mi-
crovellosidades y cilios pueden ser perceptibles en células
normales o bien diferenciadas. La queratinización indica
diferenciación escamosa y las células extrañas alargadas
o caudadas (no isodiamétricas) pueden ser más evidentes
que las de formas redondas o poligonales (isodiamétricas)
más frecuentes (fig. 9-22).
Las células adyacentes pueden mostrar moldeado cito-
plásmico o, en casos extremos, engullimiento (abrazamien-
 CITOMORFOLOGÍA 109

terial teñido de modo intenso con sangre o una respuesta

Figura 9-22 Carcinoma celular escamoso. Esta célula escamosa
alargada y anómala (caudada, célula “renacuajo” o “cometa”) po-
see un núcleo hipercromático agrandado y yace en medio de la
diátesis tumoral y remanentes celulares escamosos disqueratósi-
cos degenerados. Algunas veces pueden verse formas similares
a una correa (célula de “fibra” o “serpiente”) y naranjófilas bri-
llantes (célula de “zanahoria”) (Pap, 100 ).
inflamatoria vigorosa, por ejemplo, a menudo ocultan de-
talles citonucleares de cualquier población celular epitelial,
lo cual limita la cantidad de información disponible.
Además de los componentes estrómicos del tejido
conectivo, señalados con anterioridad, pueden ser per-
ceptibles el material de la membrana basal, la sustancia
granulada, mucosidad, cristales, exudado fibrinopurulento,
coloides, líquido rico en proteínas o incluso microbiopsias
del tejido condroide (fig. 9-24). La mineralización puede
manifestarse como depósitos amorfos del calcio o algunas
veces como cuerpos de psamoma (fig. 9-25).
El tumor invasivo puede vincularse con detritos sanguí-
neos, necroinflamatorios y de degeneración (diátesis tumo-
ral) (fig. 9-26).

to o canibalismo celular evidente (fig. 9-23a,b). Esto se

reconoce en condiciones benignas y malignas, pero es más
común en estas últimas.
Los cambios citoplásmicos degenerativos incluyen la
hinchazón o cambio hidrópico, vacuolación y pérdida de
la integridad de la membrana plasmática con derramamien-
to del contenido celular (citólisis).

Entorno y artefactos del fondo
El contenido del fondo de una citopreparación puede incluir
material de procedencia celular y no celular. Esto puede ser
útil para precisar un diagnóstico o un contratiempo. El ma-
Figura 9-24 Sustancia granulada de un adenoma pleomórfico
salival benigno. La sustancia granulada mucomixoide fibrilar
(“plumosa”) propensa a la tinción de Giemsa casi oculta a las
células epiteliales; la sustancia fue mucho menos notoria con la
tinción de Papanicolaou (MGG, 125 ).

Figura 9-23 Células mesoteliales reactivas dispuestas de forma individual o en grupos pequeños. Los bordes en cepillo de las microve-
llosidades son apenas observables alrededor de algunas células. Los espacios intercelulares vacíos (“ventanas”) son una característica
habitual. Pueden verse el moldeado nuclear y el engullimiento (abrazamiento o “canibalismo”) celular evidente (a, Pap, 250 ; b, MGG,
250 ).
110 CAP. 9 CITOPATOLOGÍA

Figura 9-25 Cuerpo de psamoma. a) Psamocalcificación central que revela un aspecto típico de laminación concéntrica, apenas
retráctil, entre un fondo de linfocitos y células sanguíneas rojas (Pap, 250 ). b) Carcinoma epitelial-mioepitelial de la glándula parótida.
Las células epiteliales mal cohesionadas, un poco pleomórficas, rodean a los glóbulos densamente teñidos del material de la membrana
basal, lo cual refleja los aspectos histológicos. Modelos similares pueden reconocerse en diversos tumores de origen glandular salival y
no salival de la glándula, benignos y malignos (MGG, 250 ).

Algunas veces está indicada una búsqueda de micro-

Figura 9-26 Carcinoma celular transitorio de la vejiga. Se iden-
tifica un racimo apenas cohesionado, con pobre polarización, de
células pleomórficas uroepiteliales. Existe hipercromasia nuclear,
un contorno nuclear irregular y macronucleolación. La biopsia
confirmó un carcinoma celular transitorio de grado alto. Obsér-
vese el fondo citolítico e inflamatorio (“sucio”) (Pap, potencia
media).
organismos o parásitos. Los comensales incluyen Lacto-
bacillus en frotis cervicovaginal y Candida en muestras
bucofaríngeas. Los patógenos incluyen virus, bacterias,
hongos y protozoarios, entre otros. Algunos pueden ser vi-
sibles con el microscopio de luz, mientras que la mayoría
de las infecciones víricas está implícita por sus efectos cito-
páticos. La coilocitosis en el virus del papiloma humano, la
multinucleación con nucleoplasma de “cristal granulado”
en Herpes simplex y las inclusiones nucleares de “ojo de
búho” en infecciones por Cytomegalovirus son ejemplos
característicos (figs. 9-27 y 9-28).
Un artefacto es un producto artificial o un cambio morfo-
lógico en una citopreparación originado en la degradación
física de una muestra o durante el muestreo, el transporte o
la preparación del frotis. Los contaminantes son “cuerpos
ajenos” que se introducen durante estos procesos. Su im-
portancia se debe sobre todo al hecho de que pueden ate-
nuar la exactitud de la interpretación del aspecto microscó-
pico. Los artefactos pueden clasificarse como intrínsecos,
 CITOMORFOLOGÍA 111

Figura 9-27 Efecto citopático del virus del papiloma humano. a) La histología muestra multinucleación con halos claros alrededor de los
núcleos hipercromáticos e irregulares (coilocitosis) (H-E, potencia media). b) Coilocitos similares presentes en un frotis cervical. Nótese
de nueva cuenta la multinucleación, clarificación perinuclear del citoplasma y leve condensación citoplásmica periférica (Pap, 100 ).

Figura 9-28 Células epiteliales en un frotis cervical que mues-
tra el efecto citopático vírico de Herpes simplex. Se ha comparado
el aspecto general, con agrandamiento nuclear, aglomerado, super-
posiciones, amoldamiento, plurinucleación y áreas de carioplasma
de cristal granulado con semillas de granada.
originados a partir de una fuente endógena, como fibras
vegetales o cárnicas y cristales de colesterol (fig. 9-29), o
extrínsecos, por ejemplo depósitos del colorante y gránulos
de talco o algodón provenientes de los guantes quirúrgicos
(fig. 9-30). Una fijación deficiente, en particular por secado
al aire seguido de la fijación en alcohol, las preparaciones
Figura 9-29 Cristales romboidales de colesterol aspirados de
un quiste tiroideo benigno. Tal sedimentación puede ser una con-
secuencia de hemorragias anteriores (MGG, 50 ).
teñidas con Papanicolaou, el artefacto de xileno y las bur-
bujas de aire confieren apariencias típicas (fig. 9-31). Ele-
mentos inorgánicos, como fibras de asbestos, se reconocen
de modo ocasional (fig. 9-32).
La transferencia de material celular (contaminación
cruzada, “transportadores” o “flotadores”), por el paso
de una muestra a otra durante el transporte, la fijación o los
procedimientos de tinción, constituye una fuente potencial
112 CAP. 9 CITOPATOLOGÍA
Figura 9-30 Numerosos gránulos de almidón que contaminan
esta muestra de un lavado bronquioloalveolar, tal vez procedentes
del polvo del guante quirúrgico. Su típico aspecto de cruz de Malta
se reconoce mejor mediante transiluminación con luz polarizada
cruzada (MGG, 50 , polarizada).
Figura 9-31 Células en “hojuela de maíz” en un frotis cervical.
Un depósito marrón apenas refráctil cubre los núcleos y el cito-
plasma de estas células escamosas. Esto es más común en frotis
cervicales y se cree que es el resultado del aire atrapado en la su-
perficie celular durante la fijación. Rara vez es tan extenso para
producir un frotis del todo indescifrable (Pap, 100 ).
para establecer resultados positivos falsos de la maligni-
dad y se debe evitar a toda costa. Es posible prevenir lo
anterior con una técnica rigurosa y una buena higiene del
laboratorio.
La contaminación ambiental espuria procede casi siem-
pre del agua o el aire y puede ser de naturaleza biológica o
no (figs. 9-33 y 9-34).
Exactitud y limitaciones de la citología
Es útil alguna medida de la confiabilidad y la exactitud
de la citología diagnóstica en varias circunstancias para la
Figura 9-32 Cuerpo ferruginoso en esputo. Un macrófago multi-
nucleado alveolar pulmonar engulle en parte un cuerpo ferruginoso
refráctil. El aspecto marrón de cuentas ensartadas se atribuye a la
incrustación del pigmento férrico en una fibra decolorada, quizá de
asbesto. Los gránulos intracitoplásmicos oscuros comprenden una
mezcla de pigmento antracótico y hemosiderótico (Pap, 1 000 ).
comparación y se expresa a menudo en términos estadís-
ticos (cuadro 9-2). La sensibilidad (fracción de verdade-
ros positivos) es una medida de la eficacia con la cual una
prueba reconoce a pacientes con el trastorno bajo conside-
ración. La especificidad (fracción de verdaderos negativos)
indica qué tan bien excluye una prueba a esos individuos
sin la enfermedad. Los valores predictivos positivo y nega-
tivo indican el modo preciso en que la prueba reconoce la
presencia o ausencia de la afección, respectivamente. Un
resultado falso negativo señala que la prueba no identifica
una enfermedad que luego sí se demuestra. Esto puede de-
berse a los errores de la investigación o las dificultades de
la interpretación. Un falso verdadero negativo se presenta
cuando la revisión retrospectiva del material confirma la
suficiencia de la muestra y corrobora un resultado negativo
genuino. Las posibles explicaciones para esto incluyen el
muestreo perilesional en lugar del lesional o el inicio de
la enfermedad después de practicar el método de la prue-
ba (intervalo de la enfermedad). La sensibilidad de una
prueba disminuye mientras el número de falsos negativos
aumenta. Un resultado falso positivo aparece si la prueba
se informa como positiva pero la enfermedad no puede de-
mostrarse con posterioridad. Esto puede ser consecuencia
de dificultades en la interpretación o del aspecto de cier-
tas anormalidades, que pueden semejarse de forma estre-
cha. La especificidad de una prueba disminuye mientras el
número de falsos positivos aumenta. La eficiencia de una
prueba es una medida de cuán bien clasifica a los pacientes
que deben recibir el tratamiento y aquellos para los que el
tratamiento es innecesario.
Los valores estadísticos absolutos de una prueba par-
ticular se pueden modular por la inclusión o exclusión de
 CITOPATOLOGÍA GINECOLÓGICA Y EXPLORACIÓN CERVICAL 113

Figura 9-33 Contaminantes aéreos. Estas condias (“zapatos para la nieve”) micóticas segmentadas de manera interna se hallaban en el
borde de un frotis. Tales elementos son consistentes con Alternaria spp. y son presuntos contaminantes aéreos (a, Pap, 250 ; b, MGG,
250 ).

Cuadro 9-2 Algunos de los parámetros más útiles para medir

la exactitud de la citología y formas de calcularlos

Enfermedad Enfermedad
positiva (a  c) negativa (b  d)
Prueba positiva Verdadero positivo Falso positivo
(a  b) (a) (b)
Prueba negativa Falso negativo Verdadero negativo
(c  d) (c) (d)

a
Sensibilidad 
ac
d
Especificidad 
bd
a
Figura 9-34 Un ácaro libre descubierto como contaminante exó- Valor positivo predictivo 
ab
geno en un frotis cervical. No es de consecuencia clínica (Pap, d
Valor negativo predictivo 
250 ). cd
ad
Exactitud 
muestras inadecuadas o insatisfactorias. La inclusión de abcd
éstas suministra una indicación global de la eficacia clíni- Fracción de probabilidad
sensibilidad
ca de la prueba, en tanto que la exclusión refleja con más de una prueba positiva 
1  especificidad
exactitud el funcionamiento del laboratorio.
Fracción de probabilidad 1  sensibilidad
de una prueba negativa  especificidad
Citopatología ginecológica
y exploración cervical

Las muestras de citología de la zona genital femenina re-
presentan una proporción considerable del procesamiento
de rutina de la mayoría de los laboratorios de diagnóstico,
en gran parte como resultado de la exploración cervical.
El primer objetivo de la prueba del frotis cervical es la de-
tección del carcinoma celular escamoso y sus precursores
en mujeres asintomáticas. También se utiliza en la inves-
tigación de las pacientes que sufren síntomas ginecológi-
cos y como parte del proceso de vigilancia después del
tratamiento. De importancia secundaria es la detección de
lesiones glandulares del cervix u otros sitios ginecológicos,
el reconocimiento de una variedad de anomalías inflamato-
rias y contagiosas, y la valoración del estado hormonal.
La exploración cervical ha demostrado ser eficaz en la
reducción de la mortalidad y la morbilidad del carcinoma
cervical en varios países, aunque no por medio de ensayos
controlados aleatorios. Un programa de exploración cer-
vical ha estado en funcionamiento en el Reino Unido desde
114 CAP. 9 CITOPATOLOGÍA

Unión escamocolumnar “original” Eversión endocervical (ectropión)

con unión escamocolumnar
“original”

Zona de transformación con “nueva” Unión escamocolumnar dentro

unión escamocolumnar del canal endocervical después
de la menopausia

S = epitelio escamoso C = epitelio columnar E = fondo de las glándulas endocervicales en el epitelio escamoso metaplásico

Figura 9-35 Diagrama esquemático de la anatomía del cervix. Se ilustra la morfología cambiante de la zona de transformación cervical y
la unión escamocolumnar con el paso de los años.
 CITOPATOLOGÍA GINECOLÓGICA Y EXPLORACIÓN CERVICAL
1964. La llamada sistemática de la población se introdujo
en 1988 bajo auspicios del NHS Cervical Screening Pro-
gramme (NHSCSP) con el establecimiento de una red de
coordinación nacional. Esto propicia la clasificación uni-
forme de las anomalías, la estandarización de la termino-
logía, el seguimiento de frotis anormales, la institución de
mecanismos para el control de calidad, la evaluación de la
efectividad del programa mediante el entrenamiento multi-
disciplinario de auditoría y la vigilancia de los profesiona-
les del cuidado de la salud.
Cuando todos los aspectos del proceso de investigación se
realizan de forma óptima, la prueba es un método muy sen-
sible para la detección de los precursores del carcinoma
celular escamoso, excepto para el carcinoma invasivo. Sin
embargo, debe recordarse que como prueba de exploración
tiene un margen de error diagnóstico bajo pero de impor-
tancia. La erradicación del carcinoma cervical tiene toda-
vía que realizarse por esta vía.
El objetivo de un frotis cervical es muestrear de manera
representativa la zona de transformación cervical que limita
la unión escamocolumnar, que es el sitio con el riesgo más
alto de cambio neoplásico (fig. 9-35). Es en última instancia
tarea del clínico visualizar el cervix y recoger muestras de
la circunferencia cervical entera, sin importar cuál sea la
celularidad o el contenido celular del frotis (fig. 9-36). Los
indicadores de la probable transformación de la zona que
se muestrea incluyen las células escamosas metaplásicas
inmaduras o el epitelio glandular endocervical con mucosi-
dad. No existen indicadores confiables de la transformación
de la zona que se muestrea en frotis atróficos.
El frotis cervical normal
La citomorfología de las células escamosas superficiales,
intermedias y parabasales refleja en gran parte la estructu-
ra histológica del epitelio escamoso estratificado maduro
(fig. 9-37). El espesor mucoso y el contenido de glucógeno
dependen de la actividad hormonal. En condiciones norma-
les, las células superficiales se exfolian de forma natural y
no existe casi nunca queratinización. Las células muestran
escasa cohesión y se disponen casi de modo individual.
Por su parte, las células glandulares endocervicales poseen
una amplia variación en el aspecto, según sean su preser-
vación y orientación. Tienden a conservar la cohesión y
pueden mostrar modelos citoestructurales comparables a
los de otros sitios glandulares. Las células de la reserva
subcolumnar están casi siempre presentes como núcleos
descubiertos e isomorfos. Las células escamosas metaplá-
sicas son un componente normal de un frotis durante los
años reproductivos. Mientras son inmaduras no se exfolian
de modo espontáneo y cuando se eliminan por abrasión
115
exhiben a menudo proyecciones citoplásmicas (células en
araña). Una vez que alcanzan la madurez completa son
indistinguibles de las células escamosas del ectocervix
original. Las células estrómicas endometriales, las células
glandulares y los histiocitos (éxodo) pueden observarse
al principio del flujo menstrual hasta el día 12 del ciclo
menstrual. Fuera de este intervalo se consideran anormales
y dicha hiperexfoliación puede deberse a irregularidades
menstruales y dispositivos anticonceptivos intrauterinos,
además de pólipos, hiperplasia y neoplasia. Los leucocitos
polimorfonucleares están invariablemente presentes y son
más evidentes cerca de la menstruación. Los linfocitos, los
eosinófilos, los mastocitos y las células plasmáticas suelen
ser escasos. La mera presencia de células inflamatorias no
implica infección en todos los casos. Los espermatozoides
pueden persistir por varios días después de la unión sexual.
El trofoblasto y el estroma deciduoide pueden perderse
durante el embarazo o el aborto y las células seudodeci-
duoides pueden ser el resultado de la terapia hormonal.
La queratinización anormal (hiperqueratosis) produce
escamas sin núcleo, profundamente naranjófilas en prepa-
raciones con Papanicolaou. La paraqueratosis demuestra
espigas (ramitas) o perlas de escamas similares que poseen
núcleos picnóticos. Ambos modelos pueden verse en con-
diciones inflamatorias y neoplásicas. Puede hallarse una
variedad de contaminantes, incluidos los helmintos, piojos,
hongos, polen y gel lubricante.
Citología hormonal
La evaluación citohormonal se basa en la maduración del
epitelio escamoso vaginal en respuesta a las hormonas
gonadotrópicas circulantes en combinación. El epitelio es
delgado e inmaduro cuando carece de estrógeno y proges-
terona. El estrógeno sin oposición promueve el crecimien-
to y la maduración. La progesterona induce descamación
y exfoliación con citólisis y células naviculares. Los
andrógenos estimulan la maduración parcial de células
intermedias en el epitelio atrófico con un efecto recíproco
sobre el epitelio maduro.
Los modelos característicos son reconocibles en el
periodo posnatal, durante la pubertad, los estados de ma-
durez sexual, de embarazo, el puerperio, la lactancia y la
premenopausia y posmenopausia establecidas, con mo-
dulación de influencias hormonales exógenas o fuentes
hormonales endógenas anormales, como los tumores ová-
ricos.
Se pueden utilizar diversos índices para registrar cam-
bios hormonales, entre ellos el índice de maduración, el
valor de maduración, el índice cariopicnótico, el índice
eosinófilo y el índice celular plegado.
116 CAP. 9 CITOPATOLOGÍA
Figura 9-36 Dispositivos cervicales de muestreo. La espátula,
en particular la de tipo extendido (Aylesbury), proporciona un me-
jor rendimiento celular y se recomienda para la exploración. Los
dispositivos con cepillo para el muestreo endocervical pueden ser
benéficos en caso de un frotis anormal. La técnica de muestreo y la
visualización del cervix son de enorme importancia, sea cual sea el
diseño empleado.
Figura 9-37 Maduración epitelial escamosa ectocervical normal.
Obsérvense la polaridad desde el estrato basal hasta las escamas
superficiales y la ausencia de queratinización superficial (H-E, po-
tencia media).
Inflamación y cambios regenerativos
La inflamación en la zona genital femenina tiene un origen
infeccioso y puede algunas veces mostrar un patrón agu-
do, crónico o granulomatoso. Es un proceso dinámico en el
que los cambios degenerativos y regenerativos se observan
de forma sincronizada.
Las infecciones más comunes incluyen cervicitis foli-
cular con notorio vínculo con Chlamydia spp., Lepthothrix
spp., a menudo acompañada de Trichomonas vaginalis, va-
ginosis bacteriana por Gardnerella vaginalis, Actinomyces
spp., Neisseria gonorrhoeae, Mycobacterium tuberculosis,
Treponema pallidum, Candida albicans, Herpes simplex
virus y virus del papiloma humano; muchas de estas infec-
ciones son de transmisión sexual (figs. 9-38 y 9-39).
Las influencias yatrógenas incluyen la ablación con lá-
ser, el daño térmico, la operación, la radioterapia, el re-
emplazo o la manipulación hormonales y los dispositivos
Figura 9-38 “Célula indicadora” en la vaginosis bacteriana. El
crecimiento excesivo de cocos confiere un aspecto granular a una
célula escamosa superficial (“célula indicadora”) en un frotis cer-
vical. Por lo regular, se debe a la flora bacteriana mixta, incluida
Gardnerella vaginalis. Su presencia no es una indicación invariable
de síntomas clínicos (vaginosis bacteriana) (Pap, 250 ).
anticonceptivos intrauterinos. Éstos pueden dar lugar a
varias hiperplasias y metaplasias, además de complicar la
interpretación exacta del frotis cervical.
Discariosis, neoplasia intraepitelial cervical
y carcinoma cervical
Al carcinoma celular escamoso invasivo del cérvix lo ante-
cede un pródromo de cambios precancerosos (displasia)
del epitelio de la zona de transformación cervical, la lla-
mada neoplasia intraepitelial cervical (NIC). Éste es un es-
pectro biológico continuo que se subdivide o se califica de
forma arbitraria en cortes histológicos como NIC 1, 2 y 3,
de acuerdo con el aumento de la gravedad de la displasia
(figs. 9-40 y 9-41). Cada fase representa el potencial para la
progresión de la regresión. Estas categorías corresponden a
discariosis celular escamosa leve, moderada y grave en las
preparaciones de los frotis de transferencia cervical (fig.
9-40). El sistema estadounidense de Bethesda utiliza una
nomenclatura apenas diferente para los mismos aspectos
citomorfológicos (véase el cuadro 9-3). Cuanto más alto
sea el grado de anormalidad, mayor es el riesgo estadístico
de progresión al carcinoma invasivo.
 CITOPATOLOGÍA GINECOLÓGICA Y EXPLORACIÓN CERVICAL 117

Figura 9-39 Tricomonas y Candida en un frotis cervical. a) Trichomonas protozoon binucleadas y flageladas (Pap, 250 ). b) Blastos-
poros y seudohifas de Candida (Pap, 250 ).

Neoplasia cervical intraepitelial

Grado 1 Grado 2 Grado 3
Epitelio Displasia Displasia Displasia
maduro leve moderada grave
normal

Invasión estrómica inicial sobrepuesta o

carcinoma microinvasivo
Figura 9-40 Precursores del carcinoma celular escamoso inva-
sivo del cervix. Representación esquemática de la progresión po-
tencial de la neoplasia intraepitelial cervical al carcinoma cervical
invasivo.
Figura 9-41 Discariosis celular escamosa moderada. Obsérven-
se la nucleomegalia desproporcionada, el núcleo que ocupa hasta
dos tercios del área citoplásmica, la hipercromasia nuclear, el
contorno nuclear irregular y los bordes celulares angulados (Pap,
100 ).
118 CAP. 9
Cuadro 9-3 Comparación amplia de las terminologías más recientes aplicadas a las células escamosas
anormales en la citología cervical
Contraparte histológica WHO, 1973
NIC 1 Displasia menor
NIC 2 Displasia moderada
NIC 3 Displasia grave
Carcinoma in situ
Carcinoma invasivo Carcinoma epidermoide
WHO, World Health Organization; CEAII, células escamosas atípicas de importancia incierta; BSCC, British Society of Clinical Cytology; LIE,
lesión intraepitelial escamosa.
*Enmiendas propuestas por la BSCC en 2002 para emplear una clasificación simplificada de dos grados (es decir, discariosis de grados bajo y alto),
en lugar de la estadificación actual de tres grados de discariosis (esto es, menor, moderada y grave), la cual debe aún ratificarse en el Reino Unido.
La invasión estrómica inicial, la microinvasión y el car-
cinoma celular escamoso invasivo indican la transgresión
de la membrana basal a grados variables, en el caso extremo
con tumefacción. Esto se evalúa mejor mediante el examen
histológico, en tanto que la discariosis grave NIC 3 puede
ser indistinguible en el plano citomorfológico respecto de
la discariosis grave que se observa en el carcinoma invasi-
vo. Las células disqueratósicas extrañas y la diátesis tumo-
ral pueden ser características distintivas útiles, pero no son
patognomónicas ni están presentes en todos los casos.
Se han establecido programas de exploración para de-
tectar carcinoma de mama en mujeres asintomáticas en va-
rios países y los resultados iniciales parecen alentadores.
Citología basada en líquidos en la exploración cervical
En años recientes, junto con el reconocimiento de la efica-
cia de la prueba del frotis cervical, también se han identi-
ficado de modo más extenso algunas de las limitaciones
del proceso. La sensibilidad aceptada de un frotis cervical
solo oscila entre 50 y 60%, lo que contrasta en grado consi-
derable con la elevada expectativa pública, muchas veces
infundada. Los métodos empleados han cambiado poco en
varias décadas y están sujetos al escrutinio creciente, con
la finalidad de reducir más la mortalidad del cáncer cervi-
cal. Se cree que sólo una pequeña proporción de los frotis
falsos negativos son consecuencia del error humano de ob-
servación o interpretación durante el examen microscópico
por el personal del laboratorio. Los factores de confusión
más significativos se reconocen ahora durante las etapas
anteriores al muestreo y la preparación. Por ejemplo, la
espátula de madera convencional no muestrea las células
anormales de manera uniforme y transfiere sólo 10 a 60%
de las células recolectadas a un portaobjetos. Por lo tan-
CITOPATOLOGÍA
BSCC, 1986* Bethesda, 1991
Limítrofe CEAII
Discariosis menor LIE grado bajo
Discariosis moderada LIE grado alto
Discariosis grave LIE grado alto
Discariosis grave Carcinoma escamoso
¿Carcinoma invasivo?
to, la distribución del material puede ser desigual y poco
representativa. Esto, y en verdad cualquier factor de la mu-
cosa, inflamación u otro pueden ser perjudiciales para la
fijación, dado que provocan artefactos, tinciones insuficien-
tes y pérdida del contorno citonuclear; todo ello representa
una proporción inadecuada del frotis global de casi 10%.
Las técnicas de citología basadas en líquido reducen al
mínimo muchos de estos problemas. A partir de octubre de
2003, el National Institute of Clinical Excellence (NICE)
ha recomendado al NHS en Inglaterra y País de Gales que
se introduzca la citología basada en líquido como medio
primario del procesamiento de muestras en el NHSCSP. Se
anticipa que tomará cerca de cinco años para que esto se ins-
tituya por completo. Esta decisión incluye la evaluación de
dos diferentes sistemas comerciales establecidos, ThinPrep
(Cytyc Corporation) y Sure-Path Prep (TriPath Imaging
Inc.). Estos productos ganaron la aprobación similar de la
US Food and Drug Administration (FDA) varios años an-
tes. Es probable que otros productos comerciales insistan
en la validación oficial a su debido tiempo. Estudios piloto
predicen efectividad clínica reforzada (mayor sensibilidad
y especificidad, menos frotis limitados), mejor relación
costo-beneficio (menos frotis inadecuados, tiempos más rá-
pidos de consulta y mejor productividad del laboratorio) y
una mejor aceptación (del público y los profesionales del
cuidado médico) en comparación con las técnicas conven-
cionales del frotis cervical.
Exploración automatizada y análisis de la imagen
Los sistemas de análisis de imagen de alta resolución se
pueden semiautomatizar o automatizar por completo y
conectarse a la poderosa red neural de computadoras. El
objetivo de evitar la subjetividad de la valoración manual y
 LECTURAS ADICIONALES
la posibilidad de que las máquinas autónomas reduzcan el
error humano durante el proceso de exploración son puntos
atractivos. El requerimiento de calidad óptima y muestras
uniformes han conducido en gran parte al avance de la cito-
logía basada en líquido. Varios paquetes comerciales se han
desarrollado y comercializado en poco tiempo. No obstante,
hasta la fecha parece discreta la perspectiva de reemplazar
a la mayoría de los citólogos expertos y la relación costo-
beneficio de esta tecnología todavía no se establece.
Los dispositivos de la microscopia asistidos por una
computadora se han utilizado como adjunto del entrena-
miento de los citólogos y para registrar los datos del control
de calidad, pero aún no se emplean de rutina en la mayor
parte de los laboratorios.
La telepatología y la teleconferencia aprovecharon
los enlaces remotos en tiempo real con los usuarios, aleja-
dos desde el punto de vista geográfico, y ello hizo posible
las consultas interactivas para el entrenamiento, revisión
grupal o del experto y la valoración de calidad.
Técnicas auxiliares
En ocasiones, la valoración citomorfológica es un proce-
so muy subjetivo y por tanto propenso a las diferencias de
reproducibilidad entre el propio clínico y entre éste y otro.
Se ha tratado de depurarla y cuantificarla de modo más ri-
guroso, con grados variables de éxito.
La citometría de flujo implica la valoración automati-
zada de células en suspensión, las más de las veces para el
análisis del DNA o con propósitos de inmunofenotipifica-
ción. La microfluorimetría permite el enfoque sobre célu-
las individuales en un campo para evaluar la cantidad de
actividad fluorescente dentro de núcleos marcados.
El análisis citogenético detecta anormalidades cromosó-
micas, algunas de las cuales son típicas de ciertos tumo-
res, como el t(x:18) en el sarcoma sinovial y el t(11:22) en
el tumor de Ewing. No obstante, casi ninguna neoplasia
muestra tales translocaciones consecuentes típicas.
Las regiones del organizador nucleolar teñidas con pla-
ta se incrementan en la mayoría de los núcleos malignos.
Infortunadamente, la superposición de anormalidades be-
nignas y malignas es considerable con frecuencia.
El escrutinio y la microscopia electrónica de transmi-
sión pueden identificar los detalles ultraestructurales útiles
e imperceptibles para la microscopia de luz y ello hace po-
sible una clasificación más exacta de diferenciación celular,
como gránulos neurosecretorios de centro denso, uniones
firmes, tonofilamentos, etcétera.
Las técnicas de hibridación in situ se pueden utilizar
para identificar el material nuclear vírico y reconocer la
activación oncógena en los tumores.
119
La microscopia con láser confocal procesa las imágenes
digitales, que pueden manipularse más para reconstruir la
microtopografía tridimensional de las células; es conve-
niente en particular para las preparaciones gruesas y los
productos fluorescentes que pueden cuantificarse.
La citometría con láser es una técnica híbrida que
combina las características de la citometría de flujo con
el análisis de imagen estática de células marcadas por los
fluorocromos multicolores; puede determinar la ploidia
del DNA e incorporar métodos de hibridación in situ fluo-
rescentes mediante citopreparaciones convencionales y
basadas en líquido.
Las técnicas de microdisección con captura de láser
permiten la selección de una subpoblación relativamente
pura de células seleccionadas de un portaobjetos de la cito-
logía o la histología. Un láser infrarrojo de baja energía se
emplea para extender un adhesivo plástico sobre las célu-
las seleccionadas, que después se desprenden con suavidad
para el estudio adicional.
Aseguramiento de la calidad
en la citología diagnóstica
El propósito de un programa de aseguramiento de calidad
es evaluar el proceso diagnóstico en su práctica. El control
de calidad interno indica una serie de procedimientos den-
tro de un laboratorio particular. Esto supone la educación
continua, el adiestramiento, la revisión de los procedi-
mientos del laboratorio y su implementación, la reevalua-
ción, la doble valoración y la auditoría. El aseguramiento
de calidad externo indica la evaluación de la ejecución
contra un grupo externo, ya sea en el plano regional o el
nacional, y esto puede ser parte de un esquema de acredi-
tación, voluntaria u obligatoria.
Lecturas adicionales
Atkins KA. Liquid-based cytological preparations in gynae-
cological and non-gynaecological specimens. In Progress
in Pathology, vol 6, Kirkham N, Shepherd NA (eds). 2003:
Greenwich Medical Media, London, 101-114.
Coleman DV. Chapman PA (eds). 1989: Clinical Cytotechnology.
Butterworths, London.
Gray W, McKee G (eds), 2003: Diagnostic Cytopathology, 2nd
edn. Elsevier Science, London.
Woods AE, Ellis RC (eds), 1994: Cytopathology. In Laboratory
Histopathology—a Complete Reference. Churchill-Livingsto-
ne, New York.
Young JA (ed). 1993: Fine Needle Aspiration. Blackwell Scien-
tific. London.
 SECCIÓN 3
MICROBIOLOGÍA-
BACTERIOLOGÍA

KWWSERRNVPHGLFRVRUJ
 10
Microscopia en bacteriología:
aplicación y preparación de la muestra
Dugald R Baird
Introducción
A finales del siglo xvii, el tapicero y científico aficionado
holandés Antonie van Leeuwenhoek pulió lentes pequeñas
de extraordinaria calidad y pudo observar microorganismos
por primera vez. Desde entonces, la microscopia desem-
peña un papel fundamental en la bacteriología clínica. El
examen microscópico de una muestra clínica puede ayudar
a valorar la propiedad de la muestra (véase la sección sobre
esputo más adelante) y puede por sí mismo indicar inme-
diatamente la probable naturaleza del agente patógeno
bacteriano en sitios casi siempre estériles, como el líquido
cefalorraquídeo (LCR) o cultivos de sangre. Los métodos
en un laboratorio de diagnóstico clínico incluyen las mi-
croscopias de luz y fluorescencia; las muestras pueden es-
tar teñidas o carecer de tinción, según sea su aplicación.
Microscopia de luz
La microscopia de luz puede emplearse de tres maneras: la
forma ordinaria transmitida (campo brillante), la de campo
oscuro y la de contraste de fase; la más utilizada, sin duda,
es la primera. Un microscopio moderno es capaz de alcan-
zar una ampliación de mil veces y un poder de resolución
aproximado de 0.2 µm. La mayor parte de los microscopios
se diseña de tal modo que el observador mira a través de
los oculares, que se inclinan a un ángulo conveniente, en di-
rección del portaobjetos, que contiene el objeto a examinar.
Una disposición alternativa (el microscopio de placa inver-
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
tida) se ideó para observar la muestra desde abajo. La ilumi-
nación de campo oscuro aumenta de forma eficaz el poder
de resolución del microscopio de luz por abajo de 0.2 µm.
Las muestras se iluminan de manera indirecta, dispersan la
luz y aparecen brillantes contra un fondo oscuro. Mediante
esta técnica es posible visualizar bacterias, como las espiro-
quetas, que tienen un diámetro cercano a 0.1 µm. La micros-
copia de contraste de fase permite el examen de estructuras
internas finas de tejidos y bacterias vivas sin teñir y las dife-
rentes estructuras aparecen en distintas tonalidades de gris.
Microscopia de fluorescencia
La fluorescencia se emite cuando una molécula se somete
a la luz de una longitud de onda particular e irradia luz de
una longitud de onda más larga. Los fluorocromos (tintes
fluorescentes) absorben luz ultravioleta invisible y emiten
luz visible. Un microscopio fluorescente utiliza una lámpa-
ra de vapor de mercurio que irradia luz ultravioleta de alta
intensidad (luz de excitación) y un espejo la dirige hacia la
muestra desde un plano superior. Las bacterias teñidas con
un fluorocromo absorben esta luz de longitud de onda cor-
ta, emiten luz de longitud de onda más larga y se delinean
como objetos verdes o amarillos radiantes contra un fondo
oscuro. La microscopia de fluorescencia permite el uso de
objetivos de poder más bajo y por lo tanto puede analizarse
con rapidez un área mucho más grande de la muestra. Esto
es importante, por ejemplo, al buscar micobacterias en una
muestra de escasos microorganismos.
124 CAP. 10 MICROSCOPIA EN BACTERIOLOGÍA: APLICACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Muestras para microscopia
Los especímenes pueden ser de dos tipos principales: a)
frotis secos de muestras líquidas o escobillados o bien de
cultivos bacterianos, extendidos sobre un área de 1 a 2 cm
de diámetro en portaobjetos de 31 y fijados por calor
(“películas”); b) “preparaciones húmedas” de líquidos,
examinadas bajo un cubreobjetos o cámaras especiales.
Los escobillados contenidos en un medio de transporte
están húmedos y se pueden frotar directamente sobre la
superficie de un portaobjetos, mientras las películas de
muestras líquidas, como pus, aspirados, LCR, etc., se pre-
paran al extenderse sobre una capa fina. Los especímenes
de tejido se presionan sobre las superficies de los portaob-
jetos para crear las impresiones, o bien pueden suspenderse
en un volumen pequeño de agua peptonada. Las colonias
de bacterias que crecen en medios sólidos se examinan al
remover con un asa la colonia y emulsificar ésta en una
gota de solución salina sobre el portaobjetos, de tal manera
que se obtenga una suspensión muy ligera para que las cé-
lulas individuales se distingan con claridad.
Examen de muestras sin teñir
por transmisión de luz
El examen de muestras líquidas en una cámara de conteo
sobre un portaobjetos con un cubreobjetos se utiliza para
evaluar la presencia de indicios de infección o inflamación
en líquidos corporales habitualmente estériles, como la
orina, LCR, aspirados y excreciones de diálisis peritoneal.
La luz transmitida se emplea con o sin contraste de fase
y la muestra se examina mediante el objetivo 25  para
eritrocitos y leucocitos, agentes patógenos, cilindros o cris-
tales, según sea apropiado para la muestra. Las cuentas de
células pueden expresarse en términos cuantitativos, si se
emplea una cámara de conteo, o semicuantitativos (p. ej.,
“por campo de alto poder”).
Las bacterias que crecen en medios de cultivo líquidos
pueden examinarse por la motilidad con un objetivo de 50 .
Al acercar el condensador aumenta el contraste y la visualiza-
ción de los microorganismos resulta más fácil; en caso contra-
rio puede ser de utilidad el microscopio de contraste de fase.
El examen de monocapas de cultivo de células de tejido
para efectos citopáticos es en particular competencia de la
virología, pero tiene una aplicación en la bacteriología para
identificar la citotoxina de Clostridium difficile en extrac-
tos fecales o sobrenadantes de cultivos.
Líquido cefalorraquídeo (LCR)
En condiciones normales, el LCR es estéril y contiene no
más de cinco células blancas por milímetro cúbico, sobre
todo linfocitos. El primer paso en el examen consiste en la
microscopia del líquido sin centrifugar para cuantificar el
número de células presentes y su tipo. Se usa una cámara
de conteo, casi siempre la Fuchs-Rosenthal modificada. Se
trata de un portaobjetos que contiene un hueco, el piso del
cual está grabado con una rejilla de nueve cuadros grandes,
cada uno de 1 mm2 de área. Estos cuadros están a su vez
subdivididos en 16 cuadros pequeños. Cuando un cubreob-
jetos se aplica encima de la cámara de conteo y el líquido
se traslada mediante una pipeta de Pasteur, la profundidad
del líquido es de 0.2 mm. El volumen del líquido que cubre
cinco cuadros grandes es por consiguiente de 1 mm3.
Un cubreobjetos se aplica al portaobjetos para crear un
sello firme uniforme sobre la cámara de conteo, tras pre-
sionar con suavidad sus bordes hasta que los colores del
arco iris se ven de manera uniforme alrededor de los lados
del cubreobjetos (anillos de Newton); esto confirma que
el cierre e incluso el contacto se efectuaron entre el cu-
breobjetos y la cámara. El LCR se introduce en la cámara
con una pipeta de Pasteur fina aplicada de modo cuidadoso
en el borde para que el líquido pase al interior y llene por
completo la cámara, sin burbujas de aire.
Después de unos cuantos minutos de reposo, las célu-
las se cuentan con un objetivo de 40 ; los números de
cuadros existentes examinados dependen del número
de células presentes. El LCR que contiene una gran canti-
dad de células blancas o el densamente teñido de sangre,
en un caso como resultado de hemorragia intracerebral
y en otro por la punción accidental de vasos sanguíneos
pequeños durante la punción lumbar, debe diluirse antes de
realizar un conteo celular exacto. Para este propósito se uti-
liza un líquido que contenga ácido acético y cristal violeta
diluido: se rompen los eritrocitos y se tiñe el núcleo de las
células blancas, lo cual las hace más visibles. La identifi-
cación de los tipos de células se facilita al centrifugar una
alícuota de LCR y crear una película, que se impregna con
una tinción diferencial como la de Leishman.
Orina
No todos los laboratorios realizan la microscopia como una
rutina en las muestras de orina. En los especímenes toma-
dos de pacientes mediante catéteres (muestras de catéter
de orina) está justificado, ya que la ausencia de células de
pus en esos especímenes no excluye la infección. Sin em-
bargo, en las muestras obtenidas con limpieza sin catéteres
(orina del chorro medio), la ausencia de piuria sugiere que la
relevancia de un aislado es en el mejor de los casos incierta;
puede tratarse de un contaminante y en tal caso se aconseja
la repetición del muestreo. La microscopia también es útil
para detectar eritrocitos, cilindros y cristales, que pueden
ser de importancia diagnóstica. En consecuencia, la infor-
 TINCIÓN DE LAS MUESTRAS
mación que se puede obtener de la microscopia de la orina
es valiosa y debe solicitarse siempre que sea posible.
La microscopia se realiza sobre orina fresca sin centri-
fugar. La visualización de microorganismos en tales pre-
paraciones es de importancia secundaria puesto que es la
cuantificación del crecimiento bacteriano lo que importa en
la evaluación de los aislados de una muestra de orina. Los
neutrófilos se excretan en números variables en la orina y
sólo cifras mayores de 104/ml pueden considerarse anor-
males en las muestras del chorro medio. Las células rojas
se encuentran como contaminantes en la orina de mujeres
saludables muy jóvenes, en relación con la menstruación,
pero pueden también indicar afecciones graves del sistema
renal, como cálculos, neoplasias o enfermedad glomerular.
En este último caso, la morfología de los eritrocitos puede
ser anormal (dismorfismo) y se reconocen fragmentación,
crenación u otras formas extrañas.
Los laboratorios que procesan pocas muestras de orina
pueden examinarlos en cámaras de conteo, como se describió
para el LCR, pero casi todos usan un método semicuantita-
tivo. Éste suele incluir tan sólo un portaobjetos y un cubre-
objetos de cristal ordinarios, cámaras de conteo desechables
o un microscopio de placa invertida. Este último permite el
procesamiento por lotes de muchas muestras en pozos de
fondo plano dentro de una placa plástica. Se usa un objetivo
40  y, si se conocen el área de campo (“campo de alto
poder”) y la profundidad de la orina, el número de células
visibles se puede expresar en cuentas/ml, aunque en la prác-
tica la mayor parte de los laboratorios registra las cuentas
sólo como escasas, moderadas o numerosas.
Otras muestras
Las técnicas descritas para la orina se pueden aplicar a otros
líquidos estériles, como los aspirados de articulaciones (en
los cuales también es importante el examen de cristales
como el ácido úrico), líquidos serosos y secreciones de
diálisis peritoneal. La microscopia de heces se emplea para
el diagnóstico de infecciones parasitarias, pero no para el
diagnóstico de la gastroenteritis bacteriana.
Examen de muestras sin teñir mediante
iluminación de fondo oscuro
Tiene una aplicación en la bacteriología clínica, sobre todo
en el examen de material tomado de un chancro primario
cuyos agentes patógenos pueden ser causantes de sífilis
(Treponema pallidum). El material se recoge de la lesión
sospechosa y se crea una película húmeda bajo un cubre-
objetos, que se examina de inmediato para identificar la
motilidad de los treponemas.
125
Tinción de las muestras
Se emplea luz transmitida porque el índice de refracción de
las bacterias es similar al del fondo oscuro y es necesario
incrementar el contraste por el uso de tinciones. El método
más utilizado de tinción de bacterias es aún el que intro-
dujo Christian Gram en 1884. Aunque no es un colorante,
sino un método de tinción, el término “tinción de Gram” se
utiliza de modo universal; la técnica delinea las diferencias
de la estructura de la pared celular que existen entre varias
clases de bacterias. El material que se tiñe puede ser una
muestra clínica, un caldo de cultivo o una suspensión en
solución salina de un microorganismo tomado de una placa
de agar. En todos los casos se realiza un frotis fino sobre
un portaobjetos y se seca de manera natural o con calor de
baja intensidad, después de lo cual el frotis se fija al por-
taobjetos, sea que éste se pase rápidamente tres veces por
un mechero de Bunsen o se emplee una placa calentada.
El método de tinción de Gram, que tiene varias modifica-
ciones, somete el frotis de modo sucesivo a lo siguiente: a)
una tinción básica de carga positiva, casi siempre cristal de
violeta; b) mordiente de yodo acuoso; c) decoloración con
acetona, y d) contratinción con carbol fucsina o safranina.
La mayor parte de las bacterias se tiñe al principio con el
cristal violeta y yodo, que forma complejos insolubles den-
tro de la pared bacteriana. Las bacterias que poseen capas
gruesas de peptidoglucano en sus paredes celulares, y en
consecuencia retienen la tinción después del tratamiento con
acetona y adquieren una tonalidad morada, se definen como
grampositivas. Los microorganismos que tienen capas más
delgadas de peptidoglucano, que pierden con rapidez el com-
plejo con la acetona y por lo tanto se tiñen con el reactivo de
tinción rosa, se conocen como gramnegativos. Los ejemplos
de ambos se hallan en el cuadro 10-1. Algunas bacterias se
tiñen sólo de modo muy discreto con la tinción de Gram
(p. ej., especies de Legionella), algunas son irregulares en el
Cuadro 10-1 Algunos ejemplos de géneros bacterianos
clasificados de acuerdo con su morfología y tinción de Gram
Forma Grampositivos Gramnegativos
Cocos (esferas) Staphylococcus Neisseria
Streptococcus Moraxella
Peptococcus* Veillonella*
Bacilos (bastones) Bacillus Enterobacteriaceae
Listeria Pseudomonas
Corynebacterium Haemophilus
Clostridium* Bacteroides*
*Género anaeróbico.
126 CAP. 10 MICROSCOPIA EN BACTERIOLOGÍA: APLICACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
grado de tinción (gramvariables, como Gardnerella vagina-
lis) y otras no se tiñen en absoluto (p. ej., micobacterias).
Se requieren métodos especiales de tinción para las mi-
cobacterias debido a la peculiar composición de sus paredes
celulares, que contienen altas concentraciones de ácidos
(grasos) micólicos. La tinción de Ziehl-Neelsen implica
el tratamiento de las películas con carbol fucsina calien-
te, seguido por pasos sucesivos de decoloración con ácido
sulfúrico concentrado y alcohol; al final se contratiñen con
malaquita verde o azul de metileno. Las micobacterias apa-
recen rojas contra un fondo verde o azul (fig. 10-1).
Figura 10-1 Esputo teñido por el método de Ziehl-Neelsen
que muestra micobacterias (rojo) contra un fondo azul (1 000 ).
Cortesía de J. Winning.
El otro método de tinción usado para las micobacterias
es el fenol de auramina. Los frotis secos y fijados por ca-
lor (esputo, líquidos pleural y ascítico, primera orina del
día, LCR, pus, etc.) se tratan con fenol de auramina y se
decoloran con ácido clorhídrico al 1% en alcohol metilado
industrial, seguido de solución diluida de permanganato de
potasio. Los especímenes se observan bajo luz ultravioleta
con el objetivo de 40  y las micobacterias brillan en tonos
verdes y amarillos contra un fondo oscuro (fig. 10-2). Esta
técnica permite la rápida proyección de un frotis y es útil si
el número de bacterias en la muestra es pequeño.
Otros dos métodos de tinción se emplean en microsco-
pia de fluorescencia, la acridina naranja y la fluoresceína,
que usan anticuerpos conjugados. La tinción con acridina
naranja es un método útil para demostrar las bacterias que
no pueden destacarse con claridad en una tinción de Gram
(como en los cultivos de sangre; véase más adelante). Bajo
luz ultravioleta, las bacterias aparecen anaranjadas.
Se dispone de dos técnicas inmunofluorescentes princi-
pales que usan conjugados de anticuerpos de fluoresceína,
las pruebas directa e indirecta de anticuerpo fluorescen-
te (DFAT e IFAT, respectivamente). La DFAT utiliza un
Figura 10-2 Esputo teñido con fenol de auramina y visualizado
bajo luz ultravioleta; se reconocen micobacterias radiantes con
una fluorescencia de tono verde o amarillo (400 ). Cortesía de
B. Watt.
fluorocromo, casi siempre isotiocianato de fluoresceína, con-
jugado con un anticuerpo específico que se une directamen-
te al antígeno superficial bacteriano. La IFAT es un proceso
de dos etapas: el anticuerpo específico (p. ej., preparado en
un conejo) se liga al antígeno y lo detecta un anticuerpo con-
jugado (p. ej., anticonejo). La ventaja de la IFAT es que un
solo anticuerpo conjugado puede usarse para identificar
una gama entera de anticuerpos específicos.
En la bacteriología clínica los principales usos de estas
técnicas de inmunofluorescencia son: a) la detección de las
especies de Legionella, que son fastidiosas y de lento creci-
miento, pero pueden visualizarse con rapidez en esputo, la-
vados bronquioalveolares y tejido pulmonar (fresco o fijado
en formalina), sea con DFAT o IFAT, y b) la demostración
directa de clamidias en muestras genitales o respiratorias.
A continuación se describen algunos ejemplos adiciona-
les del uso de la microscopia de las preparaciones teñidas
en microbiología clínica.
Muestras de sitios estériles
Con estas muestras, la microscopia es una herramienta
poderosa para predecir el probable agente patógeno causal.
El hallazgo de microorganismos en el líquido cefalorra-
quídeo, aspirado o secreciones de diálisis peritoneal, por
ejemplo, en particular cuando se acompañan por un infil-
trado de células de pus, es un indicador seguro de infección
y la apariencia sola de las bacterias puede ser diagnóstica.
Debe realizarse una investigación minuciosa de las bacte-
rias, dado que algunas veces son muy escasas en las mues-
tras, y se examinan por centrifugación (p. ej., 3 000 rpm
por 10 minutos); se desecha el sobrenadante y se crea una
película del depósito, que a continuación se tiñe por el mé-
todo de Gram o bien con auramina o con tinción de Ziehl-
 TINCIÓN DE LAS MUESTRAS
Neelsen, si la situación clínica sugiere una posible infec-
ción micobacteriana.
Casi todos los laboratorios utilizan ahora alguna forma
del sistema de cultivo en sangre semiautomatizado; el pri-
mer paso para la identificación del microorganismo es el
examen de una gota teñida de Gram del caldo de un tubo
que muestra crecimiento. La microscopia puede ser por sí
misma diagnóstica; por ejemplo, los estreptococos en la
sangre de un paciente con fiebre y un soplo cardiaco apoyan
un diagnóstico clínico de endocarditis infecciosa (véase fig.
10-3). Por otro lado, los cocos grampositivos en racimos
son casi siempre estafilococos, pero Staphylococcus aureus
no se puede distinguir por microscopia de las diversas es-
Figura 10-3 Tinción de Gram de un cultivo en sangre que mues-
tra cocos grampositivos en cadenas largas. El agente patógeno era
Streptococcus sanguis y el paciente tenía endocarditis infecciosa
(1 000 ). Cortesía del Dr. A McLay.
pecies coagulasa negativas, y puesto que estas últimas son
microorganismos de la piel, resultan los contaminantes más
comunes de los cultivos de sangre. La relevancia de los es-
tafilococos identificados en un cultivo de sangre deben casi
siempre esperar una identificación adicional. Los patógenos
gramnegativos en los cultivos de sangre son algunas veces
difíciles de visualizar contra la tinción rosada del fondo;
cuando los microorganismos no son visibles es a menudo
útil solicitar una tinción de acridina.
Muestras de sitios con una flora bacteriana
residente normal
Escobillados bucales
La microscopia es el único método que diagnostica la angina
de Vincent (estomatogingivitis anaeróbica), puesto que los
microorganismos causales (que actúan de modo sinérgico
para provocar la infección) no se pueden cultivar de mane-
127
ra artificial. Las películas de escobillados bucales muestran
muchas células de pus y un gran número de espiroquetas y
bacilos fusiformes (aspecto de huso) gramnegativos.
Esputo
Todas las muestras de esputo se registran como potencial-
mente peligrosas para el operador, ya que pueden contener
bacilos tuberculosos, y la preparación se lleva a cabo en un
gabinete de seguridad alojado en un laboratorio de conten-
ción de categoría 3. Aunque el esputo se origina en las vías
respiratorias inferiores casi siempre estériles, se contamina
de forma inevitable antes de la colección por la flora de las
vías respiratorias superiores. Es necesario tener cuidado al
interpretar los especímenes con tinción de Gram del esputo
y sólo de modo ocasional puede predecirse con seguridad el
agente patógeno causal de la neumonía con base en la mi-
croscopia. No obstante, los especímenes con tinción de Gram
son útiles porque las muestras de “esputo” que poseen menos
de 10 neutrófilos por célula epitelial escamosa representan
probablemente saliva, más que esputo, e indican que el cul-
tivo puede ser engañoso. Cuando se sospecha una infección
micobacteriana, se examinan los preparados teñidos de au-
ramina y se confirman positivos con la realización de mues-
tras frescas y teñidas con el método de Ziehl-Neelsen.
Las desventajas del esputo se superan en buena medida
con la práctica del lavado bronquioalveolar, un procedi-
miento empleado cada vez más en el diagnóstico de neu-
monía en los sujetos muy enfermos o inmunosuprimidos.
Las muestras obtenidas están libres de la contaminación de
la flora de las vías respiratorias superiores y pueden exa-
minarse por las técnicas de tinción de Gram, auramina y
Ziehl-Neelsen, además de las técnicas de inmunofluores-
cencia para las especies de Legionella y un amplio espectro
de agentes patógenos protozoarios, micóticos y víricos.
Lesiones de la piel
Los escobillados de lesiones de la piel encierran escaso
valor diagnóstico debido a la presencia de la flora normal
de la piel, con una excepción notoria: el examen micros-
cópico del material raspado de las lesiones purpúricas
relacionadas con la infección meningocócica. En ésta, la
presencia de cocos gramnegativos en pares, con su aspecto
característico, es diagnóstica.
Pus y escobillados de heridas
El valor de la microscopia de estas muestras es variable
y depende de ciertos factores, más allá del control del
128 CAP. 10 MICROSCOPIA EN BACTERIOLOGÍA: APLICACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

laboratorio. El pus o escobillados de pus de sitios como la (b)

piel o infecciones de tejidos blandos puede sugerir infec-
ción con estafilococos, estreptococos o anaerobios, mien-
tras que las muestras similares de sitios intraabdominales
pueden mostrar un cuadro mezclado, no siempre fácil de
relacionar con los hallazgos posteriores del cultivo. En
muchos de estos casos, la administración previa de anti-
biótico puede explicar las discrepancias. Sin embargo, es a
menudo útil suministrar un informe provisional indicativo
de que es probable una muestra o escobillado de pus, por
ejemplo, originada por estafilococos o, de manera alterna-
tiva, de que los microorganismos mezclados tienen un pro-
bable origen fecal.
Figura 10-4 Espécimen de una supuración uretral que ilus-
Escobillados vaginales altos tra numerosos cocos intracelulares gramnegativos de Neisseria
gonorrhoeae (1 000 ). Cortesía de J. Winning.
Las muestras con tinción de Gram se utilizan para determi-
nar la presencia de células de pus y también la de células
Lecturas adicionales
epiteliales cubiertas con pequeños bacilos gramvariables
(células indicativas). El hallazgo de estos últimos es un Bishop BJ, Neumann G. The history of the Ziehl-Neelsen stain.
indicador de un trastorno conocido como vaginosis bacte- Tubercle 1970; 51: 196-206.
riana. En medicina genitourinaria, los escobillados uretral Larsor HE, Price AB. Pseudomembranous colitis: presence of
y endocervical se examinan para reconocer células de pus clostridial toxin. Lancet 1977; 2: 1312-1314.
que contienen cocos intracelulares gramnegativos en pares, Preston NW, Morrel A. Reproducible results with the Gram stain.
esto es, Neisseria gonorrhoeae (véase fig. 10-4). J Pathol Bacteriol 1962; 84: 241-243.
 11
Medios de cultivo en bacteriología
Eric Y Bridson

Medios de cultivo en microbiología

Bulloch escribió la historia de las plagas y pestes desde los
primeros registros del género humano hasta principios del
siglo xx. Aunque los términos “contagio” e “infección” se
usaban ya en tiempos medievales, el papel de los diminutos
agentes infecciosos no pudo probarse sino hasta el trabajo
de Louis Pasteur (1822-1895). En buena medida, el trabajo
de este científico supuso la demolición de las teorías de
Galeno sobre la enfermedad infecciosa y la generación es-
pontánea de la vida microscópica.
Sin embargo, el padre de los medios de cultivo fue
Robert Koch (1843-1910; fig. 11-1), quien creó los méto-
dos para el cultivo, aislamiento e identificación de las bac-
terias. Primero Pasteur demostró que éstas eran la causa
de la infección en seres humanos, animales y alimentos,
pero sólo el trabajo de Koch confirmó que agentes pató-
genos específicos ocasionaban enfermedades específicas.
En esencia, el trabajo de Koch consistió en apartarse de
los cultivos líquidos, con sus meticulosas diluciones y fre-
cuente contaminación, y adoptar una simple pero poderosa
técnica que usaba un medio “sólido”. Al agregar gelatina, y
más tarde agar, a su caldo de extracto de carne creó la placa Figura 11-1 Robert Koch (1843-1910), el padre de los medios
rayada con sus colonias aisladas. Más tarde demostró que de cultivo.
al mezclar de forma cuidadosa material sospechoso dentro
del medio fundido y verterlo en una placa se producía una dio de agar de infusión de carne. Para este microorganismo
valoración cuantitativa de los números bacterianos, una téc- utilizó suero coagulado, huevo o papa rebanada. A finales
nica utilizada ahora en extenso en la forma de la placa raya- del siglo XIX un libro de texto de bacteriología médica des-
da. Richard Petri, uno de los asistentes de Koch, reemplazó cribía siete medios. La adición más importante al caldo de
la placa de vidrio de Koch por la placa de Petri. Este diseño infusión de carne de Koch fue la peptona, un digerido pép-
permaneció sin cambio por más de 100 años. tico de proteína que sugirió Loeffler. Este último también
Koch fue consciente de que un medio universal para incorporó 0.5% de peso/volumen de cloruro de sodio y su
bacterias patógenas era imposible. Mostró también que medio de nutrimentos es a la fecha el cimiento de los me-
Mycobacterium tuberculosis no podía crecer sobre el me- dios de cultivo complejos e indefinidos para microorganis-

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
130 CAP. 11 MEDIOS DE CULTIVO EN BACTERIOLOGÍA
mos quimioheterótrofos (es decir, aquellos que requieren
utilizar compuestos de carbón orgánico, en oposición a las
bacterias autótrofas, las cuales sintetizan compuestos de
carbón a partir del dióxido de carbono).
Muchas formulaciones más de medios de cultivo surgie-
ron en las primeras décadas del siglo XX, cuando los medios
de enriquecimiento y selección y los indicadores se idea-
ron para agentes patógenos aislados en áreas que no eran
médicas, como la agricultura, manufactura de alimentos
y bebidas, farmacéutica, etc. Alrededor de 1930, un estu-
dio sobre medios describió 2 540 formulaciones, muchas
de ellas variaciones pequeñas de los medios ya publicados.
El número creció en proporción enorme desde entonces,
pero ningún estudio similar se repitió.
Formulación de los medios de cultivo
Las formulaciones empleadas para los diversos medios
pueden contener tan poco como tres ingredientes (caldo
nutriente de Loeffler) hasta 10, como muchos medios para
microorganismos exigentes. El número de ingredientes tie-
ne poca relación con su crecimiento. Un cultivo “simple”
puede ser complejo y del todo indefinido. Una estructura
común de los medios de cultivo para agentes patógenos
quimioheterótrofos es la siguiente:
• Base amina-nitrógeno (peptona, proteína hidrolizada, in-
fusión o extracto de proteína). Pocos agentes patógenos
pueden utilizar proteínas coaguladas; se proporcionan
los derivados predigeridos o ácidos hidrolizados. Los
péptidos y aminoácidos se pueden transferir dentro de
la célula y usarse como fuentes de carbón para energía
o polimerización de las proteínas funcionales.
• Factores de crecimiento suplementarios (sangre, sue-
ro, extracto de levadura, nucleótidos, vitaminas). Los
microorganismos descritos como nutricionalmente exi-
gentes, como Neisseria, Bordetella, Legionella, exigen
factores de crecimiento adicionales. El considerable be-
neficio de la sangre entera en estos microorganismos se
atribuyó con anterioridad a los factores de crecimiento
agregados. Se considera ahora que el papel principal de
la sangre entera es proteger a los agentes patógenos vul-
nerables de los procesos tóxicos de la oxidación.
• Fuentes de energía, excepto péptidos (azúcares, alco-
holes y carbohidratos complejos). Estas sustancias casi
siempre se agregan a los medios indicadores para realzar
los cambios de pH de los microorganismos que pueden
fermentar la fuente de energía. Los patógenos quimiohe-
terótrofos pueden metabolizar muchas otras moléculas
orgánicas para proporcionar energía.
• Sales amortiguadoras (fosfatos, acetatos, citratos).
Los amortiguadores suelen agregarse a las formulacio-
nes con grandes cantidades de carbohidratos (p. ej., las
que contienen peptona de soya) para prevenir los cam-
bios excesivos de los niveles de pH. Infortunadamen-
te, muchos amortiguadores tienden a quelar metales
esenciales y deben utilizarse con cautela. Los péptidos
y aminoácidos pueden actuar como agentes amortigua-
dores a través del efecto zwitterion de las agrupaciones
NH2/COOH.
• Sales minerales y metales (fosfatos, sulfatos, Ca++,
Mg++, Fe++, Mn++, metales traza). Estas sustancias pue-
den adicionarse por separado como macrocantidades o
microcantidades en los casos en que son evidentes las
demandas particulares. Es importante que los metales se
hallen en la forma soluble y no formen complejos den-
tro de las formas insolubles durante el procesamiento de
calor. Por lo general se asume que los tejidos de plantas
o animales hidrolizados contienen suficientes minerales
y metales para el crecimiento óptimo.
• Agentes selectivos (químicos, antimicrobianos y algu-
nos colorantes de anilina). Como lo señala su nombre,
estos agentes se agregan en una concentración suficien-
te para inhibir a los agentes patógenos indeseables, pero
se permite la multiplicación de microorganismos selec-
cionados. Se requiere un cuidado extremo al determinar
la concentración óptima en el medio. Todos los agentes
selectivos poseen cierta toxicidad para algunas especies
y es posible que de forma ocasional no supriman a to-
das las especies indeseables. Una regla general es que
cualquier incremento de los nutrimentos en el medio
requiere un aumento del agente selectivo y viceversa.
Los agentes selectivos pueden interactuar en forma mu-
tua para acentuar o atenuar su selectividad; por ejemplo,
las sales biliares disminuyen la toxicidad de los colo-
rantes. Los agentes selectivos pueden también afectarse
por sustancias (p. ej., casi todos los amortiguadores) que
quelan cationes; por ejemplo, ciertos colorantes y sales
biliares pueden volverse más tóxicos. Este efecto puede
revertirse con la adición de cationes (Mg/Ca).
• Colorantes indicadores (rojo fenol, rojo neutral, bromo-
cresol morado). Estos colorantes indican cambios en el
valor del pH posteriores a la fermentación, desaminación
o descarboxilación. Los medios de cultivo cromógenos
desarrollados para indicar colonias que producen activi-
dades enzimáticas específicas son casi siempre mezclas
de colorantes indicadores. Todos los colorantes requieren
cuidadosa dosificación para evitar la inhibición selectiva.
• Agentes de gelificación (agar, gelatina, alginato, gel de
sílice). El agar extraído de las especies de algas marinas
 MEDIOS DE CULTIVO DEFINIDOS Y MEDIOS COMPLEJOS INDEFINIDOS
del genero Gelidium es el agente habitual de gelificación
para el crecimiento de los microorganismos quimiohete-
rótrofos. Aunque la calidad del agar mejoró mucho desde
sus comienzos, no puede considerarse un gel polímero
inerte. Éste aporta metales, minerales y piruvatos que
pueden influir en el crecimiento de los microorganismos.
No todos los agares son similares: las diferencias de la
fuente del agarofito y los procesos industriales de extrac-
ción pueden inducir un desempeño significativamente
diferente en el crecimiento y la difusión del antibiótico.
Las ocho categorías de materiales mencionadas cubren ca-
si todas las variaciones de las formulaciones publicadas de
los medios de cultivo. Detalles adicionales sobre estos mate-
riales y su manufactura pueden encontrarse en otras obras.
Enriquecimiento y selección en medios líquidos
Los procesos de enriquecimiento y selección en medios
líquidos no son mutuamente excluyentes. Por lo general,
el enriquecimiento se describe como un proceso que in-
crementa los números de un agente patógeno desde menos
de 10 células hasta cantidades detectables. Los caldos en-
riquecidos pueden contener factores de crecimiento que se
adicionan para reducir la fase de retraso de los números
bajos de microorganismos. Cultivar sangre es el ejemplo
más común de dicho proceso de enriquecimiento.
En una población microbiana mezclada, el término “en-
riquecimiento” también se utiliza cuando una especie se se-
lecciona para el crecimiento preferencial. Para ello se
emplean formulaciones específicas, incluidos químicos
selectivos o electivos, y ajustes del pH o una temperatura
favorable de incubación. En los medios líquidos rara vez
es posible incrementar de manera particular el agente pa-
tógeno deseado y suprimir a los demás microorganismos
presentes. Las dinámicas de crecimiento de cultivos mixtos
de agentes patógenos en caldo son complejas. Los microor-
ganismos indeseables pueden retrasarse por un periodo ini-
cial, pero pueden invadir después a los agentes de interés.
Aunque los periodos fijos de incubación y subcultivo
suelen determinarse por las horas de trabajo del laborato-
rio, en realidad pueden no ser ideales para la recuperación
exitosa de agentes patógenos particulares. La función más
importante de los caldos enriquecidos es elevar el número
de microorganismos deseados a valores que resulten sufi-
cientes para un asa del caldo de subcultivo para producir un
número cuantificable de colonias reconocibles sobre placas
de agar selectivas. Es probable que 104 microorganismos
patógenos/ml en el caldo sea la cifra mínima para la detec-
ción por este método.
Debe recordarse que la función de los caldos enrique-
cidos se determina por los resultados del subcultivo para
131
un medio sólido selectivo. La interacción entre químicos
selectivos en el caldo y aquellos presentes en la placa de
agar puede inhibirse para números pequeños de agentes
patógenos. El caldo de tetrationato subcultivado con agar
de MacConkey puede registrar números más grandes de
salmonelas o shigelas respecto de cuando se subcultiva en
agar de desoxicolato-citrato.
En suma, los siguientes factores afectan en grado sig-
nificativo el enriquecimiento exitoso de microorganismos
particulares de medios líquidos: a) la formulación de los
medios y sus agentes selectivos; b) el tamaño del inóculo de
los microorganismos deseados; c) los números y la variedad
de los agentes patógenos competidores; d) la presencia/au-
sencia de material orgánico en el caldo; e) la temperatura de
incubación; f) el periodo anterior al subcultivo; g) la interac-
ción de los componentes de enriquecimiento del caldo con
la placa de agar selectiva usada para el subcultivo.
No es de sorprender que las publicaciones muestren
demasiadas opiniones contrapuestas en relación con este
asunto, si se considera la complejidad de la posible varia-
ción de los resultados finales.
Medios de cultivo definidos
y medios complejos indefinidos
Hasta mediados del siglo xx los microbiólogos aceptaron
que los medios de cultivo eran más bien preparados culi-
narios y no formulaciones científicas. Casi sin excepción,
todos los ingredientes empleados eran materiales naturales
variables indefinidos. El comportamiento del crecimien-
to varió en grado amplio y esto suscitó el deseo de crear
medios sintéticos o químicamente definidos que reprodu-
jeran un comportamiento estándar. Entre 1950 y 1975, los
microbiólogos intentaron fusionar aminoácidos, nucleó-
tidos, vitaminas, minerales y metales seleccionados para
que crecieran agentes quimioheterótrofos al mismo ritmo
y con las mismas características que en medios indefini-
dos. Las revistas microbiológicas de ese periodo contenían
cientos de fórmulas de medios de cultivo, pero todas ellas
mostraban comportamientos del crecimiento inferiores res-
pecto de los medios indefinidos o se limitaban sólo a unas
cuantas especies. Ninguna podía recomendarse como un
medio de enriquecimiento general para microbios médicos.
La dificultad de idear y probar medios definidos, junto con
los decepcionantes resultados obtenidos, propició al final
una pérdida de interés. Un factor fue el reemplazo de los
medios de materia prima preparados en el laboratorio con
productos equivalentes deshidratados preparados de modo
comercial. Los beneficios de las mejores especificaciones
de las materias primas, manufacturas controladas a gran
escala y la prueba rigurosa del control de calidad superaron
los principales problemas de variación del comportamiento
132 CAP. 11 MEDIOS DE CULTIVO EN BACTERIOLOGÍA
del medio. En fecha más reciente, los medios preparados
comerciales sustituyeron en gran medida a la preparación
elaborada con anterioridad en los laboratorios de micro-
biología.
Aunque resulte paradójico, en 1966 un nuevo medio
de agar sangre indefinido apareció bajo el nombre de agar
Columbia. Este agente contenía una mezcla precisa de
peptonas de diversas fuentes de proteínas, hidrolizadas
por enzimas diferentes, lo cual creaba un amplio espec-
tro de péptidos, desde el aminoácido más grande posible
(peso molecular [PM] = 5 000) hasta el más simple (PM
= 100). Un gramo de almidón, 5 g de cloruro de sodio y
12 g de agar componían la fórmula. El agar Columbia, un
complejo medio indefinido, se ha convertido en el medio
de enriquecimiento utilizado de forma más amplia, en las
formas de caldo y agar, para recuperar una amplia varie-
dad de agentes patógenos exigentes. Esto parecía ser un
triunfo de quienes deseaban reemplazar tales medios con
formulaciones sintéticas o definidas.
El dilema de los medios definidos o indefinidos no se ha
resuelto todavía. Al parecer, los hidrolizados de proteína y
los factores de crecimiento son los dos grupos de materiales
que pueden ocasionar más dificultades. Parecería que las
mezclas de aminoácidos no pueden sustituir a una mezcla
compleja de péptidos. Es posible que se requiera una selec-
ción amplia de varios factores de crecimiento para asegurar
la recuperación de microorganismos atenuados o exigentes.
Es improbable que un medio definido comparable al agar
Columbia pueda desarrollarse o justificarse sobre la rela-
ción costo-beneficio.
Factores ambientales de crecimiento
La presencia de nutrimentos esenciales del crecimiento
no garantiza por sí misma el desarrollo óptimo de los mi-
croorganismos deseados. Todos los medios de cultivo son
susceptibles a la oxidación si se exponen a la luz, calor y
aire, es decir, fotooxidación, termooxidación y quimiooxi-
dación. Alguna vez se consideró que los procesos de oxida-
ción afectaban en grado menor a los microbios patógenos
quimioheterótrofos aeróbicos y anaeróbicos facultativos y
sólo los anaerobios obligados los padecían. Ahora es evi-
dente que todos, salvo unas pocas especies bien protegidas,
son vulnerables a los efectos de la oxidación. Los radica-
les tóxicos de oxígeno (superóxido, singletos, hidroxilos)
formados por los electrones capturados adicionales pueden
dañar a los ácidos nucleicos y las enzimas. Para proteger-
se, los microorganismos producen enzimas protectoras que
pueden neutralizar a estos radicales tóxicos. Son ejemplos
la catalasa, dismutasa de superóxido y peroxidasa. Algu-
nos aminoácidos son secuestradores efectivos de oxidantes
tóxicos. Pueden adicionarse agentes protectores a los
medios de cultivo para el mismo propósito, como sangre
completa, carbón vegetal, piruvato y sales de hierro reduci-
das. Puede ser esencial incluir estos agentes para los agen-
tes patógenos que son en particular vulnerables, por ejem-
plo Neisseria, Bordetella, Campylobacter, Legionella. Los
componentes sulfhidrilo, como tioglucolato y cisteína, se
agregan a los medios anaeróbicos para reducir el potencial
de oxidación-reducción con grupos -SH, que neutralizan a
los agentes tóxicos oxidantes. Algunos medios se autooxi-
dan en el autoclave, sobre todo los medios que contienen
cisteína, glucosa, fosfatos y algunos metales.
Actividad del agua
Los microorganismos tienen agua “libre” en la cual crecen y
esto se aplica en especial a las placas de agar. El traslado de
nutrimentos a la colonia y la movilización del residuo tóxi-
co desde ésta dependen del agua libre presente en el agar.
El agua puede estar “ligada” o formar complejos con tanta
firmeza con las proteínas o polímeros que los microorga-
nismos no pueden utilizarla. El hielo es una forma de agua
ligada y otras se refieren a menudo como “cuasi-hielo”.
El límite biológico de la actividad del agua es de 0.97
(1.00 si es agua pura) a 0.61 (la superficie del pescado seco
salado). Sólo los hongos xerófilos pueden crecer (con len-
titud) en la cifra más baja. Los medios líquidos son casi
siempre convenientes para el crecimiento de todos los agen-
tes patógenos, a menos que se adicionen solutos al medio
(cloruro de sodio o glicerina) para atenuar la actividad del
agua y hacerla selectiva para estafilococos u hongos.
Las placas de agar recién preparadas tienen concentra-
ciones satisfactorias de agua libre, pero en el almacena-
miento la evaporación reduce la actividad del agua de la
superficie del agar. Las placas de agar supersecas o de-
masiado almacenadas pueden ser inhibitorias, muestran
colonias pequeñas y no pueden recuperar los inóculos
“atenuados” (fig. 11-2).
Almacenamiento de los medios de cultivo
Una regla básica señala que los medios recién preparados
son mejores que los almacenados. Sin embargo, rara vez es
posible preparar medios justo antes de usarse y por tanto
es inevitable alguna forma de almacenamiento. Los me-
dios de cultivo almacenados se deben utilizar estrictamente
por turnos para evitar almacenamientos demasiado largos.
Todos los contenedores de medios deben fecharse y nume-
rarse por lote.
Los medios de cultivo deben almacenarse lejos de la luz
para prevenir la fotooxidación. Todos los medios líquidos se
almacenan en frascos o tubos cerrados, de preferencia con
 PRUEBAS DE CALIDAD
Colonias pequeñas
Gel de gran fuerza
Colonias lenticulares
Figura 11-2 Efecto de la pérdida de agua en las placas de agar. a) Reducción del tamaño de las colonias superficiales. b) Cambios en
la forma de las colonias sumergidas, de esférica a lenticular.
tapones de rosca, a 2 a 8°C, excepto el caldo de tioglucola-
to, que se preserva mejor a 15 a 22°C. Los medios líquidos,
sin antibióticos u otros ingredientes lábiles, pueden almace-
narse por muchas semanas en el frío y lejos de la luz.
Las placas vertidas deben almacenarse a 2 a 8°C, em-
paquetadas en película de plástico adherente. Ésta es pre-
ferible a las bolsas de polietileno que retienen la humedad
en la forma de acumulaciones de líquido en cada bolsa.
La vida útil en estantería de las placas preparadas depende
de la formulación y las condiciones de almacenamiento y
transporte al laboratorio. Con placas empaquetadas en pe-
lículas semipermeables y almacenadas en cajas de polies-
tireno expandido en la temperatura correcta, la vida útil de
estantería puede ser de muchos meses. No deben conser-
varse o usarse las placas tras ese lapso. Una inspección útil
consiste en medir la pérdida de agua durante el almacena-
miento. Una pérdida de peso de 5% sugiere que las placas
alcanzaron un estado terminal.
Pruebas de calidad
La mayor parte de los laboratorios microbiológicos adquie-
re medios de cultivo en formas deshidratadas o preparadas.
La responsabilidad de la prueba de calidad ha recaído en
los fabricantes y éstos deben proporcionar los detalles de
su protocolo y resultados de prueba a los compradores indi-
viduales. No obstante, debe advertirse que estas pruebas se
han llevado a cabo en medios de cultivo recién elaborados
y que el tiempo de almacenamiento, antes y después de la
entrega, puede reducir la calidad del medio.
133
Colonias grandes
Gel de baja fuerza
Colonias esféricas
El aumento del uso de los medios preparados ha prote-
gido a los medios de cultivo con agar de los efectos oxi-
dativos complejos e impredecibles de la esterilización por
autoclave de los medios de cultivo insolubles. El descenso
de los valores del pH y el oscurecimiento del color indican
sobrecalentamiento, que da lugar a que se formen comple-
jos de carbohidrato-péptido.
Cuando se prueban medios de cultivo comprados deben
ser suficientes tres cepas seleccionadas de microorganismos
apropiados. Pueden adquirirse cepas estándar de microor-
ganismos patógenos y es preciso realizar una valoración
cuantitativa. Los medios selectivos deben probarse para la
inhibición de microorganismos indeseables, al igual que
para el enriquecimiento de cepas seleccionadas.
Si se elige un nuevo proveedor o se firmó un gran con-
trato, entonces puede ser apropiada una prueba más extensa
mediante un control de medios inoculados en paralelo. Se
utilizan inóculos pequeños e incluso algunos agentes pató-
genos atenuados en la prueba. Snell y colaboradores (1991)
proporcionan más información sobre este tema.
La recuperación de microorganismos atenuados en la
prueba del control de medios de cultivo se estudia cada
vez más. Los aislados microbiológicos clínicos están con
frecuencia atenuados puesto que son agentes patógenos
aislados de alimentos calentados o procesados. Los micro-
organismos muy atenuados, viables pero no cultivables,
representan una forma extrema de atenuación. Stephens y
colegas (1997) usaron Salmonella atenuada de laboratorio
y mostraron que la recuperación de estos agentes patóge-
nos variaba entre la misma formulación de medios de cul-
tivo de diferentes fabricantes. Este trabajo demostró una
134 CAP. 11 MEDIOS DE CULTIVO EN BACTERIOLOGÍA
distribución muy amplia de tiempos de retraso entre las di-
ferentes marcas del mismo medio cuando se utilizó un solo
inóculo de células, con algunos tiempos de retraso de más
de 20 horas. En el pasado, los fabricantes de medios emplea-
ban una mezcla de aislados clínicos y cepas NCTC/ATCC
estándar de microorganismos para probar lotes de medios
de cultivo. El uso de aislados clínicos se ha suspendido en
la industria y sólo las cepas estándar de agentes patógenos
son de uso general. Estos microorganismos no se atenúan
cuando se reconstituyen de forma apropiada y pueden ocul-
tar deficiencias en los lotes de medios de cultivo. El uso de
cepas estándar, atenuadas en el laboratorio por la exposi-
ción a temperaturas altas o bajas, se investiga cada vez más
y podrían reemplazar la pérdida de aislados clínicos.
El futuro de los medios de cultivo
La placa de agar de Koch, que es barata, simple y muy
versátil, es un amplificador muy poderoso de inóculos pe-
queños. Si la preparación es apropiada, crecen todos los
microorganismos esperados y muchos insospechados de
las muestras. Los dispositivos modernos de diagnóstico
que tal vez sustituyan a la microbiología convencional son
costosos, complicados y muy específicos. Es probable que
la microbiología convencional no se modifique demasiado
en este siglo.
Indudablemente, se dispondrá de mejoras metodológi-
cas, como el marcado semiautomático, la inoculación y
señalización con tecnología de película mediante micros-
copia láser confocal para la detección temprana del cre-
cimiento y los marcadores de identificación incorporados
para la actividad específica enzimática. Se observará una
mejor recuperación de los agentes patógenos dañados en la
fase de retraso de crecimiento. Estos procedimientos me-
jorados de recuperación han de despejar las dudas sobre
algunas teorías de esterilización cinéticas existentes y re-
solverán algunos de los misterios que rodean a los “micro-
organismos viables pero no cultivables”. El viejo axioma
bacteriológico “lo que no crece, no existe” desaparecerá.
Es improbable que la microbiología se lleve a cabo por au-
tomatización, de modo similar a la bioquímica o la hemato-
logía. Gran parte de la actividad en microbiología consiste
en igualar imágenes de colonias o campos del microscopio
con el banco de datos que contiene la cabeza del microbió-
logo. El cerebro humano es increíblemente mejor en ese
quehacer que cualquier computadora.
Microbiología cuántica
Las grandes poblaciones de microbios se adecuan a las
reglas taxonómicas, pero las células individuales exhiben
incertidumbres causadas por la mutación y adaptación a los
ambientes locales. Tales células representan variantes que
pueden convertirse en los ancestros de la siguiente pobla-
ción seleccionada. Las mutaciones son procesos cuánticos
en los que intervienen moléculas que son impelidas sobre
una barrera de energía desde una configuración estable a
otra diferente. Las sustancias químicas complejas siguen
las leyes de la mecánica cuántica y la ciencia de las células
microbianas individuales se puede llamar “microbiología
cuántica”. Existe una analogía entre la física clásica/me-
cánica cuántica y la microbiología clásica/microbiología
cuántica. Ahora se necesita un sistema para estudiar las
células individuales.
Lecturas adicionales
Barer MR, Harwood CB. Bacterial viability and culturability. Adv
Microb Physiol 1999; 41: 94-138.
Bridson EY. The Development, Manufacture and Control of Mi-
crobiological Culture Media. 1994: Oxoid Ltd, Basingstoke,
UK.
Bridson EY, Gould GW. Quantal microbiology. Lett Appl Micro-
biol 2000; 30: 95-98.
British Standard BS EN 12322. In Vitro Diagnostic Devices. Cul-
ture Media for Microbiology—Performance Criteria for Cul-
ture Media. 1999. British Standards Institution London, UK.
Brock TD, Robert Koch—A Life in Medicine and Bacteriology.
1988: Science Tech Publishers, Madison, WI.
Bulloch W. The History of Bacteriology. 1938: Oxford Univer-
sity Press, Oxford. Reprinted 1984: Dover Publications, New
York.
QA for Commercially Prepared Microbiological Culture Media,
2nd edn. Approved Standard: NCCLS M22-A2, vol 16. 1996:
Villanova, PA.
Stephens PJ, Joynson JA, Davies KW, Holbrook R, Lappin-Scott
HM, Humphrey TJ. The use of an automated growth analyser
to measure recovery times of single heat-injured Salmonella
cells. J Appl Microbiol 1997; 83: 445-455.
 12
Identificación de bacterias
Andrew J Hay
Introducción
La identificación de bacterias en poco tiempo y con exac-
titud es una capacidad que requiere muchos años de expe-
riencia en el laboratorio. El propósito de este capítulo es
describir la técnica que adoptaron los laboratorios clínicos
británicos para reconocer bacterias comunes de importan-
cia médica. Se pretende que el lector adquiera una visión
básica del proceso y sea capaz de consultar los excelentes
textos detallados con más seguridad.
Las bacterias pueden identificarse de modo directo en
las muestras de los pacientes o, más a menudo, en el creci-
miento posterior de los microorganismos en cultivos. Aun-
que se consideran por separado, estos dos métodos pueden
combinarse.
Identificación directa
Microscopia
Las bacterias pueden visualizarse en muestras clínicas
mediante microscopia y uso de colorantes; aunque es útil,
proceder de esta manera rara vez permite la identificación
completa. En la actualidad, la tinción de Gram es el pro-
cedimiento diferencial más utilizado en los laboratorios de
bacteriología clínica. Existen muchas modificaciones, pero
el principio es el mismo. Se aplica una solución de violeta
de metilo seguida por una solución de yodo a una prepa-
ración de bacterias fijada por calor en un portaobjetos del
microscopio. Después de lavarse, la preparación se expone
a un decolorante (alcohol o acetona) por algunos segundos,
antes de que se aplique una contratinción roja (p. ej., safra-
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
nina). Las bacterias grampositivas no se decoloran con alco-
hol o acetona y se tiñen de púrpura. Las bacterias gramne-
gativas se decoloran y permiten que las células adquieran la
contratinción roja. Esta reacción depende de las diferencias
estructurales de la pared celular entre las bacterias gram-
positivas y gramnegativas. También se tienen en cuenta el
tamaño y la forma de las bacterias: redondas (cocos) o en
bastones (bacilos).
Sin embargo, muchas bacterias se tiñen mal o no lo hacen
en absoluto con la tinción de Gram, por ejemplo, las mico-
bacterias como Mycobacterium tuberculosis que requieren
tinciones “acidorresistentes”, como la tinción de Ziehl-
Neelsen. Estas tinciones se basan en el principio de que
ciertas bacterias, después de teñirse con soluciones calientes
de carbol fucsina, pueden resistir la acción decolorante del
ácido clorhídrico y el alcohol. Las modificaciones de estas
tinciones permiten visualizar otras bacterias, por ejemplo las
especies de Nocardia.
En el pasado se usaron tinciones con anticuerpos fluo-
rescentes para detectar bacterias específicas, como Legio-
nella, pero hoy día el desempeño deficiente imposibilita su
uso en la bacteriología regular.
Detección de anticuerpos y antígenos
Estas pruebas son útiles para las bacterias que no se culti-
van de rutina en medios sólidos, como las espiroquetas, y
los agentes patógenos intracelulares obligados Rickettsia,
Coxiella y Chlamydia. Las infecciones consecutivas a estos
géneros se diagnostican casi siempre por la detección del an-
ticuerpo en el suero (serología) o, en el caso de la infección
genital por Chlamydia, por la identificación del antígeno.
136 CAP. 12 IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS
La detección del antígeno puede usarse para el diagnóstico
rápido de infecciones bacterianas graves, como en los casos
de meningitis; los antígenos bacterianos en el líquido cefa-
lorraquídeo pueden reconocerse con la aglutinación en látex.
Una variación es la detección de un producto bacteriano,
por ejemplo, el uso de un inmunoensayo enzimático para
identificar la toxina de Clostridium difficile en las heces, un
causante de la diarrea relacionada con antibióticos.
Métodos moleculares
Desde la última edición de este libro se han observado pro-
gresos importantes en el campo de la bacteriología mole-
cular diagnóstica. Aunque es verdad que algunas de estas
técnicas experimentan la transición de un laboratorio de
investigación y referencia a uno de bacteriología clínica, el
crecimiento del número de reactivos de prueba disponibles
en el comercio representa una posibilidad distinta para el
futuro próximo, en particular si el costo relativamente alto
de estos métodos moleculares puede reducirse. Algunos
ejemplos se proporcionan más adelante.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las
sondas génicas han sido satisfactorias en la identificación
rápida de Mycobacterium tuberculosis en muestras clínicas.
Los métodos convencionales toman varias semanas para
identificar a este agente patógeno de lento crecimiento. De
forma similar, las pruebas de amplificación de los ácidos
nucleicos, como PCR o reacción en cadena de la ligasa, se
recomiendan para el diagnóstico de la infección genital por
Chlamydia trachomatis. En muestras de heces, la PCR se
utiliza para reconocer genes que codifican a las verotoxinas
de Escherichia coli, como E. coli O157. La detección simul-
tánea del DNA de Neisseria meningitidis, Streptococcus
pneumoniae y Haemophilus influenzae en el líquido cefalo-
raquídeo o sangre completa por PCR múltiple se ha conver-
tido en un procedimiento invaluable en el diagnóstico rápido
de la meningitis bacteriana. También se han desarrollado
sistemas comerciales para la detección rápida (menos de tres
horas) de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina y
especies de Enterococcus resistentes a la vancomicina me-
diante PCR en tiempo real (Roche Diagnostics, Mannheim,
Alemania). Estos métodos deben permitir el inicio temprano
de la quimioterapia antimicrobiana efectiva y las precaucio-
nes de control de la infección, con lo cual se mejoran los
resultados clínicos. En otros capítulos se discuten de modo
más detallado los mismos métodos.
Identificación después del cultivo
Cultivo puro
El primer paso en la identificación de una bacteria consiste
en establecer un cultivo puro. Esto no siempre es posible y
conduce a demorar informes o suministrar resultados enga-
ñosos de laboratorio.
El material clínico debe colocarse en medios primarios
de aislamiento, de tal manera que buena parte del crecimien-
to consista en colonias bien aisladas (fig. 12-1). Las colonias
obtenidas deben examinarse de manera cuidadosa con una
lente de mano y buena iluminación, y las colonias aisladas
se seleccionan y transfieren para la investigación a un medio
no selectivo mediante un alambre recto y mano firme. Si este
proceso falla para proporcionar un crecimiento adecuado de
un cultivo puro, debe repetirse. Acortar el proceso en esta
etapa retrasa la identificación, se desperdician reactivos y
tal vez se produzcan resultados engañosos; esto es frustran-
te para el bacteriólogo y el clínico y supone un tratamiento
potencialmente incorrecto para el paciente.
Debe observarse que en esta etapa se utiliza un medio
no selectivo, ya que los medios primarios de aislamiento
selectivos o inhibitorios interfieren a menudo con las técni-
cas de identificación bioquímicas y otras subsiguientes.
El arte de la identificación
Cuando se analiza una placa de aislamiento primario que
contiene hasta una docena de agentes patógenos o especies
diferentes de bacterias comensales, y se sabe además que
casi cualquier bacteria puede ocasionar la enfermedad, el
bacteriólogo principiante puede desesperarse ante el apre-
mio de proporcionar un informe significativo. Sin embargo,
la experiencia en examinar estas placas, combinada con el
conocimiento del sitio muestreado, el cuadro clínico, los
probables agentes patógenos y la flora comensal, suministra
una idea razonablemente exacta de los microorganismos que
requieren identificación y pruebas de sensibilidad. Este en-
foque permite al bacteriólogo elegir las pruebas que pueden
conducir a la identificación rápida del agente patógeno.
Si lo anterior no puede confirmar al agente causal más
probable, el investigador debe actuar con mente abierta y
ampliar las investigaciones. Esta conducta, que se conoce
como el método progresivo, requiere el establecimiento de
algunas características fundamentales del microorganismo
y, a partir de éstas, los grupos subsecuentes de pruebas se
eligen hasta identificar al agente patógeno.
Por último, si todo lo anterior falla, puede adoptarse el
método del “trabuco”, en el cual se realiza cada prueba y se
compara con las descritas en textos de bacteriología. Rara
vez es necesario, pero se requiere para verificar, por ejem-
plo, una nueva especie.
Identificación preliminar
La capacidad de las bacterias para crecer bajo condiciones
aerobias o anaerobias, sus requerimientos de crecimiento,
 IDENTIFICACIÓN DESPUÉS DEL CULTIVO 137

Depósito del inóculo

Se flamea
el asa

Asa de
alambre
Se flamea
Se flamea el asa
el asa
El material clínico se aplica en El material se extiende hacia Después de la incubación se elige
un tercio de la placa con agar fuera desde el depósito del una sola colonia bien aislada me-
inóculo. La placa se incuba diante un alambre recto a partir
del crecimiento mezclado

El microorganismo se extiende
hacia fuera como en (b). La placa
se incuba

Se transfiere la colonia a una Se obtiene un cultivo puro

placa no selectiva capaz de
mantener el crecimiento

Figura 12-1 Forma de establecer un cultivo puro.

morfología de la colonia, efecto sobre el medio (p. ej., he-
mólisis en agar-sangre), motilidad en medio líquido, ca-
pacidad para formar esporas, y aspecto y reacción en la
tinción de Gram permiten efectuar una identificación pre-
liminar. El uso subsiguiente de algunas pruebas simples y
rápidas indica entonces qué técnicas adicionales (si acaso)
se requieren para concluir la identificación.
Después de la tinción de Gram: la caja
de herramientas de los bacteriólogos
Como un artesano, el bacteriólogo experto selecciona las
herramientas requeridas para completar la identificación
basada en los resultados de la morfología de las colonias
y la tinción de Gram. Estas pruebas pueden agruparse en
amplias categorías, que se enumeran a continuación. Pue-
den realizarse de forma secuencial o simultánea, según sea
el microorganismo a identificar. Deben controlarse con
cuidado cada vez que se realizan, por ejemplo mediante
cepas testigo y reacciones conocidas.
Detección de enzimas
La capacidad de una bacteria para producir una enzima se
demuestra al exponerla a un sustrato y detectar el producto
resultante. Las pruebas comunes son las siguientes:
1. Prueba de la catalasa. Los microorganismos que pro-
ducen catalasa, cuando se exponen al peróxido de hi-
drógeno, producen burbujas visibles en un plazo de 30
segundos. Esta prueba puede ayudar a distinguir a los
estafilococos, que son positivos a la catalasa, de los es-
treptococos, que son negativos.
2. Prueba de la oxidasa. Esta prueba investiga la presencia
de la oxidasa de citocromo. Las bacterias positivas a la
oxidasa, como Pseudomonas, pueden oxidar el reactivo
138 CAP. 12 IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS
diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina para preci-
pitar un cambio de color. Enterobacteriaceae son negati-
vos a la oxidasa.
3. Prueba de la ureasa. Ciertas especies producen una en-
zima potente que degrada la urea hasta amoniaco; este
último se puede detectar por un cambio de color con un
indicador de pH incorporado en el medio de crecimien-
to. Esta prueba ayuda a diferenciar Proteus mirabilis,
positivo a la ureasa, un comensal del intestino, de Sal-
monella spp. y Shigella spp., agentes patógenos intesti-
nales importantes que son negativos.
4. Prueba de la coagulasa. Staphylococcus aureus posee
una enzima que coagula al plasma in vitro. Otros estafi-
lococos son negativos.
Esta lista no es exhaustiva. Existen muchas otras pruebas,
que a menudo son incorporadas en reactivos comercia-
les.
Detección del antígeno
La detección de antígenos celulares por antisueros especí-
ficos se utiliza con amplitud en bacteriología para determi-
nar la especie y el tipo de microorganismos. Dos ejemplos
son los siguientes:
1. Clasificación de Lancefield. Un antígeno del grupo de
la pared celular se extrae a partir de los estreptococos
hemolíticos beta por una enzima. El antígeno se detecta
entonces por la aglutinación con el antisuero unido a las
partículas del látex.
2. Tipificación “O” y “H”. Los antígenos de la pared ce-
lular (O) y antígenos flagelares (H) se reconocen en
bacilos gramnegativos como Salmonella, tras mezclar
suspensiones de microorganismos con antisuero espe-
cífico sobre un portaobjetos o un tubo de ensayo. Una
reacción positiva se observa por la aglomeración de los
microorganismos.
Metabolismo de los carbohidratos
La capacidad de un microorganismo para utilizar ciertos
azúcares como glucosa, sea por oxidación (aerobio) o fer-
mentación (independiente del oxígeno), u otros carbohidra-
tos, como almidón, es casi siempre una característica útil en
la identificación. La prueba requiere un medio definido que
contenga al carbohidrato y un sistema de detección para el
producto metabólico, a menudo un indicador de pH.
La utilización del azúcar puede incorporarse en medios
primarios de aislamiento, como agar de MacConkey, que
distingue Enterobacteriaceae que fermentan la lactosa de
Enterobacteriaceae que no la fermentan, y agar de tiosul-
fato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS), que reconoce a Vibrio
cholerae que fermenta la sacarosa de otras especies. Otras
pruebas detectan la capacidad del agente patógeno para
utilizar un carbohidrato como fuente única de carbón, por
ejemplo, la utilización del citrato. Los paneles de carbohi-
dratos pueden probarse de forma conveniente y simultánea
con reactivos comerciales.
Factores de crecimiento
El requerimiento absoluto de compuestos definidos para el
crecimiento bacteriano en un medio particular se utiliza
como herramienta para la identificación; así, las especies
de Haemophilus difieren en sus requerimientos por dos
factores presentes en la sangre, X (hematina) y V (nucleó-
tido de difosfopiridina), para el crecimiento en agar nutriti-
vo. Sólo Haemophilus influenzae, el agente patógeno más
importante del género, requiere de ambos.
Metabolismo de proteínas
Se somete a prueba la capacidad de una especie bacteriana
para metabolizar una proteína o un aminoácido a un pro-
ducto definido. Los sistemas de detección para el producto
y la necesidad de un medio específico son similares a los
requeridos para la utilización del carbohidrato. Es el caso
de diversas especies de Enterobacteriaceae que divergen en
su capacidad para lo siguiente: a) licuefacción de la gela-
tina; b) descarboxilación o desaminación de aminoácidos;
c) producción de ácido sulfhídrico a partir de aminoácidos
que contienen azufre, y d) elaboración de indol a partir de
triptófano. Estas pruebas se realizan a menudo con produc-
tos comerciales.
Pruebas de susceptibilidad
La susceptibilidad de una especie a un compuesto se puede
utilizar no sólo para precisar el tratamiento con antibióti-
cos, sino también para contribuir a la identificación. Dos
ejemplos de uso general son representativos, ambos proba-
dos mediante la colocación de un disco de papel filtro, que
contiene el compuesto, sobre una placa de cultivo; la mues-
tra se incuba y después se observa una zona de inhibición.
1. Prueba con optocina. Streptococcus pneumoniae es
sensible a la optocina (clorhidrato de etilhidrocupreína).
Otros estreptococos similares en agar-sangre son resis-
tentes.
2. Sensibilidad al metronidazol. Los anaerobios verdade-
ros casi siempre son sensibles a este antibiótico. Los
 IDENTIFICACIÓN DESPUÉS DEL CULTIVO
aerobios que pueden crecer de forma anaerobia son in-
variablemente resistentes.
Producción de toxinas
Esta importante característica puede ayudar a diferenciar
las especies patógenas de las que no lo son. Ejemplos:
1. Prueba de Elek. Esta prueba se utiliza para diferenciar
cepas de Corynebacterium diphtheriae productoras de
toxinas (por lo tanto patógenas), que causan la difteria,
de especies no patógenas. Se coloca una tira del papel fil-
tro que contiene la antitoxina de la difteria sobre un medio
definido. El microorganismo se extiende sobre el agar de
forma perpendicular a la tira. Después de la incubación
pueden verse las líneas precipitantes que representan al
complejo antígeno (toxina)-anticuerpo (antitoxina).
2. Citotoxina. Se puede detectar una citotoxina que produ-
cen las cepas de Clostridium difficile relacionadas con
diarrea y antibióticos por la neutralización de la anti-
toxina en un cultivo celular.
Sistemas de identificación comercial
El desarrollo de los sistemas comerciales para la identifica-
ción rápida de bacterias patógenas ha simplificado en gran
medida la vida del bacteriólogo clínico. Antes de su intro-
ducción, cada prueba bioquímica tenía que prepararse de
modo individual en un tubo de ensayo o botella de cristal,
lo que conducía a la exhibición de una impresionante cris-
talería de laboratorio. Los sistemas comerciales permiten
que muchas pruebas bioquímicas se realicen de manera si-
multánea a partir de un cultivo puro. El patrón obtenido de
los resultados de la prueba se compara entonces con los pa-
trones derivados de bacterias conocidas conservadas en un
banco de datos automatizado. Las pruebas estadísticas se
utilizan para determinar la identidad probable del aislado
clínico. El banco de datos también puede sugerir pruebas
adicionales si la identificación es dudosa. Los sistemas de
uso general en el Reino Unido son los sistemas API y Vitek,
ambos comercializados por Bio Merieux (Bio Merieux UK
Ltd, Basingstoke, England), BD Phoenix (BD Diagnostic
Systems Europe, Le Pont de Claix, France) y Mastascan
elite (Mast Group Ltd, Bootle, Merseyside, UK).
1. Sistema de identificación API (appareils et precedes
d’identification). Este sistema consiste en cúpulas de
plástico que contienen diversos sustratos y productos
químicos indicadores fijados a una tira plástica. Cada
cúpula comprende una prueba bioquímica diferente. La
adición de un inóculo estándar del agente patógeno de
prueba a cada cúpula en la tira, después de la incuba-
139
ción, precipita una serie de cambios de color que puede
advertirse a simple vista. El patrón de los resultados ob-
tenidos puede interpretarse con facilidad al compararlo
con el banco de datos. Se dispone de tiras modificadas
para la identificación de estafilococos, estreptococos,
bacterias coriniformes, Enterobacteriaceae, anaerobios
y bacterias gramnegativas que no fermentan.
2. Sistemas Vitek y BD Phoenix. Estos sistemas se basan en
principios similares. Las pruebas bioquímicas se realizan
de manera simultánea en celdillas insertadas en una tar-
jeta plástica (Vitek) o tira (BD Phoenix). Las celdillas se
llenan con la suspensión bacteriana mediante aspiración
por vacío (Vitek) o vaciamiento (BD Phoenix). Después
de la incubación, un lector modificado controlado por
computadora analiza las tarjetas y los sistemas automati-
zados interpretan los resultados. Se produce una gama de
tarjetas para identificar bacterias comunes de importancia
médica, a menudo en un plazo de cuatro a seis horas. Las
ventajas de estos sistemas incluyen la capacidad de reali-
zar la prueba de susceptibilidad antibiótica, la semiauto-
matización que requiere poco tiempo del operador y un
sistema incluido para mayor seguridad del laboratorio.
3. Élite de Mastascan. Este sistema emplea la inoculación de
puntos múltiples en medios de identificación con cajas
de Petri. Después de la incubación, las placas se exponen a
un lector que analiza e interpreta de manera automática
las pruebas de identificación incorporadas en los medios
de prueba. El sistema también permite la comprobación de
la susceptibilidad antibiótica y la inoculación directa de las
placas con muestras de orina, de tal modo que se elimi-
na la necesidad del cultivo primario de orina.
Todos los sistemas requieren un apego estricto a las ins-
trucciones del fabricante para prevenir errores. La omisión
de comenzar con un cultivo puro es una fuente común de
error que puede evitarse si se inocula una placa para purifi-
car la tarjeta o la tira mediante la suspensión de inoculación
usada. Si la placa muestra un crecimiento inconsistente, las
pruebas se repiten. Los bacteriólogos inexpertos aceptan a
menudo los resultados de estos sistemas sin objeción, sin
importar qué tan improbables pueden ser en clínica. Los
trabajadores experimentados interpretan los resultados en
su contexto clínico y confirman o repiten identificaciones
improbables o inusuales.
Nuevos desarrollos
Técnicas moleculares
Como ya se explicó, los métodos moleculares son úti-
les para reconocer los agentes patógenos que crecen con
140 CAP. 12 IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

lentitud y los incultivables en muestras clínicas. Además,
se han adoptado estos métodos para la tipificación de bac-
terias por laboratorios de investigación y de referencia o
bien para la caracterización de nuevas especies.
Es en particular apasionante el desarrollo de la tecno-
logía de DNA con chip, como los microensayos de DNA,
en los cuales se producen los millares de oligonucleótidos
localizados en un soporte sólido (chip). Tienen aplicación
para secuenciar productos de la PCR. Asimismo, están
disponibles los chips bioelectrónicos que utilizan campos
eléctricos para mover muestras hacia las diferentes áreas
analíticas; visto de cierto modo, se trata de un “laboratorio
en un chip”. Para una discusión adicional, véase Nolte y
Caliendo (2003).
trado la producción de impresiones digitales espectrales
características de la masa que permiten la identificación en
el lapso de minutos después de remover una colonia de una
placa de cultivo. Aunque sólo el tiempo establecerá si esta
técnica se ha de incorporar al laboratorio clínico común,
representa sin duda un desarrollo interesante.
Identificación de bacterias
de importancia médica
La siguiente es una breve introducción a la identificación
de bacterias de relevancia médica. Para mayor informa-
ción, véanse las Lecturas adicionales.

Espectrometría de masas Cocos grampositivos

Los avances en las técnicas de espectrometría de masas
han estimulado su aplicación al campo de la identificación
bacteriana. Por ejemplo, la espectrometría de masas con
ionización por desorción de láser asistida por matriz en
tiempo de vuelo de microorganismos intactos ha demos-
La capacidad de un coco grampositivo de producir catalasa
es una prueba rápida y útil que diferencia géneros positivos
a la catalasa, como Staphylococcus y Micrococcus, de los
géneros negativos, como Streptococcus y Enterococcus. La
identificación siguiente se relaciona con la figura 12-2.

Cocos aerobios grampositivos

Staphylococcus Positiva Prueba de la Negativa Streptococcus

Micrococcus catalasa Enterococcus

Hidrólisis
β Hemólisis Ninguna de la esculina
en agar-sangre Tolerancia de 40%
Crecen de a sales biliares
forma anae- Sí
róbica
Sí
α
No
Estafilococos Enterococcus
Prueba Negativa
N gea tiive Sensible a
de la coagulosa
negativos Grupo de la optocina No
coagulasa Soluble en
Lancefield
sales biliares
Positiva
Sí Streptococcus
viridans
Micrococos
Reactivo
comercial Strep. pneumoniae
Staphylococcus
aureus
Reactivo
Grupo A = Streptococcus comercial
pyogenes
Grupo B = Streptococcus
agalactiae
Grupo C = Streptococcus
Especies Especies
Grupo G = Streptococcus
individuales individuales

Figura 12-2 Identificación de cocos aerobios grampositivos de relevancia médica.

 IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DE IMPORTANCIA MÉDICA
Staphylococcus y Micrococcus
Estos géneros positivos a la catalasa producen de modo ca-
racterístico células dispuestas en racimos cuando crecen en
medio líquido. Los estafilococos se pueden diferenciar de
los micrococos por su capacidad para crecer bajo condicio-
nes anaerobias.
Staphylococcus aureus, una causa común de infección
de la piel, las heridas y el pulmón, se puede diferenciar de
otros estafilococos comensales de la piel por su capacidad
para coagular el plasma y producir la enzima termoestable
DNAasa. La actividad de la coagulasa se reconoce en po-
cas horas, lo que proporciona una identificación rápida y
confiable. Las cepas de estafilococos negativas a la coagu-
lasa pueden clasificarse de acuerdo con su especie median-
te reactivos comerciales.
Streptococcus y Enterococcus
En medio líquido estos géneros negativos a la catalasa pro-
ducen células dispuestas en pares o cadenas. En agar-sangre
producen colonias con un diámetro de 0.1 a 1.0 mm después
de 24 horas de incubación y el tipo de hemólisis observada
alrededor de las colonias suministra una clasificación inicial
de utilidad.
Los estreptococos hemolíticos beta se demuestran mejor
en los cultivos con crecimiento anaerobio. Las cepas que
producen aclaramiento completo del medio de crecimien-
to que contiene sangre alrededor de la colonia (hemólisis
beta) incluyen varias especies patógenas importantes que
se diferencian por la clasificación de Lancefield. Esto pue-
de realizarse por las pruebas comerciales en menos de una
hora. Por lo general, lo anterior es suficiente para completar
la identificación, aunque los reactivos bioquímicos comer-
ciales de la prueba se pueden utilizar en casos de duda.
Los estreptococos hemolíticos alfa producen hemóli-
sis parcial (hemólisis alfa), una decoloración verdosa del
medio de crecimiento que contiene sangre alrededor de la
colonia. La especie patógena más importante es el neu-
mococo, Streptococcus pneumoniae. Éste se diferencia de
la otra especie hemolítica alfa por el aspecto de su colonia
(colonias delineadoras), sensibilidad a la optocina y solu-
bilidad de sus colonias en una solución de sales biliares.
Otras especies hemolíticas alfa se encuentran como co-
mensales en las vías respiratorias superiores, pero pueden
causar de modo ocasional sepsis grave, como la endocar-
ditis bacteriana subcutánea. Pueden clasificarse de acuerdo
con su especie mediante reactivos comerciales.
De manera característica, los enterococos no son hemo-
líticos en agar-sangre, aunque las cepas individuales pueden
mostrar hemólisis alfa o beta. Los enterococos, al contrario
de la mayor parte de los estreptococos, pueden crecer en
141
un medio que contiene 40% de bilis y pueden hidrolizar la
esculina; estas propiedades se utilizan para identificarlos en
el laboratorio clínico. Poseen a menudo el antígeno grupo
D de Lancefield y pueden clasificarse de acuerdo con su
especie, si se requiere, con reactivos comerciales.
Bacilos grampositivos
Los géneros de relevancia médica se identifican de mane-
ra inicial por el aspecto de sus colonias, capacidad para
formar esporas y necesidad de condiciones de crecimiento
aerobias o anaerobias (fig. 12-3).
Bacillus y Clostridium
Estos géneros formadores de esporas pueden diferenciarse
por la catalasa y las condiciones requeridas para el creci-
miento. Las especies de Clostridium, negativas a la catala-
sa, incluyen anaerobios estrictos. Los bacilos son positivos
a la catalasa y todos crecen de forma aeróbica. Clostridium
perfringens, la causa de la gangrena gaseosa, se puede
identificar de manera preliminar por la prueba de Nagler,
que detecta una enzima específica, la lecitinasa, que pro-
duce esta especie. Ambos géneros pueden clasificarse de
acuerdo con su especie con pruebas bioquímicas.
Listeria y Corynebacterium
Estos géneros aerobios, no formadores de esporas, pueden
confundirse con cualquier otro en medios de aislamiento
primario. Listeria monocytogenes, un causante de sepsis
y meningoencefalitis, muestra motilidad “en volteretas”
característica en caldo de cultivo a temperatura ambiente,
pero no a 37°C, puede hidrolizar la esculina y es a me-
nudo hemolítica beta en agar-sangre. Corynebacteria spp.
comprende comensales de la piel, patógenos oportunistas
y varios microorganismos de importancia. Pocas especies
son hemolíticas beta. El agente patógeno más importante
es Corynebacterium diphtheriae, que puede aislarse a par-
tir de escobillados de la garganta en medios selectivos que
contienen telurito. Las cepas toxígenas se identifican con
la prueba de Elek.
Cocos gramnegativos
Existen tres agentes patógenos humanos importantes en
este grupo: Neisseria gonorrhoeae (el gonococo), que pro-
voca la gonorrea; Neisseria meningitidis (el meningococo),
un causante de septicemia y meningitis, y Moraxella cata-
rrhalis, un factor de infecciones respiratorias y oculares.
142 CAP. 12 IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

Bacilos grampositivos

Sí Forma No
esporas

• Hidrólisis de Positiva
• Crece de Crece de Sí la esculina Listeria
Sí forma aeróbica
Bacillus forma aeróbica • Motilidad a temperatura monocytogenes
• Producción de ambiente
catalasa
No
No Negativo

Filamentos Corynebacterium
Pruebas Clostridium ramificados
bioquímicas

• Pruebas
Reacción Negativa Reactivos bioquímicas Coriniformes
de Nagler comerciales • Prueba de la
toxina

Positiva
Otras especies

Especies Clostridium Especies de Corynebacterium

individuales perfringes Actinomyces diphtheriae

Figura 12-3 Identificación preliminar de bacilos grampositivos de importancia médica.

Deben distinguirse entre sí y de otras especies que son co-
mensales humanos comunes mediante las características
de crecimiento y pruebas bioquímicas (cuadro 12-1). Son
positivos a la oxidasa y catalasa.
Bacilos aerobios gramnegativos
Requerimientos simples para el crecimiento
Los sistemas comerciales simplificaron en gran media la
identificación de este grupo; empero, todavía se requieren
algunas pruebas simples para el examen externo de la flora
comensal de agentes patógenos potenciales y la elección de
la tarjeta o la tira correcta de la prueba (fig. 12-4). La prue-
ba de la oxidasa es una investigación preliminar útil que
toma apenas algunos segundos. Los géneros negativos a
la oxidasa abarcan muchas especies que son comensales y
patógenas del tracto gastrointestinal (Enterobacteriaceae).
La fermentación de la lactosa se observa casi siempre en
el agar de MacConkey que apoya el crecimiento de estos
microorganismos en el aislamiento primario. Los no fer-
mentadores de la lactosa pueden examinarse mediante la

Cuadro 12-1 Identificación de cocos aerobios gramnegativos de importancia médica

Neisseria Neisseria Especies comensales Moraxella

gonorrhoeae meningitidis de Neisseria catarrhalis
Ácido de*
Glucosa   v 
Maltosa   v 
Lactosa   v 
Sacarosa   v 
Crece en agar nutritivo   v 
Tributirina**    
DNAasa    
v  variable, según sea la especie.
*  prueba realizada en medio libre de suero.
**  detecta la capacidad de la bacteria para descomponer el tributirato de glicerilo.
 IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DE IMPORTANCIA MÉDICA 143

Bacilos aerobios gramnegativos

Requerimientos para
el crecimiento
• Filamentos
Fermenta Positiva Simple Exigentes Morfología curvos
azúcares Oxidasa + • Microaerobios
cultivo • Crece a 43ºC
Negativa
No Sí No No
Fermenta Cocos-bacilos Stenotrophomonas
azúcares
Vibrio Sistemas Sí Sí
Pasteurella comerciales
Aeromonas Acinetobacter

Negativa Positiva Campylobacter

Fermentación Ureasa
de lactosa
Especies
individuales Positiva Negativa
Pseudomonas Proteus

Escherichia Salmonella Coco-bacilo

Klebsiella Shigella 5-10% CO2
Enterobacter

Sistemas
Sistemas Sistemas comerciales
comerciales comerciales +
serología Haemophilus
Bordetella
Especies individuales Especies individuales Especies individuales Brucella

Figura 12-4 Identificación preliminar de bacilos aerobios gramnegativos de importancia médica.

prueba de la ureasa o con un reactivo comercial para la
presencia posible de Salmonella y Shigella, que luego se
confirma con más pruebas bioquímicas y de aglutinación
“O” (Salmonella y Shigella) y “H” (sólo Salmonella). Los
géneros positivos a la oxidasa pueden diferenciarse: aque-
llos que fermenten azúcares, como Vibrio y Aeromonas, y
los no fermentadores, como Pseudomonas. Pueden reque-
rirse diferentes tiras y tarjetas de pruebas comerciales para
fermentadores y no fermentadores.
Haemophilus spp. se aíslan habitualmente a partir de
muestras respiratorias. Se clasifican de acuerdo con su es-
pecie por sus requisitos distintos de los factores X y V para
el crecimiento en agar nutritivo. De modo inicial, Bordete-
lla se puede identificar por la aglutinación con el antisuero
específico. El agente patógeno Brucella puede clasificar-
se de acuerdo con su especie (casi siempre por los labo-
ratorios de referencia por razones de salud y seguridad),
susceptibilidad a la fucsina y la tionina de los colorantes,
requerimiento para la producción de CO2 y H2S.

Requerimientos estrictos para el crecimiento

Dentro de este grupo, Campylobacter spp. se identifica con
facilidad por su morfología y capacidad para crecer en una
atmósfera microaerobia a 42°C, pero no en el aire a 37°C.
Haemophilus, Bordetella y Brucella son bacilos muy
pequeños, sobre todo gramnegativos inmóviles que crecen
comparativamente mal en agar-sangre y poco o nada en lo
absoluto en agar de MacConkey. Esto les permite diferen-
ciarse con facilidad de Pseudomonas y Enterobacteriaceae.
Requieren medios enriquecidos, que contienen sangre para
el aislamiento primario y la adición de 5 a 10% de CO2
mejora el crecimiento.
Anaerobios
Los anaerobios estrictos se diferencian por su incapacidad
para crecer en presencia de oxígeno y la sensibilidad al me-
tronidazol, detectada por un disco colocado en la placa de
aislamiento primario. Pueden clasificarse en relación con su
especie mediante reactivos comerciales o la identificación
de sus productos metabólicos por cromatografía de gas-
líquido. Sin embargo, esto se realiza rara vez en laboratorios
clínicos, a menos que el anaerobio se aísle a partir de un si-
tio estéril, como sangre o tejido blando. Los géneros gram-
positivos incluyen Peptostreptococcus (cocos), Clostridium
144 CAP. 12 IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS
y Actinomyces (bacilos). Los géneros gramnegativos comu-
nes incluyen Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Por-
phyromonas (bacilos anaerobios) y Veillonella (cocos).
Lecturas adicionales
Barron GI, Feltham RKA. Cowan and Steel’s Manual for the
Identification of Medical Bacteria, 3rd edn. 1993: Cambridge
University Press, Cambridge.
Bright JJ, Claydon MA, Soufian M, Gordon DB. Rapid typing
of bacteria using matrix-assisted laser desorption ionisation
time-of-flight mass spectrometry and pattern recognition soft-
ware. J Microbiol Methods 2002; 48: 127-138.
Collins CH, Lyne PM, Grange JM. (1995). Collins and Lyne’s
Microbiological Methods, 7th edn. 1995: Butterworth-Hein-
mann, Oxford.
Gill VJ, Fedorko DP, Witebsky FG. The clinician and the micro-
biology laboratory. In Mandell, Douglas and Bennett’s Prin-
ciples and Practice of Infectious Diseases, 5th edn, Mandell
GL, Bennett JE and Dolin R (eds). 2000: Churchill Livingsto-
ne, Philadelphia, PA, pp 184-221.
Nolte FS, Caliendo AM. Molecular detection and identification of
microorganisms. In Manual of Clinical Microbiology, 8th edn,
Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH
(eds). 2003: ASM Press. Washington, DC, pp 234-256.
Stokes EJ, Ridgway GL, Wren MDW. Clinical Microbiology, 7th
edn. 1993: Edward Arnold, London.
 13
Pruebas automatizadas en bacteriología
Paul C Boreland
Automatización: uso del equipo automático para
ahorrar trabajo mental y manual. The Concise Oxford
Dictionary.
Introducción
Aunque la instrumentación automatizada se introdujo en
el laboratorio clínico de microbiología unos 30 años antes,
muchos clínicos han mostrado cierta renuencia a aceptar
del todo este sistema. Esto se debe en parte a una actitud
conservadora entre los microbiólogos, que perpetúan el uso
de los métodos para detectar el crecimiento de microorga-
nismos desarrollados a finales del siglo xix. Otros facto-
res relevantes son la variedad y naturaleza de las muestras
sometidas a análisis, la mayor complejidad de las prue-
bas microbiológicas, la dificultad de integrar un instrumen-
to a las prácticas de laboratorio existentes, además de que
muchas de las primeras máquinas no se fabricaron de forma
adecuada. Pese a ello, los recientes progresos en tecnología
y la interconexión bidireccional entre los instrumentos y
los sistemas informáticos del laboratorio han hecho ahora
de la automatización una alternativa práctica y rentable.
En la actualidad, los instrumentos son parte integral de
muchos laboratorios de microbiología clínica y el equipo
automatizado está disponible para el reconocimiento de
cultivos sanguíneos positivos, la comprobación de la sensi-
bilidad antimicrobiana, la identificación de agentes patóge-
nos, el examen de las muestras de orina para bacterias y el
aislamiento y la sensibilidad antimicrobiana de Mycobac-
terium tuberculosis en muestras clínicas. No se describe en
este capítulo la totalidad de los sistemas automatizados que
pueden hallarse en el mercado mundial, pero sí los que se
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
encuentran con regularidad en los laboratorios de micro-
biología clínica del Reino Unido.
Sistemas de cultivo sanguíneo
La detección rápida de microorganismos en la sangre es
importante para el diagnóstico y el pronóstico. Por lo tanto,
los cultivos sanguíneos son esenciales en el diagnóstico y
el tratamiento de los agentes etiológicos de la septicemia.
Como ésta constituye una de las enfermedades infecciosas
más graves, la identificación rápida de los patógenos bacte-
rianos de la sangre es una función esencial del laboratorio
de microbiología clínica. En consecuencia, en los últimos
30 años se desarrollaron y perfeccionaron los sistemas au-
tomatizados del cultivo sanguíneo. El primer instrumento
semiautomatizado empleado, el BACTEC 460 (Johnston
Laboratories Inc.), reconoció dióxido de carbono radiac-
tivo metabolizado por microorganismos que crecían en un
medio líquido con 14C incorporado. Esto condujo pronto
al desarrollo del BACTEC 660/730 no radiométrico que
utilizó la detección infrarroja del dióxido de carbono.
Con posterioridad surgió un buen número de instrumen-
tos por completo automatizados, cada uno de los cuales se
compone de tres unidades básicas: una incubadora, un de-
tector y una computadora. Los recipientes o los frascos de
cultivo sanguíneo inoculados se colocan en estantes y pue-
den o no agitarse. Cada envase se vigila de modo continuo
en relación con el crecimiento cada 10 a 15 minutos y la
computadora analiza los datos por medio de un algoritmo
predeterminado e indica cuándo un cultivo es positivo. Si se
identifica un recipiente positivo, puede retirarse del sistema
para aislar e identificar al agente patógeno. A diferencia de
146 CAP. 13 PRUEBAS AUTOMATIZADAS EN BACTERIOLOGÍA
los instrumentos más antiguos, el crecimiento microbiano
se cuantifica por medios no invasivos. La mayor parte de
los métodos de detección se basa, directa o indirectamente,
en la producción de gases (en particular dióxido de carbo-
no) o los cambios del pH que resultan del crecimiento de
microorganismos en el caldo de cultivo.
Las series BACTEC 9000 (9240, 9120, 9050) de los ins-
trumentos para cultivo sanguíneo (Becton Dickinson) se
diseñan para reconocer en poco tiempo agentes patógenos
en muestras clínicas. La muestra se inocula en un frasco,
que se introduce en el instrumento para la incubación y la
lectura periódica. En la base de cada frasco existe un sensor
de pH que contiene fluoroquímicos que reaccionan con el
dióxido de carbono insertados en una matriz. El dióxido de
carbono que producen los microorganismos al metaboli-
zar los nutrimentos en el medio de cultivo, se difunde a
través de la matriz y ello propicia una disminución del pH
que detectan los fluoroquímicos. Los fotodetectores del
instrumento miden de forma específica el grado de fluores-
cencia que emite el sensor cada 10 minutos, un aumento el
cual es proporcional a la cantidad creciente de dióxido de
carbono o a la cantidad decreciente de oxígeno presente en
el envase. Las mediciones se interpretan con un programa
de computadora de acuerdo con parámetros de positividad
preestablecidos.
El sistema BacT/Alert 3D (bioMerieux) incuba, agita y
vigila de modo continuo el crecimiento de microorganis-
mos en cultivos sanguíneos. Unido a la base de cada reci-
piente con cultivo sanguíneo, se coloca un sensor colorimé-
trico cubierto por una membrana de exclusión iónica que
es permeable al dióxido de carbono pero impermeable a los
iones de hidrógeno libres, los componentes del medio y la
sangre completa. Cuando el dióxido de carbono se libera
por el crecimiento de los agentes patógenos, se difunde a
través de la membrana, disminuye el pH y se inicia un cam-
Figura 13-1 Detección de la producción acelerada de dióxido
de carbono a partir del crecimiento microbiano. Reproducido con
la autorización de bioMerieux.
bio de color del sensor, de verde a amarillo. Este cambio lo
reconoce una luz reflejante a partir de un diodo que emite
luz roja fuera del sensor sobre un fotodiodo (fig. 13-1). La
señal del voltaje producida es proporcional a la intensidad
de la luz reflejada y por tanto a la concentración del dióxi-
do de carbono en el recipiente. Los datos obtenidos por la
computadora se trazan como una curva de crecimiento de
unidades de reflexión contra el tiempo.
Comprobación de la sensibilidad
antimicrobiana y sistemas de identificación
La identificación y comprobación de la sensibilidad anti-
microbiana de aislados bacterianos son dos de las tareas
más importantes del laboratorio de microbiología clínica.
Varios sistemas están disponibles, desde los instrumentos
semiautomatizados hasta los automatizados por completo,
y casi todos ofrecen la identificación de agentes patógenos,
así como la comprobación de la sensibilidad antimicro-
biana con opciones de incubación convencional o rápida
y tiempos de análisis. Algunos instrumentos disponen de
tiras que pueden inocularse de forma automática o manual,
incubarse externamente y después colocarse en un lector,
que interpreta reacciones de color y los puntos finales del
crecimiento. Con los sistemas por completo automatiza-
dos, las celdillas o las tarjetas de la microdilución se incu-
ban dentro del instrumento que, de manera continua, vigila
e interpreta el crecimiento o las reacciones bioquímicas.
Cada sistema requiere un paso de estandarización del
inóculo en condiciones normales con un densitómetro, para
medir la densidad bacteriana, que puede expresarse en uni-
dades McFarland. Para el reconocimiento de los cambios
de color o crecimiento en el medio líquido que contiene
los sustratos o las diluciones de los antibióticos, la mayor
parte de los lectores automáticos emplea una combinación
de tres métodos de medición de luz: a) transmisión de la luz
en cuatro regiones del espectro, la colorimetría; b) intensi-
dad de la luz transmitida, que es inversamente proporcional
a la cantidad de crecimiento bacteriano, la turbidimetría, y
c) intensidad de la luz dispersada a 30°, que es directamen-
te proporcional a la cantidad de crecimiento bacteriano, la
nefelometría. Las mediciones de la luz se convierten con
facilidad en impulsos eléctricos y luego se cuantifican.
Algunos instrumentos utilizan la hidrólisis del sustrato
fluorógeno para identificar el crecimiento bacteriano y pue-
den proporcionar resultados en un plazo de cuatro a cinco
horas. Todos los sistemas están equipados con una compu-
tadora y programas capaces de interpretar los resultados a
partir de un lector. Las concentraciones inhibitorias míni-
mas (CIM) producidas se derivan de un algoritmo o valo-
res de corte; de ese modo se identifican microorganismos a
partir de una base de datos que contiene varios biocódigos
y efectúa análisis estadísticos y epidemiológicos.
 COMPROBACIÓN DE LA SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA Y SISTEMAS DE IDENTIFICACIÓN
El sistema Vitek (bioMerieux) utiliza tarjetas reactivas
de plástico del tamaño de una tarjeta de crédito que contie-
nen cantidades pequeñas del medio de crecimiento y anti-
bióticos o medios de pruebas bioquímicas en celdillas de
prueba. Las tarjetas están disponibles para la identificación
de 300 especies de bacterias y levaduras y una gama de
17 antibióticos a los cuales aquéllas resultan susceptibles
(S), intermedias (I) o resistentes (R); también proporcionan
resultados de la CIM. Cada tarjeta de identificación cuenta
con 30 celdillas de reacción que contienen diversas pruebas
bioquímicas, sin la necesidad de agregar reactivos. La tar-
jeta de la sensibilidad contiene 45 celdillas de reacción que
incluyen una gama de 17 antibióticos, cada uno presente
sobre límites de concentración. Las pruebas específicas
para detección de los mecanismos de resistencia también
se incluyen en esta tarjeta. El sistema cuenta con un mó-
dulo de llenado y sellado para la inoculación y el cierre
hermético de las tarjetas, además de una incubadora y un
lector; las tarjetas se sostienen en un carrusel y los cambios
de color bioquímico y la densidad óptica se miden por me-
dios fotométricos cada hora. El sistema utiliza mediciones
cinéticas determinadas de modo turbidométrico del creci-
miento en presencia de antibióticos para realizar análisis de
regresión lineal y, por último, para determinar las CIM de-
rivadas del algoritmo.
Por lo regular, los resultados están disponibles en un
plazo de cuatro a 18 horas, con la identificación y la sen-
sibilidad antimicrobiana de un microorganismo individual
que se deriva del análisis computarizado de los datos.
El Vitek 2 es una versión automatizada del Sistema Vi-
tek, con procesamiento automatizado y anticipación de la
muestra, incluidos la dilución inicial del inóculo, la verifi-
cación de la densidad y los pasos de llenado y sellado de
la tarjeta. El instrumento transfiere de forma automática las
tarjetas al lector-incubadora y las traslada a un comparti-
miento de eliminación al término de la comprobación. El
sistema permite el análisis cinético tras analizar las pruebas
cada 15 minutos. El sistema óptico combina las lecturas de
multicanales del fluorímetro y el fotómetro para registrar
señales fluorescentes de turbiedad y colorimétricas. El sis-
tema Vitek 2 emplea una tarjeta con 64 celdillas y permite
el escrutinio hasta con 20 antibióticos.
El sistema de microbiología automatizado Phoenix (Bec-
ton Dickinson) usa un recipiente de plástico moldeado y
sellado mediante autollenado, con los depósitos de inocu-
lación en la tapa para llenado, y contiene 136 microceldillas.
Se utiliza con el instrumento para probar la identificación del
microorganismo o la sensibilidad antimicrobiana (AST), o
una combinación de ambos.
Para la identificación bacteriana, el área para la identifi-
cación del panel de la máquina Phoenix utiliza una serie de
pruebas bioquímicas convencionales, cromógenas y fluo-
147
rógenas en 51 celdillas. Los sustratos basados en el creci-
miento y las enzimas se emplean para cubrir los diversos
tipos de reactividad dentro de los límites establecidos. Las
pruebas se basan en la utilización y la degradación micro-
bianas de sustratos específicos detectados por varios sis-
temas indicadores. La producción de ácido se indica por
un cambio en el indicador rojo de fenol cuando un aislado
es capaz de utilizar un carbohidrato como sustrato. Los
sustratos cromógenos producen un color amarillo sobre la
hidrólisis enzimática de los compuestos p-nitrofenilo o p-
nitroanilida. La hidrólisis enzimática de sustratos fluoró-
genos resulta de la liberación de un derivado fluorescente
de la cumarina. Los microorganismos que usan una fuen-
te específica de carbón reducen el indicador basado en
reazurina. Además, existen otras pruebas que detectan la
capacidad de un agente patógeno de hidrolizar, degradar,
reducir o utilizar en otra forma un sustrato.
La prueba de sensibilidad antimicrobiana mediante el
sistema Phoenix se basa en la microdilución y usa un in-
dicador redox para la detección del crecimiento del agente
patógeno en presencia de un antibiótico. Las mediciones
continuas de los cambios del indicador, así como de la tur-
biedad, se emplean en la determinación del crecimiento
bacteriano. Cada configuración del panel de AST contiene
varios antibióticos con una extensa gama de concentracio-
nes de doble dilución. La identificación del microorganis-
mo también se utiliza en la interpretación de valores CIM
de cada antibiótico.
El Sensititre ARIS (AccuMed International Ltd) detecta
crecimiento bacteriano por medio de compuestos cono-
cidos como fluoróforos. Éstos consisten en diversos sus-
tratos, como péptidos y ésteres, ligados a los compuestos
que emiten luz fluorescente: 4-metilumbeliferona (4 MU)
y 7-aminometilcumarina (7 AMC). En condiciones norma-
les, estos complejos no son fluorescentes, pero durante el
crecimiento bacteriano se producen enzimas específicas
que inciden sobre los sustratos de los fluoróforos, lo que
posibilita que la 7 AMC o la 4 MU despidan fluorescencia
bajo luz ultravioleta. La sensibilidad a un antibiótico es-
pecífico se registra como la ausencia de fluorescencia, es
decir, ningún crecimiento, y la resistencia como fluores-
cencia debido a la producción enzimática de bacterias que
crecen en forma activa. Por lo regular, los resultados toman
sólo cuatro a cinco horas, pero pueden requerir incubación
por toda la noche. El sistema se integra con un inoculador,
una incubadora, un fluorímetro que lee la fluorescencia a
450 µm y una computadora. Las pruebas se realizan en cel-
dillas sobre bandejas preparadas de microtitulación y los
programas emplean un algoritmo que interpreta las señales
y produce el punto de corte o los resultados de la CIM. El
sistema de identificación trabaja de modo similar e incluye
sólo las pruebas bioquímicas que puedan producir fluores-
148 CAP. 13 PRUEBAS AUTOMATIZADAS EN BACTERIOLOGÍA
cencia o registrar su ausencia. El microorganismo se iden-
tifica con una base de datos de la computadora.
Mastascanelite (Mast Group Ltd) es un sistema mo-
dular único que utiliza la tecnología de multipunto para
inocular en agar una dilución para pruebas de sensibilidad
antimicrobiana, punto de corte y CIM, además de pruebas
bioquímicas de identificación. Consiste en un analizador
que contiene una cámara de video a color, un inoculador de
multipunto y una computadora. Las esferillas liofilizadas
y predosificadas con antibióticos se emplean para preparar
el punto de corte y las placas para CIM y observar también
diversos cultivos para el reconocimiento bacteriano. Las
placas de agar se inoculan con 96 diferentes microorganis-
mos, se incuban y el crecimiento se visualiza con 19 o 36
macrocolonias. Después, éstas se colocan en el analizador
y la cámara de video las inspecciona en los puntos prede-
terminados. Los tres colores básicos, rojo, azul y verde, se
emiten como señal eléctrica cuantitativa al microanaliza-
dor, que convierte las señales en números. Para el punto
de corte y las placas CIM, en los cuales la sensibilidad o
la resistencia se definen como crecimiento o ausencia del
mismo, las señales de tres colores se combinan para produ-
cir el equivalente de una señal en blanco y negro. Cuando
se examinan las placas de agar para la identificación bio-
química, los detalles de los colores medidos se usan para
definir resultados positivos o negativos de los diversos mi-
croorganismos probados. La tecnología de multipunto pue-
de también utilizarse para examinar la orina.
La creciente necesidad de contar con métodos estandari-
zados y cuantitativos de la AST, como los que recomienda
Figura 13-2 Análisis de las partículas de la orina mediante citometría de flujo y medición de la impedancia. Reproducido con auto-
rización de Sysmex UK Ltd.
la British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC)
o el National Committee on Clinical Laboratory Standards
(NCCLS), ha llevado a varios fabricantes a producir los
instrumentos semiautomatizados basados en la tecnología
de difusión con disco, la cual requiere la medición exacta de
los diámetros de la zona de inhibición. Los instrumentos
Aura Image (Oxoid Ltd), BIOMIC (Giles Scientific Inc.),
Mastascanelite (Mast Group Ltd), Osiris (Sanofi Diagnos-
tic Pasteur) y Sirscan 2000 (i2a Montpellier) son sistemas
de análisis de imagen que utilizan una cámara de video para
medir el diámetro de la zona de inhibición e interpretar los
resultados de las placas de agar para sensibilidad mediante
la difusión con disco. La placa de agar se coloca en un re-
cipiente corredizo motorizado y aparece una imagen clara
con los diámetros calculados en la pantalla de video. Una
zona de inhibición se interpreta como S, I, R de acuerdo
con las tablas BSAC/NCCLS para antibióticos.
La mayor parte de los sistemas tiene un sistema experto
basado en reglas programadas por el usuario y una base de
datos epidemiológica detallada.
Sistemas de examen de la orina
El examen de las muestras de orina para identificar bacte-
riuria y piuria representa una proporción considerable de
la carga de trabajo y el costo del funcionamiento de un la-
boratorio de microbiología clínica. Tan sólo 20 a 30% de
estas muestras produce resultados clínicos de importancia
y, por lo tanto, se han hecho varias tentativas de automati-
 SISTEMAS DE IDENTIFICACIÓN Y SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANAS PARA MICOBACTERIAS
zar el proceso para prevenir la obtención de muestras ne-
gativas. Es preciso contar con un instrumento que detecte
bacterias y otras partículas en la orina, como eritrocitos y
leucocitos, procese las muestras con rapidez y tenga un alto
valor predictivo negativo. En la actualidad sólo está dispo-
nible un instrumento que emplea la tecnología de partícula
que satisface estos criterios.
El UF-100 (Sysmex UK Ltd) combina la citometría de
flujo con la detección de la impedancia para reconocer y
contar directamente las células y los microorganismos en
la orina (fig. 13-2). Cada muestra de orina se mezcla con un
diluyente y se agrega un colorante fluorescente dual con
afinidad por el DNA y el RNA. La muestra teñida se envía
entonces a una celda de flujo, que irradia un láser de argón.
Los rayos láser se dispersan por las células de la muestra y
la luz dispersada hacia adelante (fluorescente y no fluores-
cente), que es proporcional al área de sección transversal
de las células, se cuantifica mediante un fotodiodo. Un fo-
tomultiplicador calcula la fluorescencia emitida, que indica
el grado de nucleación de la célula. Mediante cinco señales
de altura y anchura fluorescentes y no fluorescentes, más las
mediciones de la impedancia, el instrumento distingue las es-
tructuras celulares tridimensionales en sus tipos y cantida-
des celulares apropiadas y cuenta los microorganismos. La
distribución celular se puede mostrar en diagramas de dis-
persión e histogramas, con el programa Adaptive Cluster
Analysis.
Sistemas de identificación y sensibilidad
antimicrobianas para micobacterias
La reaparición de tuberculosos y la incidencia creciente de
brotes de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes
a múltiples fármacos ha conducido a la necesidad de contar
con sistemas automatizados para las pruebas de detección,
identificación y sensibilidad antimicrobiana rápidas de las
micobacterias. La mayor parte de los sistemas disponibles
en la actualidad se ha desarrollado a partir de la tecnología
que cultiva sangre existente y usa una instrumentación si-
milar. Todos los instrumentos tienen características de se-
guridad diseñadas para proteger al operador y prevenir la
contaminación del ambiente.
El BACTEC 460 TB (Becton Dickinson) fue el primer
instrumento semiautomatizado empleado para la detección
rápida de micobacterias. Se trata de un método radiométri-
co que usa viales con base para caldo Middlebrook 7H12,
que contiene ácido palmítico radiomarcado como sustrato
y cinco agentes antimicrobianos para reducir la contamina-
ción. El dióxido de carbono radiomarcado se libera en el
espacio libre del frasco por las micobacterias de la muestra
inoculada y se metaboliza el ácido palmítico. La radiacti-
149
vidad en el dióxido de carbono se mide por un contador
de centelleo y se convierte a un valor del índice de creci-
miento (IC). Un valor de IC de 10 o más indica la presen-
cia de micobacterias. El complejo M. tuberculosis (MTB)
puede diferenciarse de otras micobacterias al inocular una
alícuota a partir de un vial positivo en un vial BACTEC que
contiene fosfato de ácido nucleico (prueba NAP). Ningún
aumento o disminución del valor del IC revela la presencia
del complejo M. tuberculosis. El sistema puede también
utilizarse para la prueba de sensibilidad antibiótica de los
aislados de este complejo.
El Sistema BACTEC 9000 MB (Becton Dickinson) se
diseñó para el aislamiento rápido de micobacterias a partir
de muestras clínicas y utiliza tecnología fluorescente para
identificar micobacterias que crecen en medio de cultivo
líquido. Cada vial de cultivo contiene un sensor fluorescen-
te, que reacciona a la concentración de oxígeno presente.
Si hay agentes patógenos, los nutrimentos del frasco se
metabolizan y el resultado es un agotamiento del oxígeno
en el medio. Los fotodetectores del instrumento miden el
grado de fluorescencia, que corresponde a la cantidad de
oxígeno consumido. El análisis del grado de disminución
del oxígeno, cuando se mide mediante la fluorescencia cre-
ciente, permite al instrumento determinar si el vial es un
instrumento positivo. Los frascos se acomodan en seis
estantes, cada uno de los cuales aloja 40 viales. Los es-
tantes se incuban de manera continua a 37°C y se agitan
a intervalos de 10 minutos para la recuperación máxima
de microorganismos. Los viales se prueban cada 10 minu-
tos por diodos electroluminosos que activan los sensores
fluorescentes. Una determinación positiva indica la posible
presencia de micobacterias viables y se indica por medio
de una luz que emite el instrumento en el monitor.
El módulo de BacT/ALERT 3D (bioMerieux) para las
pruebas de crecimiento, detección y sensibilidad de las mi-
cobacterias tiene un sistema de detección idéntico al em-
pleado en los cultivos sanguíneos. Un sensor en la base de
cada envase detecta el dióxido de carbono como indicador
de crecimiento, con el cambio del verde al amarillo que
vigila de modo constante un reflectómetro en la unidad de
detección. El módulo de la incubación tiene cuatro com-
partimientos de 60 celdillas cada uno y éstos poseen un
mecanismo de agitación independiente para procesar cul-
tivos estáticos o con agitación dentro del mismo sistema.
El Sistema BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson) es
un instrumento con gran capacidad, completamente auto-
matizado, de vigilancia continua, que puede analizar has-
ta 960 tubos MGIT de 7 ml para reconocer micobacterias
(usa la misma tecnología de fluorescencia incluida en el
sistema BACTEC 9000 MB). Los tubos de cultivo contie-
nen un sensor fluorescente que responde a la concentración
de oxígeno en el medio de cultivo. Los fotodetectores del
150 CAP. 13 PRUEBAS AUTOMATIZADAS EN BACTERIOLOGÍA
instrumento miden la fluorescencia en cada tubo cada 60
minutos. La intensidad de la fluorescencia corresponde a
la cantidad de oxígeno que consumen los microorganismos
que, a su vez, es proporcional al número de bacterias pre-
sentes.
El instrumento puede también utilizar el reactivo BAC-
TEC MGIT 960 SIRE como un procedimiento cualitativo
rápido para la prueba de sensibilidad de Mycobacterium
tuberculosis a partir de un cultivo para estreptomicina, iso-
niacida, rifampicina y etambutol.
Comentario
Para realizar pruebas microbiológicas en “tiempo real”,
es decir, envío de la información al médico con un diag-
nóstico clínico de laboratorio, es inevitable que los mi-
crobiólogos incorporen cada vez más la instrumentación
automatizada. Esto también contribuirá a aliviar la pre-
sión de los presupuestos, cada vez menores, las reduccio-
nes de personal y una carga de trabajo siempre creciente.
Las numerosas ventajas de las pruebas automatizadas
incluyen la liberación del personal calificado del trabajo re-
petitivo para efectuar tareas complicadas y exigentes, con
lo cual mejora la calidad total del trabajo en el laboratorio;
tiempos de respuesta menores; mejor estandarización de
las pruebas al suprimir la subjetividad y el error humano,
y un funcionamiento rentable de las pruebas, al reducir la
proporción de muestras negativas que requieren un proce-
samiento adicional. Es difícil imaginar la desaparición de
la placa de agar y el asa de alambre después de un siglo
de uso; empero, se acerca el momento en que el microbió-
logo elija como primeras herramientas clínicas los instru-
mentos automatizados.
Lecturas adicionales
Reimer LG, Wilson ML, Weinstein MP. Update on detection of
bacteremia and fungemia. Clin Microbiol Rev 1997; 10: 444-
465.
Ferrano MJ, Jorgensen JH. Susceptibility testing instrumenta-
tion and computerized expert system for data analysis and
interpretation. In Manual of Clinical Microbiology, 7th edn,
Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH
(eds). 1999: ASM Press, Washington, DC, pp. 1593-1600.
Miller JM, O’Hara CM. Manual and automated system for micro-
bial indentification. In Manual of Clinical Microbiology, 7th
edn, Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken
RH (eds). 1999: ASM Press, Washington, DC, pp. 193-201.
Langlois MR, Delanghe JR, Steyaert SR, Everaert KC, De
Buyzere ML. Automated flow cytometry compared with an
automated dipstick reader for urinalysis. Clin Chem 1999: 45,
118-122.
Watterson SA, and Drobniewski FA. Modern laboratory diagnosis
of mycobacterial infections. J. Clin Pathol 2000; 53: 727-732.
 14
Técnicas de bacteriología molecular:
preparación y aplicación de la muestra
Richard E Holliman y Julie D Johnson
Necesidad de métodos
moleculares
Con objeto de justificar la importancia de los recursos ne-
cesarios para desarrollar y realizar métodos moleculares de
diagnóstico, una infección bacteriana debe satisfacer algu-
nos criterios básicos. Primero, debe representar un problema
clínico relevante en términos de la cantidad de casos, mor-
bilidad y mortalidad. Segundo, el diagnóstico temprano de
la infección debe mejorar el pronóstico del paciente; casi
siempre está disponible una terapia específica y eficaz. Por
último, la propuesta existente del diagnóstico basado en los
métodos tradicionales de microscopia, cultivo y serología
debe proporcionar un rendimiento inferior. Existe poca jus-
tificación clínica para desarrollar un método de diagnóstico
de base molecular para una infección bacteriana que puede
identificar y probar con facilidad la sensibilidad antimicro-
biana en el laboratorio de rutina. La aplicación de métodos
moleculares avanzados debe enfocarse en las bacterias que
son exigentes y difíciles para crecer en cultivo; bacterias
que se dañan en grado subletal; las que no pueden distin-
guirse de forma simple de las bacterias no patógenas simila-
res; aquellas en las que no puede evaluarse con seguridad la
sensibilidad microbiana, y las especies que no pueden distin-
guirse con razonable seguridad mediante los méto-dos de tipi-
ficación existentes. Este capítulo se concentra en los métodos
moleculares relacionados con ácidos nucleicos bacterianos.
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
Preparación
de la muestra
El éxito de cualquier técnica empleada para estudiar los áci-
dos nucleicos bacterianos confía de manera inicial en la libe-
ración y purificación de los ácidos nucleicos designados. No
existe hasta ahora un método de aceptación general para la
preparación de muestras clínicas, pero hay muchos factores
interrelacionados que se deben tomar en cuenta. Luego de
seleccionar al agente patógeno, el tipo de muestra clínica lo
impone la patogenia de la enfermedad. Para maximizar la po-
sibilidad de detección debe considerarse la carga bacteriana
dentro de la muestra (el número de microorganismos por vo-
lumen de muestra). En condiciones óptimas, esto es, cuando
la carga bacteriana es baja, debe examinarse un volumen de
muestra conveniente más grande; empero, las técnicas mo-
leculares utilizan a menudo volúmenes ⬍100 µl. En última
instancia, se necesita la concentración de los agentes desig-
nados en un volumen pequeño. Esto requiere una concentra-
ción elevada en las muestras, como el esputo para Mycobac-
terium tuberculosis y la sangre para la bacteriemia, pero bajas
en muestras como orina para Chlamydia con la finalidad de
conseguir la sensibilidad. Los volúmenes grandes de muestra
exigen técnicas complejas de extracción, como la precipita-
ción por etanol y la apropiación de los ácidos nucleicos “ob-
jetivo”, que propician una disminución de la sensibilidad del
análisis. Los volúmenes grandes de muestra pueden tam-
152 CAP. 14 TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA MOLECULAR: PREPARACIÓN Y APLICACIÓN DE LA MUESTRA
bién contener niveles más grandes de ácido nucleico ines-
pecífico con DNA ajeno, lo cual puede comprometer el
análisis. El tipo de muestra y la forma de procesarla du-
rante y después de la colección revisten importancia. Las
muestras de líquido cefalorraquídeo, orina y esputo pueden
contener inhibidores. El hem (a 0.8 µM) y sus productos
metabólicos son inhibidores conocidos de las polimera-
sas de DNA, debido a la unión del hem o la porfirina a la
enzima de amplificación. Los polisacáridos ácidos, com-
ponentes de las glucoproteínas en el esputo, son también
inhibidores. Pueden ser necesarias medidas adicionales
para eliminar los inhibidores de muestras como esputo y
sangre en comparación con orina o líquido cefalorraquídeo
(Woodford y Johnson, 1998).
Para la detección de enfermedades de transmisión sexual,
como Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae y
Trichomonas vaginalis, las novedosas técnicas de muestreo
de autoadministración que usan muestras recolectadas con
tampón han resultado más sensibles por PCR que el análi-
sis urinario (Tabrizi et al., 1998).
Los reactivos utilizados en la recolección de la muestra,
como EDTA y heparina, también inhiben a las enzimas de
amplificación. Si el objetivo está presente en abundancia,
la dilución de la muestra puede eliminar el efecto inhibito-
rio, al tiempo que mantiene los ácidos nucleicos a un grado
al cual la frecuencia de copias cero analizadas es baja. En
contraste, la destrucción química o enzimática de los ácidos
nucleicos reduce el número efectivo de objetivos amplifi-
cables de ácido nucleico. Los microorganismos objetivo y
la durabilidad de su pared celular poseen un efecto notable
sobre el procedimiento de extracción; por ejemplo, la pa-
red celular de M. tuberculosis es en particular resistente a la
lisis, mientras que la de Mycoplasma spp. se lisa de modo
espontáneo. Es también importante proteger al personal del
laboratorio que aplica técnicas moleculares cuando agen-
tes patógenos como M. tuberculosis son los agentes de es-
tudio; por tanto, puede ser necesario incluir medidas de
esterilización dentro del procedimiento de extracción. Es
necesario reducir al mínimo la manipulación de la mues-
tra y acatar protocolos estrictos con requerimientos redu-
cidos de equipo especializado. La amplificación extensa
del DNA bacteriano exige el procesamiento de la muestra
que libere el DNA desde una matriz de microorganismos
“blanco” y abata los factores inhibitorios. Para aumentar
la detección de agentes patógenos con paredes celulares
de lisis difícil, la purificación del DNA con columnas de
filtro de fibra de vidrio, con una medida adicional de soni-
cación, ha probado ser tan buena como la extracción están-
dar con fenol-éter de DNA (Rantakokko-Jalava y Jalava,
2002). Los procedimientos de preparación de la muestra
contribuyen a la confiabilidad de la detección del objetivo
dentro de las muestras clínicas; existen numerosos equipos
comerciales y se recomienda que las técnicas de extracción
de DNA se seleccionen de forma cuidadosa, con particular
atención en el tipo de muestra. Los equipos comerciales
han probado superioridad para la extracción de DNA de
muestras fecales (McOrist et al., 2002) y la extracción rá-
pida de DNA en los estudios moleculares epidemiológicos
de Plasmodium falciparum (Henning et al., 1999); incluso
la lisis no comercial que incluye la serie lavado-álcali-ca-
lor ha probado ser el método más sensible y simple para
la extracción del DNA de bacterias, levaduras y hongos a
partir de material de cultivo en sangre (Miller et al., 2000).
Algunos trabajadores han modificado los equipos comer-
ciales para maximizar la recuperación y pureza del DNA
extraído, en especial con protozoarios intestinales (da Silva
et al., 1999). Si la preparación de la muestra es ineficiente,
se generan resultados falsos negativos (cuadro 14-1).
Amplificación
Los ácidos nucleicos pueden ser DNA o RNA, de doble
hélice o simple, y deben estabilizarse una vez aislados
para prevenir la degradación. El RNA es más difícil de
estabilizar que el DNA. Es un requisito del aislamiento de
RNA la ausencia de DNA contaminante. La extracción o
destrucción selectivas de DNA o RNA permite sólo diri-
girse al ácido nucleico apropiado. El rRNA puede esta-
bilizarse en soluciones caotrópicas por meses a tempera-
tura ambiente. Son problemáticos los agentes patógenos
que tienen una etapa de RNA y una de DNA en su ciclo
vital. La reacción en cadena de la polimerasa con trans-
cripción inversa (RT-PCR) detecta mRNA pero también
DNA, a menos que se tomen medidas para destruir este
objetivo (Dilworth y McCarrey, 1992). La amplificación
basada en la secuencia del ácido nucleico puede también
usarse para detectar mRNA; ésta es una reacción isotér-
mica que no requiere un ciclador térmico. En fecha más
reciente, la amplificación por desplazamiento de hebra de
la transcriptasa inversa (RT-SDA) también se ha utilizado
como indicador de la viabilidad bacteriana (Keer y Birch,
2003). Los métodos de amplificación como la replicación
de secuencia autosostenida, que en teoría son capaces de
usar sólo moldes de RNA, no deben amplificar DNA sal-
vo que se incluya una medida de desnaturalización como
parte de la técnica de extracción. Es importante determinar
si el DNA de hélice simple interfiere en realidad con este
planteamiento de RNA específico. De manera análoga, la
PCR reconoce sólo DNA, a menos que un paso de trans-
cripción inversa preceda a la PCR. Las investigaciones con
tinciones de sangre y semen en patología forense han mos-
trado que el DNA y el RNA pueden aislarse de modo si-
multáneo desde la misma muestra para el análisis median-
 PRÁCTICA ACTUAL 153

Cuadro 14-1 Solución de problemas en la preparación de la muestra

Contexto clínico Problema Solución

Muestras de gran volumen
Tipos de muestras clínicas
Químicos utilizados en la recolección de
la muestra
Agentes patógenos para examen
Pacientes con tratamiento parcial
Presencia de muestras clínicas y
productos de amplificación previa en
el laboratorio
Grandes cantidades de DNA extraño
comparado con volumen pequeño de
procesamiento
Grados variables de inhibición de enzima
Inhibición de la enzima
Estabilidad variable del objetivo
Presencia de agentes patógenos viables o
inviables
La contaminación de muestras crea
reacciones falsas positivas
Extracción rigurosa de DNA
Maximizar amplificación de la
sensibilidad
Individualizar las técnicas de extracción
Dilución
Agentes quelantes
Controles positivos
Procesamiento rápido de la muestra
Condiciones óptimas de almacenamiento/
transporte
RT-PCR
Pipetas de desplazamiento positivo/
taponadas
Estaciones de trabajo para el análisis
antes y después de la PCR
Equipo especializado

te precipitación con etanol y extracción ácida con fenol y
cloroformo (Bauer y Patzelt, 2003). Los métodos de am-
plificación de ácidos nucleicos estables pueden detectar
microorganismos muertos, inactivos y en replicación. El
reconocimiento de todas las formas de los agentes pató-
genos puede ser ventajoso cuando la viabilidad se pierde
en poco tiempo durante el transporte o almacenamiento o
si el agente no puede cultivarse. Sin embargo, la discrimi-
nación de microorganismos muertos y viables representa
un problema si los agentes patógenos inviables o inactivos
permanecen una vez que la infección activa es evidente.
Control de calidad
Cuando se aísla, el blanco debe colocarse en un ambiente
acuoso compatible con la amplificación. Muchos reacti-
vos utilizados en biología molecular inhiben a las enzimas
de amplificación para la purificación de ácidos nucleicos;
éstos incluyen detergentes como el sulfato de dodecilo de
sodio o caotrópicos como clorhidrato de guanidinio, que
se utilizan para solubilizar la membrana celular o inactivar
nucleasas, sobre todo en la extracción del DNA bacteria-
no y de levadura de productos sanguíneos (Golbang et al.,
1996). Se deben tomar medidas adicionales para remover
o neutralizar dichos reactivos. El control de calidad de los
reactivos y el equipo en las técnicas clínicas de biología
molecular es de enorme importancia. Con técnicas tan po-
derosas y sensibles como la PCR, el riesgo de reacciones
falsas positivas debido a la contaminación y falsas negati-
vas debido a los inhibidores de reacción ha llevado a idear
procedimientos escrupulosos de anulación, que hacen a la
técnica relativamente cara y limitada a quienes disponen
de tiempo, instalaciones y destreza necesarios. De impor-
tancia particular en la microbiología diagnóstica es el uso
de controles para anular los falsos negativos; por ejemplo,
los controles intrínsecos de DNA de un número bajo de co-
pias de una secuencia de control pueden incluirse en la
muestra clínica. Si el control no se amplifica, puede asu-
mirse que la muestra es inhibidora. Los requisitos espe-
ciales del equipo incluyen puntas taponadas o pipetas de
desplazamiento positivo, estaciones de trabajo separadas,
termocicladores y equipo básico de detección. Todo ello
requiere un gasto financiero inicial grande. Debido a la fal-
ta de validación y protocolos estándar, además de reactivos
y equipos de calidad variable, las técnicas moleculares son
todavía la herramienta de los laboratorios de referencia y
unidades de investigación. La European Commission ha
aprobado la investigación en la validación y estandariza-
ción del uso del diagnóstico por PCR para la detección de
bacterias patógenas en los alimentos (Malorny et al., 2003)
y se espera que desarrollos similares en el diagnóstico clí-
nico puedan generalizarse en el futuro.
Práctica actual
A principios del año 2000 una cantidad creciente de infec-
ciones bacterianas se convirtió en material para los méto-
dos moleculares de diagnóstico en el curso de la práctica
154 CAP. 14 TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA MOLECULAR: PREPARACIÓN Y APLICACIÓN DE LA MUESTRA

Cuadro 14-2 Aplicación clínica de la metodología molecular

Función Bacterias Métodos convencionales Métodos moleculares

Detección del agente
patógeno
Identificación de aislados
Sensibilidad antimicrobiana
Tipificación
Neisseria meningitidis
Staphylococcus spp.
Mycobacterium tuberculosis
Streptococcus pyogenes
Microscopia del cultivo
en medios de agar para
detectar antígenos
Examen de características
fenotípicas, como
producción de la enzima
coagulasa
Cultivos sobre/en medios que
contienen antibióticos
Serotipificación de la
proteína M
Amplificación por PCR y
sondeo DNA de productos
de amplificación
Amplificación por PCR con
cebadores específicos para
especies por secuencias del
gen 16S rRNA
Electroforesis de los productos
de la PCR para detectar
diferencias genéticas
relacionadas con resistencia
Amplificación por PCR de
16S rRNA y examen de los
fragmentos del producto de
la enzima de restricción

clínica de rutina. Un número más grande de dichos mé-
todos se ha analizado en el laboratorio de investigación y
algunos de ellos pueden encontrar un papel clínico en el
futuro. Los métodos de laboratorio habituales se emplean
en funciones diversas en el proceso diagnóstico; éstos com-
prenden la detección de microorganismos en una muestra
clínica, identificación del aislado, pruebas de sensibilidad
y tipificación epidemiológica. Los métodos moleculares
se han aplicado a cada una de estas cuatro funciones; el
cuadro 14-2 lista los ejemplos representativos. Desde la
perspectiva clínica, los métodos moleculares se usan en el
diagnóstico de infecciones bacterianas de las vías respira-
torias, tejidos blandos, sistema urogenital, aparato diges-
tivo y sistema nervioso central (Mandell et al., 2000).
Vías respiratorias
Muchas bacterias causantes de la infección de vías respira-
torias crecen o se identifican con dificultad en cultivos. En
consecuencia, es conveniente la aplicación de métodos mo-
leculares avanzados en estas infecciones. Puede detectarse
Mycoplasma pneumoniae en escobillados de garganta me-
diante la PCR, en tanto que Legionella pneumophila puede
identificarse en secreciones profundas del pulmón por PCR
y sondas de DNA (Mandell et al., 2000). Se ha desarrolla-
do un anidado de PCR en un tubo simple que incorpora un
sistema de detección basado en EIA para el diagnóstico de
la infección por Chlamydia pneumoniae (Clewley, 1996).
Pueden identificarse con rapidez, por hibridación con son-
das específicas de DNA, aislados del complejo intracelular
Mycobacterium avium cultivados sobre desperdicios o en
medios líquidos. Los métodos moleculares pueden utilizar-
se para reconocer Mycobacterium tuberculosis en mues-
tras clínicas, identificar aislados que crecen in vitro, valorar
sensibilidad, vigilar la respuesta a la terapia (por la cuanti-
ficación de los valores de mRNA) y distinguir las cepas en
los estudios epidemiológicos.
Tejidos blandos
Los métodos establecidos para la identificación de especies
de estafilococos se basan en las características fenotípicas.
Dichos métodos no suministran suficiente confiabilidad de-
bido a la variable expresión de estos factores fenotípicos.
El gen 16S rRNA posee regiones reservadas y variables. Al
diseñar cebadores de PCR para secuencias específicas den-
tro del gen se logró clasificar, de acuerdo con la especie,
los aislados de estafilococos con mayor exactitud (Clewley,
1996).
Los aislados de estreptococos del grupo A (Strepto-coc-
cus pyogenes) pueden someterse a genotipificación por
el análisis del patrón de la enzima de restricción de 16S
rRNA, un proceso conocido como ribotipificación. El gen
pirógeno de la exotoxina se puede detectar por amplifica-
ción con PCR. Otro esquema de tipificación se basa en la
amplificación con PCR y la digestión con la enzima de res-
tricción del regulón de virulencia, un grupo de genes que
comprende factores de virulencia como el factor inactivador
del complemento y la actividad antifagocítica bajo control
de la transcripción de un gen de virulencia (Clewley, 1996).
Los exámenes moleculares de muestras de piel han alcan-
zado una sensibilidad hasta de 68% para el diagnóstico de
la enfermedad de Lyme.
 PRÁCTICA ACTUAL
Sistema urogenital
Es posible detectar Chlamydia trachomatis en muestras
genitales mediante prueba de ELISA, técnicas de inmu-
nofluorescencia y sondas de DNA, pero estos métodos son
menos sensibles que los cultivos convencionales. En con-
traste, la amplificación por PCR parece ser más sensible
que el cultivo de Chlamydia, al tiempo que conserva alta
especificidad y puede aplicarse a muestras de orina y esco-
billados endouretrales.
El diagnóstico de gonorrea se basa aún en el aislamien-
to de la bacteria por cultivo convencional. Sin embargo, el
sondeo de DNA, la amplificación por PCR o la reacción
en cadena de la ligasa pueden ser de valor cuando el aisla-
miento es impráctico debido a las dificultades de transporte
del espécimen o la falta de acceso inmediato a un labora-
torio con instalaciones de cultivo. Las sondas de DNA para
Neisseria gonorrhoeae tienen un límite aproximado de sen-
sibilidad de 103 patógenos por muestra. La precisión de
los diversos métodos de amplificación iguala o excede la
del cultivo, pero la experiencia clínica es limitada (Man-
dell et al., 2000). Se han descrito métodos moleculares
para el diagnóstico y estudios epidemiológicos de Haemo-
philus ducreyi y Treponema pallidum, además de agentes
patógenos relacionados con la vaginosis bacteriana.
Sistema digestivo
En general, los métodos moleculares son de valor limitado
para el diagnóstico de la infección gastrointestinal. Aunque
los métodos convencionales de microscopia y cultivo son
relativamente insensibles y consumen tiempo, la mayoría
de los pacientes requiere sólo tratamiento de apoyo y un
diagnóstico específico, que a menudo no afecta la terapéu-
tica. Una posible excepción es la infección por Campylo-
bacter, en la cual los métodos actuales de identificación se
basan en factores bioquímicos poco fiables. Los cebadores
de PCR específicos para el género Campylobacter y las es-
pecies del género, como C. upsaliensis, C. helveticus, C.
fetus, C. hyointestinalis y C. lari, se basan en las regiones
conservadas y variables del gen 16S rRNA. La digestión
por las enzimas de restricción de los productos amplifica-
dos puede utilizarse para desarrollar un esquema de tipi-
ficación para seguir la extensión de las cepas en roturas
(Mandell et al., 2000). La amplificación molecular tam-
bién ha encontrado un papel en la detección de Escherichia
coli 0157:H7.
Sistema nervioso central
Las sondas de DNA no han sido capaces de proporcionar
un nivel clínico de sensibilidad útil cuando se usan para la
detección de bacterias en el LCR; los métodos de ampli-
155
ficación de DNA han mostrado mayor utilidad. La PCR
para Neisseria meningitidis en las muestras del LCR al-
canza grados de sensibilidad y especificidad por arriba de
90% en comparación con los cultivos convencionales. Esta
técnica puede ser de particular valor cuando el paciente re-
cibe antibióticos antes de la punción lumbar y representa
un avance significativo respecto de los métodos de detec-
ción del antígeno. Estudios moleculares de la diversidad
de meningococos han identificado linajes hiperinvasivos
y posibilitado la introducción de vacunas nuevas. La PCR
también se emplea para reconocer Listeria monocytogenes
en individuos inmunosuprimidos con meningitis y Trepo-
nema pallidum en el diagnóstico de la neurosífilis sintomá-
tica. La sensibilidad y especificidad de estas aplicaciones
todavía no se establece (Mandell et al., 2000).
Amplificación de 16S rRNA y secuenciación
Los cebadores universales para la amplificación de los ge-
nes 16S rRNA, con la secuenciación subsiguiente de los
productos, se pueden utilizar para la identificación de
los aislados bacterianos y la detección de agentes patóge-
nos en las muestras clínicas; este planteamiento ha susten-
tado el diagnóstico de endocarditis infecciosa y el examen
de muestras de LCR en el caso de sospecha de meningitis.
La principal ventaja de los cebadores universales radica
en que las alícuotas de muestras clínicas son innecesarias
cuando se buscan con base en un límite particular de agen-
tes patógenos, de tal forma que se conserva el volumen de
la muestra y se evitan errores vinculados con la selección
específica de microorganismos del análisis. En la actuali-
dad se utiliza esta tecnología para buscar causas infeccio-
sas antes desconocidas de la enfermedad clínica, como la
esclerosis múltiple. La causa de la angiomatosis bacilar,
Bartonella henselae, se reconoció de esta manera.
Microensayos de DNA/RNA
Dado que ya se han establecido las secuencias genómicas
parciales o completas de muchos agentes patógenos bac-
terianos, se puede emplear la tecnología de microensayos
para medir los grados de transcripción y detectar polimor-
fismos de la secuencia. Las sondas de DNA se inmovilizan
sobre un soporte sólido y se utilizan para reconocer DNA
o RNA luego de la amplificación por PCR. Los trozos de
baja densidad son más convenientes para las aplicaciones
clínicas de rutina debido a su simplicidad, fácil procesa-
miento de datos, reproducibilidad incrementada y bajo cos-
to. Los microensayos se pueden desarrollar para detectar
límites de agentes patógenos en una sola muestra clínica
(por ejemplo, LCR) o establecer con rapidez resistencia
y sensibilidad antibióticas en un solo aislado. Hoy en día
156 CAP. 14 TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA MOLECULAR: PREPARACIÓN Y APLICACIÓN DE LA MUESTRA
tales aplicaciones se restringen a laboratorios de investiga-
ción, pero es probable que ingresen al uso diagnóstico en
un futuro próximo.
Detección molecular de resistencia microbiana
Por tradición, la resistencia antimicrobiana se determina
con el crecimiento de un agente patógeno bacteriano en
presencia de concentraciones apropiadas de agentes te-
rapéuticos seleccionados. Para mala fortuna, las tasas de
crecimiento variables de bacterias tienen como efecto un
retraso inherente, de modo que los resultados sólo están
disponibles muchas horas después del aislamiento inicial
del agente. El incremento de la comprensión de la base ge-
nética de la resistencia ha permitido el desarrollo de méto-
dos moleculares para detectar en poco tiempo los cambios
genómicos hallados en los fenotipos de resistencia. Este
principio se ha aplicado a la identificación del gen Mec A
que codifica la resistencia a la meticilina en estafilococos,
la proteína que liga la penicilina en Streptococcus pneu-
moniae y varios de los determinantes de la resistencia a la
rifampicina en Mycobacterium tuberculosis. No obstante,
los métodos moleculares tienen ciertas limitaciones: los
mecanismos de resistencia desconocidos o novedosos pue-
den omitirse, y cuando el número de genes diferentes que
inducen la resistencia es grande, los métodos moleculares
son costosos. Como resultado, los análisis fenotípicos son
todavía el método de opción para analizar a la mayor parte
de las bacterias.
Epidemiología y tipificación
Los métodos convencionales de tipificación aplicados a
las bacterias incluyen fagotipificación y serotipificación.
Muchas veces, dichos métodos muestran un poder bajo
de discriminación y escasa reproducibilidad, sobre todo
cuando se aplican a microorganismos de crecimiento len-
to, como Mycobacterium tuberculosis. Las secuencias IS
6110 repetidas del DNA muestran suficiente polimorfismo
para permitir un esquema de tipificación basado en la am-
plificación por PCR de la secuencia de inserción y la téc-
nica Southern blotting de los fragmentos de la enzima de
restricción. Las cepas que portan sólo una copia única de la
secuencia de inserción no pueden separarse por la tipifica-
ción de la IS 6110. Tales aislados pueden investigarse con
otro elemento repetitivo, la secuencia DR (Clewley, 1996).
En cada caso, el gen posee repeticiones directas separadas
por secuencias únicas. La variabilidad de estas secuencias
únicas conduce a diferentes patrones de bandas después del
corte con enzimas de restricción (polimorfismo de longitud
de fragmentos de restricción). El método desarrollado para
amplificar y marcar secuencias de DNA en la región DR se
conoce como espaciador de oligotipificación o “espoligo-
tipificación” (Marshall y Shaw, 1996). Estos métodos han
revelado microepidemias insospechadas y delinean la im-
portancia creciente de la tuberculosis como enfermedad de
reciente adquisición. La tipificación secuencial multilocus
ha hecho posible reconocer las vías de diseminación de los
tipos individuales de Staphylococcus aureus multirresis-
tente. Tal herramienta tiene ventajas sobre la electroforesis
en gel de campo pulsado (PFGE), entre ellas la facilidad
del ingreso de información en una base de datos.
Problemas con los métodos moleculares
Aunque los métodos moleculares han conducido a avances
en el diagnóstico y tratamiento de la infección, aún son
problemas de importancia. Los recursos necesarios de es-
tas técnicas suelen ser más grandes que los de los métodos
convencionales que tratan de reemplazar. El equipo espe-
cializado y los reactivos, junto con la necesidad de entrena-
miento adicional del operador, han limitado la aplicación
de los métodos moleculares en los laboratorios de diag-
nóstico comunes. La importancia clínica de la sensibili-
dad incrementada de los análisis basados en el sondeo del
DNA, en particular la amplificación del DNA, puede ser
incierta. Por ejemplo, un frotis positivo de una muestra de
esputo en la microscopia habitual puede contener alrededor
de 104 bacilos tuberculosos. A pesar de esta falta relativa de
sensibilidad, los hallazgos son de gran valor clínico para
predecir la infectividad. En contraste, es menos segura la
importancia de un análisis positivo con PCR para M. tu-
berculosis realizado sobre una muestra de esputo tomada
de un paciente sometido a terapia apropiada.
Está bien documentado el daño de las reacciones falsas
positivas debido a la práctica excesiva de la amplificación
del DNA. En contraste, los volúmenes limitados de prueba
utilizados en estos métodos pueden dar lugar a resultados
falsos negativos en virtud del error de muestreo relacionado
con la distribución irregular de los agentes patógenos en las
muestras clínicas. Por último, los métodos moleculares de
primera generación se diseñaron para detectar sólo la pre-
sencia o ausencia de un agente patógeno y no suministran
información acerca de la viabilidad del microorganismo.
Las técnicas convencionales para determinar la viabilidad
dependen de la demostración de la integridad o la activi-
dad celulares y es escasa la correlación entre la detección
del DNA y la viabilidad. Los objetivos moleculares para
valorar la viabilidad incluyen mRNA y rRNA. Las especies
de rRNA de vida media más larga y su retención varia-
ble secundaria a una variedad de tratamientos bacterianos
hacen del rRNA un indicador menos exacto de viabilidad
que los objetivos mRNA (Keer y Birch, 2003). Aunque los
 APLICACIÓN FUTURA
análisis posteriores corrigieron este defecto, tienden a ser
complejos y más difíciles de realizar.
Aplicación futura
Es posible que se desarrollen métodos moleculares apro-
piados para otros agentes patógenos cuyo crecimiento es
difícil en cultivo, como las bacterias anaerobias, o en los
casos en que la terapia antibiótica antecede a la obtención
de las muestras para el diagnóstico, como la infección de
las vías respiratorias y la osteomielitis. Los métodos mo-
leculares pueden proporcionar información útil en cuanto
a la virulencia probable de los aislados clínicos de estafi-
lococos negativos a la coagulasa y estreptococos hemo-
líticos alfa. La genotipificación puede ser de utilidad en
estudios sobre la extensión de la resistencia antibiótica y
los mecanismos de la infección cruzada en los hospitales.
Si bien los métodos moleculares no han revolucionado en
gran proporción el campo de las enfermedades infeccio-
sas, la introducción de estaciones de trabajo automatizadas
mejorará la estandarización, reducirá costos y conducirá a
una aplicación más amplia de los métodos moleculares en
el laboratorio clínico.
Lecturas adicionales
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cols and Clinical Applications, 1st edn. 1998: Humana Press,
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 15
Otras pruebas en bacteriología
Darrel Ho-Yen
Introducción
Una parte importante del trabajo en un laboratorio de bac-
teriología diagnóstica es el cultivo de bacterias. Tal iden-
tificación posibilita el diagnóstico definitivo, sobre todo
cuando crecen agentes patógenos; empero, cuando el cre-
cimiento es de microorganismos comensales, su papel no
puede relacionarse con la enfermedad. Otros problemas de
la técnica de cultivo en relación con el diagnóstico son el
difícil crecimiento de algunas bacterias (p. ej., Legionella
pneumophila, causante de la enfermedad de los legiona-
rios), la imposibilidad de cultivar algunas (p. ej., Trepo-
nema pallidum, que provoca la sífilis) y el peligro notable
que entraña el cultivo de otras (como Brucella abortus, que
ocasiona la brucelosis). A pesar de estas limitaciones, el
cultivo de bacterias es todavía el apoyo principal del labo-
ratorio de bacteriología diagnóstica.
Este capítulo considera otros métodos de identificación
de bacterias como origen potencial de la enfermedad. Las
aproximaciones directas para el diagnóstico son la iden-
tificación de bacterias (detección del antígeno) o el reco-
nocimiento de anticuerpos específicos para la presencia de
bacterias (detección del anticuerpo). Las técnicas para de-
tectar anticuerpos, IgM, aumentos cuádruples del anticuerpo
IgG, baja avidez de IgG o valores elevados de IgA pueden
develar la infección en curso. Es importante recordar que
si bien los resultados de un anticuerpo pueden delinear la
infección, ésta puede no ser la causa de la enfermedad. Por
lo tanto, una prueba específica sensible de IgM para Toxo-
plasma gondii puede ser positiva sin tener relación con los
síntomas; puede tratarse tan sólo de una infección pasada.
La formación del complejo inmunitario es un proceso
natural durante cualquier infección. Por muchas décadas
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
han existido métodos intrincados e imaginativos que tra-
tan de identificar microorganismos específicos dentro de
los complejos inmunitarios. El éxito ha sido limitado, pero
esta área constituye todavía un gran desafío intelectual para
los microbiólogos. Por último, las pruebas indirectas de la
infección bacteriana se realizan en muchos laboratorios de
bacteriología. Estas pruebas se incluyen en dos grupos. En
el primero, los marcadores de una infección particular pue-
den utilizarse para reconocer al agente patógeno (como la
cromatografía de gas-líquido y las pruebas de respiración).
El segundo grupo emplea los marcadores generales de las
infecciones y no son específicos de una bacteria particular
(como la proteína C reactiva).
Pruebas para el anticuerpo
Aunque todos los líquidos corporales se pueden analizar
para anticuerpos, en la bacteriología diagnóstica se ana-
liza por lo regular una muestra sérica. En individuos in-
munocompetentes, la infección por bacterias produce casi
siempre el anticuerpo específico contra ese agente. Los an-
ticuerpos son proteínas elaboradas en el suero (el comparti-
miento de la sangre libre de células) y conforman moléculas
complejas de diversos tipos (llamadas inmunoglobulinas).
Las inmunoglobulinas participan en diversos mecanismos
de defensa contra bacterias invasivas. Hay cinco tipos de
inmunoglobulinas en el ser humano, pero para la bacterio-
logía diagnóstica, IgM e IgG son las de mayor uso (IgA
e IgE son mucho menos importantes). El anticuerpo IgM
aparece al inicio del curso de la infección (durante la pri-
mera semana) y es diagnóstico de la infección en curso.
El anticuerpo IgG se forma más tarde en la infección
160 CAP. 15 OTRAS PRUEBAS EN BACTERIOLOGÍA
(en la segunda semana) y las más de las veces es indica-
tivo de infección e inmunidad pasadas. El anticuerpo IgG
también cruza la placenta y confiere inmunidad al recién
nacido. La IgA es la inmunoglobulina mucosa principal
y la IgE interviene en particular en reacciones alérgicas;
no obstante, ambas son incapaces de cruzar la placenta
y tienen utilidad diagnóstica en el recién nacido. La IgM
no cruza la placenta, pero una cuarta parte de los neona-
tos no produce IgM. Los aumentos y descensos de estas
inmunoglobulinas (IgM, IgG, IgA e IgE) en el suero son
diferentes y tales diferencias pueden usarse para medir el
inicio de una infección, por ejemplo el diagnóstico de la
infección durante el embarazo.
Pruebas más antiguas
Pruebas de aglutinación
Los anticuerpos específicos presentes en el suero pueden
aglutinar a las partículas bacterianas o partículas de látex cu-
biertas con antígenos bacterianos. Un ejemplo de una prue-
ba de aglutinación es el método de aglutinación directa para
la detección del anticuerpo contra Brucella abortus. En esta
prueba, una suspensión de B. abortus se agrega a una serie
de diluciones con suero del paciente contenida en tubos de
ensayo. Los tubos se incuban por una hora o más tiempo,
casi siempre a 37°C, y a continuación se interpreta el resul-
tado. Para detectar la aglutinación más tenue, la prueba se
puede incubar durante la noche para incrementar su sensibi-
lidad. La aglutinación se observa al golpear con suavidad los
tubos para perturbar las células; éstas ascienden en el líquido
en la forma de agregados o, como en el caso de los controles
negativos, como suspensión fina dispersada. Las pruebas de
aglutinación se pueden adaptar con facilidad al uso en por-
taobjetos y resultan rápidas y fáciles de realizar.
Las pruebas de aglutinación son en particular sensibles
en presencia de anticuerpos de IgM dado que esta clase de
inmunoglobulina se aglutina mejor que otras. No obstante,
debe recordarse que el anticuerpo IgM no induce siempre
aglutinación y son posibles resultados falsos negativos. Un
problema técnico es el efecto prozona, en el cual la aglutina-
ción no se observa a concentraciones más altas del anticuer-
po debido a la inhibición estérica en los sitios de unión con
el anticuerpo; sólo es obvia cuando se diluye la muestra.
Los eritrocitos (como los de oveja) pueden también
cubrirse con antígenos bacterianos. El análisis de hemaglu-
tinación de Treponema pallidum (TPHA) se emplea para el
diagnóstico de la sífilis. Estas pruebas de la partícula reves-
tida tienen la ventaja de no sufrir ninguna autoaglutinación,
es decir, la aglutinación de las partículas se efectúa a través
de la simple adherencia de la proteína, lo cual es un proble-
ma frecuente con las suspensiones bacterianas.
Pruebas de fijación del complemento
El suero del paciente se calienta primero a 56°C para destruir
el complemento. En la segunda etapa se mezcla el suero en
una gama de diluciones con el agente patógeno o sus antíge-
nos. Se agrega una fuente del complemento, que en condi-
ciones normales es una alícuota de suero fresco de cobayo,
y la mezcla se incuba. Los complejos antígeno-anticuerpo
formados entre las bacterias y la muestra del paciente ac-
tivan el complemento del cobayo y por tanto lo eliminan
de la mezcla. Al final del periodo de incubación, todas las
mezclas se eliminan en la tercera etapa de la prueba, para la
cual los reactivos se preparan de eritrocitos de una especie
conveniente sensibilizada con el anticuerpo contra los an-
tígenos del eritrocito. De manera característica se utilizan
los eritrocitos de la oveja, que se sensibilizan con el anti-
cuerpo del eritrocito antioveja del conejo, de tal forma que
los eritrocitos se cubren con el anticuerpo en ausencia del
complemento. Si el complemento se encuentra presente en
la segunda etapa, los eritrocitos sensibilizados se lisan. Por
lo tanto, la lisis indica que las muestras del paciente en la
segunda etapa del procedimiento no tenían algún anticuer-
po presente, mientras que la ausencia de lisis señala que el
anticuerpo estaba presente y que el complemento se utilizó
hasta la segunda etapa.
Las pruebas de fijación del complemento se han usado con
alguna frecuencia para muchos propósitos, como el diagnós-
tico de la infección por Brucella. Existen muchos problemas
potenciales con estas pruebas. Su confiabilidad depende de la
estandarización de todos los reactivos de la prueba antes de su
realización. Además, no es raro encontrar sustancias en suero
que ejercen efectos anticomplemento.
Pruebas de precipitación
El principio señala que un anticuerpo, en especial IgG, pre-
cipita al antígeno soluble. La precipitación se puede reali-
zar en solución acuosa en tubos de ensayo, pero se efectúa
con más frecuencia mediante el método de Ouchterlony.
Esta prueba utiliza una placa (placa de Petri) que contiene
1 a 2% de agar común, con celdas perforadas que se llenan
de antígeno (del agente patógeno de interés) o el anticuer-
po (suero del paciente). El formato general se muestra en
la figura 15-1. El antígeno y el anticuerpo se difunden uno
hacia el otro a través del agar y donde se encuentran se
forma una línea de precipitación. Casi cualquier antígeno
puede usarse, a condición de que se difunda con facilidad.
Con un anticuerpo de especificidad conocida puede preci-
sarse la identidad de un antígeno desconocido. Esta clase
de prueba se puede emplear con las toxinas bacterianas,
como las relacionadas con el tétanos y la difteria.
 PRUEBAS PARA EL ANTICUERPO
Figura 15-1 Formato de la prueba de precipitación de Ouchter-
lony.
Pruebas recientes
El principio de estas pruebas establece que el anticuerpo del
paciente presente en el suero se une a un sustrato que se pro-
porciona bajo la forma de bacterias o sus productos unidos a
una superficie sólida. Después, las proteínas indeseables del
suero se lavan a partir del sustrato y un segundo anticuer-
po, casi siempre cultivado en conejos, ovejas o cabras, que
es específico contra el anticuerpo humano y está marcado
de forma apropiada, se agrega en la segunda etapa de la
prueba. Si el anticuerpo del paciente se une al sustrato en
la primera etapa, el anticuerpo de la segunda etapa también
se liga. El marcador, o la marca, es variable, pero en cual-
quier caso debe cuantificarse con facilidad. Por ejemplo, en
la técnica del anticuerpo fluorescente, este marcaje se rea-
liza con fluoresceína, que puede visualizarse bajo luz ultra-
violeta, mientras que en el ensayo inmunoabsorbente ligado
a enzimas (ELISA) se emplea una enzima que puede actuar
con posterioridad sobre un sustrato conveniente para produ-
cir un cambio de color mensurable. El número de marcajes
disponibles es muy grande e incluye marcados radiactivos,
pero el principio es el mismo para todas estas pruebas.
Pruebas con anticuerpos fluorescentes
Se utilizan portaobjetos especiales, muchas veces cubiertos
con teflón, los cuales tienen 10 “lugares” para que puedan
examinarse varias muestras en un solo portaobjetos. Una
suspensión del microorganismo de la prueba se seca sobre
el portaobjetos, se fija en acetona o etanol y se añaden los
161
sueros de los pacientes. Después de la incubación (por lo
regular 30 min) se lava la laminilla y se agrega la inmunoglo-
bulina antihumana (IgG, IgM o IgA), que se ha marcado
con fluoresceína. Después de la incubación y el lavado, se
aplican los cubreobjetos y el portaobjetos se examina bajo
un microscopio ultravioleta. Si la muestra contiene el an-
ticuerpo contra el patógeno de la prueba, ese anticuerpo se
une a él y reacciona con la antiinmunoglobulina marcada
para producir microorganismos que emiten fluorescencia
verde brillante bajo la luz ultravioleta. Mediante una serie
de diluciones del suero del paciente es posible cuantificar
la cantidad de anticuerpo presente. Existen varios proble-
mas con estas pruebas; por ejemplo, son muy laboriosas y
la lectura del resultado final es subjetiva y depende de la
experiencia del observador. Además, la luz ultravioleta da
lugar a que la fluorescencia se atenúe, de modo que las ob-
servaciones deben ser bastante rápidas. Por lo regular, estas
pruebas son mejores con los antígenos de la pared celular,
dado que los anticuerpos casi nunca penetran en los agen-
tes patógenos para detectar antígenos internos. La prueba
no es fácil de utilizar para la medición del anticuerpo IgM.
A pesar de estas dificultades, las pruebas con anticuerpos
fluorescentes han sido muy útiles y todavía se usan en el
diagnóstico de la sífilis.
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
Este método sumamente difundido puede estar por com-
pleto automatizado, pero por lo regular es semiautomático.
De manera característica, se usan microplacas de plástico
con 96 celdillas, que pueden alojar una gran cantidad de
muestras así como controles que pueden lavarse de mane-
ra automática y centrifugarse en caso necesario; los resul-
tados los genera y analiza un lector automático. Muchas
técnicas de ELISA están disponibles en el comercio. Las
muestras se pipetean dentro de las celdillas revestidas con
el antígeno, se incuban y se lavan, y se añade la inmunoglo-
bulina antihumana marcada con una enzima. Después de la
incubación y el lavado extensos se agrega un sustrato para
la enzima. Existe un cambio de color del sustrato si la en-
zima está presente y el lector automático lo puede analizar.
La intensidad del color es proporcional a la cantidad de an-
ticuerpo que se une al antígeno; por lo tanto, el método es
del todo cuantitativo. Sin embargo, es importante recordar
que esto es verdad sólo si hay un exceso de antígeno unido
a la placa y si se proporciona un exceso de inmunoglobuli-
na antihumana en las fases posteriores. Estas condiciones
están garantizadas en los dispositivos comerciales, pero es
importante atender estos detalles con técnicas internas.
La antiinmunoglobulina usada puede ser anti-IgM, anti-
IgG, anti-IgA, etc., y por tanto la prueba ofrece una ruta
fácil para determinar el tipo de anticuerpo presente en las
162 CAP. 15 OTRAS PRUEBAS EN BACTERIOLOGÍA
diferentes etapas de la infección. El aspecto más valioso de
esto es la medición de IgM como marcador temprano de in-
fección aguda. Los métodos de ELISA son fáciles de utili-
zar, baratos y menos laboriosos que muchos otros métodos
serológicos. Como una nota técnica de menor importancia,
para los análisis internos es esencial reconocer que las filas
externas de las placas de ELISA suelen ser dudosas como
adsorbentes. Este problema puede superarse si se usan sólo
las filas internas.
Métodos radioinmunométricos
Éstos fueron los precursores de las pruebas ELISA y el
principio es el mismo. Por lo general, se realizan en tu-
bos en lugar de celdillas; la única diferencia significativa
radica en que la antiinmunoglobulina agregada está radio-
marcada, casi siempre con 131I o 125I. Debido a los peligros
potenciales de la radiactividad, estas pruebas se utilizan rara
vez hoy día, aunque tienen mayor sensibilidad que la técni-
ca ELISA y pueden emplearse en ciertos trabajos de investi-
gación en los que se requiere una medida meticulosa.
Pruebas para el antígeno
Las pruebas para el antígeno microbiano ganan cada vez más
aceptación. La razón principal de ello es que el antígeno está
presente en fase temprana de la infección y por lo tanto su
detección proporciona información clínica de utilidad. Un
buen ejemplo es la detección de los antígenos de Legione-
lla pneumophila en la orina de pacientes con la Enfermedad
de los Legionarios. Estas pruebas son a menudo positivas
cuando el sujeto está grave y agudamente enfermo, si otros
procedimientos diagnósticos no son convenientes.
Sin embargo, existen otros ejemplos, uno de los cuales,
la identificación de los antígenos de Neisseria meningitidis
en casos de septicemia o meningitis por este microorganis-
mo, ha funcionado por muchos años. De manera original,
este método empleó una técnica llamada contrainmuno-
electroforesis, que es una variante de los métodos de pre-
cipitación que se presentaron antes. En esencia, el suero
del paciente se separa en un gel de agar al pasar un po-
tencial eléctrico a través de él, lo cual da lugar a que las
proteínas humanas y el antígeno meningocócico migren
a posiciones diferentes y se separen. A continuación, se tra-
za una ranura en sentido longitudinal en el gel junto a las
proteínas separadas y se añade en la misma un anticuerpo
específico contra el antígeno microbiano de interés. La di-
fusión del anticuerpo hacia las proteínas separadas detecta
la presencia del antígeno microbiano, si se encuentra allí.
Al igual que otros métodos de precipitación, la contrain-
munoelectroforesis es relativamente insensible y la mayor
parte de los ensayos para detectar y medir el antígeno mi-
crobiano utiliza ahora los sistemas de ELISA. La modifi-
cación requerida a la técnica de ELISA consiste en utilizar
el anticuerpo específico para el antígeno de interés en la
superficie de las celdillas de la microplaca. Este anticuerpo,
las más de las veces un anticuerpo monoclonal, se usa para
“capturar” el antígeno de la muestra del paciente. En una
segunda etapa, el anticuerpo, que es específico para el an-
tígeno y está marcado por medios enzimáticos, se agrega y
se lleva a cabo el resto del procedimiento. Suele aceptarse
que la captación del anticuerpo y la detección del anticuer-
po deben ser diferentes, aunque la prueba trabaje con el
mismo anticuerpo en ambos lados del “emparedado”. Em-
plear los anticuerpos monoclonales para ambos propósitos
o usar uno policlonal y uno monoclonal son, en esencia,
una cuestión de ensayo y error.
Esta clase de aproximación ha sido en particular útil
para el diagnóstico de infecciones víricas como el HIV y
los virus de la hepatitis. Para las bacterias se ha observado
una tendencia a tratar de simplificar los métodos mediante
las partículas de látex en una prueba de aglutinación; las
partículas se cubren con el anticuerpo contra el antígeno
de interés. Como todas las pruebas de aglutinación, éstas
son relativamente insensibles y no han demostrado ser tan
útiles, como se pensó al principio.
Como nota técnica, si se utilizan muestras de orina o
esputo para reconocer un antígeno, muchas veces es nece-
sario eliminar a los “inhibidores”. La naturaleza de éstos
no está bien establecida, pero con frecuencia basta calentar
la muestra al punto de ebullición por dos o tres minutos
para eliminarlos. Esto no tiene casi nunca efectos de dete-
rioro sobre el antígeno. En los próximos años se dispondrá
tal vez de mejoras en los métodos de ELISA para la detec-
ción del antígeno. En especial, deben usarse no sólo para
detectar el antígeno, sino para cuantificarlo por completo,
algo que el método puede realizar sin problemas.
Prueba del complejo inmunitario
específico del antígeno
La figura 15-2 muestra un análisis teórico de los sucesos
ocurridos durante una infección. El crecimiento de un mi-
croorganismo produce cantidades crecientes de antígeno
microbiano a las cuales responde el huésped infectado con
la elaboración de anticuerpo específico. Al final, en una re-
acción eficaz, la cantidad de anticuerpo formada suprime
el crecimiento del agente patógeno. Varios puntos merecen
cierta consideración a partir de este diagrama. Primero, en
una fase inicial hay más antígeno disponible para la medi-
ción en comparación con el anticuerpo. En segundo lugar,
el anticuerpo mensurable libre sólo aparece de modo tardío
en el curso de la infección. Tercero, en el transcurso de
 OTRAS PRUEBAS
Figura 15-2 Diagrama de los aspectos teóricos de las interac-
ciones antígeno-anticuerpo en una infección.
la mayor parte de la infección, los complejos inmunitarios
se forman entre el antígeno y el anticuerpo, según lo re-
presenta el área delineada en el diagrama. Dado que es-
tos complejos inmunitarios contienen los antígenos de los
microorganismos infectantes, su medición proporciona un
medio para el diagnóstico.
Se ha conocido por muchos años que la mayor parte de
las infecciones microbianas sistémicas produce valores ele-
vados de complejos inmunitarios en la sangre del pacien-
te. Es raro que este reconocimiento se aproveche con fines
diagnósticos, quizá porque las técnicas para la medición de
los complejos han resultado difíciles en el pasado. En los
últimos años se han descrito los métodos para diagnosticar
pulmonía neumocócica, endocarditis contagiosa, enferme-
dad de Lyme, lepra, meningitis tuberculosa e infección por
virus C de la hepatitis, que usaban ensayos del complejo
inmunitario. Algunas de las técnicas practicadas se discu-
ten a continuación.
Métodos que usan polietilenglicol
En estas pruebas, los complejos se precipitan a partir del sue-
ro por la adición del polietilenglicol. Esto funciona porque
los complejos poseen un tamaño diferente de la inmunoglo-
bulina o el antígeno natural. El polietilenglicol se deja actuar
por varias horas, casi siempre toda la noche, y al final de ese
tiempo la muestra de suero se centrifuga y el precipitado se
elimina para el análisis adicional. La etapa siguiente de la
163
prueba supone romper los complejos y reconocer el compo-
nente del antígeno. Esto puede lograrse por calentamiento
(60°C por 30 min), con la adición de un amortiguador de
pH bajo (p. ej., glicina/HCl) o uno de molaridad alta, como
fosfato 1 M. Después de la rotura de los complejos, se prue-
ba el antígeno mediante uno u otro de los métodos descritos
con anterioridad, como la técnica de ELISA.
Medición directa de ELISA
Estas pruebas utilizan anticuerpos monoclonales específi-
cos contra los antígenos de interés unidos a las celdillas de
las microplacas y con reactivo de captación. Se agrega la
muestra del paciente y se captan los complejos presentes.
En una segunda etapa se añade la inmunoglobulina antihu-
mana marcada de forma enzimática y se liga a cualquier an-
ticuerpo humano unido a la superficie de la placa mediante
un complejo inmunitario. Esta versión confía en la elevada
especificidad de los anticuerpos monoclonales para fijarse
sólo a los antígenos de interés. También debe observarse
que el diagnóstico por este método se infiere, no se prueba,
puesto que se aduce que el anticuerpo del paciente no pue-
de estar presente a menos que se una al antígeno captado
en la placa de ELISA.
Pruebas que utilizan agentes de unión
de complejos inmunitarios
Se conocen muchas sustancias que unen de modo específico
los complejos inmunitarios, como C1q, separado y purifi-
cado (el primer componente del complemento), factor reu-
matoide (un anticuerpo desarrollado en algunos pacientes y
dirigido contra IgG humana) y conglutinina (una proteína
del suero vacuno); todas ligan complejos inmunitarios. Estas
sustancias se pueden aplicar a las celdillas de la microplaca
de la manera descrita para los ensayos de ELISA en general
y las sustancias fijan después cualquier complejo inmunitario
presente en la muestra del paciente; entonces se determina la
naturaleza del complejo con un anticuerpo marcado por me-
dios enzimáticos contra los antígenos de interés. Muchos de
los informes sobre el uso de esta clase de análisis son en la
actualidad experimentales, pero ofrecen rapidez y economía
y muestran ser más sensibles que los métodos ya descritos.
Tal vez se empleen con regularidad en el futuro.
Otras pruebas
Pruebas cromatográficas
Como se describió con anterioridad, se puede utilizar la
detección del antígeno de los microorganismos como un
164 CAP. 15 OTRAS PRUEBAS EN BACTERIOLOGÍA
marcador de su presencia en una infección. De la misma
forma, la detección de metabolitos de los agentes pató-
genos se utiliza para señalar la presencia del microorga-
nismo. La identificación de los metabolitos se realiza por
cromatografía de gas-líquido o cromatografía líquida de
alta resolución, aunque la primera representa el ejemplo
de diagnóstico mejor conocido.
La cromatografía de gas-líquido se utiliza para separar
e identificar ácidos grasos volátiles y no volátiles al hacer
pasar una muestra a través de una sustancia de separación
conveniente (p. ej., Chromasorb) mediante un flujo de gas
acarreador. Los diferentes ácidos grasos se separan en
tiempos diferentes. Una aplicación temprana fue la identi-
ficación del arabinitol en el suero de individuos con infec-
ción sistémica por Candida albicans. De manera inicial se
pensó que las concentraciones elevadas de este metabolito
se vinculaban sólo con esa infección, pero investigaciones
subsecuentes probaron que la medición fue un marcador
diagnóstico poco confiable. Se afirma que la presencia de
esos microorganismos en pus y exudados puede determi-
narse de modo directo, aunque no es práctica común utili-
zar el método en muestras de rutina. Más acertado ha sido
el uso del método para identificar y clasificar bacterias
anaerobias, en particular patógenos gramnegativos.
Pruebas de respiración
Estas pruebas no invasivas se han empleado para identi-
ficar Helicobacter pylori, ahora reconocido como causal
de úlceras duodenales. H. pylori tiene una enzima de gran
alcance, la ureasa, que puede hidrolizar la urea marcada
de forma radiactiva e ingerida para liberar el CO2 marca-
do; a continuación se mide en la respiración exhalada. Para
la prueba se usan dos isótopos, 13C y 14C: el primero es
más seguro pero más costoso que el segundo. Las pruebas
son semicuantitativas, y puesto que la urea se distribuye a
lo largo del estómago, no hay error de muestreo. La sen-
sibilidad y la especificidad de estas pruebas se comparan
bien con el cultivo y la histología. Las pruebas se pueden
emplear para el diagnóstico de H. pylori o supervisar la
respuesta al tratamiento.
Desarrollos futuros
Existen varios desafíos en el área general de la serología.
El primero es tratar la cuestión de la velocidad de los re-
sultados. Un resultado lento (es decir, varios días) es de
interés académico o inútil en términos del diagnóstico y el
tratamiento de la infección. Es claro que el antígeno o la
detección del complejo inmunitario específico del antígeno
ofrecen una vía más rápida para el diagnóstico respecto del
reconocimiento del anticuerpo y por lo tanto es deseable el
desarrollo de estos análisis.
Además, el antígeno y los análisis del complejo inmuni-
tario específico del antígeno pueden ser por completo cuan-
titativos, y utilizados de forma correcta con mediciones
seriadas, pueden valorar la gravedad de cualquier infección
y la respuesta a la terapéutica. No deja de ser decepcionan-
te que estos métodos se usen hasta la fecha casi siempre de
manera cualitativa; en el futuro se espera más un cambio
de esta posición que las mejoras de la tecnología.
Un desafío real para el futuro es la aplicación de algu-
nos de los métodos mencionados a las infecciones conse-
cutivas a patógenos comensales. Existen muchos casos,
pero el diagnóstico y el control de la infección grave por
Escherichia coli sirven como ejemplo útil. Las técnicas
convencionales son con frecuencia inútiles y los métodos
de PCR, como se emplean hoy día, tienen poco qué ofrecer
porque sólo identifican la presencia del microorganismo.
El reto consiste en saber lo que hace el agente patógeno.
En consecuencia, el futuro debe enfocarse en la cuanti-
ficación cada vez más compleja del antígeno, se halle éste
libre o en complejos; es probable que los inmunosensores
o sus equivalentes participen en este desarrollo. Dado que
la mayor parte de los métodos serológicos depende de la
interacción antígeno-anticuerpo y ésta ocurre en el lapso
de minutos, es sorprendente que casi todas las pruebas dis-
ponibles tomen varias horas y deban utilizar suero aislado.
Los métodos que pueden cuantificar el antígeno micro-
biano dentro de cinco minutos, mediante secreciones de
sangre completa o del cuerpo, son antiguas y su desarrollo
representa un verdadero desafío para el futuro.
Lecturas adicionales
Collee IG, Marmion BP, Fraser AG, Simmons A (eds). Mackie
& McCartney’s Practical Medical Microbiology, 14th edn.
1996: Churchill-Livingstone, Edinburgh and London.
Korpi M, Leinonen M. Pneumococcal immune complexes in the
diagnosis of lower respiratory infections in children. Pediatr
Infect Dis J 1998; 17: 992-995.
Laperche S, Le Harrec N, Simon N, Bouchardeau F, Defer C,
Maniez-Montrecial M et al. A new HCV core antigen assay
based on dissociation of immune complexes: an alternative to
molecular biology in the diagnosis of early HCV infection.
Transfusion 2003; 43: 958-962.
 16
Control de la quimioterapia antimicrobiana
Ian M Gould
Introducción
Puede afirmarse que la era moderna de la quimioterapia
empezó hace más de 100 años con el trabajo pionero de
Robert Koch; él y otros describieron la teoría del germen
de la enfermedad que permitió el desarrollo del concep-
to de “balas mágicas”, es decir, agentes que destruían a los
microbios sin dañar al huésped. Las primeras sustancias,
derivadas del mercurio, antimonio y arsénico, demostraron
ser muy tóxicas para su uso general, aunque encontraron un
papel marginal en el tratamiento de la sífilis. Desde enton-
ces se hicieron grandes avances en la mayor parte de las
áreas de la quimioterapia antimicrobiana, pero los deriva-
dos de estos primeros agentes todavía se emplean para cier-
tas enfermedades parasitarias, como la leishmaniosis y la
enfermedad del sueño.
En el decenio de 1930, industriales y científicos alema-
nes trabajaron juntos para crear los primeros antimicro-
bianos modernos, las sulfamidas, medicamentos derivados
de los colorantes. A éstas les siguió en poco tiempo el descu-
brimiento de los antimicrobianos naturales (antibióticos),
como la penicilina (que descubrió en realidad Alexander
Fleming en 1928, aunque primero se usó para tratar las in-
fecciones durante la Segunda Guerra Mundial). Al princi-
pio el fármaco era tan escaso que los médicos recolectaban
la orina de los pacientes tratados para extraer la “droga del
milagro” y reutilizarla en otros enfermos.
En consecuencia, la era de la quimioterapia, tal y como
se entiende ahora, comenzó durante los decenios de 1940,
1950 y 1960, lapso en el que se hicieron grandes avances
con los descubrimientos de nuevos antibióticos, se apren-
dió a sintetizarlos y se elaboraron fármacos por completo
nuevos, como las quinolonas.
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker,
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
Los primeros postulados de la quimioterapia
Desde la década de 1940 se comprendió que los diversos
antibióticos actuaban de forma sinérgica con las bacterias
de diferentes maneras, de tal modo que podía afectarse el
régimen posológico óptimo. Un decenio más tarde resultó
evidente la resistencia a casi cualquier antibiótico desa-
rrollado después de su uso prolongado. Las primeras apli-
caciones clínicas de estos dos principios fundamentales de
la ciencia de la quimioterapia tuvieron lugar en el trata-
miento de la tuberculosis, una enfermedad con una inciden-
cia anual y un índice de mortalidad medidos en millones.
El principio original del control de la terapia aprendido
en esos primeros días fue la aplicación del conocimiento
sobre los parámetros de dosis y respuesta (farmacodinámi-
cos) de la interacción antimicrobiano-microbio, que con-
dujo al tratamiento intermitente (dos veces por semana)
con rifampicina e isoniacida. Esto fue factible debido al
efecto supresor prolongado de estos antimicrobianos so-
bre el crecimiento del bacilo tuberculoso mucho después
de la excreción de los fármacos y permitió la indicación de
regímenes terapéuticos de uso más fácil, lo que se tradujo
en notorias mejorías. Esta supresión prolongada del creci-
miento se conoce como “efecto posantibiótico”.
Cuando se elaboró el primer fármaco antituberculoso, la
estreptomicina, se reconoció que la respuesta inicial con-
ducía a la recaída después de algunas semanas debido a que
las bacterias sobrevivientes se tornaban resistentes al mis-
mo. En efecto, ahora se entiende que la terapia simultánea
con tres fármacos activos (terapia triple) es esencial para
la remisión de la tuberculosis sin el riesgo del desarrollo
de cepas resistentes. Éste es el segundo principio, de suma
relevancia para el tratamiento antimicrobiano de muchas
166 CAP. 16 CONTROL DE LA QUIMIOTERAPIA ANTIMICROBIANA

infecciones, e ilustra cuán necesaria resulta la prueba pri-
maria de la sensibilidad de los aislados como guía tera-
péutica. El uso habitual de esas pruebas de sensibilidad
por los laboratorios de diagnóstico clínico empezó en ese
momento (finales del decenio de 1950 y principios del de
1960) y ahora tienen un uso extendido en todo el mundo.
La observancia de la terapia es otro principio importan-
te del control de la quimioterapia, aprendido en aquellos
primeros días del tratamiento de la tuberculosis, y es en
particular importante para las enfermedades en las que la
curación depende de la terapia prolongada (seis a 18 me-
ses). Para mala fortuna, muchas de las víctimas de la tu-
berculosis provenían de estratos sociales empobrecidos,
lo que hacía difícil la observancia terapéutica. Pronto se
conoció que el tratamiento fracasaba con frecuencia en esta
situación, a menudo debido al desarrollo de microorganis-
mos resistentes. Por lo tanto, ganó aceptación la terapia de
observación directa. De manera alternativa, puede anali-
zarse la orina de los enfermos para reconocer la presencia
de fármacos excretados. En fecha reciente, estas lecciones
básicas tuvieron que reaprenderse en Nueva York, en don-
de los recortes de los servicios sociales y médicos condu-
jeron a la cesación de la terapia de observación directa, lo
que propició un enorme brote de tuberculosis multirresis-
tente con un alto grado de letalidad.
Resistencia antibiótica (cuadro 16-1)
Desafortunadamente, el propio éxito de la quimioterapia
antimicrobiana condujo a su declinación. Los médicos y
pacientes consideran a los antimicrobianos como una pana-
cea que cura toda afección, así que los antimicrobianos se
prescriben de manera irrestricta. Este sobreuso se vincula
de forma inextricable con la resistencia, bajo la forma de
un fenómeno de selección natural que permite la supervi-
vencia de cepas resistentes. La mayor parte de la población
del mundo puede comprar antibióticos legal o ilegalmente,
aunque en muchos países están disponibles sólo con rece-
ta médica. Estos medicamentos representan una industria
mundial multimillonaria y se ha creado un gran mercado
negro con estos fármacos. Los habitantes del Tercer Mun-
do, que requieren los antibióticos con más frecuencia de-
bido a sus índices de infección muy elevados, no pueden
permitirse el consejo médico apropiado, las pruebas de la-
boratorio o los cursos completos de tratamiento necesarios
para erradicar las infecciones; en consecuencia, la resis-
tencia antibiótica es un problema particular en estas áreas
del mundo, sobre todo en las zonas urbanas necesitadas.
Incluso en los países ricos de Europa occidental y Nor-
teamérica, los clínicos emplean mal los antimicrobianos y
en los últimos 10 años se han identificado tendencias muy
preocupantes de la resistencia. El mal uso incluye prescrip-
ciones en las cuales el agente, la dosis, la duración o la vía
de administración no se indican o son incorrectos. Mien-
tras que el uso ejerce una presión acumulativa sobre la se-
lección de cepas resistentes (casi siempre por mutación o
adquisición de plásmidos resistentes) en los planos indi-
vidual y social, las dosis bajas por periodos prolongados
suscitan resistencia con más probabilidad que el mismo
peso total del fármaco administrado como una dosis más
alta por un periodo más corto. Ante esta situación, muchos
países han introducido campañas educativas públicas y
profesionales. Las del Reino Unido han sido en especial
exitosas en la reducción del uso de antibióticos por la co-
munidad, aunque la utilización hospitalaria continúa quizá
en aumento y prosiguen todavía los problemas principales
de la resistencia, como el caso del multirresistente Staphy-
lococcus aureus.

Cuadro 16-1 Tendencias en los niveles de resistencia (%)

1997 2003
Reino Unido Sur de Europa Reino Unido Sur de Europa

Penicilina/neumococos 10 50 5 50
Penicilina/meningococos 0 40 0 40
Staphylococcus aureus multirresistente 5 75 40 75
Glucopéptido/enterococos 1 5 5 10
Ciprofloxacina/E. coli 2 15 8 30
Gentamicina/Pseudomonas 3 40 7 50
Ceftacidima/Klebsiella 1 20 10 40
Amoxicilina/Haemophilus 20 30 15 40
Amoxicilina/Moraxella 80 80 95 95
Ciprofloxacina/Campylobacter 1 40 10 60
 PRINCIPIOS GENERALES DEL CONTROL DEL LABORATORIO DE LA QUIMIOTERAPIA
Principios generales del control
del laboratorio de la quimioterapia
En la actualidad existen más de 100 antibióticos autoriza-
dos para uso clínico en el Reino Unido y muchos más a
escala mundial. El papel principal del laboratorio de diag-
nóstico de un hospital consiste en definir a los agentes
patógenos causantes de la enfermedad en pacientes cuyas
muestras se procesan y, en la medida de lo posible, some-
ter el aislado a prueba para determinar la sensibilidad con
antibióticos relevantes. En condiciones normales, la prueba
se realiza sólo en relación con una serie limitada y prede-
terminada de antibióticos con importancia clínica para la
infección y, de manera presumible, activos contra el agen-
te patógeno aislado.
El proceso para determinar los antimicrobianos que se
someten a análisis es complejo y debe considerar facto-
res como el sitio y la gravedad de la infección, el método
de excreción o el metabolismo del antimicrobiano, la fun-
ción hepática y renal del paciente, la toxicidad, las vías de
administración disponibles, el costo, la necesidad de una
terapia de combinación, el beneficio clínico probado, el
tratamiento actual con antimicrobianos u otros fármacos
y las interacciones del agente. Aunque hay cerca de 100
antimicrobianos autorizados en el Reino Unido, éstos se
componen sólo de algunas docenas de clases de fármacos
diferentes y a menudo basta probar un agente representati-
vo de cada clase.
Muchas veces los pacientes iniciaron ya el tratamiento
empírico, antes de contar con los resultados del cultivo y la
sensibilidad, con la esperanza de que el laboratorio confir-
me las muestras. No obstante, aún es importante procesar
los especímenes a la brevedad posible y, en caso de que
el tratamiento necesite modificarse a la luz de los resulta-
dos del cultivo y la sensibilidad, se prescribe un agente
más potente o menos tóxico. De igual modo, es importante
trasladar con propiedad las muestras y establecer una bue-
na comunicación para obtener con facilidad un dictamen
y que éste se transmita con rapidez. También es útil para
que el laboratorio publique los resúmenes de las sensibi-
lidades a varios microorganismos, los clínicos elijan la te-
rapia empírica más adecuada y los laboratorios participen
en los esquemas de vigilancia con objeto de proporcionar
la advertencia oportuna de la aparición de variantes raras
o nueva resistencia. Esto permite a los médicos y funcio-
narios de salud pública utilizar la información y planear
el tratamiento apropiado, además de contener la expansión
de estas nuevas variantes resistentes; cabe señalar que en el
mundo moderno la propagación de un país a otro o de un
continente a otro toma muy poco tiempo (fig. 16-1).
Existen otras maneras mediante las cuales el laboratorio
puede dirigir o controlar de manera provechosa la terapia
167
Figura 16-1 Un ejemplo de un paciente con notable inmunosu-
presión que sufre infección en piel y ojo por Pseudomonas, con la
circulación sanguínea extendida, después de recibir terapia contra
el cáncer que redujo las defensas del cuerpo contra la infección.
Alguna vez este tipo de infección mataba a los pacientes; en la
actualidad, el tratamiento con antibióticos modernos suele tener
éxito. Sin embargo, cada vez son más comunes estos individuos a
medida que la medicina moderna es más exitosa y radical. Por lo
tanto, los antibióticos se utilizan cada vez más, tanto en el hospital
como en la práctica general.
antimicrobiana. La más importante es la medición de las
concentraciones sanguíneas, y en ocasiones hísticas, de los
fármacos, para asegurar que se obtienen los valores tera-
péuticos adecuados en pacientes muy graves; de ese modo
puede asegurarse una toxicidad reducida al mínimo o nula.
Estas mediciones no son necesarias en la mayoría de los
pacientes, sólo en aquellos en quienes es necesario utilizar
los antimicrobianos en una proporción terapéutica redu-
cida, es decir, agentes cuyas dosis efectivas necesarias se
aproximan a las que pueden ser tóxicas. Los aminoglucósi-
dos y los glucopéptidos son los ejemplos más obvios de es-
tos grupos de antibióticos. El uso de dichos medicamentos
en particular tóxicos debe reservarse para las infecciones
graves en las cuales la elección de agentes activos está li-
mitada, a menudo por problemas de resistencia.
No se solicita con frecuencia la medición de la actividad
antimicrobiana en el paciente, pero se logra con facili-
dad al medir la actividad inhibitoria o cidal del an-
timicrobiano en el suero; para ello se toman casi siempre
muestras antes de administrar una dosis (nivel mínimo) y
una hora después (nivel máximo). Por lo regular, la distri-
bución del antimicrobiano en los tejidos es completa para
entonces. Según sean la farmacodinamia del antimicro-
biano y el estado de la enfermedad, puede ser importante
alcanzar niveles inhibitorios o cidales altos en los puntos
máximos de la muestra; por ejemplo, los aminoglucósidos,
como la gentamicina, tienen una actividad dependiente
de la concentración. En cambio, en los lactámicos beta es
importante tener actividad durante el periodo completo de
dosificación debido a su carencia de un efecto posantibió-
tico contra muchas bacterias (dependencia del tiempo).
En individuos muy enfermos suele ser útil evaluar be-
neficios potenciales de la terapia de combinación en el la-
168 CAP. 16 CONTROL DE LA QUIMIOTERAPIA ANTIMICROBIANA
boratorio para predecir los regímenes más activos. Estas
pruebas pueden ser útiles, sobre todo en la fibrosis quística
y en los sujetos inmunosuprimidos o con infecciones como
endocarditis o meningitis, casos en los que es necesario
aniquilar al microbio con los antibióticos sin la ayuda del
sistema inmunitario del huésped.
Comprobación de la sensibilidad
El concepto de prueba de sensibilidad se ha conservado
desde que se introdujo a una escala amplia hace casi 40
años. Por necesidad, las pruebas deben ser simples, ya
que un laboratorio clínico que atiende a una población de
250 000 sujetos efectúa las técnicas en cientos de microor-
ganismos cada año. Pese a su simplicidad, las pruebas han
resultado de suma utilidad durante años para orientar la te-
rapia. Esto es lo que más sorprende cuando se considera
la complejidad de los casos individuales, en los cuales el
microbio interactúa con el sistema inmunitario del huésped
en diversas afecciones, quizá sin relación con el trastorno
sometido a prueba en el laboratorio.
Existen cuatro métodos para la prueba de sensibilidad
de uso común: a) difusión en agar (fig. 16-2); b) incorpora-
ción en agar; c) macrodilución en caldo, y d) microdilución
en caldo. El primero es el más usado en el Reino Unido (en
cerca de 85% de los laboratorios es el método habitual). En
este método, las cantidades escrupulosamente controladas
de los antibióticos se alojan en discos de papel; éstos se
colocan de manera previa en una superficie de la placa de
agar inoculada con un número controlado de las bacterias
sometidas a análisis. Por lo regular se prueban hasta seis
antibióticos por placa. Las placas se incuban en condicio-
nes controladas por 18 a 48 horas, según sea el índice de
crecimiento bacteriano. Se miden las zonas de inhibición
del crecimiento por acción del antimicrobiano difundido y
se relacionan con las bacterias sensibles y resistentes cono-
cidas del control. Los resultados se informan como “sen-
sibles” o “resistentes”, con base en el conocimiento de la
farmacocinética específica de cada antimicrobiano, inclui-
das las concentraciones alcanzadas del fármaco en el sitio
de la infección. Muchos laboratorios del Reino Unido han
adoptado en fecha reciente los métodos de difusión en agar
con disco, mucho más estandarizados, con objeto de per-
mitir una comparación más exacta de los resultados para
propósitos de vigilancia (British Society for Antimicrobial
Chemotherapy y National Committee for Clinical Labora-
tory Standards; véanse las Lecturas adicionales).
De manera alternativa, en la dilución en agar, las concen-
traciones preestablecidas de un antimicrobiano se incluyen
en placas de agar antes de que se vierta y entonces, cuando
se solidifica, las bacterias se “observan” sobre la superficie.
Hasta 30 microbios pueden probarse con un solo agente
Figura 16-2 Un ejemplo de las pruebas de sensibilidad por
disco. Éste es el método más común que prueba la sensibilidad
en el Reino Unido. La zona de inhibición del crecimiento de bac-
terias del huésped se determina por la concentración del antibiótico
en cada uno de los discos de papel y la sensibilidad de la bacteria.
En este ejemplo la bacteria es totalmente resistente a cuatro anti-
bióticos. Hay zonas pequeñas de inhibición alrededor de dos discos
(la bacteria es aún resistente) y zonas grandes de la inhibición al-
rededor de otros dos discos (sensibles). Este ejemplo de un agente
patógeno multirresistente es cada vez más común. La zona impar,
no circular, de la inhibición de dos discos se debe a que el disco
adyacente entre ellos contiene un antibiótico que interactúa con
ellos, lo cual da lugar al antagonismo de la acción (intercepción) y
la sinergia (forma de campana), respectivamente.
por placa. La concentración más baja del antimicrobiano
que inhibe el crecimiento visible de las bacterias después
de la incubación es la concentración inhibitoria mínima
(CIM).
Las pruebas de dilución en caldo para la sensibilidad
antimicrobiana se realizan en tubos de ensayo (macrodi-
lución) o placas de microtitulación (microdilución). Se in-
cuba, a las concentraciones conocidas del antimicrobiano,
un inóculo controlado de manera cuidadosa del microbio
que se prueba; éste, a diferencia de la prueba en agar, puede
ser un virus (si se incluye una variedad celular) o ciertos
hongos o parásitos protozoarios, como los parásitos del
paludismo, además de las bacterias. La CIM es la concen-
tración más baja que inhibe el crecimiento (según lo reve-
la la turbiedad a simple vista). Casi siempre es adecuado
evaluar sólo los valores del antimicrobiano que inhibe el
crecimiento; el sistema inmunitario del huésped permite la
curación al destruir a la mayor parte de los microbios des-
pués de someterse a control por el antimicrobiano.
 AUTOMATIZACIÓN
A diferencia de las pruebas de agar, las concentraciones
bactericidas mínimas (CBM) pueden evaluarse si se crea
un subcultivo de las concentraciones inhibitorias para bus-
car cualquier sobreviviente. La concentración más baja con
la eliminación de 99.9% del inóculo original es la CBM.
Para las infecciones complicadas puede ser importante es-
tablecer los valores para agentes patógenos individuales y
cerciorarse de que dichos niveles de actividad se logran en
el paciente.
Las pruebas de CIM, y algunas veces de CBM, se soli-
citan aun en el tratamiento de infecciones difíciles, como la
endocarditis y la osteomielitis.
Pruebas con microbios diferentes de las bacterias
La comprobación de la sensibilidad para microbios dis-
tintos a las bacterias es, por comparación, muy limitada.
Hasta hace poco tiempo las investigaciones relativas eran
escasas, tal vez debido a la ausencia relativa de antimi-
crobianos eficaces para muchos de estos microbios. Esto
suponía que no había opción terapéutica en caso de resis-
tencia. Desde luego, también se han soslayado de cierta
manera los problemas de resistencia. No obstante, en la
actualidad se observa una verdadera explosión de nuevos
agentes, en particular antimicóticos y antivíricos, en res-
puesta a las necesidades crecientes generadas por nuevas
enfermedades, como el SIDA. Esta enfermedad no sólo re-
quiere terapia antivírica específica para el virus HIV, sino
también tratamiento para muchas otras infecciones víricas,
micóticas, bacterianas y protozoarias, a las cuales pueden
ser más susceptibles los pacientes.
Es frecuente prescribir terapia antimicrobiana supresora
en los pacientes con HIV por muchos meses o años, pues-
to que en virtud de la profunda inmunosupresión, es casi
imposible erradicar los microbios de la infección. Éste es
un ejemplo claro de la aparición de resistencia, como su-
cedió con la tuberculosis; éstas son también lecciones para
mejorar la eficacia terapéutica y prevenir la aparición de
la resistencia y, sin duda, serán de utilidad para idear un
tratamiento apropiado del SIDA.
La resistencia es un problema particular en la terapéu-
tica de la infección vírica primaria por HIV; en ésta, para
el momento en que la enfermedad se hace evidente, se ad-
vierte una carga vírica enorme con capacidad de desarro-
llar mutantes resistentes naturales que pueden sobrevivir a
la terapia y multiplicarse. Ahora que ya están disponibles
nuevos agentes anti-HIV, la detección de esas cepas será
importante en el futuro, de tal modo que pueda individuali-
zarse la mejor terapia de combinación para cada paciente.
Los recientes desarrollos han permitido la averiguación
de CIM de bacterias y hongos en placas con agar mediante
el uso de pruebas E®, que contienen gradientes antimicro-
169
Figura 16-3 Un ejemplo de la prueba “E” ® para la comprobación
de la sensibilidad. Las concentraciones graduadas de un antibiótico
se incluyen en cada una de las tiras plásticas. Un “microorganis-
mo control” de sensibilidad conocida se coloca en el exterior de
cada tira y el agente patógeno de la prueba en el interior. En este
caso el microorganismo “prueba” es muy resistente. El grado de
resistencia o CIM (véase el texto) puede leerse fuera de la tira.
bianos en tiras plásticas, y el valor inhibitorio puede leerse
después de la incubación, casi de la misma forma como se
interpretan las zonas de inhibición en la prueba típica de
difusión en agar con disco (fig. 16-3).
Automatización
Mientras la automatización se generaliza en los labora-
torios, se llevan a cabo tentativas para adaptar los méto-
dos de prueba existentes para la sensibilidad. Las pruebas
de microdilución en caldo son tal vez las más favorables
para la modificación y las placas prepreparadas disponibles
pueden interpretarse de modo automático por espectrofo-
tometría. La lectura automatizada de las zonas con inhibi-
ción en las pruebas de difusión en agar con disco también
es promisoria en cierto grado.
Los métodos más recientes para comprobar la sensibili-
dad son mucho más susceptibles a la automatización y, en
realidad, a menudo la requieren. Éstos incluyen la nefelo-
metría, la bioluminiscencia, la impedancia o vigilancia de
la conductancia y la citometría de flujo. Mientras estos mé-
todos “directos” no suministren resultados rápidos (dentro
de una a dos horas) acerca de la actividad inhibitoria y qui-
zás también de la actividad cidal de los antimicrobianos,
por el momento sólo son técnicas de investigación.
Muchos de los valores séricos de los antimicrobianos
se cuantifican de rutina por métodos automatizados, por
170 CAP. 16 CONTROL DE LA QUIMIOTERAPIA ANTIMICROBIANA

ejemplo EMIT® y TDX®, que utilizan reacciones y fluo-
rescencia enzimáticas. Los valores de los antimicrobianos
más recientes se pueden analizar por cromatografía líquida
de alta resolución o por la técnica tradicional con placa,
en la cual el suero o la muestra hística del paciente toman
el lugar del disco que contiene el antibiótico en la prueba
de difusión en agar con disco y el campo del organismo se
convierte en una cepa control sensible. Es posible utilizar
la concentración del fármaco en el suero (volumen cono-
cido) o el tejido (peso conocido) y el tamaño de la zona de
la inhibición para calcular la concentración del fármaco.
En tanto el análisis de los valores séricos de ciertos anti-
microbianos no se transforme en una prueba de rutina, el
análisis de las concentraciones hísticas es sólo una técnica
de investigación.
Control del hospital y enlace clínico
La base del conocimiento adquirido a partir del trabajo en
el laboratorio se puede emplear para coordinar el trabajo
de varios grupos de personas relacionadas con la infección
que trabajan en la comunidad y los hospitales. Entre estos
individuos figuran el equipo de enfermeras y médicos del
control de la infección, además de los clínicos de la salud
pública encargados del control de la infección en la co-
munidad. Con una alerta oportuna es posible prevenir con
eficacia los brotes. La infección adquirida en el hospital es
muy común (quizá cerca de 10% de los pacientes admiti-
dos), de manera tal que cualquier información sobre pre-
vención y actualización de los últimos microorganismos
epidémicos puede prevenir muchas infecciones y limitar el
uso inadecuado de los antibióticos.
Es útil el conocimiento de los patrones locales de sensi-
bilidad con objeto de que los médicos establezcan el trata-
miento empírico de la infección, aunque la comunicación
rápida de los resultados de pacientes individuales también
es relevante para orientar la terapia antimicrobiana a par-
tir de una base racional. La mayor parte de los hospitales
y algunas prácticas generales han redactado lineamientos
correspondientes; asimismo, los datos de sensibilidad que
ponen a disposición los laboratorios locales crean una base
útil para diseñar estas pautas y proporcionan las recomen-
daciones locales para instituir el tratamiento empírico más
apropiado. Está probado que ello evita la exposición inne-
cesaria a los antibióticos, algunos de ellos costosos y tóxi-
cos, y mejora el resultado del paciente.
El laboratorio también debe ser una plataforma para la
educación de clínicos y público acerca del mejor uso de
los antimicrobianos. Este tema apenas si se toca entre los
estudiantes universitarios y todavía constituye un campo
complejo; además, la cantidad de fármacos crece de for-
ma constante, lo cual hace cada vez más difícil que el clí-
nico los prescriba de forma apropiada. En fecha reciente
se ha propuesto que los estudiantes universitarios y pos-
graduados enseñen la terapia antimicrobiana (www.bsac.
org.uk). Otra manera de reducir la exposición antibiótica
consiste en disminuir la cantidad de agentes notificados a
sólo aquellos que parecen más apropiados (quizá dos o tres)
o no divulgar ninguna sensibilidad para aislados que care-
Cuadro 16-3 Nuevos antibióticos (2003)
Grampositivos Respiratorios
Sinercida Cetólidos
Linezolida Quinolonas
Daptomicina
Dalbavancina De amplio espectro
Ortavancina Tigeciclina
Iclaprima Ertapenem
Cefalosporinas anti-PBP2’

Cuadro 16-2 Prescripción de antibióticos: tipos de intervención y administración

Educativa Reguladora Organizacional Estructural Restrictiva

Lineamientos* Reembolso Equipos Prescripción Listas limitadas,
(ACUERDO) multidisciplinarios computarizada formularios
Sustitución terapéutica
(incluido el cambio)
Programas Formas de orden Ciclismo
Detalles de extensión/ Pruebas/informes del
académicos* límite de sensibilidad
Auditoría/ Fechas de suspensión
retroalimentación* automática
Talleres interactivos*

* Revisión de Cochrane.
 CONCLUSIÓN
cen de relevancia clínica. Sin embargo, estas medidas no se
han evaluado de manera adecuada y confían demasiado en
la información que suministra el médico al laboratorio. El
cuadro 16-2 enumera las medidas actuales aplicadas para
mejorar la administración antimicrobiana. La base de la
evidencia para tales conductas se revisa con frecuencia, sea
en los hospitales o en la comunidad (www.cochrane.org).
Es importante redoblar los esfuerzos para limitar el uso in-
adecuado del antibiótico. Esto resulta más importante, ya
que en una reunión europea reciente se confirmó que varias
compañías farmacéuticas importantes suspendieron o re-
dujeron la investigación en antibióticos. La aparición de
nuevos y prometedores antimicrobianos se ha restringido
en comparación con 30 años antes (cuadro 16-3). Sólo se
introdujo una clase nueva por completo de antimicrobianos
en los últimos 40 años.
Conclusión
Pasteur o Fleming no se expondrían a ningún apuro en un
laboratorio diagnóstico del hospital común en estos años.
No se han observado grandes avances en los métodos de
prueba, no los imaginables si se considera el trabajo actual
de la genética microbiana. Este trabajo ha incrementado
en gran proporción el conocimiento y entendimiento de
los mecanismos resistentes y, sin duda alguna, tendrá un
efecto en la manera de probar la resistencia en el laborato-
rio de diagnóstico en los próximos 10 o 20 años. Incluso
ahora, los laboratorios más grandes pueden probar directa-
mente por sonda de DNA una pequeña selección de genes
resistentes, como el mec A que convierte a Staphylococcus
aureus en un supermicrobio resistente a todos los antimi-
crobianos lactámicos beta. De forma similar, se prueba de
rutina la presencia de enzimas lactámicas beta en algunas
bacterias en vez de evaluar la expresión fenotípica de estas
enzimas (que puede ser difícil por métodos de prueba tradi-
cionales para la sensibilidad). Desde luego, las pruebas ge-
notípicas directas se utilizarán de modo más extenso en el
futuro, dado que delinean el perfil de resistencia potencial
de un microorganismo, en vez de su resistencia al momen-
to de la comprobación y bajo las artificiales condiciones
experimentales del laboratorio. Por otra parte, el progreso
para establecer estas nuevas pruebas en los laboratorios de
diagnóstico ha sido lento.
Éste es un perfil optimista y realista del papel futuro del
laboratorio en este campo. Empero, no es posible ayudar
sin ser pesimista acerca del potencial de las bacterias para
tornarse resistentes a todos los antimicrobianos, a menos
que se administren de modo mucho más cuidadoso. El des-
171
cubrimiento de los mecanismos de los microbios, según lo
atestigua el uso de los integrones, transposones, operones,
regulones, sinergones, etc., indica que los microbios son
muy adaptables y están casi siempre cuando menos un
paso adelante de la batalla microbiana-antimicrobiana.
Lecturas adicionales
British Society for Antimicrobial Chemotherapy. Antimicrobial
susceptibility testing. BSAC Working Party Report, Journal
of Antimicrobial Chemotherapy 2001; 48: S1.
European Union Conference. The Microbial Threat; The Copen-
hagen Recommendations. September 1998: Danish Ministry
of Health and Ministry of Food, Agriculture and Fisheries.
Finch RG, Greenwood D, Norrby SR, Whitley RJ. Antibiotics
and Chemotherapy, 8th edn. 2003: Churchill Livingstone,
Edinburgh.
Garrett L. The Comming Plague. 1995: Penguin Books, Har-
mondsworth.
Gould IM, van der Meer JWM. Antibiotic Policies: Theory and
Practice. 2005: Kluwer Academic/Plenem Publishers, New
York.
House of Lords Select Committee on Science and Technology 7th
Report. The Resistance to Antibiotics and Other Antimicrobial
Agents. 1997-1998: The Stationary Office, London.
Kucers A, Bennett NM. The Use of Antibiotics, 4th edn. 1987:
Heinemann Medical, Oxford.
Levy SB. The Antibiotic Paradox, 2nd edn. 2002: Perseus, Cam-
bridge.
Lorian V. Antibiotics in Laboratory Medicine, 4th edn. 1996:
Williams & Wilkins, Baltimore, MD.
Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing,
Twelfth Informational Supplement. 2002: NC CLS, 940 West
Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898, USA.
Standing Medical Advisory Committee Sub-group on Antimicro-
bial Resistance. The Path of least Resistance. 1998: Depart-
ment of Health, London.
World Health Assembly Resolution. Emerging and Other Com-
municable Diseases: Antímicrobial Resistance, 16 May 1998:
WHA 51.16.
World Health Organization. The current status of antimicrobial
resistance in Europe. Report of a WHO work-shop held in co-
llaboration with the Italian Associazione Culturale Microbio-
logia Medica, Verona, Italy, 12 December 1997. WHO/EMC/
BAC/98.1. WHO, Geneva.
World Health Organization. The medical impact of the use of an-
timicrobials in food animals. Report of a WHO meeting, Ber-
lin, Germany, 1997. WHO/EMC/ZOO/97.4. WHO, Geneva,
pp 13-17.
 SECCIÓN 4
MICROBIOLOGÍA
Virología, Micología
y Parasitología

KWWSERRNVPHGLFRVRUJ
 17
Microscopia en virología:
aplicación y preparación de la muestra
Marie M Ogilvie
Introducción
La microscopia de luz ha desempeñado un papel significativo
en la virología desde su uso más temprano en el examen de
las preparaciones teñidas de la célula o los cortes de tejido.
Hoy en día ningún microscopio se encuentra en la banca de
virología de muchos laboratorios de microbiología, pues-
to que el trabajo de diagnóstico regional general se basa en
el uso de los reactivos de inmunoensayo para la detección
del antígeno o anticuerpo víricos. Cada vez más, incluso
en el laboratorio de diagnóstico especializado en virus, la mi-
croscopia se emplea con menos frecuencia, mientras que los
métodos más sensibles de detección de virus, basados en la
amplificación del ácido nucleico por la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR), se introducen junto con métodos exis-
tentes de detección del antígeno. Sin embargo, en los prime-
ros años del nuevo milenio los microscopios son aún de uso
regular en el trabajo de diagnóstico de virología, ya que los
cultivos celulares se examinan para efectos citopáticos debi-
do al crecimiento del virus, y las células teñidas con reactivos
fluorocromomarcados se examinan para antígenos del virus.
Histopatología: cuerpos de inclusión
y células multinucleadas gigantes
El histopatólogo que examina frotis fijos teñidos de células
o cortes de tejido observa los cambios morfológicos carac-
terísticos que se vinculan con la presencia de infecciones es-
pecíficas de virus. Las más conocidas de estas características
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
distintivas son los cuerpos de inclusión —partículas acumu-
ladas de virus (como en el cuerpo de Negri común de la rabia)
o exceso de proteínas sintetizadas durante la replicación de
virus— y las células multinucleadas gigantes. Estas últimas,
una consecuencia de la fusión entre las membranas plasmáti-
cas de las células adyacentes, son una característica de infec-
ción con los virus envueltos, que poseen una glucoproteína que
induce la fusión independiente del pH en la superficie celular,
por ejemplo el virus sincitial respiratorio (RSV) y el virus de
la inmunodeficiencia humana (HIV). Los virólogos usan el
término sincitio (del griego, syn = unión) para tal célula. Los
virus del herpes simple (HSV) y la varicella-zoster (VZV)
producen células multinucleadas in vivo e in vitro (“en un
cuerpo viviente” y “en vidrio”, es decir, en cultivo). Aún se
da el nombre de Tzanck a los frotis de células preparados por
este método para obtener raspados de la base de una úlcera o
vesícula, que después se tiñen y examinan en busca de células
gigantes del herpes (HSV o VZV) (fig. 17-1).
El bien conocido cuerpo de inclusión “ojo de búho” visto
en las células infectadas con citomegalovirus (CMV) es una
inclusión intranuclear rodeada por un halo claro, dentro de
una célula considerablemente agrandada (megálica), aunque
sólo hay casi siempre un núcleo. El CMV puede producir
células multinucleadas gigantes in vivo; éstas son de origen
endotelial y su presencia en la circulación representa enferme-
dad sistémica grave. La evidencia de localización intracelular
de CMV es importante en la confirmación del significado
patológico del hallazgo de este virus, lo que no siempre pue-
de proporcionar el simple aislamiento del microorganismo.
176 CAP. 17 MICROSCOPIA EN VIROLOGÍA: APLICACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Figura 17-1 Corte de una lesión herpética de piel, teñido con
hematoxilina y eosina. La flecha señala una célula multinucleada
gigante. Cortesía del Dr. K McLaren, Department of Pathology,
University of Edinburgh.
Virología
El éxito del aislamiento del virus (por cultivo) o la detec-
ción de antígenos víricos en las células del material clíni-
co depende en gran medida de la obtención de la muestra
correcta, su manipulación apropiada y el uso de la gama
de cultivos celulares y sondas inmunofluorescentes más
convenientes para la detección del virus. No hay recursos
disponibles para el examen indirecto de cada virus posible,
aunque la inoculación de una gama de cultivos celulares
permite que cualquiera se pueda cultivar para su creci-
miento. Deben consultarse los textos normativos modernos
sobre el trabajo de diagnóstico para obtener detalles más
completos de los aspectos discutidos más adelante; uno de
ellos, el que editaron Mahy y Kangro (véanse las Lecturas
adicionales), proporciona una buena introducción para el
investigador.
Recolección y transporte de la muestra
Muchas infecciones son relativamente cortas respecto del
periodo de replicación vírica activa una vez que se manifies-
tan los síntomas, de modo que las muestras que contienen
el virus infeccioso y las células que expresan el antígeno se
obtienen mejor en los primeros dos a tres días de la enfer-
medad. El material debe contener células del sitio afectado:
células epiteliales de la parte posterior de la nariz y la gar-
ganta o la base de una úlcera. En lactantes, las secreciones
respiratorias se pueden recolectar por aspiración con un ca-
téter fino y en sujetos mayores por enjuague, pero las célu-
las recolectadas con una escobilla se colocan en un medio
de transporte de virus. Se puede utilizar cualquier líquido
isotónico amortiguado que contenga proteína estabilizadora
para preservar la infectividad y evitar la desecación de las
células. Las muestras no deben congelarse antes del proce-
samiento, pero deben trasladarse al laboratorio de virus tan
pronto como sea posible y mantenerse enfriadas sobre hielo
o en un refrigerador si hay algún retraso. Cuando el periodo
entre la recolección de una muestra y su inoculación en el
cultivo celular se reduce al mínimo, se aumenta el índice
de aislamiento y el virus se detecta en menos tiempo. Si no
es posible inocular las células apropiadas dentro del mismo
día, la muestra se puede guardar a 4°C toda la noche. Un
almacenamiento mayor para mantener la viabilidad debe
plantearse a temperaturas muy bajas, por lo general en un
ultracongelador a ⫺70°C. (Los congeladores más comu-
nes del laboratorio que funcionan a temperaturas de ⫺18 a
⫺20°C no son convenientes para la preservación del virus;
se observa un descenso considerable de la infectividad en
esos límites de temperatura.)
Procesamiento de la muestra e inoculación
de los cultivos celulares
Las formas de solicitud que acompañan a las muestras deben
indicar con claridad el carácter de la enfermedad, la fecha
de inicio, la naturaleza de la muestra, el sitio del cual se re-
colectó y la edad del paciente para efectuar investigaciones
apropiadas. El procesamiento de la muestra para la inocula-
ción de los cultivos celulares o la preparación de las células
para la tinción inmunofluorescente es casi siempre un pro-
cedimiento estandarizado, de acuerdo con la naturaleza de
la muestra. Los cultivos tienen que examinarse para cuales-
quiera de los efectos citopáticos (ECP: el cambio morfológi-
co celular resulta de la replicación del virus), sobre una base
diaria durante los primeros cinco días después de la inocu-
lación, para no perder algunas señales, aunque una “lectura”
posterior de los tubos en días alternos suele ser suficiente
para captar los cambios más graduales de los virus de creci-
miento más lento como el CMV y muchos adenovirus.
Requisitos para el diagnóstico rápido
de infecciones víricas
Pocos virus pueden identificarse en los cultivos celulares
de rutina en menos de tres días (el virus del herpes simple
es el único regular). Para la atención clínica son importan-
tes el control de la infección dentro de las salas del hospital
(y la terapia antivírica específica donde esté disponible),
la confirmación más temprana de un diagnóstico clínico o la
identificación de una infección insospechada. Con este fin,
las muestras apropiadas se examinan en forma directa para
reconocer evidencia de virus específicos, por microscopia
de inmunofluorescencia (IF) para infecciones respiratorias,
dérmicas y otras en las cuales las células infectadas se ob-
tienen con facilidad. Las secreciones respiratorias primero
 INMUNOFLUORESCENCIA 177

se deben diluir y lavar en una solución amortiguada salina Un periodo de incubación (en promedio de 15 a 30 min) en
para preparar las células epiteliales respiratorias (libres de una cámara húmeda permite al anticuerpo reaccionar con al-
moco) que puedan depositarse sobre el portaobjetos. Por gún antígeno específico de virus en las células. El anticuerpo
lo general se usan varios lugares o celdillas, pero una pre- separado se elimina al lavarlo con una solución salina amor-
paración citocentrifugada es útil y rápida si el agente pa- tiguada; antes, el portaobjetos se seca al aire y se monta para
tógeno de estudio es un virus predominante, como en una observarse en un microscopio especial con una fuente de luz
influenza epidémica o por RSV de temporada. Una vez que ultravioleta incidente. El líquido de montaje consiste en gli-
se secan al aire, los portaobjetos se fijan por inmersión en cerol de grado analítico (50%) en una solución salina amor-
acetona fría por 10 minutos, lo que asegura que las células tiguada de fosfato a un pH óptimo de 8.6 para maximizar
permanezcan sobre el portaobjetos, retengan antigenicidad la fluorescencia. Ésta se atenúa con rapidez al exponerse a la
y sean permeables al anticuerpo, aunque en la mayor parte irradiación ultravioleta, de modo que la observación prolon-
de los casos carecen de infectividad residual. gada no es recomendable y los registros fotográficos deben
obtenerse cuando se requieran.
Inmunofluorescencia
Virus respiratorios
En los decenios de 1980 y 1990 los laboratorios de diagnósti-
co de virus ampliaron su uso de la microscopia, en particular
La inmunofluorescencia directa es el procedimiento de IF
como una ayuda para el diagnóstico rápido de infecciones
más común en la virología diagnóstica para la detección
víricas. La disponibilidad comercial de los reactivos de alta
rápida de antígenos y puede ser la única prueba empleada
calidad en la forma de anticuerpos monoclonales apoya la
para diagnosticar la infección del RSV en niños; en rea-
aplicación de la inmunofluorescencia (IF) para una amplia
lidad, en manos experimentadas puede ser tan confiable
gama de antígenos víricos. Se puede aplicar el anticuerpo
que ya no se considera necesario el aislamiento paralelo
específico (o un conjunto de anticuerpos) conjugado con un
del virus. La mayoría de los lactantes se infecta con RSV
fluorocromo colorante a una preparación celular en una prue-
en su primera estación invernal y uno de cada 100 recién
ba directa de inmunofluorescencia (DIF) para el antígeno a
nacidos admitido en el hospital desarrolla la alarmante
detectar. Éste es el método más utilizado para el diagnóstico
complicación de bronquiolitis. Puesto que el RSV tempo-
rápido por microscopia de luz, en especial conveniente para
ral de la epidemia anual invernal es con mucho el agente
las muestras simples, pero también aplicado a las secreciones
patógeno respiratorio más común en lactantes y niños, es
respiratorias diarias de lactantes y niños; lo anterior consti-
una prioridad principal la prueba rápida para RSV. En la
tuye una parte importante del trabajo de un laboratorio de
figura 17-2 se muestra la apariencia característica (glóbu-
virus que suministra servicio a una unidad pediátrica durante
los intracelulares que se tiñen de verde manzana) de una
la epidemia anual de enfermedades respiratorias.
Los mismos reactivos también pueden ser útiles para
la tinción de las células de los cultivos celulares, sea para la
confirmación del cultivo, y tipificación en el caso de HSV,
o para el examen de la detección temprana (pre-ECP) de
antígenos, en particular útil para los virus de crecimiento
más lento, como el CMV y los adenovirus. Más adelante se
proporcionan ejemplos de la gama y aplicaciones. Algunas
pruebas serológicas para los anticuerpos víricos todavía se
basan en la inmunofluorescencia indirecta, casi siempre para
los anticuerpos del virus de Epstein-Barr, parvovirus humano
(eritrovirus B19) o virus humano del herpes 6 (HHV6).
En virología, el fluorocromo, colorante más utilizado es el
isotiocianato de fluoresceína (FITC), que confiere una fluo-
rescencia verde manzana brillante. Es provechoso si se inclu-
ye una contratinción, de modo que las células que contrastan
Figura 17-2 Tinción de inmunofluorescencia directa de células
con el fondo negativo sean visibles (teñidas de rojo apagado epiteliales respiratorias de un lactante con bronquiolitis aguda. La
si se emplea el colorante azul de Evans). El anticuerpo apro- tinción verde manzana brillante de las células marcadas con el anti-
piado se aplica a la celdilla o portaobjetos que tiene las células cuerpo fluorescente del RSV indica la infección con este virus; las
examinadas, un frotis o depósito de células directas de un células no infectadas contrateñidas con el colorante azul de Evans
paciente, células de un cultivo o un cubreobjetos “shell vial”. aparecen en rojo apagado en el contraste.
178 CAP. 17 MICROSCOPIA EN VIROLOGÍA: APLICACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

prueba positiva de DIF para el RSV en células respiratorias
de secreciones de un lactante. Se dispone de tratamiento
antivírico específico para la infección por RSV en sujetos
con riesgo especial por una enfermedad grave y a menudo
se requiere la prueba DIF (o un equivalente marcado de
forma enzimática) como procedimiento urgente.
Preparaciones celulares de la piel o mucocutáneas
Las células raspadas de la base de lesiones vesiculares de la
piel se examinan con frecuencia mediante DIF con los anti-
cuerpos específicos para HSV-l, HSV-2 o VZV (si no es obvia
en clínica la infección presente). Puesto que está disponible
la terapia antivírica específica, y las infecciones por herpes
son graves en los huéspedes inmunosuprimidos, es impor-
tante un diagnóstico rápido. Para ser efectivos, los fármacos
antivíricos deben suministrarse tan pronto como sea posible
y la dosificación varía de acuerdo con el virus. La naturaleza
contagiosa del VZV es también un problema para el control
de la infección (alrededor de 10% de los adultos jóvenes no
contrajo varicela y se halla en riesgo si se expone al VZV).
Células de cultivo
Es un procedimiento muy similar a DIF en las células del
paciente. Los beneficios de la confirmación rápida de un ECP
supuesto son clínicos y ahorran tiempo y recursos del labora-
torio. Como los HSV-l y HSV-2 tienen diferentes relaciones y
su tendencia a causar enfermedad recurrente en diferentes si-
tios es variable, es útil conocer el tipo del virus, lo cual es po-
sible con los anticuerpos de tipo específico. Se puede emplear
el anticuerpo monoclonal para los antígenos específicos de
grupo comunes presentes en los adenovirus (antígeno hexon)
o los enterovirus (antígeno VP1) para confirmar el ECP que
producen los miembros de estos grupos, respectivamente.
Antígenos víricos producidos en fase temprana
del ciclo de crecimiento
Cuando el citomegalovirus se reconoció como un agente
patógeno peligroso en los receptores de trasplante que re-
querían terapia antivírica resultó esencial detectarlo con
mayor rapidez que en el pasado. Gleaves en Estados Uni-
dos y Griffiths en el Reino Unido establecieron el valor de
reconocer los antígenos tempranos del CMV que aparecen
después de unas cuantas horas, en comparación con los días
que se toman para el DNA vírico y los antígenos posteriores,
y con el tiempo necesario para la aparición de un ECP. En
Estados Unidos se acuñó el término shell vial, mientras que
en el Reino Unido la prueba se conoció como DEAFF (De-
tection of Early Antigen Fluorescent Foci). Los antígenos
tempranos del VZV también se buscan de manera ocasional.
Un uso más amplio del sistema shell vial ha ganado acep-
tación en Estados Unidos y Europa continental, donde mu-
chos laboratorios lo utilizan, en particular, para la detección
respiratoria del virus. En la propia experiencia del autor ha
mostrado gran utilidad para la identificación temprana de las
infecciones del ojo por adenovirus y también para el índice
rápido y mejorado del aislamiento del VZV. Algunos ejem-
plos de IF por shell vial se ilustran en la figura 17-3.
Examen microscópico de los cultivos celulares
Aunque ciertos cambios notables en el cultivo celular son
visibles a simple vista, como en el desafortunado caso de
la turbiedad o acidez por el crecimiento de bacterias u
hongos, es necesario el examen microscópico antes que se
reconozcan los cambios que produce el crecimiento del vi-
rus. Las observaciones seriadas se realizan por días, y aun
por semanas, y quizá deba trasladarse el virus a medios de
cultivo frescos para pruebas subsecuentes, de manera que

Figura 17-3 Tinción por DIF de cultivos shell vial HEF infectados 48 horas después de la inoculación con un escobillado de conjuntiva
teñido con anticuerpo monoclonal específico del grupo de adenovirus (a); escobillado de la garganta teñido con el anticuerpo específico
contra el grupo A de la influenza que muestra tinción nuclear y ninguna extensión fuera de las células originales infectadas (b).
 EXAMEN MICROSCÓPICO DE LOS CULTIVOS CELULARES
los cultivos se examinan sin teñirse. Un soporte sostiene el
tubo de cultivo sobre la platina del microscopio, mientras
que el área entera de la monocapa celular se explora de
modo cuidadoso a bajo poder (con objetivos de 4 o 10⫻)
con el condensador inferior a la platina hacia abajo. Las
áreas focales de células alteradas se examinan entonces a
una mayor ampliación. No es difícil notar la diferencia en-
tre una monocapa de células por completo sanas (tubo con-
trol sin inocular del mismo lote de células) y una en la cual
los hoyos aparecen como células redondeadas y descendi-
das, o bien grupos de células que forman racimos grandes;
esto exige gran experiencia y cuidado y observación cons-
tante para desarrollar destreza en el reconocimiento de los
efectos citopáticos característicos que producen los virus
específicos en cultivos diferentes.
Efectos citopáticos en los cultivos celulares comunes
• ECP degenerativo: áreas dispersadas con células redon-
das y contraídas, que degeneran pronto la superficie del
tubo (se observan con los enterovirus como poliovirus y
rinovirus).
• Células redondas, retráctiles y abultadas en grupos: se
identifican con adenovirus (“racimos de uvas” en célu-
las HEp2) y HSV. Este último crece con gran rapidez,
primero en pocas zonas (“placas”) el día posterior a la
inoculación y luego se propaga a lo largo de la monoca-
pa al día siguiente. Se reconocen sincitios pequeños, en
especial con HSV-2.
• ECP del citomegalovirus: aparece por completo único,
con progresión muy lenta y focos alargados de células
(citomegálica) abultadas en cultivos de fibroblastos hu-
manos.
Figura 17-4 Efecto citopático sincitial típico del RSV al crecer
en cultivos de células HEp2 (sin teñir), cinco días después de la
inoculación de la muestra respiratoria del paciente.
179
• ECP sincitial típico: marca característica del RSV que
crece en células HEp2 frescas (fig. 17-4), aunque las cé-
lulas multinucleadas gigantes también se observan con
el sarampión y el VZV en líneas celulares sensibles.
Las características son diferentes para el ojo adiestrado
en cada caso.
El HIV no se cultiva de rutina, pero su crecimiento se puede
reconocer por la aparición del sincitio en los cultivos de cé-
lulas mononucleares sanguíneas que crecen en suspensión,
no como monocapas. El virus del herpes humano tipo 6
(HHV6) se descubrió en 1986 cuando produjo ECP sincitial
en cultivos de sangre periférica (fig. 17-5) y, en el examen
adicional, resultó no ser HIV sino un virus herpes desco-
nocido. El ECP más famoso y reciente fue el observado en
los primeros cultivos del desconocido coronavirus humano
relacionado con el síndrome respiratorio agudo grave.
Figura 17-5 ECP en un sincitio con forma de globo (sin teñir)
que produce el virus del herpes humano tipo 6 (HHV6) en cultivo
de suspensión de la línea celular linfoblastoide (JJhan).
Crecimiento vírico no citopático en cultivo celular
El microscopista de virología sabe que algunos virus se
reproducen en los cultivos celulares sin producir citopa-
tología evidente. El mejor ejemplo conocido es el de los
virus de la influenza que crecen en las células del riñón del
mono, donde la presencia del virus se puede revelar me-
diante hemadsorción. Una glucoproteína (hemaglutinina)
codificada por el virus e insertada dentro de la membrana
de células plasmáticas es capaz de atacar a los eritrocitos de
la sangre añadidos a la superficie. En las etapas más tem-
pranas de cualquier replicación vírica, cuando sólo se in-
fectan las células individuales, el ECP no es obvio pero los
antígenos víricos están presentes.
Investigaciones adicionales de los agentes citopáticos
El microscopista no ha acabado cuando ya se observa un
ECP reconocible en un cultivo inoculado. Se espera la con-
180 CAP. 17 MICROSCOPIA EN VIROLOGÍA: APLICACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
firmación del diagnóstico informada y se puede indicar
una identificación adicional. El juicio del microscopista,
quien selecciona la prueba de confirmación con base en el
ECP, la línea celular, la muestra y otros factores, es crítico
para formular un diagnóstico rápido y ahorrar recursos. La
confirmación y tipificación del HSV ya se mencionaron. El
ECP del adenovirus o el enterovirus se puede ahora con-
firmar mediante IF de las células, pero la tipificación re-
quiere un ensayo de neutralización porque existen muchos
tipos diferentes. Esto exige mezclar alícuotas de un aislado
bien desarrollado con celdillas de antisuero que cubran los
tipos comunes, tras inocular cultivos frescos y observar el
antisuero que inhibe al ECP, es decir, la neutralización de
la infectividad vírica. Estos ejercicios de tipificación raras
veces afectan el control clínico, pero son importantes para
los estudios epidemiológicos.
Desarrollos
El virólogo de diagnóstico debe disponer de la mejor de
las técnicas para identificar las infecciones víricas. La
detección rápida es crítica por las razones ya explicadas.
En tanto se emplee la microscopia de IF para las muestras
individuales, pueden utilizarse los inmunoensayos o la in-
munofiltración enzimática para la captación del antígeno,
métodos menos subjetivos, que pueden automatizarse, para
el examen de cantidades más grandes de muestra y líquidos
de cultivo amplificados. La amplificación molecular del
ácido nucleico por la reacción en cadena de la polimera-
sa (PCR) proporciona el medio más sensible de detección
de una gama cada vez mayor de virus y los laboratorios
se orientan cada vez más en esa dirección, con menor uso
del aislamiento y la microscopia habituales. Todavía se re-
quieren los intentos paralelos al aislamiento del virus en
un laboratorio que ofrezca un servicio completo, incluidas
la tipificación epidemiológica y las pruebas de susceptibi-
lidad antivírica. Hoy en día se aplica el cultivo mejorado y
se (b)
advierte una búsqueda continua de células sensibles, en
particular para los virus incultivables. El área que emerge
de la ingeniería genética celular puede proporcionar téc-
nicas novedosas, como los sistemas inducidos por virus
ligados a enzimas (ELVIS), ya probados para el HSV (Oli-
vo 1996), que combinan tres cultivos celulares (viejos y
nuevos), la detección del antígeno y la tecnología de DNA
recombinante, sin excluir la microscopia.
Reconocimientos
Merecen un agradecimiento especial los siguientes clíni-
cos por las figuras utilizadas en este capítulo: figura 17-1,
fotografía del Dr. K McLaren, consultor histopatologista,
Universidad de Edimburgo; figuras 17-2 a 17-5, fotografías
de AJ MacAulay FIMLS, principal científico biomédico en
el Clinical Virology Laboratory, Department of Medical
Microbiology, University of Edinburgh. Las copias presen-
tadas de todas las figuras se prepararon como impresos a
color en la Medical Photography Unit del Royal Infirmary
of Edinburgh, Little France.
Lecturas adicionales
Lennette EH, Lennette DA, Lennette ET (eds). Diagnostic Proce-
dures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections, 7th edn.
1995: American Public Health Association, Washington, DC.
Mahy BWJ, Kangro HO (eds). Virology Methods Manual. 1996:
Academic Press, London.
Olivo PD. Transgenic lines for detection of animal viruses. Clin
Microbiol Rev 1996; 9: 321-343.
Simmons A, Marmion BP. Rapid diagnosis of viral infections. In
Mackie & McCartney’s Practical Medical Microbiology, 14th
edn. Collee JG, Fraser AG, Marmion BP, Simmons A (eds).
1996: Churchill-Livingstone. Edinburgh.
Zuckerman AJ, Banatvala JE, Pattison JR Griffiths PD, Schoub
BD (eds). Principles and Practice of Clinical Virology, 5th
edn. 2004 Wiley, Chichester.
 18
Microscopia electrónica en virología
Hazel Appleton
Introducción
Los virus se consideran agentes malignos que causan en-
fermedad y dolor. Sin embargo, cuando se visualizan en el
microscopio electrónico se reconocen diversas estructuras.
Los tipos de los múltiples grupos víricos parecen diferentes
y es esa morfología característica la base para su identifi-
cación mediante microscopia electrónica. Ésta proporciona
los medios para detectar e identificar con rapidez los virus
en el material tomado directamente de los pacientes (cuadro
18-1). Un diagnóstico rápido puede facilitar la atención y el
tratamiento de los enfermos. El diagnóstico tiene también
implicaciones de salud pública para el control de brotes y
la propagación de las enfermedades infecciosas en la comu-
nidad. A largo plazo, la microscopia electrónica desempeña
un papel en la vigilancia epidemiológica de la enfermedad
infecciosa. A diferencia de muchas pruebas diagnósticas,
que se seleccionan para un agente particular, la microscopia
electrónica es un método que puede detectar cualquier virus
o una mezcla de virus en la muestra. Esto es en particular
útil en el diagnóstico y el estudio de los virus que no pueden
cultivarse con facilidad in vitro. El uso de la microscopia
electrónica ha conducido al descubrimiento e identificación
de muchos agentes víricos nuevos en años recientes y tiene
una función principal en el estudio de los virus nuevos.
Métodos
Tinción negativa
Es el método más utilizado en virología diagnóstica y recu-
rre a la tinción del entorno vírico, no tanto al virus mismo.
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
La preparación de la muestra es simple y los resultados se
pueden obtener con rapidez. Empero, la técnica depende
de la presencia de números suficientes de partículas del vi-
rus en la muestra (se requiere casi siempre un mínimo de
106 partículas del virus por mililitro de muestra) y de la
integridad estructural de las partículas del virus que per-
manecen intactas, de tal modo que puedan reconocerse e
identificarse. Algunas veces la sensibilidad se puede acre-
centar mediante el uso de sueros inmunitarios (microscopia
electrónica inmunitaria, MEI). Los virus que no se deli-
nean con claridad en relación con el material del entorno,
por ejemplo los parvovirus, pueden agregarse en grupos si
se mezcla la muestra con un antisuero específico de mane-
ra que puedan observarse con facilidad. En caso contrario,
los virus pueden llevarse a una rejilla revestida con anti-
suero (microscopia electrónica inmunitaria de fase sólida).
Los métodos de MEI se pueden utilizar para la tipificación
antigénica de los virus. Cuando un virus se identifica por
tinción negativa simple se reconoce como miembro de un
grupo o una familia de virus, pero casi nunca es posible
distinguir entre los miembros del grupo sin pruebas adi-
cionales; por ejemplo, el virus del herpes causante de la
varicela (virus de la varicela-zoster, VZV) posee una apa-
riencia idéntica respecto del virus del herpes causante de
ampollas febriles (virus del herpes simple, HSV).
Corte fino
La microscopia electrónica de corte fino es útil para el
examen de muestras en las que hay números escasos de
partículas víricas para reconocerlas en las suspensiones ne-
gativas teñidas. Algunos virus, como los retrovirus, tienen
182 CAP. 18 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN VIROLOGÍA

Cuadro 18-1 Virus detectados mediante microscopia electrónica cífico. El virus se une a las perlas y se recubre con oro. La
técnica parece ofrecer poca ventaja respecto de la MEI de
Muestras examinadas Ejemplos de virus detectados tinción negativa y tiene la desventaja de oscurecer la mor-
fología característica del virus, además de que los reactivos
Piel: líquidos Virus del herpes: herpes simple, son costosos.
vesiculares o virus de la varicela-zoster
raspaduras de Poxvirus: ectima, molusco contagioso
lesiones* Virus del papiloma (verruga humana) Usos de la microscopia electrónica
Heces* Virus de la gastroenteritis: rotavirus,
adenovirus, astrovirus, norovirus,
La microscopia electrónica empezó a sobresalir en la viro-
sapovirus (hepatitis A y E,
enterovirus) logía diagnóstica en el decenio de 1960 con el diagnóstico
Suero Parvovirus B19 rápido de la viruela. Las lesiones de piel que se producen
Hepatitis B en esta enfermedad y las consecutivas de la varicela pue-
Orina Poliomavirus BK den confundirse en clínica. Las alarmantes implicaciones
Citomegalovirus de la infección de la viruela llevaron en poco tiempo a di-
Adenovirus (cistitis hemorrágica) ferenciar estas infecciones básicas. Las lesiones de piel,
Hígado Hepatitis B y en particular los líquidos de las vesículas, son ricos en
Hígado fetal Parvovirus B19 (hidropesía fetal) partículas víricas. Basta mezclar la muestra con una gota
Cerebro Virus del sarampión (SSPE) de un colorante negativo para ver con precisión el virus,
Poliomavirus JC
sin necesidad de recurrir a la concentración. La viruela se
Virus del herpes
Tumor Virus de Epstein-Barr
debe a un miembro de la familia del poxvirus y la varicela
Cultivos celulares Cualquier virus cultivado, como al VZV. Los poxvirus y los virus del herpes tienen morfo-
de laboratorio para influenza, parainfluenza, sarampión, logías muy diferentes y se pueden distinguir con facilidad
la identificación paperas, adenovirus, poliomavirus, mediante el microscopio electrónico (figs. 18-1 y 18-2). El
rápida de los aislados* enterovirus, virus del herpes, virus de la viruela, variola, y el virus vaccinia utilizados
retrovirus (virus exóticos, p. ej., en la vacuna son indistinguibles y se requirieron pruebas
Marburg, Ébola)
*Principales usos habituales de la microscopia electrónica en virología
diagnóstica.

estructuras que se identifican de modo más fácil en cor-

tes finos en comparación con las preparaciones negativas.
Aunque la sensibilidad puede acrecentarse, no es una téc-
nica rápida y tiene aplicación limitada en un laboratorio de
diagnóstico. Es útil para estudiar la patogenia de la infec-
ción y puede emplearse para la confirmación diagnóstica
en biopsia y muestras post mortem. Las estructuras del vi-
rus son resistentes a la lisis celular y la preservación pobre
del tejido; es posible obtener resultados positivos a partir
de material que aparenta ser poco prometedor.

Microscopia electrónica de barrido

Pocos laboratorios de diagnóstico tienen acceso a un mi-

croscopio electrónico de barrido o incluso un accesorio de
barrido para un microscopio electrónico de transmisión.
Este último se utiliza sobre todo como herramienta para
investigar la fijación y patogenia del virus y hasta el mo-
mento ha tenido poco uso en virología diagnóstica. Se ha
observado cierto interés en los inmunoensayos de fase só-
lida, con perlas de látex cubiertas con el anticuerpo espe- Figura 18-1 Vaccinia: un ortopoxvirus (180 000 ⫻).
 USOS DE LA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA
Figura 18-2 Virus del herpes de una lesión de la piel (180 000 ⫻).
para diferenciarlos: por lo regular se realiza la distinción
en cultivo de la membrana corioalantoica de los huevos de
las gallinas, lo cual toma unos tres días. La detección de un
virus del herpes evitó la necesidad de todas las medidas
sanitarias públicas que debían activarse en presencia de un
caso de viruela.
Lesiones de la piel
En 1980, la Organización Mundial de la Salud declaró que la
viruela se había erradicado, pero la microscopia electrónica
no ha dejado de tener un papel importante en el diagnóstico
rápido de la infección por el virus del herpes. Esto es en
particular útil para los individuos inmunocomprometidos,
en los cuales el uso de fármacos antivíricos apropiados
puede facilitar el tratamiento. Además, puede auxiliar en la
atención de los sujetos de las unidades de trasplante, en las
cuales un brote de varicela podría tener consecuencias gra-
ves y algunas veces mortales. La microscopia electrónica to-
davía se utiliza en el diagnóstico de otras dos infecciones del
poxvirus, el ectima y el molusco contagioso, ninguno de los
cuales se puede identificar con facilidad por otros medios. El
ectima es una infección zoonótica adquirida de las ovejas,
secundaria a un virus parapox, el cual es más pequeño y alar-
gado que los virus ortopox, como el vaccinia y el cowpox
(fig. 18-3). El molusco contagioso es un poxvirus humano
183
Figura 18-3 Ectima: un parapoxvirus (180 000 ⫻).
que causa erupciones benignas en la piel y es similar en
apariencia a los virus ortopox. La microscopia electrónica
también se utiliza de modo ocasional en la detección del vi-
rus del papiloma humano (HPV) que provoca verrugas.
Gastroenteritis
El descubrimiento de los virus que causan la gastroenteritis
condujo a la expansión del uso de la microscopia electróni-
ca en laboratorios de diagnóstico y salud en las décadas de
1970 y 1980. Diversos virus pueden causar gastroenteritis
y todos se descubrieron en el examen por microscopia elec-
trónica de muestras fecales. Resultó sorprendente que los
virus podían visualizarse en ese complejo material, pero en
verdad estos virus se excretan en números inmensos dentro
del contenido intestinal y pueden reconocerse con facilidad
si las muestras se recogen en el momento apropiado.
Los virus de la gastroenteritis no crecen en los cultivos
celulares convencionales y la microscopia electrónica ha
sido el método principal para su identificación. Algunos
virus de la gastroenteritis, como los rotavirus y adenovi-
rus, tienen tales morfologías distintivas que sólo necesitan
observarse una o dos partículas para el reconocimiento po-
sitivo (figs. 18-4 y 18-5). Las muestras pueden ser tan ricas
en virus que no se precisa ninguna concentración (se calcu-
lan concentraciones de 1012 partículas/g). A menudo es
184 CAP. 18 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN VIROLOGÍA

Figura 18-4 Rotavirus: una causa importante de gastroenteritis

en recién nacidos y niños menores. Los “rayos” típicos pueden
verse alrededor de las partículas. La partícula del centro perdió su
cápside (180 000 ⫻).

suficiente emulsionar una muestra pequeña de heces en una

gota de agua destilada, mezclar con colorante negativo y
colocar sobre una rejilla. Para otros virus de las gastroente-
ritis, como astrovirus y norovirus, la identificación es más
difícil y deben examinarse más partículas para realizar una Figura 18-6 Astrovirus. Pueden verse estrellas de cinco o seis
identificación exacta (figs. 18-6 y 18-7). En estos casos, por puntas en la superficie de algunas partículas (180 000 ⫻).
lo general, es necesario concentrar el virus de la muestra.
Se han desarrollado pruebas comerciales, como ELI-
ca primaria en muchos laboratorios de diagnóstico. Esto
SA, técnicas de aglutinación de látex, PCR e incluso
permite que números más grandes de muestras se sometan
pruebas con tira reactiva, y ahora se emplean como técni-
a examen, en comparación con la microscopia electróni-
ca, y muchas veces con mayor sensibilidad. Sin embargo,

Figura 18-5 Adenovirus: se relacionan en gran medida con las

infecciones de las vías respiratorias y oculares. Dos adenovirus
se vinculan con la gastroenteritis e infectan sobre todo a niños Figura 18-7 Norovirus. Este virus provoca muchos brotes de
jóvenes (180 000 ⫻). gastroenteritis en la comunidad (180 000 ⫻).
 USOS DE LA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA
estas pruebas tienen limitaciones puesto que son selecti-
vas para un tipo específico del virus y no detectan todas
las cepas dentro de un grupo del virus. Las muestras que
arrojan resultados negativos o equívocos se pueden exa-
minar posteriormente mediante microscopia electrónica.
El Health Protection Agency Centre for Infections reúne
los informes de los virus detectados en casos de gastroente-
ritis en Inglaterra y el País de Gales. Esto ha facilitado que
se represente un panorama epidemiológico de los grupos
de edad afectados por los diferentes agentes víricos, las
distribuciones estacionales, los patrones de excreción y los
modos de transmisión. Esta información hace posible pro-
porcionar el consejo apropiado sobre factores como el con-
trol de brotes, tiempo que debe apartarse de los alimentos a
quienes los manipulan y tiempo óptimo para la recolección
de muestras.
Rotavirus
De los virus de la gastroenteritis, el mejor conocido e iden-
tificado con facilidad es el rotavirus (de la palabra latina
rota, rueda: la disposición de los capsómeros vistos en la
superficie de las partículas del virus se asemeja a los rayos
de una rueda) (fig. 18-4). El rotavirus es una causa impor-
tante de la gastroenteritis en recién nacidos y niños. En el
Reino Unido y otros países desarrollados propicia el nú-
mero más grande de admisiones al hospital en este grupo
de edad, y en países subdesarrollados se calcula que causa
alrededor de medio millón de muertes por año. La infec-
ción ocurre sobre todo en los meses del invierno en climas
templados. Los brotes también se observan entre ancianos,
al parecer debido a la declinación de la inmunidad.
El rotavirus se encontró primero en los cortes finos de
biopsias duodenales de niños en Australia, pero tales téc-
nicas invasivas no son necesarias ya que el virus puede
verse en las emulsiones simples de muestras fecales. Los
equipos comerciales para la detección de los rotavirus se
utilizan con amplitud. No obstante, estos equipos sólo de-
tectan el tipo más común de los rotavirus conocidos, como
los rotavirus del grupo A. Otros tipos, como los rotavirus
del grupo C, también infectan a los seres humanos, aunque
se observan con menor frecuencia. Los rotavirus del grupo
C infectan a todos los grupos de edad y se han vinculado
con un buen número de brotes en familias y escuelas. En
muchos laboratorios, las muestras se examinan sólo por
microscopia electrónica si los resultados de una prueba de
ELISA o látex son negativos. Los rotavirus que no pertene-
cen al grupo A se identifican casi siempre cuando surge una
discrepancia entre el resultado negativo del equipo y uno
positivo hallado con la microscopia electrónica. La carac-
terización se lleva a cabo por el análisis PAGE o PCR.
185
Adenovirus
El examen de muestras fecales de niños con gastroenteritis
condujo al descubrimiento de dos adenovirus nuevos. Por
mucho tiempo los adenovirus se habían relacionado con las
infecciones respiratorias y oculares y se aislaban en culti-
vos celulares. Los dos adenovirus nuevos, los denominados
tipos 40 y 41, se vinculan de manera específica con la gas-
troenteritis y no pueden cultivarse con facilidad. La micros-
copia electrónica tiene limitaciones y puede indicar sólo la
presencia de los adenovirus (fig. 18-5) y no de manera espe-
cífica los tipos 40 y 41, para los cuales se requieren pruebas
adicionales. Los adenovirus respiratorios comunes se aíslan
algunas veces de muestras fecales, pero esto se considera un
hallazgo incidental. Del mismo modo que para el rotavirus,
ahora se dispone de los equipos de ELISA y tira reactiva.
Los tipos 40 y 41 de los adenovirus tienen una epidemiolo-
gía similar al rotavirus dado que infectan sobre todo a jóve-
nes y se observan durante los meses invernales.
Astrovirus
Otro virus vinculado con la gastroenteritis es el astrovirus,
un virus original, nombrado así por la estrella de cinco o
seis puntas delineada en la superficie de una gran propor-
ción de partículas (fig. 18-6). Los astrovirus explican al-
rededor de 1 a 2% de los informes de virus causales de
gastroenteritis en el Reino Unido. La infección se notifica
sobre todo en los muy jóvenes y se han descrito brotes en
las unidades neonatales; no obstante, se sugiere que la in-
fección en otros grupos de edad se encuentra subestima-
da. Como el rotavirus, los brotes se reconocen de modo
ocasional en los ancianos. En raras ocasiones se refiere la
transmisión que producen los alimentos. La microscopia
electrónica es todavía el método principal de detección.
Norovirus
Los norovirus, conocidos antes como virus similares al
Norwalk o virus pequeños redondos estructurados (SRSV),
se consideran la causa más común de la gastroenteritis en
la comunidad. Se reconocen en todos los grupos de edad y
se relacionan de modo frecuente con brotes en hospitales,
hogares residenciales y escuelas. Los virus de la gastroen-
teritis casi siempre se transmiten en forma directa de per-
sona a persona a través de la vía fecal-bucal o en gotitas
de aerosol. A veces también se pueden transmitir algunos
a través del alimento o el agua y en estas situaciones los
norovirus son los que se notifican más a menudo. El primer
virus del grupo se descubrió por microscopia electrónica
186 CAP. 18 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN VIROLOGÍA
en 1972. Originado de un brote en la ciudad de Norwalk, en
Estados Unidos, se conoció como el agente Norwalk. El
término “virus pequeño redondo estructurado” o SRSV
se relaciona con el aspecto del virus en el microscopio
electrónico (fig. 18-7). Las partículas del virus miden 30 a
35 nm de diámetro y tienen una superficie amorfa y un
contorno irregular. Los norovirus se clasifican dentro de la
familia Caliciviridae. Hay muchas cepas diferentes y éstas
forman dos genogrupos amplios. Hay también un tercero,
el genogrupo emparentado de forma más lejana, llamado
sapovirus porque se aisló en una guardería en Sapporo, Ja-
pón. Los sapovirus tienen el aspecto típico de un calicivirus,
con depresiones similares a una taza vistas en la superficie
de las partículas del virus. Estas depresiones en forma de
taza casi nunca se identifican en los norovirus. La diferen-
ciación entre norovirus, calicivirus y también astrovirus
por microscopia electrónica puede ser difícil y requiere la
intervención de un microscopista experimentado.
Los norovirus no se pueden cultivar y la mayor parte de
los diagnósticos se establece por microscopia electrónica.
Empero, los norovirus se excretan sólo en números suficien-
tes para la detección por cerca de 48 horas después del inicio
de los síntomas y por tanto suele ser difícil obtener muestras
apropiadas. Los norovirus tienden a no excretarse en núme-
ros grandes, como el rotavirus y los adenovirus, y puesto que
no tienen tales características morfológicas distintivas, son
mucho más difíciles de detectar en términos técnicos. Por lo
tanto, los norovirus no aparecen en una enorme proporción
de los informes. La microscopia electrónica no es bastante
sensible para reconocer el virus en el alimento o muestras
ambientales. Se han desarrollado los ensayos de PCR para
los norovirus, pero están sólo disponibles en laboratorios es-
pecializados. Estos ensayos son muy sensibles: pueden de-
tectar al virus en las muestras clínicas por hasta una semana
después del inicio de los síntomas y pueden emplearse para
examinar los alimentos y las muestras ambientales. Sin em-
bargo, no detectan todas las cepas del norovirus. En 2003 se
dispuso ya de los equipos comerciales de ELISA que iden-
tifican una amplia gama de los norovirus de los genogrupos
1 y 2. Éstos tienen sensibilidad similar a la de la microsco-
pia electrónica, pero son mucho más fáciles de usar, pueden
procesar números más grandes de muestras y han tenido un
efecto significativo en el examen de los norovirus. Existe
una gran diversidad dentro del grupo del norovirus y, pese
a ello, las técnicas ELISA no detectan todas las cepas. En
consecuencia, la microscopia electrónica juega todavía un
papel esencial en el diagnóstico.
Otras infecciones
La microscopia electrónica tuvo un papel importante en el
descubrimiento de otros virus, en especial algunos de los
virus de la hepatitis, los papovavirus y el parvovirus B19.
Otras pruebas sustituyeron en gran medida a la microsco-
pia electrónica en el diagnóstico.
Virus de la hepatitis
El virus que causa la hepatitis A se descubrió en 1972 por
microscopia electrónica inmunitaria de muestras fecales de
los pacientes incluidos en los estudios de voluntarios. Sin
embargo, se demostró en poco tiempo que la mayor parte
de la excreción del virus ocurre en la fase prodrómica de
la enfermedad y el diagnóstico se establece ahora por la
detección del anticuerpo IgM específico de la hepatitis A.
Aunque no se utilizó para el diagnóstico, fue la microsco-
pia electrónica la que reveló que el otro virus transmitido
por vía entérica, el de la hepatitis E, tiene la morfología de
un calicivirus. La hepatitis E no se identifica con frecuen-
cia en el Reino Unido, pero se vincula con brotes transmi-
tidos en áreas en vía de desarrollo del mundo y la infección
es en particular grave en mujeres embarazadas.
La microscopia electrónica fue más útil en el diagnóstico
de la infección de la hepatitis B. Las partículas y antígenos
víricos, sobre todo el antígeno de superficie de la hepatitis
B, están presentes en el suero por periodos prolongados. El
diagnóstico puede determinarse con facilidad si se reconocen
partículas completas del virus, pero a menudo sólo pueden
verse esferas de 22 nm de la capa proteínica del virus (antí-
geno superficial). El antígeno superficial es difícil de distin-
guir de otro material de fondo en el suero. Para aumentar la
sensibilidad y la identificación del caso, el suero del pacien-
te se mezcla con un antisuero específico en una prueba MEI,
la cual no es conveniente para examinar una gran cantidad
de muestras y debe emplearse de manera selectiva.
Parvovirus B19
Mientras se buscaba el virus de la hepatitis B por MEI del
suero se descubrió primero el parvovirus B19. Con poste-
rioridad se reconoció que éste era el agente etiológico del
eritema infeccioso, una infección común de salpullido de la
niñez que también se conoce a menudo como “síndrome de
la cara abofeteada”. La infección en el embarazo puede cau-
sar daño fetal. Puede también precipitar crisis aplásica grave
en individuos con trastornos hematológicos como la anemia
falciforme. La confirmación del laboratorio de la infección
por B19 puede modificar en grado notorio la atención de estos
pacientes. Aunque no se han utilizado por más tiempo para el
diagnóstico de rutina, los resultados contradictorios entre las
pruebas para la infección por el parvovirus B19 (p. ej., una
PCR positiva pero un resultado negativo de la IgM) se pueden
resolver en poco tiempo mediante microscopia electrónica.
 REACCIÓN RÁPIDA DE URGENCIA 187

Cerebro agente citopático, en especial si están presentes varios tipos

víricos. Se utiliza cuando otras pruebas suministran resulta-
Cuando los fármacos antivíricos estuvieron disponibles dos inconsistentes, equívocos o aun negativos; por ejemplo,
para el tratamiento de la encefalitis herpética se realizaron las pruebas de PCR y ELISA para el norovirus no iden-
intentos para detectar al herpesvirus en suspensiones teñi- tifican todas las cepas y la microscopia electrónica puede
das negativas de material cerebral. El diagnóstico rápido proporcionar resultados positivos sobre muestras al parecer
y exacto era importante porque los medicamentos antiví- negativas. La microscopia electrónica también se usa para
ricos tempranos eran en extremo tóxicos. Sin embargo, la comprobar los antígenos víricos, como los virus del saram-
microscopia electrónica no mostró particular sensibilidad pión y la rubeola y preparados de otras pruebas, y detectar
y pronto la sustituyeron la microscopia de fluorescencia y los contaminantes víricos que aparecen de forma natural
luego las técnicas de PCR. El paramixovirus helix del sa- en los cultivos celulares, como SV40 (fig. 18-8).
rampión se ha identificado en cortes finos de tejido cerebral
de personas con panencefalitis esclerosante subaguda. El
primer poliomavirus humano, JC, se descubrió en cortes
finos de tejido cerebral de pacientes con leucoencefalopatía
multifocal progresiva. Aunque la microscopia electrónica
fue útil para establecer la causa de estas dos anormalida-
des, las técnicas de fluorescencia y las pruebas de PCR son
más sensibles para examinar material cerebral.

Orina

Los intentos para hallar virus en las muestras de orina han

tenido un éxito variable. Mediante microscopia electrónica
se descubrió un segundo poliomavirus humano conocido
como virus BK. Éste infecta de manera regular a los in-
dividuos sometidos a trasplante y se excreta en la orina.
Muestra un crecimiento muy lento en los cultivos celulares
y la microscopia electrónica ha sido en extremo útil para
el diagnóstico. Se han desarrollado pruebas de PCR y son
ahora el método habitual empleado para fines diagnósticos.
El citomegalovirus (CMV), un miembro del grupo del virus
del herpes, también se elimina en la orina, pero se reconoce
sólo por microscopia electrónica cuando está presente una
Figura 18-8 Poliomavirus encontrado como un contaminante en
gran cantidad de partículas víricas. Los síntomas de las in-
un cultivo celular (180 000 ⫻).
fecciones con los virus CMV y BK pueden semejar a los
del rechazo del órgano. El diagnóstico de una causa vírica
da lugar a una mejor atención del paciente, puesto que el Reacción rápida de urgencia
uso inadecuado de los agentes inmunosupresores prolon-
garía en realidad la infección del virus. Los acontecimientos actuales del mundo condujeron a una
conciencia del potencial de la actividad bioterrorista, y las
agencias de gobierno revisan de forma continua los planes
Laboratorio de virología para enfrentar algún acontecimiento de esta naturaleza. La
viruela se ha identificado como un agente posible para la li-
Además de su papel primario en el diagnóstico, la mi- beración intencionada. Puesto que la microscopia electró-
croscopia electrónica tiene muchas otras funciones en un nica es el método más rápido para detectar un ortopoxvirus,
laboratorio de virología. Proporciona también apoyo en el los microscopistas han revisado protocolos y examinado pa-
desarrollo de nuevas pruebas alternativas de diagnóstico neles externos de aseguramiento de la calidad para garanti-
y con frecuencia es útil en proyectos de investigación. La zar una respuesta. Después de la erradicación, la vacunación
microscopia electrónica se utiliza para la identificación rá- cesó y por lo tanto casi todo el personal del laboratorio care-
pida de los virus aislados en cultivos celulares y puede redu- ce de vacunación. Mientras que la amenaza de infección sea
cir en gran proporción el tiempo invertido en identificar un aún muy baja, se considera que los riesgos relacionados con
188 CAP. 18 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN VIROLOGÍA

la vacunación pueden tener más peso que los de la viruela.

Para proteger al personal que puede enfrentarse inesperada-
mente a un espécimen de la viruela, se recomienda inacti-
vación del microorganismo antes del proceso. Es esencial
que cualquier método elegido no comprometa la capacidad
de identificar a los poxvirus y virus del herpes. Se ha obser-
vado que una solución de formaldehído al 5% amortiguada
con fosfatos inactiva al virus sin enmascarar las caracterís-
ticas morfológicas identificables. El glutaraldehído se usa
muchas veces como un fijador para la microscopia electróni-
ca. Algunos microscopistas prefieren no fijar la muestra, te-
ñir sobre una rejilla y después impregnar la rejilla preparada
en una gota de glutaraldehído. No obstante, si la muestra se
trata con glutaraldehído antes del procesamiento, la estruc-
tura superficial de cualquier virus teñido de forma negativa
se oscurece por completo. Si un ortopoxvirus se reconoce
por microscopia electrónica, se requieren pruebas adiciona-
les para identificarlo. Por lo regular, esto se realiza mediante
PCR en laboratorios especializados. El ortopoxvirus que se
presenta más veces en el Reino Unido es el cowpox, que
suele adquirirse de gatos domésticos. En 2003 tuvo lugar un
brote de una enfermedad con lesiones vesiculares en seres
humanos en Estados Unidos que causó preocupación y di-
fusión considerables. Un ortopoxvirus se reconoció en poco
tiempo mediante microscopia electrónica y con posteriori- Figura 18-9 El virus del síndrome respiratorio agudo grave
dad se identificó como el monkeypox, adquirido de roedores (180 000 ⫻).
domésticos de latitudes lejanas. Aunque la infección por el
monkeypox puede ser muy grave, este poxvirus no es por cuales la salud pública se pone en riesgo, tanto si la libera-
fortuna muy transmisible entre los seres humanos. ción de un agente biológico es deliberada como si se trata de
una nueva infección de surgimiento natural. La microscopia
electrónica se utiliza a menudo como método de diagnósti-
Virus de nueva aparición co primario en las etapas tempranas después que un virus
se descubre hasta el desarrollo de pruebas más fáciles. La
Nuevos virus se descubren y la microscopia electrónica microscopia electrónica implica un trabajo intensivo y no es
se halla a la vanguardia en la búsqueda y caracterización conveniente para examinar una gran cantidad de muestras.
inicial de estos microorganismos. La facilidad de los vue- Por lo tanto, si las pruebas alternativas convenientes pueden
los internacionales supone que las nuevas infecciones se estar disponibles, la microscopia electrónica tiende a tomar
pueden transmitir alrededor del mundo a las poblaciones un papel más bien confirmatorio. El énfasis principal de la
no inmunizadas en un tiempo muy corto. Por ejemplo, en microscopia electrónica en virología parece enfocarse más
la primavera de 2003 se identificó el síndrome respiratorio en los aspectos de la investigación, donde ha tenido siempre
agudo grave, que se originó en el Extremo Oriente, como un papel esencial. El costo primario del equipo supone que
una enfermedad nueva. Se observó un esfuerzo mundial, la microscopia electrónica no está disponible en todos los
que coordinó la Organización Mundial de la Salud, para laboratorios. Además, un servicio satisfactorio requiere per-
identificar el agente etiológico. La microscopia electrónica sonal experto y experimentado y tiempo en el mantenimien-
desempeñó un papel prominente al identificar con rapidez to del equipo en condiciones de trabajo óptimas. Si bien
un coronavirus nuevo como la causa (fig. 18-9). la microscopia electrónica ha sufrido una declinación en la
virología de rutina, puede ser práctico colaborar con los mi-
croscopistas electrónicos en otros campos de la patología y
Conclusiones ofrecer una gama completa de técnicas de microscopia elec-
trónica. Esto puede funcionar con eficiencia, siempre que
La microscopia electrónica desempeña un papel esencial las diferentes necesidades de todos los usuarios se atiendan
en la respuesta pronta a las situaciones de urgencia en las y haya acceso conveniente y fácil para todos ellos.
 LECTURAS ADICIONALES
La microscopia electrónica se ha utilizado en extenso
para la detección de virus en las muestras fecales de pacien-
tes con gastroenteritis y en particular para la investigación
de lactantes con diarrea. Es probable que la introducción de
equipos ELISA comerciales nuevos reduzca los números
de muestras examinadas por microscopia electrónica. Es-
tos equipos ofrecen pruebas más baratas y la capacidad de
examinar gran cantidad de especímenes, pero tienen limi-
taciones y no pueden identificar todas las cepas víricas. La
microscopia electrónica es todavía el método más rápido
para el diagnóstico de lesiones vesiculares por virus y tiene
importancia especial en la atención de los pacientes inmu-
nocomprometidos. La microscopia electrónica también po-
see una función relevante en la identificación rápida de los
virus aislados de muestras clínicas en cultivo celular.
Muchos virus nuevos se han descubierto gracias al uso
de la microscopia electrónica, en especial desde los prime-
ros años de la década de 1970. La microscopia electrónica
tiene una contribución importante en el descubrimiento y
caracterización de los virus nuevos, junto con los avances
recientes de la virología molecular. Por ejemplo, 40% de
las infecciones de gastroenteritis todavía permanece sin
diagnosticar. Algunos virus de la hepatitis y retrovirus aún
requieren la caracterización por microscopia electrónica
y ésta se emplea asimismo para buscar virus en tumores.
No dejará de utilizarse para comprender la patogenia de
las infecciones víricas y el papel de los antígenos víricos,
189
que podrían conducir al desarrollo de tratamientos eficaces
y vacunas. Tales estudios pueden auxiliarse del desarrollo
de técnicas mejoradas y pruebas automatizadas de pre-
paración para el corte fino y la exploración. Los avances
recientes en el diseño del microscopio electrónico, como
los microscopios ambientales de exploración que no re-
quieren procedimientos de secado complejos y extensos,
significan que no sólo las muestras pueden procesarse de
modo más rápido y fácil, sino que se evita la contracción
y la distorsión de la muestra. Como los microscopios se
tornan cada vez más “de uso amable”, la investigación de
virus por microscopia electrónica será más fácil.
Lecturas adicionales
Appleton H, Field AM. The electron microscope and public
health virology. Microsc Anal 1990; 20: 7-9.
Caul EO, Appleton H. The electron microscopical and physical
characteristics of small round human faecal viruses: An inte-
rim scheme for classification. J Med Virol 1982: 9: 257-265.
Doane FW, Anderson N. Electron Microscopy in Diagnostic Viro-
logy: A Practical Guide and Atlas. 1987: Cambridge Univer-
sity Press, Cambridge.
Madeley CR, Field AM. Virus Morphology, 2nd edn. 1988: Chur-
chill- Livingstone, Edinburgh.
Field AM. The contribution of the electron microscope. In Public
Health Virology: 12 Reports, Mortimer PP (ed.). 1986: Public
Heath Laboratory Service, London.
 19
Cultivo tisular
William L Irving y Alan Pawley
Introducción
Las partículas víricas consisten en material genético (ácido
nucleico) más una pequeña cantidad de proteínas, de ahí la
memorable cita de sir Peter Medawar “los virus son pro-
blemas envueltos en una capa de proteínas”. Algunos virus,
además, poseen un recubrimiento de lípidos. No hay or-
ganelos internos, como mitocondrias, ribosomas o aparato
de Golgi. Por lo tanto, los virus son parásitos intracelula-
res obligatorios, es decir, sólo pueden reproducirse dentro
de células vivas, de modo que usurpan la generación de la
energía y la maquinaria biosintética de la célula huésped.
El aislamiento de los virus a partir del material clínico re-
presenta entonces varios desafíos del todo distintos de los
que se encuentran en un laboratorio de bacteriología, en el
cual las bacterias pueden crecer en medios inanimados. La
presencia de células vivas en una forma u otra es el primer
requisito esencial para el crecimiento exitoso de los virus.
Por muchos años, los virus crecieron en huevos de galli-
nas fecundas. Una alternativa consiste en utilizar animales
experimentales completos. Aunque ambas técnicas pueden
todavía ser de valor en circunstancias especializadas, las
han reemplazado en gran parte los cultivos celulares deri-
vados de una variedad de tejidos en los laboratorios víricos
de rutina y crecen como monocapas sobre superficies de
cristal o plástico (es decir, tubos o frascos). En este capítu-
lo se discuten los detalles prácticos del funcionamiento de
un laboratorio de cultivo celular para el aislamiento de los
virus y se resaltan las ventajas y desventajas de esta apro-
ximación al diagnóstico de la infección vírica.
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker,
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
Selección de los cultivos celulares
El primer paso en el ciclo de la réplica de cualquier vi-
rus es la unión a su célula objetivo. Éste es un proceso muy
específico que implica la interacción precisa entre un li-
gando sobre la superficie del virus y un receptor sobre la
superficie de la célula objetivo. En consecuencia, no todos
los virus infectan y crecen en todos los tipos celulares; las
células que carecen del receptor apropiado para un virus
particular son resistentes a la infección por ese virus. Esto
crea un problema para el laboratorio de diagnóstico: para
proporcionar un servicio detallado para el aislamiento de
todos los virus posibles se requeriría la disponibilidad de di-
versos tipos celulares. En la práctica, la mayor parte de los
laboratorios analiza sólo dos o tres diferentes tipos de célula,
cada uno de los cuales apoya el crecimiento de una gama
de virus todo lo amplia posible. Los cultivos celulares más
comunes se enumeran en el cuadro 19-1, que también se-
ñala qué virus pueden crecer en cada uno. Aunque esta lis-
ta incluye a muchos de los virus comunes hallados en la
práctica clínica, algunos virus importantes (por ejemplo,
el virus de la inmunodeficiencia humana [HIV], los virus
de la hepatitis, los virus de la gastroenteritis, incluidos ro-
tavirus y adenovirus entéricos, y el virus de Epstein-Barr
[EBV]) no figuran allí, al igual que otros más. El aisla-
miento de algunos de estos microorganismos se puede
alcanzar por medio de técnicas especializadas de cultivo
celular, como el cultivo de órgano. Las características di-
ferenciales del tejido de origen pueden mantenerse en el
cultivo de órgano; por ejemplo, los anillos traqueales fetales
192 CAP. 19
Cuadro 19-1 Cultivos celulares comunes
Tipo de cultivo Virus capaces de crecer
Cultivos primarios/secundarios
Células renales del mono Virus de la influenza, virus
de la parainfluenza,
enterovirus, virus de las
paperas
Líneas celulares semicontinuas Virus del herpes simple
Fibroblastos embrionarios (HSV), virus de la varicela
humanos zoster, citomegalovirus,
enterovirus, adenovirus,
rinovirus
Líneas celulares continuas HSV, virus de las paperas
Células Vero (derivadas del
riñón del mono)
Células Hep-2/células HeLa Virus sincitial respiratorio,
adenovirus
Células renales caninas de Virus de la influenza
Madin Darby (MDCK)
humanos tienen células epiteliales ciliadas que funcionan
en el tracto respiratorio capaces de apoyar la replicación
de los virus comunes del resfriado. De manera alternativa,
pueden utilizarse cultivos celulares especializados, como
el HIV y el EBV, que pueden crecer en linfocitos humanos
de la sangre periférica, y algunos de los virus de la he-
patitis, que crecen en cultivos primarios del hepatocito, o
algunos de los virus de la hepatitis, que crecen en cultivos
de hepatocitos primarios o estirpes celulares derivadas del
hepatoma. Sin embargo, las dificultades de la disposición
de una fuente regular de estos cultivos más especializados
significa que el aislamiento de estos virus se restringe a
los laboratorios de referencia o de investigación. Otros vi-
rus (por ejemplo, los virus del papiloma humano, el virus
de la hepatitis C) son tan exigentes en sus requerimientos
para el crecimiento que el aislamiento en cultivo celular ha
demostrado ser casi imposible. El diagnóstico de la infec-
ción con estos virus debe apoyarse siempre en otras técni-
cas distintas del aislamiento en cultivo celular.
Preparación de cultivos celulares
El funcionamiento eficiente de un laboratorio de virología
diagnóstica requiere la disponibilidad de: a) células comu-
nes que crecen a gran escala y b) células maduras en núme-
ros pequeños. Estas últimas se preservan en un receptáculo
(casi siempre un tubo, aunque las placas de “microtitula-
ción” para cultivo celular son una alternativa) listo para la
inoculación con el material clínico apropiado, a medida
que dicho material llega al laboratorio. Cuando estos tu-
CULTIVO TISULAR
bos se utilizan, se sustituyen por tubos frescos preparados
a partir de los cultivos de reserva.
Todos los tipos celulares estándar enumerados en el cua-
dro 19-1 crecen como células de adhesión, no tanto como
suspensiones celulares. Esto significa que se unen a una su-
perficie plana (por lo regular frascos de plástico con cultivo
celular) y entonces se multiplican y dividen, a condición
de que el medio de cultivo contenga los nutrimentos nece-
sarios, hasta que se cubra la superficie completa. En este
punto, casi todas las células dejan de dividirse debido a la
inhibición por contacto. Este proceso se conoce como cre-
cimiento de confluencia. Una vez que una placa celular es
confluente, las células pueden desprenderse de la superficie
mediante una enzima proteolítica como la tripsina diluida
en un medio de cultivo, y verterse de nueva cuenta dentro
de una cantidad de frascos nuevos (p. ej., tres o cuatro),
donde crecen entonces otra vez para confluir. Este proceso
se conoce como pasaje celular y, de esta manera, el núme-
ro de las células disponibles puede ampliarse con rapidez.
De forma alternativa, las células de un frasco confluente
pueden distribuirse en concentraciones celulares bajas en
un estante para tubos con cultivo celular que, una vez que
las células se instalan y alcanzan la confluencia, esperan la
inoculación con el material clínico.
Las células se diferencian en su capacidad de someterse
a pasajes repetidos. Los cultivos primarios, es decir, aque-
llos establecidos de manera directa a partir del tejido (por
ejemplo, células renales del mono) no sobreviven más de
dos o tres pasajes in vitro. Esto es una desventaja impor-
tante para su uso, ya que el suministro continuo de cultivos
primarios frescos es costoso e inconveniente. En realidad,
existe una considerable preocupación de que el suministro
de células renales del mono pueda cesar por varias razones.
Estas células se han replicado para el aislamiento de los vi-
rus circulantes de la influenza y ha existido un gran esfuer-
zo para encontrar los sustratos celulares alternativos para
estos virus. Por comparación, las líneas celulares tumorales
(por ejemplo, células Hep-2, células HeLa) pueden divi-
dirse de modo indefinido cuando se transforman in vitro y
por lo tanto se conocen como líneas celulares continuas.
Entre estos dos extremos, las células diploides derivadas
del tejido embrionario humano (por ejemplo, fibroblastos
embrionarios humanos) pueden crecer con éxito en 30 o 40
pasajes antes de cesar y, por lo tanto, se denominan líneas
celulares semicontinuas.
Las células se cultivan en frascos de cultivo bajo con-
diciones estériles. La preparación se efectúa a menudo en
gabinetes con flujo laminar vertical, pero se puede realizar
en un lugar abierto con un mechero de Bunsen y la técnica
aséptica apropiada. El medio agregado a los frascos debe
ser isotónico y con un pH conveniente (por ejemplo, 7.2 a
7.4), casi siempre basado en soluciones salinas fisiológi-
 IDENTIFICACIÓN DEL CRECIMIENTO VÍRICO
camente equilibradas. La composición exacta del medio
puede variar de acuerdo con el tipo de célula: las fórmulas
detalladas están disponibles en guías prácticas. Es útil agre-
gar un colorante indicativo para permitir el reconocimiento
del metabolismo celular por un cambio del color (células
sanas que al crecer producen un medio ácido). Para el cre-
cimiento, son necesarios los aminoácidos esenciales y la
proteína y éstos se proporcionan bajo la forma de suero pro-
cedente de un bovino fetal. Los antibióticos se agregan al
medio de crecimiento como precaución adicional contra la
contaminación bacteriana o micótica, cuyas fuentes prin-
cipales son las bacterias flotantes, las levaduras a partir de
la fuente de dióxido de carbono y las especies de Myco-
plasma a partir de reactivos contaminados o del operador.
Estos últimos reducen en grado notable la capacidad de las
células para apoyar el crecimiento del virus.
Una vez que se alcanza la confluencia, las células se pue-
den desprender con procedimientos físicos mediante un ras-
pador de caucho de silicón estéril (conocido como “policía
de caucho”) o, las más de las veces, mediante el tratamiento
con tripsina y EDTA, que interrumpen la adhesión de las
células a la superficie plástica y dan lugar a que las células
se agrupen y desprendan. En esta etapa las células se pueden
contar en un hemocitómetro y se calcula el volumen apro-
piado para la resuspensión (para proporcionar la concentra-
ción de siembra óptima). Sin embargo, con experiencia, es
suficiente un cálculo aproximado del volumen necesario.
Si las células no se transforman más, como las que se ha-
llan listas en los tubos para la inoculación, entonces el medio
de crecimiento se sustituye por un medio de conservación,
una vez que se alcanza la confluencia; la diferencia radica en
que en el último la concentración de suero está sumamente
reducida. Las células confluentes en los tubos de cultivo ce-
lular con medio de conservación sobreviven por varios días,
pero se atenúan al final con lentitud a pesar de los cambios
del medio, punto en el cual deben desecharse.
Las células generadas para las investigaciones con virus
pueden, cuando se exceden los requisitos, conservarse como
reservas de semillas congeladas en nitrógeno líquido. Las
células se suspenden en un medio que contiene dimetilsul-
fóxido, que previene la formación de cristales de hielo que
destruyen a las células. Si es necesario, en caso de contami-
nación bacteriana de las células en uso, las células pueden
descongelarse con rapidez y prepararse los cultivos frescos.
Especímenes clínicos
para el aislamiento de virus
No hay ninguna restricción en la naturaleza del material
clínico que impida inocular en cultivo celular para el aisla-
miento de virus. Las muestras líquidas (por ejemplo, líquido
cefalorraquídeo, saliva, orina, líquido vesicular, aspirados
nasofaríngeos, líquido de lavado broncoalveolar, sangre,
193
heces diarreicas) pueden enviarse al laboratorio en un con-
tenedor estéril y agregarse a tubos de cultivo celular apro-
piados y limpios o sometidos a dilución en un medio de
conservación. Los escobillados (por ejemplo, de conjun-
tivas, garganta, base de la úlcera, cuello cervical, recto) se
deben introducir en el medio vírico de transporte (líquido
isotónico más los antibióticos para inhibir el sobrecreci-
miento microbiano), puesto que los virus no sobreviven en
los escobillados secos. Después de verter la botella para
liberar tanto material celular como sea posible a partir del
escobillado en el medio, el medio de transporte se inocula
sobre las placas celulares. Las biopsias tisulares (por ejem-
plo, cerebro, intestino, pulmón) se deben también colocar
en el medio de transporte vírico. El tejido puede picarse
muy fino y el material celular y el sobrenadante inocular-
se en cultivo.
Identificación del crecimiento vírico
Una vez que un espécimen clínico se inocula en los tubos
de cultivo celular, éstos se incuban bajo condiciones que se
asemejen, tanto como sea posible, a aquellas de las que
se obtuvo el material. La mayor parte de los cultivos se
mantiene a 37°C, pero algunos virus, sobre todo los de las
vías respiratorias superiores, crecen mejor a una tempera-
tura ligeramente más baja, como 33°C, y en presencia de
5% de dióxido de carbono. Los cultivos se pueden rotar
lentamente con un tambor de rodillo, que mejora la ai-
reación de la placa celular, o mantenerse inmóviles. El
desafío para el microbiólogo consiste entonces en determi-
nar si un cultivo celular dado contiene o no células en las
cuales se replica un virus. Existe una cantidad de opciones
disponibles para lograr este objetivo.
Efectos citopáticos
Cuando los virus se replican dentro de las células, éstas
pueden experimentar cambios morfológicos como acre-
centamiento debido a la alteración de la permeabilidad de
la membrana, contracción por la muerte celular o forma-
ción de células gigantes multinucleadas por la presencia
de una proteína de fusión que el virus codifica. Estos cam-
bios de la morfología celular, visibles bajo el microscopio
de luz, se refieren como efecto citopático (ECP) y los virus
que inducen estos cambios son citopatógenos. Por consi-
guiente, la presencia de un virus dentro de un cultivo celu-
lar puede determinarse por el examen regular (por ejemplo,
cada dos días) del cultivo bajo la lente de bajo poder de un
microscopio de luz para reconocer el desarrollo de un ECP.
El aspecto exacto de un ECP es variable, de acuerdo
con el virus causante y el tipo de célula en que ocurre. Las
células pueden aumentar de tamaño con rapidez, secarse o
fundirse en el sincitio (células multinucleares gigantes). El
efecto puede extenderse a lo largo de la placa celular en-
194 CAP. 19 CULTIVO TISULAR
(a)
Figura 19-1 Efectos citopáticos. a) Una placa celular normal de
fibroblastos. Las células han crecido para confluir y toman la for-
ma de huso. b) Algunas de las células están redondeadas y agran-
dadas. Este aspecto en focos discretos separados por las células
que parecen normales es típico del efecto citopático que induce
el citomegalovirus. c) Varias células se han agrupado por toda la
placa celular para conferir un aspecto de “salpicadura”. Éste es el
aspecto característico del ECP que induce un rinovirus.
tera o puede ser mucho más focal en naturaleza. Puede
verse de manera predominante, cuando no exclusiva, en el
borde de la placa, tanto como en el centro. El ritmo de de-
sarrollo del ECP puede variar de tan poco como 18 horas
hasta incluso cuatro semanas. Si se tienen en cuenta todos
estos factores, más los detalles clínicos relevantes de un
espécimen particular, un virólogo puede diagnosticar qué
virus está presente en el cultivo a través de la observación
por microscopia de luz de tan sólo el ECP. En consecuen-
cia, un ECP que se origina en un escobillado de una vesícu-
la, que posee células agrandadas que aparecen después de
24 horas de cultivo y que se extienden con rapidez para
destruir la placa celular entera, es muy probable atribuir-
lo al virus del herpes simple. En cambio, un escobillado
de una vesícula que da lugar a que un ECP aparezca sólo
después de 10 días de cultivo, en sólo dos o tres focos de
células agrandadas en el centro de la placa, y que se extien-
de en forma lenta durante varios días después, es probable
que se explique por el virus de la varicela-zoster. En la fi-
gura 19-1 se listan las características de los ECP para virus
específicos.
Pasaje de los virus
La replicación de los virus dentro de una placa celular no
es la única causa de un ECP visible. El material inoculado
(b)
(c)
sobre la placa puede ser citotóxico, un problema en espe-
cial frecuente con muestras fecales; puede ocurrir también
la contaminación con otros microorganismos, a pesar de
todas las precauciones tomadas. Si existe alguna duda en
cuanto a los orígenes de un ECP, una manera simple de
distinguir entre un virus comparado con un efecto tóxico
consiste en procurar el pasaje del virus supuesto. Las cé-
lulas que permanecen en la placa celular se raspan dentro
del sobrenadante del cultivo y algunas gotas del material
resultante se inoculan en un tubo con cultivo celular fresco.
Si había en verdad un virus en el cultivo original, enton-
ces no sólo reaparece el ECP dentro del tubo nuevo, sino
que el ritmo de desarrollo debe ser más elevado; asimis-
mo, la cantidad, o el título, del virus se tiene que incremen-
tar de forma significativa luego del crecimiento vírico en el
primer cultivo. Empero, si el ECP original surge debido a
algún componente tóxico del espécimen, entonces éste se
diluye en el segundo tubo y el ECP subsiguiente debe desa-
rrollarse de forma más lenta y extenderse menos, si acaso.
El pasaje de virus es útil por otras dos razones. En pri-
mer lugar, algunos virus pueden no producir un ECP vi-
sible cuando crecen primero en un cultivo, aun cuando,
en efecto, la réplica tenga lugar. Sin embargo, en el pasaje
repetido en el mismo sustrato celular, un ECP puede ser
evidente después de la adaptación del virus al crecimiento
en ese tipo particular de célula. El proceso del pasaje de vi-
 IDENTIFICACIÓN DEL CRECIMIENTO VÍRICO
rus a partir de células al parecer normales se conoce como
pasaje ciego, quizá porque en esa etapa el virólogo no pue-
de reconocer la presencia del virus. La identificación del
virus de la rubeola que crece en células renales de conejo
(RK13) puede requerir varios pasajes ciegos. En segundo
lugar, el pasaje de virus es un buen método que incrementa
la cantidad de virus disponibles para otros estudios, como
en la prueba de neutralización (véase más adelante).
Confirmación del aislamiento del virus
En la mayor parte de los casos, el tipo de virus en un cul-
tivo celular se puede determinar con certeza razonable
mediante la observación de las características del ECP pre-
sente en la placa celular, según lo descrito antes. Pese a
ello, hay casos en que puede requerirse la confirmación de
la identidad del virus, por ejemplo, si el ECP es atípico, no
se realiza bien el pasaje o está ausente o, de manera alter-
nativa, cuando se requiere más información sobre la cepa
particular del virus. Esto se puede conseguir con el uso de
la microscopia electrónica, la detección del antígeno o las
pruebas de neutralización.
El proceso del cultivo celular actúa como medio para
incrementar el título vírico a un grado suficiente que per-
mita la visualización por microscopia electrónica (ME).
De esta manera, a condición de que haya acceso a ME,
casi todos los problemas relacionados con ECP atípicos
o inusuales pueden resolverse con rapidez por el examen
apropiado con ME de las células o el sobrenadante del cul-
tivo. Los virus necesitan tener una concentración ⱖ 106
partículas/ml para utilizar esta técnica con éxito.
Las células infectadas con un virus particular expresan
los antígenos derivados de ese virus. Estos antígenos pue-
den detectarse si se tiñen con anticuerpos. Por lo tanto, la
identidad específica de un virus que crece en cultivo celu-
lar puede determinarse al teñir las células con un panel de
anticuerpos monoclonales apropiados, marcados de manera
conveniente con una marca inmunofluorescente. Las cé-
lulas pueden rasparse o aspirarse fuera de los tubos con
cultivo celular y después secar sobre un portaobjetos de
cristal con multisitios cubiertos con teflón o, si se conoce
que es necesaria la detección del antígeno, las células pue-
den crecer sobre una superficie plana, como un cubreobje-
tos, dentro del tubo con cultivo celular, que puede entonces
recuperarse, fijarse y teñirse. La detección del antígeno
hace posible la distinción entre, por ejemplo, virus de la
influenza A y B o los virus de la parainfluenza 1, 2, 3 o 4,
todos los cuales producen una prueba positiva similar a la
hemadsorción (véase más adelante).
Las pruebas de neutralización se utilizan casi siempre
para distinguir entre los diversos enterovirus que crecen
en cultivo o para la serotipificación de adenovirus. En prin-
cipio, el virus aislado en cultivo se distribuye en una se-
195
rie de tubos y a cada tubo se agrega un antisuero diferente
(por ejemplo, antipolio 1, antipolio 2, antipolio 3 a los tu-
bos 1, 2 y 3, respectivamente). Después de la incubación
del virus más el antisuero por una hora, las mezclas se agre-
gan a los tubos individuales con cultivo celular y el as-
pecto del ECP se supervisa durante los días siguientes. La
ocurrencia de un ECP típico en los tubos 1 y 3, combinada
con la ausencia de un ECP en el tubo 2, indica que el virus
original era un poliovirus de tipo 2.
Adaptaciones del cultivo celular
En condiciones normales, el aislamiento del virus por cul-
tivo celular es mucho más lento que el aislamiento bac-
teriano en medios inanimados. El crecimiento vírico más
rápido, el del virus del herpes simple, puede producir un
ECP después de 18 horas, pero casi todos los virus requie-
ren varios días (o aun semanas) para hacerlo. ¡Esto es una
desventaja considerable! Así, se han introducido diversas
modificaciones del cultivo celular con el propósito de ace-
lerar el proceso. Dos de ellas, adoptadas por los laborato-
rios de diagnóstico son la hemadsorción y la detección de
los focos fluorescentes del antígeno temprano.
Algunos virus (por ej., los virus de influenza y parain-
fluenza y los de las paperas) poseen una hemaglutinina (es
decir, una proteína que se une a los eritrocitos). Las células
infectadas expresan esta molécula en sus superficies. De
esta manera, si los eritrocitos se añaden a un tubo con cul-
tivo celular en el cual el virus se halla bajo replicación, al
final se adhieren a la placa celular, un fenómeno conocido
como hemadsorción (fig., 19-2a). La hemadsorción es de-
mostrable (al girar con suavidad el tubo con cultivo) por
algunos días antes de que el ECP sea evidente. La naturale-
za exacta del virus hemadsorbente puede determinarse tras
teñir con anticuerpos monoclonales.
La detección de focos fluorescentes del antígeno tem-
prano (prueba de DEAFF) se desarrolló de modo específico
para acelerar la identificación del citomegalovirus (CMV)
en cultivo celular. En esencia, la DEAFF es una adapta-
ción de la detección del antígeno en la cual los antígenos
a detectarse se seleccionan como aquellos que aparecen en
fase temprana (dentro de las 24 a 48 h) en el ciclo de la
replicación del virus (de ahí la denominación de “antíge-
nos tempranos”). Entonces, el material clínico se inocula
sobre una placa celular que creció sobre un cubreobjetos
u otra superficie plana (un tipo de cultivo conocido como
shell vial). Hay un paso de centrifugación (2 500 ⫻ g ⫻ h)
que aumenta en grado considerable la infectividad de la
placa celular por el virus. Después de 24 horas, la placa
se lava y en seguida se tiñe con un anticuerpo monoclo-
nal marcado con fluoresceína dirigido contra un antígeno
temprano del CMV. El cubreobjetos se examina entonces
bajo luz ultravioleta. Un resultado positivo se indica por la
196 CAP. 19 CULTIVO TISULAR

(a) (b)

Figura 19-2 Adaptaciones del cultivo celular. a) Hemadsorción. La placa celular (riñón del mono) es normal, esto es, ningún
efecto citopático visible se ha desarrollado aún. Sin embargo, muchas células dentro de la placa expresan una hemaglutinina
codificada de forma vírica sobre su superficie, como los eritrocitos, aquí observados como puntos pequeños que cubren la placa
celular, y se han unido a la placa. b) Prueba de DEAFF. La placa celular se tiñe con un anticuerpo monoclonal anti-CMV marcado
de modo fluorescente. Un solo núcleo se advierte en tono verde manzana, intenso y brillante, bajo la luz ultravioleta, lo que indica
la presencia del CMV en esta célula. Todas las células (contrateñidas con el colorante azul de Evans) son normales en términos
morfológicos.

presencia de núcleos fluorescentes en las células aisladas Cuadro 19-2 Aislados víricos potenciales obtenidos
(es decir, focos), que parecen normales desde el punto de de material clínico
vista morfológico (véase la fig. 19-2b). Esta técnica se ha
extendido a otros virus de crecimiento lento; por ejemplo, Virus que pueden aislarse en
los adenovirus pueden reconocerse mucho antes que sea Espécimen clínico cultivos celulares comunes
evidente cualquier ECP si se tiñen con anticuerpos contra Líquido o escobillado de una Virus del herpes simple (HSV),
antígenos tempranos del adenovirus. vesícula virus de la varicela zoster
Aspirado nasofaríngeo o Virus sincitial respiratorio,
Conclusiones escobillado de la garganta virus de la influenza A y B,
virus de la parainfluenza
El aislamiento de virus en cultivos celulares es todavía una 1-4, adenovirus, rinovirus,
técnica importante para el diagnóstico de las infecciones enterovirus, HSV,
víricas. En teoría, una sola partícula vírica dentro de un citomegalovirus (CMV)
espécimen clínico puede crecer en cultivo celular y, de ese Heces Enterovirus, adenovirus
modo, extenderse por muchos órdenes de magnitud, lo cual Líquido cefalorraquídeo Enterovirus, virus de las paperas
permite la detección y caracterización exactas. Los altos Orina CMV, virus de las paperas
grados de sensibilidad y especificidad inherentes al aisla- Escobillado conjuntival HSV, adenovirus
Sangre (placa CMV
miento del virus son los “estándares de oro” contra los que
leucoplaquetaria)
deben compararse las nuevas técnicas. La metodología es
apropiada para una amplia gama de especímenes clínicos y
diferentes virus (cuadro 19-2). En raras ocasiones, su uso
da lugar a la identificación de virus inesperados o inclu- celular, que contribuyen a disponer de un arsenal cada vez
so sin identificación previa: el HIV y los virus del herpes más extenso de virus, puede superar en cierto grado el pro-
humano 6 y 7 se descubrieron primero en cultivo celular blema anterior, aunque hay varias adaptaciones del cultivo
y el último virus que se identificó de esta manera es el co- celular que pueden acelerar el proceso de identificación vírica.
ronavirus del síndrome respiratorio agudo grave. Es una
técnica que analiza todo y está bien adaptada a la identi- Lecturas adicionales
ficación de lo “desconocido” en especímenes clínicos. Lennette EH, Schmidt NJ (eds). Diagnostic Procedures for Viral
Los dos inconvenientes principales de esta técnica son, Rickettsial and Chlamydial Infections, 7th ed. 1996: American
primero, que no todos los virus pueden crecer en cultivo Public Health Association, Washington, DC.
y, segundo, que algunos virus experimentan además creci- Cann AJ (ed.). Virus Culture: A Practical Approach. 1999: Oxford
miento lento. El desarrollo de los nuevos tipos de cultivo University Press, Oxford.
 20
Pruebas serológicas en virología
Goura Kudesia
Introducción
El sistema inmunitario produce los anticuerpos en respuesta
a varios estímulos, incluidas las infecciones, y la serología
es la ciencia de la cuantificación de estos anticuerpos en el
suero. Por convención, el término “serología” también inclu-
ye el estudio del suero para el antígeno y, por extensión, se
define cualquier prueba que implica una reacción antígeno-
anticuerpo como prueba serológica. Las pruebas serológicas
aprovechan el hecho de que la mayor parte de las infecciones
víricas y muchas bacterianas, micóticas y parasitarias obtie-
nen buenas reacciones del anticuerpo. Estas pruebas se han
utilizado para el diagnóstico de enfermedades víricas u otras
enfermedades en las que los microorganismos no se aíslan
con facilidad, por ejemplo Toxoplasma y sífilis. En infeccio-
nes víricas como la hepatitis B, en la que hay una fase viré-
mica prolongada, se pueden utilizar técnicas similares para
detectar el antígeno del virus. Este capítulo, aunque se limita
sobre todo a la serología del virus, también considera otras
pruebas serológicas empleadas hoy día en los laboratorios de
serología para el diagnóstico de enfermedades infecciosas y
describe los principios, técnicas, interpretación y futuro de
estas pruebas.
Principios
La clase del anticuerpo producido y las propiedades fun-
cionales pueden explotarse para medir la respuesta inmu-
nitaria después de la infección. Las clases de anticuerpo
más útiles para la medición son IgM e IgG. La cuantifica-
ción del anticuerpo IgA secretorio y sérico puede también
ser útil, pero es más exigente en términos técnicos y por lo
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
tanto no se utiliza de rutina en laboratorios de diagnóstico.
El anticuerpo inicial que se produce después de la infección
primaria es de la clase IgM y se vuelve casi siempre percep-
tible uno a dos días después del inicio de los síntomas y así
permanece seis a 12 semanas. El anticuerpo IgG específico
comienza a aumentar en una a dos semanas y es perceptible
por muchos años, cuando no el resto de la vida, después de
la infección. Por consiguiente, el anticuerpo IgG específico
del virus sólo se relaciona con la infección pasada y en casi
todos los casos denota inmunidad para la infección futura.
Por otra parte, como el anticuerpo IgM específico del virus
suele ser imperceptible después de tres meses, su presencia
indica una infección reciente. La figura 20-1 muestra una
representación gráfica de la reacción de IgM e IgG después
de la infección primaria. La medición de los anticuerpos
IgG e IgM específicos del virus en una sola muestra del
suero puede por tanto auxiliar en el diagnóstico y ayudar a
distinguir la infección vírica reciente de la pasada. Muchas
técnicas, como el inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA
o EIA), el ensayo inmunofluorescente (IFA, por sus siglas
en inglés) y el radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en
inglés), se han desarrollado para medir IgG e IgM especí-
ficas. En condiciones normales, estas pruebas se usan para
resultados “cualitativos”, es decir, un resultado de la prue-
ba positivo o negativo y no son cuantitativas. Tienen prin-
cipios similares por los cuales la reacción del anticuerpo
con el antígeno se detecta por la adición de un segundo
anticuerpo dirigido contra la inmunoglobulina humana. La
antiinmunoglobulina se marca con la fluoresceína (IFA),
la enzima (ELISA) o el radioisótopo (RIA). Estas técnicas
se pueden también emplear para la detección del antígeno.
El anticuerpo producido en respuesta a una infección
puede también ser distinto en su aspecto funcional, esto es,
198 CAP. 20 PRUEBAS SEROLÓGICAS EN VIROLOGÍA
Figura 20-1 Reacción de IgM e IgG en las infecciones tem-
prana, reciente, convaleciente y pasada.
puede ser fijador del complemento, hemaglutinante o neu-
tralizante. Los antígenos presentes en el virus determinan
las características funcionales del anticuerpo producido
en respuesta, de modo que sólo los virus (p. ej., rubeola,
sarampión o influenza) que poseen hemaglutinina desen-
cadenan anticuerpos hemaglutinantes. Puede utilizarse
el conocimiento de la estructura antigénica de los virus para
concebir pruebas serológicas convenientes, como fijación
del complemento (FC), hemaglutinación (HA) o pruebas de
inhibición de la hemaglutinación (IHA). Estas pruebas detec-
tan las clases de IgG e IgM del anticuerpo al mismo tiempo y
pueden cuantificar la reacción serológica. Es posible solicitar
diluciones seriadas del suero para determinar el título del an-
ticuerpo presente. Se requieren muestras del suero agudas y
de convaleciente pareadas para establecer un diagnóstico de
la infección reciente: un aumento del cuádruple o mayor en
el valor del anticuerpo es diagnóstico.
Técnicas
Las técnicas serológicas se pueden dividir con base en la
complejidad de la prueba. Las más simples son aquellas
en las cuales la presencia del anticuerpo se demuestra por
una interacción simple con el antígeno (las pruebas de
precipitación o aglutinación). Las siguientes son las que
implican sistemas indicadores para reconocer la reacción
antígeno-anticuerpo (neutralización o fijación del comple-
mento). Las pruebas más complejas suponen el uso de un
segundo sistema con anticuerpo marcado, como el ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o IFA.
Precipitación
El método de doble difusión (DD) de Ouchterlony se pue-
de utilizar para detectar el anticuerpo o el antígeno. En el
primer caso se usa un antígeno conocido y en el segundo
un anticuerpo de especificidad conocida. El anticuerpo y el
antígeno se difunden el uno hacia el otro en gel de agaro-
sa y una línea de precipitación blanca indica una reacción
positiva. La contrainmunoelectrofluorescencia (CIE) dirige
de manera específica el movimiento del antígeno y el an-
ticuerpo el uno hacia el otro en un campo eléctrico y por
lo tanto es más rápido que el DD. La CIE fue el método
usado de manera original en la identificación del antígeno
superficial de la hepatitis B. Estos métodos se han sustitui-
do sobre todo por técnicas mucho más sensibles, aunque
algunos laboratorios todavía las utilizan para las pruebas
de anticuerpos de hongos.
Hemaglutinación e inhibición
de la hemaglutinación (HA e IHA)
La hemaglutinina de ciertos virus, como los virus de la in-
fluenza, el sarampión y la rubeola, tiene la propiedad de
aglutinar a los eritrocitos de las especies seleccionadas. Las
pruebas de HA son las más utilizadas con los virus de la
influenza. Las influenzas A y B aglutinan a los eritrocitos
del grupo O humano, del cobayo y las gallinas a 4 y 20°C,
mientras que la influenza C aglutina sólo a eritrocitos de
gallinas. Las pruebas de HA son por tanto útiles en la de-
tección y titulación del antígeno vírico. La IHA utiliza la
presencia de la hemaglutinina en el virus para identificar al
anticuerpo. La prueba se basa en el principio según el cual
el anticuerpo específico se combina con la hemaglutinina
e inhibe a la HA. Se permite que diluciones seriadas del
suero del paciente reaccionen con una cantidad especifica-
da de hemaglutinina y entonces se agregan los eritrocitos
indicadores apropiados. Si el anticuerpo específico está
presente, bloquea la hemaglutinina y por consiguiente se
advierte una reacción positiva por la ausencia de la hema-
glutinación. Donde está ausente el anticuerpo específico,
la hemaglutinina vírica está libre para aglutinar a los eri-
trocitos indicadores (reacción negativa). En el pasado, las
pruebas de IHA se usaron de modo amplio para establecer
el estado inmunitario y diagnosticar infecciones recientes
del virus de la rubeola. Sin embargo, la IHA es complicada
por el hecho de que el suero necesita tratamiento anterior
para retirar los inhibidores inespecíficos, y por lo tanto se ha
reemplazado con técnicas más sensibles y específicas para
el diagnóstico de la rubeola. Pese a ello, los laboratorios de
referencia todavía utilizan la IHA para la identificación y
tipificación de los virus de la influenza. Las técnicas de HA
se pueden también emplear para los virus que no poseen
 TÉCNICAS
hemaglutinina; esto se logra al hacer acoplar el antígeno
vírico a la superficie de los eritrocitos por un agente aco-
plador como el ácido tánico. Cuando se mezclan con el
suero que contiene el anticuerpo específico, los eritrocitos
se aglutinan porque el antígeno vírico se liga a su superficie
(HA indirecta o pasiva). La HA indirecta se ha usado para
el reconocimiento del anticuerpo contra el toxoplasma. No
obstante, debido a la inestabilidad de los eritrocitos, en la
actualidad se utilizan partículas inertes de portador, como
partículas de látex, gelatina y carbón.
Pruebas de aglutinación de partículas
Muchas pruebas se basan en la aglutinación de la partícula.
Estas pruebas se llevan a cabo sobre un portaobjetos o una
diapositiva de cartón o bien en celdillas de microtitulación.
Lo que sigue no es una lista exhaustiva, sino ejemplos de
algunas de las pruebas más comunes de uso actual.
Aglutinación de látex (AL)
Las micropartículas de látex de poliestireno se sensibilizan
o cubren con el antígeno vírico aglutinado cuando se mez-
clan con el suero del paciente que contiene el anticuerpo
específico. Las partículas de látex revestidas con el antígeno
se mezclan con el suero del paciente sobre un portaobjetos
o en una celdilla de microtitulación. Un patrón visible de
aglutinación aparece si el anticuerpo específico está presen-
te. Estas pruebas son de uso amplio en los laboratorios de
virus debido a su rapidez, simplicidad y facilidad de uso. En
la actualidad están disponibles buenas pruebas de AL para la
rubeola, el toxoplasma y el citomegalovirus. Las pruebas
199
Figura 20-2 Prueba de aglutinación de partículas
de gel con Mycoplasma pneumoniae.
de AL se utilizan para el examen de una sola muestra de
suero para establecer inmunidad y los sueros pareados para
diagnosticar una infección reciente.
Prueba de aglutinación de partícula de gelatina
Las partículas de gelatina se cubren con el antígeno y las
diluciones seriadas del suero de un paciente se prueban en
celdillas de microtitulación. El título del anticuerpo se de-
termina por la dilución más alta del suero que aglutina las
partículas revestidas de antígeno. Puede ocurrir la aglutina-
ción inespecífica y por lo tanto las partículas de gelatina sin
cubrir se incluyen siempre como controles (fig. 20-2).
VDRL
VDRL es una prueba serológica para el examen de la in-
fección de sífilis. Una modificación de la prueba utiliza el
antígeno que contiene carbón microparticulado para exa-
minar el anticuerpo reagina. El uso de las partículas de car-
bón incrementa la lectura visual del resultado de la prueba
en un fondo blanco.
Fijación del complemento (FC)
El suero del paciente, después de la inactivación a 56°C por
30 minutos para destruir el complemento nativo, se agrega
a una cantidad conocida del antígeno vírico y del comple-
mento de conejo. Si ocurre la reacción anticuerpo-antígeno,
entonces se activa el complemento, “se fija” o se liga. Luego
se agrega un sistema detector del antígeno y el anticuerpo,
200 CAP. 20 PRUEBAS SEROLÓGICAS EN VIROLOGÍA
Figura 20-3 Inmunoensayo de enzimas de IgG e
IgM de la varicela zoster.
bajo la forma de eritrocitos de oveja sensibilizados con
el anticuerpo del conejo para los eritrocitos de oveja (he-
molisina). Si la primera reacción antígeno-anticuerpo “fija”
el complemento, los eritrocitos de oveja no se lisan, lo
cual indica una reacción y una presencia positivas del an-
ticuerpo específico en el suero. La hemólisis de eritrocitos
sensibilizados de las ovejas por el complemento señala una
reacción negativa. La prueba FC es cuantitativa. El suero se
diluye de modo seriado y el valor del anticuerpo se expresa
como recíproco de la dilución más alta del suero que da lu-
gar a la hemólisis de 50% de los eritrocitos sensibilizados.
Un aumento del cuádruple del título o la seroconversión
entre una muestra aguda y otra de suero de convaleciente
son diagnósticos. Esta técnica requiere destreza conside-
rable y mucho trabajo, pero el suero se puede probar con-
tra antígenos múltiples en una sola ocasión con el mismo
sistema indicador. Las pruebas de FC se efectúan sólo en
laboratorios de virología especializados y son todavía las
pruebas de opción para el diagnóstico serológico de las in-
fecciones víricas respiratoria y bacteriana atípicas.
Neutralización
La interacción del anticuerpo específico con el virus neu-
traliza la infectividad y previene la infección de un siste-
ma huésped viviente susceptible a ese virus. Una desventaja
importante de estas pruebas es que se requiere un sistema
huésped vivo, bajo la forma de un cultivo celular o animales
vivos y por lo tanto muchas de estas pruebas se han reem-
plazado con otras técnicas. Las pruebas de neutralización
todavía se utilizan para detectar el anticuerpo del poliovirus
y ciertas toxinas, como en el caso de Clostridium difficile.
Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA)
Ésta es la prueba serológica más difundida de uso corrien-
te. Se conocen muchas variaciones de la metodología, pero
todas implican la fijación del antígeno a una fase sólida,
la cual es casi siempre una placa o gota de poliestireno o
polivinilo. Se agrega el suero del paciente y después de
una extensión apropiada de tiempo para permitir al anti-
cuerpo unirse al antígeno sobre la fase sólida, se eliminan
mediante lavado el material ligado de forma inespecífica y
el exceso de suero. Entonces se agrega una inmunoglobuli-
na antihumana marcada por la conjugación con una enzi-
ma (conjugado). El conjugado se une al anticuerpo en el
complejo de antígeno-anticuerpo. El exceso de conjugado
se lava entonces para removerlo y la presencia de la inmu-
noglobulina antihumana marcada ligada se identifica por la
adición de un sustrato conveniente para la enzima marca-
dora. Si han ocurrido las reacciones apropiadas, entonces
el sustrato se convierte en un producto absorbente de luz y
aparece coloreado. En ausencia del anticuerpo, no se pro-
duce ningún color (fig. 20-3). La intensidad del color se re-
laciona directamente con la cantidad del anticuerpo ligado
al antígeno. El cambio del color puede cuantificarse a sim-
ple vista o lo registra un espectrofotómetro para revelar la
intensidad exacta de la reacción. Los sistemas de enzima-
sustrato de uso corriente son peroxidasa del rábano (HRP),
O-fenilendiamina (OPD) y fosfatasa alcalina y fosfatasa de
p-nitrofenilo. Para adaptar la prueba a la detección del an-
tígeno, la fase sólida se cubre con el anticuerpo específico
para el antígeno a detectar. Un segundo anticuerpo marca-
do se añade entonces para detectar cualquier complejo an-
tígeno-anticuerpo en la superficie de la fase sólida. Según
sea la secuencia de reacción, las pruebas ELISA se dividen
 TÉCNICAS
Figura 20-4 Diferentes formatos de la prueba ELISA.
(a) ELISA indirecta:
1. Fase sólida de la capa con el antígeno vírico.
2. Incubar con el suero del paciente. El anticuerpo específico
presente se fija al antígeno unido a la fase sólida.
3. Agregar la enzima marcada anti-IgG o anti-IgM.
4. Agregar el sustrato; cambia el color si la reacción es positiva.
(b) ELISA de captura:
1. Fase sólida de la capa con anti-IgG o IgM.
2. Incubar con el suero del paciente. Todas las IgG o IgM
presentes se capturan en la fase sólida.
3. Agregar el antígeno; éste une a cualquier anticuerpo espe-
cífico capturado.
201
4. Agregar el antivírico IgG marcado con enzima.
5. Agregar el sustrato; cambia el color si la reacción es positiva.
(c) ELISA competitiva:
1. Fase sólida de la capa con el antígeno.
2. Agregar el suero del paciente y el anticuerpo específico
marcado con enzima. El anticuerpo específico compite con
el conjugado para unirse a la fase sólida.
3. Agregar el sustrato. La reacción positiva se muestra sin color
en (a), ya que el anticuerpo específico bloqueó al conjugado.
La reacción negativa se muestra por el color en (b), ya que el
anticuerpo marcado con enzima no se bloqueó.
202 CAP. 20 PRUEBAS SEROLÓGICAS EN VIROLOGÍA
en directas, indirectas, de captura o competitivas. La figura
20-4 explica algunas de las diferencias entre estos méto-
dos. Las pruebas son específicas para IgM o IgG, según
sea que se emplee IgM antihumana o IgG como el segundo
anticuerpo. Para una revisión detallada, véase la obra de
Booth, 1983 (véanse las Lecturas adicionales).
ELISA es una técnica muy sensible porque una cantidad
pequeña de enzima puede procesar una cantidad grande de
sustrato. Los resultados negativos falsos de IgM pueden
ocurrir en presencia de valores altos de IgG específica, que
compiten por el antígeno en la fase sólida. Esto puede evi-
tarse si se remueve la IgG antes de la prueba de la muestra.
Las reacciones inespecíficas en el ensayo de IgM pueden
también ocurrir debido a la presencia del factor reuma-
toide (RF). El RF de la clase de IgM se une a los antígenos
nuevos expuestos debido a los cambios configuracionales
en la región Fc de la molécula IgG específica cuando ésta
se liga al antígeno en la fase sólida. El RF de la IgM no
puede distinguirse de la IgM específica del virus, pero el
RF se puede remover por absorción con el agregado de IgG
antes del examen para la IgM. Se prefieren los ensayos de
captura para IgM, ya que no se afectan con el RF o la IgG
específica en el suero del paciente. Las pruebas ELISA tie-
nen la ventaja de ser objetivas, se pueden automatizar con
facilidad y no requieren gran destreza técnica. Son pruebas
rápidas y la mayor parte de los métodos se pueden comple-
tar dentro de dos a tres horas. Casi todos los laboratorios
microbiológicos, si no todos, están equipados para realizar
ELISA, que son de uso extenso para la investigación y el
diagnóstico serológico del HIV, hepatitis vírica, rubeola,
citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus de la varicela
zoster, sarampión, paperas, toxoplasma, Chlamydia tra-
chomatis, etcétera.
Inmunofluorescencia (IF)
En la IF indirecta para la detección del anticuerpo, las cé-
lulas infectadas por virus o el antígeno bacteriano se fijan
a las celdillas en portaobjetos cubiertos de teflón, se añade
el suero del paciente y se detecta la reacción antígeno-anti-
cuerpo por la adición de la inmunoglobulina antihuma-
na marcada con el colorante fluoresceína (isotionato de
fluoresceína). La reacción se registra debajo de un mi-
croscopio de luz fluorescente y las reacciones positivas se
indican por la fluorescencia verde manzana típica. Se han
utilizado por muchos años las pruebas de IF indirectas para la
identificación de los anticuerpos IgM e IgG para los cito-
megalovirus, el virus de Epstein-Barr y el virus de la vari-
cela zoster. Las reacciones positivas falsas secundarias a la
expresión de receptores sobre las células infectadas, a las
cuales se puede unir el anticuerpo específico no vírico de
la clase IgM, son un problema. Las pruebas de IF también
requieren equipo especializado, como un microscopio de
fluorescencia, y están sujetas al criterio del operador en la
lectura. Por lo tanto, las han sustituido las pruebas ELISA
para la detección del anticuerpo. Por otra parte, la disponi-
bilidad de los anticuerpos monoclonales de buena calidad
para una variedad de antígenos víricos ha convertido a la
IF directa en el método ideal para la detección del antíge-
no en varios tejidos y muestras. El material infectado se
fija encima de un portaobjetos con la ayuda de acetona o
alcohol y se tiñe con el anticuerpo monoclonal marcado
con fluoresceína dirigido contra el antígeno bajo prueba.
La IF directa se utiliza extensamente para el diagnóstico
rápido de virus respiratorios por el examen de las células
epiteliales de aspirados nasofaríngeos para el virus sinci-
tial respiratorio, los virus A y B de la influenza, los virus
1, 2 y 3 de la parainfluenza y los adenovirus.
Radioinmunoensayos (RIA)
Éstos se basan en los mismos principios que los métodos
ELISA. Las pruebas de RIA usan un radioisótopo marcado
en vez de una enzima marcada. Debido a la corta vida útil
del radiomarcador y los requisitos especiales para eliminar
la radiactividad, las técnicas ELISA los han reemplazado.
Western blot (WB) o inmunoensayo en línea (LIA)
Representan una herramienta muy específica y sensible
para detectar y caracterizar a los anticuerpos contra micro-
organismos en virtud de su enlace a los antígenos fijados
a las membranas de nitrocelulosa. Para la prueba WB se
separan las proteínas víricas o bacterianas semipurificadas
por electroforesis en un gel de poliacrilamida y después
se transfieren de modo electroforético a una membrana de
nitrocelulosa. En el inmunoensayo en línea los antígenos
víricos, producidos por técnicas moleculares recombinan-
tes o sintetizados de manera artificial (péptidos sintéticos),
se unen directamente a la membrana de nitrocelulosa.
La membrana de nitrocelulosa se incuba con el suero del
paciente para permitir al anticuerpo unirse a los antígenos
fijados en la membrana. Se agrega la inmunoglobulina
antihumana con enzima marcada con base en un princi-
pio similar al de la prueba ELISA. Se siguen los pasos de
lavado apropiados. En la adición del sustrato pueden ser
visibles las bandas del antígeno para las cuales el anticuer-
po específico está presente.
La técnica es única en el sentido de que puede identi-
ficarse el anticuerpo contra las proteínas víricas o bacte-
rianas simples o los epitopos antigénicos, lo que torna a la
prueba muy específica. Se utilizan en extenso como prue-
bas de confirmación para el HIV y el virus de la hepatitis C
y para el diagnóstico de la enfermedad de Lyme.
 INTERPRETACIÓN Y USO DE LAS PRUEBAS SEROLÓGICAS
Pruebas de avidez del anticuerpo
Las técnicas para medir la avidez del anticuerpo IgG se han
desarrollado para ayudar a la cronología de la infección por
serología. El anticuerpo de avidez baja se produce de for-
ma inicial después de la infección primaria, mientras que el
anticuerpo de avidez alta lo hace después de la reinfección
o la recrudescencia. Las pruebas de avidez del anticuerpo
se basan en el principio de que los complejos antígeno-
anticuerpo de avidez alta requieren más energía para la di-
sociación o prevención de la formación del complejo. En la
celdilla de prueba, el anticuerpo de avidez baja se remueve
por lavado con 8 M de urea (disociación) o los enlaces se
previenen desde la formación con el uso del agente des-
naturalizante de la proteína clorhidrato de guanidina en el
líquido diluyente del suero. Las celdillas control se tratan
con lavado normal y líquido diluyente. Los anticuerpos en
forma de complejos de la fase sólida se detectan enton-
ces en las celdillas de prueba y control. Si un anticuerpo
muestra avidez alta, no hay diferencia significativa entre
la lectura de la celdilla de prueba y la de control dado que
estos complejos no se disocian ni se previenen con facili-
dad desde que se forman. Los ensayos de avidez han sido
inestimables en la atención de la rubeola e infecciones por
Toxoplasma en el embarazo y han contribuido a establecer
la cronología de la infección.
Serología en muestras no séricas
Las pruebas ELISA de captura de IgG e IgM se han adap-
tado para el examen de muestras de orina y saliva. Puesto
que éstas son muestras no invasivas, se prefieren para los
niños y otros grupos, como los consumidores de drogas
intravenosas, en los que es difícil obtener muestras de san-
gre. El diagnóstico serológico por el examen de la saliva
está disponible ahora para el sarampión, paperas y rubeola.
La serovigilancia a gran escala de la infección del HIV se
efectúa mediante revisión de orina y saliva.
Interpretación y uso de las pruebas
serológicas
La capacidad con los métodos ELISA semiautomatizados o
automatizados generalizó su disponibilidad para un número
extenso de laboratorios. Las pruebas más antiguas eran di-
fíciles desde el punto de vista técnico y las practicaban sólo
algunos laboratorios especializados. Las notorias mejorías
tecnológicas del método ELISA, junto con el conocimien-
to de la importancia de las infecciones víricas en muchos
grupos vulnerables de pacientes, convirtió a la serología en
un pilar fundamental del diagnóstico del virus.
203
En la actualidad, la serología se establece para el diag-
nóstico de las infecciones, en especial enfermedades víri-
cas. La tecnología más reciente significa que muchas de
las pruebas diagnósticas comunes se pueden realizar por
medio de microbiología general o por otros laboratorios no
especializados.
Diagnóstico de las infecciones agudas
Los estudios serológicos contribuyen en grado notorio al
diagnóstico de las enfermedades infecciosas. De manera ha-
bitual, una confirmación serológica requiere el examen de
una muestra de suero tomada inmediatamente después del
inicio de la enfermedad (aguda) y una segunda muestra de
una a dos semanas después (convaleciente). Un incremen-
to del cuádruple del anticuerpo o de la seroconversión del
estado negativo al estado positivo del anticuerpo entre las
muestras aguda y convaleciente indica infección aguda. Sin
embargo, las nuevas tecnologías para la detección específi-
ca de IgM e IgG permiten al laboratorio precisar un diag-
nóstico o descartar una infección sospechada en una sola
muestra de suero. Para ello, las técnicas ELISA se emplean
de forma amplia en los laboratorios de microbiología. Si no
se reconocen IgM o IgG, entonces el paciente no estuvo ex-
puesto al microorganismo o la muestra se recogió demasia-
do pronto. Como el anticuerpo IgM para la mayor parte de
los virus se puede identificar dentro de una semana tras el
inicio de los síntomas, una muestra tomada en ese tiempo,
si es negativa para IgM vírica, es suficiente para descartar
una infección reciente o actual. La IgM específica se pue-
de detectar sólo por tres meses, pero algunas pruebas más
sensibles pueden reconocer IgM más allá de los 12 meses.
Como la IgG está sólo presente más adelante, una reacción
positiva de la IgM, con o sin la presencia de IgG específica,
indica una infección reciente. La IgG específica permanece
positiva por toda la vida y por tanto la presencia exclusiva
de IgG con IgM negativa indica una infección pasada y en
casi todos los casos inmunidad a la infección futura contra
ese agente patógeno específico. Está claro que la selección
de la prueba y la interpretación del resultado dependen de
la afección clínica y la fecha de inicio de los síntomas, que
deben por tanto comunicarse siempre al laboratorio.
Detección del anticuerpo para verificar la inmunidad
La verificación de la inmunidad a las infecciones se requie-
re en muchas situaciones clínicas, como el periodo pos-
terior a la vacunación, solicitudes de empleo, embarazo,
condiciones anteriores al trasplante o pacientes inmunosu-
primidos que pueden entrar en contacto con infecciones.
Las pruebas para reconocer al anticuerpo protector tienen
204 CAP. 20 PRUEBAS SEROLÓGICAS EN VIROLOGÍA
que ser sensibles y requieren el examen para IgG específica.
Se utilizan las pruebas víricas ELISA de IgG específica, IFA
o anticuerpo total, como la prueba de aglutinación de látex.
Las encuestas seroepidemiológicas posteriores a la va-
cunación para determinar seroconversión e inmunidad des-
pués de la vacunación para sarampión, paperas, rubeola y
hepatitis B han formado una parte vital de la evaluación
de la eficacia de los programas de vacunación. Los méto-
dos ELISA automatizados y sensibles han hecho factible
el examen masivo de la etapa posterior a la vacunación.
El anticuerpo para la hepatitis B se expresa en unidades
internacionales y esta capacidad de cuantificar permite al
clínico decidir sobre la cronología de las revacunaciones
consecutivas.
La inmunidad para la rubeola y la hepatitis B es un re-
quisito de empleo para muchos trabajadores de la atención
sanitaria. La inmunidad a otras infecciones, como el vi-
rus de la varicela zoster, sarampión y paperas, es también
deseable, sobre todo para aquellos que trabajan con niños
o pacientes inmunocomprometidos, sea para protegerse o
para prevenir la propagación de la infección a los pacientes
susceptibles. Quienes son susceptibles a la infección por
varicela zoster y los que se exponen a la varicela se deben
excluir del trabajo, para no exponer a los pacientes suscep-
tibles a la infección.
Durante el embarazo, el examen para identificar el an-
ticuerpo protector contra la rubeola se ofrece a todas las
personas y se vacuna a las mujeres susceptibles después del
parto. Se recomienda examinar a todas las pacientes para el
virus de la hepatitis B y se suministra inmunización de la
hepatitis B a los recién nacidos de madres infectadas para
prevenir la transmisión vertical de la infección. El examen
del HIV para las madres en riesgo permite el tratamien-
to con el medicamento específico de la madre durante el
embarazo y el parto para reducir el riesgo de la transmi-
sión vertical del HIV. El examen del anticuerpo para otros
microorganismos, como varicela zoster, toxoplasma y cito-
megalovirus, permite al clínico aconsejar a pacientes sus-
ceptibles acerca de la forma de evitar la infección. Todos
estos controles requieren una prueba simple de aglutinación
de látex o ELISA de IgG. Sin embargo, en caso de contacto
reciente con una infección, los métodos de IgM tienen que
realizarse además de asegurarse que la IgG detectada es de
una infección pasada y no de una actual.
Pacientes sometidos a trasplante e inmunosuprimidos
Estos individuos son en particular propensos a desarrollar
infecciones por citomegalovirus (CMV). Los pacientes po-
sitivos al anticuerpo CMV que reciben un órgano de un
donante positivo al CMV requieren profilaxis para prevenir
el desarrollo de la infección por CMV primaria. Además,
la infección por toxoplasma adquirida del donante es un
problema grave en el receptor del trasplante del corazón,
así que todos los donantes y receptores se examinan en re-
lación con el anticuerpo contra el toxoplasma y se aplica
profilaxis en los receptores negativos de un corazón de do-
nantes positivos para anticuerpos contra el toxoplasma. Los
pacientes inmunosuprimidos también se examinan para las
infecciones comunes, como varicela, herpes simple y sa-
rampión, puesto que ellos pueden sufrir enfermedad grave
si se exponen a ellas.
Examen para la donación de sangre, órganos y tejidos
Muchos microorganismos, en especial virus transporta-
dos en la sangre, se pueden transmitir por vía sanguínea y
productos de la sangre, trasplante de órganos y tejidos. Es
esencial que la sangre se examine antes de la transfusión.
En el Reino Unido toda la sangre se examina para HIV,
hepatitis B, hepatitis C y sífilis. En el caso del HIV y el
virus de la hepatitis C, la presencia del anticuerpo signifi-
ca infección actual y el examen para el antígeno vírico es
innecesario. La sangre destinada para pacientes inmunosu-
primidos también se examina para CMV. Debido a la im-
portancia de desechar la sangre infectada, sólo se emplean
las pruebas más sensibles. Las donaciones que se encon-
traron positivas se someten a pruebas confirmatorias por
los laboratorios de referencia especializados. Para hacer
frente al volumen de exámenes requeridos, los laborato-
rios de transfusión de sangre tienen sistemas ELISA au-
tomatizados para el examen microbiológico de la sangre.
Los donantes de órganos y tejidos se someten a procedi-
mientos de revisión similares.
Diagnóstico de infección congénita
Como la IgG materna cruza la placenta y llega al feto, la
presencia de IgG con especificidad vírica en la sangre neo-
natal no indica en todos los casos infección. La persistencia
del anticuerpo IgG más allá de los seis meses de edad se-
ñala infección congénita, dado que el anticuerpo derivado
de la madre desaparece para entonces. La presencia de IgM
específica en o poco después del nacimiento supone infec-
ción congénita o vertical, ya que la clase IgM del anticuer-
po no cruza la placenta.
Futuro de la serología
Aunque muchas infecciones se pueden diagnosticar con
rapidez por la detección de IgM específica del virus por
 FUTURO DE LA SEROLOGÍA
las técnicas descritas en este capítulo, para otras como las
infecciones respiratorias del virus sólo es posible un diag-
nóstico retrospectivo porque se requiere una muestra de
suero convaleciente para el examen por CFT. Es posible
que muchos pacientes inmunosuprimidos no activen una
buena respuesta del anticuerpo y por tanto la ausencia de
una reacción de IgM específica para el virus no descarta
siempre la infección en este grupo de personas.
Los avances en las técnicas de amplificación del ácido
nucleico, en especial en la reacción en cadena de la poli-
merasa (PCR) en tiempo real con tecnología automatizada,
han permitido a los laboratorios ofrecer PCR para el diag-
nóstico común de las infecciones víricas. Los métodos ba-
sados en la PCR son rápidos: la PCR en tiempo real puede
demorar dos a tres horas. Muchos laboratorios se inclinan
ahora por realizar las técnicas de PCR para diagnosticar
la infección. En virtud de la detección vírica de RNA o
DNA, se puede reconocer la infección mucho antes que se
establezca una reacción del anticuerpo (según lo establecen
los métodos serológicos). Esto puede ser de utilidad, sobre
todo en pacientes inmunosuprimidos.
Sin embargo, las pruebas serológicas de IgM se emplean
todavía para diagnosticar infecciones recientes en quienes
no las manifiestan de inmediato, ya que la IgM se puede
detectar más allá de tres meses tras la infección y algunas
veces mucho tiempo más. Los procesos serológicos tam-
bién tienen un papel crucial para establecer evidencia de
inmunidad a la infección, como resultado de una infección
205
pasada o consecutiva a la vacunación. Son también una
herramienta epidemiológica importante en los estudios de
serovigilancia, que establecen la prevalencia de la infección.
En el futuro, aunque las técnicas de amplificación de
ácidos nucleicos rápidas y sensibles (como la PCR) pue-
den reemplazar a la serología para diagnosticar la infección
actual por muchos virus, la serología no dejará de desempe-
ñar un papel importante en el acompañamiento de la PCR
para el diagnóstico de una infección reciente. Lo que es más
importante, será aún el pilar fundamental en la medicina
preventiva al establecer la evidencia de inmunidad posterior
a la vacunación, identificar a los individuos susceptibles a
la infección para protegerlos y estudiar la epidemiología
de las infecciones víricas.
Lecturas adicionales
Booth JC. The use of the enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) technique in clinical virology. Recent Advances in
Clinical Virology, Waterson AP (ed.). 1983: Churchill-Li-
vingstone, Edinburgh, 73-98.
James K. Immunology of infectious diseases. Clin Microbiol Rev
1990; 3(2): 132-152.
Parry JV, Perry KR, Mortimer PP. Sensitive assays for viral anti-
bodies in saliva: an alternative to tests on serum. Lancet 1987;
2: 72-75.
Thomas HIJ. Specific antibody avidity studies in clinical micro-
biology: past, present and future. PHLS Microb Dig 1995;
12(2): 97-102.
 21
Pruebas automatizadas en virología
Roger P Eglin
Introducción
Durante los últimos 50 años la comprobación diagnóstica
en laboratorios clínicos se ha desarrollado a partir de la ope-
ración manual de pruebas como el examen de los frotis de
sangre y los métodos químicos simples mediante técnicas
que requieren cantidades relativamente grandes de sangre,
suero o plasma. En el decenio de 1960 se desarrolló el ana-
lizador multicanal para la química clínica y se introdujeron
métodos de conteo electrónico, como el contador de Coul-
ter. El desarrollo continuo de estas comprobaciones auto-
matizadas comenzó a concentrarse en mejoras de la calidad
y la consistencia de los resultados y en reducir los tiem-
pos requeridos para las pruebas y el volumen de la muestra
exigido para cada una. Aunque los sistemas automatizados
complejos son ya una práctica común en otras áreas de la
patología desde los últimos 20 años, la microbiología y en
particular los laboratorios de virología han utilizado méto-
dos de comprobación tradicionales. Para la virología, és-
tos se basaron en el cultivo celular y el aislamiento vírico
con las pruebas del anticuerpo mediante reactivos produ-
cidos en buena medida en casa. Los inmunoensayos
enzimáticos (IEE) aparecieron en la década de 1970 y sus
desarrollos comerciales posibilitaron la transición hacia
la automatización. El impulso se originó tras el desarrollo
de estos equipos a solicitud del Blood Transfusion Service
(ahora National Blood Authority) para examinar las dona-
ciones de sangre para una gama limitada pero en aumento
constante de infecciones víricas transmitidas por la sangre.
Primero se empleó el antígeno HBs en el decenio de 1970,
después siguió el anti-HIV en 1984, el anti-CMV selectivo
en 1980 y el anti-HCV en 1991. La gran expansión de la
gama de IEE comerciales en el decenio de 1980 amplió el
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
uso de protocolos estándar e impulsó la fabricación de sis-
temas automatizados. Sólo hasta comienzos de la década de
1990 se desarrolló un equipo ideado de modo específico para
el laboratorio de virología diagnóstica. En la actualidad se
halla en el repertorio de estas máquinas automatizadas una
amplia variedad de pruebas diagnósticas. En términos gene-
rales, los métodos disponibles se basan en la técnica de IEE.
Los primeros sistemas se desarrollaron para las pruebas de
examen solicitadas con más frecuencia, es decir, antígeno
de HBs, anti-HBs, IgG de la rubeola y antígeno de Chla-
mydia trachomatis. Después de la dificultad inicial para co-
mercializar los equipos automatizados en los primeros años
del decenio de 1990, el mercado adquirió estabilidad en la
época actual. Ahora se han identificado diferentes clases de
máquinas y el tipo de carga de trabajo más apropiado para
cada clase de instrumento. Las definiciones básicas del tipo
de automatización se discuten a continuación.
Procesador de líquidos (PL)
Un PL completa la preparación de una microplaca que con-
tiene muestras diluidas de forma apropiada y controles espe-
cíficos de la prueba mediante una hoja de trabajo para identi-
ficar las muestras y los protocolos específicos para la prueba
requerida; asimismo, completa la separación del suero a par-
tir de un coágulo de sangre y de ese modo prepara un alma-
cén de suero a partir de las muestras de sangre recibidas.
Procesador automatizado de IEE
Un procesador automatizado de IEE completa un IEE
con tan sólo el suministro de las muestras y los reactivos
208 CAP. 21 PRUEBAS AUTOMATIZADAS EN VIROLOGÍA

específicos para esa prueba; además, termina un IEE con
la simple adición de una microplaca que contiene muestras
correctamente diluidas y los reactivos específicos para esa
prueba. En consecuencia, el equipo puede subdividirse en
las siguientes clases:
• Acceso aleatorio/comprobación por lote. Por lo general,
los procesadores de IEE se diseñan para pruebas especí-
ficas sobre muestras que se acumulan como un lote y se
identifican con una hoja de trabajo específica. Algunos
procesadores son también capaces de analizar pruebas de
muestras únicas para satisfacer la respuesta a la demanda
clínica urgente. Estas pruebas únicas requieren calibrado-
res de control para la prueba, además de la muestra para
la prueba. Es posible interrumpir la prueba para procesar
una muestra urgente o puede introducirse en un momento
conveniente entre los lotes de otras pruebas. Estas máqui-
nas de acceso aleatorio requieren módulos de la prueba
específicos del fabricante o el uso de controles permanen-
tes sobre el tablero para operar la prueba.
• Formato con tubo único/formato con microplaca. Al-
gunos procesadores llevan a cabo un muestreo directo
del tubo y realizan todas las operaciones subsecuentes
como pruebas únicas del tubo, por ejemplo los equipos
VIDAS, E7001. Otros procesadores aceptan muestras
únicas del tubo, pero preparan la prueba con micropla-
cas. Este formato de la placa puede ser específico del
fabricante o aceptar cualquier microplaca basada en IEE
de uso estándar.
• Sistema de prueba específico del fabricante/método de
microplaca estándar. El sistema de procesamiento del
fabricante es único y el uso del procesador impone la
necesidad de utilizar los equipos del fabricante, por
ejemplo VIDAS, AXSYM, PRISM. Se han diseñado
otros procesadores para analizar cualquier IEE basado
en microplaca y la elección depende del laboratorio y de
las características de ejecución de la prueba. En el cua-
dro 21-1 se proporcionan algunos ejemplos del equipo
actual disponibles de cada clase.

Cuadro 21-1 ¿Qué equipo automatizado es más apropiado?

Tipo de máquina Ventajas Desventajas

Acceso aleatorio: pruebas Comprobación rápida de muestras únicas
específicas del fabricante Requiere un grupo completo de muestras
control una vez/mes
No requiere grupo completo de control
para cada prueba, usa calibradores
Gama amplia de pruebas disponibles
que cubren varias disciplinas
Compartir costos con otros usuarios de la
máquina (bioquímica, inmunología)
Comprobación por lote: También puede incluir la omisión de la
sistema basado en dos o muestra
tres microplacas Pueda ser capaz de procesar cualquier
sistema basado en microplacas
Sistema basado en Usa cualquier prueba de placa de
microplacas de acceso microtitulación basado en IEE
abierto Puede aceptar la placa de la próxima
prueba en cualquier momento
Sistema que no requiere Permite la manipulación de pruebas no
muestra marcadas o vinculadas
Puede usarse para otros propósitos, como
alícuotas de la muestra para almacenar
suero en recipientes/microplacas, CFT,
SRH
El rendimiento diario puede ser pequeño, p. ej., 300/día
El rendimiento del laboratorio total en un día de
trabajo normal puede ser >400 muestras
Recargo pagado para el mismo proveedor comercial
único de los módulos y el equipo de prueba
Pueden estar disponibles márgenes limitados de
pruebas para enfermedades infecciosas
Si se usa como una instalación de laboratorio central,
¿pueden interrumpirse en realidad las pruebas actuales?
Deben ser pruebas específicas del fabricante, p. ej.,
AXSYM (quimioluminiscencia). ¿Está disponible
una gama completa de pruebas para enfermedades
infecciosas?
Puede procesar sólo tres lotes en un día normal de
trabajo
Puede requerirse la planificación cuidadosa del
procesamiento de la prueba
Puede ser necesario separar la muestra que dispensa
el equipo
Los costos pueden incrementarse
 AUTOMATIZACIÓN EN EL LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO
Automatización en el laboratorio
de diagnóstico
Para discutir este asunto es necesario considerar las si-
guientes presuposiciones: en primer lugar, el laboratorio
utiliza un programa de diagnóstico para procesar la base
de datos de los pacientes; en segundo lugar, se identifican
mediante un sistema de código de barras las etiquetas que
se aplican a la solicitud, el tubo de sangre primario y la
muestra de suero archivada, y en tercer lugar, el laboratorio
emplea un sistema automatizado que comprende un PL y
un procesador de IEE basado en microplaca.
Luego de la recepción de la muestra y el formato de
solicitud en el laboratorio, muchas veces las primeras dos
etapas del procesamiento ocurren de forma simultánea.
Hojas de trabajo
Se ordena una serie de pruebas en conformidad con los de-
talles clínicos y la fecha de inicio anotados en el formato de
solicitud. Este grupo de pruebas se almacena en la compu-
tadora y ello conduce a la creación de hojas de trabajo es-
pecíficas de la prueba, las cuales pueden cancelarse cuando
sea necesario de acuerdo con la hoja de planificación diaria
del sistema automatizado.
Separación del suero
Después de centrifugar el tubo primario con la sangre, para
centrifugar el coágulo de sangre, el suero se separa por PL
o de forma manual en un tubo de almacenamiento, que se
etiqueta con la misma identificación de código de barras
que el tubo primario con la sangre.
Preparación de las microplacas para el ensayo
Si un sistema de acceso aleatorio se halla en uso, entonces
el recipiente del almacenamiento con el suero se carga di-
rectamente en el sistema con las diluciones requeridas que
efectúa la máquina. El PL debe ser capaz de identificar los
tubos con la muestra o los tubos primarios con sangre en
estantes o carruseles. Verifica que todas las muestras en la
hoja de trabajo actual estén presentes y luego lleva a cabo
las diluciones apropiadas del suero en las celdillas, según el
protocolo específico. La placa se identifica con un código
de barras para permitir la identificación positiva y la selec-
ción del protocolo correcto por el programa. Esto permite
a la computadora ordenar los reactivos apropiados para el
IEE específico. Debe también agregar los estándares apro-
piados, los suministrados por los fabricantes y el laboratorio
209
en las muestras internas, y las muestras de calibración cuan-
do sea necesario para permitir el control de calidad (QC) de
la práctica de la prueba. Estas muestras de QC se distribu-
yen en las celdillas designadas en el protocolo. El sistema
indica si en una muestra no se recolectó el líquido.
Procesador IEE
La placa se identifica con un código de barras y el programa
reconoce la hoja de trabajo y el protocolo correctos corres-
pondientes a esa práctica específica de la prueba. La máqui-
na revisa la colocación exacta de los reactivos solicitados
para el IEE en el sistema y se verifican los volúmenes de
estos reactivos con base en el peso. La comprobación inclu-
ye la solución amortiguadora de lavado y los reactivos de
la prueba y verifica que el volumen del recipiente de dese-
chos es suficiente. El primer paso, que es parte del control
de calidad que vigila el sistema, consiste en tomar una lec-
tura espectrofotométrica de la placa para comprobar que se
agregó una muestra a cada una de las celdillas previstas. Una
lectura discrepante de la densidad óptica (DO) identifica el
punto donde no hay muestra. El procesador activa al IEE y
a continuación el protocolo se almacena en el programa. Si
un sistema de acceso abierto se halla en función, el proce-
sador recalcula los espacios de tiempo para los análisis en
proceso y el ajuste en la nueva placa para procesar cuanto
antes. El tiempo de inicio aparece junto con una advertencia,
si el retraso antes del análisis excede el lapso predefinido por
el sistema. Por lo general se evitan los IEE que utilizan incu-
baciones a temperatura ambiente porque, aunque los periodos
de la incubación suelen ser más largos que los de las incu-
baciones a 37°C, las primeras reacciones de la incubación
comienzan inmediatamente después que la muestra diluida
se distribuye en las celdillas. Las incubaciones a 37 o 40°C
permiten un tiempo de inicio determinado, lo cual es necesa-
rio para las máquinas de acceso abierto. El protocolo del IEE
debe incluir la vigilancia después de cada paso que requiera
la adición de reactivos líquidos y también la revisión de las
cabezas de lavado después de cada operación para constatar
que todas las celdillas se lavaron de modo apropiado. Debe
mostrar la lectura a partir de la vigilancia de cada adición
líquida cuando el IEE continúa y cualquier error detectado
se señala de inmediato. Si una máquina de acceso abierto se
encuentra en uso, cada serie de reactivos de la prueba debe
añadirse cuando lo requiera el procesador.
Procesamiento de los datos
Las lecturas finales de la DO, tomadas al término del ensa-
yo, se envían de forma automática al programa del sistema
para el procesamiento que realiza el paquete de reducción
de datos. Este paquete requiere, según sea el tipo de prueba,
210 CAP. 21 PRUEBAS AUTOMATIZADAS EN VIROLOGÍA
calcular el valor de intercepción a partir de los controles
y aplicarlo a los valores de la DO de la muestra; en este
caso, los resultados se expresan como positivos, negativos
o ambiguos para cada muestra; asimismo, debe generar una
curva estándar a partir de los controles y aplicarla a las lec-
turas de la muestra; esta vez los resultados para las muestras
se expresan como unidades/ml.
El programa también constata que los calibradores y los
estándares del fabricante incluidos en el examen se hallen
en los límites permitidos y que no hay indicadores de cual-
quier discrepancia. Si los calibradores tienen valores acep-
tables, los valores estándar almacenados se aplican a la
DO de las muestras para el examen de la prueba. Después
de la validación de los resultados que presenta el técnico
experimentado, éstos se transfieren de manera automática
a la hoja de trabajo. Ésta se puede imprimir para almacenar
la copia dura, que contiene toda la información necesaria
para rastrear los detalles de la prueba si se descubre más
adelante cualquier problema. Estos pormenores incluyen la
placa del análisis y los reactivos relacionados, tipo, número
de lote, fecha de caducidad de la placa y reactivos, fecha de
la prueba, solicitante de la hoja de trabajo, operador del
método y verificador de los resultados. A partir de la hoja
de trabajo, los resultados se transfieren por medios electró-
nicos a los registros individuales de los pacientes en la base
de datos del laboratorio.
El programa también verifica el control de calidad in-
terno exigido (sistema de control del proceso) en la prueba
mediante lo siguiente: a) anotación de los 20 promedios
registrados para las muestras de control y marcación de
cualquier resultado discrepante y b) proyección de las grá-
ficas de Shewhart (Costongs et al., 1995) con los nuevos
resultados del control. A continuación se aplican las reglas
de Westgard seleccionadas para verificar que la prueba es
válida y puede proporcionarse. Cualquier resultado fuera
de los límites de estos criterios activa a los indicadores para
realizar una acción inmediata.
En la evaluación microbiológica realizada en los laborato-
rios de comprobación de los NBS Centres puede revisarse un
modelo en el cual este procesamiento automatizado y el con-
trol de proceso alcanzan un valor muy alto de aseguramien-
to de la calidad. Estos 10 centros procesan un total aproximado
de 10 000 donaciones por día en la evaluación automatizada
para HBsAg, anti-HCV y anti-HIV. Todos los reactivos de
la prueba deben vigilar la adición de la muestra, con una re-
visión positiva en cada adición del reactivo como ideal. El
índice de error del proceso es menor de 0.1%. Los resultados
de la determinación se emiten directamente en el sistema IT
nacional alrededor de las 2 pm un día después de la colección,
para la publicación de los componentes producidos de la do-
nación de sangre. Estos laboratorios se ajustan a la General
Manufacturing Practice y se revisan con regularidad.
¿Debe automatizarse el laboratorio?
Las consideraciones anteriores describen la operación de un
sistema automatizado dentro del laboratorio. Antes de ello
debe tomarse la decisión de adoptar un sistema automati-
zado para la prueba de IEE. El trabajo preparatorio para al-
canzar esta decisión es considerable e incluye varios pasos
analíticos. También supone cambios relevantes en los patro-
nes de trabajo del laboratorio y el personal debe intervenir
en el desarrollo de este proyecto para adquirir nuevas for-
mas de trabajo. La próxima sección describe algunos de los
factores importantes que deben tomarse en cuenta durante
este proceso de revisión.
Análisis del laboratorio actual
Esto incluye pormenorizar la gama de virus, tipos y can-
tidad de pruebas que realiza el laboratorio y revisar los
tiempos de respuesta reales de los resultados requeridos
por la suscripción de un contratado. ¿Hay lugar para que la
adopción del sistema satisfaga las demandas clínicas con
resultados más oportunos?, ¿la comprobación por acceso
aleatorio es una opción realista para una pequeña canti-
dad de cualquier prueba que se realiza por lote para una o
dos pruebas a la semana? Si se identifican los volúmenes
grandes de algunos análisis de evaluación, ¿se basan estas
pruebas en IEE y, si no es así, puede ajustarse la prueba
con éxito a IEE sin pérdida de la calidad y quizás con me-
Comprobación antígeno/anticuerpo
Sistema basado en IEE
SÍ NO
¿Es posible adoptar las pruebas IEE?
AUTOMATIZAR SÍ NO
¿Cómo puede hacerse?
Figura 21-1 Diagrama de flujo de la automatización.
jor sensibilidad y especificidad (fig. 21-1)? Debe decidirse
cómo tratar por lotes las pruebas de evaluación regulares
para una o dos pruebas al día (unas 30 pruebas es habitual-
mente el número mínimo por lote por razones económi-
cas); ¿se necesita un procesamiento diario?, ¿se trata de un
servicio que proporciona el resultado el mismo día? Hay
que definir también los requerimientos para una compro-
bación externa urgente o en la guardia y calcular cuántas
pruebas pueden incluirse en un procesamiento normal sin
que se retrase demasiado el resultado (fig. 21-2).
 ¿DEBE AUTOMATIZARSE EL LABORATORIO?
¿Usa en la actualidad el equipo para líquidos en otras pruebas o produce alícuotas séricas?
SÍ
¿Cuántas pruebas de IEE o placas se procesan/día?
<9 placas >9 placas
Usa microplacas Usa procesador de acceso
basadas en lote abierto basado en microplacas
Figura 21-2 ¿Qué tipo de equipo elegir?
¿Qué tipo de equipo elegir?
Un laboratorio primario (laboratorio general del hospital
del distrito) que emprende una determinación regular de una
cantidad relativamente pequeña de muestras puede elegir
una máquina especializada pequeña; hacer uso del anali-
zador grande del departamento de patología para atender
todo el espectro de pruebas infecciosas, y asegurar el costo
del equipo al procesar una prueba de diagnóstico de la
máquina a usarse por acceso al azar, como los análisis de
antibióticos.
Un laboratorio secundario (laboratorio de enseñanza
hospitalaria, laboratorio grande de referencia) emprende una
amplia serie de pruebas sobre una gran cantidad de mues-
tras: se requiere un rendimiento considerable de muestras
cada día y proporciona una amplia gama de pruebas; con-
sidera procesamientos por lote, decide cuántas pruebas por
día se necesitan (la mayor parte de los IEE se termina en un
plazo de tres horas). Esto permite dos procesamientos en el
día laborable normal y uno durante la noche. Para un sistema
de tres placas esto equivale a nueve placas/día. Los siste-
mas de acceso abierto completan ocho placas de la prueba
cada cinco horas.
La opción final del equipo requiere la comparación de-
tallada de su funcionamiento, la mecánica, los sistemas de
calidad y del programa, y rebasa los alcances de este ca-
pítulo.
Cuestiones de calidad
La transferencia a un sistema automatizado representa va-
rias ventajas para el laboratorio. El sistema elimina subjeti-
211
NO
<9 placas/<300 pruebas >9 placas/<300 pruebas
Usa acceso aleatorio/sistema Usa acceso aleatorio/sistema
por lote con microplacas abierto con microplacas
vidad en todos los aspectos de los procedimientos usados.
Los procesamientos se concluyen en términos de reprodu-
cibilidad y se continúa el protocolo del mismo modo en
cada ocasión. Las variaciones de los protocolos ocurren
sólo cuando el encargado del sistema modifica el protoco-
lo. Esta estandarización mejora la reproducibilidad de los
métodos, a juzgar por los CV de los estándares (Westgard
et al., 1981). El sistema automatizado asegura la identidad
positiva de la muestra a lo largo de la prueba y permite que
el laboratorio se adecue a los estándares ya exigidos de los
laboratorios NBS. Esta seguridad de la identidad reside en
la codificación con barras de todas las muestras y las placas
IEE a lo largo del sistema. La vigilancia de las adiciones
líquidas y las fases de lavado confirma que todos los pa-
sos del protocolo se realizaron con éxito. Esto permite la
identificación del punto crítico en el sistema en caso de
que un procesamiento de la prueba no logre la validación
por control de calidad. La transferencia automatizada de la
hoja de trabajo del programa de diagnóstico de laboratorio
al programa del sistema automatizado y el retorno de los
resultados validados directamente a la base de datos del
paciente elimina los errores de transcripción de raíz. Los
tiempos de regreso para la comprobación tal vez se reducen
con los resultados producidos en un periodo que es efectivo
para la atención del paciente.
Consideraciones financieras
Las prácticas de trabajo adoptadas en fecha reciente permi-
ten que los miembros del personal procesen cantidades cre-
cientes de pruebas. Esto conduce a la generación de mayor
ingreso o al desahogo de la carga de trabajo original con
212 CAP. 21 PRUEBAS AUTOMATIZADAS EN VIROLOGÍA
menos personal; asimismo, si el número de clínicos no cam-
bia, entonces se puede efectuar el nuevo trabajo adicional
conducido por los requerimientos del cliente. El aumento
de la cantidad de pruebas distribuye los costos del personal
sobre una gran cantidad de muestras y ayuda a reducir los
costos directos por prueba. A mayor número de pruebas ter-
minadas en el sistema automatizado, menores gastos indi-
rectos por prueba por la depreciación de capital del sistema
y las cargas anuales del mantenimiento. Debe tomarse la
elección entre la compra absoluta en lugar del alquiler con
opción a compra o la renta del reactivo y depende en buena
medida del tipo de equipo requerido y la posición financiera
del laboratorio en ese momento. Si se decide usar un siste-
ma específico del fabricante, el recargo que se paga debe
calcularse con base en el costo de los IEE de rutina para la
misma prueba. Si se requiere el equipo de acceso aleatorio,
debe estimarse el número previsto de muestras que requiere
este tratamiento urgente y una prueba de determinación co-
mún real identificada que pueda procesarse en este equipo
para calcular los costos, como en el caso de los antibióticos
en un AXSYM.
Mejorar la competitividad del laboratorio
La adquisición de un sistema automatizado en el laboratorio
permite la confirmación del papel del laboratorio dentro del
departamento de patología. Debe ser posible convertirlo en
la instalación central para el suministro de la comprobación
basada en IEE dentro de la patología y cubrir un amplio es-
pectro de comprobaciones para la virología, bacteriología,
inmunología y bioquímica. Debe conseguirse una mejora
notoria en algunos tiempos de respuesta de los resultados.
El laboratorio puede realizar bien la función de encargarse
del trabajo de evaluación para los nuevos desarrollos de la
prueba y las investigaciones de campo antes de que el pro-
ducto llegue al mercado. El laboratorio almacena grandes
cantidades de muestras para todas las pruebas de rutina y
puede ofrecer la comprobación reproducible, después de la
instalación de los protocolos financiados por la compañía
comercial.
Otros desarrollos de la automatización
Este capítulo describe la automatización del IEE del anticuer-
po y el antígeno para la cual se dispone en la actualidad de
una opción amplia de equipo. La próxima área de comproba-
ción que se automatice será la del análisis de la amplificación
del ácido nucleico y, de manera específica, la prueba de la
PCR. Esto ya es posible al usar los sistemas automatizados
que procesan de manera automática lotes de amplificacio-
nes y las detecciones de la PCR. En el próximo año o dos
se anticipa que la extracción de ácidos nucleicos a partir de
las muestras relativamente limpias, como suero y plasma, se
automatizará, lo cual supone la creación de un sistema por
completo automatizado, desde la muestra hasta el resultado.
Conclusiones
La automatización es la única solución para darle rentabi-
lidad a un laboratorio. Los gastos del laboratorio se abaten
cada vez más, desde las reducciones de costos esperadas
año con año en contratos hasta las demandas cada vez
mayores de más procesamientos y una gama creciente de
nuevas pruebas. Es esencial desprenderse de la vieja tecno-
logía. Están disponibles nuevos sistemas y el laboratorio
ha experimentado modificaciones para darle mejor uso a
sus sistemas. Esto exige conseguir la confianza del perso-
nal para llevar a cabo estos cambios. Es necesario ver los
beneficios de la implementación de nuevos sistemas y la
aparición de áreas de trabajo del todo nuevas, como la car-
ga vírica, que se acrecienta de modo continuo a una tasa sin
precedente. Para hacer frente a estos cambios importantes
es esencial invertir en el personal, sea en capacitación o
aprendizaje de nuevas capacidades.
Lecturas adicionales
Costongs GM, van Oers RJ, Leerkes B, Janson PC. Evaluation of
the DPC IMMULITE random access immunoassayanalyser.
Eur J Clin Chem and Clin Biochem 1995; 33, 887-892.
Westgard JO, Hunt MR, Groth T. A multi-Shewhart chart for
quality control in clinical chemistry. Clin Chem 1981; 27(1):
493-501.
 22
Técnicas moleculares en virología
Paul E Klapper
Introducción
Las técnicas biológicas moleculares saturan la virología.
Su aplicación en el descubrimiento de fármacos antivíricos
ha contribuido al diseño racional de los medicamentos y
mejorado de forma radical el ritmo del descubrimiento y la
aplicación de compuestos antivíricos; tales pruebas promo-
vieron el desarrollo de vacunas antivíricas y aumentaron la
gama de vacunas disponibles para su aplicación; además,
revolucionaron la virología clínica y no han dejado de ha-
cerlo. La aplicación de estos procedimientos permitió el
descubrimiento de muchos de los virus patógenos huma-
nos de reciente descripción (cuadro 22-1) y acortó de for-
ma notable el periodo desde el reconocimiento inicial de
un agente causal hasta la caracterización completa, el desa-
rrollo de la prueba diagnóstica y la producción de pruebas
serológicas confiables de la infección (p. ej., el síndrome
respiratorio agudo grave consecutivo al coronavirus origi-
nado en la provincia de Guandong, República Popular de
China, en noviembre de 2002). No sólo los procedimientos
de diagnóstico molecular figuran entre los principales mé-
todos actuales para el diagnóstico de la infección vírica,
sino también tienen un papel cada vez más importante en el
control cotidiano de la terapia antivírica de los pacientes.
Técnicas de amplificación del ácido nucleico
Las técnicas de amplificación del ácido nucleico (TAAN)
son el soporte principal de las técnicas empleadas en un
laboratorio clínico moderno de virología. Las técnicas pue-
den clasificarse como procedimientos de amplificación del
“blanco”, la “sonda” o la “señal”. En la TAAN del “blan-
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
co” el ácido nucleico presente en una muestra se amplifica
directamente a un grado en el que puede detectarse con
facilidad. En la TAAN de la “sonda” la acción para vincu-
lar una secuencia específica de la sonda de ácido nucleico
conduce a la amplificación y el reconocimiento subsiguien-
te de la sonda. En la TAAN de la “señal” la vinculación
inicial a una molécula blanco genera una señal que por sí
misma se amplifica a un grado en que la señal puede iden-
tificarse con facilidad. La distinción entre las técnicas se
anula a menudo porque los procedimientos de amplifica-
ción del “blanco” incluyen con frecuencia un elemento de
la amplificación de la “señal” o la “sonda”, o ambas.
Varios métodos disponibles en el comercio son útiles
para emplearse bajo estos formatos, basados en principios
diferentes y pasos técnicos distintos. Sin embargo, los pro-
ductos comerciales están sólo disponibles para una cantidad
limitada de virus patógenos y, en consecuencia, la mayor
parte de los laboratorios clínicos utiliza una combinación de
pruebas disponibles en el comercio y sus propios métodos
de prueba “internos” (es decir, “elaborados en los propios la-
boratorios”); estos últimos se basan casi de manera exclusi-
va en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Amplificación del blanco
Reacción en cadena de la polimerasa
Debido a su flexibilidad y facilidad de uso, la primera que
se estudia de las TAAN, la PCR, es también la técnica más
empleada. Este procedimiento implica el uso de dos mo-
léculas sintéticas oligonucleótidas, cada una de las cuales
hibridiza a una cadena del DNA blanco de doble cadena
214 CAP. 22 TÉCNICAS MOLECULARES EN VIROLOGÍA

Cuadro 22-1 Lista representativa de virus patógenos humanos recientes caracterizados mediante técnicas biológicas moleculares

Virus Enfermedad relacionada Técnica de su descubrimiento

Virus de la hepatitis E
Virus de la hepatitis C
Virus sin nombre
Virus del herpes humano 8
Virus GBV a-c
Virus TTV
Virus Nipah
Metaneumovirus
Virus SEN
Síndrome respiratorio agudo
grave (coronavirus)
Hepatitis infecciosa
Hepatitis relacionada con la transfusión
Síndrome pulmonar por hantavirus
Sarcoma de Kaposi, enfermedad de Castlemaine
Hepatitis relacionada con la transfusión
Hepatitis relacionada con la transfusión
Encefalitis y neumonía
Enfermedad respiratoria
Hepatitis relacionada con la transfusión
Enfermedad respiratoria aguda grave
Transcripción inversa
PCR con cebadores aleatorios +
experimentos de transmisión animal
Transcripción inversa
PCR con cebadores aleatorios para
producir genotecas del cDNA
Acuerdo general de PCR basado en la secuencia
Análisis de diferencia representacional
Análisis de diferencia representacional
Análisis de diferencia representacional
Transcripción inversa
PCR con cebadores aleatorios
Transcripción inversa
PCR con cebadores aleatorios
Transcripción inversa
PCR con cebadores aleatorios
Transcripción inversa
PCR con cebadores aleatorios

(dsDNA). Estas moléculas oligonucleótidas se diseñan de
modo cuidadoso para unirse a una región blanco específica
dentro del ácido nucleico del virus que se amplifica y atra-
viesan una región definida dentro de ese ácido nucleico.
La hibridación del oligonucleótido con el DNA actúa
como un cebador (iniciador) para una enzima polimerasa
del DNA (casi siempre una enzima termoestable deriva-
da originalmente de la bacteria termófila Thermus aqua-
ticus, conocida como polimerasa Taq). La enzima crea
una cadena complementaria de DNA al agregar desoxinu-
cleótidos de forma secuencial. Para iniciar este proceso, el
dsDNA blanco se calienta a una temperatura superior a
90°C. A esta temperatura las cadenas del DNA se separan.
La mezcla de reacción se enfría entonces a una temperatura
de 50 a 70°C y las moléculas del cebador de oligonucleó-
tido sintético se unen a cada una de las cadenas del DNA.
La temperatura se eleva un poco, 72 a 76°C, la cifra óptima
para que la polimerasa Taq efectúe la extensión de la ca-
dena complementaria del DNA. Al repetir el ciclado de la
temperatura unos 30 ciclos o más repetitivos se producen
millones de copias de la secuencia original del blanco. El
límite del cambio de la temperatura y magnitud del tiempo
los controla un ciclador térmico programable (fig. 22-1).
Al término de la amplificación, la mezcla de reacción se

Figura 22-1 Termociclador programable. Un termociclador programable típico, junto con un perfil de temperaturas idealizado de un
solo ciclo PCR. D, desnaturalización; A, hibridación de cebadores; E, extensión del DNA. El instrumento programable automatiza esa
extensión, el calentamiento y los ciclos de enfriamiento de la técnica PCR.
 TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN DEL ÁCIDO NUCLEICO
Figura 22-2 Electroforesis en gel de poliacrilamida con tin-
ción de bromuro de etidio. Representación de los productos de
PCR separados sobre geles de poliacrilamida al 8%. El ejemplo
mostrado es de un método para tipificar adenovirus por digestión
con una enzima de restricción de los productos de PCR. El bro-
muro de etidio se intercala con el DNA de doble cadena y se
revela por la transiluminación de la luz ultravioleta en el gel. M,
escala del peso molecular usada para calibrar el tamaño de los
productos de PCR.
analiza para determinar si tuvo lugar la amplificación es-
pecífica. El método convencional consiste en someter a
electroforesis la mezcla de reacción en geles de agarosa
o poliacrilamida en presencia de bromuro de etidio. Este
último se intercala con la dsDNA y, cuando se expone a la
luz ultravioleta, emite luz fluorescente para revelar el ácido
nucleico (fig. 22-2). Puede utilizarse la técnica Southern
blotting para confirmar la especificidad del producto de la
reacción de la prueba. En la prueba Southern blotting un
oligonucleótido marcado designado para unirse a la región
intercebadora del producto de reacción del ácido nucleico
se deja hibridar con el producto separado de forma elec-
troforética y su vinculación se revela mediante autorradio-
grafía. Un método de detección menos laborioso que la
hibridación consiste en desnaturalizar el DNA amplificado
y capturar el DNA de una sola cadena sobre una fase sólida
(por lo regular una placa de microtitulación de poliestire-
no) mediante avidina o biotina incorporadas dentro de uno
de los cebadores del oligonucleótido. Un oligonucleótido
marcado se deja unir al amplicón del DNA capturado y su
nexo se revela en una reacción que incluye conversión ca-
talizada de manera enzimática de un sustrato cromógeno.
Con la finalidad de detectar virus RNA es necesaria una
reacción inicial para producir una copia de DNA (cDNA)
de la plantilla o molde del RNA. Esto se logra con el uso de
la transcripción inversa, que se realiza mediante la adición
de una enzima transcriptasa inversa separada o enzimas con
capacidad de transcripción inversa termoestable y actividad
de polimerasa del DNA.
215
Es posible una amplia variedad de modificaciones del
procedimiento PCR básico, incluida la PCR anidada, que
supone el uso de cuatro oligonucleótidos del cebador en dos
reacciones separadas. Los productos de una primera ronda
de amplificación PCR se reamplifican en una segunda ron-
da de amplificación térmica, mediante un segundo grupo de
oligonucleótidos del cebador interno para el grupo utiliza-
do en la primera ronda de la amplificación térmica.
La opción de la metodología depende de los requeri-
mientos de sensibilidad y especificidad, además de las
circunstancias prácticas bajo las cuales debe realizarse la
PCR. Es necesario tener una gran capacidad técnica, junto
con instalaciones y equipo especializados, para todos los
procedimientos PCR, pero la PCR anidada exige áreas es-
pecializadas adicionales debido a la necesidad de separar
físicamente los procedimientos de la primera y segunda
rondas para prevenir la adherencia del remanente del DNA
amplificado (“amplicones”) de la amplificación de la pri-
mera ronda a la de la segunda, lo que arrojaría resultados
falsos positivos de la prueba.
Para mejorar la utilidad de la PCR en el marco clínico
del laboratorio de virología se han desarrollado PCR capa-
ces de detectar ácidos nucleicos blanco víricos múltiples.
De manera característica, estas técnicas PCR “multiplex”
incorporan varios pares de oligonucleótidos cebadores
dentro de una sola reacción. Es posible la amplificación de
cualesquiera de los ácidos nucleicos blancos, con las mis-
mas condiciones térmicas del ciclo completo y la misma
composición de la mezcla de reacción.
La mayor parte de los métodos PCR en uso actual pro-
porciona sólo respuestas cualitativas (sí/no). La determi-
nación de la cantidad de virus presente en una muestra,
llamada “cuantificación vírica” o “vigilancia de la carga
vírica”, es cada vez más importante en la evaluación del
efecto de la quimioterapia antivírica y en la vigilancia de
la progresión de la enfermedad. Por ejemplo, la vigilancia
de la sangre de los receptores del trasplante de médula ósea
para el DNA de citomegalovirus (CMV) permite suminis-
trar la terapia anticipada con el fármaco antivírico gan-
ciclovir para prevenir el desarrollo de la enfermedad por
CMV. La terapia antivírica se instituye casi siempre cuan-
do se detecta un aumento notable de los valores sanguíneos
del DNA del CMV. La dilución seriada de una muestra en
paralelo con un estándar que contiene cantidades elevadas
conocidas de ácido nucleico vírico puede proporcionar la
cuantificación cruda, pero está sujeta al error por la am-
plificación diferenciada de las dos muestras, lo cual su-
ministra comparaciones entre una prueba y otra de difícil
cuantificación. Una cuantificación más exacta se consigue
por la coamplificación competitiva de un ácido nucleico de
control interno de concentración conocida, junto con el áci-
do nucleico de la muestra de concentración desconocida; la
216 CAP. 22 TÉCNICAS MOLECULARES EN VIROLOGÍA
Figura 22-3 Disposición interna del instrumento Cobas®
Amplicor de Roche Diagnostics. El ciclo térmico y la de-
tección del producto por un sistema de ensayo basado en
micropartículas ligadas de manera enzimática están auto-
matizados en este instrumento.
molécula del control interno que se designa amplifica con
igual eficacia al blanco de la muestra. El método constituye
la base de los métodos comerciales eficientes para los virus
de las hepatitis B y C, el virus de inmunodeficiencia hu-
mana (HIV) y el citomegalovirus. En el último sistema, un
alto grado de automatización del ensayo y la detección del
producto reducen de modo adicional la variabilidad entre
las pruebas (fig. 22-3).
PCR en tiempo real
La PCR cinética o “en tiempo real” es un método que sus-
tituye cada vez más a la PCR convencional. Esto es posible
por el marcado de los cebadores, las sondas o el amplicón
con moléculas fluorógenas. Cuando un producto específico
se acumula, la fluorescencia incrementada emitida a par-
tir de la reacción revela la acumulación. En contraste con
la PCR convencional, no es necesaria la detección de la
amplificación posterior del producto a través de la manipu-
lación de la mezcla de reacción. El producto se identifica
dentro de un tubo de muestreo cerrado. La posibilidad de
contaminación cruzada derivada del amplicón de las prue-
bas se reduce así en gran proporción y, dado que la acumu-
lación del ácido nucleico amplificado se reconoce mientras
sucede, la prueba se termina en menos tiempo. Además, los
límites de concentraciones sobre los cuales es posible la
cuantificación exacta del producto son mucho más grandes
respecto de los que pueden alcanzarse en formatos PCR
competitivos más convencionales.
Varios métodos están disponibles para lograr la detec-
ción de la fluorescencia en PCR en tiempo real. En su modo
más simple, los compuestos como bromuro de etidio o el
verde 1 SYBR® se añaden a la mezcla de reacción. Éstos se
unen al dsDNA y despiden luz fluorescente cuando se exci-
tan con luz de una longitud de onda apropiada. Esta aproxi-
mación no es ideal dado que la formación de artefactos por
los dímeros cebador-cebador y la amplificación inespecífica
del DNA que no es blanco y es irrelevante pueden emitir
señales fluorescentes falsas positivas. Este problema puede
tratarse si se calienta el producto final y se mide la tempera-
tura de disociación de los productos. Los dímeros cebadores
se disocian a una temperatura más baja que la empleada
para el producto PCR específico.
La especificidad de la PCR en tiempo real se mejora
muchas veces mediante el marcado de “sondas” de oligo-
nucleótido con una sonda fluorescente. En realidad, se tiene
acceso a una variedad de métodos de marcado y detección
de la sonda. Dos de los más difundidos son la sonda híbri-
da o los métodos de sondeo con endonucleasa 5’ (también
conocidos como Taqman®). La hibridación de las sondas
requiere dos oligonucleótidos de la sonda; uno se marca con
un fluoróforo donador 3’ y el segundo con un fluoróforo re-
ceptor conveniente. Los oligonucleótidos se unen al ácido
 TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN DEL ÁCIDO NUCLEICO 217

Figura 22-4 PCR en tiempo real. a) Sondas de hibridación. Los oligonucleótidos se unen al DNA blanco adyacente; cuando se excitan
por luz de una longitud de onda conveniente, el fluoróforo donador (D) transfiere energía mediante resonancia fluorescente al fluoróforo
receptor (A), que emite luz fluorescente. b) Sondas Taqman. Cuando la polimerasa Taq de DNA extiende la cadena del DNA, encuentra
la sonda de hibridación unida al DNA de la plantilla. La actividad de la endonucleasa 5’-3’ de Taq desplaza y degrada a los oligonucleóti-
dos, con lo cual libera al fluoróforo indicador (R) a partir del oligonucleótido y lo separa por consiguiente del fluoróforo extintor (Q) de
manera que el indicador despide luz fluorescente.

nucleico blanco adyacente a otro y, cuando el fluoróforo se
activa por la luz a una longitud de onda conveniente, libera
luz fluorescente y, por un proceso conocido como transfe-
rencia de energía de resonancia fluorescente, transfiere ener-
gía al fluoróforo receptor 5’ adyacente, que entonces emite
la luz a una diferente longitud de onda (fig. 22-4). La detec-
ción de esta emisión señala la vinculación específica de las
sondas adyacentes del oligonucleótido a su ácido nucleico
blanco. Una alternativa para el uso de estas sondas duales
es la utilización de un solo oligonucleótido y la capacidad de
la polimerasa Taq para actuar como endonucleasa 5’-3’. Un
fluoróforo se une al extremo 5’ de un oligonucleótido de la
sonda y un segundo fluoróforo se agrega al extremo 3’ del
oligonucleótido de la sonda. Bajo circunstancias normales,
la excitación de un fluoróforo conduce a la transferencia de
energía de resonancia fluorescente al otro fluoróforo. Esto
lleva a la emisión de la luz de una diferente longitud de
onda, que no suele reconocerse. Se dice que la fluorescencia
se extingue. Cuando el oligonucleótido se hibridiza con su
ácido nucleico blanco, los fluoróforos se liberan por hidró-
lisis y la fluorescencia ya no se extingue más (fig. 22-4).
Existen numerosas alternativas para lo anterior, incluidas
las sondas de un péptido del ácido nucleico (sondas “Luz-
up™”), sondas del oligonucleótido horquilla (“faros mole-
culares”) y amplicones autofluorescentes (p. ej., cebadores
“Sunrise™” o “Scorpion™”).
En la actualidad existe una extensa variedad de instrumen-
tos para usar la PCR en tiempo real. Uno de los más rápidos
de éstos es el “Lightcycler®” (fig. 22-5). Un capilar de cristal
asentado en plástico se utiliza como el recipiente de la reac-
ción. El capilar permite calentamientos y enfriamientos muy
rápidos de los reactantes y también posibilita la detección di-
recta de fluorescencia dentro del recipiente de la reacción. El
calentamiento y el enfriamiento se alcanzan con un elemento
térmico y un ventilador. Los capilares se rotan delante de un
diodo que emite un láser azul y la fluorescencia intracapilar
se vigila a través de tres diodos de fotodetección, cada uno
con filtros de longitud de onda diferentes para la activación.
El calentamiento y el enfriamiento rápidos alcanzados en este
sistema (20°C/seg) significan que un perfil del ciclo térmico
típico de 40 ciclos puede completarse en 20 minutos.
Automatización y PCR
El alto nivel de capacidad técnica requerido para realizar la
PCR convencional se ha resuelto en cierto grado con la cre-
ciente disponibilidad de productos comerciales de la prueba.
Un obstáculo importante que causa retrasos es la necesidad
de métodos confiables de alto rendimiento para la extrac-
ción de ácidos nucleicos. Los recientes progresos en robó-
tica y la estandarización de los reactivos han conducido al
desarrollo de varias plataformas capaces de automatizar la
preparación de la muestra y la disposición del método. Estos
procedimientos reducen la exigencia técnica requerida para
realizar la PCR, mejoran la reproducibilidad de la prueba
y promueven la comprobación de alto rendimiento, con lo
cual es posible introducir la comprobación NAAT para un
espectro más amplio de laboratorios clínicos y una gama
más extensa de virus patógenos.
218 CAP. 22 TÉCNICAS MOLECULARES EN VIROLOGÍA
Figura 22-5 El instrumento Lightcycler. Diagrama de la estructura interna del aparato. Reproducido con autorización de www.light-
cycler-online.com.
Amplificación mediada
por transcripción
Se han desarrollado varios métodos alternativos para la
amplificación del blanco; la amplificación mediada por
transcripción (AMT) es un ejemplo. Después de una téc-
nica de extracción propietaria para liberar y estabilizar el
ácido nucleico a partir del virión, la muestra de la prueba
se calienta brevemente a 95°C para desnaturalizar el ácido
nucleico blanco. Para amplificar el ácido nucleico, un oli-
gonucleótido se une al blanco de manera específica, al cual
se adhiere una secuencia impulsora para la polimerasa de
RNA. Si el ácido nucleico blanco es el RNA, en una reac-
ción isotérmica, una enzima transcriptasa inversa (TI) crea
una copia de DNA de la plantilla del RNA por extensión a
partir del extremo 3’ del cebador-promotor. El RNA en el
dúplex RNA-DNA se degrada entonces por la acción de la
RNAasa de la transcriptasa inversa. Un segundo oligonu-
cleótido se une al cDNA copiado y una nueva cadena del
DNA se sintetiza por TI. El dúplex de DNA con el promo-
tor del RNA adherido actúa como plantilla para la trans-
cripción por la polimerasa del RNA. Las copias del RNA
recién sintetizadas también actúan como plantillas nuevas
que vuelven a entrar al proceso AMT, lo que produce una
nueva ronda de la réplica, que conduce a un aumento expo-
nencial de los amplicones de RNA. La adición de una sonda
del DNA marcado con éster de acridinio, que une de modo
específico a los amplicones del RNA blanco, permite, des-
pués de la desnaturalización química de la sonda separada,
la detección del producto con quimioluminiscencia.
Amplificación basada en la secuencia
del ácido nucleico
La amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico
(ABSAN) es en apariencia muy similar a la AMT; empero,
mientras que la AMT utiliza dos enzimas en una amplifi-
cación isotérmica, la ABSAN usa tres. Después de la ex-
tracción del ácido nucleico con un método propietario para
la extracción del ácido nucleico basado en sílice, un ceba-
dor del oligonucleótido con un promotor de la polimerasa
de T7 RNA adherido se amplía por la acción de la TI, que
actúa en una dirección 3’ a 5’. Una enzima RNAasa degrada
entonces la cadena del RNA y un segundo cebador se une
a la molécula del cDNA y la TI produce la molécula de
DNA de doble cadena (en repeticiones recientes de la téc-
nica se ha utilizado una enzima que combina la actividad
de la polimerasa de DNA en la transcripción inversa y la
RNAasa de la misma forma que en la técnica AMT).
La polimerasa T7 produce luego transcripciones del RNA a
partir del DNA de doble cadena y actúa como plantilla adi-
cional para el procedimiento de ABSAN. La detección de
amplicones se logra por hibridación con un oligonucleótido
ligado a perlas paramagnéticas revestidas de estreptavidina
y una sonda marcada con rutenio. Las perlas paramagnéti-
cas que lleva el complejo híbrido amplicón-sonda se captu-
ran en la superficie de un electrodo por medio de un imán.
El voltaje aplicado a este electrodo desencadena una reac-
ción electroquimioluminiscente. Se han descrito métodos
para una amplia gama de blancos y un desarrollo recien-
te es el uso de “faros moleculares” en esta tecnología que
 TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN DEL ÁCIDO NUCLEICO
permite la detección y la cuantificación “en tiempo real”
del RNA del HIV.
Amplificación por desplazamiento de la cadena
La amplificación por desplazamiento de la cadena es un
comparativo recién llegado al campo de la amplificación
del ácido nucleico, pero ha ganado una amplia aceptación.
Dicho método se basa en la capacidad de las polimerasas
de DNA para iniciar la síntesis del DNA mediante un corte
a una sola cadena dentro de una molécula blanco de DNA
de doble cadena. Después de la extracción y la desnaturali-
zación de la molécula de DNA blanco, un oligonucleótido
cebador que contiene una secuencia específica del blanco y
una secuencia que posee un sitio que reconoce una enzima
de restricción (casi siempre BsopI) se unen a la molécula
blanco de DNA de una cadena. Una enzima polimerasa de
DNA copia entonces la molécula de DNA. Sin embargo,
los trifosfatos de desoxinucleótido (dNTP) usados para
este alargamiento se modifican mediante la sustitución del
tiol alfa. Cuando una enzima de restricción se añade a la
reacción, ésta intenta cortar el DNA en el sitio de recono-
cimiento BsopI, pero puede cortar sólo una de las cadenas
del DNA porque la cadena recién sintetizada contiene el
dCTP sustituido por tiol alfa, que la enzima de restricción
no puede seccionar. La cadena recién sintetizada del DNA
se desplaza y el dúplex cebador-DNA puede actuar como
iniciador para una ronda nueva del copiado conducido por
la polimerasa de DNA. Las copias liberadas pueden servir
como plantilla adicional para la reacción. La acumulación
del producto puede detectarse por quimioluminiscencia.
Amplificación de la señal
DNA de cadena ramificada
Un ejemplo de un método de amplificación de la “señal”
para la detección y la cuantificación del ácido nucleico se
encuentra en el método con cadenas ramificadas de DNA
(bDNA) disponible en el comercio. Se hallan en el mercado
tres productos para identificar y cuantificar el DNA del virus
de la hepatitis B, el RNA del virus de la hepatitis C y el RNA
del virus de inmunodeficiencia humana. El método usado
para la detección del RNA del HIV es un procedimiento de
hibridación del ácido nucleico emparedado para la cuanti-
ficación directa del RNA del HIV-1 en plasma humano. El
HIV-1 se concentra primero en el plasma por centrifugación.
A continuación se utiliza un procedimiento de extracción
propietaria del ácido nucleico para liberar el RNA a partir
de los viriones. Un conjunto de sondas específicas que cap-
turan el oligonucleótido sintético atrapan el RNA en una
219
microcelda. Se permite que un grupo de sondas blanco hi-
bridice al RNA vírico y las sondas del preamplificador. Las
sondas de captura, que comprenden a 17 extensores indivi-
duales de captura, y las sondas blanco, que incluyen a 81
extensores individuales blanco, unen a las diversas regiones
del gen pol del RNA vírico. La sonda del amplificador hibri-
diza al preamplificador y forma un complejo DNA ramifica-
do (bDNA). Las copias múltiples de una sonda marcada con
fosfatasa alcalina (AP) se hibridan a este complejo inmovili-
zado. La detección se logra tras incubar el complejo con un
sustrato quimioluminiscente. La emisión de luz se relaciona
directamente con la cantidad de RNA del HIV-1 presente en
cada muestra y un analizador del luminómetro registra los
resultados como unidades de luz relativas (RLU). Una curva
estándar se define por la emisión de luz a partir de los es-
tándares que contienen concentraciones conocidas del virus.
Las concentraciones de RNA del HIV-1 en las muestras se
determinan a partir de esta curva estándar.
Captura híbrida
Otra amplificación de la señal disponible en el comercio
ofrece una sensibilidad más limitada que el método bDNA.
El método de captura híbrida implica la suspensión de la
muestra para liberar el DNA blanco. Después, el DNA se
combina con las sondas específicas del RNA en la solución
y los híbridos DNA-RNA se capturan sobre una placa de
microtitulación o un tubo de reacción mediante anticuerpos
monoclonales específicos para los híbridos DNA-RNA.
Los híbridos capturados se detectan con el uso de los an-
ticuerpos múltiples conjugados con fosfatasa alcalina. La
fosfatasa alcalina ligada se identifica mediante una reac-
ción quimioluminiscente con un sustrato del dioxetano.
Amplificación de la sonda
Reacción en cadena de la ligasa
La reacción en cadena de la ligasa (LCR) supone la unión de
dos secuencias complementarias del oligonucleótido de la
sonda a un DNA blanco (después de la extracción del ácido
nucleico a partir del virión y la desnaturalización del DNA).
Una enzima ligasa de DNA se utiliza para unir los dos pares
de sondas complementarias después que hibridan a la mo-
lécula blanco. La reacción se calienta para separar las cade-
nas del DNA y las dos secuencias de una cadena de DNA
forman las plantillas para la unión de la sonda adicional. El
método acusa ciertas limitantes por la alta anexión debido al
enlazamiento del extremo cohesivo de los dúplex de la sonda
y las condiciones de la hibridación deben ser rigurosas para
reducir la unión inespecífica de la sonda. Sin embargo, la
220 CAP. 22 TÉCNICAS MOLECULARES EN VIROLOGÍA
técnica encontró aplicación comercial en los métodos para
Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, las mico-
bacterias y Borrelia spp. No obstante, en fecha reciente los
proveedores comerciales de esta tecnología parecen aban-
donar el procedimiento en favor de una técnica PCR para la
detección de blancos microbianos.
Análisis de la secuencia
La determinación de la secuencia del ácido nucleico de
un virus tiene aplicación práctica importante en la virolo-
gía clínica. Mientras que el uso del aislamiento del cultivo
celular del virus ha declinado en favor de métodos más
rápidos de identificación del mismo (como la detección
directa de antígenos o ácidos nucleicos víricos), se obser-
va una reducción de la cantidad de información epidemio-
lógica referente a cepas de virus circulantes. Para tratar
este problema se introdujeron los métodos genómicos de
rastreo epidemiológico. La información epidemiológica
es de importancia en el control del paciente individual, en
medidas para prevenir o contener la extensión de la infec-
ción, en el rastreo del contacto y en el diseño de vacunas y
antivíricos para prevenir o tratar la infección. En contraste
con los esquemas tipificantes epidemiológicos basados en
características biológicas —como la capacidad para hema-
glutinar ciertos tipos de células rojas— o en la tipificación
serológica —sustentada en la capacidad de los antisueros
aislados para unir y neutralizar la infectividad de la con-
tagiosidad vírica— el análisis genómico proporciona casi
siempre una clasificación biológica más exacta.
En el proceso de identificación de un virus desconocido,
los datos de la secuencia, obtenidos a partir de cualquier re-
gión del genoma vírico, se pueden comparar con todas las
secuencias víricas conocidas a través del uso de los progra-
mas de gran alcance de la alineación secuencial (muchos
de los cuales están disponibles, p. ej., a través de internet),
hallados en bases de datos internacionales de ácido nuclei-
co de acceso abierto, como las que pone a disposición el
European Molecular Biological Laboratory o la base de
datos de Los Álamos en Estados Unidos. Con los virus co-
nocidos, las bases de datos menores están disponibles para
las comparaciones de la secuencia. Por supuesto, no todos
los virus humanos se han secuenciado todavía, pero el nú-
mero de secuencias víricas completas aumenta año con año
y para muchos más virus la información de secuencia par-
cial está disponible; esto significa que la información de
la secuencia se ha convertido en el método de facto para la
identificación y la clasificación de un nuevo virus.
La información de la secuencia también juega un pa-
pel importante en el control de ciertas enfermedades; por
ejemplo, se sabe que el genotipo del virus de la hepatitis C
es un determinante importante en la respuesta a la terapia.
A los pacientes identificados como crónicos e infectados
con el virus de la hepatitis C (persistencia del RNA vírico
de la hepatitis C en plasma) se les puede ofrecer una com-
binación del fármaco antivírico ribavirina y el interferón
alfa formulado con una cadena lateral de glicol de polie-
tileno (interferón pegilado); empero, se ha encontrado que
la respuesta a la terapia de un individuo se correlaciona
notoriamente con el genotipo del virus. En consecuencia,
los individuos sometidos a tratamiento tienen el genotipo
de un virus determinado. Aquellos en quienes se determina
que portan virus de los genotipos 1 o 4 requieren terapia
antivírica prolongada para lograr la curación.
Un uso muy importante de la tecnología de secuencia-
ción se encuentra en el control de los sujetos infectados con
el HIV. En Europa, por lo menos 20% de los nuevos casos
de la infección con HIV implica la transmisión del virus a
partir de una persona que ya experimentó la terapia con un
fármaco antivírico y es portadora de virus resistentes, por
lo menos a algunos de los fármacos antivíricos usados en el
tratamiento de combinación para el HIV. La determinación
del patrón de resistencia al fármaco puede ser crucial para
la terapéutica efectiva. El procedimiento también desem-
peña una función vital para seleccionar una combinación
apropiada de compuestos antivíricos en quienes fracasa
la terapia antivírica. Hay dos pruebas principales para la
resistencia antirretrovírica, la que detecta resistencia geno-
típica y la que reconoce resistencia fenotípica.
Las pruebas genotípicas buscan la alteración en la se-
cuencia base de los genes del HIV que se vinculan con el
desarrollo de la resistencia al fármaco. Por ejemplo, una
mutación específica, M184V, en el gen de la transcriptasa
inversa confiere resistencia al nucleósido análogo 3TC. Las
pruebas fenotípicas miden la concentración requerida de
un fármaco para inhibir la réplica vírica por 50 o 90% (IC50
o IC90, respectivamente) y requieren el cultivo del virus o
la construcción de los virus “recombinantes” indicadores.
La comprobación de la resistencia fenotípica para el
HIV se basaba (hasta finales del decenio de 1990) en los
métodos de reducción de la placa o los métodos de cultivo
de células de monocapa de sangre periférica (CMSP), que
exhibían distintas desventajas. Los métodos de reducción
de la placa del HIV requirieron el cocultivo del virus con
células HeLa-CD4+ y sólo así se podían utilizar para la mi-
noría de los aislados clínicos que pueden inducir al sincitio
en el cultivo celular (es decir, virus que son CXCR4 trópi-
cos). Los métodos de cultivo de células de monocapa de
sangre periférica son más versátiles, pero requieren 10 a
14 días de cocultivo de las CMSP del paciente con CMSP
estimuladas por el mitógeno a partir de individuos sero-
negativos al HIV, junto con la vigilancia del crecimiento
a través de un marcador sustituto de la infección, como el
 ANÁLISIS DE LA SECUENCIA 221

antígeno HIV p24. Hoy en día se utiliza con regularidad
una técnica molecular fundada en tal comprobación. En
dos variantes de la técnica disponibles en el comercio se
emplea una PCR de transcripción inversa para amplificar
la proteasa, la mayor parte de las TI y una porción de los
genes gag del HIV-1. En uno de estos métodos el cDNA
se incorpora en un virus recombinante pol-suprimido para
crear un aislado HIV-1 recombinante por la recombinación
homóloga en cultivo celular. Este aislado recombinante
es capaz de infectar una línea de células estándar y puede
usarse para medir la réplica vírica en presencia de concen-
traciones variables de fármacos antirretrovíricos mediante
la observación de la muerte celular inducida por el virus
recombinante. En el otro método directo se usa la ligadu-
ra para combinar el cDNA producido con el vector HIV-1
pol-suprimido y prueba la construcción del recombinante
durante una sola ronda de la réplica con el método del gen
indicador de la luciferasa. Ambos métodos poseen la sensi-
bilidad del fármaco en términos de la concentración micro-
molar del agente requerido para inhibir la réplica del HIV-1
en 50%. Aunque la comprobación fenotípica proporciona
un método más directo de medir la resistencia, en la ac-
tualidad la duración del tiempo necesario para realizar la
prueba (hasta varias semanas) reduce su utilidad clínica.
Los cambios fenotípicos se originan a partir de las trans-
formaciones en el genotipo y de ese modo la comprobación
genotípica puede proporcionar indicios sobre la resistencia
del fármaco antes de las pruebas fenotípicas. El virus extraí-
do del plasma se transcribe de manera inversa y se efectúa
una serie de PCR, diseñada para permitir la amplificación de
regiones de la proteasa vírica, la transcriptasa inversa u otras
regiones del genoma (p. ej., el gen de envoltura proteínica
del gp41 del HIV-1 en los sujetos sometidos a la terapia con
fármacos inhibidores de la fusión del HIV). A continuación
se secuencian los productos marcados de forma apropiada
(véase la fig. 22-6). La secuencia del cDNA se alinea con
una cepa de “tipo silvestre” del HIV y se compara con una
base de datos en la cual se documentan las mutaciones de
punto y las combinaciones de las mutaciones de punto co-
rrelacionadas con el desarrollo de la resistencia a combina-
ciones individuales o múltiples de fármacos. A las bases de
datos las mantienen los proveedores comerciales de la prue-
ba o están disponibles a través de bases de datos de colabora-
ción internacional de acceso gratuito, como la base de datos
de la Stanford University HIV RT and Protease Database.
En el examen de los virus RNA, como el virus de la
hepatitis C o el HIV, el RNA extraído a partir del plasma
se transcribe en forma inversa y el cDNA se amplifica por
PCR. Luego se puede examinar la secuencia de varias ma-
neras. En el método InnoLipa, disponible en el comercio
para la genotipificación de la hepatitis C, el cDNA desnatu-
ralizado se hibrida con las tiras de nitrocelulosa a las cua-
les están unidos los oligonucleótidos que corresponden a
las secuencias presentes en los genotipos aislados del virus
de la hepatitis C. Uno de los cebadores del oligonucleótido
usado en la PCR se marca con una molécula de biotina. El
modelo de unión del cDNA se revela por la reacción del
cDNA inmovilizado con un complejo avidina-enzima, se-
guida por un sustrato cromógeno; el patrón de bandas que
aparece en la tira revela el genotipo del virus. Los méto-
dos de resistencia comerciales similares de la transcriptasa
inversa y la proteasa del HIV-1 emplean principios meto-
dológicos similares, pero en este caso las sondas del oligo-
nucleótido inmovilizadas sobre la nitrocelulosa se diseñan
para seleccionar mutaciones de la resistencia en los genes
de la proteasa o la TI del HIV-1.
Pese a ello, en condiciones normales, el cDNA se marca
en una PCR adicional en presencia de 2’,3’–trifosfatos de

Figura 22-6 Secuenciación. Un ejemplo que muestra la secuenciación de la proteasa del HIV-1 y los genes de la TI. Las bases que se
elucionan a partir del secuenciador capilar se codifican por color (azul, citosina; negro, guanina; rojo, timina; verde, adenina), lo que
permite que la secuencia se construya y compare con la secuencia de una cepa de tipo silvestre de la secuencia HIV-1 para determinar los
cambios de base dentro de la cepa de prueba del virus que puedan vincularse con el desarrollo de la resistencia al fármaco antivírico.
222 CAP. 22 TÉCNICAS MOLECULARES EN VIROLOGÍA
didesoxinucleósido (ddNTP). Se usa una mezcla optimiza-
da de manera cuidadosa de los trifosfatos de desoxinucleó-
tido (dNTP) y los ddNTP, junto con los oligonucleótidos
en una PCR convencional. La síntesis de la cadena nueva
se termina de modo aleatorio por la incorporación de un
ddNTP, que se marca con un colorante específico de la base
que éste marca. Al final de la reacción de establecimiento de
la secuencia, el tubo donde se produce la misma posee una
mezcla de las copias parcialmente sintetizadas del DNA.
Cada una tiene un extremo 5’ común (definido por el oli-
gonucleótido cebador usado en la reacción), pero sus longi-
tudes son diferentes (varían por una base de longitud en el
extremo 3’). La mezcla se analiza mediante electroforesis
en gel de poliacrilamida y fluorometría o secuenciación en
gel capilar automatizada de alto rendimiento (fig. 22-6). En
el último método, los fragmentos más pequeños del DNA
marcado presentan la mayor movilidad y se elucionan pri-
mero a partir del capilar. Cada fragmento que se eluciona
con posterioridad del capilar es una base más larga que
aquella que la precede. Los fragmentos separados del DNA
se revelan por excitación con láser. Cada uno de los colorantes
unidos a una base terminal 2’3’ emite luz en una diferente
longitud de onda que permite distinguir la base terminal in-
dividual. Los cuatro colores, y por lo tanto las bases, pueden
reconocerse con facilidad. La secuencia del fragmento se
lee en forma directa a partir del eluido capilar.
Las alternativas a este procedimiento incluyen el uso de
portaobjetos de cristal, láminas de silicón o membranas
de nylon con oligonucleótidos incorporados (microchips de
DNA). Para la genotipificación del HIV-1 se ideó una se-
rie para analizar la secuencia completa del gen de la pro-
teasa del HIV-1 y una región de 1 200 pares de bases del
gen de TI. El chip incluía 18 000 sondas de 18 a 22 pares
de bases y se diseñó para abarcar todas las combinaciones
posibles de la mutación dentro de esta secuencia. Cada
nucleótido en la secuencia por analizar requiere por lo
menos cuatro sondas del oligonucleótido para determinar
si el nucleótido en esa posición es una A, T, C o G. Para
utilizar la serie, el cDNA que resulta de una TI PCR del
virus derivado del plasma se transcribe al RNA de una ca-
dena y se marca con moléculas indicadoras fluorescentes.
Después de la hibridación, se explora el chip mediante un
láser para activar la marca fluorescente y el modelo de la
vinculación se revela por el examen con un microscopio
confocal. Las moléculas indicadoras despiden luz fluores-
cente en proporción con la astringencia con la cual se une
la sonda al ácido nucleico. Las sondas que no se unen a
ningún ácido nucleico no emiten luz fluorescente, mien-
tras que las sondas unidas con un solo par de bases mal
emparejadas tienen hasta 35 veces menos fluorescencia
respecto del emparejamiento completo de la secuencia.
El enderezamiento automatizado del modelo de la unión
observada permite la vinculación de las secuencias deriva-
das de sondas superpuestas para determinar la secuencia a
partir de la secuencia de tipo silvestre del RNA del HIV-1
representada en el chip. La variación genética del HIV re-
presenta un gran desafío para el uso de los chips de DNA.
En comparaciones con la secuenciación didesoxinucleotí-
dica se encontró que el chip es menos confiable en la detec-
ción de la mutación y menos capaz del discernimiento de
inserciones o deleciones de la secuencia. El chip tampoco
es del todo apropiado para secuenciar cepas que no son
del subtipo B de HIV-1, el subtipo en el cual se diseñó el
chip. A pesar de este retroceso, las capacidades y el alto
rendimiento de los microchips de DNA condujeron a su
desarrollo comercial continuo y los chips para el análisis
genotípico de los virus de las hepatitis B y C no están le-
jos de su aparición en el mercado. Un enfoque interesante
para el uso más amplio de esta tecnología es la descripción
de una microconfiguración del DNA de un oligonucleótido
largo (70-mer) que ha demostrado ser capaz de detectar e
identificar centenares de diversos virus humanos. Median-
te una PCR de transcripción inversa aleatoria fue posible
reconocer junto con esta tecnología virus múltiples en es-
pecímenes respiratorios sin el uso de PCR, a partir de ceba-
dores específicos de la secuencia o degenerados.
Resumen
No han dejado de multiplicarse las aplicaciones de las téc-
nicas biológicas moleculares en virología, sobre todo en la
virología clínica. Los métodos moleculares de diagnóstico
reemplazaron en poco tiempo a los métodos convenciona-
les de diagnóstico, como el aislamiento en cultivo celular,
la serología, la microscopia de fluorescencia y la micros-
copia electrónica. La automatización ha atenuado la com-
plejidad técnica de la comprobación, al tiempo que mejora
reproducibilidad y confiabilidad. Su aplicación desplazó a
la virología clínica de una búsqueda de mero interés acadé-
mico a una ciencia clave determinante en el diagnóstico de
la fase aguda y el tratamiento de los enfermos.
Lecturas adicionales
Los últimos datos sobre los patrones antirretrovíricos de la resis-
tencia (comprobación genotípica) se pueden encontrar en: An-
tiviral Drug Resistance Online, www.viral-resistance.com; en
la Stanford University HIV RT and Protease Database, http://
hivdb.stanford.edu/hiv; y en la base de datos de la secuencia
del HIV de Los Álamos, http://hiv-web.lanl.gov
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 23
Virología: otras pruebas
Alex WL Joss
Este capítulo incluye la descripción de las técnicas no
descritas en las secciones anteriores; tales metodologías se
agrupan en tres áreas que salen del ámbito de los laborato-
rios de diagnóstico vírico: enfermedad por prion, suscepti-
bilidad antivírica e inmunidad mediada por células.
Detección de la enfermedad por prion
Los priones se clasifican como una entidad infecciosa inde-
pendiente porque la mayoría de los investigadores cree que
carecen de cualquier ácido nucleico y que consisten tan sólo
en partículas proteináceas infecciosas. Se incluyen en esta
sección por varias razones: son subvíricos en tamaño; en el
plano histórico se denominaron “infecciones víricas lentas”,
y la opinión de la minoría sostiene aún que se trata en rea-
lidad de virus, “nemavirus”. Son la causa de la enfermedad
cerebral, encefalopatía transmisible espongiforme (ETE),
por la cual la acumulación de la proteína prion da lugar a la
vacuolización del tejido nervioso y neurodegeneración, que
se manifiesta en clínica como demencia de lenta progresión,
ataxia, sueño y trastornos de la alimentación y conduce de
modo inevitable a la muerte. Las enfermedades incluyen
temblor en ovejas, encefalopatía bovina espongiforme (EBE)
en el ganado y cuatro tipos de enfermedad humana: enfer-
medad de Gerstmann-Straussler-Schinker (GSS), insomnio
familiar mortal (IFM), enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
(ECJ) y kuru, además de una quinta si se incluye la variante
de la ECJ (vECJ) relacionada con la EBE epidémica (fig. 23-1).
Es demasiado temprano para determinar si una segunda in-
fección zoonótica, por una ETE de los ciervos o los alces
(enfermedad caquectizante crónica), debe también incluirse,
aunque tres hombres han muerto de enfermedad neurodege-
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
nerativa después de banquetes de caza silvestre en Estados
Unidos. Antes de considerar la cuestión del diagnóstico, es
esencial entender algo del fondo y el mecanismo teórico del
proceso infeccioso. Sólo entonces es posible reconocer las
dificultades inherentes al diagnóstico rápido.
La esencia de la enfermedad por prion es la alteración
de la conformación helicoidal alfa de una proteína normal
y esencial de la membrana neuronal (PrPc) a una confor-
mación de lámina beta resistente a la proteasa (PrPRes), la
eliminación de la cual conduce a la degeneración neuroló-
gica (fig. 23-1). La presuposición de que sólo la proteína
(PrPRes) puede inducir este cambio se apoya en evidencia
in vitro. Datos nuevos sugieren que la neurodegeneración
se desencadena por el estrés oxidativo debido a que la afi-
nidad de unión al metal de la PrPc se altera. Ésta es un anti-
oxidante que se une al cobre fijado a las membranas celulares
neuronales y el efecto protector se puede perder cuando la
PrPRes se liga a otros metales, como zinc y manganeso.
De las enfermedades humanas por priones, la GSS e
IFM surgen de varias mutaciones puntuales en el gen PrPc,
las cuales se “transmiten” genéticamente dentro de las fami-
lias (fig. 23-1). La ECJ surge de modo esporádico (ECJe),
otra vez con la evidencia de la mutación puntual, o quizá
también con la sobreexpresión del gen PrPc. El aspecto in-
feccioso de la ECJ es su probada transmisión yatrógena a
partir de injertos durales o córneos, instrumentos neuroqui-
rúrgicos o extractos de la hormona pituitaria y la posibilidad
de infección accidental por la manipulación del tejido cere-
bral. El kuru, reconocido como la consecuencia de prácticas
caníbales en Papúa, Nueva Guinea, se ajusta más a la imagen
de un proceso infeccioso. De manera similar, el canibalismo
artificial de cerebro ovino o bovino conduce a la infección
por EBE, y la ingestión subsiguiente de tejido neural infec-
226 CAP. 23 VIROLOGÍA: OTRAS PRUEBAS

Figura 23-1 Mecanismos de transmisión y evolución de la enfermedad por prion.

 DIAGNÓSTICO
tado de EBE provoca vECJ, la cual es distinta de la ECJe
en términos histológicos y epidemiológicos. Es más fácil
y estrecha la transmisión interespecies en relación con la
PrPc en el receptor en comparación con la fuente. Las PrPc
ovina y bovina difieren sólo en siete residuos, mientras que
las PrPc bovina y humana lo hacen en 30 residuos. Sin em-
bargo, todas las ETE, con excepción del IFM, se han trans-
mitido de manera experimental a un grupo de especies.
Diagnóstico
Las características que hacen tan difícil el diagnóstico son
el sitio de la enfermedad, el parentesco cercano del agente
patógeno con su huésped equivalente y la falta notoria de
ácido nucleico. Es poco probable realizar una biopsia del
cerebro cuando la terapia es aún inasequible, a menos que
se excluyan otras enfermedades tratables, y las muestras pe-
queñas pueden ser falsamente negativas. Los signos clínicos
de la ECJ, como demencia de rápida progresión, mioclono,
ataxia, trastornos visuales o síndrome de la mano ajena, no
son diagnósticos, pero pueden serlo en una persona más jo-
ven, como en la vECJ. Las mediciones fisiológicas son casi
siempre inútiles.
Histología
El diagnóstico definitivo de la enfermedad por prion re-
quiere evidencia de la eliminación de PrPRes en el propio
cerebro humano o después de la transmisión al cerebro ani-
mal. Las placas amiloides teñidas de rojo Congo, depósitos
de PrP sináptica, cambios espongiformes, marañas neu-
rofibrilares y gliosis subcortical son todos características
histológicas consistentes con el diagnóstico. No obstante,
todos estos signos se comparten en grados diversos con
otros trastornos neurodegenerativos, como las placas ami-
loides en la enfermedad de Alzheimer. Pueden relacionarse
de manera específica con la enfermedad por prion con me-
dios inmunohistoquímicos.
El anticuerpo específico de prion no es fácil de producir,
pero se ha cultivado el antisuero policlonal de conejo con-
tra núcleos de placa amiloide purificados del cerebro hu-
mano, o el cerebro de ratón infectado con ECJ, y contra los
péptidos sintéticos equivalentes a las secuencias alteradas
en el prion humano. Puede examinarse el tejido incluido en
parafina y fijado en formalina, pero después de la despara-
finización es esencial el pretratamiento con una proteína
desnaturalizante para incrementar la inmunorreactividad.
El ácido fórmico es el desnaturalizante más simple y
eficaz, si bien se puede reemplazar con el “autoclave hidro-
lítico” a 121°C por 10 minutos en una concentración apro-
piada de ácido clorhídrico. Se identifica la eliminación del
227
prion al ligarse el anticuerpo específico, el cual se visualiza
por la reacción con una enzima marcada (biotina-estreptavidina
o peroxidasa-antiperoxidasa) o conjugado fluorescente. Ce-
pas diferentes de prion producen proporciones variadas de
las dos anomalías principales, placas amiloides (GSS, kuru)
o depósitos sinápticos punteados (ECJe), mientras que la
vECJ humana y los cerebros del mono macaco infectados
con EBE producen abundantes placas corticales floridas en-
tremezcladas con vacuolas en un patrón “de margarita”.
Microscopia electrónica
Las partículas tubulofilamentosas, a menudo de 1 µm de
largo, son características diagnósticas observadas en im-
presiones de tejido cerebral humedecido recién cortado,
dispuestas sobre las rejillas del microscopio electrónico y
teñidas negativamente con ácido fosfotúngstico. Son dis-
tinguibles de los filamentos neurofibrilares identificados en
la enfermedad de Alzheimer. El diagnóstico de la micros-
copia electrónica puede fallar debido al muestreo aleatorio
de tejido no infectado, pero puede encontrarse evidencia
positiva de la infección en animales antes de que sean evi-
dentes otros cambios histológicos.
Cultivo
Además del IFM, las “infecciones” por prion se pueden
confirmar por el pase en ratones o cricetos. El diagnóstico
es lento y requiere por lo menos 60 días para demostrar la
histología característica en los cerebros inoculados, y más
tiempo aún que el periodo de vida de un ratón para algunas
cepas de crecimiento lento. El éxito de la transmisión pue-
de ser bajo, pero las EBE cruzan la barrera de la especie
con mayor facilidad y se pueden transmitir por vía bucal.
Los priones humanos se pueden expresar en cultivo tisular
(p. ej., células del ovario del criceto chino), pero no hay
efecto citopático evidente. Se ha desarrollado el cultivo in
vitro sin células, si puede describirse así; en éste, la PrPc
radiomarcada se convirtió en PrPRes en dos días de expo-
sición al prion de la encefalopatía espongiforme ovina sin
marcado. Sin embargo, la segunda tuvo que purificarse y
agregarse más de 50 veces, lo que indicó que la técnica
requería depuración para tener aplicaciones diagnósticas.
Inmunoblotting
Es posible establecer el diagnóstico rápido, en plazo de un
día, en muestras pequeñas del cerebro por inmunoblotting.
El tejido digerido por la proteinasa K se separa en geles de
poliacrilamida SDS y se transfiere de modo electroforético a
228 CAP. 23 VIROLOGÍA: OTRAS PRUEBAS
las membranas de nitrocelulosa, con lo cual se producen tres
o cuatro bandas de 16 a 31 kDa de peso molecular que reac-
cionan con el antisuero específico del prion. Sus cocientes de
tamaño e intensidad pueden distinguir la vECJ de la ECJe.
Éstas no se encuentran en la enfermedad de Alzheimer y la
proteinasa K digiere por completo a la PrPc normal.
Pruebas en otros tejidos o líquidos corporales
Todos los métodos discutidos hasta ahora se realizan en te-
jido cerebral; el diagnóstico sería más simple en un material
más accesible. El anticuerpo monoclonal del PrPc se puede
utilizar para diagnosticar la ECJ tras detectar la proteasa re-
sistente de PrP en muestras distintas de las cerebrales. La
PrPRes se ha identificado en la orina de los pacientes con
ECJ por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS e in-
munoblotting de bolitas de ultracentrifugación digeridas por
la proteinasa K. Puede también identificarse en amígdalas y
ganglios linfáticos incluidos y fijados en formalina, después
de la desparafinización, el tratamiento de ácido fórmico y el
autoclave hidrolítico mediante el conjugado biotina-avidi-
na, aunque sólo en pacientes con vECJ.
Las pruebas en el líquido cefalorraquídeo para los mar-
cadores sustitutos de la destrucción neuronal ahora son
parte del repertorio aceptado para el diagnóstico de la ECJ.
El utilizado más a menudo es un análisis de inmunotransfe-
rencia con el anticuerpo policlonal de conejo para detectar
una proteína neuronal muy conservada de 30 kDa, 14-3-3.
Como la presencia de esta proteína en el LCR puede ocu-
rrir en otras enfermedades neurodegenerativas, incluidos
algunos casos de Alzheimer, la prueba es específica sólo
en una proporción de 88 a 95%. Es menos sensible para
la vECJ (50%) que para la ECJe, pero con la adición de
la prueba ELISA comercial para la tau, una fosfoproteína
microtubular del axón, puede mejorar la sensibilidad a la
vECJ hasta 86 por ciento.
Técnicas no invasivas
Por lo general se considera útil la electroencefalografía,
aunque inespecífica. Los complejos periódicos de onda
agudos y la reactividad a estímulos externos o fármacos son
observaciones notorias. La prueba ordinaria imagenológica
de elección es la resonancia magnética de difusión ponderada,
que produce hiperintensidades corticales y subcorticales
multifocales; esta técnica es un marcador que posee 100%
de sensibilidad y especificidad en pacientes con ECJe.
En conclusión, la naturaleza de la enfermedad por prion
limita de manera notable los procedimientos habituales para
el diagnóstico y éste suele ser lento, invasivo y muchas ve-
ces sólo se determina en la necropsia. Sin embargo, la vECJ
proporciona el impulso para idear técnicas más rápidas y
menos invasivas. El examen del LCR para la proteína
14-3-3 ahora es el “estándar de oro” y los progresos en
resonancia magnética han mejorado las perspectivas del
diagnóstico no invasivo.
Pruebas de susceptibilidad antivírica
Los métodos de susceptibilidad antivírica todavía no se lle-
van a cabo con regularidad en muchos laboratorios de ruti-
na de virología. Las pruebas toman varios días o semanas
para realizarse y por lo tanto es probable que beneficien sólo
a los sujetos que requieren terapia extensa para los proble-
mas clínicos muy graves. Es más probable que se efectúen
en los laboratorios que atienden a gran cantidad de pacientes
inmunocomprometidos, quizá para supervisar la resistencia
antivírica del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) o
identificar virus resistentes del grupo del herpes en tales pa-
cientes. En la práctica, las decisiones para cambiar la terapéu-
tica antivírica se basan a menudo en la evidencia empírica de
la resistencia, es decir, el fracaso para responder en clínica
(fig. 23-2). De manera alternativa, se miden los marcadores
sustitutos de la resistencia, como fracaso del antígeno víri-
co o los valores del ácido nucleico en sangre para descender
en respuesta al tratamiento. Los métodos de susceptibilidad
confiables se agrupan en dos categorías: los fenotípicos, que
miden el efecto del antivírico sobre el crecimiento del virus
in vitro, y los genotípicos, que detectan en forma directa la
presencia de los mutantes que confieren la resistencia.
Ensayos fenotípicos
Los análisis fenotípicos proporcionan la prueba definitiva
de la resistencia antivírica. Miden la concentración anti-
vírica requerida para inhibir el efecto citopático (ECP)
total del crecimiento del virus en el cultivo celular o las
etapas específicas del metabolismo vírico, esto es, síntesis
de DNA o proteína. El virus debe propagarse primero en el
cultivo tisular, un paso que por sí mismo puede confundir
el resultado al alterar la proporción de mutantes resistentes
examinados con posterioridad. Por lo tanto, las pruebas se
realizan de preferencia en aislados de escaso pase. El HIV
se aísla a menudo de células mononucleares periféricas de
la sangre por cocultivo con una línea celular linfoblastoide,
otra complicación agregada.
Pruebas de reducción de placa (RP)
Cuando las monocapas celulares se siembran con el virus
diluido en condiciones que limitan el movimiento del virus,
 PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIVÍRICA 229

es decir, bajo un agar o recubrimiento de celulosa, o líqui-
do que contenga inmunoglobulina antivírica, cada unidad
vírica formadora de placa produce una placa discreta de
ECP. La adición de un antivírico diluido de forma seriada,
junto con cantidades tituladas fijas de virus (15 a 500 uni-
dades formadoras de placa), permite la medición de la sus-
ceptibilidad antivírica como la concentración que causa
50% de reducción de la placa (ID50). Los métodos de RP
detectan sólo cepas resistentes que constituyen más de 20 a
25% del aislado. Proporciones más bajas se pueden detec-
tar mediante un umbral de reducción de placa de 90%, pero
las mediciones ID90 son menos exactas que la ID50.
Las pruebas de RP utilizan técnicas de cultivo relativa-
mente baratas, pero las desventajas son los volúmenes de
los reactivos, los medios y el virus utilizados y el tiempo
requerido para estandarizar las concentraciones celulares,
víricas y antivíricas, y para contar de manera manual las
placas en cultivos replicados. El tiempo total de la prueba
es cuando menos de dos semanas. El cociente virus:célula
se debe optimizar para evitar que se generen cálculos altos
o bajos falsos de la susceptibilidad cuando los cocientes
son, respectivamente, demasiado bajos o altos. Los resul-
tados preliminares de la susceptibilidad del herpes simple
(HSV) se pueden obtener en tres días por examen prelimi-

Figura 23-2 Medidas para determinar la resistencia antivírica.

230 CAP. 23 VIROLOGÍA: OTRAS PRUEBAS
nar de los aislados en paralelo con la titulación de su in-
fectividad por la incubación de diluciones víricas seriadas,
con o sin aciclovir, a 1.5 veces la concentración aceptada
del umbral de resistencia.
Los ensayos de RP son el estándar de oro para la de-
tección de la resistencia del HSV, citomegalovirus (CMV)
y varicela zoster (VZV). Se han establecido los umbrales
de resistencia aceptados: 2 µg/ml para el aciclovir, 100
µg/ml para el foscarnet y un aumento triple a cuádruple de
ID50 para el ganciclovir en comparación con el tratamien-
to previo. Pese a ello, la duración de los procedimientos
y las tasas bajas de aislamiento, muchas veces tan bajas
como 30%, hacen en clínica menos útiles los métodos de
RP del HIV que las pruebas genotípicas más rápidas.
Captación del colorante (pruebas CC)
La tecnología semiautomatizada de una prueba CC conviene
a los laboratorios con un rendimiento más alto. Principios
similares se aplican al examinar concentraciones constantes
del virus contra diluciones seriadas del antivírico, pero el
ECP después de dos a tres días de incubación se mide por
medios espectrofotométricos. Las cantidades del colorante
rojo neutral absorbido por las células viables sobrevivien-
tes, en una hora, entonces eluidas en alcohol amortiguado,
producen lecturas de densidad óptica que son inversamen-
te proporcionales al ECP y a los títulos del virus. Pueden
interpretarse de modo objetivo y calcularse de manera au-
tomática a los valores ID50. Puesto que se utilizan recubri-
mientos líquidos, los valores ID50 calculados son más altos
que en los métodos de RP y los umbrales de resistencia se
elevan en consecuencia, por ejemplo de 2 a 3 µg/ml para el
aciclovir. La técnica, en placas de microtitulación, requiere
menos reactivo y detecta cepas resistentes que constituyen
sólo 3 a 9% de un aislado total; empero, los métodos de RP
predicen de forma más exacta la falla clínica atribuida a la
resistencia.
Pruebas de síntesis de DNA
La síntesis del DNA vírico en cultivos celulares se puede
cuantificar por la hibridación con sondas de DNA especí-
ficas radiomarcadas. Se mide el valor ID50 antivírico como
la concentración que causa la reducción de 50% de la señal
de la sonda ligada. El DNA de las células lisadas al final de
un periodo definido del crecimiento del virus se transfiere a
“filamentos” de nylon y se cuantifica mediante sondas mar-
cadas con 125I (métodos comerciales Hybriwix), o filtros de
nitrocelulosa y después se hibridan con sondas marcadas
con 32P. Estos análisis son más rápidos que los métodos RP,
producen resultados en cuatro a seis días y se han utilizado
para detectar resistencia en cepas de HSV, CMV y VZV. Las
desventajas son su costo y la vida útil breve de las sondas.
La resistencia al aciclovir en cepas de HSV o VZV puede
confirmarse tras demostrar el mecanismo de la resistencia.
La mayor parte de las cepas resistentes muestra mutación
en el gen de la cinasa de timidina (TK), lo cual las inca-
pacita para fosforilar y activar al aciclovir. La deficiencia
de TK se puede medir en pruebas de incorporación de ra-
diomarcador en las líneas celulares apropiadas, como una
señal reducida sobre autorradiografía de la placa, mediante
125I-yododesoxicitidina o 14C-timidina. Esto se correlacio-
na bien con la imposibilidad de fosforilar al aciclovir.
Pruebas de síntesis de proteína
Para algunos virus, el crecimiento se puede supervisar por
el aspecto de las proteínas fácilmente identificables del
virus en cultivos celulares. El mejor ejemplo es la hemaglu-
tinina de la influenza A, que se puede detectar en monoca-
pas de riñón canino 18 horas después de la infección con
el anticuerpo monoclonal en una prueba inmunoabsorbente
ligada a enzimas (ELISA). La resistencia a la amantadina
o la rimantadina se demuestra como una falla para reducir
las lecturas de densidad óptica del método ELISA, es de-
cir, síntesis de hemaglutinina, excepto en concentraciones
elevadas del antivírico. Esta prueba discrimina con claridad
la resistencia de cepas susceptibles con más éxito que los
métodos de RP y es la prueba de opción para la influenza A.
Con el advenimiento de los agentes antineuraminidasa osel-
tamivir y zanamivir, la resistencia antivírica se puede medir
como la inhibición disminuida de la actividad enzimática
vírica en sobrenadantes del cultivo tisular de influenza me-
diante un sustrato fluorógeno. Los métodos de expresión
del antígeno vírico también se encuentran disponibles para
HSV, VZV y CMV y reconocen las proteínas tempranas o
tardías. El grado de inhibición de la expresión del antígeno
por antivíricos se puede medir por citometría de flujo, que
es más rápida que los métodos de RP y más automatizada.
Métodos genotípicos
Cuando se conoce que las mutaciones puntuales dentro de
genes específicos del virus confieren resistencia antivírica,
pueden probarse de forma directa, en cualquier aislado o
muestra clínica, las más de las veces sangre. Por lo general,
las mutaciones se identifican mediante amplificación de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de las secuen-
cias de DNA pertinentes en las muestras clínicas, seguido
por los análisis de secuencia o hibridación con las sondas de
mutación específicas. Una gama considerable de métodos
comerciales o internos están disponibles hoy día; es proba-
 INMUNIDAD MEDIADA POR CÉLULAS
ble que los análisis de secuencia sean el método de detección
más sensible. La complejidad de la metodología y su inter-
pretación obligan a efectuar las pruebas en los laboratorios
especializados, donde la prueba para la resistencia del HIV
se realiza de rutina. Los resultados de la susceptibilidad se
notifican sobre antivíricos individuales dentro de cada uno
de los tres grupos anti-HIV principales: inhibidores nucleó-
sidos de la transcriptasa inversa, inhibidores no nucleósidos
de la transcriptasa inversa e inhibidores de la proteasa. Las
mutaciones en los genes fosfotransferasa o polimerasa de
DNA del CMV y el gen de la proteína transmembrano-
sa de la influenza A también se vinculan con la resistencia
antivírica y así proporcionan blancos para los ensayos
genotípicos. La ventaja de esta técnica es su directividad,
que evita la necesidad de aislar, cultivar y cuantificar el vi-
rus. Esto no es sólo más rápido en términos técnicos; los
mutantes de resistencia se pueden identificar en la sangre
antes de que se aísle el virus resistente. Las desventajas son
la incapacidad para detectar resistencia cuando se ignoran
las mutaciones específicas o reconocer las mutaciones pre-
sentes como una proporción baja (p. ej., <10 a 25%) de la
población vírica total en una muestra.
Conclusión
En la práctica clínica es probable que continúen las deci-
siones de cambiar la terapia antivírica a partir de evidencia
empírica o del marcador sustituto. Sin embargo, todavía
existe un lugar para la prueba de susceptibilidad in vitro
para confirmar la resistencia. La resistencia del CMV o
HIV puede demostrar heterogenicidad focal, por ejemplo
los aislados retinales de CMV resistente junto con los ais-
lados sistémicos sensibles, que modifican el tratamiento.
Los años recientes han visto que la innovación rápida en la
terapia antivírica y la búsqueda de compuestos útiles han
suministrado buenos métodos de susceptibilidad. La intro-
ducción de nuevos antivíricos, la evaluación de la terapia
combinada y la investigación de los datos inconsistentes
acerca de la resistencia in vitro e in vivo deben incremen-
tar la demanda de esta tecnología. Con la atención actual
mejorada de la infección por HIV con terapia de múltiples
fármacos, la prueba genotípica de resistencia antivírica del
HIV se ha vuelto parte del repertorio de atención cuando
falla el tratamiento.
Inmunidad mediada por células
Una inmunorrespuesta celular eficaz es importante en la su-
peración de la infección vírica, aun si las investigaciones de
laboratorio se centran casi de modo exclusivo en la reac-
ción humoral. Las pruebas de inmunidad celular son mucho
231
menos favorables al rendimiento grande que las pruebas se-
rológicas. Además de los estudios de investigación, estas
pruebas se reservan para el análisis de deficiencias, como
el fracaso para superar las infecciones del grupo del herpes.
Los métodos típicos in vitro valoran dos aspectos de la fun-
ción del linfocito, la capacidad de reconocer al virus (me-
diante pruebas de proliferación) y la capacidad de destruir
las células infectadas (con métodos de citotoxicidad).
Pruebas de proliferación
Los linfocitos de la sangre periférica (LSP) en el medio de
cultivo se estimulan para proliferar por activadores externos
y mitógenos, como fitohemaglutinina (PHA) o, de forma
más específica, los antígenos víricos. Se requieren varios
días de incubación, después de la cual la proliferación se
mide como la cantidad de timidina radiomarcada que se in-
corporó dentro del DNA en las últimas horas, cuantificada
por el contador de centelleo líquido de ácido precipitado,
y las células se lavan. Las pruebas comparan la respuesta
de los linfocitos T del paciente a un virus particular de los
controles sin estimular (negativo) o estimulados con PHA
(positivo). Los métodos se realizan por lo menos por tripli-
cado y, cuando se llevan a cabo en diluciones seriadas de
LSP, se calcula el número de linfocitos T circulantes que
reconocen el antígeno del virus y la frecuencia de la célula
reactiva. Pueden determinarse los antígenos purificados in-
dividuales o los extractos ordinarios de la célula infectada.
Pruebas de citotoxicidad
Los ensayos de citotoxicidad se pueden realizar en una
variedad de poblaciones de leucocitos (células asesinas
dependientes de anticuerpo, células asesinas naturales
inespecíficas, monocitos), pero es la respuesta citotóxica
del linfocito T (CTL) la más relevante en este contexto. Las
células se pueden enriquecer a partir de la fracción de LSP
por procedimientos de adsorción-elución y los anticuerpos
monoclonales o la citometría de flujo. La prueba implica
otra vez cultivo de varios días para medir la actividad efec-
tora en las células blanco que contienen al virus. Las célu-
las blanco deben ser histocompatibles con los CTL de los
pacientes y pueden ser fibroblastos, linfocitos B, macrófa-
gos o células del tumor que expresan antígenos víricos, ya
sea después de infección, transfección o pulsaciones con
péptidos víricos. La actividad de CTL se cuantifica por la
emisión del cromo radiactivo de las células blanco marca-
das sobre un corto periodo al final de la incubación. Las
pruebas de cultivos replicados, habitualmente de los CTL
diluidos en serie, miden el número de las células efecto-
ras que destruyen a un porcentaje específico de un número
232 CAP. 23 VIROLOGÍA: OTRAS PRUEBAS
predeterminado de células blanco. El análisis de datos es
complejo y es esencial un protocolo de la prueba bien con-
trolado, con metodología estadística apropiada. Los CTL
activos deben ser perceptibles en pacientes con infección
vírica aguda, persistente o reactivada.
Citometría de flujo
Desde el punto de vista técnico, la medición de los marca-
dores CD4 en la infección por HIV es una investigación de
inmunocompetencia celular. La citometría de flujo se uti-
liza para medir los cocientes CD4:CD8 en individuos con
HIV para determinar la progresión o recuperación inmu-
nitarias después del tratamiento. En fecha más reciente el
método se ha utilizado para determinar la persistencia de la
inmunidad mediada por células después de la vacunación
del sarampión o la varicela. Los linfocitos del paciente se
incuban con el antígeno vírico por varios días y la expre-
sión subsiguiente del antígeno CD25 en la población CD4
indica inmunidad persistente. Estos datos proporcionan
evidencia tranquilizadora para la eficacia de la vacunación
de la varicela en los sujetos inmunocomprometidos.
En suma, los métodos de proliferación y citotoxici-
dad consumen tiempo, utilizan radiactividad, tienen todos
los problemas del mantenimiento de los métodos inter-
nos más complejos y requieren un suministro regular de
LSP frescos, con control de edad y sexo de los voluntarios.
Los métodos controlados de manera correcta de citotoxi-
cidad deben vigilar la variación diaria de los resultados de
los CTL de control, con alta y baja toxicidad criopreser-
vada. Los límites normales se deben establecer a partir de
un grupo grande de voluntarios. Por lo tanto, las pruebas
se realizan en centros especializados, las más de las veces
con propósitos de investigación. Sin embargo, los pacien-
tes individuales con infecciones graves y recurrentes de
HSV, VZV o EBV requieren investigación para revelar la
disfunción exacta de la inmunidad celular, de tal modo que
puedan sugerirse y supervisarse las medidas terapéuticas.
La citometría de flujo se utiliza para personas inmunocom-
prometidas, pero su alcance se limita por su costo y reque-
rimiento de equipo complejo y destreza interpretativa.
Lecturas adicionales
Demaerel P, Sciot R, Robberecht W, Dom R et al. Accuracy of
diffusion-weighted MR imaging in the diagnosis of sporadic
Creutzfeldt-Jakob disease. J Neurol 2003; 250: 222-225.
Green AJE, Thompson EJ, Stewart GE et al. Use of 14-3-3 and
other brain-specific proteins in CSF in the diagnosis of variant
Creutzfeldt-Jakob disease. J Neurol Neurosurg Psychiat 2001;
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Oitani K. Expression of interleukin-2 receptor, CD25, on CD4
lymphocytes in response to Varicella zoster virus antigen
among patients with malignancies immunised with live atte-
nuated varicella vaccine. Pediatr Int 1999; 41:32-36.
Safrin S, Elbeik T, Mills J. A rapid screen test for in vitro suscep-
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Swierkosz EM, Arens MQ. Susceptibility test methods: viruses.
In Manual of Clinical Microbiology, 8th edn, Murray PR,
Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH (eds), 2003:
ASM Press, Washington, DC, 1638-1649.
 KWWSERRNVPHGLFRVRUJ
24
Micología
David W Warnock
Introducción
De las 50 000 a 250 000 especies de hongos que se han
descrito, menos de 500 se identifican como patógenos hu-
manos. Con pocas excepciones, estos microorganismos
se encuentran en el ambiente y las infecciones humanas se
adquieren a través de inhalación, ingestión o implantación
traumática. Las enfermedades micóticas humanas pueden
dividirse en tres amplios grupos: superficiales, subcutáneas
o sistémicas.
Las micosis superficiales son infecciones limitadas a las
capas exteriores de la piel, uñas y pelo, además de las mem-
branas mucosas. Las infecciones principales en este grupo
son la dermatofitosis y la candidiasis. Los agentes etiológi-
cos de estas enfermedades dependen del huésped viviente
para su supervivencia, pero difieren uno de otro en la manera
por la cual se logra esto. Los agentes etiológicos de la der-
matofitosis (las especies de dermatófitos Epidermophyton,
Microsporum y Trichophyton) dependen de la propagación
de una persona a otra para su supervivencia, mientras que los
agentes etiológicos de la candidiasis, de los cuales Candida
albicans es la más importante, son comensales normales del
aparato digestivo. Estos microorganismos no producen en-
fermedad a menos que un cambio en el huésped atenúe sus
defensas naturales. En esta situación, la infección endógena
da lugar a la infección superficial o sistémica.
Las micosis subcutáneas son infecciones que afectan a
la dermis, los tejidos subcutáneos y el hueso adyacente.
Entre las infecciones de este grupo se hallan la micosis por
el cromoblasto, el micetoma y la esporotricosis. Estas anor-
malidades son las más comunes en las regiones tropicales y
subtropicales y se adquieren casi siempre como resultado
de la implantación traumática de los microorganismos que
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
se encuentran en el ambiente. La enfermedad puede confi-
narse al sitio de la implantación o extenderse al tejido blan-
do y el hueso adyacentes. Es rara una diseminación más
extensa de la infección, a través de la sangre o los linfáti-
cos, y ocurre casi siempre sólo si el huésped se encuentra
de alguna manera debilitado o inmunocomprometido.
Las micosis sistémicas son las infecciones que suelen
originarse en aparato respiratorio o digestivo, pero pueden
propagarse a muchos otros órganos. Los agentes que causan
estas anomalías pueden dividirse en dos grupos distintos:
los patógenos verdaderos y los oportunistas. El primero de
estos grupos consiste en una pequeña cantidad de micro-
organismos, como los incluidos en la especie Histoplasma
capsulatum, que pueden invadir los tejidos de un huésped
normal sin predisposición reconocible. Además de la histo-
plasmosis, las infecciones principales por miembros de este
grupo son blastomicosis, coccidioidomicosis y paracocci-
dioidomicosis. En muchos casos, estas infecciones son asin-
tomáticas o leves y de corta duración. Los individuos que
se recuperan de estos padecimientos gozan a menudo de
resistencia duradera a la reinfección, mientras que aquellos
con enfermedad crónica o residual tienden con frecuencia
a sufrir una enfermedad subyacente intensa.
El segundo grupo de hongos patógenos sistémicos, los
oportunistas, comprende a un grupo mucho más grande
de microorganismos menos adaptables, como Aspergillus
fumigatus, que sólo pueden invadir tejidos debilitados o in-
munocomprometidos del huésped. Aparte de la aspergilo-
sis, las infecciones principales secundarias a los miembros
de este grupo son la candidiasis, criptococosis y mucormi-
cosis (zigomicosis). Con excepción de la candidiasis, que
de manera habitual se adquiere a partir del reservorio endó-
geno propio del individuo, la mayor parte de las infecciones
234 CAP. 24 MICOLOGÍA
micóticas oportunistas se adquiere a partir del ambiente, no
tanto como resultado de la propagación de persona a perso-
na. Estas infecciones se vinculan con altas tasas de morta-
lidad, pero se piensa que las estimaciones de su incidencia
son absolutamente conservadoras en comparación con su
verdadera magnitud, dado que muchos casos no se diagnos-
tican o informan.
Como en el caso de otras infecciones microbianas, el
diagnóstico de las infecciones micóticas depende de una
combinación entre la observación clínica y la investigación
de laboratorio. Las infecciones superficiales y subcutáneas
producen a menudo lesiones características que sugieren el
diagnóstico, pero las pruebas de laboratorio son esenciales
cuando éste no es el caso porque los signos clínicos semejan
los de otras enfermedades o un tratamiento previo altera el
aspecto de las lesiones. En casi todas las situaciones en las
cuales la infección micótica sistémica se considera como
un diagnóstico, la manifestación clínica es inespecífica y
puede deberse a una amplia gama de infecciones, enferme-
dades subyacentes o complicaciones del tratamiento.
El diagnóstico acertado de laboratorio de las infeccio-
nes micóticas depende en buena medida de la recolección
de especímenes adecuados para la investigación. También
guarda relación con la selección de los procedimientos de
prueba microbiológicos, serológicos e histopatológicos
apropiados. Éstos difieren de una enfermedad a otra y de-
penden del sitio de la infección, así como de los síntomas
presentados y los signos clínicos. La interpretación de los
resultados de las investigaciones de laboratorio puede en
ocasiones establecerse con confianza, pero algunas veces
los resultados pueden ser inútiles o incluso engañosos. En
estas circunstancias es esencial el enlace cercano entre el
clínico y el laboratorio.
Los métodos de laboratorio para el diagnóstico de las
infecciones micóticas se apoyan todavía en tres amplias
técnicas: detección microscópica del agente etiológico en
el material clínico; aislamiento e identificación en cultivo,
y detección de una reacción serológica del agente patógeno
o de algún otro marcador de su presencia, como un com-
ponente micótico de la célula o un producto metabólico.
En la actualidad se desarrollan nuevos procedimientos de
diagnóstico basados en la detección del DNA micótico en
material clínico, pero todavía no han tenido un efecto de
importancia en los laboratorios clínicos. En las secciones
que siguen se revisan el valor y las limitaciones de los pro-
cedimientos de diagnóstico actuales para las infecciones
micóticas.
Examen microscópico
Por lo regular, el examen microscópico directo del mate-
rial clínico es útil en el diagnóstico de laboratorio de las
infecciones micóticas. Diversos métodos pueden utilizar-
se: se pueden observar preparaciones humedecidas sin te-
ñir mediante iluminación de campo claro, campo oscuro o
contraste de fase, o bien es posible teñir y examinar frotis
secos. En algunos casos, el examen microscópico directo
hace posible establecer un diagnóstico preliminar o defi-
nitivo, mucho antes de que el crecimiento sea evidente en
el cultivo. En otros casos, la observación de elementos mi-
cóticos en un espécimen clínico es más significativa que
aislar el hongo en cultivo, sobre todo si el agente es un
contaminante común.
Aunque las células micóticas son más grandes que
las bacterianas, estos microorganismos se encuentran a
menudo presentes en cantidades mucho más pequeñas en
los especímenes clínicos. Por esta razón es esencial aumen-
tar la concentración de elementos micóticos en un espéci-
men antes de examinarlo. Los líquidos y las secreciones
deben centrifugarse y el sedimento conservarse para la in-
vestigación micológica. Otras muestras, como el esputo, se
deben digerir antes de la centrifugación.
Figura 24-1 Frotis de líquido de drenado peritoneal teñido con
Gram que muestra racimos de células de levadura y numerosas
células bacterianas mucho más pequeñas.
Existen varios métodos para preparar los especímenes
para el examen microscópico directo. Los frotis teñidos
con Gram son de uso frecuente para detectar células mi-
cóticas en líquidos y secreciones (fig. 24-1). La tinta de
la India es útil para la tinción negativa del sedimento del
líquido cefalorraquídeo (LCR) y así revelar células en-
capsuladas de Cryptococcus neoformans. La tinciones de
Giemsa y Wright se pueden emplear para perfilar las células
de Histoplasma capsulatum en preparaciones de la médula
ósea o frotis de sangre. La tinción de Papanicolaou se usa
en el esputo u otras muestras de las vías respiratorias para
reconocer elementos micóticos.
Los raspados de piel y otros especímenes dermatológi-
cos deben examinarse después de la digestión con solución
 CULTIVO 235

Estos métodos de teñido, aunque útiles para revelar la pre-

sencia de elementos micóticos en tejidos, rara vez precisan el
género micótico exacto identificado. Por ejemplo, la detec-
ción de la hifa septada y ramificada sin tinción es típica de la
infección por Aspergillus, pero es también característica de
una gran cantidad de microorganismos menos comunes,
como las especies de Fusarium y Scedosporium. Asimismo,
el reconocimiento de células micóticas pequeñas en fases
tempranas permite sólo de modo ocasional un diagnóstico
específico. Las células que forman el tejido de Histoplasma
capsulatum y Blastomyces dermatitidis, por ejemplo, pue-
den parecer similares y se confunden muchas veces con las
células de Cryptococcus neoformans sin cápsula.
Figura 24-2 Preparación de la piel con hidróxido de potasio Para superar este problema se han desarrollado diversos
sin teñir que muestra la presencia de hifas de dermatófitos ramifi- métodos para la identificación específica de microorganis-
cantes, algunos de los cuales están fragmentados en artrosporas. mos micóticos en tejido. La inmunoperoxidasa y los reac-
tivos inmunofluorescentes de tinción, sea monoclonales o
de hidróxido de potasio al 10 a 20%, que aclara el espéci- policlonales, están disponibles para algunos hongos y pueden
men sin dañar las células micóticas. Estas muestras pueden facilitar la identificación de elementos micóticos atípicos y
examinarse sin tinción, como preparación húmeda (fig. 24-2). la detección de cantidades pequeñas de microorganismos.
La adición de abrillantadores químicos, como el blanco de En la actualidad está bajo investigación una serie de técni-
calcoflúor, es útil en la demostración de elementos micóti- cas que incluye la unión específica de las sondas del DNA
cos en preparaciones húmedas de éstos y otros materiales al ácido nucleico del agente micótico directamente sobre el
clínicos, como esputo, cuando se examinan bajo un micros- portaobjetos (hibridación in situ) o en un tubo de prueba.
copio de fluorescencia. Los elementos micóticos aparecen
en tonos brillantes teñidos contra un fondo oscuro.
Cultivo
En ciertas situaciones, el examen microscópico directo de
líquidos u otro material clínico puede establecer el diagnós-
El aislamiento en cultivo hace posible identificar a la ma-
tico de una infección micótica subcutánea o sistémica. Los
yor parte de los hongos patógenos. Casi ninguno de estos
casos incluyen el reconocimiento de células encapsuladas de
microorganismos es exigente en sus requerimientos nutri-
Cryptococcus neoformans en LCR o células de Histoplasma
cionales y crece en los medios usados para el aislamiento
capsulatum en frotis de sangre periférica. Empero, con más
bacteriano a partir de especímenes clínicos. Sin embargo, el
frecuencia, sólo puede determinarse un diagnóstico presun-
crecimiento en estos medios puede ser lento y el desarrollo
tivo de infección micótica profunda con base en el examen
microscópico. No obstante, esto puede ayudar a determinar
si un agente recuperado más adelante en cultivo es un conta-
minante o un patógeno y puede ser de utilidad en la selección
de las condiciones más apropiadas de cultivo para recuperar
los microorganismos visualizados en un frotis directo.
El examen histopatológico de los cortes tisulares es uno
de los métodos más confiables para establecer el diagnósti-
co de infecciones micóticas subcutáneas y sistémicas. Pese
a ello, la facilidad con la cual puede reconocerse un hongo
patógeno en tejido depende no sólo de su abundancia, sino
también de la distinción de su aspecto. Muchos hongos se
tiñen de modo incorrecto con hematoxilina y eosina, un
método que resulta insuficiente para revelar elementos mi-
cóticos en el tejido. Existe un buen número de tinciones
especiales para detectar y resaltar microorganismos micó- Figura 24-3 Cultivo típico de Aspergillus nidulans sobre el
ticos, entre ellas la metenamina-plata (Grocott o Gomori) agar-dextrosa de Sabouraud. Obsérvese el aspecto polvoriento de
y el ácido peryódico de Schiff. El mucicarmín se puede la superficie colonial debido a la presencia de números enormes
utilizar para teñir la cápsula de Cryptococcus neoformans. de esporas.
236 CAP. 24 MICOLOGÍA
de las esporas y otras estructuras usadas en la identificación
micótica puede ser deficiente. Por estas razones, la mayo-
ría de los laboratorios utiliza un medio específico, como el
agar-dextrosa de Sabouraud, para aislar hongos (fig. 24-3).
Muchos especímenes clínicos sometidos al cultivo micótico
se contaminan con bacterias y es esencial añadir antibióti-
cos antibacterianos a los medios de cultivo micóticos. Si
se aíslan hongos dermatófitos o dimorfos, la cicloheximida
(actidiona) también se debe agregar al medio para prevenir
el crecimiento excesivo de hongos que crecen más rápido.
La temperatura óptima de crecimiento para los hongos
patógenos se aproxima a 30°C. El material de pacientes con
sospecha de una infección superficial se debe incubar de 25
a 30°C porque la mayor parte de los dermatófitos no crece a
temperaturas más elevadas. El material de sitios subcutá-
neos o profundos se debe incubar a dos temperaturas, 25 a
30°C y 37°C, porque varios hongos patógenos importantes,
entre ellos Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermati-
tidis y Sporothrix schenckii, son dimorfos y el cambio en su
forma de crecimiento, que depende de las condiciones de la
incubación, es útil en la identificación. A 25 a 30°C estos
microorganismos se desarrollan como mohos en el agar-
dextrosa de Sabouraud, pero a temperaturas más altas sobre
un medio enriquecido (como la infusión de agar-cerebro-
corazón), estos microorganismos crecen como levaduras.
Algunos hongos patógenos crecen con lentitud y los
cultivos deben conservarse por lo menos dos semanas, y en
algún caso hasta cuatro semanas, antes de desecharse como
negativos. No obstante, muchos hongos patógenos comu-
nes, como las especies Aspergillus y Candida, producen
colonias identificables en un plazo de uno a tres días. Los
cultivos deben examinarse con regularidad (por lo menos
tres veces por semana) y se realizan los subcultivos apropia-
dos, en especial a partir de medios enriquecidos con sangre,
en los cuales a menudo los hongos no pueden esporular.
Es importante reconocer que el crecimiento de un agen-
te en cultivo no establece en todos los casos su papel como
patógeno. Sólo si el microorganismo se identifica como pa-
tógeno inequívoco, por ejemplo Trichophyton rubrum o
Histoplasma capsulatum, puede establecerse el diagnóstico
con firmeza. Si, pese a ello, se recupera un agente opor-
tunista como Aspergillus fumigatus o Candida albicans, su
aislamiento puede carecer de relevancia clínica, a menos
que haya evidencia adicional de su participación en un pro-
ceso patógeno. En esta situación, los resultados del cultivo
deben compararse con los del examen microscópico. El ais-
lamiento de hongos patógenos oportunistas a partir de sitios
estériles, como sangre o LCR, proporciona muchas veces
evidencia confiable de una infección grave, pero su aisla-
miento a partir de material como pus, esputo u orina se debe
interpretar con cautela. Debe prestarse atención a la cantidad
de hongo aislada y solicitar investigaciones adicionales.
Muchos mohos desconocidos se han informado como
causales eventuales de la infección sistémica mortal en
pacientes inmunocomprometidos. Ningún aislado debe ex-
cluirse como un contaminante sin la consideración cuidado-
sa de la afección clínica del sujeto, el sitio del aislamiento, el
método de colección del espécimen, la cantidad de microor-
ganismos recuperados y la probabilidad de contaminación.
Aunque el cultivo establece con frecuencia el diagnóstico
definitivo de una infección micótica, también tiene algunas
limitaciones; la principal es la falla para recuperar el agente.
Esto puede deberse a la recolección inadecuada del espéci-
men o el transporte tardío de las muestras. Los procedimien-
tos incorrectos del aislamiento o los periodos inadecuados
de incubación son otros factores de consideración.
Identificación
Una vez aislados en cultivo, los mohos y los dermatófitos
(hongos filamentosos) se identifican con base en sus carac-
terísticas morfológicas macroscópicas (colonias) y micros-
cópicas. Las propiedades macroscópicas, como forma colo-
nial, color superficial y pigmentación, son a menudo útiles
en la identificación, pero es esencial examinar las prepa-
raciones en portaobjetos del cultivo bajo un microscopio.
Si están bien preparadas, éstas suministran casi siempre la
suficiente información sobre la forma y la disposición de
las esporas y las estructuras que posibilitan la esporulación
para el reconocimiento del hongo (fig. 24-4).
Figura 24-4 La tinción de lactofenol azul de algodón de Clado-
phialophora carrionii muestra las largas cadenas de ramificación
típicas de las esporas que identifican a este microorganismo.
Dado que la identificación es dependiente de la visuali-
zación de las estructuras particulares que un microorganis-
mo produce cuando esporula, el reconocimiento depende
por lo regular de la capacidad del agente para esporular.
Los mohos crecen a menudo mejor en medios ricos, como
 PRUEBAS SEROLÓGICAS
el agar-dextrosa de Sabouraud, pero la superproducción del
micelio da lugar con frecuencia a la pérdida de la esporu-
lación. Si un aislado de mohos no puede producir esporas
después de dos semanas, debe subcultivarse en un medio
menos rico para promover la esporulación. El uso de los
métodos de identificación basados en DNA puede eliminar
en un futuro este requisito.
De manera habitual, las levaduras (hongos unicelulares
recientes) se identifican a partir de sus características mor-
fológicas y bioquímicas. Las características morfológicas
útiles incluyen el color de las colonias, el tamaño y la for-
ma de las células, la presencia de una cápsula alrededor
de las células y la producción de hifas o seudohifas. Las
pruebas bioquímicas útiles incluyen la asimilación y la fer-
mentación de azúcares y la asimilación de nitrato y urea.
La mayor parte de las levaduras vinculadas con infecciones
humanas puede identificarse mediante uno de los nume-
rosos sistemas comerciales de identificación, como el API
20C AUX (bioMerieux-Vitek Inc., Hazelwood, MO), que
se basan en la asimilación diferencial de varios compues-
tos de carbono. Sin embargo, es importante recordar que el
examen morfológico de cultivos en la placa Dalmau sobre
agar de harina de maíz es esencial para evitar la confu-
sión entre los microorganismos con perfiles bioquímicos
idénticos. Se han ideado varias pruebas rápidas simples
para la presunta identificación de algunos de los agentes
patógenos humanos más importantes. La principal de éstas
es la prueba en tubo con suero de germen para Candida
albicans, que puede realizarse en menos de tres horas, y
la prueba de la ureasa para Cryptococcus neoformans. En
fecha reciente se desarrolló un buen número de pruebas
comerciales rápidas, entre las que se incluyen el sistema
de RapID Yeast Plus (Innovative Diagnostic Systems, Nor-
cross, GA) que contiene los sustratos convencionales y cro-
mógenos y requiere cuatro horas para realizarse. La mayor
parte de estos sistemas de pruebas rápidas es más exacta en
la identificación de levaduras patógenas comunes, no tanto
de las raras.
En el pasado, los hongos dimorfos como Blastomyces
dermatitidis e Histoplasma capsulatum se identificaron al
observar la conversión del crecimiento micélico a 25°C al
crecimiento como levadura a 37°C. Empero, el desarrollo
de las pruebas basadas en sondas de DNA (Accuprobe,
GenProbe Inc., San Diego, CA) ha permitido identificar
estos agentes patógenos con tan sólo una cantidad pequeña
de material micélico.
Pruebas serológicas
La comprobación serológica proporciona a menudo los
medios más rápidos para diagnosticar una infección
237
micótica sistémica. Casi todas las pruebas se basan en la de-
tección de anticuerpos contra hongos patógenos específicos,
aunque las pruebas para antígenos micóticos muestran ahora
una amplia disponibilidad. Las pruebas serológicas indivi-
duales pueden ser diagnósticas, como las pruebas de anti-
genemia en la criptococosis y la histoplasmosis. Pese a ello,
en general los resultados de la comprobación serológica son
rara vez más que sugestivos o se inclinan por un diagnósti-
co micótico. Estas pruebas deben interpretarse con cautela y
considerarse junto con los resultados de otras investigacio-
nes clínicas y de laboratorio.
Las pruebas de anticuerpos han probado ser útiles en
diagnosticar infecciones, como la histoplasmosis y la coc-
cidioidomicosis, en personas inmunocompetentes. En estos
individuos, el intervalo entre la exposición y el desarrollo
de los síntomas (dos a seis semanas) es casi siempre su-
ficiente para que se desarrolle una reacción humoral. Las
pruebas para los anticuerpos de Histoplasma capsulatum y
Coccidioides immitis son muy provechosas cuando se ob-
tienen especímenes de suero (agudo y convaleciente), al
grado que puede determinarse si los títulos se incrementan
o disminuyen. Las pruebas de anticuerpos también tienen
un uso diagnóstico establecido en las diferentes formas de
infección de Aspergillus que ocurren en individuos inmu-
nocompetentes. En contraste, estas pruebas rara vez son
provechosas para el diagnóstico de aspergilosis invasiva en
personas inmunocomprometidas, muchas de las cuales son
incapaces de activar una respuesta humoral detectable a la
infección. Las pruebas para los anticuerpos contra Can-
dida se han evaluado de forma extensa, pero son todavía
de utilidad limitada en el diagnóstico de formas invasivas de
candidiasis. Estas pruebas se complican con resultados
falsos positivos en pacientes con la colonización mucosa
o infección superficial y con resultados falsos negativos
en individuos inmunocomprometidos.
La comprobación de antígenos micóticos en suero, LCR
u orina es un procedimiento establecido para el diagnóstico
de la criptococosis y la histoplasmosis; en la actualidad se
evalúan pruebas similares para aspergilosis y candidiasis.
La prueba LPA para el antígeno polisacárido capsular de
Cryptococcus neoformans es sensible y específica y arroja
resultados positivos con especímenes de suero y LCR en
más de 90% de los pacientes infectados. Los títulos altos o
ascendentes indican la progresión de la infección, mientras
que los títulos descendentes señalan la regresión de la en-
fermedad y la buena respuesta al tratamiento. La detección
del antígeno en orina ha probado ser un método útil para
el diagnóstico rápido de la histoplasmosis en los pacien-
tes que se presentan con enfermedad aguda, así como en
aquellos con la infección diseminada. En la enfermedad
aguda, el antígeno puede detectarse en orina dentro del
primer mes después de la exposición, antes que aparezcan
238 CAP. 24
los anticuerpos. Se han desarrollado varios formatos de la
prueba, incluidos RIA y ELISA.
Las pruebas para la detección del antígeno también se
han evaluado con amplitud para el diagnóstico rápido de
las formas invasivas de aspergilosis en individuos inmuno-
comprometidos. Se han comercializado dos pruebas para
detectar el galactomanan circulante, un componente impor-
tante de la pared celular de la especie Aspergillus. Ambas
utilizan el mismo anticuerpo monoclonal, o en un formato
LPA o ELISA tipo emparedado. La última prueba (Platelia
Aspergillus, Sanofi Diagnostics Pasteur, París, Francia) es
más sensible que la primera (Pastorex Aspergillus, Sanofi
Diagnostics Pasteur) y puede detectar el galactomanan en
suero en una fase temprana de la infección.
Nuevas direcciones en el diagnóstico
Los nuevos métodos diagnósticos de infecciones micóticas
invasivas incluyen la detección de las secuencias micóti-
cas genómicas en especímenes clínicos. La mayor parte de
los métodos de diagnóstico que se han diseñado se basa en
el uso de los formatos PCR convencionales, pero muchas
técnicas modificadas también se han evaluado, incluidos
los métodos PCR multiplex y PCR anidada. Varias regio-
nes dentro del genoma micótico se han evaluado como
blancos potenciales para la detección, pero gran parte del
esfuerzo se ha centrado en el complejo gen del DNA ri-
bosómico (rDNA). Esta sección del genoma incluye las
regiones relativamente conservadas de los genes 18S, 5.8S
y 28S y regiones espaciadoras transcritas intervencionales
más variables. Los últimos desarrollos en el diagnóstico
molecular micótico implican el uso de métodos PCR en
tiempo real, en los cuales el termociclado se combina con
la vigilancia de la fluorescencia del producto amplificado
MICOLOGÍA
durante su generación. Estas técnicas permiten la cuanti-
ficación de las cantidades de ácido nucleico micótico pre-
sentes en especímenes clínicos, lo cual permite medir la
carga microbiana.
A pesar del reciente progreso, el objetivo de contar con
pruebas clínicas simples, rápidas y rentables en vías de
desarrollo para el diagnóstico molecular de infecciones
micóticas agudas peligrosas para la vida aún está lejos de
alcanzarse. Aunque los numerosos laboratorios de inves-
tigación ahora ofrecen procedimientos “internos” para la
detección molecular de la infección micótica a partir de es-
pecímenes de tejido o líquidos corporales, la sensibilidad,
la especificidad y el valor pronóstico de estas pruebas no
siempre se han investigado a fondo. Debe esperarse que, en
el futuro, se demuestre la importancia de la vigilancia se-
riada de los antígenos micóticos y las secuencias del ácido
nucleico específicas micóticas en sangre y otros líquidos
biológicos y que las pruebas confiables estén disponibles
para un grupo mucho más amplio de laboratorios clínicos.
Lecturas adicionales
Campbell CK, Johnson EM, Philpot CM, Warnock DW. Identifi-
cation of Pathogenetic Fungi. 1996 Public Health Laboratory
Service, London.
Chen SC, Halliday CL, Meyer W. A review of nucleic acid-
based diagnostic tests for systemic mycoses with an emphasis
on polymerase chain reaction-based assays. Med Mycol 2003;
40: 333-357.
Richardson MD, Warnock DW. Fungal Infection: Diagnosis and
Management, 3rd edn. 2003: Blackwell, Oxford.
Yeo SF, Wong B. Current status of nonculture methods for diag-
nosis of invasive fungal infections. Clin Microbiol Rev 2002;
15: 465-484.
 25
Parasitología
Robert WA Girdwood
Introducción
En el contexto de este libro, la parasitología de diagnóstico
se puede definir como la demostración de evidencia de mi-
croorganismos protozoarios o metazoarios que viven en los
seres humanos u otros animales (los huéspedes). La evi-
dencia puede ser directa o indirecta. Los hallazgos directos
proceden del examen de las muestras del supuesto hués-
ped, como heces, orina, sangre y otros tejidos, en una fase
del parásito o en una porción de éste. La evidencia indirec-
ta puede obtenerse tras demostrar reacciones inflamatorias
características, productos del parásito o los anticuerpos es-
pecíficos en el supuesto huésped. La demostración directa
de una fase del parásito en una muestra del huésped, por
ejemplo un huevo del helminto en una muestra de heces,
es casi siempre la evidencia indiscutible de infección, pero
siempre debe considerarse la posibilidad de la contamina-
ción del espécimen. A la inversa, un fracaso para demostrar
huevos en una muestra fecal no descarta en todos los casos
un diagnóstico, ya que se requiere tiempo para que los pa-
rásitos maduren en sus huéspedes y lleguen a la fase en la
que pueden observarse o el estadio del parásito puede es-
tar presente de forma escasa o intermitente en las muestras
examinadas. La evidencia indirecta de la infección, como
la demostración de anticuerpos, debe también tratarse con
precaución, sobre todo debido a la posibilidad de reaccio-
nes cruzadas con otros parásitos. Es por estas razones que
un conocimiento detallado de los ciclos vitales del parási-
to, los modos de transmisión y los tiempos tomados para
que las diversas fases se completen son requisitos para de-
terminar el diagnóstico. Es preciso este conocimiento para
decidir qué muestras se envían a examen y cuáles son las
más apropiadas en relación con el posible tiempo de expo-
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
sición a la infección y las manifestaciones de la enferme-
dad, si se presenta.
La piedra angular de la mayor parte de la parasitología
de diagnóstico se basa en la morfología y parámetros mor-
fométricos. En consecuencia, aunque en términos microbio-
lógicos los estadios de transmisibilidad (es decir, huevos,
quistes, ooquistes o larvas) tienden a ser relativamente gran-
des (en el orden de decenas a centenares de micrones [µm]),
el convencional microscopio de transmisión es todavía la
herramienta diagnóstica más importante. De modo similar,
aunque la mayor parte de los gusanos adultos y casi todos
los parásitos artrópodos (o vectores) son macroscópicos,
casi siempre se requiere la microscopia para detectar las ca-
racterísticas morfológicas, a menudo sutiles, necesarias
para la identificación de la especie. En este último caso, tie-
ne mayor utilidad el estereomicroscopio de bajo aumento.
Microscopia
El convencional microscopio de luz transmitida, que pro-
porciona magnificaciones totales de 100, 400 y 1 000 ⫻, es
el instrumento básico de los parasitólogos. Dado que es muy
importante una medición exacta del tamaño de los quistes
del protozoario, los ooquistes y los huevos del helminto, es
esencial disponer de una escala grabada del ocular calibra-
do con precisión. La microscopia de luz transmitida exige
que el espécimen sea lo suficientemente transparente para
permitir que la luz pase a través de él y que proporcione la
definición adecuada de la morfología. Esto significa que las
muestras tienen que ser finas, en el orden de micrones, y
cuando son relativamente opacas deben adquirir transparen-
cia mediante agentes clarificadores. Cuando los parásitos
240 CAP. 25 PARASITOLOGÍA
tienen por sí mismos un índice de refracción similar al de la
muestra que los contiene, requieren una tinción diferencial,
de tal modo que los colorantes usados se capten de manera
preferencial por los parásitos. Con menos frecuencia, los
tejidos o el medio circundante pueden teñirse y los parásitos
contenidos permanecen sin teñir: ésta es la tinción negativa.
Un método alternativo consiste en utilizar diferentes siste-
mas de iluminación como la microscopia de campo oscuro,
la de contraste de fases o la de contraste de interferencia
diferenciada (Nomarski).
Montajes húmedos
En parasitología, lo más frecuente para examinar la mues-
tra es el montaje húmedo, en el cual unas cuantas gotas del
espécimen o una suspensión de éste se colocan sobre un
portaobjetos del microscopio, se cubren con un cubreobje-
tos y se examinan a amplificaciones totales de 100 y 400⫻.
Los detalles específicos de la preparación del espécimen
dependen del número de parásitos probables en la mues-
tra en relación con la presencia de material contaminante u
oscurecedor. Por consiguiente, mientras que pueda ser útil el
examen directo de gotas sin concentrar de sangre u orina o
suspensiones salinas de heces, casi siempre es necesaria la
concentración de la muestra porque el parásito se halla en
cantidades pequeñas respecto del volumen del espécimen
que se requiere examinar. Los líquidos transparentes, como
la orina, pueden analizarse por centrifugación y examen
de un montaje húmedo del sedimento resuspendido o fil-
tración y examen similar del sedimento. El material fecal
representa un problema más complejo dado que los escasos
parásitos pueden estar presentes en una masa de detritos
opaca y oscurecida. Se emplean técnicas de concentración
selectiva, en las cuales los huevos, quistes y ooquistes del
parásito se concentran y se separan del detrito fecal, o
Figura 25-1 Huevo de una especie de Taenia. Suspensión fecal
concentrada en formol éter (400 ⫻).
viceversa (fig. 25-1). Tales técnicas utilizan la flotación o
centrifugación, en las cuales se explotan las diferencias en-
tre las densidades de los estadios del parásito y el detrito
contaminante mediante varios medios de suspensión de di-
ferentes densidades específicas. Según sea la técnica usada,
la muestra concentrada “limpia” para examinar al micros-
copio se obtiene a partir del sedimento centrifugado, es de-
cir, la interfaz entre los medios en suspensión de diferentes
densidades específicas y el menisco superficial flotante.
Ejemplos de estas técnicas incluyen la flotación/centrifu-
gación diferencial en formol éter de Ridley, la concentra-
ción del gradiente de sucrosa y la flotación de sulfato de
zinc. Los mismos principios se utilizan para la detección
de quistes, ooquistes y huevos del parásito en muestras am-
bientales, como agua, suelo, lodo y aguas residuales. En di-
chas muestras los parásitos son a menudo más escasos y se
utilizan ahora técnicas de concentración adicionales, como
anticuerpos antiparasitarios ligados a partículas magneti-
zadas.
Los parásitos en la circulación sanguínea están presentes
en concentración baja y, de nueva cuenta, se emplean las
técnicas que incluyen la concentración de parásitos y per-
miten el examen de volúmenes más grandes de sangre. En
consecuencia, la detección de la microfilaria, que tiende a
ser muy escasa aunque es relativamente grande (200 a 300
µm), exige cualesquiera de estas técnicas: a) la filtración de
un volumen grande de sangre anticoagulada a través de un
filtro de membrana que retiene a las microfilarias y permite
que pasen componentes celulares más pequeños de la san-
gre, con tinción, aclaración y microscopia subsecuentes del
filtro, o b) lisis de los eritrocitos en un volumen grande de
sangre (cerca de 5 ml) y la sedimentación de cualquier mi-
crofilaria contenida, que se examinan en un montaje húme-
do del sedimento resuspendido.
Extendidos y frotis
Los extendidos y frotis se utilizan con amplitud para detec-
tar parásitos en muestras de sangre, médula ósea y heces.
Las muestras de sangre para la identificación de parásitos
protozoarios, como los del paludismo y tripanosomas, se
examinan por lo general en la forma de extendidos finos o
gruesos teñidos con tinción de Romanowsky (fig. 25-2). Los
extendidos finos de sangre, del grosor de una célula, se fijan
antes de teñirse y, debido a ello, conservan la morfología de
los eritrocitos así como, en el caso del paludismo, los pará-
sitos intracelulares contenidos. Con los extendidos gruesos
los eritrocitos se lisan antes de teñirse y fijarse; de ese modo,
la preparación final revela sólo leucocitos, plaquetas y pará-
sitos. La ventaja de la película gruesa es que puede exami-
narse más material, pero son desventajas la imposibilidad
de reconocer los cambios morfológicos importantes en los
 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA
Figura 25-2 Tripomastigotos de Trypanosoma rhodesiense. Fro-
tis de sangre delgada teñida con Romanowsky (400 ⫻).
eritrocitos que produce el parásito del paludismo y que los
parásitos se pueden confundir con plaquetas y viceversa.
Los frotis de médula ósea teñidos con una tinción de Ro-
manowsky se usan para identificar Leishmania spp. intra-
celulares.
Se requieren frotis fijados y teñidos para la detección
de los trofozoítos del protozoario en heces. Dichas técni-
cas son indispensables porque se requieren la rotura de los
trofozoítos en material sin fijar y la visualización de los de-
talles finos de la estructura nuclear y las inclusiones
intracitoplásmicas para la identificación de las especies de
amebas. La hematoxilina férrica, las tinciones tricrómicas
y el Giemsa se emplean en extenso para estos propósitos.
Además, los frotis fecales teñidos se utilizan para recono-
cer ooquistes de Cryptosporidium spp. y esporas de mi-
crosporidios.
Con menos frecuencia, los frotis de impresión teñidos
de biopsia tisular o material de necropsia se emplean para
diagnosticar infecciones por Leishmania spp.
Histopatología
Las secciones tisulares convencionales pueden propor-
cionar información diagnóstica al parasitólogo o revelar
reacciones características del tejido para la infección o la
demostración del parásito (protozoario) o cortes del parási-
to (metazoario). De nueva cuenta, la micrometría es impor-
tante y, en el contexto del examen de cortes histológicos de
gusanos y sus huevos, es preciso el conocimiento adecuado
por la contracción debida a la fijación y las dimensiones
alteradas si los cortes son además distintos de los trans-
versales o sagitales. Con frecuencia se emplean tinciones
especiales para acentuar ciertos componentes de las sec-
ciones del parásito, pero la descripción de su uso rebasa los
alcances de este capítulo.
241
Fluorescencia
La capacidad de los materiales de emitir luminosidad cuan-
do se observan con luz ultravioleta se emplea en la para-
sitología diagnóstica de tres maneras: autofluorescencia,
tinción con fluorocromo y marcado con fluorocromo. La
autofluorescencia se refiere a la característica intrínseca
del microorganismo o un componente de éste para emitir
luz fluorescente y lo ejemplifica el aspecto azulado de los
ooquistes de Cyclospora spp. cuando se observan en mon-
tajes húmedos sin tinción bajo luz ultravioleta. La tinción
con fluorocromo se refiere a una tinción directa del micro-
organismo o un componente de éste con el fluorocromo. La
fluorescencia verde manzana que producen los ooquistes
de Cryptosporidium spp. cuando se tiñen con el fenol de
auramina es un ejemplo de este método. El marcado con
fluorocromo incluye casi siempre métodos inmunológicos,
en los cuales los anticuerpos (policlonales o monoclonales)
específicos del parásito se conjugan con un fluorocromo,
como el isotiocianato de fluoresceína, y se utilizan para
acentuar la detectabilidad de los parásitos en el material
clínico. El éxito de esta técnica depende en gran parte de
la especificidad del anticuerpo usado para unir la marca
fluorescente al parásito. Ejemplos de ensayos útiles inclu-
yen la detección de quistes de Giardia duodenalis estruc-
turalmente dañados en muestras fecales y la detección de
trofozoítos de Entamoeba histolytica en cortes o abscesos
tisulares. Los métodos indirectos, que utilizan microscopia
fluorescente y el parásito específico como sustrato fijado
para detectar anticuerpos en suero, se describen de modo
sinóptico en la sección de serología más adelante. La in-
corporación o la exclusión de fluorocromos se postula cada
vez más como método sustituto para determinar la viabili-
dad y, por lo tanto, la contagiosidad potencial de los quistes
o los ooquistes aislados a partir de muestras ambientales.
Por consiguiente, la exclusión del yoduro de propidio y
la inclusión de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por los
ooquistes de Cryptosporidium spp. se hallan bajo evalua-
ción actual.
Microscopia electrónica
A excepción de las infecciones por microsporidios, la
microscopia electrónica ocupa un lugar discreto en la pa-
rasitología diagnóstica. Aunque se han desarrollado pro-
cedimientos de diagnóstico alternativos, la microscopia
electrónica de transmisión de heces, biopsias intestinales
y otros tejidos es la técnica definitiva, aunque algo incon-
veniente, para diagnosticar infecciones con estos micro-
organismos, sobre todo porque son pequeños (1 a 2 µm),
intracelulares y se tiñen de modo deficiente.
242 CAP. 25 PARASITOLOGÍA
Cultivo
Una forma muy básica de cultivo se emplea para el diagnósti-
co y especiación de larvas de nematodo, como las uncinarias
y Strongyloides spp. Mientras que las larvas de Strongyloides
se evacuan en las heces del huésped y los huevos casi nun-
ca están presentes, lo contrario es válido para las uncinarias
Ancylostoma duodenale y Necator americanus, en los cuales
los huevos sólo se eliminan en heces frescas. Como los hue-
vos de los dos últimos son indistinguibles desde el punto de
vista morfológico, para efectuar la especiación basta crear las
condiciones en las cuales el huevo se incube y se desarrolle
en larvas de tercer estadio. Además, la motilidad de las lar-
vas de las tres especies se utiliza para facilitar la recolección.
Esto es en particular útil en el diagnóstico de la estrongiloi-
diosis, en la cual las larvas presentes en heces pueden ser
escasas y no se concentran bien cuando se aplican técnicas
convencionales, como la de éter formol. Las condiciones que
pertenecen a la transmisión natural de estos parásitos se re-
construyen con la técnica de Harada-Muri (o una similar).
En ésta, el material fecal se frota sobre tiras de papel filtro,
cuyos extremos inferiores se suspenden en un pozo con agua
destilada contenido en tubos de prueba sellados y se incuba
a 28°C por alrededor de 10 días. Bajo estas condiciones, las
larvas de uncinarias incubadas y las de Strongyloides migran
hacia abajo del papel filtro para recolectarse en el agua. Las
larvas se clasifican entonces por especie y se reconocen las
diferencias morfológicas. Debe observarse que ninguna ré-
plica de los parásitos ocurre en esta técnica de “cultivo”.
El cultivo in vitro de material clínico para propósitos de
diagnóstico se utiliza relativamente poco en parasitología
en comparación con otras disciplinas microbianas. Esto se
debe a que los protozoarios y metazoarios tienen reque-
rimientos metabólicos más complejos; éstos, en la mayor
parte de casos, no pueden reunirse en sistemas de cultivo in
vitro actuales. Sin embargo, los métodos de cultivo repli-
cativos únicos tienen un papel limitado en la parasitología
diagnóstica, en la que se emplean métodos alternativos,
con otras limitaciones. Por lo tanto, el sistema de cultivo
de Robinson para el aislamiento de Entamoeba histolyti-
ca como una técnica de diagnóstico es bastante incómoda
e insensible, pero ofrece la ventaja, cuando es exitosa, de
producir los trofozoítos para el análisis de la isoenzima.
La determinación cimodémica de aislados puede distin-
guir entre las cepas patógenas y las no patógenas. De igual
modo, el cultivo in vitro del material de la biopsia se utili-
za de modo amplio en el diagnóstico de la leishmaniosis,
cutánea y visceral, muchas veces como un adjunto para la
microscopia directa de una porción convenientemente teñi-
da del mismo material. La ventaja de la microscopia radica
en que es rápida y, si es positiva, diagnóstica, aunque esto
se atenúa por la habitual escasez de parásitos. El cultivo es
relativamente lento —días a semanas— pero tiene la venta-
ja, cuando es positivo, de producir microorganismos viables
que pueden someterse a especiación por análisis molecular,
serológico o enzimático y, además, se puede utilizar para la
comprobación de la susceptibilidad a los fármacos. Debe
acentuarse otra vez que los resultados negativos del cultivo
no excluyen el diagnóstico.
Cada vez más, con la complejidad creciente de las téc-
nicas de cultivo in vitro, los parásitos se propagan en cul-
tivo axénico de tal forma que los parásitos, las fracciones
preparadas de ellos o sus productos metabólicos pueden
recolectarse, purificarse y caracterizarse para el uso en pro-
cedimientos diagnósticos inmunológicos. Dos ejemplos
básicos del uso de los métodos de cultivo para propósitos
inmunodiagnósticos son: primero, cultivo in vitro de los tro-
fozoítos de Entamoeba histolytica, que se recolectan, se
adhieren a los portaobjetos del microscopio y se usan como
antígeno en la prueba indirecta del anticuerpo fluorescente
para la amebiosis; segundo, el mantenimiento de las larvas
incubadas de Toxocara canis de segundo estadio in vitro
y la recolección, concentración y estandarización de los
productos excretorios/secretorios que producen para el uso
como antígenos en una prueba de ELISA para la detección
de los anticuerpos circulantes de Toxocara.
Infección animal
La inoculación o suministro de material clínico dentro de
especies susceptibles de animales experimentales mante-
nidos en laboratorio fue alguna vez el apoyo principal de
todas las disciplinas de la microbiología diagnóstica. El
diagnóstico se establecía mediante el sacrificio de anima-
les, después de un periodo apropiado de incubación, y la
demostración del microorganismo o la enfermedad carac-
terística que producía en los órganos o tejidos mediante téc-
nicas microscópicas e histológicas convencionales. Cada
vez más se utilizan métodos alternativos de diagnóstico,
pero todavía se requieren animales, ya sea para el manteni-
miento de los parásitos para usarse como antígenos, cuan-
do no hay técnicas de cultivo in vitro disponibles, o para
la producción de anticuerpos antiparásitos usados en las
pruebas de diagnóstico. Parece probable que en el caso an-
terior el uso de los antígenos constructivos o el desarrollo
de técnicas de cultivo tisular reduzcan más este requisito;
por ejemplo, el cultivo celular continuo para la producción
de T. gondii reemplazó al cultivo animal.
Xenodiagnóstico
Este método inusual se halla entre el cultivo y la inocu-
lación animal y utiliza un vector natural o un huésped
 MÉTODOS MOLECULARES
intermedio en el ciclo vital del parásito para concentrar-
lo y de ese modo hacerlo más detectable. El ejemplo tí-
pico del xenodiagnóstico emplea uno de los vectores del
insecto Trypanosoma cruzi para facilitar el diagnóstico de
la enfermedad de Chagas (tripanosomiosis sudamericana).
Las ninfas (libres de parásitos) criadas en laboratorio de los
insectos redúvidos se habilitan para que se alimenten sobre
el paciente y se sacrifican algunas cuatro semanas después.
Los contenidos del intestino posterior se exprimen, tiñen
y examinan al microscopio en busca de tripomastigotos.
Este ejemplo casi único de xenodiagnóstico reconoce que
los parásitos son en extremo escasos en la sangre periférica
del huésped y que los insectos redúvidos son vectores muy
eficientes.
Serología
El serodiagnóstico es menos confiable que los métodos mi-
croscópicos más directos debido a los problemas de reac-
tividad cruzada (escasa especificidad), sensibilidad baja y,
con frecuencia, incapacidad para distinguir entre infeccio-
nes pasadas y actuales. De los tres grupos principales de
métodos serológicos, es decir, la detección del anticuerpo,
detección del antígeno y detección de complejos inmunita-
rios, la primera es la más utilizada para el diagnóstico. En
condiciones normales, dichas técnicas serológicas se em-
plean cuando el material para el examen directo en busca
de parásitos no está disponible. Por lo tanto, las pruebas
serológicas para el diagnóstico de parásitos intestinales
casi nunca se recomiendan, ya que el diagnóstico específi-
co mediante demostración de huevos o quistes en las heces
sería el método elegido. Por el contrario, en enfermedades
parasitarias invasivas del tejido, como equinococosis, toxo-
plasmosis o toxocariosis, la demostración de anticuerpos
circulantes puede ser más productiva que el examen de la
biopsia tisular. La interpretación de los resultados seroló-
gicos en relación con la fase de la enfermedad (aguda o
crónica) producida por el parásito puede mejorarse si se
determina la clase y el isotipo de la inmunoglobulina in-
cluidos en la respuesta del anticuerpo. Algunas veces se
puede lograr mayor sensibilidad y especificidad de la prue-
ba mediante inmunoblotting. De forma similar, una me-
jor caracterización de las preparaciones del antígeno, por
ejemplo mediante anticuerpos monoclonales, puede lograr
el mismo objetivo. Debido a que los anticuerpos pueden
persistir por años luego de la infección y el tratamiento
exitoso, la detección del antígeno del parásito en material
clínico es, en teoría, más atractiva porque la presencia del
antígeno debe indicar una infección actual o muy recien-
te. Los ejemplos del valor de este acercamiento son los
siguientes: a) uso de la técnica ELISA para reconocer el
243
antígeno de la filaria en suero, orina y líquido de hidrocele
de pacientes con infecciones por Wuchereria bancrofti (en
la cual la microfilaria es difícil de demostrar en la sangre
periférica en los estados crónicos), y b) en el suero y la
orina de individuos con infecciones por Onchocerca vol-
vulus. Una ventaja adicional potencial de la detección del
antígeno es que la cuantificación del antígeno circulante o
excretado puede correlacionarse con la carga del gusano
y, por extrapolación, con los síntomas y la transmisibili-
dad. La detección de complejos inmunitarios no es todavía
específica lo suficiente para propósitos diagnósticos, pero
la disociación de estos complejos para detectar los com-
ponentes del antígeno o el anticuerpo es una técnica más
satisfactoria.
Métodos moleculares
El uso de sondas de DNA y la técnica PCR proliferaron
en todos los campos de la microbiología en los últimos 20
años. En tanto que esto es verdad en la investigación pa-
rasitológica, en la cual predominan ahora dichas técnicas,
en los campos de la parasitología diagnóstica el papel de
los métodos moleculares sigue restringido aún. La venta-
ja principal de los métodos de detección basados en los
ácidos nucleicos es su sensibilidad. En consecuencia, en
el diagnóstico esto ocurre sólo cuando la carga del pará-
sito es baja y estas técnicas pueden mejorar las pruebas
más convencionales. La tripanosomiosis sudamericana es
un buen ejemplo; en la fase crónica de esta afección, las
parasitemias están tan bajas que se hallan fuera del límite
de detección por métodos microscópicos convencionales
(véase antes la sección Xenodiagnóstico). También en esta
enfermedad, debido a su carácter endémico, el serodiag-
nóstico no sólo carece de especificidad, sino que tampoco
puede distinguir entre la infección pasada o presente y el
estado actual de la enfermedad. De manera específica, una
secuencia de minirrepetición conservada de los minicírcu-
los del DNA del cinetoplasto usados como sonda, seguida
por la amplificación PCR, ha demostrado más sensibilidad
y especificidad que la microscopia, el serodiagnóstico o la
serología. Los métodos moleculares pueden ser también
valiosos con fines diagnósticos si los métodos más con-
vencionales están comprometidos por los cambios en el
huésped. Un primer ejemplo es el problema de diagnos-
ticar toxoplamosis en el huésped inmunocomprometido.
Toxoplasma gondii tiene una distribución mundial, con una
alta incidencia de infección subclínica. Por lo general, el
diagnóstico de infecciones pasadas o presentes se deter-
mina tras probar varias clases de anticuerpos específicos.
En el huésped inmunocomprometido, la infección latente
puede progresar a la enfermedad potencialmente mortal y,
244 CAP. 25 PARASITOLOGÍA

Cuadro 25-1 Algunas ventajas y desventajas de los métodos principales usados en la parasitología diagnóstica

Método Ventajas Desventajas

Microscopia Rápida (para espécimen individual)
Visualización directa del parásito
Resultado positivo casi siempre definitivo
Requiere un microscopista experimentado
Requiere parásitos relativamente numerosos,
es decir, que el resultado negativo no excluya
el diagnóstico
Lenta por la exploración masiva

Cultivo in vitro Detecta parásitos sólo viables Lento

Proporciona aislados además de la caracterización, Sólo disponible para un número limitado
comprobación de la sensibilidad y preparación de especies/cepas
del antígeno El cultivo negativo no excluye el diagnóstico

Infección animal Como el anterior Como el anterior

Costoso

Serología Simple Escasez de reactivos estándar (antígenos)

Rápida Difícil diferenciar entre infecciones pasadas
Puede usarse para la exploración masiva y presentes
Resultados falsos positivos debido a la
reactividad cruzada

Xenodiagnóstico Simple Sensibilidad baja

Barata Aplicación muy limitada
Específica Lenta
¿Incómoda?

Métodos moleculares Rápida Costosa

Sensible Detecta parásitos vivos y muertos
Puede detectar parásitos vivos y muertos Falsos negativos por inhibidores de PCR
Detección directa del parásito Falsos positivos por contaminación

en virtud de la deficiencia inmunitaria, el serodiagnóstico
es inútil. Los métodos de PCR que se dirigen a los genes
B1 o P30 se han aplicado al líquido amniótico y por lo tan-
to el diagnóstico de la infección fetal se puede establecer
sin fetoscopia.
La producción del antígeno, por hibridación o la tec-
nología de DNA recombinante, ha proporcionado reacti-
vos de diagnóstico específicos y sensibles tal vez útiles, y
el uso de técnicas moleculares para detectar vectores
transportadores de parásitos es otro ejemplo de las posibi-
lidades de la investigación molecular. Sin embargo, el en-
tusiasmo por el potencial de tales técnicas debe moderarse
por el conocimiento de las desventajas del costo relativo
y los problemas de resultados falsos positivos debido a la
contaminación de las muestras.
Los procedimientos de diagnóstico principales con al-
gunas de sus ventajas y desventajas se resumen en el cua-
dro 25-1.
Lecturas adicionales
Basic Laboratory Methods in Medical Parasitology. 1991: World
Health Organization, Geneva.
Cook GC (ed.) Manson’s Tropical Diseases. 1996: WB Saunders,
London.
Fleck SL, Moddy AH. Diagnostic Techniques in Medical Parasi-
tology. 1988: Wright, London.
Gillespie SH, Hawkey PM (eds). Medical Parasitology—A Prac-
tical Approach. 1995: Oxford University Press, Oxford.
Kettle DS (ed). Medical and Veterinary Entomology. 1995: CAB
International, Wallingford.
 SECCIÓN 5
HEMATOLOGÍA

KWWSERRNVPHGLFRVRUJ
 26
Morfología de las células sanguíneas
y de la médula ósea
Supratik Basu

Morfología de la sangre periférica
La morfología de la célula es una parte esencial de cual-
quier investigación hematológica, y se valora mejor con el
examen de una película extendida, bien teñida. Una película
sanguínea puede formarse a partir de sangre no anticoagula-
da (natural), que se obtiene de una vena o de un vaso capilar,
o de sangre anticoagulada con EDTA. Un frotis de sangre
bien hecho se extiende de manera uniforme y tiene un borde
torneado en lengüeta. Después, el frotis debe secarse rápido
al aire y fijarse en metanol puro por 10 a 20 minutos.
Tinción
Una vez que se fijan todos los frotis de sangre deben teñirse
en seguida. Los frotis de sangre y de médula ósea se tiñen
con colorante Romanowsky, una mezcla de azul de meti-
leno y de eosina. El primero tiñe los componentes ácidos,
por ejemplo, los núcleos y el RNA citoplásmico de azul,
mientras la eosina tiñe los componentes básicos, como la
hemoglobina, de rojo. La tinción popular Romanowsky es
conocida como May-Gruenewald-Giesma. En ciertas si-
tuaciones, p. ej., en la diferenciación de los diversos tipos
de leucemias, se usan tinciones especiales (cuadro 26-5).
aglutinación anormales. Una vez que la observación a bajo
aumento es satisfactoria, un área adecuada de la película se
examina detalladamente a gran aumento o se usa un objeti-
vo de inmersión en aceite.
Morfología del eritrocito
Cuando son saludables, los eritrocitos varían poco de ta-
maño y forma. La mayor parte son redondos y lisos y de
un diámetro dentro de un rango estrecho (la media es ± 2
DE) de 6.0 a 8.5 µm con una palidez central. Si durante
el examen de una película los eritrocitos se aprecian bien
separados y no se tocan unos a otros, menos de 10% de és-
tos deben tener una forma oval. Un porcentaje muy peque-
ño (menos de 0.1%) puede contraerse o fragmentarse. En
lactantes prematuros y normales esta proporción suele ser
más alta (de 0.3 a 5.6%) (para la morfología de la sangre
periférica normal, véase fig. 26-1).

Técnica para examinar un frotis sanguíneo

(un extendido)

Las películas deben examinarse primero en bajo aumento,

para tener idea de la calidad de la preparación, del núme-
ro, distribución y tinción de eritrocitos, de leucocitos y de
plaquetas. La visualización a bajo aumento también es más Figura 26-1 Frotis de sangre periférica normal que muestra
adecuada para detectar la presencia de precipitados y de neutrófilos, linfocitos, monocitos.

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
248 CAP. 26 MORFOLOGÍA DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS Y DE LA MÉDULA ÓSEA

Cuadro 26-1 Alteraciones del eritrocito

Terminología Qué significa Condiciones asociadas

Anisocitosis Variación más grande de lo normal Características no específicas. Pronunciada en anemia
en el tamaño grave
Anisocromía Población doble de células. Algunos Deficiencia de hierro en pacientes tratados o transfundidos.
eritrocitos adquieren un tono pálido Deficiencia hematínica combinada
Acantocitosis Células pequeñas con proyecciones Posesplenectomía (hiposplénica), fenotipo
espiculares regulares, múltiples McLeod, ␣-␤ lipoproteinemia, inanición
Autoaglutinación Agrupamiento irregular de eritrocitos Enfermedades de la aglutinina fría, anemia hemolítica
(fig. 26-2) autoinmunitaria
Punteado basofílico Inclusiones pequeñas de azul profundo en Envenenamiento con plomo, deficiencia de pirimidina 5’
(fig. 26-3) el eritrocito. Se ven mejor con el objetivo nucleotidasa, mielodisplasia, anemia megaloblástica,
de inmersión en aceite enfermedad de la hemoglobina inestable, talasemia
Células crenadas eritrocitos mostrando proyecciones romas Artefacto, hipotiroidismo, vejez, falla renal
con espacios uniformes
Eliptocitosis Células elípticas u ovales Anemia megaloblástica, deficiencia de hierro,
mielofibrosis, eliptocitosis/ovalocitosis hereditaria
Cuerpos de Howell Teñidos oscuros, inclusión como punto Hipoesplenismo de cualquier causa, anemia
Jolly (fig. 26-4) dentro de las células (remanente nuclear) megaloblástica
Hipocromía Eritrocitos pálidos (MCH <27 pg) Anemia por deficiencia de hierro, talasemia, anemia
(fig. 26-5) sideroblástica
Macrocitosis Células grandes (MCV >100 fl) Anemia megaloblástica, mielodisplasia, hipotiroidismo,
(fig. 26-6) anemia aplásica, enfermedad del hígado
Microcitosis Células pequeñas (MCV <75 fl) Veánse hipocromía
(fig. 26-5)
Eritrocitos nucleados Presencia de eritrocitos con núcleo Cualquier anemia grave, mielofibrosis, hemólisis grave,
(fig. 26-7) talasemia (posesplenectomía), infiltración de médula.
Normal en sangre del cordón, se encuentran en gran
número en la enfermedad hemolítica del recién nacido
Poiquilocitos Eritrocitos con forma anormal Cualquier anemia, especialmente relacionada con
eritropoyesis anormal, por ejemplo, talasemia, mielofibrosis
Policromasia Presencia de eritrocitos teñidos de gris Hemólisis, pérdida de sangre, eritropoyesis extramedular
azulado. Éstos son reticulocitos
Rouleaux Hacinamiento de eritrocitos en columnas Cierto grado es normal, mieloma, macroglobulinemia,
(fig. 26-8) infección crónica e inflamación
Esquistocito Eritrocitos fragmentados DIC, carcinoma, anemia hemolítica microangiopática
(fig. 26-9) (MAHA)
Célula falciforme Células delgadas, en forma de media luna Enfermedades de células falciformes
(fig. 26-10) elongada
Esferocitos Células pequeñas tensas y densas, sin palidez Esferocitosis hereditaria, enfermedad hemolítica del
(fig. 26-7) central recién nacido ABO, anemia hemolítica autoinmunitaria
Célula en espuela Células con proyecciones irregulares, afiladas Enfermedad del hígado, deficiencia de piruvato cinasa
Estomatocitos Células con una rendija parecida a una boca Estomatocitosis hereditaria, alcoholismo, artefacto
en el centro
Células diana Eritrocitos con un área central de coloración Hemoglobinopatías, por ejemplo, HbCC, enfermedad del
(fig. 26-11) densa y anormal, borde de hemoglobina en hígado SC
la periferia, con un anillo claro entre estos dos
Célula “en forma Autoexplicatoria (tipo de poiquilocitosis) Mielofibrosis, talasemia
de lágrima”
(fig. 26-12)
 EXAMEN Y MORFOLOGÍA DE LA MÉDULA ÓSEA
Anormalidades de la morfología del eritrocito
No es posible una descripción completa de todas las varia-
ciones normales y de las anormalidades en este capítulo (los
detalles morfológicos deben consultarse en un atlas). Algu-
nas alteraciones comunes que afectan a los eritrocitos con
sus desórdenes relacionados se listan en el cuadro 26-1.
Morfología del leucocito
Los leucocitos normales de la sangre periférica se clasifi-
can como leucocitos polimorfonucleares y células mono-
nucleares. El último término se refiere a los linfocitos y
monocitos. En un frotis (extendido) de sangre los monoci-
tos y los neutrófilos se concentran en el borde y al final de
ésta. La información vital se obtiene explorando en la pelí-
cula para evaluar la morfología celular y las alteraciones en
número en una ampliación más baja. El estudio detallado
de la granulación y de la morfología nuclear y citoplásmica
se realiza mejor bajo el objetivo de inmersión en aceite o
con una ampliación de aumento más alto.
Morfología normal
Los leucocitos normales son de cinco tipos:
• Neutrófilos. El neutrófilo maduro mide de 12 a 15 µm de
diámetro. El citoplasma es acidófilo con gránulos finos.
El núcleo con la cromatina agrupada se divide desde dos
a cinco lóbulos distintos, los cuales son filamentos de
heterocromatina densa. En el sexo femenino, algunos
neutrófilos tienen un apéndice nuclear en forma de ba-
queta ligado al núcleo por un filamento. Esto representa
un cromosoma X inactivo (fig. 26-1).
• Eosinófilos. Son ligeramente más grandes que los neu-
trófilos, 12 a 17 µm de diámetro. El núcleo con frecuen-
cia es bilobulado. Los gránulos eosinófilos son esféricos,
grandes, gruesos y de color naranja rojizo (fig. 26-13).
• Basófilos. Su tamaño es similar al de los neutrófilos, y su
núcleo oscurecido por gránulos negro púrpura, gruesos.
• Linfocitos. Éstos miden de 10 a 16 µm de diámetro. Los
linfocitos que predominan son los más pequeños (10 µm),
tienen citoplasma escaso y núcleo redondo con cromati-
na condensada. Cerca de 10% de los linfocitos son más
grandes, tienen un citoplasma abundante y cromatina
nuclear menos condensada. Los linfocitos pueden tener
una pequeña cantidad de gránulos que contienen enzi-
mas lisosomales (gránulos azurofílicos). En ocasiones las
células más grandes, con un citoplasma más abundante,
tienen gránulos azurofílicos bastante prominentes. Éstas
249
son llamadas linfocitos granulares grandes (para la mor-
fología normal del linfocito, véase la fig. 26-1).
• Monocitos. Son las células más grandes, con un diá-
metro de 12 a 20 µm; presentan un núcleo irregular y
lobulado; contiene abundante citoplasma de color grisá-
ceo-azul. Pueden apreciarse gránulos azurofílicos finos
en estas células; su contorno con frecuencia es irregular
y es posible que el citoplasma también esté vacuolado
(fig. 26-1). El retraso en la elaboración de frotis de san-
gre anticoagulada con EDTA propicia cambios en la
proteína secuestrina. Esto se muestra como vacuolación
del núcleo y del citoplasma; ello primero afecta a los
monocitos y luego a los neutrófilos.
Anormalidades de la morfología de los leucocitos
Algunas alteraciones comunes que afectan a los leucocitos
se listan en el cuadro 26-2.
Plaquetas
Las plaquetas normales miden de 1 a 3 µm de diámetro.
Contienen gránulos finos que se dispersan o concentran en
el centro. Es posible efectuar una estimación aproximada
del número de plaquetas mientras se examina una película.
En sangre anticoagulada con edta las plaquetas permane-
cen por lo general separadas. En los frotis frescos se agrupan
con frecuencia. Una muestra mal colectada puede producir
un conteo falso de plaquetas bajo. Algunas anormalidades
comunes de las plaquetas se listan en el cuadro 26-3.
Examen y morfología de la médula ósea
La distribución de la médula hematopoyética depende de la
edad. En recién nacidos, la médula hematopoyética ocupa
casi toda la cavidad de la médula ósea. La hematopoyesis
ocurre prácticamente en todos los huesos. Con la edad, la
médula hematopoyética se contrae y se sustituye por médu-
la grasa. En adultos jóvenes la médula hematopoyética se
confina al cráneo, a la espina dorsal, a las costillas, a la cla-
vícula, al esternón, a la pelvis y a las porciones proximales
de los huesos largos. Sin embargo, la médula hematopoyéti-
ca puede expandirse en respuesta a una demanda creciente.
Examen de la médula ósea
Debe examinarse la morfología de la médula ósea por me-
dio de una biopsia obtenida mediante trepanación por
aspirado. Las biopsias por aspirado de la médula ósea se
realizan con frecuencia en el esternón, la cresta iliaca o la
250 CAP. 26 MORFOLOGÍA DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS Y DE LA MÉDULA ÓSEA

Cuadro 26-2 Alteraciones del leucocito

Terminología Qué significa Condiciones relacionadas

Linfocitos atípicos Linfocitos grandes con citoplasma basófílo. Infecciones virales, reacciones
(fig. 26-14) Con frecuencia se rodean de los eritrocitos a las drogas
Bastones Auer Inclusión roja parecida a un bastón en las Leucemias mieloides
células inmaduras (blastos)
Células blásticas Células primitivas inmaduras Leucemias
Cuerpos de Döhle Inclusiones citoplásmicas azules en el Infección, inflamación
(fig. 26-15) citoplasma neutrófilo
Neutrófilos hipogranulares Neutrófilos con granulación anormal Mielodisplasia
y reducida
Leucoeritroblástico Presencia de eritrocitos nucleados y Infiltración de la médula,
granulocitos tempranos en sangre mielofibrosis hemólisis aguda
Leucocitosis Recuento de leucocitos más de 11⫻ 109/L Infección, inflamación, leucemia
Linfocitosis Recuento de linfocitos >4 ⫻ 109/L en adultos Leucemia linfática crónica,
linfoma en fase leucémica
>7 ⫻ 109/L en niños Pertusis, infección viral
Neutrofilia Neutrófilos >7.5 ⫻ l09/L Inflamación, reacción leucemoide,
leucemia mieloide crónica
Anomalía de Pelger-Huët Neutrófilos con dos lóbulos no segmentados Mielodisplasia, leucemia mieloide,
(bilobulados) forma hereditaria
“Cambio a la izquierda” Presencia de células mieloides tempranas (Véase Neutrofilia)
“Cambio a la derecha” Neutrófilos de cinco o más lóbulos Anemia megaloblástica
Célula difusa Linfocitos difuminados, degenerando Leucemia linfática crónica
Granulación tóxica (fig. 26-16) Neutrófilos con gránulos púrpura gruesos Infección, inflamación
Células de Turk/células Células linfoplasmacíticas reactivas Infección bacteriana, viral grave,
plasmacíticas leucemia rarade la célula plasmática

superficie intermedia de la tibia en bebés hasta los 18 meses
de edad. Hay agujas especiales de aspiración para este pro-
cedimiento. Las muestras de aspiración son apropiadas para
el examen citológico con fineza y detalle cuando se extien-
den en forma apropiada sobre un portaobjetos. El aspirado
de médula ósea es también conveniente para los estudios
de citometría de flujo, análisis cariotípicos y moleculares, y
también para los estudios de cultivo celular de médula ósea.
Las biopsias de fragmento óseo se realizan mejor, y con
mayor facilidad, a partir de la cresta iliaca. Las agujas es-
peciales para biopsia ósea se encuentran disponibles para
este propósito. La obtención de un fragmento de médula
ósea es esencial para una valoración histológica y de ce-
lularidad correcta. Las células de la médula ósea también
pueden evaluarse examinando fragmentos de la médula
que fue aspirada.

Cuadro 26-3 Anormalidades de la plaqueta

Anormalidad Qué significa Condiciones relacionadas

Plaquetas grandes Plaquetas del tamaño promedio antedicho Trombocitopenia inmunitaria, plaquetas ”gigantes”
del síndrome Bernard-Soulier
Agrupamiento de Agrupamiento de plaquetas en el frotis, Anticoagulante relacionado, muestra mal
plaquetas dando lugar a un recuento de plaquetas bajo colectada, muestras coaguladas parcialmente,
grupos pequeños normales en frotis frescos
Trombocitopenia Recuento bajo de plaquetas <150 ⫻ 109/L Trombocitopenia inmunitaria (ITP), aplasia de médula,
o infiltración, mielodisplasia, hiperesplenismo
Trombocitosis Recuento alto de plaquetas >500 ⫻ 109/L Infección, inflamación, estados mieloproliferativos
(fig. 26-17)
 EXAMEN Y MORFOLOGÍA DE LA MÉDULA ÓSEA 251

La celularidad disminuye de manera constante con la topoyéticas, el número de megacariocitos y la morfología.

edad, con una declinación acelerada a los 70 años. Las
biopsias con trépano se realizan siempre que un “aspira-
do seco” o una muestra diluida se obtienen por aspiración.
Esto sucede a menudo cuando una médula es fibrótica, hi-
percelular o se infiltra de modo anormal en alguna enfer-
medad. Las biopsias por aspiración y con trépano deben
considerarse como procedimientos complementarios.
Morfología de la médula ósea
Una vez que se aspira la médula debe extenderse formando
una película, como se describe antes. Los frotis de la médula
ósea, después de teñirse, deben examinarse al microscopio
con un objetivo de bajo aumento (10 ⫻) para el conteo de la
celularidad total, la distribución de las células hematopoyé-
ticas, la presencia de grupos anormales de células no hema-
La maduración de los componentes eritroides y mieloides,
sus proporciones relativas y patrones anormales de madura-
ción (p. ej., megaloblástico o displásico) deben observarse.
El cociente normal mieloide a eritroide (cociente M:E) es
de 2.5:1 a 8:1. Lo ideal es hacer un recuento diferencial
(mielograma) de al menos 200 células nucleadas. Esto
es importante si se sospecha de infiltración anormal con
leucemia, mieloma o linfoma. Los niños tienen una gran
cantidad de linfocitos pequeños; este número disminuye al
incrementarse la edad. En adultos cerca de 5 a 15% de las
células nucleadas son linfoides. Otras células que deben lo-
calizarse son los megacariocitos, las células plasmáticas, los
macrófagos y las células cebadas. Tanto su número como la
morfología son importantes. A los parásitos con frecuencia,
se les ubica mejor dentro de los macrófagos.
Una tinción con azul de Prusia de la médula permite
valorar las reservas y la distribución del hierro. La médula

Diagrama A Representación diagramática de la hematopoyesis. CFU-S, unidad formadora de colonias-bazo; CFU-GEMM, unidad
formadora de colonias-granulocito, eritrocito, macrófago, megacariocito; LSC (CFU-L), célula linfoide germinal (unidad formadora de
colonias-linfoide); CFU-GM, unidad formadora de colonias-granulocito; BFU-E unidad formadora de colonias-eritroide; CFU-Meg,
unidad formadora de colonias-megacariocito; CFU-NM, unidad formadora de colonias-neutrófilo, monocitos; CFU-Eo, unidad forma-
dora de colonias-eosinófilo; CFU-Bas, unidad formadora de colonias-basófilo; CFU-E, unidad formadora de colonias-eritroide; CFU-M,
unidad formadora de colonias-monocitos/macrófago; CFU-N, unidad formadora de colonias-neutrófilo; N, neutrofílica; E, eosinofílica;
B, basofílica; NB, normoblasto.
252 CAP. 26 MORFOLOGÍA DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS Y DE LA MÉDULA ÓSEA

Diagrama B Mapa de maduración. Reproducido con permiso de Churchill Livingstone, “Atlas of Haematology”, G.A.
 FIJACIÓN Y DESCALCIFICACIÓN 253

McDonald, J. Paul y B. Cruickshank. 5ª edición, 1989.

254 CAP. 26 MORFOLOGÍA DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS Y DE LA MÉDULA ÓSEA

Figura 26-2 Autoaglutinación de los eritrocitos. Figura 26-5 Eritrocitos macrocíticos, hipocrómicos.

hematopoyética entera se origina de una célula embrionaria

totipotencial hematopoyética en la médula. Una represen-
tación diagramática simple se muestra en el diagrama A.

Eritropoyesis normal

El primer precursor eritroide reconocible, el pronormo-

blasto, se desarrolla en forma progresiva y se diferencia en
un eritrocito normal. En este proceso adquiere más hemo-
globina de forma progresiva, y de manera gradual pierde
su basofilia citoplásmica y su núcleo. Este proceso entero
se divide, en forma arbitraria, en tres etapas: normoblasto
temprano, normoblasto intermedio y normoblasto tardío.
Los normoblastos tardíos no se dividen, pierden su nú-
Figura 26-3 Punteado basofílico de los eritrocitos.
cleo por extrusión y dan lugar a un reticulocito de la médu-
la. Éstos pasan hasta dos días en la médula antes de entrar
en la sangre periférica, donde constituyen menos de 1% de
la población de eritrocitos. Los reticulocitos poseen una
coloración gris azulado característica que permite verlos a
detalle y contarlos mejor usando una tinción supravital. Los
eritrocitos maduros son viables cerca de 120 días antes de su
destrucción en el sistema reticuloendotelial. La eritropoye-
sis normal y la hematopoyesis se ilustran en el diagrama B.

Algunos desórdenes frecuentes que afectan

principalmente la eritropoyesis

Anemia megaloblástica

Ésta surge de una deficiencia de la vitamina B12 o del áci-

do fólico. Debido sobre todo a la formación defectuosa del
timidilato, la síntesis del DNA en la fase S del ciclo celular
Figura 26-4 Cuerpos de Howell-Jolly. se retrasa. Esto hace que la división nuclear se rezague, y la
 EXAMEN Y MORFOLOGÍA DE LA MÉDULA ÓSEA 255

sincronización citoplásmica nuclear en desarrollo se afecte.

Aparte de los eritroblastos, la mayor parte de las células
en proliferación se modifican, también la mucosa intesti-
nal, los granulocitos y los precursores de la plaqueta. La
médula megaloblástica es hipercelular. La eritropoyesis es
desplazada a la izquierda, con aumento de tamaño celular y
apertura del sistema nuclear de la red de cromatina. La ad-
quisición de hemoglobina de manera temprana con pérdida
de sincronización del desarrollo citoplásmico nuclear es fre-
cuente (son características megaloblásticas). Los cambios
paralelos en precursores del granulocito incluyen la presen-
cia de mielocitos o de metamielocitos gigantes y neutrófilos
multilobulados (al desplazarse se mueve a la derecha). Los
megacariocitos también muestran hipersegmentación. La
Figura 26-8 Rouleaux con células de plasma anormal en el
sangre periférica muestra la presencia de macrocitos y de
mieloma.
neutrófilos desplazados a la derecha (figs. 26-6 a 26-18).

Figura 26-6 Neutrófilos macrocíticos e hipersegmentados.

Anemias hemolíticas Figura 26-9 Eritrocito fragmentado en la anemia microan-

giopática hemolítica (MAHA).
Las anemias hemolíticas (destrucción excesiva de eritroci-
tos) por cualquier causa muestran hiperplasia compensato-

Figura 26-7 Esferocitos con eritrocitos nucleados en la anemia

hemolítica autoinmunitaria (AIHA). Figura 26-10 Enfermedad de la célula falciforme.
256 CAP. 26 MORFOLOGÍA DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS Y DE LA MÉDULA ÓSEA

Figura 26-11 Talasemia con los eritrocitos nucleados. Figura 26-14 Linfocitos atípicos en la mononucleosis infec-
ciosa.

Figura 26-12 Células “en forma de lágrima” en mielofibrosis. Figura 26-15 Cuerpo de Döble en neutrófilo.

Figura 26-13 Eosinófilos. Figura 26-16 Granulación tóxica en neutrófilos.

 EXAMEN Y MORFOLOGÍA DE LA MÉDULA ÓSEA
ria eritroide de la médula. El cociente M:E se reduce, con
hiperplasia normoblástica y supresión de espacios grasos.
A partir de esta característica compartida en común, otras
pistas de diagnóstico útiles se obtienen mejor al analizar la
morfología del eritrocito periférico, y de investigaciones su-
plementarias de laboratorio apropiadas para la hemólisis.
Estados aplásicos e hipoplásicos
Estos desórdenes se presentan con frecuencia con anemia,
leucopenia y trombocitopenia, por ejemplo, la pancitope-
nia. Las causas pueden variar pero son a menudo idiopá-
ticas. La pancitopenia, en algunos casos, puede llegar a
ser progresiva y grave. La anemia es muy normocrómica
y normocítica con reticulocitos indetectables en la sangre
periférica. La médula celular es deficiente con un predomi-
nio de espacios grasos. Puede detectarse una proporción un
poco alta de linfocitos y de células plasmáticas. La médula
aspirada es acelular y el diagnóstico definitivo se mejora al
realizar biopsia ósea. La hipoplasia puede afectar sólo a un
linaje, como en la aplasia del eritrocito puro cuando el lina-
je de los glóbulos rojos tiene una alteración predominante.
Síndromes mielodisplásicos
Es un grupo con condiciones morfológicas heterogéneas
que se producen por una alteración adquirida de la célula
madre mieloide, que conducen a la proliferación anormal
y a la maduración desordenada de uno o más linajes de
las células hematopoyéticas. Éste se caracteriza por una
hematopoyesis ineficaz, que causa citopenia sanguínea
periférica y una propensión para la transformación leucé-
mica. La clasificación FAB (Francesa, Americana y Bri-
tánica) subdivide los síndromes de la mielodisplasia en
varios subgrupos.
La morfología de la médula muestra características dis-
plásicas que afectan a los tres linajes. La displasia eritroide
es notoria por una adquisición de hemoglobina heterogénea,
morfología nuclear anormal e irregular, y puente citoplásmi-
co. En un subgrupo conocido como anemia sideroblástica
en los precursores del eritrocito se observan gránulos side-
róticos anormales (con tinción azul de Prusia) dispuestos en
forma de anillo alrededor del núcleo del eritroblasto (véase
la fig. 26-27). Los cambios comunes del eritrocito periféri-
co incluyen anisocitosis, poiquilocitosis, microcitosis y, con
frecuencia, la presencia de hipocromía o un cuadro sanguí-
neo dimórfico. Los cambios correspondientes en las series
del leucocito incluyen neutropenia y la presencia de neutró-
filos hipogranulares en sangre periférica, con los cambios
seudo-Pelger. Anormalidades similares pueden también de-
tectarse en precursores granulocíticos de la médula ósea.
257
Policitemia
La policitemia proliferativa primaria (PRV o PPP) se ca-
racteriza clínicamente por la hemoglobina alta, hematócrito
alto, cuenta y masa eritrocíticas elevadas. Las cuentas de
leucocitos y plaquetas se elevan con frecuencia y la espleno-
megalia es común. La médula ósea muestra obliteración de
espacios grasos con hiperplasia de los tres linajes celulares.
Pueden ocurrir también cambios cromosómicos. La transi-
ción al estado mielofibrótico puede ocurrir hasta en un 15
a 20% de los casos. Cuando esto sucede la muestra obteni-
da por biopsia ósea muestra fibrosis creciente de reticulina
y de la médula. Los poiquilocitos “en forma de lágrima” y
las características leucoeritroblásticas aparecen en la sangre
periférica. También suele ocurrir transformación terminal a
leucemia mieloide aguda o a un estado mielodisplásico.
La policitemia secundaria es una condición que sólo
afecta a las series de los eritrocitos sin que muestre leu-
cocitosis o trombocitosis. Esto sucede principalmente en
enfermedades cardiovasculares crónicas o pulmonares,
causando disminución en la saturación del oxígeno que, a
su vez, produce policitemia compensatoria. La morfología
de la hiperplasia eritroide predomina sin un aumento para-
lelo en otros linajes.
Anemia por pérdida sanguínea o deficiencia de hierro
La pérdida crónica de sangre produce anemia por deficien-
cia de hierro. Los eritrocitos periféricos muestran hipo-
cromía y microcitosis con células elongadas en forma de
lápiz. La eritropoyesis en la médula es hiperplásica. Los
eritroblastos son a menudo pequeños, la acumulación de
hemoglobina es deficiente, el contorno es irregular y des-
igual (micronormoblastos).
La tinción con azul de Prusia no muestra ningún depó-
sito de hierro. Una condición llamada anemia de la enfer-
medad crónica (que ocurre por la inflamación o surge de la
infección crónica) puede dar un cuadro sanguíneo similar.
En estas condiciones la médula exhibe un aumento en el
depósito de hierro. Sin embargo, los depósitos de hierro
intraeritrocítico son reducidos.
Eritroleucemia
Ésta es una forma de leucemia mieloide aguda en la cual
el linaje eritroide afectado es predominante. Los precur-
sores eritroides son en general marcadamente anormales
con lobulación nuclear extraña. La eritropoyesis puede ser
también megaloblástica o sideroblástica. Una prominente
anormalidad del eritrocito aparece en la sangre periférica,
incluyendo muchos eritrocitos circulantes nucleados.
258 CAP. 26 MORFOLOGÍA DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS Y DE LA MÉDULA ÓSEA

Anemia leucoeritroblástica (incluyendo mielofibrosis

idiopática)

Esta condición se caracteriza por la presencia de los poiqui-

locitos “con forma de lágrima”, de eritrocitos nucleados y
de granulocitos tempranos en sangre periférica. Este cuadro
puede presentarse cuando la médula está infiltrada por un
tumor metastásico o con tejido extraño, o cuando la médula
está fibrosada. La fibrosis prominente de la médula puede
ser la manifestación primaria de un estado mieloprolifera-
tivo. Ésta se designa como mielofibrosis idiopática prima-
ria. La médula muestra un aumento en la reticulina y en la
fibrosis extensiva. El aspirado de la médula ósea es difícil
o no sirve de ayuda en esta condición. Una biopsia ósea
siempre es segura y diagnóstica. Figura 26-17 Cuenta plaquetaria elevada en trombocitemia es-
encial con algunas formas grandes

Mielopoyesis y megacariopoyesis normales

Las células que pueden identificarse más tempranamente

en las series granulocíticas es el mieloblasto, que da lugar
a una secuencia de promielocitos, mielocitos, metamielo-
citos, células en banda y neutrófilos maduros (diagrama B).
Del promielocito hacia adelante, los gránulos específicos
(neutrófilos, eosinófilos, basófilos) surgen cada vez más en
el citoplasma y se distinguen de los granulocitos neutró-
filos comunes de los precursores eosinófilos y basófilos
menos comunes. Los monocitos y sus precursores, mono-
blastos y promonocitos sólo están presentes en cantidades
pequeñas en la médula normal. En estados anormales, no-
tables en la leucemia, pueden llegar a ser muy evidentes.
Los megacariocitos se reconocen con facilidad en la
médula por su gran tamaño y por el núcleo lobular. Con
la maduración el citoplasma se fragmenta y aparecen las Figura 26-18 Médula ósea megaloblástica
plaquetas. Los megacariocitos son más pequeños y pueden
tener una apariencia muy similar a los mieloblastos.

Desórdenes comunes que predominan

en la mielopoyesis y en la megacariopoyesis

Leucemia mieloide aguda

En la leucemia mieloide aguda la médula ósea se infiltra

con los mieloblastos primitivos que ascienden a más de
30% del total de las líneas celulares mieloides. Los mie-
loblastos también están presentes con frecuencia en la
sangre periférica. Los mieloblastos son células primitivas
que muestran un patrón de cromatina nuclear abierta y un
nucleolo.
La granulación citoplásmica y los bastoncitos de Auer
pueden o no estar presentes (figs. 26-19 y 26-20). La mor-
fología de la leucemia mieloide aguda está subdividida en Figura 26-19 Leucemia mieloide aguda
 EXAMEN Y MORFOLOGÍA DE LA MÉDULA ÓSEA 259

riférica se encuentren blastos circulantes. El análisis de la

médula ósea es obligatorio y diagnóstico.

Leucemia mieloide crónica

Éste es un desorden de la célula embrionaria que se caracte-

Figura 26-20 Leucemia promielocítica aguda
varios subtipos por el grupo FAB, dependiendo del grado de
diferenciación y de la naturaleza de las células predominan-
tes en la médula. A veces los mieloblastos y los monoblastos
primitivos son difíciles de diferenciarse con facilidad de los
linfoblastos con las tinciones de Romanowsky. Las tinciones
citoquímicas especiales se utilizan, a veces, en esta situación
(cuadros 26-4 y 26-5). Recientemente, la citoquímica ya se
reemplaza por la inmunofenotipificación (véase el cap. 32).
La leucemia mieloide aguda es una enfermedad malig-
na. Los cambios cromosómicos se observan con facilidad
en el 50% de los casos. Clínicamente, es frecuente que el
paciente se presente con anemia, un conteo plaquetario
bajo, sangrado e infección. Es normal que en la sangre pe-
riza por mantener una cuenta leucocítica alta y la presencia
de precursores del granulocito, donde son muy notorios los
mielocitos y metamielocitos, junto con numerosos neutró-
filos circulantes. La médula muestra hipercelularidad con
hiperplasia granulocítica, y eosinofilia o basofilia frecuente
(fig. 26-21). La hiperplasia megacariocítica con una cuen-
ta plaquetaria elevada también es común. La alteración
cromosómica distintiva es la presencia del cromosoma Ph
(Filadelfia). Ésta es una translocación recíproca entre seg-
mentos del brazo largo del cromosoma 22 y del brazo largo
del cromosoma 9, t(9:22) (q34:q11). Lo anterior genera
la transferencia del oncogén abl de 9q a un sitio en 22q,
conocido como la región del punto de ruptura (BCR). La
transformación a leucemia aguda (AML, o se indica como
ALL) ocurre después de un periodo variable (también se
le llama crisis blástica), siendo el intervalo medio de tres
a cuatro años.
Cambios reactivos en granulocitos y monocitos
En estados infectivos e inflamatorios la cuenta de WBC se
incrementa cerca de 11 ⫻ 109/L.

Cuadro 26-4 Clasificación Francesa, Americana, Británica (FAB) de las leucemias mielocíticas agudas

Categoría Criterio morfológico (médula ósea)

M1 Mieloblástica sin maduración ⱖ90% de células de la línea mieloide son blastos
M2 Mieloblástica con maduración 30 a 89% de las células de la línea mieloide son blastos, >10% son promie-
locitos para PMN (con frecuencia displásica), <20% son monocitos
M3 Promielocítica Promielocitos hipergranulares con gránulos semejantes a polvo, frecuentes
barras de Auer; el núcleo, bilobulado; la variante microgranular puede ocurrir
M4 Mielomonocítica 30 a 80% de células de la línea mieloide son mieloblastos más neutrófilos
madurando; >20% de células de la línea mieloide son de linaje monocítico.
Además, >5 000/␮L células monocíticas en sangre periférica
M4 Con eosinofilia Como el anterior, con ⱖ5% de eosinófilos anormales que pueden tener núcleos
no segmentados y gránulos eosinofílicos y basofílicos grandes
M5 Monoblástica, monocítica >80% de células de la línea mieloide son monoblastos, promonocitos o
monocitos; en M5a, 80% de células de la línea mieloide son monoblastos;
en M5b, <80% son monoblastos, y el resto son promonocitos y monocitos
M6 Eritroleucemia ⱖ50% de las células de la médula ósea son precursores eritroides; ⱖ30% de
las células de la línea mieloide no eritroides son blastos
M7 Megacariocítica Los blastos en médula o sangre se identifican como linaje megacariocítico;
siempre que la médula sea inaspirable, la biopsia muestra números grandes
de blastos, con frecuencia con incrementos de megacariocitos y reticulina
PMN: Leucocitos polimorfonucleares.
260 CAP. 26 MORFOLOGÍA DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS Y DE LA MÉDULA ÓSEA

Cuadro 26-5 Tinciones especiales y ensayos usados en la clasificación de las leucemias agudas

Tinción
Peroxidasa o Esterasas
Leucemia negro de Sudán B Específicaa No específicab PASc
AML-M1 + + _ _
AML-M2 + a +++ + _ _
AML-M3 +++ +++ _ _
AML-M4 ++ a +++ + a +++ + a +++ _
AML-M5 + _ +++ _
AML-M6 _ _ _ +++
AML-M7 _ 0 a ++ 0 a ++ (moteado)d ++ (moteado)
ALL _ _ _ +++
Neutrófilos normales +++ +++ _ +++
Monocitos normales + _ +++ +++
Linfocitos normales _ _ _ ±
a␣-naftol AS-D cloroacetato.
b␣-naftil
acetato esterasa y ␣-naftil butirato esterasa.
cÁcido peryódico de Schiff.
dMegacarioblastos negativos para ␣-naftil butirato esterasa.

particular los que implican displasia de los tres linajes

celulares, muestran de manera progresiva un incremento
en la proporción de blastos en la médula, y finalmente
su transformación en leucemia mieloide aguda. Una sub-
categoría especial, que se conoce como leucemia mielo-
monocítica crónica (CMML), muestra características de
displasia y de una condición mieloproliferativa. Ésta se
caracteriza por la presencia de monocitosis en sangre pe-
riférica > 1 ⫻ 109/L. Los monocitos son a menudo anor-
males en la morfología. Las características displásicas
relacionadas están también presentes en los eritrocitos y
en otros leucocitos.

Figura 26-21 Leucemia mieloide crónica.

Los neutrófilos muestran un cambio a la izquierda con
granulación tóxica. Algunos mielocitos circulantes y mie-
loblastos ocasionales también pueden observarse. La mé-
dula muestra una hiperplasia mieloide con predominancia
de promielocitos y mielocitos.
El cuadro global suele, en casos graves, asemejarse a
un proceso leucémico, que a veces se denomina “reacción
leucemoide”. Los antecedentes clínicos del paciente, in-
munofenotipificación, estudios cromosómicos y estudios
de clonalidad son necesarios para separar esta condición de
la leucemia.
Estados mielodisplásicos
Este grupo heterogéneo de desórdenes se menciona antes
(véase pág. 257). Los estados mielodisplásicos graves, en
Megacariocitos y desórdenes plaquetarios
Trombocitopenia
Una cuenta plaquetaria baja < 150 ⫻ 109/L puede ocu-
rrir por un consumo periférico intenso (inmunitario o no
inmunitario) o por una producción medular reducida de
plaquetas, es decir, aplasia medular o infiltración. En la
púrpura trombocitopénica idiopática (IT), los anticuerpos
antiplaquetarios causan una destrucción reticuloendotelial
incrementada de plaquetas. En ITP u otros estados físicos,
la médula ósea muestra un número normal a un incremento
de megacariocitos. Los desórdenes en la producción pla-
quetaria se diagnostican mejor con la prueba ósea. Aquí
los megacariocitos pueden estar ausentes, reducidos, o
mostrar morfología displásica. El aspirado de médula ósea
también muestra la presencia de una infiltración anormal.
 EXAMEN Y MORFOLOGÍA DE LA MÉDULA ÓSEA 261

Trombocitosis Desórdenes comunes que afectan el linaje

Una cuenta plaquetaria persistente elevada sobre 1 000 ⫻
109/L ocurre en la trombocitemia esencial (ET), una enfer-
medad mieloproliferativa que implica un predominio del
linaje megacariocítico. La presencia de plaquetas grandes
o incluso de fragmentos megacariocíticos es también una
característica de este desorden. La aspiración de la médula
ósea puede ser difícil, pues suele coagularse con facilidad
antes de separarse. La biopsia de la médula ósea mues-
tra hipercelularidad con un aumento visible en la cuenta
de megacariocitos, con frecuencia atípicos en la morfolo-
gía medular ósea.
También es común un aumento relacionado con la reti-
culina o la fibrosis medular.
La trombocitosis reactiva (por infección o inflamación)
suele producir, a veces, un cuadro similar y, ocasionalmen-
te, dificultad para diferenciarla de la trombocitemia esen-
cial sólo por la morfología (véase fig. 26-17).
Linfocitos, células plasmáticas y sus desórdenes
de los linfocitos y de las células plasmáticas
Leucemia linfoblástica aguda (ALL)
Es una enfermedad neoplásica monoclonal que surge de
los precursores linfoblásticos de los linfocitos. Explica cer-
ca de 85% de todas las leucemias agudas por abajo de los
16 años. Los linfoblastos anormales permanecen con fre-
cuencia presentes en la sangre periférica relacionada con
anemia y con una cuenta plaquetaria baja.
La médula ósea muestra infiltración anormal con linfo-
blastos que tienen un cociente citoplásmico nuclear más
alto que un mieloblasto típico. El grupo FAB clasifica la
leucemia linfoblástica aguda en tres subtipos morfológicos
(cuadro 26-6). Una distinción morfológica pura entre un
linfoblasto y un mieloblasto indiferenciado puede ser difí-
cil en algunos casos. La citometría de flujo y las tinciones
especiales son muy útiles en esta situación (véanse cuadro
26-5 y fig. 26-22).

La variación morfológica en linfocitos y en células plas-

máticas cubre una gama mucho más amplia que entre los
granulocitos. En las infecciones, en particular infecciones
virales, los linfocitos muestran características de activación
o inmunoblásticas, con basofilia citoplásmica y el aspecto
de nucleolos.
Los niños tienen con frecuencia linfocitosis relativa,
que disminuye con la edad. Las células plasmáticas tienen
un típico citoplasma basofílico más abundante, con un nú-
cleo excéntrico que muestra una cromatina agrupada (con
aspecto de “cara de reloj”).
La inclusión citoplásmica de inmunoglobulinas puede
verse en algunas ocasiones. Figura 26-22 Leucemia linfocítica aguda.

Cuadro 26-6 Clasificación FAB de la leucemia linfocítica aguda

Citología L1 L2 L3
Tamaño de la célula Pequeño Grande Grande, homogéneo
Cromatina nuclear Homogénea Inconstante Finamente revestida
Forma nuclear Regular Irregular De oval a redonda
Nucleolos Raros Presentes 1a3
Citoplasma Escaso Moderado Moderado, vacuolado
Basofilia citoplásmica Moderada Inconstante Intensa
Incidencia en niños 85% 13% 2%
Incidencia en adultos 35% 63% 2%
Marcadores inmunológicos B temprano o T tímico B temprano o T tímico B diferenciado (SIg positivo),
leucemia/linfoma tipo Burkitt
262 CAP. 26 MORFOLOGÍA DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS Y DE LA MÉDULA ÓSEA

Leucemia linfocítica crónica (CLL)

La enfermedad es rara antes que el individuo llegue a una

edad media; su incidencia aumenta con la edad. Es típico
que se presente con linfocitosis periférica, linfadenopatía
y hepatoesplenomegalia. La sangre periférica y la médu-
la ósea muestran muchos linfocitos pequeños que parecen
maduros y monomórficos. Es una característica que célu-
las en forma de mancha se encuentren presentes en este
desorden. Las células de la CLL tienen también un perfil
inmunofenotípico distintivo (fig. 26-23).

Figura 26-24 Células de carcinoma metastásico.

Figura 26-23 Leucemia linfocítica crónica.

Mieloma

Es una enfermedad que se caracteriza por el crecimiento

clonal y neoplásico de las células plasmáticas. Los pacien-
tes se presentan con paraproteína, hipercalcemia, lesiones Figura 26-25 Parásitos del paludismo en sangre.
óseas líticas, anemia e insuficiencia renal. La médula ósea,
que es diagnóstica, muestra la presencia de células plasmá-
ticas anormales en una proporción grande (>30%) (véase
fig. 26-8).

Linfomas

Los linfomas son un grupo complejo, heterogéneo, de en-

fermedades neoplásicas clonales que surgen de los ganglios
linfáticos, pero que involucran a la sangre periférica o a la
médula ósea. El linfoma es una enfermedad con muchos
subtipos. Las células neoplásicas pueden ser pequeñas y
parecer similares a linfocitos pequeños (linfoma de grado
bajo). Por otra parte, algunas células del linfoma tienen
morfología similar a la de un blasto, grande, muy inmaduro
(linfoma de grado alto). La enfermedad de Hodgkin (HD),
la que se clasifica como un tipo de linfoma, se caracteriza
por la presencia de las células de Reed-Sternberg. Figura 26-26 Microfilaria en sangre.
 LECTURAS ADICIONALES
Figura 26-27 Sideroblastos.
Células no hematopoyéticas y parásitos
en sangre y médula ósea
Un aspirado y una biopsia de la médula ósea es una prue-
ba útil para detectar células metastásicas de carcinoma, en
263
especial en presencia de un cuadro sanguíneo leucoeritro-
blástico (fig. 26-24). Los parásitos del paludismo se de-
tectan mejor en un frotis de sangre periférica. El parásito
microfilaria también puede encontrarse en ella, aunque es
poco frecuente (figs. 26-25 y 26-26). La especialización y
la confianza en la morfología celular se adquieren con la
práctica. Para una revisión más exhaustiva en este tema,
véase Hayhoe y Flemans, 1992.
Lecturas adicionales
Bennet JM, Catovsky D, Daniel MT et al. Proposal for classi-
fication of myelodysplastic syndrome. Br J Haematol 1982;
51: 189.
Bennet JM, Cartovsky D, Daniel MT et al. Proposal for classifica-
tion of acute leukaemia. Br J Haematol 1976; 33: 451.
Hayhoe FGJ, Flemans RJ. A Colour Atlas of Haematological
Cytology, 3rd edn. 1992: Wolfe, London.
Holtbrand AV. Pettit JE. Clinical Haematology, 2nd edn. 1994:
Sandoz Atlas, London.
 27
Principios de los contadores automatizados
de células sanguíneas
Graham Martin

Introducción 3. Cuantificación de los reticulocitos y de los RBC nucleados.

El conteo sanguíneo completo (FBC) hace grandes progre-
sos a partir de una simple medición de hemoglobina y de
componentes celulares en la sangre periférica. El desarro-
llo y la adaptación de diversas tecnologías ha generado una
gran variedad de parámetros celulares, algunos muy útiles;
otros todavía tienen que demostrar su valor. En paralelo a
la tecnología de medición, se han desarrollado instrumen-
tos automáticos que pueden analizar cantidades muy pe-
queñas de sangre usando el muestreo del tubo cerrado y
tener rendimientos muy altos.
Numerosas mediciones que se obtienen por instrumentos
automáticos y semiautomáticos son principalmente modi-
ficaciones de las técnicas manuales originales; sin embar-
go, existen varias aplicaciones interesantes de las nuevas
tecnologías. Estos instrumentos son precisos y exactos, y
las mediciones son reproducibles. Hay diferentes fabrican-
tes de instrumentos que emplean tecnologías y sistemas de
medición similares que evalúan el mismo parámetro con li-
geras variantes. Existen ventajas y desventajas en todos los
sistemas y podría argumentarse que un grupo de problemas
puede intercambiarse por otro.
En este capítulo se propone revisar las diferentes tecno-
logías y sus principios de operación. Los principales pará-
metros son:
1. Cuantificación de la hemoglobina (Hb).
2. Cuantificación de los eritrocitos (RBC).
4. Cuantificación de los leucocitos (WBC).
5. Cuantificación plaquetaria.
Medición de la Hb
La medición de la Hb (fig. 27-1) se basa en la relación li-
neal entre la cantidad de luz que se absorbe en una banda
de absorción particular y la concentración de la entidad de
absorción en la muestra (ley de Beer) (Skoog DA, West
DM, 1965).
La mayor parte de los contadores automáticos emplea el
método de cianometahemoglobina que lee la absorbancia a
longitudes de onda de 525 o 540 nm. Los sistemas Sysmex
utilizan lauril sulfato de sodio, con la ventaja de que se
elimina el cianuro en los desechos del analizador.
Mediciones de los eritrocitos
Los eritrocitos pueden contarse con la impedancia de la
abertura, técnicas que dispersan la luz, usando láser LED o
tungsteno o una combinación de las dos tecnologías.
Impedancia de la abertura
Esta técnica la patentó, en 1956, Wallace Coulter y se co-
noce como el principio de Coulter (fig. 27-2). Se utiliza

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
266 CAP. 27 PRINCIPIOS DE LOS CONTADORES AUTOMATIZADOS DE CÉLULAS SANGUÍNEAS
Amplificador
Derivación de la Hb
C Bath Absorbancia = log10 (VR/Vs),
Fuente de luz
donde VR = el voltaje de referencia
y Vs = el voltaje de la muestra
(láser, LED o tungsteno)
Muestra Detector
Figura 27-1 Cuantificación de Hb.
para contar RBC, WBC y plaquetas. Un flujo de corriente
eléctrica se establece a través de una abertura de dimensiones
conocidas. Cuando una célula o una partícula pasa a través
de la abertura, la célula o la partícula impide el flujo de la
corriente y causa un impulso en el voltaje. El voltaje primero
se eleva y después cae por debajo de cierto umbral, indicando
que una célula o una partícula pasa por la zona de detección.
Las células y las partículas se cuentan registrando el número
de pulsos de voltaje que ocurren durante un intervalo de me-
dición específico. El volumen celular se determina midiendo
la magnitud del pulso que se genera. Se fijan los umbrales o
entradas electrónicas, permitiendo al analizador discriminar
los pulsos de Cuantificaciones de los eritrocitos de los pulsos
más pequeños de las plaquetas, detritus y del ruido eléctrico.
Coincidencia
La inexactitud puede introducirse por coincidencia. Si dos
o más células entran en la abertura de la zona de detección,
Figura 27-2 Principio de Coulter.
el cambio en la resistencia crea un solo pulso alto o un pul-
so de doble pico. Las correcciones estadísticas se aplican
en el software del analizador para corregir esto. Para evi-
tar la recirculación de células alrededor de la abertura, que
produzcan mediciones falsas de cantidades y de volumen,
las células se inyectan de manera convencional en el com-
partimiento de la abertura justo en el centro de una corrien-
te de un fluido envolvente o, una vez contadas, se remueven
de la zona de detección con un líquido de arrastre.
Técnicas de dispersión de luz
Con la dispersión de luz se estima el tamaño aproximado
de la célula con base en la dispersión frontal, la cual es
sobre todo una medida más del diámetro transversal. La
cantidad de luz que se dispersa es proporcional al área su-
perficial y, por tanto, al volumen de la célula. Los láser
tienen características ópticas superiores, al compararse con
las fuentes luminosas de tungsteno, y pueden colocarse de-
tectores para recolectar la luz frontal dispersada en ángulo
amplio y estrecho (fig. 27-3).
La luz láser se utiliza para medir el volumen y la con-
centración celular de la Hb en los instrumentos Bayer. La
cantidad de luz dispersada en ángulo bajo (2 a 3°) depende
del tamaño del RBC, y la cantidad dispersada en ángu-
lo alto (5 a 15°) se relaciona con el índice de refracción
de la célula. De la manera como se proyecten hacia el
láser, las células no esféricas como plaquetas y las cuan-
tificaciones de los eritrocitos pueden dar señales muy
diferentes hacia los detectores. Bayer ha superado este
problema con una técnica que se conoce como generación
de esfera isovolumétrica. El dodecil sulfato de sodio y el
 MEDICIÓN DE LOS RETICULOCITOS Y RBC NUCLEADOS 267

Figura 27-3 Sistema óptico de dispersión de luz láser usado por los instrumentos Sysmex.

glutaraldehído en el reactivo para el eritrocito producen Cuadro 27-1 Técnicas de conteo de reticulocitos
fijación parcial y la formación esférica a partir de los eri-
trocitos y de las plaquetas, eliminando resultados erró- Tinción del
neos. ¿Permite esto medir con exactitud el porcentaje de Compañía Analizador Método RNA
las células hipocrómicas?; no sólo eso, ha demostrado ser
Abbott Cell-Dyn 4000 + Fluorescencia CD4K530
un parámetro útil para perfeccionar la terapia con eritropo- Sapphire
yetina y hierro (Richardson, et al., 2001). ABX ABX Pentra 120 Fluorescencia Naranja
de tiazol
Bayer ADVIA 120 + Dispersión y Oxacina 750
Medición de los reticulocitos y RBC 2120 absorción en células
nucleados de luz esféricas
Beckman GEN-S + Dispersión Nuevo azul
Conteo de los reticulocitos Coulter LH750 de luz de metileno
en células
esféricas
Todos los fabricantes de contadores celulares proporcio- Sysmex XE 2100 Fluorescencia Auramina O
nan el análisis del reticulocito en sus instrumentos. Al-
gunos sistemas miden reticulocitos y los parámetros re-
lacionados usando los colorantes fluorescentes para ácido Resumen de los métodos actuales
ribonucleico con luz láser (referencias de ALM en Hp90 utilizados en los analizadores
Takubo et al., 1989; Tichelli et al., 1990; Davis et al.,
1996; Kim et al., 2003). Otros sistemas utilizan colorantes También es posible medir la madurez del reticulocito, debido
básicos supravitales que producen precipitación y colo- al hecho de que los reticulocitos inmaduros tienen una pro-
ración de la sustancia reticular, la cual se mide, en este porción más grande de RNA, y por tanto, se tiñen con más
caso, por absorbancia y dispersión de la luz (referencias intensidad o reflejan una fluorescencia mayor. La dispersión
de ALM en Hp90 Buttarello et al., 1995, 1996, 1997; Van de la luz monocromática mide el volumen graficado contra
den Bossche J et al., 2001; Rudenski, 1997; Wysocka J, la absorción y se usa en el Advia para proporcionar un índice
Turowski D, 2000). de la maduración del reticulocito y su contenido de Hb.
268 CAP. 27 PRINCIPIOS DE LOS CONTADORES AUTOMATIZADOS DE CÉLULAS SANGUÍNEAS

Eritrocitos nucleados
Los fabricantes del instrumento adoptan aproximaciones
que difieren para distinguir a los RBC nucleados. Los nú-
cleos se cuentan usando combinaciones de dispersión de la
luz e impedancia después de que el citoplasma del RBC ha
sido eliminado (Beckman Coulter). El conteo se hace en el
canal de WBC y el WBC total se corrige por la presencia
de NuRBC. En los analizadores Sysmex, las cuentas de
NuRBC se determinan por medio de citometría de flujo y
luz láser. La muestra se aspira y se mezcla con una tinción
para RNA/DNA. En el conteo NucRBC usa fluorescencia
lateral, dando información del RNA/DNA y de la disper-
sión frontal, una medida del tamaño celular.
En los analizadores la cuenta de NucRBC se expresa
con NucRBC/100 WBC, a partir de la fórmula:
NucRBC ⫻ 100
%NucRBC=
NucRBC ⫹ WBC

Cuadro 27-2 Tecnologías de los analizadores comunes

Compañía Analizador Tecnología

Abbott Cell-Dyn 3500 Dispersión frontal de la luz
Dispersión de la luz en ángulo estrecho
Dispersión ortogonal de la luz
Dispersión de luz polarizada
Cell-Dyn 4000 + Todo lo anterior, más cuenta de RBC posterior a la unión con el colorante
Sapphire fluorescente
ABX Pentra 60 Citoquímica
Impedancia por flujo enfocado
Absorbancia de luz
Citometría de flujo
Pentra 120 Retic Citoquímica
Impedancia-citometría de flujo enfocada y absorbancia
Absorción de luz posterior a la tinción de los eosinófilos
Impedancia posterior al desprendimiento preferencial del citoplasma
de los basófilos a un pH bajo
Láser ion-argón
Bayer Advia 60 Citoquímica
Impedancia por flujo enfocado
Absorbancia de luz
Citometría de flujo
ADVIA 120, 2120, Dispersión de la luz posterior a la reacción de la peroxidasa
H1, H2 y H3 Absorbancia de luz posterior a la reacción de la peroxidasa
Dispersión de la luz posterior al desprendimiento del citoplasma
de las células, excepto basófilos, por un agente lítico a un pH bajo
Beckman Coulter AcT 5diff Medición de la impedancia posterior a la lisis diferencial
Mediciones de impedancia y absorbancia citoquímica
GEN-S + LH750 Impedancia con corriente electromagnética de baja frecuencia
Conductibilidad con corriente electromagnética de baja frecuencia
Dispersión de luz láser
Sysmex SE 9000 Impedancia con corriente electromagnética de baja frecuencia
Impedancia con corriente electromagnética de radiofrecuencia
Impedancia con corriente electromagnética de baja frecuencia a pH bajo
y pH alto
XE 2100 Impedancia con corriente electromagnética de baja frecuencia
Impedancia con corriente electromagnética de radiofrecuencia
Dispersión frontal de la luz
Dispersión lateral de la luz
Intensidad de la reacción de fluorescencia posterior a la tinción fluorescente
 MEDICIONES DE LOS LEUCOCITOS 269

Mediciones de los leucocitos

Los leucocitos pueden contarse y diferenciarse dentro de

un amplio número de categorías por diversas tecnologías.
Existen ventajas y desventajas en todas. El desarrollo de
sistemas de conteo basado en un líquido vehículo, que per-
mite el pasaje de las células a través de la zona de detec-
ción, condujo al análisis multiparámetro en la misma célula
combinando las señales de varios sensores. Según el fa-
bricante, la zona de detección puede ser: óptica, de conduc-
tancia, de impedancia o una combinación de todas; y los
sensores colocarse para observar la dispersión frontal de la
luz, la dispersión lateral, la dispersión en ángulo estrecho
o amplio, la dispersión de la luz polarizada o la fluorescen-
cia. Las tecnologías de cada una de las aplicaciones de los
instrumentos actuales se resumen en el cuadro 27-2.

Impedancia de la abertura
Figura 27-5 Análisis VCS tridimensional grupal. Reproducida
Al principio cuando el citoplasma es parcialmente eliminado
con el permiso de la compañía Beckman Coulter.
en los leucocitos, la impedancia de la abertura (fig. 27-4),
como se describió antes, dará una medición del tamaño
como demarcadores entre poblaciones celulares. El desa-
rrollo de sistemas de “asistencia diagnóstica” se considera
NUM. Linfos Monos Granulocitos
como otra mejora en la capacidad del laboratorio para in-
REL. 50-90 fl 90-160 fl 160-450 fl
terpretar hallazgos diferenciales electrónicos.
Ambos sistemas diferenciales de tres y cinco partes están
provistos con algoritmos indicadores, alertando al usuario
de posibles alteraciones morfológicas o de otro tipo, requi-
WBC 50 100 200 300 400 fl riendo la revisión de los datos o de alguna otra forma de
intervención, como una revisión de la morfología.
Figura 27-4 Una presentación del histograma del canal 256 de
la población celular de WBC entre 35 y 450 fl, usando sólo datos
de impedancia de la abertura. Reproducida con el permiso de la
Citometría de flujo y dispersión de luz
compañía Beckman Coulter

Los conteos de WBC y los diferenciales en los instrumen-

del núcleo y de la granularidad citoplásmica. Usando este
método sólo es posible cuantificar linfocitos, monocitos y
granulocitos.
Impedancia de la abertura y dispersión de luz
Los instrumentos Beckman Coulter realizan la diferencia-
ción de cinco poblaciones con tres mediciones simultáneas
sobre cada célula: volumen (v), usando impedancia de la
abertura estándar; conductividad (c), empleando ondas
electromagnéticas de alta frecuencia; determinación de la
complejidad celular y dispersión de luz (s), midiendo las ca-
racterísticas de la superficie celular y la lobularidad de cada
célula (análisis VCS tridimensional grupal, fig. 27-5).
Los algoritmos adaptables de análisis grupal despla-
zan en gran parte el uso temprano de discriminadores fijos
tos Sysmex XE se determinan usando citometría de flujo
combinada con un láser semiconductor. Se obtiene infor-
mación celular usando la dispersión de luz frontal para
determinar el volumen celular; la dispersión de luz lateral
para evaluar la estructura interna de la célula, y la luz fluo-
rescente lateral para dar información sobre los ácidos nu-
cleicos RNA/DNA. Aspirando la muestra de sangre en seis
canales separados con diferentes reactivos, puede aplicarse
un análisis complejo del grupo para separar todas las va-
riantes normales y anormales de la célula. Los algoritmos
de aprendizaje competitivos permiten la adaptación óptima
a las diferencias biológicas entre las muestras, incluyendo
las células extremadamente alteradas.
El colorante polimetina se combina con los ácidos nuclei-
cos (DNA y RNA nucleares y en organelos citoplásmicos).
El Sysmex XE tiene la capacidad de contar reticulocitos,
270 CAP. 27 PRINCIPIOS DE LOS CONTADORES AUTOMATIZADOS DE CÉLULAS SANGUÍNEAS
Figura 27-6 La dispersión frontal se grafica contra la dispersión lateral. Reproducida con el permiso de Sysmex UK Ltd.
de reconocer las plaquetas que contienen RNA, de reco-
nocer y de contar los RBC nucleados y de distinguir célu-
las con características de células progenitoras hematopo-
yéticas (HPC), que pueden utilizarse para predecir un au-
mento de células CD34⫹.
Citoquímica y dispersión de luz
Las series de instrumentos de la compañía Bayer derivan un
diferencial a partir de dos canales. El canal de la peroxidasa
utiliza una reacción citoquímica en la cual la peroxidasa de
neutrófilos, eosinófilos y monocitos actúa sobre un sustrato,
4-cloro-l-naftol, para generar una reacción que se transfor-
ma en un producto de color negro.
La dispersión de luz, que es proporcional al tamaño de
la célula, se grafica contra la absorbancia de la luz, que es
proporcional a la intensidad de la reacción de la peroxi-
dasa. Los neutrófilos, los eosinófilos, los monocitos y los
linfocitos caen en cuatro grupos, separados por umbrales
electrónicos. Debido a que los basófilos caen en la región
del linfocito, se separan de otras células en un canal aparte
con base en su resistencia a la eliminación ácida del cito-
plasma celular. Los basófilos que son más grandes que
otras células se clasifican por dispersión frontal. Este ca-
nal también se emplea para detectar blastos. La dispersión
frontal se grafica contra la dispersión de luz de ángulo alto
para medir la densidad y la lobulación nuclear (fig. 27-6).
Conteo plaquetario
Desde que se identificaron a mediados del siglo xix como
“el polvo sanguíneo”, las plaquetas han presentado un desa-
fío en términos de exactitud de las técnicas de conteo. Las
terapias modernas requieren exactitud, no sólo en el rango
clínico crítico, sino también en la capacidad para diferen-
ciar eritrocitos pequeños y plaquetas grandes. Las plaquetas
pueden contarse y clasificarse por tamaño con impedancia,
la dispersión de la luz, una combinación de las dos y la cito-
metría de flujo que usa la fluorescencia (fig. 27-7).
Impedancia
Los instrumentos de la compañía Beckman Coulter utilizan
impedancia para obtener una cuenta plaquetaria, que se de-
riva del número de células bajo la curva (fig. 27-8). Usan-
do software apropiado para la curva, la exactitud de esta
cuenta se mejora cuando las plaquetas presentes superan
el volumen de los 20 femtolitros (fl). La cuenta plaquetaria
fuera del límite de 35 ft se amplía hasta 70 fl.
Conteo plaquetario óptico
La gama de instrumentos Advia de la compañía Bayer
combina las señales de dispersión en ángulo alto (5 a 15°)
y en ángulo bajo (2 a 3°) para cada célula. Éstas se transfor-
man en volumen que se grafica sobre un eje vertical y los
valores del índice de refracción sobre el eje horizontal para
dar un citograma de la dispersión plaquetaria (fig. 27-9).
Las líneas curvas representan una cuadrícula del índice de
refracción variante a lo largo de la cual las plaquetas caen.
También se grafica el índice de refracción contra el rango
del volumen plaquetario, pueden separarse las macropla-
quetas y los eritrocitos.
 LECTURAS ADICIONALES 271

Figura 27-7 Fluorescencia graficada contra dispersión lateral. Reproducida con permiso de Sysmex UK Ltd.

Cuenta de
Combinación de impedancia y conteo óptico
partícula
La variedad de instrumentos Sysmex XE emplea un ca-
RBC
nal de impedancia cuando la cuenta y un canal de fluo-
PLT
rescencia fallan en situaciones anormales. Las mediciones
plaquetarias se realizan usando la dispersión frontal para
2 10 20 determinar el tamaño, la dispersión lateral que considera
Volumen celular (fl)
la estructura interna y la fluorescente que mide los ácidos
Figura 27-8 Gráfica de Coulter que muestra la distribución del nucleicos RNA/DNA teñidos.
tamaño celular de las plaquetas (PLT) y de los eritrocitos (RBC).

Cuentas inmunoplaquetarias

De esta manera por conteo óptico y por impedancia, el Cell-

Dyn 4000 y el Sapphire cuentan las plaquetas midiendo la
fluorescencia verde del CD61. Un anticuerpo monoclonal,
presente en uno de los reactivos, se une al antígeno CD61
localizado en todas las plaquetas normales. El isotiocianato
de fluoresceína (FITC) es el colorante que se emplea, que
fluorece cuando se excita a una longitud de onda de 488
nm. Esta técnica es útil cuando se observan una gran canti-
dad de fragmentos de RBC o de WBC.

Figura 27-9 Citograma de la dispersión plaquetaria. 1, pla-
quetas; 2, plaquetas grandes; 3, RBC; 4, fragmentos RBC; 5.
detritus; 6, fantasmas de eritrocitos. Reproducida con permiso
de Bayer plc.
Lecturas adicionales
Buttarello M, Bulian P, Pra MD, Barbera P, Rizzotti P. Reticu-
locyte quantification by Coulter MAXM VCS (volume, con-
ductivity, ligth scatter) technology. Clin Chem. 1996; 42 (12):
1930-1937.
272 CAP. 27 PRINCIPIOS DE LOS CONTADORES AUTOMATIZADOS DE CÉLULAS SANGUÍNEAS
Buttarello M, Bulian P, Temporin V, Rizzotti P. Sysmex SE-9000
hematology analyzer: performance evaluation on leukocyte
differential counts using an NCCLS H20-A protocol. National
Committee for Clinical Laboratory Standars. Am J Clin Pa-
thol. 1997, 108 (6): 674-686.
Buttarello M, Bulian P, Venudo A, Rizzotti P. Laboratory eva-
luation of the Miles H.3 automated reticulocyte counter. A
comparative study with manual reference method and Sysmex
R-1000. Arch Pathol Lab Med 1995; 119 (12): 1141-1148.
Davis BH. Diagnostic utility of red cell flow cytometric analysis.
Clin Lab Med 2001; 21 (4): 829-840.
Kim YR, van’t Oever R, Landayan M, Bearden J. Automated
red blood cell differential analysis on a multi-angle ligth scat-
ter/fluorescence hematology analyser. Cytometry, 2003; 56B
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Richardson D, Bartlett C, Will EJ. Optimizing erythropoietin the-
rapy in hemodialysis patients. Am J Kidney Dis 2001; 38 (1):
109-117.
Skoog DA, West DM. Analytical Chemistry. 1965: Holt, Reinhart
and Winston. New York. pp. 451-455.
Takubo T, Kitano K, Ikemoto T, Kikuchi T, Shimizu A. Ring eosi-
nophils in patients with lowered eosinophill peroxidase activity,
Article in Japanese. Rinsho Byori 1993; 41 (4): 468-470.
Tichelli A, Gratwohl A, Driessen A, Mathys S, Pfefferkorn E,
Regenass A, Schumacher P, Stebler C, Wernli M, Nissen C, et
al. Evaluation of the Sysmex R-1000. An automated reticulo-
cyte analyzer. Am J Clin Pathol 1990; 93 (1): 70-78.
Van den Bossche J, Devreese K, Malfait R, Van de Vyvere M,
De Schouwer P. Comparison of the reticulocyte mode of the
Abx Pentra 120 Retic, Coulter General-S, Sysmex SE 9500,
Abbott CD 4000 and Bayer Advia 120 haematology analysers
in a simultaneous evaluation. Clin Lab Haematol 2001; 23 (6):
355-360.
Wysocka J, Turowski D. New reticulocyte indices and their utility
in hematologic diagnosis (Article in Polish). Pol Merkuriusz
Lek 2000; 8 (49): 498-502.
 28
Métodos para la identificación
de hemoglobinopatías
Nick Jackson y Anne Sermon
Introducción
Las hemoglobinopatías y las talasemias son los trastornos
genéticos heredados más comunes. Los defectos molecula-
res se localizan en los genes que codifican para la globina
y afectan la síntesis de hemoglobina (Hb) en el eritrocito
en desarrollo. Clínicamente se manifiestan como anemia
hemolítica y la herencia es del tipo autosómica recesiva o
codominante. Por lo general, las mutaciones que generan
una hemoglobinopatía son diversas; el estudio y la carac-
terización del gen humano de la hemoglobina pueden uti-
lizarse como ejemplo para mostrar la mayor parte de los
tipos conocidos de mutación genética. Los defectos clíni-
cos significativos se encuentran en los genes ␣ y ␤ (locali-
zados en los cromosomas 16 y 11, respectivamente), pero
las mutaciones que es posible identificar en cualesquiera
de los genes que codifican para la globina generan altera-
ciones cualitativas y cuantitativas en la síntesis de Hb. Las
hemoglobinopatías producen una variante de Hb estruc-
tural anormal; las talasemias surgen de una reducción en
la tasa de síntesis en uno o más de los tipos de cadenas de
globina.
Las mutaciones puntuales que conducen a las sustitu-
ciones de aminoácido o a la terminación anormal de la
transcripción del gen explican la mayor parte de los de-
fectos del gen que codifica para la globina y son típicas de
las hemoglobinopatías y de la ␤-talasemia. La supresión
del gen es la causa común de la ␣- y ␦␤-talasemia. En la
actualidad hay más de 1 000 variantes identificadas del gen
para la globina, que pueden dividirse ampliamente dentro
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
de los grupos siguientes: a) clínicamente silenciosas (la
mayor parte); b) hemoglobinas talasémicas; c) hemoglobi-
nas inestables; d) hemoglobinas con afinidad alterada para
el oxígeno; e) efectos atípicos diversos, por ejemplo, de la
hemoglobina falciforme (HbS).
La HbS es la variante clínica significativa más común
de la Hb, y en el estado homocigótico (HbSS) o en combi-
nación con la HbC o el rasgo ␤-talasemia produce proble-
mas graves de salud. La isquemia del tejido, secundaria a la
aglomeración de células falciformes aguda resulta en crisis
dolorosas y con un potencial fatal. La HbS es la más común
en las poblaciones oriundas del sub-Sahara, África, pero
también se encuentra en gente de India, de Arabia Saudita y
de la cuenca del Mediterráneo. Las talasemias se localizan
en poblaciones de todas las áreas tropicales del mundo y del
Mediterráneo. El tamizaje se dirige por lo general a aquellas
poblaciones étnicas en riesgo de portar estos genes, pero con
el aumento del mestizaje étnico el tamizaje puede llegar a
aplicarse en forma universal para no omitir algunos casos o
individuos portadores.
Técnicas de tamizaje
La metodología actual de tamizaje permite la detección rápi-
da y la identificación exacta de los trastornos clínicos signi-
ficativos de la hemoglobina, así como sus estados heteroci-
góticos. Estas técnicas también son confiables para aplicarse
en el tamizaje de recién nacidos en la detección de una en-
fermedad que no se sospecha, así como la condición del in-
dividuo portador. Es posible determinar el riesgo genético
274 CAP. 28 MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINOPATÍAS
a través de la identificación de los portadores y ofrecer el
diagnóstico prenatal del feto. Se establecen políticas en la
mayor parte de los laboratorios para el tamizaje de adultos
y recién nacidos. Las técnicas para el diagnóstico prenatal
de fetos se basan en el análisis de DNA y es una aplicación
común en centros nacionales de salud.
Para una interpretación integral de los resultados del
análisis de Hb en un individuo, la información siguiente
debe estar disponible: edad, sexo, origen étnico, condición
clínica actual (p. ej., si hay embarazo o no) y conteo san-
guíneo completo (FBC). Para aquellos con microcitosis del
eritrocito (MCV < 80 fl), una medida confiable del estado
de hierro se requiere (p. ej., de la ferritina sérica) para ex-
cluir deficiencia de hierro. Las muestras de los pacientes
señalados para el tamizaje deben entonces canalizarse a
través de un protocolo flexible de las investigaciones de
laboratorio, que puede incluir la cromatografía líquida
de alto rendimiento (HPLC) o la electroforesis, la solu-
bilidad falciforme y la medición de los niveles de HbA2
y de HbF. El diagnóstico de la mayor parte de los esta-
dos del portador común y de la enfermedad, es decir ␣- y
␤-talasemia, HbS, HbC, HbD y HbE, puede conseguirse
comúnmente con la evaluación de estos parámetros.
Los laboratorios que manejan una pequeña cantidad de
muestras pueden utilizar la electroforesis de Hb y la esti-
mación de HbA2 por microcolumna como sus herramientas
primarias del tamizaje. Sin embargo, con políticas cada vez
más amplias de tamizaje la mayor parte de los laboratorios
ahora tamizan muestras por HPLC. La electroforesis de Hb
y otras técnicas se utilizan para confirmar la identidad de
las hemoglobinas variantes que se detectan por HPLC. La
prueba de la solubilidad de la hemoglobina falciforme se
emplea principalmente para la exclusión de los desórdenes
de la célula falciforme antes de la cirugía de urgencia en las
poblaciones en riesgo.
Diagnóstico de laboratorio
de hemoglobinopatías y de talasemias
Conteo sanguíneo completo, frotis sanguíneo y ferritina
En la mayor parte de los estados de individuo portador con
hemoglobinopatía estructural el FBC no muestra alteración,
aunque el frotis sanguíneo muestre ciertas características
(p. ej., las células “en diana” en los rasgos de HbC y de
HbE). El punteado basofílico se halla en el rasgo ␤-talase-
mia y las células contraídas en forma irregular en el rasgo
␣-talasemia. Los índices de eritrocitos son indicadores im-
portantes en la evaluación para el rasgo de talasemia, que se
caracteriza por microcitosis y una Hb normal o casi normal.
Un volumen celular medio (MCV) < 80 fl o una Hb celu-
lar media (MCH) < 27 pg indican una posible talasemia,
en particular cuando el recuento de RBC es normal o ele-
vado (> 5 ⫻ 1012/L) y la ferritina sérica es normal (> 30
µg/L). Sin embargo, estos parámetros pueden mostrar una
variación leve de un laboratorio a otro, según el método de
medición automática y de los rangos normales que asigna
el laboratorio. En el FBC de los pacientes que son sintomá-
ticos (p. ej., la ␤-talasemia mayor, HbSS) se observan ca-
racterísticas de la anemia en grados variables y alteraciones
morfológicas más graves de los eritrocitos. La policitemia
suele encontrarse en los casos de hemoglobinas con afini-
dad elevada por el oxígeno.
Detección, identificación y cuantificación
de hemoglobinopatías
Los principios de la detección, identificación y cuantifica-
ción de hemoglobinas se basan en la separación física de
las hemoglobinas en solución, dependiendo de su carga.
Las sustituciones del aminoácido en la mayor parte de las
variantes introducen un cambio en la carga superficial total
esencial para su detección. Una limitación de estas técnicas,
por tanto, ocurre porque las variantes de la Hb no pueden
distinguirse de la HbA si tienen la misma carga superficial.
Para la interpretación correcta de todas estas pruebas, es
importante asegurarse de que la muestra no se obtenga en
los tres meses posteriores a una transfusión sanguínea.
Detección e identificación
Electroforesis
La metodología básica de tamizaje descansa en la migra-
ción de una molécula cargada (Hb) en un campo eléctrico
hacia un cátodo o un ánodo. La fuerza y la polaridad de la
carga se determinan por el pH del ambiente amortiguado.
La tasa de migración la gobierna el tamaño del poro del
medio de la matriz donde se realiza la electroforesis y la
magnitud de la carga sobre la molécula.
El acetato de celulosa es una matriz de uso general barato
y con una vida útil indefinida; el agar es una alternativa muy
empleada. El pH para el control preliminar es alcalino, fijo
a un pH 8.4 a 8.9 con amortiguadores Tris-borato EDTA o
Tris-barbitona. A este pH la mayor parte de las hemoglobi-
nas tienen carga negativa y migran del cátodo hacia el ánodo.
En estas condiciones, muchas variantes, aparte de la HbA,
hacen visible la detección, es decir, son más obvias tiñéndo-
las con un colorante específico para proteína, por ejemplo,
el Ponceau S o el negro de Amido. El patrón de migración,
marcado por controles de referencia, puede entonces com-
pararse con un mapa de variantes de hemoglobina para dar
con la identificación probable. Las técnicas de pH fijas son
 DETECCIÓN, IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINOPATÍAS
relativamente insensibles a la separación discreta de los
grupos de variantes con cargas similares. A un pH de 8.4,
dos grupos de las variantes comunes comigrantes: HbS,
HbD y HbG; y HbC, HbE y HbO Arab. Esto hace imposi-
ble la distinción entre las variantes de hemoglobina de cada
grupo sin investigación adicional. Un cambio diferencial
en la carga, en las hemoglobinas, se induce cambiando el
amortiguador a ácido (p. ej., a un pH de 6.3, en agar citra-
to), el cual altera la tasa y el patrón característico de migra-
ción. Las movilidades relativas de la variante Hb a un pH
ácido y alcalino se refieren en forma cruzada sobre mapas
de las hemoglobinas variantes y esto permite su identifica-
ción segura, por ejemplo, a un pH de 6.3, la HbC llega a
diferenciarse de la HbE y de la HbO Arab, y HbS se separa
de la HbD y de la HbG. La identidad de algunas variantes
permanece sin resolver, y puede establecerse con análisis
adicional por diversas técnicas, por ejemplo, el isoelectro-
enfoque (IEF) o HPLC. Algunos casos raros requieren la
identificación de la mutación a nivel molecular.
Solubilidad de la hemoglobina falciforme
La prueba de solubilidad de la hemoglobina falciforme es
simple, rápida para la presencia de HbS. Un tamizaje positi-
vo no distingue entre los homocigotos y los heterocigotos y
debe tener una sensibilidad debajo de 20% de concentración
aproximada de HbS. Esta prueba es más útil cuando se re-
quiere un examen rápido, por ejemplo, antes del anestésico
general en un paciente de un grupo étnico “en riesgo” cuyo
estado de hemoglobinopatía es desconocido.
La detección de HbS se basa en su insolubilidad relativa
cuando se desoxigena y en la deformación posterior de la
membrana del RBC en la forma clásica de hoz. En el tubo de
ensayo, la desoxigenación se induce con ditionito de sodio
con trazas de saponina. Si la HbS está presente, entonces la
forma desoxi se polimeriza para formar cristales tactoides
clásicos. Una prueba positiva conserva un aspecto opaco
(debido a los RBC falciformes en suspensión), mientras que
la desoxihemoglobina en muestras negativas da una solución
clara de hemoglobina. Hay otras seis variantes raras que tam-
bién tienen características de falciformación. Este examen
no es exclusivo para HbS, sino más bien para hemoglobinas
“falciformes”. La identidad debe confirmarse siempre por
electroforesis. Inversamente, una banda de la variante que
emigra en la posición de la HbS debe confirmarse siempre
con una prueba de solubilidad falciforme.
Este examen es insensible a niveles muy bajos de HbS,
como en aquellos encontrados en los recién nacidos, y por
tanto sin utilidad alguna como parte del examen neonatal.
Sin embargo, es posible emplearla para detectar el gen HbS
en individuos donde no está disponible la electroforesis
275
como primera línea de investigación, por ejemplo, en países
del Tercer Mundo.
Isoelectroenfoque (IEF)
El isoelectroenfoque es una forma muy sensible y mucho
más sofisticada de electroforesis que se basa en la separa-
ción de hemoglobinas según su punto isoeléctrico. Los an-
folitos de bajo peso molecular portadores con un rango de
puntos isoeléctricos se incorporan en el gel o el agar de po-
liacrilamida para crear un gradiente del pH. Para los propó-
sitos de separación de Hb, se utiliza un rango del pH de 5.5 a
8.5. Como las hemoglobinas emigran a través del gradiente,
llegan a ser neutrales en su punto isoeléctrico (pI) y se de-
tiene la migración, es decir se enfocan en su pI. Puesto que
el pI es específico en la carga superficial en una molécula,
incluso las hemoglobinas con una carga diferenciada muy
pequeña se separan en forma discreta. En geles prefabrica-
dos, las hemoglobinas de manera reproducible se enfocan
en el mismo lugar, para obtener, de tal modo, mayor certeza
de la identificación en una sola separación (fig. 28-1). De-
bido a la sensibilidad elevada del IEF, aun las variantes que
están presentes en concentraciones muy pequeñas pueden
determinarse, por ejemplo, con Constant Spring, variantes
A2, H, de Bart. Esta técnica, por tanto, también es conve-
niente para efectuar el tamizaje sanguíneo a partir de sangre
del cordón umbilical de los recién nacidos.
Cuantificación
La cuantificación de las fracciones de la Hb se usa princi-
palmente en la distinción de los rasgos ␣- y ␤-talasemia en
gente con microcitosis H de RBC y estado normal de hierro.
Esto también tiene valor en: a) la caracterización adicional
de algunas variantes, por ejemplo, en las variantes de la cade-
na ␣, HbE; b) el diagnóstico de síndromes compuestos de
hemoglobinopatías; c) el diagnóstico de los desórdenes de la
persistencia hereditaria de la Hb fetal (HPFH), y d) la super-
visión de los regímenes de transfusión en desórdenes de las
células falciformes. La estimación de las fracciones de Hb
puede conseguirse con una variedad de técnicas, incluyendo
la separación de la variante por electroforesis, seguida por
elución, cromatografía en microcolumna, HPLC, inmunodi-
fusión radial y ELISA.
Cromatografía en microcolumna
La cromatografía en microcolumna se emplea mucho para
determinar el porcentaje de HbA2 en la detección del rasgo
␤-talasemia, pero puede también modificarse para la cuan-
276 CAP. 28 MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINOPATÍAS

Figura 28-1 Representación diagramática del isoelectroenfoque en capa fina de hemoglobinas normales y algunas variantes estructura-
les de la hemoglobina. IB1 e IB2 son híbridos ferrosos-férricos de la HbA. (Cortesía del Dr. Yves Beuzarda).

tificación de fracciones importantes, por ejemplo, de HbS.
El principio de separación depende de la adsorción y la
unión de las moléculas de Hb cargadas a una resina con una
cadena lateral polar. Durante la adición de un amortiguador
desarrollador a la columna, a la proteína ligada se le des-
plaza con iones cargados más fuertes del amortiguador, de
ahí el término “cromatografía de intercambio iónico”. Las
hemoglobinas que se desplazan se lavan después a partir
de la resina en la elución. La estimación del porcentaje de
concentración de la fracción entonces se mide contra un
total diluido por densitometría óptica. La celulosa DEAE
(dietilaminoetil) es una resina de intercambio de aniones,
 DETECCIÓN, IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINOPATÍAS 277

que se acompaña con un amortiguador glicina-KCN o Tris- adecuada para examinar una gran cantidad de muestras de
HCl, pH de 8.3. manera rápida, exacta y económica. El principio de sepa-
El rango normal para la HbA2 es de 1.8 a 3.5%, con ración es el mismo de la cromatografía en microcolumna,
niveles elevados (hasta cerca de 7.5%) indicando el rasgo aunque la resina tiene una cadena lateral de poliaspartato,
␤-talasemia. Los niveles fronterizos (3.3 a 3.7%) necesi- es un intercambiador catión y la fase fluida es un ion Cl¯.
tan interpretación cuidadosa, y posiblemente un análisis El análisis se automatiza con un automuestreador de inyec-
del DNA, para confirmar normalidad o una talasemia (␤+) ción sobre la columna y una bomba que ejerce una presión
leve. En el rasgo ␣-talasemia, el nivel de HbA2 puede ser constante del amortiguador de elución en la parte superior
normal o bajo. Los niveles reducidos de HbA2 también se del lisado. Esto controla y regula el tiempo de elución. El
encuentran en la deficiencia de hierro grave, enfermedad aumento de la sensibilidad de la separación es enorme con
de HbH y ␦-talasemia. el empleo de dos amortiguadores, que difieren en la concen-
tración del ion o el pH o ambos. Las fracciones de Hb son
eluidas en forma secuencial de la columna por la creación
Medición de HbF de un gradiente de elución, conseguido al mezclar las dos
fases fluidas. Esto permite la separación de las variantes de
La HbF abarca < 1% en adultos normales, y se incrementa
hemoglobina previas sin identificar, es decir, D de G, y E
un poco en cerca de la mitad de los portadores de ␤-tala-
de O. La densidad óptica de los eluidos se mide directo cuan-
semia. La HPFH y la ␦␤-talasemia producen niveles sig-
do pasan desde la columna y se trazan de forma continua
nificativos elevados de HbF y se distinguen por mantener
para crear un cromatograma (fig. 28-2). La identificación
normales, en lugar de reducidos, el MCV y el MCH res-
se consigue por la comparación de los tiempos de reten-
pectivos. La prueba Kleihauer es probable que también sea
ción contra los de las variantes de hemoglobina conocidas.
útil, pues algunos tipos de HPFH son “pancelulares” (con
Los componentes principales y menores pueden cuantifi-
una distribución uniforme de HbF en los RBC), mientras
carse con exactitud integrando el área bajo cada pico; las
que otros son “heterocelulares” (con una distribución he-
␣- y ␤-talasemias se distinguen con facilidad, pues el nivel
terogénea de HbF en los RBC). En ␦␤-talasemia, la dis-
de HbA2 se calcula de manera automática. Se recomienda
tribución típica es heterocelular. Sin embargo, puede ser que la identidad de una variante de Hb que se detecta por
necesario realizar un análisis de DNA para estar seguro de HPLC se confirme con una segunda técnica (p. ej., electro-
esta distinción, en especial si la ␣-talasemia es una condi- foresis o solubilidad de la hemoglobina falciforme).
ción coexistente posible que causa un MCV bajo.
Un método de uso frecuente en el análisis de HbF lo
introdujo primero Betke y se basa en la desnaturalización
selectiva de otras hemoglobinas por el álcali, dejando la
HbF intacta, que es resistente. Una solución lisada diluida
se somete a una incubación fija de 2 min con NaOH, que
oxida todas las demás fracciones que contiene. Las meta-
hemoglobinas resultantes se precipitan con una solución de
sal saturada, que también neutraliza la oxidación. La HbF,
que permanece en la solución puede separarse del precipi-
tado por filtración, o mejor por centrifugación de alta ve-
locidad. La proporción de la fracción de HbF se determina
por densitometría óptica contra una dilución de Hb total.
Un nivel de HbF < 1% es el rango normal del adulto; 1 a
5% se encuentra en 50% de los portadores de ␤-talasemia;
5 a 20% es característico del rasgo ␦␤-talasemia y algunos
casos de HPFH; 20 a 45% es característico de la HPFH
pancelular tipo africano. En algunos casos homocigotos, la
HbF puede representar > 90% de la Hb total.

Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

La HPLC combina la detección, la identificación y la cuan- Figura 28-2 Diagrama del empalme de los cromatogramas por
tificación de hemoglobinas en una sola técnica y es muy HPLC de las variantes comunes de Hb.
278 CAP. 28 MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINOPATÍAS
Detección de cuerpos de inclusión de RBC
La reacción redox de la tinción supravital se utiliza para
teñir los cuerpos de inclusión del eritrocito que se forman
de derivados de Hb. Esta propiedad es útil en la caracteri-
zación adicional de los desórdenes de la Hb.
La HbH es un tetrámero que se forma con el excedente
de cadenas ␤ (␤4) en la ␣-talasemia y es perceptible por
electroforesis o HPLC cuando existen cantidades significa-
tivas (es decir, en la enfermedad de HbH). La HbH intracelular
es soluble pero muy inestable y se precipita por incubación
con azul brillante de cresil. El precipitado se fija a la mem-
brana del RBC para dar un aspecto típico de “pelota de
golf” a los RBC, con los cuerpos múltiples teñidos. Las in-
clusiones de HbH están presentes en 1 a 2 células/1 000 en
el rasgo ␣-talasemia, pero pueden ser difíciles de detectar
al microscopio. Son mucho más numerosas y visibles en la
enfermedad de HbH.
Los cuerpos de Heinz (véase hemoglobinas inestables)
no son perceptibles en un frotis teñido con Romanowsky
estándar, pero sí como precipitados intracelulares grandes,
redondos y normalmente solos después de la incubación
con violeta de metilo. Su presencia común se detecta sólo
en la hemólisis aguda y no puede ser obvia si la función
esplénica está intacta o si la tinción se realiza sobre sangre
muy fresca.
Detección de hemoglobinas inestables
La inestabilidad molecular de la Hb puede surgir de la
sustitución del aminoácido en los grupos de unión hem,
las áreas ␣␤ de contacto o en el interior del hueco del gru-
po hem. Estos defectos confieren debilidad en los contactos
hem-globina y en las estructuras tetraméricas o helicoida-
les totales. Esto conduce a una tolerancia reducida a estrés
fisiológico, con una tendencia a la oxidación irreversible
del hierro del grupo hem y de la precipitación intracelular
de Hb bajo la forma de cuerpos de Heinz. Hay más de 180
hemoglobinas inestables conocidas, algunas de las cuales
conducen a las anemias hemolíticas congénitas de cuerpos
de Heinz, con una gravedad dependiente de la naturaleza y
de la posición del defecto molecular.
La electroforesis no es en particular útil en el diagnósti-
co de la enfermedad de Hb inestable, puesto que la mayor
parte de estas mutaciones no muestra cambio en la carga
neta de la molécula. La inestabilidad se detecta cuando se
emplean dos controles de desnaturalización basados en la
exposición a un solvente o en la precipitación por calor.
Las muestras deben estar frescas, y la sangre del cordón
puede utilizarse como un control positivo (la HbF tiene una
intolerancia relativa al calor y al estrés hidrofóbico compa-
rada con la Hb normal adulta).
Prueba de inestabilidad al calor
Este control somete la hemoglobina a una incubación de
50°C, lo que ejerce estrés adicional sobre las fuerzas de van
der Waals internas ya debilitadas, y producir subunidades
al disociar con más facilidad de lo normal.
Prueba de estabilidad al isopropanol
La incubación con isopropanol induce estrés hidrofóbico.
El isopropanol es más polar que el agua y debilita las unio-
nes hidrofóbicas, permitiendo que el agua entre en el hueco
del grupo hem y facilite la oxidación del hierro del grupo
hem. En ambos controles, la hemoglobina normal perma-
nece en solución, mientras que las variantes inestables se
detectan con la floculación y precipitación variables.
Análisis molecular
Las técnicas estándares de control descritas antes son ade-
cuadas para la detección y la caracterización de las mutacio-
nes comunes, pero se limitan a identificar variantes raras y a
especificar los defectos de la talasemia. La identificación de
la alteración molecular exacta es esencial para los propósi-
tos de asesoramiento genético, diagnóstico prenatal y, algu-
nas veces, para el manejo clínico. Esto se logra con el aná-
lisis del DNA genómico que se extrae, y luego se amplifica,
a partir de leucocitos de la sangre periférica, o de muestras
de las vellosidades coriales (CVS) para el diagnóstico pre-
natal. En el desarrollo de las técnicas de diagnóstico para el
análisis de DNA se ha logrado un progreso rápido que es
reciente. Una descripción con detalle de las técnicas y sus
aplicaciones está más allá del alcance de este capítulo. Sin
embargo, en seguida se da una breve reseña sobre el uso de
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en el diagnós-
tico de la hemoglobinopatía.
Reacción en cadena de la polimerasa
La PCR se aplica sobre todo para la detección de las mu-
taciones puntuales, deleciones y polimorfismos del DNA.
Esta técnica amplifica una región del DNA de interés, con
sencillez y de manera muy rápida, y en particular es apro-
piada para el diagnóstico prenatal, puesto que requiere sólo
de una muestra muy pequeña que puede obtenerse por CVS
cerca de las 12 semanas de gestación.
El principio de la PCR implica la síntesis de DNA usando
iniciadores sintéticos (secuencias cortas de DNA de cadena
sencilla), los cuales flanquean la región del DNA de interés,
y una DNA polimerasa termoestable (polimerasa Taq). La
 LECTURAS ADICIONALES
amplificación enzimática de cantidades grandes de DNA
permite la visualización directa de los fragmentos de
DNA teñidos en un gel de agarosa. Una sola sustitución
de base puede identificarse por el cambio en el tamaño del
fragmento del DNA después de la digestión del producto
de la PCR con enzimas de restricción que reconocen se-
cuencias específicas de DNA, seguida por una hibridación
del tipo ”Southern blotting”. Sin embargo, esto consume
tiempo e involucra el uso de radioisótopos.
Se han desarrollado nuevas técnicas, que se basan en la
PCR, que permiten la prueba para mutaciones específicas
sin el uso de enzimas de restricción o de radioisótopos si
el defecto molecular exacto que se busca ya es conocido,
permitiendo así que los resultados estén disponibles en un
lapso de 24 horas. Una técnica así es el “sistema de am-
plificación refractaria de la mutación” (ARMS), cuando
se emplean iniciadores específicos para el alelo. En esta
técnica dos iniciadores diferentes se utilizan, uno comple-
mentario al alelo normal y el otro al alelo mutado, que
difieren sólo en el sitio de la mutación. Los iniciadores dan
un producto de PCR sólo si el iniciador y las secuencias
de DNA son complementarios. Así, los iniciadores normal
y mutante amplifican los alelos normal y mutante respecti-
vos. Usando esta técnica, el DNA del paciente puede exa-
minarse para una mutación específica del gen, por ejem-
plo, HbS. Se han sintetizado iniciadores para ␤A, ␤S, ␤C,
␤E y la mayor parte de los genotipos comunes de ␤-ta-
lasemia. En ␤-talasemia, un número limitado de defectos
se encuentra con frecuencia en cada grupo étnico. Así, el
origen étnico del paciente determina primero el empleo de
una serie particular de iniciadores en el análisis, con una
alta probabilidad de identificación positiva en el primer
control.
La GAP-PCR es una técnica con la cual se detectan
“huecos” grandes (deleciones) en el DNA, y es útil en el
diagnóstico de las formas comunes de ␣+ y ␣0 talasemias,
que son sobre todo originadas por deleción. También se
utiliza en el diagnóstico molecular de Hb Lepore, ␦␤-ta-
lasemia y las formas delecionales de HPFH. La PCR mul-
tiplex es una técnica útil para la demostración/exclusión
simultáneas de un número de mutaciones diferentes (p.
ej., en todas las ␣+ y ␣0 talasemias conocidas) en una sola
279
prueba. Las técnicas que se basan en la PCR que se men-
cionan antes se utilizan cuando se examinan mutaciones o
deleciones específicas. Sin embargo, si el defecto molecu-
lar permanece indeterminado, la mutación supuesta puede
identificarse secuenciando de modo directo el gen.
Agradecimientos
Gracias a Jaspal Kaeda FIBMS PhD (Leukaemia Unit, Im-
perial School of Medicine, Hammersmith Hospital, Lon-
don) por la ayuda con la sección PCR, y a Yvonne Elliott
CSI FIBMS (Walsgrave Hospital, Coventry) por la revisión
crítica del manuscrito.
Lecturas adicionales
Bain BJ. Haemoglobinophathy Diagnosis. 2001: Blackwell
Science, Oxford.
Huisman THJ, Carver MFH, Efremov GD. A Syllabus of Human
Hemoglobin Variants. 1996: Sickle Cell Anemia Foundation,
Augusta, GA.
International Committee for Standardization in Haematology
(ICSH). Recommendations for neonatal screening for haemo-
globinopathies. Clin Lab Haematol 1988; 10: 335-345.
Thalassaemia Working Party of the British Committee for Stan-
dards in Haematology, General Haematology Task Force.
Guidelines for the investigation of ␣-and ␤-thalassaemia
traits. J Clin Pathol 1994; 47: 289-295.
Vulliamy T, Kaeda J. Molecular techniques. In Dacie and Lewis
Practical Haematology, 9th edn. Lewis SM, Bain BJ, Bates 1
(eds) 2001: Churchill Livingstone, London, 493-526.
Wild BJ, Stephen AD. The use of automated HPLC to detect and
quantitate haemoglobins. Clin Lab Haematol 1997; 19: 171-
176.
Working Party of the General Haematology Task Force of the
British Committee for Standards in Haematology. The labora-
tory diagnosis of haemoglobinopathies. Br J Haematol 1998;
101: 783-792.
Working Party of the General Haematology Task Force of the
British Committee for Standards in Haematology. Guidelines
for the fetal diagnosis of globin gene disorders. J Clin Pathol
1994; 47: 199-204.
 29
Investigaciones especiales del factor de von Willebrand
Mohammad S Enayat
Introducción
La enfermedad de von Willebrand (vWD) fue descrita pri-
mero por Erik von Willebrand en 1926 en varios miembros
de una familia grande del archipiélago Åland, en Finlandia.
En 1953, se identifica una relación entre la disminución
de la actividad procoagulante del factor VIII (FVIII) y la
vWD, lo que condujo a cierta confusión referente a la natu-
raleza de la proteína responsable de la hemofilia A y de la
vWD. Pero sólo hasta finales de la década de 1970 se logró
una mejor comprensión de las estructuras inmunológica y
molecular del FVIII y del vWF que llevaron al mapeo ge-
nético y la clonación del cDNA que codifica para el FVIII
en 1986 y del vWF en 1989.
La vWD es el más común de los desórdenes sanguíneos
congénitos, con un fenotipo heterogéneo. Deriva de de-
fectos cuantitativos (tipos 1 y 3) o cualitativos (variantes
del tipo 2) del vWF en plasma o plaquetas, o ambos. Esta
glucoproteína multimérica grande (10 a 20 ⫻ 106 kDa)
tiene dos papeles importantes en la hemostasis; actuando
como portador y protector proteolítico del FVIII, y como
mediador de la adherencia plaquetaria al subendotelio, des-
pués de una lesión vascular. El vWF se sintetiza en las cé-
lulas endoteliales y en los megacariocitos por medio de la
transcripción del mRNA de aproximadamente 9 kb resul-
tante a partir del gen del vWF de 180 kb sobre el extre-
mo telomérico del cromosoma 12 en 12p13.2 S pter (fig.
29-1). Los estudios de localización que usan una sonda de
cDNA para la porción media del vWF identifican no sólo
el gen auténtico en este cromosoma, sino también una se-
cuencia del seudogén en el cromosoma 22 en 22q11-23.
Este seudogén tiene 21 a 29 Kb de longitud, con un DNA
genómico que corresponde tanto a exones como intrones de
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker,
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
la región codificante de los exones 23 a 34 del gen del vWF
y con sólo 3.1% de divergencia en la secuencia. El gen
del vWF tiene 52 exones, mide aproximadamente 178 kb,
que codifican un producto de traducción precursor (Prepro-
vWF) de 2 813 aminoácidos (aa) con una repetición interna
grande de dominios homólogos. El propéptido (de 763 aa)
y la subunidad madura (de 2 050 aa) del vWF se componen
de dominios que se repiten en el siguiente orden: D1-D2-
D´-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK. Antes de la
secreción, el vWF experimenta un procesamiento postra-
duccional extenso, que incluye la eliminación del propépti-
do D1-D2, seguida por la glucosilación con oligosacáridos,
12 N-ligados y 10 O-ligados, y multimerización. Algunos
de los oligosacáridos N-ligados del vWF tienen la carac-
terística rara de portar determinantes del grupo sanguíneo
del ABO. Varios dominios funcionales (fig. 29-1) se han
identificado en la molécula del vWF, y la mayor parte de
las mutaciones responsables de varios tipos de la vWD se
han mapeado en estas regiones.
Los resultados a partir de pruebas fenotípicas y genotí-
picas forman la base del diagnóstico y de la clasificación
de los diferentes tipos de vWD. Sin embargo, como surgen
más detalles de estos tipos de pruebas, un diagnóstico más
exacto y la clasificación compleja se hacen regularmente.
Una clasificación revisada de vWD fue publicada en 1994,
pero no se ha modificado y, como de manera continua se
identifican más mutaciones responsables de cada tipo de
vWD, se ha propuesto una nueva clasificación basada en
defectos y mutaciones funcionales. En el año 2003, en el
XIX Congreso de la Sociedad Internacional de Trombosis
y Hemostasia en Birmingham, Reino Unido, varias ponen-
cias enfatizaron la necesidad de una nueva clasificación de
vWD, con base en el diagnóstico molecular y el análisis
282 CAP. 29 INVESTIGACIONES ESPECIALES DEL FACTOR DE VON WILLEBRAND

Figura 29-1 Representación esquemática del gen y de la proteína del vWF humano. De arriba hacia abajo: características estructurales
del gen, seudogén y cDNA del vWF; localizaciones y numeración, antigua y nueva, del péptido señal (SP), del vWF prepropéptido y
maduro. El vWF prepro contiene 2 813 (2 050 numeración antigua) aminoácidos, de los cuales 1-22 (-22-1 numeración antigua) son pép-
tidos señal, 23-763 son propéptidos y 764-2 813 son subunidades maduras. Las cajas rotuladas denotan regiones de dominios homólogos
internamente repetidos; localizaciones aproximadas del grupo de mutaciones responsables de diversos tipos de vWD; puentes disulfuro
Al y A3 y posiciones de los dominios funcionales; posiciones de los enlaces disulfuro responsables de la dimerización y de la multime-
rización del vWF. La glucoproteína de la plaqueta Ilb-IIIa (␣llb␤3) se une a la secuencia Arg-Gli-Asp (RGD) indicada en el dominio C1.

multimérico mejorado del vWF. Con tantos pacientes in-
clasificables en el grupo tipo 1 de vWD, ahora se sugiere
que tal método multimérico mejorado puede ayudar en la
clasificación futura de estos pacientes.
En este capítulo se describen tres pruebas fenotípicas
especiales que se utilizan ahora para el diagnóstico y la cla-
sificación de la vWD. Son el análisis multimérico de vWF:
Ag, usado para el diagnóstico diferencial de todos los tipos
de vWD variante; la agregación plaquetaria inducida por
la ristocetina, esencial para el diagnóstico de la vWD tipo
2B; y finalmente el ensayo de la unión vWF/FVIII para
el diagnóstico de vWD tipo N “Normandía”. Aunque no
hace mucho tiempo que el gen del vWF fue identificado,
las pruebas moleculares ahora se introducen extensivamen-
te, y también se describen una breve metodología y algunas
estrategias para la detección de la mutación.
Pruebas fenotípicas
Análisis multimérico del VWF
En 1981 una electroforesis en gel de SDS, bajo condiciones
no reductoras, permitió la alta resolución de los multímeros
vWF:Ag y fue divulgada por Ruggeri y Zimmerman. Este
método original se ha modificado y mejorado desde enton-
ces, pero el principio del método es el mismo. Las modi-
ficaciones incluyen variaciones del método actual, tipo de
 PRUEBAS FENOTÍPICAS
medio en el cual se separa la proteína, semiautomatización,
y diversos tipos de anticuerpos y métodos de visualización
de las bandas del multímero. Todos estos métodos se utili-
zan para la identificación de alteraciones cualitativas del
vWF:Ag, tal como son vistos en la vWD variante o tipo 2,
donde hay pérdida de multímeros de peso molecular alto o
intermedio, o ambos. Para el análisis comprensivo del multí-
mero del vWF:Ag usado en el diagnóstico y clasificación de
la vWD tipo 2, vWF:Ag del plasma y de la plaqueta deben
examinarse en geles de agarosa a concentraciones del 1.0 al
2.2%. El método descrito aquí es la modificación de Enayat
y Hill (1983) del método original de Ruggeri y Zimmerman
(1981). Esta es una electroforesis en gel de agarosa-SDS
usando una técnica en gradiente amortiguador. La visuali-
zación de la banda del multímero es mediante autorradio-
grafía, usando un anticuerpo anti-vWF mono o policlonal
marcado con 125I. También es posible utilizar otros méto-
dos no radiactivos para la visualización de la banda des-
pués de transferir las bandas del multímero de los geles de
agarosa en diferentes tipos de filtros.
Preparación de gel
Un sistema de sándwich hecho de una pieza del gel unida a
una película (Flowgen), cubierto por una placa de vidrio y
separada de una segunda placa de vidrio por un espaciador
de plástico en forma de “U” de 1 mm de grueso, se utiliza
para preparar los geles. El gel (Agarosa LGT tipo VII; Sig-
ma) se vierte entre las placas de cristal y, después de que se
ha fijado, se quita la placa del cristal superior, y una tira de
3 cm de la parte superior de gel se corta y se sustituye por un
gel concentrador compuesto de agarosa a 0.8% (Agarosa de
SeaKem HGT (P), Flowgen Instruments Ltd). Los pozos
de la muestra se cortan en el gel aglomerante. Las muestras
que deben aplicarse se incuban por 30 min a 56ºC en un
amortiguador que contenga colorante azul de bromofenol,
para vigilar la migración molecular, y dodecil sulfato de so-
dio (SDS) para la dispersión completa de las moléculas del
vWF y aportar una carga negativa a todos los multímeros.
Condiciones electroforéticas
Cada instrumento de la electroforesis se optimiza para este
método pero, por lo general, la electroforesis se realiza rá-
pidamente a 2 mA/cm al inicio, para que las muestras se
muevan de los pozos al gel concentrador. Los pozos vacíos
se llenan de gel concentrador fundido y la electroforesis se
realiza durante toda la noche a una velocidad más baja, 1.0
mA/cm. Cuando se completa la electroforesis, los geles se
fijan en una solución de isopropanol, se secan con presión
y se lavan con una solución de suero de conejo al 10%. La
283
autorradiografía se realiza incubando en los geles el anti-
cuerpo (DAKO Ltd) de vWF antihumano marcado con 125I
durante la noche. Después de un lavado minucioso para
eliminar el anticuerpo sin reaccionar, los geles se secan y
se aplican a placas autorradiográficas de rayos X y se alma-
cenan a ⫺7°C de 2 a 5 días antes del revelado.
Interpretación de los resultados
La autorradiografía es un método muy sensible y, cuando
se varía el tiempo de exposición, se pueden obtener dife-
rentes autorradiografías con diversas intensidades de la
señal del mismo gel. El patrón normal del vWF:Ag en plas-
ma muestra la gama completa de bandas del multímero que
corresponde al factor de von Willebrand. Éste se compone
de multímeros de peso molecular alto, intermedio y bajo
(fig. 29-2). Cada banda del multímero se integra con un
trío de bandas, una central principal y dos bandas satélites
borrosas pero también teñidas (a y b). La mejor extensión
de los multímeros de vWF:Ag se observa en gel de agaro-
sa de media resolución (1.3 a 1.5%), la pérdida de multí-
meros de peso molecular alto se investiga mejor en geles
de agarosa de baja resolución (1.0 a 1.3%) (fig. 29-2A), y
las anormalidades del trío de bandas en geles de agarosa de
alta resolución (1.8 a 2.2%) (fig. 29-2B). Por tanto, para un
análisis multimérico completo deben usarse dos o tres con-
centraciones diferentes del gel. Ésta no es una técnica fá-
cil y cada corrida puede variar y necesitar la optimización
individual de las condiciones electroforéticas. El análisis
densitométrico de cada patrón multímero puede también
ayudar en la cuantificación de la cantidad de multímero
ganada o perdida en algunos pacientes con vWD tipo 2A
(fig. 29-2C).
Las bandas del multímero del vWF:Ag en la plaqueta
normal son diferentes a aquellas observadas en el plasma.
Hay multímeros más grandes presentes en las plaquetas más
que en el plasma, y la organización multimérica también es
diferente (fig. 29-3). Las bandas de multímeros más peque-
ñas parecen estar compuestas de un dúo, y las bandas cen-
trales emigran menos que los multímeros correspondientes
en el plasma. La información del análisis del multímero de
la plaqueta puede ayudar a decidir el tipo de tratamiento
de algunos pacientes con vWD tipo 2A y corresponder al
tipo de mutación presente en ellos.
Ensayo de la agregación plaquetaria inducida
por la ristocetina (RIPA)
Una de las funciones principales de la glucoproteína del vWF
es promover la adherencia de plaquetas al subendotelio en el
sitio de la lesión vascular, a través de la interacción profunda
284 CAP. 29 INVESTIGACIONES ESPECIALES DEL FACTOR DE VON WILLEBRAND

Figura 29-2 Las autorradiografías de diferentes patrones vistos en los multímeros del vWF:Ag en el plasma del tipo 2A (carril 1), 2D
(carril 2), 2B (carril 3), normal (carril 4) y vWD tipo 1 (carril 5) sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 1.2% (A) y al 1.8% (B).
El trío de la banda 2 es marcado por una llave, y las bandas satélites a y b pueden verse mejor en la banda 1 del plasma en la vWD tipo 2A
(carril 1). La flecha en la parte superior del gel señala la línea entre los geles concentrador y separador. La dirección de la electroforesis
es de arriba hacia la parte inferior. (C) Un gel al 1.0% que muestra la migración de multímeros de gran peso molecular, según lo visto en
la Vincenza tipo 2 (1) y algunos pacientes con vWD tipo 2 no clasificados (2). El panel siguiente ilustra el análisis densitométrico de uno
de los dos geles anormales y el área de los multímeros de gran peso molecular.

con GPIb en el complejo receptor GPIb-IX (glucoproteína
IB-IX) en la membrana plaquetaria. Este dominio funcio-
nal que mapea el dominio A1 del vWF desempeña un papel
importante en la hemostasis primaria. Los defectos en este
dominio dan lugar a aumento en la afinidad del vWF por el
GPIb plaquetario. Sin embargo, esto no causa trombosis sino,
paradójicamente, sangrado. Este fenotipo raro de una varian-
te del tipo 2 de la vWD se refiere como tipo 2B, y su anor-
malidad funcional característica se detecta por el ensayo de
la agregación plaquetaria inducida por la ristocetina (RIPA).
El antibiótico ristocetina induce la unión del vWF al GPIb
plaquetario en el plasma rico en plaquetas (PRP) y el gra-
do de aglutinación plaquetaria con diversas concentraciones
de ristocetina forma la base de este ensayo. Aparte de esta
alteración, 2B vWD también se caracteriza por la ausencia
selectiva de multímeros de peso molecular alto (HMWM)
en el plasma, y es identificada por el análisis multiméri-
co del vWF:Ag. De hecho, los pacientes con la vWD tipo
2B pueden sintetizar una gama completa de multímeros
del vWF, como se muestra por patrones del multímero del
vWF:Ag multimérico normal en plaquetas y células endo-
teliales, pero los HMWM son eliminados de la circulación
por la afinidad incrementada del vWF anormal del receptor
GPIb plaquetario.
La metodología RIPA descrita aquí es una modifica-
ción del trabajo original referido en 1977. La ristocetina
(Paesel-Lore) se reconstituye en una solución salina Tris
amortiguada, pH 7.4, y cinco soluciones diferentes, dando
concentraciones finales de 0.50, 0.1, 0.125 y 0.15 mg/ml,
se preparan para usarse en el análisis. La PRP se prepara
centrifugando las muestras sanguíneas de la prueba y del
control a 800 rpm durante 10 minutos. La cuenta plaque-
taria en el supernadante (PRP) se ajusta aproximadamente
a 250 ⫻ 109/L. Se añaden 200 µl de la sangre del paciente
o del control normal (blanco) a las cubetas que contienen
una barra magnética para agitar y se colocan en los blo-
ques de calentamiento a 37°C del agregómetro plaquetario
Bio/Data de 4 canales por 2 minutos. Cada cubeta enton-
ces se inserta en uno de los canales del agregómetro y se
comienza la agregación. Se añaden 20 µl de ristocetina (co-
menzando con la muestra menos concentrada) a cada uno
de los especímenes. Se permite la agregación durante un
mínimo de 3 minutos. Un trazo del patrón de la agregación,
que es proporcional a la luz transmitida, se imprime; un
patrón típico se muestra en la figura 29-4. Las muestras de
vWD tipo 2B requieren menos ristocetina para alcanzar un
patrón de agregación comparable a las normales.
Ensayo de la unión vWF/FVIII
El vWF y el FVIII mantienen una relación estrecha y en
el plasma forman un complejo molecular no covalente. La
integridad del dominio de unión del FVIII en la molécula
del vWF es un factor importante para la formación de éste,
y para la estabilidad y transporte del complejo vWF/FVIII
 PRUEBAS GENOTÍPICAS PARA IDENTIFICAR LA MUTACIÓN
Figura 29-3 Autorradiografía que muestra diferentes patrones
del multímero observados en el vWF:Ag normal del plasma (Pls)
y de la plaqueta (Plt), separación electroforética en agarosa a 1.4%.
La flecha en la parte superior del gel señala los pozos donde se co-
locó la muestra. Dos flechas pequeñas en la parte inferior indican
el patrón de la banda doble mejor observada en agarosa al 1.4%.
Obsérvese la presencia de los multímeros de peso molecular muy
alto en la muestra de la plaqueta.
Figura 29-4 Un trazo típico del patrón de agregación en plasma
de un individuo normal con plaquetas en presencia de diferentes
concentraciones finales de ristocetina.
285
en el plasma. En una investigación de varios casos de vWD,
se observó que el vWF tiene una capacidad de unión al-
terada hacia el FVIII, causando la reducción en el nivel
de este factor, lo que conduce a una condición similar a la
hemofilia A leve. A esta condición se le refiere inicialmen-
te como “seudohemofilia”; más tarde se le reconoce como
anormalidad del vWF y se renombra “Normandía” (área de
donde provino el primer paciente definido) o vWD tipo 2N.
Los multímeros de vWF:Ag en esta variante de la vWD son
normales, pues los defectos mutacionales presentes en estos
pacientes no afectan el mecanismo de multimerización del
vWF. Recientemente se han mapeado mutaciones especí-fi-
cas, dentro del vWF y los responsables de esta condición en
los dominios D´ y D3, y la mayor parte de las mutaciones se
agrupan en los exones 18 a 24, entre Arg 19 y Cis 297.
El método descrito aquí para determinar la unión del
FVIII al vWF es la modificación de Nesbitt et al. (1996)
del método que se populariza originalmente. Una concen-
tración conveniente de un anticuerpo monoclonal anti-vWF,
MAS 533p (de la compañía Sera Lab), se une a las placas
de microtitulación (Immulon 4, laboratorios Dynatech) in-
teraccionando durante toda la noche a 4ºC. Las placas se la-
van dos veces en 50 mM de Tris, 100 mM de NaCl, a un pH
de 8.0 (TBS), conteniendo BSA a 0.1%. Diluciones seriales
del plasma del paciente que contienen 1 U/dl, 0.5 U/dl, 0.25
U/dl y 0.125 U/dl del vWF:Ag se agregan al amortiguador
TBS que contiene BSA al 3% y se incuba otra vez duran-
te toda la noche a 4°C. Se lavan las placas como antes y
el FVIII endógeno en las muestras se elimina incubando
con 0.35 M CaCl2 por una hora a temperatura ambiente.
Un FVIII recombinante (de la compañía Bioclate, Baxter) a
0.05 U/ml se diluye en TBS/BSA al 1% con CaCl2 10 mM y
Tween 20 al 0.002% se adiciona y se incuba por dos horas a
37°C. Después de lavar el FVIII ligado al vWF se determina
usando el equipo cromogénico Coamatic FVIII (de la com-
pañía Quadratech) y se realizan lecturas a 405 nm.
Los resultados se grafican como porcentaje de dilución
del vWF:Ag contra la absorbancia a 405 nm para la vincu-
lación del FVIII. En el ejemplo que se describe aquí (fig.
29-5), las muestras que se usan son de un control normal,
un control homocigoto y dos pacientes heterocigotos con
vWD tipo 2N (P1 y P2) con la mutación de Thr28Met
como controles positivos. Para la determinación de cual-
quier resultado anormal, debe utilizarse una gama de mues-
tras control normales.
Pruebas genotípicas para identificar la mutación
Tamizaje para mutaciones
Las mutaciones relacionadas con todos los tipos de vWD
se han identificado desde finales de la década de 1980. Sin
286 CAP. 29 INVESTIGACIONES ESPECIALES DEL FACTOR DE VON WILLEBRAND
Figura 29-5 Unión del FVIII al vWF de un control normal, de
dos pacientes heterocigotos, P1 y P2, con la mutación Thr28Met y
un control homocigoto con la misma mutación.
embargo, por el gran tamaño y complejidad del gen vWF
y la presencia del seudogén en el cromosoma 22, con la ex-
clusión de grandes deleciones, por lo general existe menos
información sobre defectos moleculares de la vWD tipo
1 y tipo 3 que del tipo 2. La investigación de las mutacio-
nes responsables de los subtipos 2A, 2B, 2N y 2M tiene
más éxito porque es el resultado de los datos aportados por
los estudios del fenotipo. Una región sensible a las pro-
teasas dentro del dominio A2, cercana al sitio de digestión
de Tyr 842 a Met 843, se informa como la que genera los
cambios estructurales similares a aquellos que se observan
en 2A vWD, y este dominio se señala para detectar la mu-
tación en la 2A vWD. En la 2B vWD, donde hay mayor
afinidad por el GpIb plaquetario, los estudios de la detec-
ción de la mutación se dirigen al dominio A1 del vWF, que
contiene el dominio funcional de la unión con el GpIb. De
hecho, casi todas las mutaciones responsables de estos dos
subtipos de vWD se han detectado en el exón 28, donde
mapean los dominios Al y A2 del vWF. De manera similar,
los exones 18 a 24 se estudian para detectar la mutación en
la vWD tipo 2N. En 1993 se publicó una base de datos de
mutaciones puntuales, por inserción y deleción identifica-
das en la vWD, junto con una gran cantidad de polimor-
fismos que se encuentran en el vWF. Sin embargo, puesto
que esta lista aumenta continuamente mientras más infor-
mación llega a estar disponible, una nueva base de datos en
línea de la mutación y del polimorfismo del vWF se crea
y mantiene por un consorcio de investigadores de la vWD
en Internet. Este sitio ahora ha cambiado y existe uno nue-
vo a nombre del Comité Científico y de Normalización
de la ISTH para el vWF, que mantiene la Universidad de
Sheffield del Reino Unido. Este sitio Web (http://www.she
ffield.ac.uk/vWF) contiene la información actualizada so-
bre las mutaciones y polimorfismos más recientes que se di-
vulgan sobre el gen para el vWF. Aunque la mayor parte de
estas mutaciones reportadas se comprueban con estudios
funcionales, donde el vWF recombinante se expresa en un
cultivo de la línea celular en la cual la mutación se intro-
duce por mutagénesis dirigida al sitio, otras tienen todavía
que expresarse. En algunas de las mutaciones divulgadas el
gen completo del vWF no se ha investigado para excluir la
posibilidad de cambios en otra parte.
En la vWD tipos 1 y 3, donde las mutaciones se po-
drían encontrar en cualquier parte a lo largo del gen del
vWF, se ha reportado el uso de diferentes técnicas para
una búsqueda preliminar como son: la detección por medio
del corte químico de la unión alterada entre las cadenas de
DNA (CMCD), la electroforesis en gel que detecta cam-
bios conformacionales (CSGE) o la electroforesis en gel
de gradiente desnaturalizante (DGGE). Para el tamizaje de
la mutación por CMCD, todo el gen del vWF se amplifica
en siete fragmentos del cDNA, que se obtienen por la trans-
cripción inversa del mRNA “ilegítimo” encontrado en lin-
focitos periféricos por medio de la reacción en cadena de
la polimerasa (RT-PCR). Estos segmentos pueden entonces
tamizarse por CMCD para la mutación. La DGGE es tan
sensible como CMCD, pero requiere la síntesis de inicia-
dores especiales y el uso de la técnica de electroforesis en
geles. La metodología de CSGE es un método de detección
simple y no radiactivo; sin embargo, implica amplificacio-
nes y análisis de hasta 60 fragmentos para el análisis del
gen que codifica para el vWF.
Detección e identificación de la mutación
Secuenciación de DNA
Los métodos de tamizaje tales como CSGE y CMCD iden-
tifican sólo la posición y a veces el tipo de un cambio mo-
lecular en un segmento pequeño del gen, y donde pudieran
encontrarse mutaciones. La naturaleza real de la mutación,
sin embargo, sólo podría determinarse por la secuencia-
ción directa del DNA. Los métodos más antiguos para la
preparación de productos PCR de DNA de cadena sen-
cilla necesarios para la secuenciación (usando cebadores
biotinados apropiados y perlas magnéticas revestidas con
estreptavidina, o por PCR asimétrica) han sido sustituidos
en la actualidad por la secuenciación cíclica. Este método
se basa en la síntesis de una hebra nueva de DNA a par-
tir de una cantidad pequeña de la plantilla de doble hebra
original en un proceso de secuenciación cíclica, emplean-
do una enzima Taq termoestable especial y dideoxi-dNTP
marcados con compuestos fluorescentes. Con la introduc-
ción de los analizadores genéticos automáticos con 16 a
 LECTURAS ADICIONALES
96 sistemas capilares de electroforesis, es posible ahora
realizar centenares de secuenciaciones por día.
Después de la detección de una mutación, ésta puede
caracterizarse por mutagénesis dirigida al sitio y expresar-
se en un cultivo de línea celular o por uno de los siguientes
métodos:
1. Análisis de la endonucleasa de restricción. Una sola
sustitución del par de bases puede crear o eliminar un si-
tio para la restricción de la enzima endonucleasa. Para la
confirmación de tal cambio, los productos de restricción
de PCR relevantes obtenidos por el corte de una de
las cientos de enzimas de restricción pueden analizarse
por electroforesis en agarosa o en gel de poliacrilamida,
y las bandas de DNA obtenidas por corte se visualizan
por medio de tinción con bromuro de etidio. Dentro del
tipo 2NvWD casi todas las mutaciones reportadas pue-
den detectarse de esta manera.
2. Hibridación con oligonucleótido iniciador específica de
alelo (ASO). En mutaciones donde no hay disponible
una enzima de restricción para detectar el cambio, un
análisis ASO-H o dot-blot puede utilizarse. Aquí se sin-
tetiza un oligonucleótido corto (cerca de 15bp) con se-
cuencias del tipo silvestre y del mutante. Los productos
PCR purificados del exón relevantes se desnaturalizan
en NaOH. Los productos obtenidos por PCR tanto del
alelo normal como del paciente del exón apropiado se
aplican a tiras de nylon Hybond N+ (Amersham Inter-
national), manualmente o con un aparato disponible en
el comercio. Las tiras de nylon del filtro entonces se hi-
bridan con los dos diferentes tipos de oligonucleótidos
marcados con 32P-ATP, usando el fragmento Klenow (de
la compañía Pharmacia) de la DNA polimerasa I. Des-
pués de las hibridaciones, las tiras del filtro se lavan tres
veces en concentraciones que difieren de SSC con SDS
por 10 a 20 min a una temperatura óptima determinada
empíricamente para cada sonda del ASO. Por medio de
la exposición a una autorradiografía, es posible visuali-
zar muestras positivas (hibridación positiva) y negativas
(hibridación negativa).
En la actualidad, por lo menos se listan 40 mutaciones de
sentido equivocado, cuatro microdeleciones y una inser-
ción, en la base de datos, como las alteraciones causantes
de la vWD tipo 2A. Una forma dominante rara de la vWD
tipo 2A (formalmente tipo IID) se encontró como causal de
una mutación de sentido erróneo en el dominio CK del car-
boxiloterminal. Una serie de mutaciones de sentido erró-
neo responsables de la vWD tipo 2B se ha identificado
ahora, y todas se agrupan en el dominio 2A del vWF, que
contiene el dominio de la unión funcional con el receptor
GPIb. Con pocas excepciones, todas se confinan a un pép-
tido corto (540 a 578 aminoácidos). La mayor parte de las
287
mutaciones frecuentes son R1306W, R1308W, V1316M y
R1341Q, que explican cerca del 90% de las vWD tipo 2B.
Quince mutaciones de sentido equivocado, en los dominios
D´ y D3 relacionados con los exones 18 a 24, aparecen ac-
tualmente en la base de datos para la vWD tipo 2N, siendo
la mayor parte mutaciones de sentido equivocado R854Q.
Ya que las mutaciones para los tipos 1 y 3 podrían estar
presentes en cualquier parte de los 52 exones del gen del
vWF, la detección de estas alteraciones en estos tipos de
vWD fue lenta y sólo unas pocas, con grandes deleciones,
se han reportado al principio de la década de 1990. Sin em-
bargo, en la actualidad con la introducción y la facilidad
relativa de secuenciación directa de DNA, una gran canti-
dad de mutaciones se han comunicado para la vWD tipo 3,
sobre todo en forma homocigota en pacientes de familias
con matrimonios consanguíneos. Como resultado de un
estudio europeo multicentro (MCMDM-1vWD) y de un es-
tudio canadiense en el diagnóstico y el control de la vWD
tipo 1, muchas más mutaciones se identifican actualmente.
Estos resultados indican que las mutaciones heterocigotas
de sentido equivocado en el vWF maduro son una causa im-
portante de la vWD tipo 1, y que varios otros tipos de muta-
ciones pueden dar lugar a niveles reducidos en la expresión
del vWF y contribuir a este fenotipo de la vWD.
Lecturas adicionales
Budde U, Drewake E, Mainnusch K, Schneppenheim R. Labora-
tory diagnosis of congenital von Willebrand Disease. Semin
Thromb Hemost 2002; 28: 173-190.
Enayat MS. Multimeric analysis of von Willebrand Factor. Me-
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Evan Sadler J, Matsushita T, Dong Z et al. Molecular mechanism
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most 1995; 74: 161-166.
Ginsburg D. Molecular genetics of von Willebrand disease.
Thromb Haemost 1999; 82: 585-591.
Goodeve AC. Laboratory methods for the genetic diagnosis of
bleeding disorders. Clin Lab Haematol 1998; 20: 3-19.
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Willebrand’s Disease. Methods Mol Med 1999; 31: 169-177.
Kenney S, Cumming AM. The molecular biology of von Wille-
brand disease. Clin Lab Haematol 2001; 23: 290-230.
Nesbitt IM, Goodeve AC, Guillart AM et al. Characterisation of
type 2N von Willebrand disease using phenotype and molecu-
lar techniques. Thromb Haemost 1996; 75: 959-964.
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factor detected by denaturing gel electrophoresis in a patient
with type IIB von Willebrand disease. Blood 1991; 78: 1738-
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Ruggeri ZM, Ware J. The structure and funtion of von Will-
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288 CAP. 29 INVESTIGACIONES ESPECIALES DEL FACTOR DE VON WILLEBRAND

Ruggeri ZM, Zimmerman TS. The complex multimeric composi- Schneppenheim R, Budde U, Ruggeri ZM. A molecular approach
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Sadler JE, Mannucci PM, Berntorp E et al. Impact diagnosis and
treatment of von Willebrand disease. Thromb Haemost 2000;
84: 160-174.
 30
Análisis de plaquetas
Steven Walton y Peter E. Rose
Introducción
Las plaquetas son fragmentos pequeños de citoplasma de
megacariocito con un diámetro medio de 1 a 2 µm y un vo-
lumen medio de 5 a 8 fl, teniendo una vida media en la cir-
culación periférica de 1 a 10 días. Su función es mantener
la integridad de la pared vascular e iniciar la homeostasis
al dañarse la red vascular. Su funcionalidad puede dividirse
en tres áreas principales: adherencia al endotelio vascular;
agregación entre sí, y liberación de productos químicos en
el plasma. Este capítulo describe el principio básico de las
técnicas usadas para investigar cada una de estas áreas.
La pérdida de esta función clínicamente se manifiesta
en pacientes con contusión grave, erupciones petequiales o
sangrado prolongado posteriores a traumatismos menores,
como punción venosa o tratamiento dental. Los pacientes
que presentan estos problemas deben sujetarse a una eva-
luación de la función plaquetaria y a cuantificación de la
cuenta plaquetaria.
Estructura y función
La función y la estructura de la plaqueta se relacionan
estrechamente. La membrana externa de la plaqueta es
un organelo muy funcional, que contiene diferentes glu-
coproteínas que atraviesan la membrana celular bilípida
estándar. Varias de estas glucoproteínas activan diferen-
tes vías bioquímicas dentro de la plaqueta para inducir
algunas funciones requeridas como respuesta normal de
la plaqueta. Se ha demostrado que la función plaqueta-
ria anormal se debe a falta de expresión de una o más de
esas glucoproteínas (cuadro 30-1 y fig. 30-1). La adhesión
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
anormal plaquetaria se observa en el síndrome de Bernard-
Soulier, en el cual la glucoproteína de membrana plaqueta-
ria interna ha mostrado ser deficiente. Esta glucoproteína
tiene una capacidad de unión específica por el factor de von
Willebrand de la proteína plasmática, cubriendo la matriz
subendotelial expuesta al plasma, de tal forma que adhiere
las plaquetas al sitio de la lesión vascular por medio de la
glucoproteína Ib. La deficiencia del complejo de la glu-
coproteína IIb/IIIa causa una alteración en la capacidad
de las plaquetas para agregarse (fig. 30-1). Esta condición
se conoce como trombastenia de Glanzman. Éstas y otras
glucoproteínas actúan como receptor fisiológico para va-
rios agonistas plaquetarios de peso molecular bajo y alto.
Una vez que uno o más de estos receptores glucoproteíni-
cos se han activado, hay una transducción de señales en
los organelos internos de la plaqueta. Esto es común que
ocurra vía activación de la enzima fosfolipasa C, la cual
está expuesta a los extremos internos de las glucoproteí-
nas transmembranales y a la activación por sus respectivos
ligandos.
En el citoplasma de la plaqueta se encuentran muchas de
las estructuras internas encontradas en otras células secre-
toras; sin embargo, la plaqueta no tiene una gran capacidad
para la síntesis de proteínas. La plaqueta contiene un retícu-
lo endoplásmico rugoso y aparato de Golgi muy pequeños
(fig. 30-2). Contiene el retículo endoplásmico liso extenso,
que se señala con frecuencia como “el sistema tubular den-
so”. El citoplasma también contiene muchos ␣-gránulos y
gránulos densos. Estos gránulos contienen una variedad
amplia de compuestos químicos implicados en la respuesta
inflamatoria y, principalmente, en la aceleración del pro-
ceso de la hemostasia localizada. Los ␣-gránulos contie-
nen los factores de coagulación V, VII y el fibrinógeno,
290 CAP. 30 ANÁLISIS DE PLAQUETAS

Cuadro 30-1 Factores implicados en una respuesta plaquetaria

Glucoproteína Función
receptora Ligandos plaquetaria
GP IIb-IIIa
Vitronectina La agregación y
Factor de von Willebrand adhesión a índices
Fibronectina de flujos altos
Fibrinógeno
GP Ia-IIa Vitronectina Adhesión
Factor de von Willebrand
Fibronectina
Fibrinógeno
GMP 140 Varias glucoproteínas Interacción plaqueta
(PADGEM) y glucolípidos a leucocito

Figura 30-2 Representación esquemática de la estructura pla-

quetaria. El diagrama ilustra las estructuras internas principales
de una plaqueta discoide. CS, sistema canalicular conectado a la
superficie; M, mitocondria de la plaqueta; DTS, sistema tubular
denso; DB, cuerpo denso; G, gránulos de la plaqueta; MT, banda
circunferencial de los microtúbulos.

mientras que el ATP tiene un efecto inhibidor sobre el ADP

y es, por tanto, una parte del mecanismo de control para lo-
calizar la formación del trombo. La 5-HT es otro agregador
plaquetario de gran alcance; la membrana de la plaqueta
contiene numerosos receptores para 5-HT. Estos receptores
son miembros de la superfamilia de las proteínas G, aco-
plados a un neurotransmisor y un receptor hormonal que se
encuentra en las células nerviosas y en el endotelio intesti-
nal en grandes cantidades

Figura 30-1 Representación esquemática de los receptores pla- Conteo plaquetario

quetarios
junto con factores de crecimiento para ayudar a la repara-
ción vascular, fundamentalmente el factor de crecimiento
derivado de la plaqueta (PDGF) y el factor de crecimien-
to endotelial (EGF). Otra sustancia almacenada en los
␣-gránulos es el factor IV plaquetario; es un compuesto
que se analiza y es uno de los principales factores para de-
terminar la respuesta de liberación plaquetaria.
Los gránulos densos contienen una proporción grande
de nucleótidos plaquetarios disponibles, principalmente
difosfato y trifosfato de adenina y guanina, junto con iones
calcio y magnesio y 5-hidroxitriptamina (5-HT). El ADP
es un acelerador importante para la agregación plaquetaria,
Es importante obtener una cuenta de plaquetas exacta an-
tes de proceder a las pruebas de la función plaquetaria.
La cantidad de plaquetas puede estimarse a partir de un
frotis sanguíneo analizado por microscopia y teñido con
Romanowski. La morfología de la plaqueta que muestre
el tamaño y la granularidad es útil en los desórdenes rela-
cionados con plaquetas grandes, como en el síndrome de
Bernard-Soulier.
Las máquinas automatizadas para cuenta sanguínea con
capacidad de conteo de plaquetas forman parte del equipo
rutinario de laboratorio (véase el cap. 27). La exactitud más
grande de las técnicas manuales permite medir cuentas tan
bajas como 5 ⫻ 109/L y superiores a 1 000 ⫻ 109/L.
 INVESTIGACIONES DE LA AGREGACIÓN PLAQUETARIA
Anticuerpos plaquetarios
La disminución de la cuenta plaquetaria ocurre por una
falla en la producción medular (p. ej., después de la quimio-
terapia citotóxica) o por un aumento en el consumo de la
plaqueta. La producción del anticuerpo dirigido en contra
de algún componente de la membrana de la plaqueta o para
una sustancia asociada a la membrana plaquetaria puede
dar lugar a un incremento del secuestro por el bazo. La pre-
sencia de inmunoglobulinas dirigidas contra la membrana
plaquetaria es, por tanto, una investigación importante. La
presencia de la inmunoglobulina plasmática dirigida contra
las plaquetas no se correlaciona con la gravedad clínica de
la trombocitopenia autoinmunitaria, mientras que la con-
centración de la inmunoglobulina ligada a la plaqueta es un
mejor marcador de la actividad patológica.
La demostración de la inmunoglobulina unida a la pla-
queta es más difícil que identificar la inmunoglobulina
relacionada a la superficie del eritrocito. Debido a las canti-
dades bajas de plaquetas y a la dificultad para visualizarlas,
se recomienda el método que emplea un citómetro de flujo
y combinar el reactivo de la globulina antihumana con un
colorante fluorescente. Se prepara un plasma rico en pla-
quetas por centrifugación a baja velocidad. Este plasma se
centrifuga a gran velocidad en presencia de un amortigua-
dor que contiene EDTA o algún otro inhibidor plaquetario
para formar un botón de plaquetas, el cual es entonces la-
vado varias veces para eliminar cualquier plasma atrapado
que contenga globulinas humanas. Finalmente, las plaque-
tas son resuspendidas en albúmina bovina al 5%. En segui-
da una alícuota de plaquetas se mezcla con una globulina
antihumana acoplada a isotiocianato de fluoresceína u otro
fluorocromo detectable por citometría de flujo. Después de
incubar en la oscuridad, las plaquetas se someten a un la-
vado final con amortiguador PBS EDTA y se resuspenden
en una cantidad suficiente de amortiguador para permitir
el flujo fácil a través del citómetro de flujo. Las plaque-
tas del paciente sin colorante fluorescente se usan como un
control negativo. Una reacción positiva ocurre cuando el
índice fluorescente es más alto en las plaquetas marcadas
con el fluorocromo que en aquellas plaquetas sin colorante.
Tiempo de sangrado
Una de las pruebas más simples de la función de la plaqueta
es el tiempo de sangrado. Se hace una incisión en la piel del
antebrazo, con un dispositivo para el sangrado, y se mide
el tiempo consumido para que se detenga el sangrado. Para
mejorar la reproducibilidad del método, la técnica se reali-
za haciendo una incisión dual, usando una lanceta cargada
por resorte en el área convencional. El resorte tiene una
291
tensión estándar para dar una profundidad reproducible al
corte, mientras que un manguito del esfigmomanómetro se
infla a una presión seleccionada de 40 mmHg. El tiempo
hasta que el sangrado cese es medido por un cronómetro y
la detección, limpiando el exceso de sangre del brazo con
papel filtro limpio. Cualquier defecto importante de la pla-
queta se registra con un tiempo prolongado, como sucede
en las alteraciones de la proteína de von Willebrand.
Adherencia plaquetaria
La primera etapa fisiológica de la activación plaquetaria
es la adherencia de las plaquetas a la matriz subendotelial.
La medición de la adherencia de la plaqueta es difícil y
es raro que se realice en los laboratorios rutinarios. Se re-
portan varios métodos que pueden utilizarse para dar una
estimación neta de la función de adhesión plaquetaria. El
más simple indica tomar una muestra sanguínea citratada
sin obstrucción venosa y someterla a un conteo plaqueta-
rio. Una alícuota de la muestra se pasa a presión constante
sobre un tubo que contiene perlas de cristal estandarizadas,
y un segundo conteo plaquetario se realiza en la muestra
emergente. Ahora, el porcentaje de adherencia de la pla-
queta puede calcularse. Una modificación a esta técnica es-
tándar usa una matriz subcelular como el colágeno y puede
semejar un cuadro fisiológico mejor. Los problemas con la
reproducibilidad de los resultados restringieron el uso de
este método en los laboratorios de investigación, incluso
en compañías farmacéuticas que evaluaban la eficacia de
los fármacos que modificaban la adherencia o la activación
plaquetaria. Un método más complejo implica un sistema
para simular la presión venosa normal y requiere la elabo-
ración de un tubo de plástico inerte con un área de matriz
subendotelial. La sangre entonces se hace pasar dentro del
sistema a tasas fisiológicas normales de flujo sanguíneo.
Investigaciones de la agregación plaquetaria
Es probable que la medición de la agregación plaquetaria
sea la técnica más común usada en la investigación de los
desórdenes plaquetarios. Los estudios de agregación se ba-
san en una técnica fotométrica. La agregación se registra
como el cambio en la absorbancia de una mezcla de plasma
rica en plaquetas cuando los agregados se forman. Cuan-
to más grandes son los aglomerados, más pesados son, y
cuando se salen de la trayectoria luminosa se detecta una
transmisión más alta de la luz. Existen varios agonistas de
uso general, incluyendo ADP, adrenalina, colágeno y el an-
tibiótico ristocetina. Esta última es un agonista inusual ya
que no tiene ningún efecto directo sobre las plaquetas pero
modifica la parte del complejo del factor VIII, conocido
292 CAP. 30 ANÁLISIS DE PLAQUETAS
como factor de von Willebrand. Cuando se modifica, esta
proteína cambia de una estructura globular a una lineal.
La estructura lineal entonces une a varias plaquetas y faci-
lita la seudoagregación. Una respuesta anormal a la risto-
cetina se observa en pacientes con cambios cuantitativos y
cualitativos en la proteína de von Willebrand.
Analizador PFA-100 para la función
plaquetaria
El dispositivo PFA 100 (Dade) se utiliza cada vez más en
laboratorios de manera rutinaria para medir el tiempo de
sangrado inducido por colágeno/epinefrina. El dispositivo
mide la formación del tapón plaquetario sobre un tubo ca-
pilar revestido de colágeno bajo tensión del flujo sanguí-
neo. La sangre venosa citratada se conduce a través de un
tubo capilar para que entre en contacto con una membrana
cubierta con epinefrina, y se activen las plaquetas. Enton-
ces la sangre se aspira a través de una abertura de precisión
en la membrana, mientras las plaquetas comienzan a adhe-
rirse a la circunferencia hasta formar un tapón estable que
ocluye la abertura. El tiempo de sangrado es, por tanto,
el tiempo transcurrido para que deje de pasar la sangre a
través de la abertura, y una medición de la formación del
tapón plaquetario ex vivo. Esta metodología representa en
la actualidad la primera línea de investigación plaquetaria
en muchos laboratorios.
Investigaciones sobre la liberación
plaquetaria
Las técnicas que estudian la liberación de la plaqueta pue-
den dividirse en dos, las que utilizan radioisótopos y las
que emplean la producción de luz usando la enzima lucife-
rinasa. Las técnicas isotópicas es posible realizarlas en dos
formas. Las plaquetas pueden incubarse con un radioisóto-
po que pueda incorporarse dentro de la molécula bajo in-
vestigación, tal como 5-hidroxitriptamina (5-HT) marcada
con 14C para observar la liberación de 5-HT. En estos mé-
todos, el plasma rico en plaqueta se incuba durante un pe-
riodo con un compuesto radiactivo óptimo. Las plaquetas
entonces se separan del plasma y el exceso de radioisótopo
se elimina. Para hacer esto, las plaquetas se centrifugan
mediante un gradiente de densidad con albúmina, dejando
la pastilla de plaquetas en el fondo y el plasma radiactivo
en la parte superior. Después la pastilla de la plaqueta se
suspende de nuevo en un amortiguador, se lava otra vez
y se cuenta. Después de la agregación plaquetaria con un
agonista potente, el plasma pobre en plaquetas también se
cuenta y la cantidad de radiactividad en el plasma pobre en
plaquetas se expresa como un porcentaje de la actividad de
una muestra llena de plaquetas.
Una segunda técnica que usa radioisótopos se emplea
para realizar un ensayo radioinmunitario (RIA). Con esta
metodología el compuesto bajo investigación se mezcla con
una porción del mismo compuesto marcado con un trazador
radiactivo. Se agrega a esta mezcla un anticuerpo específico
para el compuesto bajo investigación. Después de la incuba-
ción, el compuesto ligado al anticuerpo se separa del que no
está unido, generalmente por la adición de carbón activado
y luego por una centrifugación. Es posible cuantificar la ra-
diactividad en el sedimento o en el sobrenadante libre. Debi-
do a que el anticuerpo se liga en muestras radiomarcadas y no
radiomarcadas en igual cantidad, la proporción de radiacti-
vidad ligada por el anticuerpo es inversamente proporcional
a la cantidad del compuesto en el plasma bajo investigación.
El método se cuantifica usando concentraciones conoci-
das de plasma control para construir un gráfico y, entonces,
las lecturas para las muestras se miden a partir del gráfico.
La quimioluminiscencia es otra técnica usada en la
investigación de la reacción de liberación de la plaqueta.
Ésta se basa en la misma reacción química que ocurre en la
luciérnaga, donde el ATP y la luciferinasa reaccionan con
la luciferina para producir fotones de luz. La reacción
depende de la cantidad de ATP que se produce. Para la re-
acción plaquetaria, se agregan luciferinasa y luciferina a
un vial de la reacción junto con compuestos que liberan
la plaqueta. La cantidad de ATP en el vial de la reac-
ción determina la cantidad de luz producida. Una pro-
ducción más alta de luz resulta de una liberación más
elevada de ATP a partir de las plaquetas.
Citometría de flujo
La citometría de flujo se utiliza cada vez más para investigar
la función plaquetaria en presencia de anticuerpos dirigi-
dos contra antígenos específicos expresados en las plaque-
tas. La metodología para la citometría de flujo se discute
en el capítulo 32. Para las investigaciones de la plaqueta
hay dos proteínas principales que pueden identificarse; las
requeridas para la unión de la plaqueta a la pared celular y
las proteínas necesarias para formar agregados plaqueta-
rios. La glucoproteína Ib es un antígeno de superficie que
se requiere para unir las plaquetas a la matriz subendotelial
vía el factor de von Willebrand. La glucoproteína IIb/IIIa
es uno de los componentes principales requeridos para la
reacción de agregación plaquetaria. Un déficit de la fun-
ción de la plaqueta se puede, por tanto, identificar usando
anticuerpos monoclonales dirigidos contra cualesquiera de
estas proteínas.
Para investigar las alteraciones en glucoproteínas aso-
ciadas a la membrana plaquetaria, se prepara un plasma
 TROMBOELASTOGRAMA
rico en plaquetas por centrifugación lenta. El plasma enton-
ces se diluye en fluido plasmático pobre en plaquetas o en
albúmina para obtener una cuenta plaquetaria aproxima-
da a 1 ⫻ 109/L. Una alícuota de ésta se mezcla con un
anticuerpo monoclonal marcado con fluorescencia espe-
cífico para la glucoproteína. Después de la incubación, la
cantidad completa se diluye otra vez para dar cerca de 0.5
ml. La muestra se analiza, en seguida, con un citómetro
de flujo. Para determinar que es positivo, el índice de fluo-
rescencia debe ser más alto que el de la muestra control
con las mismas plaquetas del paciente, sin la presencia del
fluorocromo. Las plaquetas son el componente celular más
pequeño de la sangre, y no es necesario lisar los eritrocitos
o eliminar algún detritus de la muestra, pues es simple el
acceso con respecto a las plaquetas que se analizan.
Está aumentando el interés sobre el papel de las plaque-
tas en los desórdenes trombóticos. Esto ha conducido a la
investigación de plaquetas para identificar poblaciones ac-
tivas de plaquetas durante episodios trombóticos, por ejem-
plo, después de reemplazos de la prótesis de válvula del
corazón. Se han identificado dos marcadores importantes
de la activación. Uno se debe a los cambios en la conforma-
ción de las glucoproteínas membranales, notablemente en
las proteínas IIb/IIIa. Este cambio expone sitios al ambien-
te externo que, en la plaqueta inactiva, se ocultan dentro de
regiones enrolladas de las moléculas. Muchos anticuerpos
se generan dirigidos contra estos epítopos de la activación.
Estos antígenos de la activación sólo son demostrables en
las plaquetas que se han activado con las soluciones débiles
de trombina y son negativos en las plaquetas sin tratar. Un
segundo tipo de proteína de activación se identifica cuando
las partes de los ␣-gránulos se expresan sobre la membrana
superficial de las plaquetas. Esto sucede cuando los grá-
nulos han pasado por el proceso secretorio y la membrana
de éstos se ha incorporado a la membrana externa de la
plaqueta. Se les ha nombrado como componente granular
derivado de la activación plaquetaria para la membrana
externa (PADGEM). Usando anticuerpos dirigidos contra
estos marcadores, solos o combinados, y un citómetro del
flujo con la técnica discutida antes, es posible determinar la
proporción de plaquetas activadas.
293
Tromboelastograma
Un acercamiento más fisiológico y global a la función pla-
quetaria se evalúa usando un tromboelastograma que mide
la coagulación en función de la temperatura, los factores
fibrinolíticos y la función de la plaqueta supervisando las
características físicas del coágulo y su capacidad para rea-
lizar trabajo mecánico a través de su desarrollo y degrada-
ción. Se agrega CaCl2 a la sangre venosa tratada con citrato
dentro de una cubeta a temperatura regulada (37°C) que
oscila en un ángulo de 4° 45´. Un pistón disponible se co-
loca dentro de la muestra inmediatamente después de la
recalcificación. El torque de la cubeta rotante se transmite
al pistón sumergido después de que la relación plaqueta-
fibrina acopla a la cubeta y al pistón. La magnitud del mo-
vimiento del pistón depende de la fuerza del acoplamiento,
con coágulos fuertes que mueven el pistón directamente
dentro de la fase con el movimiento de la cubeta. Cuando
el coágulo se contrae o disuelve, las uniones se rompen y
disminuye la transferencia del movimiento de la cubeta. Se
proporciona información sobre el tiempo de formación del
filamento de fibrina, la cinética de la formación del coágulo
y la disolución del coágulo. Este acercamiento se utiliza
cada vez más en el cuidado intensivo que se establece para
vigilar el estado de coagulación.
Lecturas adicionales
Ahn YS et al. Activated platelet aggregates in thrombotic throm-
bocytopenic purpura: decrease with plasma infusions and nor-
malisation in remission. Br J Haematol 1996; 95: 408-415.
Chand IF, Keiffer NA, Phillips BR. Platelet membrane glyco-
proteins. In Haemostasis and Thrombosis; 3rd ed. 1994:
Lippincott, London.
Dacie JV, Lewis SM (eds). Basic haematological techniques. In
Practical Haematology, 7th edn. 1991: Churchill Livingstone,
London.
Rosenfield CS, Nichols G, Bodensteiner DC. Flow cytometric
measurement of antiplatelet antibodies. Am J Clin Pathol
1987; 87: 518-522.
White JG. Platelet ultrastructure. Haemostasis and Thrombosis,
2nd edn. 1987: Churchill Livingstone, London.
 31
Servicio transfusional del hospital
Steven Walton y Peter E Rose
Un servicio de transfusion sanguínea del hospital empren-
de tres investigaciones serológicas importantes: a) identi-
ficar el grupo sanguíneo de un paciente; b) detectar e
identificar los anticuerpos irregulares, incluyendo aquellos
que inducen anemia hemolítica; c) proporcionar compo-
nentes sanguíneos compatibles con los pacientes.
Identificación del grupo sanguíneo
Los métodos de laboratorio aplicados a la serología de la
transfusión están cambiando muy rápido para satisfacer una
necesidad creciente de simplificar y automatizar muchos as-
pectos del servicio. Los principios de la serología, sin em-
bargo, siguen siendo los mismos. Hay aproximadamente
100 antígenos reconocidos en la membrana del eritrocito,
la presencia de los cuales pueden identificarse por la aglu-
tinación de los eritrocitos al exponerse con el anticuerpo o
el antisuero correspondiente. La mayor parte de los antíge-
nos del grupo sanguíneo surgen naturalmente, y la exposi-
ción del antígeno puede estimular una respuesta primaria
con anticuerpos en una persona que carece del antígeno. El
aloanticuerpo resultante es específico para ese antígeno, y la
exposición adicional al antígeno estimula una respuesta rá-
pida y prolongada del anticuerpo, con el potencial de inducir
una reacción significativa de transfusión. Una hemólisis in-
travascular rápida se produce por la unión del anticuerpo (por
lo general, IgM) al antígeno y activación de la cascada del
complemento. Esto resulta en incompatibilidad ABO cuan-
do el anti-A o el anti-B, naturalmente presente en el suero
del receptor, se expone al antígeno apropiado. Es normal que
un individuo genere anticuerpos que surgen de modo natural
contra los antígenos AB ausentes en sus propios eritrocitos,
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
debido a la estimulación del mismo antígeno encontrado en
otras sustancias biológicas, tales como polen o bacterias. Un
grupo sanguíneo individual puede determinarse agregando
directamente los antisueros específicos a los eritrocitos de
prueba y de manera indirecta con una adición de eritrocitos
de especificidad antigénica conocida a los sueros de prue-
ba. Para determinar un grupo sanguíneo de un paciente se
requiere la caracterización de los antígenos del eritrocito.
Para determinar el grupo sanguíneo de forma rutinaria, es
necesario identificar los antígenos A, B y D. La gente que
expresa el antígeno A en las células no produce anti-A pero
puede producir el anti-B. La gente que expresa el antígeno
B no produce normalmente el anti-B pero puede producir el
anti-A, mientras que el grupo O no expresa el antígeno A o
el B. Históricamente, la identificación del antígeno se realizó
usando anticuerpos purificados de pacientes previamente ti-
pificados. Hoy en día, la mayor parte de los anticuerpos de
tipificación son anticuerpos monoclonales modificados con
químicos. Para su facilidad de empleo, los anticuerpos co-
merciales tienen un tinte coloreado específico agregado a
los anticuerpos anti-A y anti-B. Un método indirecto para
comprobar el grupo sanguíneo de un paciente es hacer
reaccionar el suero de un paciente, que contiene los anticuer-
pos, con células de especificidad conocida ABO, lo cual da
un grupo contrario o inverso. Así, el suero de un paciente del
grupo A reacciona con las células B, los pacientes del grupo
B reaccionan con las células A, y los pacientes del grupo O
reaccionan con las células A y B. Los escasos pacientes que
poseen los antígenos A más B no reaccionan con ninguna
célula. Una revisión adicional y parte de la investigación
para los anticuerpos irregulares es colocar el suero del pa-
ciente con las células del grupo O, que no deben reaccionar,
independientemente del grupo sanguíneo del paciente.
296 CAP. 31 SERVICIO TRANSFUSIONAL DEL HOSPITAL
Cuadro 31-1 Resultados esperados de los grupos sanguíneos comunes
Grupo Anti-A Anti-B Anti-AB Células A
A Rh⫹ ⫹ ⫺ ⫹ ⫺
A Rh⫺ ⫹ ⫺ ⫹ ⫺
B Rh⫹ ⫺ ⫹ ⫹ ⫹
B Rh⫺ ⫺ ⫹ ⫹ ⫹
AB Rh⫹ ⫹ ⫹ ⫹ ⫺
AB Rh⫺ ⫹ ⫹ ⫹ ⫺
O Rh⫹ ⫺ ⫺ ⫺ ⫹
O Rh⫺ ⫺ ⫺ ⫺ ⫹
Es importante incluir controles negativos apropiados,
como células del propio paciente o células O. Las células
que se utilizan como control son necesarias para identifi-
car las reacciones que producen los anticuerpos fríos en la
muestra, excepto los anti-A y anti-B.
El sistema rhesus (Rh)
Es el segundo sistema más importante de grupos sanguí-
neos por identificar. Diferente a lo que ocurre en el sistema
ABO, los anticuerpos no están presentes en forma natural
en ausencia del antígeno; sin embargo, los anticuerpos pue-
den formarse con facilidad después de la exposición de cé-
lulas rhesus positivas (Rh+) en un receptor huésped rhesus
negativo (Rh¯). Los anticuerpos formados, por lo general
IgG, pueden cruzar la barrera placentaria, ocasionando que
en el segundo o subsecuentes embarazos, en los cuales la
madre es Rh¯ y el feto Rh+, desarrolle la enfermedad hemo-
lítica del recién nacido (HDN). Es, por tanto, importante
que se realicen todos los esfuerzos para evitar la sensibi-
lización de las mujeres en edad de tener hijos al antígeno
D. Los exámenes de grupo sanguíneo rhesus se realizan
por duplicado, empleando un anticuerpo IgM monoclonal
anti-D. Los controles positivos y negativos se incluyen en
cada lote de pruebas y los resultados deben evaluarse por
microscopia, después de la centrifugación de los tubos,
por 1 min a una velocidad baja. En el Reino Unido, las
directrices nacionales recomiendan el uso de dos reactivos
anti-D diferentes. El antígeno D es un antígeno complejo
compuesto de muchos subantígenos (epítopos) diferentes.
Los anticuerpos monoclonales tienen una especificidad
elevada y pueden reaccionar a epítopos simples; por tanto,
si el epítopo particular al cual el reactivo reacciona está
ausente se obtiene un resultado negativo falso.
Usando estos ocho reactivos (anti-A, anti-B, anti-AB,
anti-D, anti-D2, células A, células B y células O), es po-
sible identificar a los grupos sanguíneos comunes (cuadro
31-1).
Células B Células O Anti-D1 Anti-D2
⫹ ⫺ ⫹ ⫹
⫹ ⫺ ⫺ ⫺
⫺ ⫺ ⫹ ⫹
⫺ ⫺ ⫺ ⫺
⫺ ⫺ ⫹ ⫹
⫺ ⫺ ⫺ ⫺
⫹ ⫺ ⫹ ⫹
⫹ ⫺ ⫺ ⫺
Métodos para identificar el grupo sanguíneo
Hay muchos métodos que usan estos reactivos básicos para
conocer el grupo de los pacientes, los cuales pueden divi-
dirse en cinco categorías amplias: a) métodos basados en
tubos individuales, convencionales, que requieren cerca
de una hora de incubación a una temperatura óptima de
16°C; b) métodos en tubos individuales mejorados (para
determinaciones de grupos sanguíneos rápidamente), que
requieren siempre centrifugación, se realizan sólo para la
tipificación de la célula; c) métodos que usan placas de
microtitulación; d) métodos que usan una matriz de fase
sólida; e) métodos automáticos basados en los principios
de flujo continuo. El método elegido depende del volu-
men de trabajo que se emprenda y de su urgencia. Los mé-
todos rápidos empleados con regularidad comprueban sólo
los antígenos del paciente sin un análisis completo.
La visualización de los resultados varía dependiendo
del método empleado. Para los métodos de tubo y de mi-
crotitulación es necesaria la aglutinación de los eritrocitos,
que puede interpretarse micro o macroscópicamente. Las
metodologías de microtitulación y de grupo rápido tienden
a utilizar la visualización macroscópica, mientras los mé-
todos no realzados se emplean para ser interpretados por
microscopia.
Métodos de microtitulación
Las metodologías de microtitulación permiten que se ha-
gan fácilmente grupos múltiples en lotes. Una placa de
microtitulación estándar se forma de 96 celdillas en un
bloque plástico sólido, alineado en 12 hileras de ocho.
Usando ocho reactivos para un grupo completo, la sangre
de 12 pacientes puede concentrarse en una placa. La vi-
sualización de todos los grupos sanguíneos en la placa es
rápida, usando contraluz para ver los resultados positivos
y negativos. Hay sistemas disponibles con computadoras y
microrrobótica para automatizar o semiautomatizar los
 TAMIZAJE DE ANTICUERPOS
Figura 31-1 Análisis del grupo sanguíneo ABO del sistema en gel con una muestra del grupo B Rh⫹. Reproducida con permiso de
DiaMed-GB Ltd.
sistemas para conocer el grupo sanguíneo por microtitula-
ción. Estos sistemas incorporan lectores de placas de mi-
crotitulación que pueden programarse para identificar los
grupos sanguíneos por patrón de reactividad de la placa de
microtitulación.
Sistemas en gel
Los sistemas en fase de gel se basan en la captura de células
que reaccionan en una matriz sólida o semisólida, con los
resultados negativos que se movilizan a través del gel. Esto
ocurre para colocar los anticuerpos monoclonales, que se
mencionan antes, químicamente unidos a la matriz. Así, las
células que contienen el antígeno correspondiente se unen
(atrapadas en la matriz) cuando son empujadas para movi-
lizarse en el gel al utilizar centrifugación (fig. 31-1). Este
método es en particular útil para conocer el grupo sanguí-
neo de pacientes en riesgo elevado de portar en la sangre
microorganismos, como el de hepatitis o el VIH. El alto
costo de fabricar los geles que incorporan los anticuerpos
específicos necesita considerarse al incluir esta metodolo-
gía en la práctica de rutina del laboratorio.
Sistemas automatizados
Métodos automáticos que usan equipo que puede utili-
zar la identificación positiva de la muestra y se requieren
en laboratorios con mucha carga de trabajo. Al utilizar un
equipo automático reduce el tiempo de manipulación de
la muestra, y los pacientes se benefician de la eliminación
de errores administrativos, ya que los resultados pueden
reportarse directo desde la lectura sin transcripción. El
gran desembolso de capital requerido encarece los siste-
mas automáticos, es decir, son demasiado costosos para los
laboratorios con una carga de trabajo baja. La mayor parte
de los laboratorios utiliza dos técnicas, un sistema rápido
para el análisis urgente y un sistema rutinario de lote para
297
el volumen de la carga de trabajo. Las técnicas rápidas se
realizan para identificar el grupo sanguíneo del paciente
en una urgencia cuando se requiere la sangre para la com-
patibilidad cruzada (cross-matching), permitiendo que la
sangre de un grupo sanguíneo compatible se seleccione sin
demora.
Tamizaje de anticuerpos
El tamizaje de los sueros del paciente para la presencia de
cualquier anticuerpo irregular ahora es una parte rutinaria
del banco de sangre de los hospitales. Es raro en la ac-
tualidad emprender una identificación del grupo sanguí-
neo sin el tamizaje del anticuerpo al mismo tiempo, con
la excepción posible de las muestras neonatales, donde la
producción del anticuerpo no ha comenzado y el tamaño de
muestra es pequeño.
Para muchos pacientes que se someten a procedimien-
tos quirúrgicos de urgencia y electivos, la investigación del
grupo sanguíneo y el tamizaje del anticuerpo es todo lo que
se recomienda. Esta política ha reducido mucho el desper-
dicio de sangre, con la compatibilidad sanguínea cruzada
reservada para los procedimientos con una probabilidad
mayor de 30% de requerimiento celular. Para los pacientes
en quienes un anticuerpo significativo clínico se identifica
con el procedimiento de la prueba de tamizaje, una compa-
tibilidad cruzada completa es necesaria.
Existen diferentes propiedades fisicoquímicas exhibi-
das por diferentes anticuerpos que son importantes en su
identificación. Primero, diversos anticuerpos del grupo san-
guíneo se distinguen uno de otro con base en que algunos
anticuerpos aglutinan eritrocitos mejor con bajas tempera-
turas (anticuerpos fríos), mientras otros son activos a 37°C.
Los anticuerpos fríos con frecuencia son anticuerpos IgM,
y es posible que no sean detectables o clínicamente signifi-
cativos a temperaturas más altas. Algunos anticuerpos que
surgen en forma natural, como los anti-A y anti-B, aun reac-
cionan a 37°C; sin embargo, el título será mucho más alto de
298 CAP. 31 SERVICIO TRANSFUSIONAL DEL HOSPITAL
Figura 31-2 Ejemplo de células para el tamizaje de anticuerpos. Reproducida con permiso de DiaMed-GB Ltd.
0 a 4°C. Los anticuerpos calientes son, por lo general, IgG
y aglutinan eritrocitos más rápido a 37°C. Históricamente,
los anticuerpos también se han clasificado como completos
o incompletos, dependiendo de la cantidad de aglutinación
de eritrocitos suspendidos en una solución salina normal.
Los anticuerpos incompletos no aglutinan eritrocitos bajo
tales circunstancias, y esto conduce a la búsqueda de otras
técnicas para mejorar la sensibilidad. Los eritrocitos sus-
pendidos en 20 a 30% de albúmina bovina pueden ayudar a
identificar muchos anticuerpos incompletos. Otros métodos
que emplean el polibreno o las células tratadas con enzimas
se emplean de rutina. Las enzimas como la tripsina, la papaí-
na, la bromelaína o la ficina se utilizan para eliminar el ácido
neuramínico de las superficies de los eritrocitos y reducir
la carga negativa, provocando que el anticuerpo incompleto
aglutine las células tratadas con enzimas. Las pruebas sa-
linas a temperatura ambiente, los métodos de la albúmina
y de la enzima se han reemplazado por la prueba indirec-
ta de antiglobina (IAT). La última prueba muestra una ele-
vada eficacia en identificar clínicamente los anticuerpos
significativos, y sin la desventaja de identificar los anticuer-
pos irrelevantes que pueden dar lugar a un serio retraso en el
laboratorio, pues la evaluación y la identificación adiciona-
les del anticuerpo son necesarias.
El tamizaje del anticuerpo se emprende al reaccionar
los eritrocitos que contienen la mayor parte de los antíge-
nos comunes del grupo sanguíneo con el suero del pa-
ciente. Es frecuente mantener una serie de tres muestras
celulares, y los antígenos conocidos en cada muestra celu-
lar se obtienen de una hoja de información (fig. 31-2).
El tamiz del anticuerpo puede realizarse usando cuales-
quiera de las técnicas que se emplean en el laboratorio,
pero con mayor frecuencia la prueba indirecta de antiglo-
bulina se utiliza como el tamiz inicial. Esto es, porque la
prueba IAT es la más sensible para la mayor parte de los
anticuerpos. Usando los nuevos sistemas en gel, se propone
que un tamiz del anticuerpo basado en la IAT negativa y la
selección de la sangre ABO Rh compatible sean suficientes
para emplear la sangre en un paciente, y la compatibilidad
cruzada ya no se requiere tanto. En la mayor parte de los
casos esto es verdad, pero hay un riesgo de que la sangre
incompatible pueda usarse en un paciente con anticuerpos
a un antígeno raro.
Prueba indirecta de antiglobulina
La IAT que usa eritrocitos suspendidos en solución salina
de baja fuerza iónica (LISS) es el método recomendado
para el tamizaje del anticuerpo. En solución salina normal
los grupos ionizados tanto en el antígeno como en el an-
ticuerpo se neutralizan parcialmente con iones opuestos
cargados en la solución. El tiempo de incubación mínimo
para las técnicas de fuerza normal iónica es de 45 min y no
es muy recomendado.
Si la LISS se utiliza como medio, las reacciones del an-
tígeno y del anticuerpo son más rápidas. La LISS es una
solución de glicina más sodio que contiene 0.03 M de clo-
ruro de sodio. Es raro que los autoanticuerpos dependientes
de LISS puedan detectarse y, en estas circunstancias, las
técnicas de fuerza iónica normal son útiles.
Las células de tamizaje que se utilizan en la detección
del anticuerpo deben tener expresión homocigota de los
antígenos apropiados (Rh, Cc, Ee, Jka, Jkb, Fya, Fyb, Ss).
Se espera que el 99.9% de anticuerpos sea detectado, sólo
con anticuerpos en los eritrocitos de muy de baja frecuen-
cia que no es posible visualizar. Después de la incubación
del suero de prueba con los eritrocitos de tamizaje, las cé-
lulas se lavan para remover cualquier anticuerpo no unido.
Cualquier contaminación por globulina libre neutraliza el
componente antiglobina en el reactivo antiglobulina, y por
tanto debe evitarse.
El anti-IgG monoespecífico puede utilizarse sustituyen-
do un reactivo poliespecífico antiglobulina que contenga
sueros anticomplemento, con el método de LISS IAT. Esto
evita la susceptibilidad indeseable hacia la interfase de am-
plitud térmica baja y a los anticuerpos dependientes LISS
que están ligados al complemento. Cuando se identifica un
anticuerpo irregular, es necesaria la investigación adicional
para identificar la especificidad del anticuerpo.
Figura 31-3 Ejemplo de un antigrama mostrando un rango amplio de antígenos. Reproducida con permiso de DiaMed-GB Ltd.
300 CAP. 31 SERVICIO TRANSFUSIONAL DEL HOSPITAL
Identificación del anticuerpo
Si un resultado positivo se obtiene en cualesquiera de las
células de tamizaje del anticuerpo es esencial identificar
la especificidad del anticuerpo. Esto requiere hacer reac-
cionar los sueros con un panel más grande de células tipi-
ficadas. Es común que los paneles comerciales contengan
11 tipos de células y se abastezcan con un antigrama de los an-
tígenos correspondientes (fig. 31-3). La identificación del
anticuerpo se produce comparando el patrón reactivo del an-
ticuerpo con el patrón de los antígenos. Si la sangre se re-
quiere para transfusión, sólo las unidades negativas para
el antígeno correspondiente deben seleccionarse. Como
en el tamiz del anticuerpo cualquier método puede utili-
zarse, pero es mejor comenzar con la misma técnica con la
que se obtuvo la reacción positiva en el tamiz del anticuer-
po. Con frecuencia esta es la IAT. Si los resultados de este
panel son inconcluyentes pueden clarificarse con facilidad
repitiendo el panel con una técnica mejorada enzimática-
mente. Incluso, si la identificación es aún inconcluyente,
debe utilizarse un panel diferente de células. Los resultados
no concluyentes pueden requerir la toma de una muestra
fresca para verificar que el anticuerpo es verdadero y no un
contaminante de la muestra. Si la identidad del anticuerpo
continúa como desconocida, es posible que se necesite en-
viar la muestra al centro de referencia, donde permanece
disponible en un panel más grande donador para ayudar a
la identificación.
Compatibilidad cruzada
La compatibilidad cruzada es el procedimiento realiza-
do para asegurarse que la sangre del donador potencial es
compatible con el receptor. Una vez que se obtienen los
grupos ABO Rh y el tamiz negativo del anticuerpo, las com-
paraciones de la sangre pueden hacerse de manera directa.
Las unidades donadoras deben, en lo posible, seleccionarse
del mismo grupo ABO y Rh. El tipo de producto del eritro-
cito necesita considerarse; por ejemplo, la sangre comple-
ta, el concentrado de eritrocitos, las células con suplemento
agregado, pobre o escaso en leucocitos. Esto depende de
la condición clínica que se requiere para la transfusión y
de la edad del receptor. Además, es necesario verificar que
las mujeres menores de 50 años que donan están dando
eritrocitos Kell negativos. Esto es necesario porque los an-
ticuerpos producidos contra el antígeno Kell pueden cruzar
la barrera placentaria. Las mujeres estimuladas al producir
anti-Kell por la transfusión, que se embarazan, pueden te-
ner un bebé que desarrolle anemia hemolítica in utero.
Una vez que se selecciona el producto correcto, el pro-
cedimiento de compatibilidad cruzada es relativamente
directo, ya que las células del donador recolectadas se lavan
y se hacen reaccionar con el suero del receptor. La elección
de la técnica es la misma que se emplea para el tamizaje del
anticuerpo, pero debe incluir un método indirecto con anti-
globulina. Cualquier unidad que da una reacción positiva no
debe transfundirse. Son muy raros los casos donde es im-
posible obtener unidades compatibles, por ejemplo, en pa-
cientes con autoanticuerpos fuertes en el suero. En estos
pacientes debe realizarse una autocompatibilidad cruzada
(las células del receptor contra el suero del receptor). Las
unidades que no exhiben mayor fuerza de reactividad que
en el autocruce autoautólogo pueden usarse.
Todos los autoanticuerpos deben investigarse más a fon-
do para identificar especificidad y rango térmico del anti-
cuerpo. Para esto es posible que se requieran técnicas de
elución.
Métodos de elución
Es posible remover los anticuerpos ligados a los antígenos
del eritrocito, sin alterar su especificidad antigénica, por un
proceso que se denomina elución; son tres procedimientos
principales para la elución: temperatura, pH bajo y solven-
tes orgánicos.
Temperatura
El sistema de temperatura de elución utilizado con más fre-
cuencia consiste en calentar los eritrocitos lavados a 56°C
por 5 min. Después de la centrifugación, el sobrenadante
contiene los anticuerpos. Con el congelamiento de las cé-
lulas lavadas suspendidas en albúmina se obtiene el mismo
sobrenadante hemolizado, que después de la centrifuga-
ción está listo para la investigación. Ambos métodos son
rápidos y fáciles de montar en cualquier laboratorio.
pH bajo
Si los eritrocitos lavados se resuspenden en amortiguadores
con un pH por abajo de 3.5, los anticuerpos IgG pueden
recuperarse de las membranas celulares sin lisis. Aunque
el pH bajo es la técnica recomendada de elución, un pH
sobre 10 parece dar mejores resultados para los anticuerpos
IgM.
Solventes orgánicos
Aunque los resultados de los eluidos usando éter o xileno
son muy buenos para los anticuerpos IgG, los riesgos para
 PRÁCTICA DE LA TRANSFUSIÓN
los trabajadores por la exposición a estos solventes restrin-
gen su uso a los laboratorios con campanas de extracción.
Una vez que la elución está preparada, se le sustituye por el
suero en un método de identificación del anticuerpo.
Práctica de la transfusión
La práctica actual de la transfusión hospitalaria debe in-
cluir sistemas para minimizar el uso de los productos san-
guíneos en lo posible. La transmisión potencial de virus
patógenos de la hepatitis B, C, VIH y CMV en productos
sanguíneos, junto con un riesgo potencial de la enfermedad
de Creutzfeldt Jakob (ECJ), ha promovido la creación de
medidas para mejorar la seguridad de los productos sanguí-
neos. Éstas incluyen sistemas mejorados para la selección
del donador, tamizaje viral de rutina, el uso de productos
inactivados del plasma y agotamiento de leucocitos de
los productos del eritrocito. Las medidas para minimizar
el uso de los productos de transfusión incluyen el uso de
esquemas de ordenamiento máximo de la sangre, el desa-
rrollo de la práctica de transfusión autóloga y la partici-
pación en el sistema que reporta los Riesgos Serios de la
Transfusión (SHOT). El último es un sistema de divulga-
ción voluntario del Reino Unido de diversos acontecimien-
tos serios después de la transfusión. Los acontecimientos
301
adversos agudos incluyen las reacciones hemolíticas de la
transfusión, infusión de productos sanguíneos contamina-
dos por bacterias, lesión aguda del pulmón relacionada con
la transfusión, sobrecarga de fluido, reacciones alérgicas
graves o anafilaxis y púrpura postransfusión. Las complica-
ciones potenciales a largo plazo ocurren por infección viral
(véase antes), injerto crónico vs. enfermedad del huésped
grave en los inmunosuprimidos, y sobrecarga de hierro. En
todos los casos los riesgos de la transfusión necesitan un
balance contra los de no recibir los productos sanguíneos.
Los pacientes deben, por tanto, tener acceso e informárse-
les apropiadamente sobre los riesgos.
Lecturas adicionales
Guidelines for Pretransfusion Compatibility Procedures in Blood
Transfusion Laboratories. Transfusion Med 1996; 6: 273-283.
Issitt PD. Applied Blood Group Serology, 3rd edn. 1985: Montgo-
mery Scientific; Miami, FL.
Knight RC, DeSilva M. New technologies for red cell serology,
Blood Rev 1996; 10: 101-110.
Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M. Blood Transfusion
in Clinical Medicine, 9th edn. 1993: Blackwell Scientific,
Oxford.
 32
Citometría de flujo y biología molecular
en la hematología
Ian Chant
Introducción
La utilidad diagnóstica de la citometría de flujo y de la bio-
logía molecular continúa extendiéndose dentro de diversas
áreas de la hematología clínica. La combinación de una
aproximación inmunobiológica y molecular al diagnóstico
y a la vigilancia del paciente ha demostrado ser más útil
respecto de las neoplasias sanguíneas que en cualquier otra
área de la biología del cáncer.
En la citometría de flujo, el desarrollo de nuevos ana-
lizadores automatizados, de mesa de trabajo y las combi-
naciones de anticuerpos monoclonales disponibles en el
comercio permite una aproximación multiparamétrica al
diagnóstico. Con ello se logra una definición exacta de la
inmunofenotipificación de células específicas. La acumula-
ción de datos de inmunofenotipificación es importante, no
sólo desde un punto de vista del diagnóstico sino también
en términos de la evaluación pronóstica. En diferentes neo-
plasias hematológicas, la expresión o la ausencia de ciertos
antígenos muestra una importancia pronóstica. Además,
la citometría de flujo ahora se utiliza en la vigilancia del
tratamiento, en particular en términos de la detección de
enfermedad residual mínima.
De manera similar, la biología molecular se continúa
extendiendo como herramienta indispensable en el diag-
nóstico y vigilancia de la enfermedad. Las tecnologías
moleculares más importantes de la hematología de diag-
nóstico son la hibridación in situ fluorescente (FISH) y las
metodologías de la reacción en cadena de la polimerasa
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
(PCR). Las estrategias moleculares son únicas en la detec-
ción de alteraciones genéticas específicas que se observan
en las neoplasias sanguíneas. Además, la demostración de
la clonalidad en los desórdenes linfoproliferativos se con-
sigue con técnicas moleculares.
La importancia de un estudio del fenotipo inmunológico
y molecular combinado para el diagnóstico de la leucemia y
del linfoma se demuestra en una publicación reciente de la
Organización Mundial de la Salud (OMS), que las clasifi-
ca en neoplasias hematopoyéticas y linfoides. Este sistema
relaciona clasificaciones anteriores con nuevos datos ge-
nerados a partir de la citometría de flujo y de la biología
molecular, al incorporarlos dentro de un sistema con im-
portancia clínica. Esto se ejemplifica por el desarrollo de
las modalidades del tratamiento enfocadas a las alteracio-
nes genéticas específicas.
En otras áreas de la hematología, la citometría de flu-
jo y la biología molecular continúan evolucionando como
herramientas indispensables para el diagnóstico clínico.
La base genética de las hemoglobinopatías se continúa
esclareciendo, mientras que las técnicas moleculares son
cada vez más importantes en el diagnóstico de las coagu-
lopatías.
En este capítulo se delinean los principales usos de es-
tas dos tecnologías en el laboratorio de hematología y se
ilustra cómo la combinación de la información inmunobio-
lógica y molecular produce un profundo impacto sobre el
diagnóstico y la comprensión de la biología de las altera-
ciones hematológicas.
304 CAP. 32 CITOMETRÍA DE FLUJO Y BIOLOGÍA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGÍA

Citometría de flujo e inmunofenotipificación Cuadro 32-1 Un panel de anticuerpos usados como primera línea
para determinar el linaje y la diferenciación en leucemias agudas
El uso más importante de la citometría de flujo en el labo-
ratorio de hematología diagnóstica es la identificación del Linaje CD3 Pan-T (también CD3
linaje celular en leucemias y linfomas. La expresión de an- linfoide citoplásmico)
tígenos de superficie celular que dependen del linaje y de la CD7 Pan-T
diferenciación permite el uso de anticuerpos monoclonales CD19 Pan-B
específicos, marcados con fluorocromos, para detectar es- CD10 Pre-B
tos antígenos. Los anticuerpos monoclonales que recono- CD79 Pan-B (expresión
citoplásmica)
cen epítopos específicos de antígenos son identificados por
Linaje CD13 Granulocitos, monocitos
el grupo de designación numérica (CD). En el momento de
mieloide CD33 Progenitor mieloide, monocitos
escribir este capítulo, se han asignado cerca de 250 núme- CD14 Monocitos
ros de CD y muchos de éstos son en particular importantes CD64 Monocitos
en la inmunofenotipificación de células hematopoyéticas. CD15 Granulocitos, monocitos
La aproximación al diagnóstico de la leucemia y del CD117 Progenitor mieloide
linfoma utiliza un panel de anticuerpos monoclonales que MPO Mieloperoxidasa
identifica el linaje específico de una población celular, y Linaje sin HLA-DR Célula progenitora
provee un fenotipo inmunológico específico para una su- restricción CD34 Célula progenitora
puesta población de células malignas. Junto con la infor- Tdt (Expresión nuclear)
mación morfológica y molecular, este dato de la citometría
de flujo es una herramienta esencial en la clasificación de la
célula maligna. Cuadro 32-2 Clasificación de leucemias mieloides agudas me-
diante el sistema Francés-Americano-Británico (FAB)

Inmunofenotipificación de leucemias agudas AML M0 AML con inmadurez

El objetivo de la fenotipificación inmunológica en una leu-
cemia recién diagnosticada es sobre todo discriminar entre
la leucemia mieloide y la linfoide. Esto puede conseguir-
se usando un panel relativamente pequeño de anticuerpos
monoclonales, que detectan antígenos específicos del li-
naje expresados en células mieloides o linfoides inmadu-
ras, discriminando leucemias mieloides agudas (AML) de
leucemias linfoblásticas (ALL). El panel inicial del linaje
primero debe diferenciar la célula B de la célula T en ALL
y permitir la definición adicional del subtipo, por ejemplo,
de marcadores monocíticos y megacariocíticos en AML.
El cuadro 32-1 muestra un panel típico de la primera línea
del anticuerpo para el diagnóstico de la leucemia aguda.
Este panel inicial incluye el linaje B (CD10, CD19, CD20,
CD22), el linaje T (CD2, CD3, CD7) y los marcadores
mieloides asociados (CD13, CD33, CD117), otros más que
ofrecen la información sobre el grado de diferenciación ce-
lular (TdT, CD34).
Leucemias mieloides agudas
Los marcadores mieloides específicos más útiles usados
para discriminar las células mieloides de aquellas de origen
linfoide son CD13, CD33 y CD117. La expresión de antí-
genos linfoides está ausente en células AML, a excepción
de CD7 y de Tdt, que pueden ser positivos en pocos casos.
AML Ml AML con maduración mínima
AML M2 AML con maduración
AML M3 Leucemia promielocítica aguda
AML M4 Leucemia monocítica aguda
AML M5a Monoblástica aguda sin diferenciación
AML M5b Monoblástica aguda con diferenciación
AML M6 Eritroleucemia aguda
AML M7 Leucemia megacariocítica
Las AML son clasificadas por el sistema Francés-Ame-
ricano-Británico (FAB) sobre fundamentos morfológicos
y citoquímicos (cuadro 32-2). En AML, aunque no hay
marcadores específicos que distingan los subtipos AML
M1-M5, la inmunofenotipificación se correlaciona razo-
nablemente bien con el subtipo FAB, algunos marcadores
son expresados preferentemente dentro de ciertos grupos.
Éstos incluyen los marcadores monocíticos CD14 y CD64
en las categorías M4 y M5, mientras que los subtipos más
raros M6 y M7 de AML pueden caracterizarse por su ex-
presión de antígenos específicos para el eritrocito y para
la plaqueta, respectivamente. Las células AML M0 care-
cen de diferenciación y expresan antígenos mieloides más
CD34, el marcador hematopoyético de la célula embrio-
naria, mientras que en AML M1 hay generalmente sólo
expresión de antígenos mieloides. El cuadro 32-3 enumera
los inmunofenotipos generales vistos en AML en relación
con su clasificación FAB.
 CITOMETRÍA DE FLUJO E INMUNOFENOTIPIFICACIÓN 305

Cuadro 32-3 Inmunofenotipos típicos en AML correlacionados con la clasificación FAB

CD Anticuerpos M1, M2 M3 M4, M5 M6 M7

Linaje mieloide
CD11b Mo1, Leu 15     
CD13 MY7, Leu-M7     
CD14 MY4, Mo2, Leu-M3     
CD15 Leu-M1     
CD33 MY9, Leu-M9     
Linaje T
CD2 T11, Leu-5b     
CD3 T3, Leu-4     
CD5 T1, Leu-1     
CD7 3A1, Leu-9    ± 
Linaje B
CD10 CALLA, J5     
CD19 B4, Leu-12     
CD20 B1, Leu-16     
Linaje eritroide
Glucoforina A D2.10     
CD71 T9     
Linaje megacariocito
CD41 gpIIb/IIIa     
CD42 gpIb     
CD61 gp/IIIa     
Célula embrionaria
CD34 MY10, HPCA-1     
CD38 Leu-17     
No dependiente de linaje
HLA-DR Ia, 13     

La clasificación reciente de la OMS de AML pone énfa-
sis sobre las características morfológicas, inmunofenotípicas
y moleculares, por lo que la AML se clasifica de acuerdo
con las alteraciones genéticas recurrentes específicas, y
éstas se relacionan a menudo con perfiles inmunofenotípi-
cos específicos. En casos de AML, donde no son eviden-
tes tales alteraciones genéticas, éstos se describen según su
grado de diferenciación y/o de diferenciación a lo largo de
linajes monocítico, megacariocítico o eritroide. Así que, el
inmunofenotipo es esencial en la caracterización de las cé-
lulas leucémicas de la misma forma que su utilización en el
sistema FAB.
de los primeros antígenos superficiales en el desarrollo de
la célula T es CD7, presente en todas las células T-ALL.
Las leucemias linfoblásticas de célula B pueden clasifi-
carse dentro de tres grupos, de acuerdo a su grado de ma-
duración, que se relaciona con un fenotipo generalmente
característico. ALL de célula nula, una leucemia inmadura,
tiene células que expresan marcadores de célula B (CD19,
CD22) más TdT y CD34. La ALL común se distingue por
la presencia de la expresión de CD10, junto con los antíge-
nos de célula B y TdT. Las células B-ALL expresan todos
los antígenos de célula B comunes pero se distinguen por
la ausencia de TdT y de CD10.

Leucemias linfoblásticas agudas (ALL) Desórdenes linfoproliferativos crónicos

Las leucemias agudas de origen linfoide se clasifican ruti-
nariamente según su origen, de célula B o de célula T. Las
células ALL de célula T expresan uno o más de los antíge-
nos de célula T (CD2, CD3, CD7) y Tdt. El antígeno CD3
se expresa en el citoplasma en los inicios de la maduración
de la célula T y es el marcador más útil para T-ALL. Uno
La citometría de flujo es una herramienta esencial en el
diagnóstico de desórdenes linfoproliferativos cronicos o
maduros. La inmunofenotipificación se diseña para de-
mostrar la naturaleza de la célula B o T de la célula ma-
ligna, y para la clonalidad potencial de la expresión
superficial de la cadena ligera  o  sobre las células B. La
306 CAP. 32 CITOMETRÍA DE FLUJO Y BIOLOGÍA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGÍA

aproximación, es para usar un panel de primera línea de an- citometría de flujo como intensidad de la fluorescencia.
ticuerpos específicos para un número de antígenos de célula Por ejemplo, en la leucemia linfocítica crónica (CLL), las
B y T, que identifican la clonalidad o la expresión del antí- células B maduras coexpresan CD5 (un antígeno normal-
geno anormal. Un panel de segunda línea puede aplicarse en mente presente en las células B) más CD23. En CLL, los
forma selectiva de acuerdo a estos resultados, más algunas antígenos CD19 y CD20 de célula B están subregulados,
indicaciones morfológicas o clínicas pertinentes. El cuadro al igual que la expresión de cadena ligera superficial. Por
32-4 ilustra paneles de primera y segunda línea típicos. el contrario, las células del linfoma de linaje B muestran
Las malignidades de la célula B representan la mayor fuerte reactividad con CD19, CD20 y con cadenas lige-
parte de los desórdenes linfoproliferativos maduros, y és- ras superficiales  o . En casos donde un diagnóstico de
tos se relacionan por lo general con patrones particulares leucemia de célula pilosa se sospeche sobre bases mor-
de la expresión del antígeno de célula B. Además de la fológicas o clínicas, se utilizan anticuerpos para CD11c,
presencia o ausencia de ciertos antígenos, la interpreta- CD25 y CD103, mientras en casos potenciales de posible
ción de datos inmunofenotípicos necesita considerar la proliferación celular linfoplasmacítica o plasmática, se
intensidad de la expresión del antígeno, demostrada por incluyen anticuerpos contra CD38 y CD138.
Los desórdenes linfoproliferativos de la célula T ex-
Cuadro 32-4 Un panel de primera línea para la investigación
hiben que un traslape de la expresión del antígeno CD y
de una linfocitosis para establecer el linaje celular B y T
las células malignas muestran a menudo pérdida del an-
tígeno o la expresión anormal de los marcadores de cé-
Anticuerpo Linaje lula T. Ciertos marcadores son característicos, como la
Linaje T CD2 Células T, células NK expresión importante de CD25 en la leucemia de célula T
CD3 Pan-T del adulto (ATLL), el incremento de reactividad con CD7
CD4 Colaborador T en la leucemia prolinfocítica de célula T del adulto, y la
CD8 Supresor T expresión de CD56 en la leucemia del linfocito granular
CD7 Pan-T grande (LGL).
Linaje B CD19 Pan-B En los desórdenes de las celulas B y T, el diagnóstico
CD20 Pan-B se basa no sólo en el patrón inmunofenotípico revelado por
CD22 B madura
los paneles del anticuerpo, sino también refiere los niveles
CD23 B inmadura, CLL
de la expresión del antígeno, como se detecta por la inten-
CD103 Célula pilosa
 SIg sidad de la fluorescencia durante el análisis citométrico de
 SIg flujo. Esto se ilustra en el cuadro 32-5, que muestra los
patrones inmunofenotípicos vistos en estos desórdenes.

Cuadro 32-5 Patrones inmunofenotípicos en los desórdenes linfoproliferativos de célula B y T.

Desórdenes linfoproliferativos de célula B

Desórdenes linfoproliferativos
de célula B CD5 CD 10 CD19 CD20 CD23 CD25 FMC7 o
CLL    (w)    (w)
PLL     (s)     (s)
NHL (difuso)     (s)     (s)
Linfoma de célula manto     (s)     (s)
Linfoma folicular         (s)
Leucemia de célula pilosa     (s)     (vs)
Desórdenes linfoproliferativos
de célula T
CD2 CD3 CD4 CD5 CD8 CD16 CD25 CD56
T-PLL        
L-GL        
Célula de Sézary        
Reactividad débil (w); reactividad fuerte (s); reactividad muy fuerte (vs); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia prolinfocítica (PLL); linfoma
no Hodgkin (NHL); leucemia linfocítica granular (L-GL).
 BIOLOGÍA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGÍA 307

Valoración de la función plaquetaria Biología molecular en la hematología

por citometría de flujo
La disfunción plaquetaria se observa en una variedad de
desórdenes sistémicos, incluyendo enfermedad renal, insu-
ficiencia hepática, desórdenes del tejido conectivo, desór-
denes mieloproliferativos y mielodisplásicos, malignidad y
enfermedad cardiovascular. La disponibilidad de anticuer-
pos monoclonales que reconocen antígenos específicos
tanto en la superficie de plaquetas inactivas como activas
proporciona los medios para la evaluación de la función
plaquetaria. Esto incluye anticuerpos para P-selectina
(CD62P), una molécula de adherencia, que se desplaza a
la superficie de la plaqueta durante la activación. Los anti-
cuerpos dirigidos contra esta molécula sólo se unen a pla-
quetas con degranulación. Los anticuerpos también están
disponibles para GPIIb/IIIa (CD41/CD61), un epítopo que
aparece cuando se activa la plaqueta. Éste resulta de un
cambio conformacional que conduce a la unión del fibri-
nógeno con la superficie plaquetaria y posteriormente a la
agregación plaquetaria.
Hasta hoy, el análisis citométrico de flujo de la función
plaquetaria no reemplaza a las pruebas clínicas estándares
para la función plaquetaria, como el tiempo de sangrado y
la agregometría plaquetaria. Esto se debe, en parte, al costo
de la prueba y a la destreza del operador, aunque la cito-
metría ofrece varias ventajas como el análisis de la sangre
completa, por lo que minimiza la activación plaquetaria y se
requieren volúmenes pequeños de sangre (20 µl); por lo tan-
to, hacen posible los estudios neonatales. Las plaquetas de
pacientes con trombocitopenia profunda también pueden
analizarse con exactitud.
El impacto más grande de las técnicas de la biología mo-
lecular en la hematología ocurre en la identificación de
alteraciones genéticas relacionadas con leucemias y linfo-
mas. La identificación de la translocación cromosómica,
que da lugar al cromosoma Filadelfia, característica de la
leucemia mieloide crónica, fue el primer cáncer humano
para el cual se estableció una base genética. De hecho,
se entiende más sobre la patogenia molecular de las ma-
lignidades hematológicas que sobre cualquier otro grupo
de cánceres humanos. El cuadro 32-6 ilustra algunas al-
teraciones genéticas selectas relacionadas con neoplasias
hematológicas.
Las herramientas principales de la biología molecular
que se emplean para detectar tales aberraciones genéticas
son la hibridación in situ, especialmente la FISH y la PCR.
Ambas técnicas tienen una sensibilidad muy alta y son más
rápidas que el análisis citogenético convencional, el DNA o
RNA pueden extraerse a partir de sangre de médula ósea
o de una gran variedad de fluidos corporales para análi-
sis molecular. Estas dos técnicas se usan para identificar
alteraciones cromosómicas y genes o mRNA anormales,
por ejemplo, la expresión de un oncogén. Éstas incluyen
rearreglos del gen inducidos por translocación que involu-
cran la activación del oncogén, más los rearreglos norma-
les del gen que implican genes de cadena pesada y ligera
de inmunoglobulina que se utilizan para demostrar la clo-
nalidad en neoplasias linfoides. Los ejemplos delineados
adelante ilustran cómo la FISH y la PCR se utilizan para
identificar estos rearreglos genéticos en neoplasias hema-
tológicas.

Tabla 32-6 Algunas de las características citogenéticas y moleculares frecuentes observadas en los neoplasmas hematológicos
que son útiles en el diagnóstico y como blancos para el monitoreo de la enfermedad

Enfermedad Cariotipo Gen anormal Uso diagnóstico

CML t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL Diagnóstico de CML
AML t(8;21)(q22;q22) AML 1-ETO AML con maduración
t(15;17)(q22;q21) PML-RARA Promielocítico agudo
inv(16)(p13;q22) CBF-MYH11 Mielomonocítico
ALL t(12;21)(p13;q22) TEL-AML1 Precursor B-ALL
t(4;11)(q21;q23) MLL-AF4 Con frecuencia presentación neonatal
t(8;14)(q24;q32) MYC desregulado Burkitt tipo ALL
t(1;14)(p32;q11) TAL1 desregulado T-ALL
t(7;9)(q34;q32) TAL2 desregulado T-ALL
Linfomas t(14;18)(q32;q21) bcl-2 desregulado Linfoma de centro folicular
t(11;14)(q13;q32) bcl-1 desregulado Linfoma de célula manto
CML, leucemia mieloide crónica.
AML, leucemia mieloide aguda.
ALL, leucemia linfoblástica aguda.
308 CAP. 32 CITOMETRÍA DE FLUJO Y BIOLOGÍA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGÍA
FISH para demostrar el cromosoma Filadelfia en CML
El cromosoma Filadelfia es el resultado de una transloca-
ción recíproca, t(9;22) (q34;q11), que causa un rearreglo
del gen que implica un oncogén celular, c-abl, y el gen
BCR (fig. 32-1). Esta reestructuración se observa en 95%
de los pacientes con leucemia mieloide crónica (CML), ge-
nerando un gen híbrido de la fusión BCR-ABL, que codifi-
ca para una proteína con actividad creciente de la tirosina
cinasa. La activación creciente de las proteínas reguladoras
del crecimiento por bcr-abl incrementa el índice mitótico y
protege a las células contra la apoptosis.
Figura 32-1 La translocación recíproca entre los cromosomas 9
y 22 produce un cromosoma 9 más largo (der 9) y el cromosoma
Filadelfia Ph1, que contiene el gen fusionado bcr-abl.
La FISH puede usarse para visualizar los genes ABL y
BCR por medio de la hibridación con sondas, de ácidos nu-
cleicos, complementarias a las secuencias de DNA en los
dos genes (fig. 32-2). Empleando una sonda marcada con
biotina para BCR, el gen BCR puede detectarse con avidi-
na-FITC, que une la sonda marcada con biotina y puede
visualizarse como puntos verdes por medio de microsco-
pia fluorescente. Una sonda para el gen ABL se marca con
digoxigenina y se detecta con antidigoxigenina-rodamina,
que emite una luz fluorescente como puntos rojos. La pre-
sencia del gen fusionado BCR-ABL sobre el cromosoma
Filadelfia, por tanto, se visualiza por los puntos rojos y ver-
des combinados.
Una gran cantidad de sondas marcadas están disponibles
en el comercio y se utilizan con frecuencia en alteraciones
genéticas observadas en leucemias y linfomas, lo anterior
permitirá posiblemente la transferencia de las metodolo-
gías FISH dentro del laboratorio de diagnóstico rutinario.
Figura 32-2 Visualización de los genes bcr y abl usando FISH
para demostrar el gen bcr-abl fusionado sobre el cromosoma Fi-
ladelfia.
Demostración de la clonalidad por estudios
de rearreglo del gen
El diagnóstico de los desórdenes linfoproliferativos se basa
en métodos inmunofenotípicos para demostrar clonalidad
y linaje celular. En las malignidades de célula B, la res-
tricción de la cadena ligera  o  puede evaluarse a me-
nudo, pero para las de célula T la clonalidad es más difícil
de determinar. Por tanto, el uso de técnicas de la biología
molecular para detectar clonalidad en células T o B es un
desarrollo diagnóstico importante.
Análisis de la clonalidad de la célula B por PCR
Durante el desarrollo de la célula B existen rearreglos de
la cadena pesada de inmunoglobulina (IgH), que involucra
regiones V (variable), D (diversidad) y J (acoplamiento),
que se fusionan para formar una unidad funcional. En una
población normal de célula B, cada célula utiliza una com-
binación diferente de segmentos V, D y J, aunado a que
existe inserción de pares de bases al azar en las uniones
V-D y D-J (fig. 32-3).
El método de PCR utiliza dos iniciadores, uno que
corresponda a una secuencia consenso, encontrada en la
mayor parte de los segmentos V, y el otro a una secuen-
cia consenso común a la mayor parte de los segmentos J.
Cuando se amplifica el DNA, la longitud del producto de
PCR se determina por el número de nucleótidos insertados
al azar durante la unión VDJ. En una población normal de
células B, cada producto de PCR posee un tamaño ligera-
mente diferente, de modo que cuando los productos de esta
amplificación se separan por electroforesis, un barrido se
observa en el gel. En el caso de una población neoplásica
de células B, todas con la misma reestructuración VDJ, se
 BIOLOGÍA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGÍA 309

Figura 32-3 Durante el desarrollo de la célula B, cada uno de los diversos segmentos V, D y J son ligados por rearreglo del gen. Usando
iniciadores V y J, el análisis por PCR del DNA del gen de la inmunoglobulina se generan varios productos de PCR en células B normales.
En un desorden linfoproliferativo de la célula B, la clonalidad es demostrada por un solo producto o banda de PCR.

crea un producto de PCR de un solo tamaño, que se vi-
sualiza por la predominancia de una banda discreta en la
electroforesis.
El análisis de la clonalidad de la célula B por PCR tiene
diferentes ventajas. Puede realizarse en sangre periférica,
médula ósea, tejido fresco o congelado y muestras inclui-
das en parafina. Se requieren muestras muy pequeñas de
DNA y, como en la hibridación in situ, los resultados están
disponibles mucho más rápido que con el análisis citoge-
nético convencional.
iniciadores de secuencia consenso para la cadena TCR
los que se usan, y de esta forma los productos amplificados
se separan por electroforesis. Una población policlonal de
célula T da lugar a un barrido en el gel de los productos
de PCR, mientras que una población monoclonal de célu-
las T malignas se demuestra por apenas una o dos bandas
distintas visibles en la electroforesis en gel.
Detección de la enfermedad residual mínima

La enfermedad residual mínima (ERM) se define como

Estudios de los rearreglos del gen receptor de la célula T aquellas células malignas que sobreviven después de la
quimioterapia inicial de remisión-inducción. La detec-
El receptor para el antígeno en la mayor parte de las células ción de una población potencial muy pequeña de células
T maduras (TCR) comprende dos polipéptidos,  y , que malignas, por ejemplo, en una de la médula ósea que está
se ligan y relacionan con la molécula CD3. Una población morfológicamente en remisión, puede tener implicaciones
más pequeña de células T tiene un heterodímero diferen- pronósticas y terapéuticas importantes. Las técnicas de
te, integrado por dos polipéptidos diferentes, designados citometría de flujo y biología molecular se emplean para
y
, que tienen un grado de homología con las cadenas  y vigilar la ERM.
, respectivamente. El desarrollo de la célula T normal im- Uno de los problemas principales con la citometría de
plica la reestructuración de estas cadenas para obtener una flujo es la identificación de un inmunofenotipo específico
población heterogénea de genes receptores de la célula T. de tumores. Sin embargo, algunos antígenos hematopoyé-
La clonalidad de las células T es una evaluación común ticos se encuentran en las células malignas en combina-
de PCR, usando el sitio TCR . Ésta es la cadena sencilla ciones que no están presentes en sangre normal o médula
más apropiada para examinar, puesto que las extensiones ósea; por ejemplo, en la mayor parte de los casos de leu-
inmaduras de la célula T pudieron no experimentar la re- cemia linfoblástica aguda de la célula T (T-ALL), las célu-
combinación , mientras el gen
se suprime durante una las malignas expresan TdT nuclear así como CD3, CD5 y
recombinación del gen. Por lo general, son tres grupos de CD1. Este patrón no se observa normalmente en células T
310 CAP. 32 CITOMETRÍA DE FLUJO Y BIOLOGÍA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGÍA
fuera del timo y puede utilizarse para demostrar células
T-ALL en sangre o en médula ósea. Otras combinaciones
inmunofenotípicas se utilizan en el análisis de ERM para
ALL de célula B y leucemia mieloide aguda (AML), con
grados variables de éxito. Un problema importante con las
técnicas inmunológicas son las limitaciones en la sensibi-
lidad, y la citometría de flujo capaz de detectar una célula
blanco de entre 104 a 105 células. La mayor parte de los
estudios de la enfermedad residual, por tanto, utilizan la
sensibilidad extrema de la PCR para identificar las alte-
raciones genéticas conocidas presentes en la malignidad
en cuestión. Por ejemplo, la detección de los genes resul-
tantes de la fusión BCR-ABL se utiliza de manera exten-
sa en el seguimiento de pacientes con CML, incluyendo
trasplantes de médula ósea posteriores. En desórdenes
linfoproliferativos, los rearreglos clonales únicos pueden
emplearse como blancos para los análisis basados en la
PCR con sondas de ácidos nucleicos específicas para las
células malignas de un paciente en particular. Tales aproxi-
maciones requieren de mucho trabajo, pero cuanta más
información llega a estar disponible desempeña un papel
importante en la evaluación del pronóstico y de la ele-
gibilidad para las diversas modalidades del tratamiento
específico.
Diagnóstico de hemoglobinopatías
La biología molecular tiene ventajas profundas en la iden-
tificación de mutaciones comunes específicas que dan
lugar a una síntesis alterada de la cadena globina. La PCR
se ha aplicado sobre todo a la detección de las mutacio-
nes puntuales, deleciones y polimorfismos del DNA, para
proporcionar una prueba de tamizaje rápida que es en par-
ticular importante en el diagnóstico prenatal. La opción de
una técnica específica depende del grado de la enfermedad
definida a nivel genético. Por ejemplo, en enfermedad de
célula falciforme el gen afectado se conoce por medio del
análisis de la secuencia del DNA, y diferentes estrategias
pueden elegirse para amplificar y analizar un perfil del
DNA de un paciente por medio de la PCR. El conocimiento
de una mutación puntual específica permite el desarrollo de
técnicas de amplificación fluorescente para el tamizaje rá-
pido. Estos métodos utilizan iniciadores oligonucleótidos
para las secuencias del DNA normales y mutantes, mar-
cadas diferencialmente con moléculas fluorescentes rojas
y verdes. Acoplando cada uno con un segundo iniciador
no marcado, los productos de PCR se pueden analizar por
fluorescencia diferencial roja y verde en un fluorómetro,
obteniéndose una técnica de tamizaje rápida.
En enfermedades como las talasemias, los genes son
clonados y secuenciados, pero las mutaciones genéticas
son heterogéneas. El acercamiento a estudios de la heren-
cia, por tanto, se basa en estudios de ligamiento, usando los
polimorfismos de longitud variable de los fragmentos de
restricción (RFLP). Éstas son mutaciones del DNA, por lo
general en secuencias del DNA no codificantes, que se he-
redan ligadas con un gen y pueden por tanto convertirse en
marcadores útiles para la detección de un gen mutante en el
diagnóstico prenatal.
Alteraciones genéticas en las coagulopatías
En cuanto a las hemoglobinopatías, se ha identificado un
número creciente de mutaciones específicas de la enferme-
dad que conducen a alteraciones relacionadas con la coa-
gulación sanguínea. La detección de mutaciones puntuales
en genes que codifican factores de coagulación se utilizan
para estudios diagnósticos y de escrutinio familiar.
Una prueba muy usada es la detección basada en PCR
de la mutación del factor V de Leiden. Se estima que 2 a
6% de la población normal lleva esta mutación, y la ho-
mocigosidad de los alelos informa que existe un riesgo
incrementado 80 veces de trombosis. La detección de la
mutación utiliza iniciadores específicos de la secuencia, un
iniciador “sentido”, que es complementario a ambos fac-
tores normales V y FV de Leiden, y un segundo iniciador
“antisentido” complementario a ambos, el alelo FV normal
o el alelo FV de Leiden. La naturaleza del genotipo de FV
puede entonces determinarse por el análisis de los produc-
tos de la amplificación, puesto que ambos, el iniciador es-
pecífico normal o el específico a FV de Leiden, amplifican
un producto.
Resumen
La citometría de flujo y la biología molecular desempeñan
conjuntamente un papel fundamental en el diagnóstico de
leucemias y de linfomas. El reconocimiento de los mar-
cadores inmunofenotípicos y genéticos anormales que se
relacionan con desórdenes hematológicos particulares con-
ducen a un análisis replanteado del sistema de clasificación
para las alteraciones hematológicas. El sistema de clasi-
ficación reciente publicado por la Organización Mundial
de la Salud (OMS) toma más en cuenta estos desarrollos
y esfuerzos para utilizar las características inmunológicas y
genéticas junto con las observaciones morfológicas. Esto
produce un sistema de clasificación que tiene más valor
clínico en términos de modalidades del pronóstico y del
tratamiento.
Los avances futuros en el tratamiento de estos desórde-
nes deben surgir de las modalidades que pueden apuntar
 LECTURAS ADICIONALES
hacia las características inmunológicas o genéticas espe-
cíficas de la enfermedad. Está claro que incluso dentro de
entidades distintas de la enfermedad, la perspectiva pro-
nóstica exacta para un paciente particular depende de una
variedad de factores, incluyendo la expresión de muchos
genes, algunos todavía no identificados. Un desarrollo
inquietante implica la técnica de los microarreglos de DNA,
que permiten la cuantificación de miles de genes. Genes
distintos que son representados por fragmentos del cDNA
sobre un sustrato sólido, miles de los cuales pueden aco-
modarse en un solo portaobjetos de vidrio. El cDNA o las
sondas de RNA marcados están preparados a partir de célu-
las del paciente y se hibridan al microarreglo. La cantidad
de sonda que hibrida al DNA blanco del microarreglo es
proporcional a la expresión del mRNA del gen correspon-
311
diente en la célula del paciente. Este cuadro muy amplio,
de gran alcance de la expresión del gen, en el futuro, cierta-
mente nos dará un conocimiento de los factores implicados
en el proceso maligno y conducirá a que se encuentre un
mejor tratamiento para los neoplasmas hematológicos.
Lecturas adicionales
Jennings CD, Foon KA. Recent advances in flow cytometry:
application to the diagnosis hematologic malignancy. Blood
1997: 90: 2863-2892.
Provan D, Gribben J (eds). Molecular Haematology. 2000: Black-
well Science, Oxford.
Stamatoyannopoulous G (ed.). The Molecular Basis of Blood Di-
seases. 2001 W.B. Saunders, Philadelphia, PA.
 33
Investigaciones hemáticas
Frank Wells
La anemia puede ocurrir por pérdida de sangre, destrucción
de eritrocitos o por una falla en la producción de éstos. El
fracaso para producir células sucede con más frecuencia
por las deficiencias separadas o combinadas del hierro he-
matínico, de la vitamina B12 y del folato. La vitamina B12
se conoce más por su nombre químico apropiado, cobala-
mina, y es como se utiliza aquí.
El punto de partida para la investigación de laboratorio de
la anemia es el conteo sanguíneo. La macrocitosis y la pan-
citopenia son hallazgos característicos en las anemias mega-
loblásticas que producen la deficiencia de cobalamina y de fo-
lato, mientras la microcitosis y la hipocromía se caracterizan
por la deficiencia de hierro. El examen microscópico de san-
gre y de médula produce los hallazgos característicos, pero en
el caso de la anemia megaloblástica no es posible distinguir la
deficiencia de folato y de cobalamina. La medición de las vi-
taminas y de hierro en la sangre es de valor significativo, pero
los resultados requieren interpretación cuidadosa, basada en
las interacciones posibles entre el folato y la cobalamina, otras
patologías coexistentes, efectos de las proteínas de captación y
la posible presencia de estados de deficiencia leve. En el caso
del hierro, una deficiencia funcional puede ocurrir en presen-
cia de reservas adecuadas de este elemento. Todos estos fac-
tores se discuten de forma breve, junto con los métodos para
esclarecer la causa de las deficiencias identificadas y la inves-
tigación del exceso de hierro.
Cobalamina (vitamina B12) y folato
La cobalamina y el folato son esenciales para un número de
transferencias de carbón simple, y en el contexto presente la
más importante de éstas se relaciona con la síntesis de DNA.
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
En la figura 33-1 se muestran de forma simplificada las vías
metabólicas que involucran las dos vitaminas. La forma acti-
va del folato, el tetrahidrofolato (THF), transporta y utiliza la
unidad de carbón simple en diferentes estados de oxidación
como 5-metil THF (>N—CH3), 5,10-metileno THF (>N—
CH2—N<) o 10-formil THF (>N—CHO). Se requiere inser-
tar dos veces carbón simple (del formado por la vía 10-formil
THF) en la síntesis de las purinas; el metileno THF se utiliza
en la conversión de uridina a timidina en la síntesis de pirimi-
dina. El 5-metil THF y la cobalamina se deben agregar juntos
para la metilación de la homocisteína a metionina. La ma-
yor parte de la metionina se convierte, además, a S-adenosilme-
tionina, un donador universal de grupos metilo requeridos en
un amplio rango de reacciones de metilación que involucran al
DNA, al RNA, a las hormonas, a los neurotransmisores, a los
lípidos de la membrana y a la proteína básica de la mielina. La
falla de esta última función provoca la degeneración subaguda
de la médula espinal relacionada con deficiencia grave de co-
balamina. Ésta también es un cofactor esencial para la mutasa,
que convierte el ácido metilmalónico a ácido succínico.
Tanto la cobalamina como el folato se presentan en las
formas unidas a proteínas en la sangre. La proteína princi-
pal de unión para la cobalamina es la transcobalamina II.
En la leucemia mielógena crónica, la transcobalamina III,
que es producida en cantidades grandes por los granuloci-
tos, puede generar falsas medidas de concentracion altas de
la cobalamina sérica.
Análisis de cobalamina y folato en sangre
Los métodos de análisis de laboratorio con frecuencia se
afectan por la necesidad de analizar grandes cantidades
314 CAP. 33 INVESTIGACIONES HEMÁTICAS
S-adenosil Homocisteína
metionina
B12
como
donador Me
Metionina
Lípidos de la membrana Formas
Proteína básica metiladas
de la mielina
Neurotransmisores
Figura 33-1 Transformaciones metabólicas que implican cobalamina (vitamina B12) y folato. Reproducida con permiso de Klee
(2000).
de muestras. Esto actúa en contra de los procedimientos
que requieren la intervención manual o de los pasos que
no pueden incorporarse fácilmente en un proceso automá-
tizado continuo. Los primeros métodos para el análisis de
ambas vitaminas dependían del crecimiento de organismos
que tienen un requerimiento absoluto por una de las vi-
taminas. Para la cobalamina se empleó Euglena gracilis
o Lactobacillus leichmannii y para el folato Lactobacillus
casei, un organismo resistente al cloranfenicol. El creci-
miento se mide por un aumento en la turbiedad del medio
de cultivo con todos los demás nutrientes requeridos en ex-
ceso. Aunque estos ensayos aún tienen valor como una me-
dición de la vitamina biológicamente activa, se sustituyen
en la práctica de rutina por los ensayos de unión proteica
competitiva.
Ensayos de unión proteica competitiva
El principio de estos análisis puede resumirse respecto a la
cobalamina y se representa de manera esquemática en la fi-
gura 33-2. Una proteína debe ligarse a la cobalamina con
mucha fuerza y se agrega específicamente a una mezcla na-
tural de esta última (la muestra) y a una forma marcada. La
proteína de unión está presente en una concentración sig-
nificativamente menor que la de la vitamina y su análogo
marcado. Las formas naturales y marcadas de la vitamina
compiten por el número limitado de sitios de enlace en la
proteína durante un periodo de equilibrio. En equilibrio,
el cociente natural de la cobalamina marcada ligada a la
proteína específica se aproxima a la misma que el cociente
natural de la cobalamina marcada en la solución original.
La cobalamina ligada entonces se separa de la solución, y
la cantidad de cobalamina marcada unida a la proteína de
5-Me-THF Otras especies
de un carbono,
5,10-
metilenoTHF,
THF 10-formilTHF
d-UMP d-TMP
Precursores y
de la purina purinas
DNA
enlace se mide. El marcador puede ser una especie fluores-
cente o una enzima, y pueden emplearse técnicas sensibles
de medición, como la quimioluminiscencia.
La comparación del resultado con una curva estándar
permite la cuantificación de la cantidad de cobalamina na-
tural en la muestra original, y tiene en cuenta que la cons-
tante de enlace para la cobalamina natural y marcada puede
no ser exactamente la misma, y que el enlace no específico
puede también ocurrir con otras proteínas séricas. Los de-
talles de este proceso varían con diferentes analizadores,
pero el principio es común en casi todos. Cuando la con-
centración de cobalamina en la muestra es muy alta, la can-
tidad marcada ligada a la proteína de enlace se aproxima a
cero, y cuando la concentración de cobalamina en la mues-
tra es cero, la unión de esta vitamina alcanza un máximo.
Los primeros ensayos competitivos de la proteína de
enlace utilizaron radioisótopos para el marcaje de la co-
balamina, pero los riesgos implicados y las dificultades en
la automatización de tales técnicas causaron que declinara
su uso.
Ensayo de cobalamina
La vitamina se separa de la proteína ligante natural, transco-
balamina II, por el hidróxido de sodio (pH 12.9). El cianuro
de potasio convierte la vitamina a su forma de cianocoba-
lamina. Los métodos anteriores utilizaban un pH más bajo,
pero involucraban la ebullición de la mezcla para liberar la
cobalamina de sus proteínas naturales de unión. El factor
intrínseco porcino (HIF) se agrega como proteína de unión
específica. En una forma particular del ensayo, la cobala-
mina libre de la muestra compite con la cobalamina que
está “marcada” en virtud de ligarse a un soporte sólido (una
 COBALAMINA (VITAMINA B12) Y FOLATO 315

Marcado Marcado Marcado Marcado

HIF HIF HIF

Marcado Marcado Marcado Marcado

HIF HIF

= cobalamina HIF = factor intrínseco porcino HIF

El cuadro cortado identifica las especies

“ligadas” medidas

En equilibrio el cociente de cobalamina natural a cobalamina marcada ligada a la

proteína específica (factor intrínseco porcino) será el mismo que el del cociente
de cobalamina natural a cobalamina marcada en la solución original. Los “conteos”
ligados se comparan con los valores encontrados en una curva de calibración
construida usando seis a ocho muestras de cobalamina de concentración conocida.

Figura 33-2 Esquema del principio del ensayo de unión proteica competitiva.

perla de plástico). Estos componentes se incuban con un an-
ticuerpo HIF conjugado con la fosfatasa alcalina (Falc-HI-
FAb). El Falc-HIFAb se inmoviliza sólo en aquellas perlas
que tienen HIF ligado. Las perlas se lavan, con lo que se li-
bran de excesos de reactivos, y la cantidad de HIF ligada se
determina por medio de la enzima fosfatasa alcalina ligada.
Si hay muy poca cobalamina en la muestra, mucho del HIF
será ligado a la cobalamina en las perlas, e inversamente, si
la concentración de cobalamina en la muestra es alta, habrá
poco HIF, y así poca fosfatasa alcalina ligada a la perla.
Aunque la secuencia de eventos difiere levemente, el prin-
cipio de este proceso puede verse idéntico al del esquema
de la figura 33-2.
Ensayo de folato
El folato puede medirse en el suero o en los eritrocitos. El
folato eritrocítico es, potencialmente, la medición más
significativa, ya que representa una visión promedio del tiem-
po de la disponibilidad de folato sobre el cual los eritrocitos
circulantes se formaron, mientras que el folato sérico es muy
dependiente de la ingestión dietética reciente. El principio
de los ensayos de folato es muy similar al de la cobalamina,
descrito antes, aunque los detalles varían considerablemente
con los diferentes sistemas analíticos. La proteína de enlace
específica usada en el análisis competitivo es la ␤-lactoglob-
ulina (un ligando del folato en la leche).
La disociación del folato de las proteínas de enlace se
logra otra vez por alcalinización con hidróxido de sodio.
Si el folato se mide en el suero y en la sangre completa,
los dos resultados pueden utilizarse, junto con el hema-
tócrito, para determinar el folato eritrocítico. El método
es más impreciso que en la medición del folato sérico
por la naturaleza aditiva del error analítico. En general,
el coeficiente de variación de un análisis que implica tres
mediciones está dado por:
316 CAP. 33 INVESTIGACIONES HEMÁTICAS
CVt ⫽ (CV21 + CV22 +CV23)
donde CVt es el coeficiente total de variación del análi-
sis y CV1, CV2 y CV3 son los coeficientes de variación de
los análisis individuales implicados, en este caso del fola-
to sérico, del folato de la sangre entera y del hematócrito,
respectivamente. La matriz más compleja del hemolizado
de la sangre entera puede también causar interferencia. Por
ello, los laboratorios pueden elegir medir el folato sérico,
porque el análisis es menos impreciso, o el folato eritrocíti-
co, porque el resultado es más significativo, o ambos.
La interpretación del ensayo se altera porque la coba-
lamina, como el folato, tiene poca precisión en el extremo
inferior del rango, y también porque los rangos de refe-
rencia del folato son a veces inadecuados, particularmente
en poblaciones con una ingesta suplementada con folato.
Diferentes métodos analíticos para el folato muestran un
sesgo que difiere, y los laboratorios deben determinar los
rangos de referencia locales.
Medidas alternativas del estado de la cobalamina
y del folato
Aunque los ensayos de estas vitaminas en la sangre dan
información valiosa, un número de factores puede causar
resultados engañosos. La cobalamina suele incrementar-
se, ya sea por desórdenes mieloproliferativos, o disminuir
por deficiencia de folato (ambas son medidas falsas), por
embarazo, carencias de proteínas de enlace y mielomato-
sis. La deficiencia de cobalamina sólo puede reducir las
concentraciones de folato intracelulares, y esto dar lugar
a folato sérico normal relacionado con folato eritrocítico
bajo y cobalamina sérica baja. Hay también evidencia de
que secuelas clínicas significativas pueden seguir a la defi-
ciencia leve de la vitamina con concentraciones séricas en
el rango normal bajo.
La figura 33-1 muestra el papel de la cobalamina y del fo-
lato en la conversión de la homocisteína (HC) a metionina.
La cobalamina sola también está implicada en la conversión
importante del ácido metilmalónico a ácido succínico. La
deficiencia de cualesquiera de las dos vitaminas resulta de
este modo en el incremento de las concentraciones séricas
de homocisteína, y la deficiencia aislada de cobalamina en
incremento de los niveles séricos y excreción del ácido me-
tilmalónico (MMA). La medición de estas dos sustancias,
HC del plasma y MMA de la orina o plasma, puede con-
firmar la deficiencia de las vitaminas, y la comparación de
los dos, distinguir las deficiencias simples y combinadas y,
en general, mejorar la especificidad de la prueba de diag-
nóstico, particularmente en los casos con cobalamina o
folato bajo en la línea fronteriza. Hay evidencia de que las
concentraciones elevadas de estos dos metabolitos pueden
detectar clínicamente deficiencia significativa de la vitami-
na antes de que ésta sea muy evidente desde la medición de
las vitaminas mismas y de que haya evidencia de macroci-
tosis. Actualmente las dificultades analíticas en la medición
del MMA y de la HC impiden su uso extenso, pero am-
bos mantienen la posibilidad de una valoración funcional
del estado de la cobalamina y del folato, que puede ser útil
en una variedad amplia de situaciones, pero en particu-
lar en los ancianos, en quienes la deficiencia marginal de
cobalamina se piensa que es relativamente común.
Investigación de los factores que generan
la deficiencia de folato y cobalamina
La deficiencia de folato es normal que sea causada por
una malabsorción o una ingestión dietética inadecuada
(o una combinación de uno de éstos con un mayor requeri-
miento, como en el embarazo). La suplementación es fran-
ca, y en algunos países los alimentos se fortifican de rutina
con folato adicionado, pero el cuidado es necesario debido
a que la administración de folato a un paciente deficiente
en cobalamina puede causar la degeneración combinada
subaguda de la médula espinal. Una causa importante de
deficiencia de cobalamina es la anemia perniciosa (AP), en
la cual las células parietales gástricas no tienen la suficiente
capacidad para producir el factor intrínseco esencial para la
absorción de cobalamina en el segmento ileal del intestino.
La investigación preliminar puede implicar la valoración de
los anticuerpos dirigidos en contra de la célula parietal gás-
trica y los del factor intrínseco. Los primeros son positivos
en 90% de los casos de AP, pero tienen especificidad esca-
sa para la condición, y están presentes en 3 a 10% de los
sujetos normales. Los anticuerpos del factor intrínseco son
completamente específicos para la AP, pero su sensibilidad
es baja; hay dos tipos, los que bloquean la unión del FI a la
cobalamina y los que bloquean la captación del complejo
IF-cobalamina por el íleo terminal. El primer anticuerpo es
el único que se mide de rutina y está presente en 50% de los
casos de AP. En el pasado, la prueba Schilling (que mide
la absorción de cobalamina radiactiva en presencia y au-
sencia del factor intrínseco agregado) se utilizó para deter-
minar la capacidad de absorber cobalamina administrada
e identificar si esto era debido a la deficiencia del factor
intrínseco (como en la AP) o por alguna otra causa, como
enfermedad ileal. La saturación anterior con cobalamina
sin marcar, administrada por inyección intramuscular, ase-
gura que toda la cobalamina marcada que se absorbe es
excretada. La prueba Schilling se utiliza menos en la actua-
lidad que en el pasado debido a los problemas implicados
 HIERRO 317

Cobalamina sérica (vitamina B12)

150 a 300 ng/L

< 150 ng/L
> 300 ng/L
(sin comprobación adicional)
Ensayo del MMA sérico Anticuerpo del factor intrínseco

≤ 0.4 µmol/L > 0.4 µmol/L Negativo

Ensayo de gastrina

> 200 ng/L* ≤ 200 ng/L Positivo*

Figura 33-3 Un procedimiento de investigación para la anemia perniciosa. *Indica que es consistente con anemia perniciosa.

en el uso de radioisótopos, y la inconveniencia general de
la prueba.
Casi 80% de los casos de anemia perniciosa tiene incre-
mento de la gastrina sérica como resultado de la aclorhidria
debido a la falla de células parietales para producir ácido
clorhídrico, de tal modo que la gastrina sérica puede tener
valor en la investigación de la AP. La ausencia del ácido gás-
trico es significativa por sí misma, ya que la falla para li-
berar la cobalamina dietética (y el folato) de las proteínas
naturales de unión en la dieta puede deteriorar la absorción.
Una prueba Schilling normal (que mide la absorción de la
cobalamina libre) es posible que suceda en un paciente que
absorbe mal la cobalamina ligada a la proteína de los ali-
mentos naturales.
Un diagrama de laboratorio para la investigación de la
anemia perniciosa se muestra en la figura 33-3. Esto evi-
ta el uso de la prueba Schilling pero implica mediciones
no disponibles de rutina en laboratorios del Reino Unido.
El ácido metilmalónico es muy raro que esté disponible, y
aunque no se carece de la gastrina, se utiliza poco en este
contexto. Debido a que la suplementación oral de cobala-
mina es ineficaz en el tratamiento de la AP, un diagnóstico
exacto es importante.
dos estados principales de oxidación, Fe(II) y Fe(III), y el
caso con el cual puede participar en la transferencia de un
electrón, resulta en una fuente potencial de radicales libres
del oxígeno, que tienen uso importante en la defensa del
huésped contra las bacterias pero que, si no se confina a
su ubicación apropiada, son demasiado perjudiciales a los
tejidos del huésped. La absorción y el transporte de hierro
están así controlados en forma rigurosa para evitar la pre-
sencia de hierro libre, y las condiciones de la sobrecarga de
hierro tiene consecuencias clínicas serias.
Mediciones de laboratorio de la deficiencia
y sobrecarga de hierro
Aparte de la hemoglobina misma, las mediciones de labora-
torio del estado de hierro con más frecuencia utilizadas son
el hierro sérico y la capacidad de unión al hierro, la ferritina
sérica, la protoporfirina zinc de la célula y, recientemente, la
concentración del receptor de transferrina sérico (TfR).
Hierro sérico y capacidad de unión del hierro

El hierro sérico es la medida más obvia del estado de hierro

Hierro
El hierro es un elemento importante, involucrado no sólo
en la síntesis de hemoglobina sino en muchas metalopro-
teínas, que contienen y no grupo hem, implicadas en la uti-
lización del oxígeno molecular. El efecto más obvio de su
deficiencia es anemia por deficiencia de hierro, pero puede
haber cambios más sutiles que resultan de su implicación
en otros procesos metabólicos. La existencia del hierro en
en el organismo, su concentración es afectada por diferen-
tes factores, incluyendo la concentración de su proteína de
unión, la transferrina. Algunas mediciones de la transferri-
na son, de esta manera, esenciales en la interpretación de
la concentración del hierro sérico, tanto por la medición
directa de la proteína como para valorar químicamente la
capacidad de unión del hierro sérico, que es equivalente a la
concentración de transferrina.
318 CAP. 33 INVESTIGACIONES HEMÁTICAS
Ferritina
La ferritina se compone de 24 subunidades de proteína
alrededor de un núcleo, que puede contener hasta 4 500
átomos de hierro y comprende la forma principal de alma-
cenamiento de hierro disponible encontrada en la mayor
parte de los tejidos del cuerpo. En la forma desnaturaliza-
da, la ferritina forma hemosiderina. La concentración de
ferritina en el plasma se relaciona de manera directa con el
nivel de reserva de hierro, con cada µg/L de ferritina sérica
que equivale a casi 8 mg del hierro de reserva. Es también,
sin embargo, una proteína de fase aguda, la concentración
de la cual se eleva en respuesta a la infección, a la inflama-
ción y a la malignidad, y que pueden dar lugar a concen-
traciones “normales” de ferritina sérica en un paciente con
deficiencia de hierro y enfermedad inflamatoria.
Protoporfirina zinc (ZPP)
En la síntesis de hemoglobina, la enzima ferroquelata-
sa inserta el hierro (II) dentro del sistema de anillo de la
protoporfirina para producir grupo hem. En ausencia del
hierro adecuado, el zinc se inserta (otra vez enzimática-
mente) y la protoporfirina zinc permanece en el eritrocito
durante toda su vida. La concentración de ZPP aumenta
cuando el hierro es inasequible en la médula ósea, debido a
una deficiencia simple o a una deficiencia de tipo funcional
de hierro en presencia de reservas adecuadas de éste. Esta
última situación corresponde a la anemia de la enfermedad
crónica. La medición de ZPP tiene el mérito de identifi-
car la disponibilidad disminuida de hierro en la médula,
pero no siempre proporciona información directa sobre
las reservas de hierro. El aumento de ZPP también refleja
problemas antiguos en la síntesis del grupo hem (en el or-
den del periodo de vida de la célula) y puede ser normal en
la deficiencia de hierro de inicio rápido que causa la pérdi-
da gastrointestinal de sangre, por ejemplo. Aunque rara vez
es un problema interpretativo, la ZPP también aumenta en
la toxicidad por plomo.
Receptor de transferrina sérico (TfR)
Los eritrocitos nucleados en la médula ósea transportan la
mayor parte de los receptores de transferrina, aunque tam-
bién existen en otras células en cantidades que reflejan los
requerimientos de hierro de las mismas. Estos receptores,
situados en la membrana celular, internan la transferrina y,
después de liberar su hierro regresan al fluido extracelular.
El receptor de transferrina (TfR) consiste en dos subunida-
des idénticas de proteína de masa molecular de 95 kDa. La
síntesis del TfR es controlada por el suministro de hierro,
disminuyendo cuando la célula está repleta de ion. El TfR
está presente en el plasma, ligado a la transferrina, y su
concentración en el plasma o suero refleja el número de re-
ceptores celulares de transferrina y, siempre que las reser-
vas de hierro sean adecuadas, el TfR refleja el número de
eritrocitos en desarrollo en la médula ósea. La deficiencia
de hierro produce un incremento en el TfR sérico en pa-
ralelo con un aumento en los receptores celulares. El TfR
sérico elevado puede reflejar disponibilidad disminuida de
hierro, o eritropoyesis elevada, o ambos.
Investigación por sospecha de deficiencia de hierro
El conteo sanguíneo es la primera línea de la investigación.
Índices hematológicos más específicos, como el porcenta-
je de células hipocrómicas, son vistos por muchos autores
como de las mejores medidas de la deficiencia de hierro.
Medición de la ferritina sérica
El análisis de la ferritina sérica utiliza un ensayo de dos
sitios o inmunométrico. En contraste con el ensayo de
competencia por las proteínas de enlace descrito para la
cobalamina y el folato, la concentración de los anticuer-
pos antiferritina utilizados para capturar ferritina es muy
superior a las concentraciones normales de ésta. La que se
encuentra en la muestra del suero la capturan eficazmente
los anticuerpos antiferritina sobre un soporte sólido (gra-
no o celdilla). Un segundo anticuerpo antiferritina, que se
une a un epítopo diferente sobre la molécula de ferritina,
se agrega, también en exceso. Este segundo anticuerpo
forma un emparedado con la ferritina en el centro. El se-
gundo anticuerpo lleva un marcador; originalmente un
radioisótopo, pero ahora es más común que se sustituya
con una enzima o una especie fluorescente. Después de
lavarlo para remover todos los reactivos no unidos al gra-
no o la celdilla, se agrega el sustrato que reacciona quí-
micamente con el anticuerpo marcado para dar una señal
apreciable, que se compara con aquella que se produce
por una serie de estándares. Porque el método confía en
un exceso de ambos anticuerpos, hay una posibilidad de
que las concentraciones excepcionalmente altas de ferri-
tina puedan saturar los anticuerpos y dar valores bajos
(el efecto “gancho a dosis-altas” [high-dose hook]). Hay
medios de diseño de ensayo que minimizan este riesgo,
pero en caso de duda la muestra del suero se analiza en di-
lución, y si el efecto “gancho” está presente, la muestra
diluida exhibe un valor aparente más alto para la ferriti-
na sérica. El ensayo inmunométrico se muestra de mane-
ra esquemática en la figura 33-4.
 HIERRO 319

Anticuerpo antiferritina (1)

Ferritina

Anticuerpo antiferritina marcado (2)

El cuadro cortado identifica las muestras marcadas medidas

Figura 33-4 Esquema del ensayo inmunométrico de dos sitios para la ferritina.

Medición de protoporfirina zinc portaobjetos, sufre reabsorción mínima por la hemoglobina

Alguna confusión existe con respecto a la relación de la
ZPP y la protoporfirina libre, principalmente porque los
primeros métodos de medición de la ZPP implicaron la
extracción ácida, que removía el zinc para dar protopor-
firina libre. Excepto en porfirinas raras, la protoporfirina
libre abarca 5% o menos de la porfirina que no es del
grupo hem total en el eritrocito, la mayor parte que exis-
te como ZZP.
La protoporfirina zinc absorbe la luz de longitud de
onda de alrededor de los 425 nm (banda Soret) y fluoresce,
emitiendo luz a una longitud de onda de 595 nm. El método
más común de medir la protoporfirina zinc implica emplear
la técnica de la fluorimetría de cara frontal. Una gota de
sangre entera es pretratada con un reactivo que convierte
la hemoglobina a cianohemoglobina y elimina el efecto de
interferencia del contenido variable de la oxihemoglobina.
La sangre diluida se coloca en un portaobjetos y un haz de
luz incidente (415 nm) se dirige sobre el lado más bajo del
portaobjetos. La capa de eritrocitos sobre la superficie de
cristal plana absorbe la luz incidente, y la ZPP emite luz
fluorescente a 595 nm que se dispersa en todas las direc-
ciones. Aquella luz emitida hacia abajo, por detrás del
y se detecta con un tubo fotomultiplicador. La concentra-
ción de ZPP se expresa como µmol ZPP/mol del hem. La
interferencia surge de la hemólisis, de la bilirrubina sérica
alta o de las concentraciones de riboflavina. Lavando los
eritrocitos se remueven estas interferencias, pero esto con-
sume tiempo.
Medición del receptor de transferrina sérico
La medición del TfR sérico se realiza con un ensayo inmu-
nométrico de dos sitios, similar en principio al de la ferriti-
na sérica. El análisis es un ensayo inmunoabsorbente liga-
do a enzima (ELISA). Desafortunadamente, las diferencias
en los procedimientos que se utilizan para purificar los re-
ceptores de transferrina ligada a la membrana que se usan
como estándares en el ensayo caen en rangos de referencia
que varían con el sistema de ensayo particular, aunque las
diferencias cualitativas entre los grupos de pacientes son
similares, independientemente de la formulación del ensa-
yo. Gran parte del rango de referencia no lo afecta la edad
y el sexo (a diferencia de, p. ej., la ferritina), aunque la
información en niños y bebés es escasa. La deficiencia de
320 CAP. 33 INVESTIGACIONES HEMÁTICAS
hierro resulta en un aumento triple a cuádruple de la con-
centración de TfR sérico comparada con la normal.
Medición del hierro sérico y de la capacidad
de unión del hierro
El hierro en el suero está en la forma Fe(III) y ligado a la
transferrina. A un pH menor de 4.5 y en la presencia de ácido
ascórbico como agente de reducción, el hierro trivalente es
liberado de la transferrina y reducido a Fe(II). Entonces se
forma un complejo con un cromóforo, por ejemplo, fereno
[3-(2-piridil)-5,6-bis-2-(ácido 5-furil sulfónico)-1,2,4-triazi-
na] o alternativamente ferrozina. Se mide la absorbancia del
complejo hierro-fereno a 700 nm. Este método es homogé-
neo (no implica precipitación de proteína), la mezcla de la
reacción contiene detergente para mantener la proteína en
solución, y tiourea para minimizar la interferencia del cobre.
La capacidad de enlace del hierro puede medirse al adi-
cionar exceso de solución Fe(III) para saturar totalmente la
transferrina y dejar un poco de hierro libre. Después de la re-
ducción con ácido ascórbico, el hierro libre se mide como un
complejo fereno a un pH 8.6, pH al cual el hierro ligado a la
transferrina permanece inasequible. La solución entonces se
acidifica y el ensayo del hierro se repite. El aumento en éste
debido a la acidificación es la capacidad de enlace del hie-
rro del suero, que es equivalente al ligado a la transferrina.
De manera alternativa, la transferrina puede medirse
directo por métodos inmunológicos. Éstos implican la for-
mación de los complejos antígeno-anticuerpo en solución
entre la transferrina y los anticuerpos antitransferrina. La
concentración de estos complejos se mide por su capacidad
para dispersar la luz. O la disminución de la luz transmitida
se mide en un espectrofotómetro (turbidimetría) o la luz
dispersada real se evalúa con detectores a 90° de la trayecto-
ria de la luz transmitida (nefelometría). La estandarización
del ensayo de la transferrina presenta algunos problemas,
y hay poco que elegir entre el ensayo de la transferrina y la
capacidad de unión del hierro como métodos de medición
de la concentración de transferrina.
El lugar de las pruebas de laboratorio en la investigación
de la deficiencia de hierro
En casos sencillos, ninguna otra investigación de labora-
torio puede ser necesaria cuando se identifica una anemia
microcítica hipocrómica y el tratamiento con hierro oral
es acertado, aunque la recurrencia de la anemia en presen-
cia de ingesta normal de hierro de la dieta requiere expli-
cación. Una posible malabsorción o la pérdida oculta de
sangre del aparato digestivo pueden requerir endoscopia u
otros modos de investigación.
Un problema diagnóstico importante ocurre durante
la diferenciación de la anemia por deficiencia de hierro
(IDA) y la anemia por enfermedad crónica. Esta última
puede presentar un cuadro normocítico, normocrómico o
microcítico, hipocrómico, y surgir en presencia o ausencia
de reservas adecuadas de hierro. Es posible definirla como
una anemia hipoproliferativa que ocurre en relación con la
infección, la inflamación o la enfermedad neoplásica. Se
caracteriza por valores bajos de hierro sérico, transferri-
na sérica y porcentaje de saturación de la transferrina, in-
cremento de la ferritina sérica, aumento de las reservas de
hierro reticuloendotelial, incremento de la ZPP, elevación
moderada del TfR y absorción reducida de hierro. Ocurre
también un acortamiento moderado del periodo de vida
del eritrocito. El mecanismo exacto del proceso todavía no
está totalmente aclarado y el metabolismo desordenado del
hierro no es el único elemento, pues la entrega de éste a
la médula eritroide se mantiene como una posibilidad y la
terapia con eritropoyetina puede corregir la condición, pero
no la deficiencia de hierro. El efecto de las citocinas infla-
matorias parece central. La anemia por enfermedad crónica
puede distinguirse de la anemia por deficiencia de hierro
examinando la médula, con la presencia de hierro que se
puede teñir en las células reticuloendoteliales, excluyendo
la ADH como una causa de anemia, pero esta prueba no es
conveniente para un uso extenso.
El hierro sérico tiene defectos importantes como prueba
de deficiencia de hierro. Muestra variación diurna significa-
tiva y también es afectado por la ingesta de comida recien-
te, lo que da por resultado alta variabilidad intraindividual.
En la anemia por enfermedad crónica, el hierro sérico está
disminuido y es independiente de las reservas y, aunque el
uso de la saturación de la transferrina supera parcialmen-
te esto (como la transferrina o IBC está deprimido en la
misma situación), su valor predictivo no es alto. La estro-
genización (en embarazo, anticonceptivo oral o terapia de
reemplazo de estrógeno) puede confundir la situación al
incrementarse la transferrina sérica (e IBC).
La ferritina sérica en una persona saludable indica un
buen índice de reservas de hierro corporales, pero la in-
flamación y la enfermedad del hígado causan su aumento,
independientemente del estado del hierro, lo cual perjudi-
ca su valor diagnóstico. Aunque una ferritina sérica menor
de 20 µg/L es congruente con la ADH y una superior a
100 µg/L torna improbable la ADH, incluso en presencia
de enfermedad inflamatoria, esto deja a un grupo grande de
pacientes con valores intermedios de ferritina en quienes el
diagnóstico puede ser incierto.
La protoporfirina zinc, a diferencia de la ferritina sérica,
no se ve afectada por enfermedad del hígado, ni directa-
mente por la reacción en fase aguda; que sea positiva en la
toxicidad por plomo es un problema raro. En la enferme-
 HIERRO
dad reumatoide se correlaciona con el porcentaje de células
hipocrómicas, pero se incrementa con frecuencia cuando la
demora es normal y en la falla renal se eleva no específi-
camente cuando el porcentaje de las células hipocrómicas
es normal. Esta es una prueba de deficiencia funcional, la
cual se incrementa cuando el hierro es inasequible al mo-
mento de la eritropoyesis, y esto es cierto en la anemia por
enfermedad crónica. Aunque se dice que no es afectada
por el rasgo de talasemia, hay evidencia de que 50% de los
pacientes con esta condición tiene ZPP elevada; pero no
es diagnóstico de deficiencia de hierro, aunque proporcio-
na información sobre la disponibilidad funcional de hierro
para el desarrollo del eritrocito, excepto posiblemente en el
rasgo de talasemia.
El receptor de la transferrina sérica está relacionado con
las reservas de hierro en individuos saludables y aumenta
cuando existe deficiencia de hierro u ocurre incremento de
la eritropoyesis. Esta última situación incluye eritropoye-
sis ineficaz. En la enfermedad crónica, las concentraciones
aumentan, incluso en presencia de reservas adecuadas de
hierro, relacionadas posiblemente a la incidencia de eri-
tropoyesis ineficaz. Sin embargo, una relación con las re-
servas de hierro aún permanece. El cociente de TfR sérico
a ferritina sérica ha mostrado ser una medida excelente de
las reservas en el estado de salud, y un mejor indicador de la
deficiencia de hierro en la anemia por enfermedad crónica
que la ferritina sérica sola. El TfR sérico puede ser parti-
cularmente útil en el embarazo. El embarazo puede causar
anemia por hemodilución, la cual se relaciona con frecuen-
cia con una ferritina disminuida, incluso en presencia de
reservas adecuadas de hierro, y con un aumento en IBC
causado por los estrógenos puede sugerir deficiencia de
hierro. El TfR sérico parece, desde la evidencia preliminar,
ser relativamente afectado por el embarazo, permitiendo su
uso en la valoración de la deficiencia de hierro.
Aunque su naturaleza manual la hace inadecuada en
algunos laboratorios, la ZPP es una prueba de primera lí-
nea buena y económica para medir la deficiencia de hierro,
apreciable en la muestra inicial del conteo sanguíneo com-
pleto. La ferritina es una buena prueba de segunda línea, si
se reconocen sus deficiencias. El receptor de transferrina
sérica puede asumir una mayor importancia cuando está
disponible fácilmente en los analizadores principales y su
papel es definido con más claridad, pero hay probablemen-
te poco qué ganar en el presente al agregar la medición del
TfR sérico al rango existente de las pruebas disponibles
en los laboratorios. Es importante, cuando nuevas pruebas
de laboratorio se introducen, que los protocolos de inves-
tigación sean revalorados, para evitar siempre paneles más
amplios de las pruebas que se empleen sin la discrimina-
ción correcta.
321
Investigación sobre la sobrecarga de hierro
La sobrecarga adquirida de hierro ocurre conjuntamente
con las anemias hemolíticas crónicas, sobrecarga paren-
teral de hierro, o enfermedad crónica del hígado, pero el
origen está establecido desde la historia del paciente, y la
investigación y el manejo de esta condición no se describen
aquí.
La susceptibilidad genética a la hemocromatosis es co-
mún en la población general (1 en 100 a 300), aunque la
incidencia de la enfermedad sintomática es probablemente
un vigésimo de la mutación genética, condición importan-
te que se debe excluir en cualquier incidencia con elevación
inexplicada de las enzimas hepáticas, porque su potencial
es fatal pero fácilmente tratable, y el descubrimiento de
los casos índice permite la investigación de los parientes
cercanos para establecer el riesgo futuro. La primera anor-
malidad que surge es un aumento en la saturación de la
transferrina, y valores mayores de 55% en mujeres o 60%
en varones sugieren acumulación de hierro. El efecto del
alimento y la variación diurna se evitan mejor con el em-
pleo de una muestra en ayuno temprano por la mañana. La
ferritina sérica aumenta en una etapa posterior de la acu-
mulación de hierro, cuando el hierro hepático se eleva. Los
valores superiores a 500 µg/L son sospechosos de sobre-
carga de hierro, pero otras condiciones que implican infla-
mación deben eliminarse, y la saturación de la transferrina
también es una prueba superior en este aspecto, ya que la
enfermedad inflamatoria produce una saturación disminui-
da y menos incertidumbre del diagnóstico.
Si la hemocromatosis genética es sugerida por estas in-
vestigaciones preliminares, el análisis de la mutación del
gen de la hemocromatosis (HFE) debe realizarse, usando
una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La forma
más común de la sobrecarga heredada de hierro (cerca de
90% de los casos) está relacionada con mutaciones en el
gen para la HFE, en particular con la mutación C282Y, en
la cual la cisteína (C) en la posición 282 es sustituida por
un residuo de tirosina (Y). La otra mutación es H63D, en
la cual la histidina (H) en la posición 63 es reemplazada
por el ácido aspártico (D). La homocigosidad para la mu-
tación C282Y está relacionada con la sobrecarga de hie-
rro, y hasta 10% de los hombres y 5% de las mujeres con
el fenotipo HH/YY desarrollan sobrecarga sintomática de
hierro. La situación con los heterocigotos compuestos (p.
ej., HD/CY) no es del todo conocida y, del mismo modo,
los homocigotos para la mutación H63D (DD/CC) son se-
riamente menos afectados.
La valoración del hierro hepático no es una parte necesa-
ria del proceso diagnóstico, pero puede utilizarse para valo-
rar la gravedad de la enfermedad en pacientes seleccionados.
322 CAP. 33 INVESTIGACIONES HEMÁTICAS
El tratamiento es por venodisección regular hasta donde la
línea fronteriza de la deficiencia de hierro se alcanza.
Resumen
La investigación de las deficiencias hematínicas siempre
comienza con el conteo sanguíneo completo. La medición
de la cobalamina sérica, y del folato sérico o del eritro-
cito, o ambos, puede contribuir en la identificación de la
deficiencia específica, aunque una comprensión de las
limitaciones de las pruebas es necesaria, y de otras prue-
bas no disponibles con facilidad en la actualidad, pueden
volverse más importantes, en particular durante la investi-
gación de la deficiencia marginal. Hay diferentes medidas
de suficiencia de las reservas de hierro con ferritina que, a
pesar de sus imperfecciones, continúan siendo las mejores
pruebas fácilmente accesibles; y aunque la protoporfirina
zinc tiene un papel importante, en el futuro el receptor de
transferrina sérico puede ser la opción. Si bien el hierro
sérico, la capacidad de captación del hierro y la saturación
de la transferrina tienen una importancia menor en la va-
loración de la deficiencia de hierro, son las pruebas más
sensibles para la sobrecarga de hierro, y la presencia de
hemocromatosis genética puede ser demostrada de manera
precisa determinando la mutación del gen HFE por PCR.
La investigación de la sobrecarga de hierro puede susci-
tarse por anormalidades inexplicables de las pruebas de
función hepática.
Siempre en las pruebas de laboratorio, la interpretación
debe ser en el contexto de una valoración clínica comple-
ta del paciente y con un conocimiento basado en la evi-
dencia de las fortalezas y deficiencias de las pruebas de
laboratorio individuales.
Lecturas adicionales
Scott J M. Folate and vitamin B12. Proc Nutrit Soc 1999; 58: 441-
448.
Klee G G. Cobalamin and folate evaluation: measurement of me-
thylmalonic acid and homocysteine vs. vitamin B12 and folate.
Clin Chem 2000; 46 (8B): 1277-1283.
Spyvak J L. Iron and the anemia of chronic disease. Oncology
2002; 16: (9) suppl: 25-33.
Worwood M. Serum transferrin receptor assays and their applica-
tion. Ann Clin Biochem 2002; 39: 221-230.
Braun J. Erythrocyte zinc protoporphyrin. Kidney Int 1999; 55:
S57-S60.
Dooley J S. Diagnosis and management of genetic haemochroma-
tosis. Best Pract Res Clin Haematol 2002; 15: 277-293.
 34
Investigación de laboratorio de la hemólisis
Paul Revell
Introducción
En la vida normal, los eritrocitos se reciclan cada 120 días.
Los desórdenes hemolíticos son aquellos en que hay des-
trucción acelerada del eritrocito, acompañados por un au-
mento compensatorio en la producción eritrocítica. Si la
médula no puede “mantener” la demanda creciente para las
nuevas células, se produce anemia. La destrucción acelera-
da ocurre porque el eritrocito es anormal. Las alteraciones
relacionadas detectables en el laboratorio se muestran en
la figura 34-1 y se resumen en el cuadro 34-1. Algunas de
éstas se ilustran en la figura 34-2.
Características clínicas
La manifestación en el paciente es con frecuencia muy
inespecífica y depende de la velocidad de inicio tanto como
de la enfermedad en particular que causa la hemólisis. Las
características clínicas principales observadas en anemias
hemolíticas se resumen en el cuadro 34-2.
En las condiciones iniciales muy rápidas (p. ej., transfu-
sión sanguínea incompatible) hay postración, fiebre y dolor
de espalda con hemoglobinuria y malestar, en lugar de las
características descritas en el cuadro 34-2. Las condiciones
más crónicas alcanzan, con frecuencia, un “estado estable”
con destrucción y producción en equilibrio, aunque nor-
malmente algunos resultados de la prueba siguen siendo
anormales. Este estado estable puede apreciarse por las
exacerbaciones de la enfermedad o “crisis”. Existen cuatro
tipos principales de crisis:
1. Una crisis hemolítica la ocasiona un aumento acelerado
en la hemólisis, originado a menudo por una enferme-
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
dad intercurrente, como una infección viral. Esto causa
un aumento en la ictericia y la anemia, y salida a la cir-
culación de reticulocitos (y a veces de eritrocitos nu-
cleados) de la médula. Ésta es una faceta de una “crisis
falciforme”.
2. En una crisis aplásica la médula deja de trabajar du-
rante algún tiempo, por ejemplo en la infección del par-
vovirus. En la mayoría de las personas esto tiene poco
efecto, pero en condiciones hemolíticas el paciente pue-
de volverse con rapidez muy anémico y enfermo, puesto
que la mayor parte del tiempo cuenta con una médula
muy activa para “proseguir”.
3. Una crisis de secuestración ocurre en algunas condicio-
nes, como en la enfermedad de la célula falciforme en
niños, cuando de repente el bazo se agranda y secuestra
las células. El paciente o está muy enfermo o muere al
llegar al hospital; este caso, afortunadamente, es raro.
4. Una crisis megaloblástica la causa la médula, que fun-
ciona sin folato (normalmente) a partir de la producción
excesiva de eritrocitos requeridos para “proseguir”, y
una franca anemia megaloblástica se produce. “Mega-
loblástica” se refiere a un aspecto característico de la
médula ósea, donde los eritrocitos nucleados parecen
anormales porque la maduración del núcleo y del cito-
plasma está asincrónica entre las células.
Control general del paciente
Cuando el paciente se presenta por primera vez, las prio-
ridades del diagnóstico son establecer que la hemólisis
está ocurriendo (figs. 34-1 y 34-2 y cuadros 34-1 y 34-2)
324 CAP. 34 INVESTIGACIÓN DE LABORATORIO DE LA HEMÓLISIS

Contiene suero intravascular Hemoglobina libre (y matanemalbúmina)

Bilirrubina sin conjugar

Vasos
sanguíneos
Extravascular

Destrucción
Eritrocitos
prematura
anormales
en el bazo

Descenso en Hb

Bilirrubina sin conjugar

Riñón

Urobilonógeno
Hígado
Hemoglobiona
Médula Hemosiderinuria
ósea Urobilinógeno
Hiperplasia
del eritrocito

Estercobilinógeno

Intestino
Eritrocitos Utilización de
incrementados hierro y fosfato

Figura 34-1 Características fisiopatológicas de la hemólisis. Si la destrucción ocurre dentro de los vasos sanguíneos, entonces se libera la
hemoglobina, y aparece en la orina (véase también la fig. 34-2). Si la destrucción es extravascular (del bazo, a veces del hígado) entonces
esto se evita pero se libera excesiva bilirrubina sin conjugar, lo que puede ocasionar que el paciente presente ictericia (tonalidad amarilla; o
amarillo claro, si también es anémico, se identifica de manera temprana en la esclerótica ocular) y el producto secundario, urobilinógeno, se
detecta en la orina durante la prueba (no decolora la orina). El aumento en la producción crea un cambio de eritrocitos a formas más jóvenes,
que genera policromasia, un matiz azul, sobre el frotis de la sangre periférica, que se refleja en una cuenta aumentada de reticulocitos. Los
eritrocitos nucleados, por lo general presentes sólo en la médula, también pueden observarse en la sangre en la hemólisis activa.

e intentar determinar si el proceso es lento o rápido, intra
o extravascular. Las pruebas para encontrar la causa de la
hemólisis entonces continúan de manera lógica. Los pa-
cientes necesitan por lo general vitamina B12 y que se veri-
fiquen los niveles de folato y después se comience a aplicar
las dosis del tratamiento con ácido fólico por vía oral. La
transfusión es necesaria en estados clínicos extremos. Si se
encuentra la causa, entonces el tratamiento específico se
inicia, por ejemplo, con corticoesteroides por vía oral para
hemólisis inmunitaria. Las complicaciones pueden nece-
sitar tratamiento, como el retiro de los cálculos biliares
formados por el pigmento, que son sintomáticos en la es-
ferocitosis hereditaria. La extirpación del bazo (esplenec-
tomía, para reducir la destrucción) tiene que considerarse
en algunos casos.
La hospitalización del paciente es necesaria en tiempos
de estrés (embarazo, cirugía, etc.), y siempre es necesario
apoyar y educar al paciente y a la familia en condiciones
 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS 325

Cuadro 34-1 Anormalidades de laboratorio en la hemólisis Cuadro 34-2 Características clínicas de la hemólisis

No todas se encuentran en cada paciente. La gravedad relativa La información clínica proporcionada por el médico puede
de cada anormalidad depende del estadio que se ha alcanzado ayudar en la selección de investigaciones primarias y
de la enfermedad. La vida del eritrocito reducida se mide poco secundarias cuando se sospecha hemólisis.
en forma directa (véase la fig. 34-5 como ejemplo). En general:
• Historia de episodios anteriores
• Hemoglobina baja si está descompensada • Asociación de episodios con: infecciones
• Cuenta del reticulocito incrementada • Anemia fármacos
• Bilirrubina incrementada (sin conjugar) • Ictericia frío
• Urobilinógeno en orina • Cálculo biliar del pigmento alimentos
• Tiempo de vida reducido del eritrocito • Úlceras en las piernas
• Eritrocitos anormales (dependiendo de la causa) • Retraso en el crecimiento
• Historia familiar de anemia/ictericia
Y si hay hemólisis intravascular:
• Bazo alargado
• Hemoglobinemia
• Anormalidades del esqueleto
• Metahemalbuminemia
• Hemoglobinuria
• Hemosiderinuria
• Haptoglobina sérica baja

Figura 34-2 Algunos hallazgos de laboratorio en la hemólisis intravascular. a) La hemoglobina se libera dentro del suero, produciendo
un aspecto “turbio-marrón”. Un suero normal se muestra para la comparación. b) Parte se aprecia directamente en la orina, causando una
decoloración similar. Esto no debe confundirse con la incidencia, mucho más común, de la hematuria, donde eritrocitos enteros aparecen
en la orina. En la hemoglobinuria, por tanto, la prueba de la tira diagnóstica para la sangre es positiva pero ningún eritrocito se muestra en la
microscopia de la orina. c) Las células del riñón pasan a la orina (contratinción roja), toman hemoglobina y se presentan como gránulos
pequeños de hemosiderina (azules). Véase también el cuadro 34-7.
326 CAP. 34 INVESTIGACIÓN DE LABORATORIO DE LA HEMÓLISIS

crónicas. Los estudios de asesoramiento genéticos y sobre tener 45% de HbS y el resto de HbA, pero cada célula será
la familia pueden ser apropiados en ciertos casos. toda HbS o toda HbA.

Desórdenes hemolíticos Anemia de célula falciforme (SS)

¡Existen centenares de diversas condiciones y se han escrito
grandes tomos de ellas! El cuadro 34-3 muestra un pano-
rama general de los amplios grupos y ejemplos comunes o
importantes. Una breve descripción de cada uno de éstos se
desarrolla para ilustrar dónde se sitúan dentro de este esque-
ma general; los capítulos anteriores dan mayor detalle sobre
algunas de las condiciones individuales. Hay también una
lista de lecturas al final de este capítulo.
Anemias de células falciformes y otras variantes
de la hemoglobina
El eritrocito contiene hemoglobina formada de cadenas de
globina alteradas. La hemoglobina A (HbA) es normal. La
HbF es una variante pero es normal en el feto. La hemo-
globina S anormal se presenta por un defecto genético que
causa la sustitución de un aminoácido en la cadena ␤ de
la hemoglobina. En estas condiciones el eritrocito contiene
hemoglobinas particulares según los genes que se portan.
Por ejemplo, en la enfermedad falciforme homocigótica
con dos genes S, el eritrocito contiene principalmente HbS
y un poco de HbF pero ninguna HbA. En el rasgo (un gen
S) contiene 45% de HbS y el resto de HbA. Vale considerar
que estos son los porcentajes en cada célula; en contraste,
un paciente con anemia falciforme homocigótica, a quien
se transfunde con sangre normal (sólo HbA) también puede
La forma desoxigenada de la Hb anormal es menos soluble
que la HbA normal (en un amortiguador de fosfato ésta
forma la base de la prueba de tamizaje para HbS). La HbS
produce eritrocitos deformes (células falciformes) debido
a la formación “tactoide”, y éstos son destruidos en el bazo
y periféricamente. Los pacientes tienen una hemoglobina
baja (5 a 10 g/dl) y con frecuencia tienen cuentas de neu-
trófilos y de plaquetas elevadas. Las células falciformes y
“con forma de bote” son visibles en el frotis sanguíneo. El
diagnóstico se realiza por electroforesis de Hb sobre gel de
agarosa a pH ácido o alcalino. Los laboratorios que mane-
jan una cantidad grande de muestras utilizan la cromato-
grafía líquida de alto rendimiento (HPLC). Una Hb baja es
suficiente para dañar el desarrollo en algunos niños. Los fe-
nómenos trombóticos se deben, sobre todo, a la morfología
falciforme de los eritrocitos, que causa dolor en los miem-
bros, y también afecta a pecho, abdomen y cerebro. El in-
farto (destrucción localizada por la carencia de oxígeno) del
bazo produce hipoesplenismo con cuerpos de Howell-Jolly
en eritrocitos sobre el frotis sanguíneo. Un cuidado médico
adecuado tiene un impacto significativo sobre la calidad de
vida y mortalidad de pacientes con esa condición.
En el rasgo de la célula falciforme (AS) la morfología
falciforme no ocurre (ya que hay menos HbS en cada cé-
lula) excepto bajo condiciones muy hipóxicas (p. ej., en un
avión despresurizado, en anestesia general). Hay poco que
ver en el frotis.

Cuadro 34-3 Desórdenes hemolíticos

Esta manera de dividir las condiciones permite, con una cantidad limitada de información clínica, guiar la comprobación subsiguiente.
HEREDADOS Defecto de la síntesis de la hemoglobina, por ejemplo, enfermedad de la célula falciforme o talasemia
Anormalidad de la membrana, por ejemplo, esferocitosis hereditaria
Deficiencia enzimática, por ejemplo, deficiencia de G6PD o PK
ADQUIRIDOS INMUNITARIOS Autoinmunitarios, por ejemplo, AIHA caliente o fría (CHAD)
Enfermedad hemolítica del recién nacido
Incompatibilidad de la transfusión
NO INMUNITARIOS Físico-mecánico, por ejemplo, válvulas cardiacas
Microangiopatías
Hemoglobinuria paroxística nocturna
 DESÓRDENES HEMOLÍTICOS 327

Enfermedad de HbC (CC) que se condensan como cuerpos de inclusión (cuerpos H,

Produce hemólisis leve y esplenomegalia, además de pro-
blemas adicionales en la deshidratación y en el embarazo.
El rasgo (AC) no es significativo para el individuo, excepto
en términos genéticos.
Enfermedad HbSC (S/C)
Crea hemólisis leve pero los pacientes pueden tener proble-
mas de morfología de célula falciforme, especialmente en
el embarazo. En algunos, ocurren problemas de retinopatía
(infartos en la parte posterior del ojo) y de destrucción ósea
(p. ej., de la cabeza del fémur).
vistos a la tinción con azul de cresilo).
Esferocitosis hereditaria
La esferocitosis hereditaria es “autosómica dominante”, es
decir, con un alelo del gen alterado una persona hereda la
condición; se encuentra por lo general en caucásicos. Hay
alteración de las proteínas contráctiles de la membrana del
eritrocito que conduce a deformabilidad reducida. Las cé-
lulas anormales son secuestradas en el bazo y se destruyen
de manera prematura. Es normal que la anemia sea leve
y que los esferocitos se observen en el frotis sanguíneo,

Enfermedad falciforme/tal (S/tal)

La gravedad depende de la cantidad de Hb normal que se

produce, que a su vez depende del gen de la talasemia espe-
cífica. Sin ninguna, entonces la enfermedad es en todo tan
grave como la forma SS homocigota.

Talasemias

En estas condiciones, existe producción alterada, en cuanto

a número, de las cadenas de globina (en lugar de la produc-
ción de tipos anormales de la cadena). Éstas comprenden
desde la ␤0-talasemia (ninguna cadena ␤) hasta las ␣-talase-
mias leves, donde hay una reducción mínima en la síntesis
de cadena ␣ y ningún problema clínico para expresarlas.
Los heterocigotos no se encuentran con el problema pero a
menudo muestran alteraciones visibles en el frotis sanguí-
neo. La ␤0-talasemia homocigota es una alteración seria que
requiere de transfusiones por toda la vida y se complica a
veces por hiperesplenismo (el bazo hiperactivo que destru-
ye todas las células sanguíneas). Los leucocitos presentan
características observables en el frotis. La falta de produc- Figura 34-3 Prueba de fragilidad osmótica. Alícuotas de san-
ción es más importante que la hemólisis de células anorma- gre oxigenada bien mezclada se agregan a una serie de concen-
les. La hiperplasia de la médula produce las deformidades traciones salinas amortiguadas, por lo general NaCl en el rango
óseas típicas de la niñez. Los niños no crecen saludables y de 0.2 a 1.2%. Las diluciones se incuban a temperatura ambiente
mueren sin la transfusión. Los sobrevivientes de la transfu- por 30 min antes de que los tubos se centrifuguen y la cantidad de
sión sufren los efectos de la sobrecarga de hierro. Si la que- hemólisis en el sobrenadante se lee espectrofotométricamente. Los
lación falla, usando cada noche un fármaco quelante oral o esferocitos son anormalmente sensibles a las soluciones hipotóni-
cas y se lisan en concentraciones más altas que los eritrocitos nor-
desferrioxamina como infusión subcutánea para aumentar
males. Una prueba de fragilidad osmótica inconclusa puede repe-
la excreción del hierro, entonces ocurren daños en la glán-
tirse incubando la muestra sanguínea por 24 h a 37ºC, antes de
dula endocrina (pituitaria, gonadal, pancreática), el hígado la comprobación. Esta modificación es mucho más sensible en la
e infiltración cardiaca, con resultado fatal, frecuentemente detección de la esferocitosis leve que el método original. El gráfico
antes de los 25 años. La enfermedad de la hemoglobina H para los eritrocitos normales aparece por lo general en el área gris;
es una forma de ␣-talasemia (¡no una variante anormal de la también se muestra un gráfico representativo para un paciente con
Hb llamada H!). Aquí la ausencia de algunas cadenas ␣ pro- esferocitosis hereditaria. Algunos laboratorios utilizan una varia-
duce exceso de cadenas ␤ para formar los tetrámeros (␤4), ción, la prueba del tiempo de lisis en glicerol acidificado.
328 CAP. 34 INVESTIGACIÓN DE LABORATORIO DE LA HEMÓLISIS
(¡pero suelen ser fácilmente confundidos!). El diagnóstico
se realiza por una “fragilidad osmótica” incrementada (fig.
34-3) y puede confirmarse por un análisis electroforético
de los componentes de la membrana del eritrocito usando
geles de poliacrilamida SDS.
Deficiencia de G6PD (glucosa 6-fosfato deshidrogenasa)
El eritrocito tiene una energía reductora que disminuye a
partir de una carencia de la primera enzima de la vía de
desviación, la pentosa fosfato del metabolismo de la glu-
cosa. Es frecuente que sea una condición recesiva ligada
al sexo: la enfermedad se expresa en varones con un alelo
del gen afectado en el cromosoma X, pero en las mujeres
se necesitan ambos alelos afectados. Las mujeres con un
alelo afectado mostrarán expresión variable, dependiendo
del cromosoma X inactivo y en qué células, según la hipó-
tesis de Lyon. Esto se observa sobre todo en poblaciones
negras y mediterráneas, y afecta a 3% de la población mun-
dial. La actividad de G6PD está presente en los reticuloci-
tos pero cae rápido y prematuramente en estos individuos.
La integridad del eritrocito, por tanto, se reduce durante la
exposición a químicos oxidantes y fármacos (p. ej., antibió-
ticos de sulfonamida). Los cuerpos de Heinz se observan en
los frotis sanguíneos preparados de manera especial. El diag-
nóstico se realiza mediante el análisis de G6PD, pero sólo en
el estado estable (no cuando hay una cantidad excesiva de
reticulocitos, p. ej., después de una crisis hemolítica). Algu-
nos de estos episodios son producidos por alimentos (clási-
camente por habas: “favismo”) y también por fármacos.
Tamizaje para la deficiencia de 6GPD
Dentro de la vía de la pentosa fosfato el NADP es reducido
por G6PD a NADPH. Este producto fluoresce bajo luz ul-
travioleta, lo que forma la base de la prueba de la mancha
fluorescente. La sangre completa se mezcla con:
• Glucosa 6-fosfato.
• NADP.
• Agente lisante (normalmente saponina).
• Amortiguador.
Esto se incuba de 5 a 10 min antes de colocarse sobre el
papel filtro, secarse y examinarse bajo luz UV de onda lar-
ga. Las muestras normales despiden luz fluorescente bri-
llante, las deficientes no, o sólo una luz escasa fluorescente.
Cualquier prueba de tamizaje anormal debe confirmarse
por un ensayo funcional de la G6PD; aquí la producción
de NADPH por G6PD se mide espectrofotométricamente,
como un cambio en la densidad óptica a través del tiempo.
Deficiencia de piruvato cinasa
La deficiencia de piruvato cinasa es una condición “au-
tosómica recesiva” (una persona manifiesta la condición
cuando ambos alelos de un gen son anormales) y otro pro-
blema enzimático, el más común de las enfermedades raras
sin G6PD. Las células llegan a tornarse deformes y lábi-
les. El frotis sanguíneo muestra poiquilocitos (eritrocitos
anormales) que son hemolizados de forma espontánea sin
estímulo de algún fármaco. Las transfusiones pueden ser
necesarias.
Tamizaje para la deficiencia de piruvato cinasa
La piruvato cinasa es el catalizador para la reacción:
ADP ⫹ fosfoenolpiruvato S ATP ⫹ piruvato
El producto de esta reacción, piruvato, avanza dentro de la
siguiente reacción, que es catalizada por lactato deshidro-
genasa (LDH):
Piruvato ⫹ NADH S lactato ⫹ NAD
NADH despedirá fluorescencia bajo luz UV de onda lar-
ga, mientras que NAD no. Por tanto, cuando la sangre com-
pleta es incubada con ADP, fosfoenolpiruvato y NADH,
en muestras normales, NADH se oxida a NAD, con una
pérdida consecuente de fluorescencia. Las muestras defi-
cientes despedirán luz fluorescente brillante. Una prueba
de tamizaje de PK anormal debe confirmarse por un ensayo
completo donde la oxidación de NADH a NAD es medida
por un cambio en la absorbancia espectrofotométricamente
en una cinética basada en el tiempo.
Hemólisis inmunitaria
Diferentes patologías (como las que se listan en el cuadro
34-4) dan lugar a eritrocitos que son el blanco de anticuer-
pos en su superficie; por lo tanto, tienen un periodo de vida
corto. La hemólisis inmunitaria se divide en el laboratorio
en “caliente” y “fría”, dependiendo de la variación de la
temperatura en la que existe actividad del anticuerpo (y de
la aglutinación) en el laboratorio, clásicamente a 37ºC en
caliente y a 4ºC en frío, aunque existe, a veces, un peque-
ño traslape. Así también como en una prueba de Coombs
(antiglobulina) directa de tamizaje amplio, que es positiva
 DESÓRDENES HEMOLÍTICOS 329

Cuadro 34-4 Causas de la hemólisis inmunitaria

Hay muchas condiciones diferentes que pueden dar lugar a eritrocitos cubiertos con anticuerpos. Aquí se muestran amplios grupos.
La división bajo condiciones “frías” y “calientes” ayuda en la decisión del tratamiento.
“Fría” Desórdenes linfoproliferativos, por ejemplo, linfoma no Hodgkin de grado bajo
Infecciones, por ejemplo, Mycoplasma pneumoniae
Enfermedad por hemaglutinina-fría (CHAD)
”Caliente” Desórdenes linfoproliferativos, por ejemplo, leucemia linfocítica crónica
Enfermedades del tejido conectivo, por ejemplo, lupus eritematoso sistémico
Farmacos, por ejemplo ␣-metildopa, usados para presión sanguínea alta

Figura 34-4 Prueba de Coombs (o antiglobulina) directa. El DCT (o DAGT) detecta eritrocitos cubiertos de anticuerpos. a) A una
suspensión de eritrocitos del paciente (ya cubiertas con el anticuerpo) se agrega b) antiglobulina de espectro amplio (p. ej., antihumana
de conejo). c) La aglutinación ocurre. El resultado se muestra en un método tradicional con tubo (superior) o con la tecnología de gel
(inferior)
330 CAP. 34 INVESTIGACIÓN DE LABORATORIO DE LA HEMÓLISIS
(DCT, fig. 34-4), los reactivos que dan un perfil más espe-
cífico (IgG, complemento) pueden utilizarse en la hemóli-
sis inmunitaria caliente. Es frecuente, cuando se sospecha
hemólisis inmunitaria fría, mantener el espécimen de la
sangre a una temperatura mayor a la ambiental hasta que el
suero se separe, después se realiza la prueba contra células
del adulto (que contiene antígeno I) y del cordón umbilical
(que producen antígeno i). La DCT es, por lo general, sólo
positiva con el reactivo complemento, y el frotis sanguí-
neo muestra aglutinación, a menos que se realice en condi-
ciones calientes. La distinción entre condiciones calientes
y frías es importante para el tratamiento. En la hemólisis
inmunitaria caliente, los esteroides y otros tratamientos in-
munosupresivos dirigidos a reprimir, o a interferir con el
efecto de la producción del anticuerpo es con frecuencia
útil. La esplenectomía a menudo funciona. En la hemólisis
inmunitaria fría, sin embargo, la quimioterapia citotóxica
(a veces) y mantener caliente al paciente ayuda (casi siem-
pre), pero no los esteroides o la esplenectomía. La trans-
fusión por lo general se evita en la hemólisis inmunitaria,
pues la autoaglutinación interfiere con la compatibilidad
cruzada. El estado clínico del paciente demanda, de cuando
en cuando, la transfusión y no puede permitirse ciertamen-
te sucumbir por la carencia de eritrocitos, en este caso se
proporciona la sangre que es “menos incompatible”.
Enfermedad hemolítica del recién nacido (HDN)
Las células rhesus positivas del feto Rh+ pasan a la circu-
lación de una madre Rh–, por ejemplo, en la hemorragia
durante el embarazo o por amenaza de aborto. Esto cau-
sa que la madre produzca anticuerpos anti-D (antirrhesus)
que más tarde en este embarazo o en subsecuentes, pasan
al feto y se dirigen en contra de los eritrocitos, causando
hemólisis si el bebé es Rh+. Las incompatibilidades del
grupo ABO pueden causar problemas similares pero de
menor gravedad. Altos niveles de bilirrubina sin conjugar
después del nacimiento (debido a hemólisis) cruzan la ba-
rrera hematoencefálica y producen “kernícterus”, con daño
cerebral. El tratamiento, que puede incluir la transfusión de
intercambio, previene esto. Pueden verse esferocitos sobre
el frotis sanguíneo y el DCT se torna positivo. En casos
graves el bebé se vuelve hidrópico (anemia/ictericia/au-
mento de volumen con edema). En potenciales periodos
hemorrágicos feto-maternos, la producción del anticuerpo
por la madre puede prevenirse con la administración pasiva
de anti-D mediante inyección intramuscular para bloquear
células Rh+, antígeno que hace que ella produzca su propia
respuesta. El uso profiláctico de anti-D de esta manera es
una de las historias exitosas de la medicina científica mo-
derna, así los infantes afectados son ahora escasos; pueden
tratarse por transfusión intrauterina (una maniobra deli-
cada) o en inducción temprana de la labor del parto, con
transfusión de intercambio en el recién nacido.
Transfusión incompatible
La transfusión incompatible crea una hemólisis inmunome-
diada. En la incompatibilidad de grupo ABO (que ocurra es
muy raro y se espera) las células del donador se destruyen
en el lecho intravascular debido a que los anticuerpos del
paciente anti-A o anti-B (o ambos) se producen de manera
natural. El paciente puede enfermarse muy rápido, como
se describe antes, y desarrollar hemoglobinuria. Si la trans-
fusión no se detiene o el paciente está bajo anestesia, la
condición puede ser fatal. Las reacciones de incompatibi-
lidad a otros antígenos es normal que provoquen hemólisis
extravascular con anemia e ictericia. La recuperación es la
norma, pero se presentan problemas de compatibilidad cru-
zada después de esto, por causa de aloanticuerpos para los
antígenos del eritrocito.
Mecanismos no inmunitarios
Éstos pueden dar lugar a eritrocitos anormales (que, por
tanto, tienen una vida media corta). El traumatismo físico y
mecánico para los eritrocitos normales, como atravesar una
válvula mecánica del corazón que se fuga, puede conducir
a la fragmentación y lisis intravascular o a su reciclaje pre-
coz por el bazo.
La hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH) es una
enfermedad hematológica adquirida rara. El paciente su-
fre una típica hemólisis intravascular mediada por el com-
plemento, que resulta en hemoglobinuria, deficiencia de
hierro, crisis aplásica y una predisposición a la trombosis
venosa. Éste es un desorden de la célula embrionaria que
produce células deficientes en proteínas reguladoras del
complemento, ocasionando un incremento de la sensibili-
dad de la membrana del eritrocito a la lisis por el comple-
jo del complemento. Por lo común el diagnóstico se hace
usando una variedad de pruebas. Las más sensitivas son
las pruebas con suero acidificado (prueba de Hams) y la
prueba de la lisis de la sacarosa. Éstas ahora se sustituye-
ron en gran parte por la introducción de la citometría de
flujo para la detección de las moléculas superficiales CD55
(factor acelerador del deterioro-DAF) y CD59 (factor de
restricción homocigoto-HRF/proteína ligada a C8 [C8bp]).
Estos antígenos están reducidos o ausentes en PNH y la
citometría de flujo es la herramienta más sensible y espe-
cífica disponible para el diagnóstico actual. La alteración
puede detectarse en la superficie de los eritrocitos y leuco-
citos en esta condición.
 DESÓRDENES HEMOLÍTICOS 331

Cuadro 34-5 Causas de la microangiopatía Cuadro 34-6 Diagnóstico de laboratorio de las condiciones
microangiopáticas
Estos tres grupos amplios contienen todas las causas proba- La detección de la coagulación, la bioquímica renal y la infor-
bles: mación clínica normalmente distinguen la causa.
• Coagulación intravascular diseminada (DIC) (en problemas
obstétricos, septicemia, cáncer, etcétera) Hb/ Insuficiencia Contexto
• Lupus eritematoso sistémico (SLE) y otros desórdenes re- Causa plaquetas Coagulación renal clínico
nales y del tejido conjuntivo DIC Baja Anormal ⫹ ⫹⫹
• Púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) y síndrome SLE Baja N ⫹ ⫹⫹⫹⫹
urémico hemolítico (HUS) TTP Baja N ⫺ ⫺
HUS Baja N ⫹⫹⫹ ⫹⫹⫹

Cuadro 34-7 Investigación de laboratorio de la hemólisis intravascular

Durante la hemólisis, la hemoglobina se libera en el plasma. Ésta se liga rápido a la haptoglobina y a la hemopexina de las proteí-
nas del plasma antes de eliminarse de la circulación por el hígado. Si la hemólisis es grave las concentraciones de haptoglobina y he-
mopexina se agotan muy rápido, y la hemoglobinuria/anemia y metahemalbuminemia se tornan detectables.
• La metahemalbúmina con su apariencia ”turbia-marrón”, que puede medirse fotométricamente, tiene un pico de absorción carac-
terístico de 624 nm
• Los niveles de haptoglobina y hemopexina séricas pueden medirse de varias maneras incluyendo la filtración en gel y métodos elec-
troforéticos, fotométricos e inmunológicos. Los más comunes actualmente son los métodos inmunológicos, que utilizan antihapto-
globina o antihemopexina, que permiten la demostración por inmunodifusión radial o técnicas del cohete de Laurell.
• La demostración de la hemosiderina urinaria es por el método de la tinción de hierro con azul Prusia de Perl. Una muestra de
orina se centrifuga y el sedimento se extiende a un portaobjetos de vidrio, se seca al aire antes de fijarse en metanol. El hierro
férrico presente en el sedimento reacciona con el ferrocianuro de potasio acidificado para producir ferrocianuro férrico que apa-
rece como gránulos teñidos de azul en la microscopia.

Figura 34-5 Marcado del eritrocito. La señora ID, de 76 años, sufría

ataques recurrentes de anemia relacionados con palpitaciones, falta de
respiración y agotamiento. La conocían por tener una enfermedad car-
diaca valvular compleja, incluyendo un reemplazo de la válvula aórtica,
que tenía murmullos al escuchar el corazón, que podrían indicar fuga. Se
le aplica warfarina y se le distingue por tener aloanticuerpos del eritroci-
to, haciendo la compatibilidad cruzada difícil. Un cuadro de deficiencia
del hierro indica la pérdida de eritrocitos pero, con poca fragmentación
sobre el frotis sanguíneo, reducida haptoglobina pero ninguna hemosi-
derinuria, y confusión para determinar una destrucción intravascular sig-
nificativa. Ella no tenía algún síntoma intestinal y el examen completo
del aparato gastrointestinal no reveló ninguna causa anatómica de la pér-
dida sanguínea. Sus eritrocitos, por tanto, fueron marcados con 5lCr y se
transfundieron nuevamente (día 0). Las muestras de sangre se tomaron
todos los días para la actividad isotópica y las heces recolectadas, como
se muestra en la gráfica. El día 1 se toma como 100% para permitir pér-
didas tempranas inaplicables. Puede observarse que la vida media del cromo (T50Cr) se reduce a 15 días (lo normal es de 25 a 33 días),
aunque ella mantuvo su Hb durante el estudio. Esta modesta reducción se explica por la pérdida considerable advertida a partir del aparato
gastrointestinal, que se observa en las cuentas del isótopo en las heces. La pérdida es claramente variable y se asume que proviene de una
angiodisplasia en el intestino largo (éstas no son demostrables anatómicamente). La paciente necesitó varias transfusiones electivas y de
urgencia durante el primer año, pero ninguna a partir de entonces. Parecía que la pérdida de sangre había cesado. La válvula del corazón
no necesitó reemplazarse.
332 CAP. 34 INVESTIGACIÓN DE LABORATORIO DE LA HEMÓLISIS
Microangiopatías
Las microangiopatías causan destrucción del eritrocito por
los filamentos de fibrina de vasos pequeños y se relacionan
con un cuadro sanguíneo característico, que contiene por-
ciones de los fragmentos, algunos glóbulos rojos “alarga-
dos” y pocos microesforocitos. La trombocitopenia y los
marcadores de la hemólisis (anemia, reticulocitos eleva-
dos y bilirrubina) están con frecuencia presentes. Existen
varias causas de la microangiopatía, las cuales se resumen
en el cuadro 34-5. Los indicadores del diagnóstico que las
distingue se muestran en el cuadro 34-6. El diagnóstico
debe hacerse de manera correcta porque todas estas condi-
ciones son serias y pueden de otro modo causar la muerte
a pacientes sanos jóvenes, aunque a menudo son tratables.
La distinción acertada entre ellas es importante porque
ciertos productos sanguíneos son en potencia peligrosos
en algunas personas, y asimismo el manejo con esteroides
es provechoso sólo en algunos individuos.
En el cuadro 34-7 se muestra evidencia adicional de he-
mólisis intravascular que puede obtenerse a partir de las
investigaciones que se ejemplifican aquí.
Segmento final
Siempre existen algunos casos difíciles de aclarar y la me-
dición directa mediante el marcaje de eritrocitos con isóto-
pos puede ser necesaria (fig. 34-5). Por último, es probable
que algunos pacientes presenten de forma clara la hemóli-
sis, pero en quienes ninguna causa puede encontrarse. La
mayoría de ellos presenta un desorden de la estructura o
fisiología del eritrocito, hasta ahora no identificado.
Lecturas adicionales
Dacie JV. The Haemolytic Anaemias, 3rd edn, vols 1-5. 1988-
1999: Churchill Livingstone, Edinburgh.
Greer. JP et al. Wintrobe’s Clinical Hematology. 11th edn. 2004:
Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.
Hall R, Malia RG. Medical Laboratory Haematology, 2nd edn.
1991: Butterworth- Heinemann, Oxford.
Lewis SM, Brain BJ, Bates I, Dacie and Lewis’. Practical Hae-
matology. 9th edn. 2001: Churchill Livingstone, London.
 35
Investigaciones de laboratorio de la hemostasis
Peter E Rose y Catherine Caveen
Introducción
El flujo sanguíneo en el compartimiento vascular depende
del equilibrio entre la actividad anticoagulante y la procoa-
gulante. Bajo circunstancias normales la actividad anticoa-
gulante es la que domina; sin embargo, con el daño a las
células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos, el
subendotelio puede ser expuesto, con el inicio de la forma-
ción local del coágulo. La agregación plaquetaria inicial
forma un tapón plaquetario, mientras la coagulación lo-
cal produce un coágulo firme de fibrina. Posteriormente, un
sistema de digestión del coágulo (fibrinólisis) previene la
extensión del coágulo y restaura la permeabilidad.
La investigación de laboratorio se utiliza de rutina para
evaluar a los pacientes con elevado riesgo trombótico o
hemorrágico. En muchas condiciones médicas agudas el
equilibrio normal de la hemostasis se altera y requiere
corrección. Además, el monitoreo de los agentes terapéuti-
cos para promover la actividad anticoagulante o los agen-
tes para restaurar la hemostasis normal forma parte de las
investigaciones de rutina emprendidas en el laboratorio de
hematología. La coagulación in vivo requiere superficies
de calcio y de fosfolípidos como un componente integral
para la formación del coágulo. Los factores de coagulación
circulan como precursores inactivos, que bajo estímulos
apropiados se convierten a enzimas y a cofactores acti-
vos, con la generación de trombina y la conversión sub-
siguiente del fibrinógeno a fibrina. Los pasos iniciales en
la activación de la coagulación involucran el factor tisular,
expresado en las superficies no vasculares de la membrana
celular, actuando como un cofactor para la activación
de los factores VII a VIIa, con la activación subsiguiente de
los factores X y IX y la generación eventual de trombina.
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
Hay, sin embargo, interacciones hemostáticas numerosas
entre los factores de coagulación, permitiendo a una di-
versidad de ellos actuar como anticoagulantes y, además,
como procoagulantes en diferentes circunstancias.
Por tradición, las pruebas de coagulación in vitro se han
separado de forma conveniente en activación de una vía
intrínseca o una extrínseca. La activación no fisiológica de
la vía intrínseca ocurre por el contacto con una superficie
ajena del factor XII, cininógeno de alto peso molecular y
por la activación subsiguiente de los factores coagulantes a
través de los factores XI, IX, X y la protrombina. In vivo,
sin embargo, las cantidades pequeñas de generación de
protrombina después de la activación de la vía extrínseca
resulta en una amplificación de la hemostasis vía activa-
ción del factor XI (fig. 35-1).
Tiempo de protrombina
El tiempo de protrombina se utiliza como medida de la ac-
tividad de la vía extrínseca, en la cual la tromboplastina
(factor tisular) y el calcio se agregan al plasma, y el tiempo
requerido para la formación del coágulo se mide (fig. 35-2).
Un tiempo de protrombina prolongado puede deberse a:
• Anticoagulantes orales.
• Deficiencia del factor I, II, V, VII o X, que puede here-
darse o adquirirse, por ejemplo, en la enfermedad del
hígado o coagulación intravascular diseminada.
• Altos niveles de heparina.
• Inhibidores de los factores de coagulación específicos,
incluyendo el inhibidor del lupus. La investigación adi-
cional de un tiempo de protrombina prolongado puede
334 CAP. 35 INVESTIGACIONES DE LABORATORIO DE LA HEMOSTASIS

Figura 35-1 La vía de la cascada de la coagulación.

implicar estudios de corrección o ensayos de los facto-
res coagulantes.
Un tiempo de protombina prolongado puede corregir-
se en presencia de plasma normal. El patrón de corrección
identifica el factor, o los factores, que son deficientes. Di-
ferentes reactivos se utilizan en los estudios de corrección
(cuadro 35-1). Estas pruebas, sin embargo, se han sustitui-
do en gran parte por los ensayos de los factores coagulantes
individuales.
Control anticoagulante oral
El cociente normalizado internacional (INR) es el método
recomendado para informar los resultados del tiempo de
protrombina para el control anticoagulante. El sistema del
INR se ha desarrollado para compensar la fuente principal
de discrepancia en los ensayos del tiempo de protrombina,
a saber, la variabilidad en la respuesta a diferentes reactivos
de tromboplastina a los cambios en los factores coagulantes
dependientes de la vitamina K inducidos por la warfarina.
Como los números de los pacientes que requieren terapia
oral anticoagulante van en aumento (1 de 80 personas en el
Reino Unido) y la necesidad de vigilancia regular del INR,
esto representa una carga de trabajo importante. El princi-
pio de la anticoagulación oral es proporcionar un nivel de
anticoagulación para prevenir problemas trombóticos pero
también para evitar problemas de sangrado de la sobreanti-
coagulación. Para la mayor parte de los problemas trombó-
ticos venosos un INR en el rango de 2 a 3 es satisfactorio.
 TIEMPO PARCIAL DE TROMBOPLASTINA ACIVADA (TTPA) 335

Errores de la protrombina

Los errores con la estimación del tiempo de protrombina pue-

Figura 35-2 Vía extrínseca
Para los pacientes con válvulas mecánicas del corazón, un
nivel más alto de anticoagulación INR en el rango de 2.5 a
3.5, es necesario para prevenir la formación del coágulo en
la válvula (cuadro 35-2).
El INR se expresa como:
PT
INR = (ISI)
GMNPT
donde ISI es el índice de sensibilidad internacional del
reactivo de tromboplastina y GMNPT es la media geomé-
trica del tiempo de protrombina normal.
Fuentes importantes de error permanecen en la medi-
ción del INR y pueden surgir de problemas en la medición
del tiempo de protrombina, ISI o GMNPT.
den crearse por los problemas con la colección de la mues-
tra, la concentración del anticoagulante y el tipo de tubo de
colección utilizado. Además, las diferencias entre los mé-
todos manuales y automáticos son reconocidas; con los
últimos se producen tiempos de protrombina más cortos.
Mientras se requieren productos manufacturados para
producir un valor del ISI para cada lote del reactivo de
tromboplastina, la calibración incorrecta de los reactivos
de tromboplastina por el laboratorio local o los fabricantes
es un problema. Para la calibración de una tromboplasti-
na, se recomienda un reservorio de muestras del plasma de
20 adultos normales y 60 pacientes en warfarina, además,
diferentes preparaciones de referencia internacional de dis-
tintas especies producen diferencias en el ISI. La media
geométrica del tiempo de protrombina normal debe deri-
varse de un reservorio de 20 muestras de plasma de adultos
normales y la media geométrica calculada de éste.
Tiempo parcial de tromboplastina
activada (APTT)
Esta prueba mide la vía intrínseca de la coagulación. Un ac-
tivador, como el caolín, desencadena la vía al activar los fac-
tores de contacto (fig. 35-3). En presencia de iones de calcio
y de fosfolípido, esto culmina en la generación de trom-
bina y en última instancia en la formación del coágulo de
fibrina. El APTT también se utiliza en el monitoreo de la te-
rapia de heparina. Un APTT prolongado en un paciente con
historia de una diátesis hemorrágica requiere investigación
adicional, en particular para excluir la hemofilia A o B.

Cuadro 35-1 Estudios de corrección de un tiempo de protrombina prolongado

Plasma normal Suero envejecido Plasma absorbido Plasma oxalatado Deficiencia del factor Pruebas adicionales
⫹ ⫺ ⫹ ⫹ I Ensayo de fibrinógeno
⫹ ⫺ ⫺ ⫹ II Ensayo del factor
⫹ ⫺ ⫹ ⫺ V Ensayo del factor
⫹ ⫹ ⫺ ⫹ VII Ensayo del factor
⫹ ⫹ ⫺ ⫹ X Tiempo RVV
⫺ ⫺ ⫺ ⫺ Inhibidor Tiempo de reptilasa
Neutralización por protamina
⫹ ⫽ corregido; ⫺ ⫽ sin corregir; RVV ⫽ prueba con veneno de la víbora de Russells (serpiente Vipera russelli).
Plasma normal citratado: éste proporciona todos los factores de coagulación.
Suero envejecido: la sangre coagulada se incuba por 24 h a 37°C; el suero contiene los factores VII, IX, X, XI y XII.
Plasma absorbido: el plasma normal se trata con el hidróxido de aluminio, que absorbe ciertos factores; el plasma resultante contiene los factores
I, V, VII, XI y XII.
Plasma oxalatado: plasma normal que se agrega a oxalato de sodio y se incuba por 72 h a 37°C; contiene todos los factores excepto el V.
336 CAP. 35 INVESTIGACIONES DE LABORATORIO DE LA HEMOSTASIS

Cuadro 35-2 Anticoagulantes orales para diversas condiciones clínicas

Condición Rango INR Duración recomendada

Tromboembolismo venoso
• Trombosis posoperatoria de la vena de la pantorrilla sin algunos factores de riesgo 2a3 6 semanas
• Trombosis de la vena de la pantorrilla en pacientes no quirúrgicos sin 2a3 3 meses
algunos factores de riesgo
• Trombosis de la vena de la pantorrilla en pacientes no quirúrgicos con factores 2a3 Indefinida (mientras los
de riesgo factores de riesgo persistan)
• Émbolo pulmonar y trombosis de la vena proximal 2a3 6 meses
• DVT recurrente y/o PE 2a3 Indefinida
• DVT recurrente y/o PE aunque sobre warfarina (INR rango 2 a 3) 3a4 Indefinida

Fibrilación auricular
• Fibrilación auricular u otras arritmias de alto riesgo 2a3 Indefinida

Prótesis de la válvula del corazón y otras indicaciones cardiacas

• Válvulas protésicas mecánicas 2.5 a 3.5 Indefinida
• Válvulas bioprotésicas del corazón (no aórticas) 2a3 3 meses
• Cardiomiopatía, trombo mural o segmento acinético 2a3 Indefinida

El ácido acetilsalicílico es la terapia de primera línea para las siguientes condiciones; si está contraindicado, se recomiendan los
siguientes rangos
del INR para la terapia de warfarina:
• Ataque TIA/isquémico 3a4 Indefinida
• Trombosis arterial periférica e injertos 3a4 Indefinida
• Trombosis de la arteria coronaria 3a4 Indefinida
• Trombosis del injerto de la arteria coronaria 3a4 Indefinida
• Angioplastia coronaria y stents coronarios 3a4 Indefinida
*Interrumpir la warfarina si no hay AF, trombo intracardiaco o embolismo sistémico. Los pacientes que no requieren warfarina deben considerarse
para la terapia antiplaquetaria (p. ej., con ácido acetilsalicílico).

Figura 35-3 Vía intrínseca.

 TIEMPO DE TROMBINA 337

Investigación de laboratorio de un APTT prolongado

Figura 35-4 Investigación de laboratorio de un APTT prolongado.

Un APTT prolongado puede causarlo la deficiencia de Tiempo de trombina

los factores I, II, V, VIII, IX, X, XI o XII, que se heredan
o adquieren debido a la enfermedad o a la consunción he-
El tiempo de trombina se utiliza como un tamiz rápido para
pática, como en la coagulación intravascular diseminada.
las anormalidades del fibrinógeno y evaluar si la hepari-
La terapia de heparina, los inhibidores para los factores
na es la causa de un APTT prolongado. La trombina se
de coagulación específicos, la presencia del anticoagulan-
agrega al plasma citratado y se mide el tiempo para la for-
te del lupus o los niveles altos de FDP (productos de la
mación de fibrina (fig. 35-5).
degradación del fibrinógeno) también es posible que pro-
Un tiempo de trombina prolongado puede deberse a:
duzcan un APTT prolongado. Los estudios de corrección
también suelen utilizarse para investigar, además, la causa • Disfibrinogenemias, heredadas o adquiridas, con una
de un APTT prolongado. Si los estudios mezclados mues- molécula de fibrinógeno estructuralmente anormal con
tran corrección del APTT, entonces los ensayos del factor las características funcionales alteradas.
específico se realizan para determinar el factor deficiente.
La falla que se pretende corregir requiere investigación adi- • Nivel bajo de fibrinógeno (< 1 g/L).
cional para excluir un inhibidor adicional específico o el
anticoagulante del lupus (fig. 35-4). • Niveles elevados de los productos de degradación del
El APTT se usa con más frecuencia para monitorear el fibrinógeno.
tratamiento de heparina y ajustar el programa de infusión,
según se ilustra en el cuadro 35-3. • Terapia con heparina.
338 CAP. 35 INVESTIGACIONES DE LABORATORIO DE LA HEMOSTASIS

Cuadro 35-3 Régimen de infusión de heparina, con monitoreo de laboratorio del tratamiento usando el APTT. El rango terapéutico
debe determinarse del rango APTT equivalente a una concentración de heparina del plasma de 0.2 a 0.4 UI/ml

Programa de infusión de heparina

Bolo IV 5 000 unidades
Infusión IV 15 000 unidades/12 h

Verificar el APTT después de 2 a 6 h

• Rango aceptable 1.5 a 2.5
• En el embarazo 1.5 a 2.0

Ajustar la heparina como sigue:

> 5.0 Parar por una hora
Disminuir a 6 000 unidades/12 h Verificar el APTT en 2 a 6 h
4.1 a 5.0 Disminuir a 3 600 unidades/12 h Verificar el APTT en 2 a 6 h
3.1 a 4.0 Disminuir a 1 200 unidades/12 h Verificar el APTT en 2 a 6 h
2.6 a 3.0 Disminuir a 600 unidades/12 h Verificar el APTT en 2 a 12 h
1.5 a 2.5 Sin cambio Verificar el APTT dentro de 24 h
1.2 a 1.4 Aumentar a 2 400 unidades/12 h Verificar el APTT en 2 a 12 h
< 1.2 Aumentar a 4 800 unidades/12 h Verificar el APTT en 2 a 6 h
Verificar el APTT 2 a 6 h después de circular la heparina.
La heparina no debe represcribirse por más de 24 h.
La verificación del APTT sobre una base diaria es el mínimo obligatorio para todos los pacientes que reciben heparina intravenosa.
Vigilar las plaquetas después de cuatro días del tratamiento con heparina.

heparina en la muestra. El tiempo de reptilasa se prolonga

en la disfibrinogenemia e hipofibrinogenemia.

Figura 35-5 Tiempo de trombina.
La presencia de heparina en una muestra se confirma por la
corrección del tiempo de trombina con sulfato de protami-
na, que neutraliza la actividad anticoagulante.
Tiempo de reptilasa
La reptilasa es una enzima del veneno de la serpiente
Bothrops atrox (Per-de-lana), que coagula el fibrinógeno
humano al cortar el fibrinopéptido A del fibrinógeno. La
reptilasa no es inhibida por la heparina o la antitrombina
III. Un tiempo de protrombina prolongado y tiempo de rep-
tilasa normal está también de acuerdo con la presencia de
Fibrinógeno
Si bien los desórdenes heredados del fibrinógeno son raros,
los desórdenes adquiridos son comunes en pacientes con
coagulopatías de consumo, enfermedad hepática y, después
de una cirugía mayor, derivación cardiopulmonar. Además,
la asociación de niveles altos de fibrinógeno y elevado ries-
go del corazón isquémico y la enfermedad vascular peri-
férica están bien reconocidos. El fibrinógeno es también
un reactor de fase aguda, con niveles elevados observados
con frecuencia en las enfermedades inflamatorias. La in-
terpretación de resultados es por tanto difícil, y el método
más apropiado depende del objetivo de la investigación.
La confirmación de los niveles bajos de fibrinógeno con
un método Clauss manual es el más recomendable. Hay
muchos métodos que se emplean para medir el fibrinóge-
no, sobre todo con más frecuencia los de coagulación, que
miden el fibrinógeno funcional, basados en la formación
de fibrina. En el método del tiempo de trombina (Clauss),
el tiempo de trombina es proporcional a la concentración
del fibrinógeno en la muestra de prueba. Una curva de cali-
bración se prepara de las concentraciones conocidas de fi-
brinógeno y se utiliza para convertir el tiempo de trombina
a una concentración de fibrinógeno. Hay poca interferencia
 ENSAYOS DEL FACTOR
de los FDP o de la heparina, a menos que estén presentes
en altas concentraciones.
Un título del fibrinógeno puede obtenerse si se emplea
una serie de diluciones del plasma, seguidas por la adición
de trombina. La dilución en la cual el fibrinógeno se di-
suelve es una medida de la concentración del fibrinógeno
presente. La prueba se efectúa con frecuencia en paralelo
con sulfato de protamina y ácido E-aminocaproico (EACA)
como indicadores de FDP y de fibrinólisis, respectivamen-
te. Los métodos fisicoquímicos que se usan con menos fre-
cuencia miden el fibrinógeno total y pueden no reflejar la
actividad funcional, mientras los métodos inmunológicos
miden el antígeno relacionado con el factor presente tanto
en el fibrinógeno como en los FDP. El uso creciente de coa-
gulómetros automáticos condujo a la automatización de
los ensayos del fibrinógeno como parámetro derivado del
tiempo de protrombina, basados en un análisis turbidimé-
trico con un espectrofotómetro.
Ensayos del D-dímero y de los FDP
Los ensayos del D-dímero se utilizan cada vez más en el
diagnóstico de la enfermedad tromboembólica venosa. Los
fragmentos D-dímero se producen durante la degradación
de los coágulos de fibrina generados desde la trombina
por la plasmina. Los ensayos se basan en la detección que
hacen los anticuerpos específicos de los fragmentos de fi-
brina entrelazada sin actividad cruzada con fibrinógeno.
Estas pruebas se pueden, por tanto, realizar en muestras
de plasma. Hay actualmente tres métodos principales para
la detección del D-dímero. Un ensayo inmunoabsorben-
te ligado a enzimas (ELISA) tiene una sensibilidad muy
alta y proporciona resultados cuantitativos. La desventaja
principal es que la técnica consume tiempo y, por tanto,
presenta problemas donde este análisis se utiliza en el ta-
mizaje rápido para la enfermedad tromboembólica venosa.
Los ensayos de aglutinación de látex son más rápidos, pero
tienen una sensibilidad menor a 80%, requiriendo que se
utilicen conjuntamente con un tanteo de probabilidad clí-
nica como parte de cualquier procedimiento de tamizaje.
Los ensayos de látex automáticos cuantitativos requieren
equipo especial para medir la disminución de la transmi-
sión de la luz a 405 nm; éste tiene la ventaja de ser sensible
y también rápido. Los ensayos de aglutinación de sangre
entera ofrecen el ensayo más rápido, basado en la agluti-
nación cuantitativa del eritrocito, en la cual el anticuerpo
monoclonal para un D-dímero se liga al anticuerpo mono-
clonal que une a los eritrocitos. Estos ensayos son rápidos
pero dependen del operador, y no se obtiene un resultado
cuantitativo; asimismo tienen un alto valor predictivo ne-
gativo para la enfermedad tromboembólica venosa y, por
339
tanto, es frecuente que se combinen con una cuenta clínica
predictiva de probabilidad en el tamizaje de los pacientes
para excluir trombosis venosa. Los resultados elevados del
D-dímero no son específicos para la trombosis profunda de
la vena y, especialmente en los ensayos más sensibles, los
niveles bajos de fibrina se detectan en una variedad de con-
diciones, como inflamación, infección, vasculitis, embara-
zo y en particular durante tres semanas, después de la ci-
rugía. Los niveles elevados de los D-dímeros y de los FDP
se observan en la coagulación intravascular diseminada,
la cual es un método útil en el monitoreo del progreso de la
enfermedad siguiendo la activación in vivo de la plasmina.
El ensayo puede utilizarse también para valorar si una res-
puesta fibrinolítica a un agente fibrinolítico terapéutico, tal
como estreptocinasa o urocinasa, se ha conseguido. Como
los ensayos del D-dímero son más específicos y distinguen
entre la fibrinogenólisis y la fibrinólisis, han sustituido en
gran parte los ensayos para los FDP.
Los FDP se incrementan después de la degradación de
la plasmina del fibrinógeno y de la fibrina no entrelazada,
y ocasionan un tiempo de trombina prolongado o uno de
coagulación por la reptilasa. Los ensayos del FDP que se
emplean con más frecuencia utilizan una técnica de aglu-
tinación de látex, en la cual un anticuerpo que reconoce
los FDP es cubierto en la superficie de partículas de látex.
Las partículas se aglutinan en presencia de los FDP, y la
concentración se determina por la dilución que sostiene
la aglutinación. Como los anticuerpos utilizados en este en-
sayo pueden unirse al fibrinógeno, el último debe eliminar-
se de la muestra del paciente. Esto se consigue al coagular
la muestra con trombina o veneno de serpiente en presencia
de un inhibidor de plasmina para prevenir la generación in
vitro de productos de digestión. Estos reactivos se incorpo-
ran en tubos de colección especiales.
Ensayos del factor
Los ensayos específicos del factor de coagulación se basan
en el tiempo de protrombina o el APTT. Un rango de dilu-
ciones del plasma estándar se agrega a un plasma deficiente
del factor específico. Los tiempos de coagulación que se
obtienen muestran una relación lineal en la concentración
del factor cuando se trazan en el papel de registro. La ac-
tividad del factor en el plasma de prueba puede entonces
determinarse desde el gráfico. Estos ensayos son particu-
larmente importantes en la identificación de pacientes con
desórdenes heredados y también en la observación de la
concentración del factor en la terapia de reemplazo. Los
factores II, V, VII y X se ensayan con frecuencia usando
una fase del tiempo de protrombina, mientras que los fac-
tores VIII, IX, XI y XII se basan en un método de APTT.
340 CAP. 35 INVESTIGACIONES DE LABORATORIO DE LA HEMOSTASIS
La deficiencia del factor XIII no la detectan algunas prue-
bas de coagulación de rutina, ya que éste no participa en la
reacción que conduce a la formación de fibrina. Una prue-
ba de solubilidad de la urea es el método más utilizado para
tamizar la deficiencia del factor XIII. Un coágulo de fibrina
se forma, y se agrega acetona o urea a la muestra de plas-
ma, a 37°C. La fibrina unida por la acción del factor XIII
es insoluble en estas soluciones, pero en ausencia de la ac-
tividad del factor XIII un coágulo de fibrina se disuelve en
cerca de una hora.
Anticoagulantes naturales
In vivo hay activación de grado bajo continua de la coagu-
lación e inhibidores naturales de los factores de coagulación
activos. Una deficiencia de tales factores puede relacionarse
con una tendencia protrombótica.
Antitrombina III
La antitrombina III es un regulador principal de la trombi-
na in vivo. Se prefieren los análisis funcionales, pues se re-
conoce que una variedad de formas moleculares produce la
cuantificación normal de acuerdo a lo medido por técnicas
inmunológicas. La mayor parte de los ensayos funcionales
miden la neutralización de la trombina del factor Xa en
presencia de heparina adicionada.
Proteínas C y S
La proteína C se activa después de la generación de trom-
bina. Ésta se une a la trombomodulina sobre la superficie
de las células endoteliales, y liga y activa la proteína C. La
trombina en esta situación pierde su actividad procoagu-
lante y es incapaz de convertir el fibrinógeno en fibrina.
La proteína C activada actúa como anticoagulante natural
degradando los factores V y VIII, limitando la generación
adicional de trombina. La proteína S sirve como un co-
factor para la proteína C activada. Un hallazgo adicional
importante es que la resistencia a la proteína C activada
puede ocurrir por un defecto de la molécula del factor
V, la mutación Leiden del factor V. Ésta se relaciona con
un riesgo aumentado de la trombosis venosa y es el factor
de riesgo protrombótico heredado conocido con más fre-
cuencia. El tamiz por PCR se recomienda para los pacien-
tes con una historia protrombótica para excluir este factor.
El tamiz, que por PCR detecta la mutación G2020 de la
protrombina, también se realiza de rutina como parte de un
tamiz de trombofilia.
Fibrinólisis
La fibrinólisis produce la rotura del coágulo de fibrina y
se inicia la liberación desde el endotelio vascular del acti-
vador del plasminógeno tipo tisular (tPA) y del activador
del plasminógeno tipo urocinasa (uPA). Estos activadores
convierten el plasminógeno en la enzima activa plasmina,
la cual degrada la fibrina. Hay también un inhibidor natural
para la plasmina, ␣II antiplasmina y el inhibidor del acti-
vador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1) liberado por el en-
dotelio, que se une al tPA y al uPA libres, y los inactiva.
Marcadores de la coagulación activada
En los últimos años ha aumentado el interés en la hiper-
coagulabilidad y las pruebas disponibles para su detección.
Los ensayos para los marcadores de la activación de la coa-
gulación tienen varias aplicaciones potenciales, incluyendo
la caracterización de los pacientes con condiciones clínicas
que predisponen a la trombosis, ayudando al diagnóstico
de casos trombóticos agudos y al monitoreo de la terapia
anticoagulante. Esto puede lograrse midiendo las formas
enzimáticas de los cimógenos de la coagulación generadas
durante la activación de la coagulación, o de forma indirec-
ta, midiendo los péptidos de la activación que se generan
cuando se activan los cimógenos. Además, midiendo los
complejos que resultan de la inactivación enzimática por
los inhibidores naturales del plasma, un planteamiento adi-
cional está disponible; también un número de inmunoensa-
yos para medir los fragmentos que se crean de la activación
de factores coagulantes como los péptidos de activación de
los factores IX y X. El fragmento 1 + 2 de la protrombina,
que resulta de la activación mediada por la trombina de
la protrombina y fibrinopéptido A, cortado a partir de la
cadena ␣ del fibrinógeno por la trombina, son índices de
la generación y de la actividad de la trombina, respectiva-
mente. Los inmunoensayos para cuantificar la proteína C
activada o el péptido de activación de la proteína C pueden
considerarse como índices de la función de la trombina y
de la trombomodulina. Los inmunoensayos están también
disponibles para la medición de los complejos inhibidos
enzimáticamente, como la trombina, la antitrombina, y
otros complejos que resultan de la inhibición de la proteí-
na C activada por el inhibidor de la proteína C y la anti-
tripsina. Actualmente, la utilidad de los marcadores de la
activación de la coagulación mejoró la evaluación de la hi-
percoagulabilidad en el diagnóstico de los acontecimientos
trombóticos agudos. Para el último propósito es más eficaz
medir los marcadores de activación de la fibrinólisis, tales
como el D-dímero.
 EVALUACIÓN AUTOMATIZADA DE LA COAGULACIÓN
Evaluación automatizada de la coagulación
Los avances recientes en tecnología han anunciado la in-
troducción de instrumentos automáticos para el tamiza-
je de la coagulación. Un aumento en la carga de trabajo, la
demanda de mayor especificidad y la reducción en traba-
jo manual garantizan que casi todos los laboratorios ahora
tengan automatización parcial o total. La mayor parte de
los métodos manuales pueden modificarse para la instru-
mentación, aunque los resultados varían mucho según los
instrumentos. Todas las pruebas de rutina de tamizaje de
la coagulación, incluyendo los ensayos del factor, pueden
analizarse en instrumentos automatizados. Instrumentos
más avanzados permiten los ensayos cromogénicos para
las pruebas especializadas de la coagulación. Los primeros
instrumentos permitieron la detección del coágulo de fibri-
na a través de electrodos. Un electrodo se mueve dentro y
fuera del reactante/plasma. Se agrega calcio y, tan pronto
como se forme el primer coágulo de fibrina, el circuito eléc-
trico se completa y se detiene el temporizador. La mayor
341
parte de los instrumentos modernos implican la detección
fotoóptica de la terminación. Ya que tiene lugar el proceso
coagulante, la luz dispersada de un haz fijo se aumenta.
El tiempo de coagulación se obtiene a partir de la curva
de coagulación así como el tiempo requerido para que la
muestra alcance el porcentaje preestablecido de la intensi-
dad de la luz dispersada. La instrumentación completa in-
cluye muestreo robótico, lectura por código de barra de las
muestras, dispensadores automáticos del reactante y un sis-
tema de manejo de datos. Sin embargo, como los tiempos
de coagulación varían entre los diferentes instrumentos, de-
pendiendo del método de detección de la terminación, los
resultados de la automatización no son estrictamente com-
parables. Por tanto, las técnicas manuales aún se utilizan
como métodos de referencia.
Lectura adicional
Lugassy G, Shulman S. Thrombosis and Anti-thrombotic Ther-
apy. 2001: Hartin Dunitz, London.
 SECCIÓN 6
CITOGENÉTICA

KWWSERRNVPHGLFRVRUJ
 36
Bandeo y análisis cromosómico
Mervyn Humphreys
Introducción
La citogenética implica el estudio de los cromosomas hu-
manos en la salud y en la enfermedad. En el núcleo huma-
no el material genético (DNA) está químicamente ligado
a las proteínas y empaquetado en las distintas estructuras
llamadas cromosomas. En general las células humanas po-
seen un total de 46 cromosomas, o 23 pares, un miembro
de cada par de cromosomas se hereda del padre y el otro lo
hereda la madre. El DNA de cada célula se empaqueta den-
tro de los cromosomas para facilitar la separación correcta
del material genético a ambas células hijas en cada división
celular. Cuando células, espermatozoides y huevos del ga-
meto humano se producen, el número de cromosomas se
divide en dos hasta formar 23 pares vía división celular
meiótica, de tal manera que cuando un nuevo cigoto sea
formado, por la fusión de un espermatozoide con un óvulo,
las células tengan el número correcto de cromosomas, 46;
1956 es considerado el año en que da principio la citogené-
tica humana moderna, ya que antes de ese año se pensaba
que el número de cromosomas en la célula humana normal
era de 48.
El análisis citogenético permite la detección de alteracio-
nes cromosómicas, que pueden ser numéricas (cromosomas
adicionales o faltantes) o estructurales (deleciones, duplica-
ciones, translocaciones, etc.). Las preparaciones cromosó-
micas o cariotipos pueden elaborarse y analizarse a partir
de diferentes tejidos del organismo, incluyendo sangre peri-
férica, líquido amniótico, piel o médula ósea. Los estudios
cromosómicos son un procedimiento diagnóstico de labo-
ratorio importante en numerosas situaciones clínicas. Por
ejemplo, los pacientes con defectos de nacimiento múltiples
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
o retraso mental, o ambos, desarrollo sexual anormal o este-
rilidad y numerosos tipos de neoplasias que pueden resguar-
dar alteraciones citogenéticas. Es, por tanto, muy importante
que los estudios cromosómicos se realicen como parte de
las investigaciones rutinarias en tales pacientes.
Hasta inicios de la década de 1970 el análisis citogené-
tico sólo se realizó sobre preparaciones cromosómicas sin
bandeo, con tinción sólida. Los cromosomas sólo podrían
identificarse y clasificarse con base en la forma y el tamaño
y, por tanto únicamente las alteraciones numéricas o los arre-
glos estructurales grandes podían detectarse. Algunas altera-
ciones numéricas claras no pueden caracterizarse de manera
definitiva usando sólo la tinción como tal (fig. 36-1); éste es,
sin embargo, aún el método de elección para las investiga-
ciones de inestabilidad cromosómica, posterior a la expo-
sición de los pacientes o de células a agentes clastogénicos.
A principios de la década de 1970 se introducen las pri-
meras técnicas de bandeo cromosómico permitiendo una
identificación mucho más exacta de cada par cromosómi-
co. Esto, a su vez, permitió la detección de alteraciones
estructurales más sutiles relacionadas con condiciones pa-
tológicas específicas. Este capítulo describe y explica los
principios fundamentales de las diversas técnicas de ban-
deo cromosómico que están disponibles y destaca sus prin-
cipales aplicaciones en el laboratorio. También se describe
el procedimiento del análisis citogenético.
Bandeo cromosómico
Desde que se describieron las primeras preparaciones cro-
mosómicas con bandeo a principios de la década de 1970,
346 CAP. 36 BANDEO Y ANÁLISIS CROMOSÓMICO

utilizan la tinción de Leishmann en lugar de la de Giemsa.

Algunos métodos implican el tratamiento previo de los por-
taobjetos con solución salina (2⫻ SSC). Cada cromosoma
exhibe un patrón característico y constante con bandeo G,
permitiendo la identificación exacta de cada par cromosómi-
co y la detección de alteraciones estructurales cromosó-
micas, como deleciones, inversiones y translocaciones.
Es esencial que los portaobjetos sean expuestos a dife-
rentes tratamientos antes del bandeo G o dejarlos a tempe-
ratura ambiente 3 a 4 días, calentarlos durante la noche a
60°C o tratarlos previamente con peróxido de hidrógeno.
El almacenar de manera previa las preparaciones cromo-
sómicas refuerza la integridad de los cromosomas, al ha-
cerlos menos vulnerables a la sobredigestión por la tripsina
(fig. 36-2).

Figura 36-1 Metafase cromosómica con tinción sólida de una

paciente con el síndrome de Down (trisomía 21). Aunque el cro-
mosoma 21 no puede distinguirse del 22 en las preparaciones con
tinción sólida, los cinco cromosomas del grupo G presentes (21s y
22s) están señalados.

ha ocurrido una proliferación rápida de técnicas de tinción

cromosómica permitiendo la caracterización precisa del
cariotipo humano normal. El método de bandeo con Giem-
sa, desarrollado a mediados de la década de 1970, es la téc-
nica más utilizada para el análisis cromosómico rutinario.
Muchos otros métodos de bandeo por lo general se utilizan
sólo para ayudar en la identificación de las alteraciones es-
pecíficas de un cromosoma, cuya naturaleza exacta es in-
cierta, después del análisis de bandeo G.
Aunque se conoce muy poco acerca de la base bioquími-
Figura 36-2 Proliferación en la metafase femenina normal teñida
ca del bandeo cromosómico, los diversos patrones que se
por bandeo G.
obtienen parecen reflejar la mejor manera en que se orga-
niza, por la cual la enorme longitud del DNA humano es
empaquetada dentro de los cromosomas. Las técnicas de Mecanismo
bandeo cromosómico pueden dividirse en dos grupos: a)
aquellas que dan lugar a bandas distribuidas a lo largo de Aunque ninguna hipótesis satisfactoria explica el meca-
todo el cromosoma, como los bandeos G, Q y R; y b) las nismo del bandeo G, parece estar relacionado con la com-
que tiñen un número restringido de regiones específicas del posición del DNA e implica probablemente la eliminación
cromosoma, como el bandeo C, tinciones NOR y DAPI. selectiva de proteínas de diversas regiones del cromosoma.
Se cree que los cromosomas contienen una estructura bá-
sica que se evidencia por medio del procedimiento de ban-
Bandeo Giemsa (bandeo G) deo G. Un número aproximado a los 146 pares de bases de
la cadena de DNA humano está enrollada alrededor de un
El bandeo G de los cromosomas puede hacerse con dife- centro que consiste en ocho moléculas de la proteína his-
rentes químicos que producen bandas alternas de intensidad tona, para producir las réplicas de unidades llamadas nu-
oscura y clara a lo largo de los cromosomas. El método más cleosomas o cromómeros. Los nucleosomas sucesivos se
utilizado implica la digestión de preparaciones cromosómi- ordenan como cuentas sobre un collar. Esta fibra elemental
cas con la tripsina, una enzima proteolítica, seguida por una de nucleosomas ligados se enrolla sobre sí misma como un
tinción con Giemsa. Muchos métodos de bandeo G ahora solenoide para formar la fibra de cromatina. Las fibras de
 BANDEO CROMOSÓMICO 347

cromatina se unen y se enrollan más dentro de los paquetes

finales del cromosoma. Se cree que las bandas G oscuras
pueden correlacionarse simplemente con estos cromóme-
ros que parecen cuentas, y el patrón de bandeo G, por tanto,
refleja la organización estructural de la cromatina a lo largo
del cromosoma.
Se ha sugerido, como alternativa, que las bandas G oscu-
ras y claras se correlacionan con el contenido funcional que
difiere del DNA en esas regiones del cromosoma. Los estu-
dios de replicación exhiben que las regiones del DNA con
tiempos de replicación similares se agrupan con el DNA en
las bandas G oscuras y se replican de manera tardía en la
fase S, en comparación con el DNA de la banda G clara. Los
estudios de hibridación in situ muestran una correlación en-
tre el patrón de bandeo G y la localización de las secuencias
repetitivas del DNA. Se ha demostrado que las bandas G
oscuras son ricas en secuencias repetitivas del DNA tipo L1, Figura 36-3 Bandeo Q. La proliferación en la metafase de un
las cuales son relativamente ricas en AT y codifican muy paciente con un cromosoma X anormal, derivado de una reestruc-
pocos genes expresados. También se ha verificado que las turación t(X;Y). La flecha pequeña indica el cromosoma Y nor-
bandas G claras son ricas en secuencias repetitivas del DNA mal; la flecha grande indica X anormal con heterocromatina Yq
tipo Alu, que son relativamente ricas en GC y codifican para ligada a Xp.
muchos genes que se expresan.
oscuro. Excepciones notables incluyen la porción distal del
brazo largo del cromosoma Y, que muestra fluorescencia
Aplicación muy brillante. Las regiones satélites de los cromosomas
acrocéntricos (13 a 15 y 21 a 22) también muestran los
El bandeo G es en gran medida el método más utilizado patrones característicos del bandeo Q (fig. 36-3).
para el análisis citogenético rutinario en investigaciones
clínicas. Este método permite la identificación de cada par
cromosómico y la detección de la mayor parte de las al- Mecanismo
teraciones cromosómicas numéricas y estructurales. Los
laboratorios citogenéticos que no emplean como rutina el Debido a que los patrones del bandeo Q y del bandeo G
bandeo G usan por lo general el bandeo R. Los otros mé- muestran tales semejanzas, los mecanismos tienen influen-
todos de bandeo cromosómico se utilizan sólo cuando un cias claras por los mismos parámetros de la composición
análisis de bandeo G inicial detecta una alteración cromo- del cromosoma (véase bandeo G). El patrón del bandeo
sómica que requiere investigación adicional para su carac- Q se explica por la especificidad de las mostazas de ni-
terización exacta. El patrón de bandeo G es, a grosso modo, trógeno por la guanina. La fluorescencia de la quinicrina
similar al patrón de bandeo Q. se realza en las regiones de DNA ricas en secuencias AT
y se opaca en las regiones ricas en GC, lo que produce el
patrón del bandeo Q. El contenido de DNA en AT/GC va-
Bandeo con quinicrina (bandeo Q) riante de las bandas cromosómicas explica, por tanto, las
diferencias en la intensidad de la tinción cuando se tratan
El bandeo Q, la primera técnica de bandeo cromosómico, con quinicrina.
se introdujo en 1968, cuando las preparaciones cromosó-
micas eran teñidas con la mostaza de quinicrina. El ban-
deo Q en la actualidad se produce por lo general usando Aplicaciones
el dihidrocloruro de quinicrina, que es menos tóxico. Una
serie de regiones brillantes y opacas que despiden luz fluo- El bandeo Q requiere un microscopio de fluorescencia para
rescente se revelan a lo largo de los cromosomas cuando se el análisis. El bandeo Q en preparaciones cromosómicas no
observan con microscopia fluorescente (de 450 a 500 nm). es conveniente para las investigaciones citogenéticas ruti-
El patrón de bandeo Q se asemeja enormemente al patrón narias, pues la fluorescencia se pierde muy rápido durante
de bandeo G, con bandas Q que despiden luz fluorescente el análisis. Este método de bandeo, sin embargo, es útil
brillante que corresponden con las bandas G que se tiñen de para el examen específico de los heteromorfismos relacio-
348 CAP. 36 BANDEO Y ANÁLISIS CROMOSÓMICO
nados con el cromosoma Y y las regiones satélites de los
cromosomas acrocéntricos. Los patrones del bandeo Q del
brazo corto y de los heteromorfismos satélites pueden, por
ejemplo, usarse a veces para determinar el origen parental,
y la etapa sin separación meiótica en las trisomías que in-
volucran cromosomas acrocéntricos.
Bandeo reverso (bandeo R)
El bandeo R cromosómico es complementario de las ban-
das Q y G, y su primera aparición se reporta en 1971. Las
laminillas se incuban en un amortiguador de fosfato a 85 a
89ºC, después se tiñen con Giemsa o con naranja de acridi-
na, lo que produce un patrón de bandas, que es el contrario
de los bandeos G o Q. Cuando se tiñen con Giemsa, las
bandas son pálidas y requieren contraste de fases para el
análisis. Ésta fue la primera técnica de bandeo no fluores-
cente en desarrollarse. Usando la tinción con naranja de
acridina, las bandas R positivas despiden luz fluorescente
verde/amarilla, mientras las bandas R negativas emiten una
luz fluorescente naranja/roja. El bandeo R es muy exitoso
si las laminillas se han envejecido a temperatura ambiente
por varios días o a 60°C durante la noche. Las laminillas
recién hechas requieren tiempos de incubación más cortos,
dentro de un amortiguador (fig. 36-4).
Figura 36-4 Bandeo R usando naranja de acridina.
Mecanismo
Igual que en los bandeos G y Q, el patrón del bandeo R
parece reflejar la composición estructural y funcional de
los cromosomas. Las bandas R positivas son ricas en ba-
ses GC, se replican en forma temprana, y contienen genes
housekeeping, mientras las bandas R negativas son ricas
en AT, se replican de manera tardía y no contienen genes
housekeeping. El patrón de bandeo R se produce por la
desnaturalización diferencial de las regiones cromosómi-
cas ricas en GC y ricas en AT. Las regiones ricas en AT se
desnaturalizan a una temperatura más baja y despiden luz
fluorescente roja con el naranja de acridina. Este último
cuando se intercala entre los pares de bases de las regiones
ricas en GC de doble hebra despide luz fluorescente ama-
rilla. No está muy claro, en su totalidad, por qué los trata-
mientos con Giemsa también producen bandeo R. Puede ser
debido a la interacción diferencial de las proteínas con las
regiones cromosómicas ricas en AT y en GC. Que las lami-
nillas envejecidas requieran tiempos más cortos de incuba-
ción y produzcan un mejor bandeo R sugiere, otra vez, que,
como las laminillas están envejecidas, su estructura general
llega a ser más estable y menos vulnerable a la degradación
mediante diferentes agentes (véase bandeo G).
Aplicación
Aunque los laboratorios citogenéticos utiliza el bandeo
G para investigaciones de rutina, el bandeo R es el méto-
do empleado para el análisis rutinario del cromosoma en
muchos laboratorios franceses. Esta técnica de bandeo en
general no revela ninguna nueva información que no esté
disponible siguiendo el bandeo G, pero en ocasiones se em-
plea para determinar con más exactitud los puntos de rotura
de las alteraciones estructurales, sobre todo si existen pun-
tos de rotura cromosómicos en las porciones terminales.
Bandeo de heterocromatina constitutiva (bandeo C)
El procedimiento del bandeo C implica tratar los cromoso-
mas con ácido clorhídrico (HCl), álcali (BaOH2) y solución
salina caliente (2⫻SSC). Las preparaciones cromosómicas
del bandeo C por lo general se tiñen ligeramente, excepto
las del teñido oscuro de las regiones de heterocromatina
constitutiva. Éstas se sitúan en los centrómeros de todos los
cromosomas, lo cual no ocurre en el cromosoma Y, que se
localizan en la región distal del brazo largo (fig. 36-5).
Mecanismo
Se piensa que los tratamientos astringentes para la técni-
ca de bandeo C facilitan la pérdida preferencial de DNA
y de proteína de las regiones cromosómicas sin banda C.
La depuración y la desnaturalización sucesivas de DNA
cromosómico ocurren durante los tratamientos con ácido
clorhídrico y álcali. Además, los fragmentos pequeños de
DNA se pierden durante el tratamiento con sal, dejando
 BANDEO CROMOSÓMICO
Figura 36-5 El bandeo C de una proliferación en la metafase de
un paciente con una inversión del cromosoma 4. El cromosoma
4 invertido (flecha grande) tiene la posición del centrómero des-
plazada hacia el extremo del telómero del brazo corto (punta de
flecha). Los cromosomas normales del grupo B (4 y 5) no pueden
distinguirse usando sólo bandeo C (flechas pequeñas).
sólo la heterocromatina centromérica muy compactada.
Las proteínas no histónicas ligadas a las regiones con ban-
da C pueden prevenir la desnaturalización de DNA que se
produce en esos sitios.
Aplicaciones
Las bandas C de todos los cromosomas, especialmente
de los cromosomas 1, 9, 16 y Y, varían de tamaño entre ho-
mólogos así como entre individuos. La variación extrema
del tamaño de las bandas C no tiene ningún efecto feno-
típico, pues estas regiones contienen sólo heterocromati-
na constitutiva y ningún gen importante. Si es confuso que
una banda adicional o un segmento anormal del cromo-
soma, detectado por bandeo G, represente una variación
normal de una región heterocromática o una alteración cro-
mosómica dicromática de posible importancia clínica, el
análisis de bandeo C puede proveer información conclu-
yente. El bandeo C puede, en ocasiones, permitir la de-
terminación del origen de la no disyunción en pacientes
con trisomías. Cuando el cromosoma implicado tiene una
variante heterocromática notable, entonces la comparación
de las preparaciones para bandeo C del caso índice y de
ambos padres puede indicar en cuál de los padres, y posi-
blemente en qué etapa de la meiosis, ocurre el error de la
no disyunción que causa la trisomía.
349
Tinción de la región organizadora nucleolar
(tinción NOR)
Los genes ribosómicos que codifican para el RNA, forman
y mantienen el nucleolo en núcleos interfásicos, están situa-
dos en los brazos cortos de los cromosomas acrocéntricos
satélites (13, 14, 15, 21 y 22). Cuando las preparaciones del
cromosoma se incuban durante toda la noche con solución
de nitrato de plata, estas regiones organizadoras nucleo-
lares (NOR) se tiñen de oscuro (fig. 36-6). Los satélites
Figura 36-6 Metafase teñida con NOR de un paciente con una
translocación recíproca entre los cromosomas 7 y 14. La flecha
indica el cromosoma 14 anormal con el material del cromoso-
ma 7 translocado sobre la NOR.
de los cromosomas acrocéntricos se ven con frecuencia en
grupo dentro de las células. Este fenómeno, llamado re-
lación basada en los satélites, refleja una función común,
probablemente, de las diversas NOR en la organización del
nucleolo celular.
Mecanismo
El teñido de NOR implica la extracción de DNA, RNA e
histonas a partir de los cromosomas. Realmente son pro-
teínas residuales adyacentes a las NOR, más que NOR sin
histona, las que se tiñen selectivamente con este método.
Los estudios han demostrado que este método tiñe sólo las
NOR activas que participaron en la formación del nucleolo
en la interfase precedente del ciclo de la célula.
350 CAP. 36 BANDEO Y ANÁLISIS CROMOSÓMICO
Aplicación
El número de las NOR que se detectan por proliferación
en la metafase varía en los individuos porque sólo se ti-
ñen las NOR activas que participan en la formación del
nucleolo durante la etapa interfase precedente. El patrón
de la tinción de la NOR de cromosomas acrocéntricos es
consistente dentro de un individuo y es hereditario. Los
patrones de las NOR y el aspecto por el bandeo Q de los
satélites acrocéntricos son, por tanto, útiles para determi-
nar el origen parental y/o la etapa sin disyunción meiótica
implicada en las trisomías que involucra a estos cromoso-
mas. La tinción de las NOR es útil para la caracterización
de cromosomas marcadores pequeños, para confirmar si
poseen o no regiones satélite y, por tanto, se derivan a partir
de un cromosoma acrocéntrico.
Bandeo DA-DAPI
Cuando los cromosomas se tiñen con el colorante fluo-
rescente 4,6-diamino-2-fenil-indol (DAPI) y se tratan con
distamicina (DA) en una contratinción no fluorescente, un
subconjunto de bandas C fluorescentes se revela. Las re-
giones heterocromáticas de los cromosomas 1, 9, 16 y Y,
además de la proximal del brazo corto del cromosoma 15
despiden luz fluorescente muy brillante. Usando sólo DAPI
se produce un patrón de bandeo similar al bandeo Q (fig.
36-7).
Figura 36-7 Metafase masculina teñida usando bandeo DA/
DAPI. Las flechas indican el cromosoma 15s con brazos cortos
que despiden luz fluorescente brillante.
Mecanismo
DAPI, que une al DNA, tiene una afinidad por los pares de
bases AT. La unión de DAPI, en consecuencia, sólo produ-
ce un patrón de bandeo Q débil. Aunque la fluorescencia
de DAPI es realzada por ambos pares de bases AT y GC,
existe un realce significativo de la fluorescencia en regio-
nes de DNA ricas en AT. Existe también cierta evidencia
de que DAPI se une a grupos AT en el surco menor de la
hélice doble del DNA. También DA muestra afinidad por
la unión al DNA específica de AT. Aunque los dos coloran-
tes usados tienen preferencia de apareamiento con bases
similares, poseen diferentes afinidades de unión y estructu-
ras diferentes. La fluorescencia diferencial que se obtiene
puede deberse a la unión competitiva entre los dos coloran-
tes, que se unen en sitios similares pero no idénticos. Alter-
nativamente, DA es probable que bloquee el enlazamiento
de DAPI en regiones eucromáticas, mientras los sitios de
enlazamiento de DAPI permanecen disponibles en regio-
nes heterocromáticas.
Aplicaciones
El bandeo DA/DAPI es predominante cuando se le utiliza
para la interpretación de ciertas alteraciones del cromoso-
ma detectadas al usar los métodos más rutinarios de bandeo
(bandeo G o R), por ejemplo, el bandeo DA/DAPI puede
usarse donde un cromosoma modificado en su estructura
tiene un punto de rotura cercano a una región teñida selec-
tivamente con bandeo DA/DAPI. Este bandeo es útil, en
particular, para estudiar cromosomas marcadores satélites
pequeños. Esta técnica puede identificar aquellos cromo-
somas marcadores que involucran la región proximal del
extremo del cromosoma 15. La tinción DAPI es también
la contratinción normal usada para la hibridización in situ
fluorescente de rutina en preparaciones cromosómicas.
Bandeo de replicación
Un patrón del bandeo G o R puede producirse sobre pre-
paraciones cromosómicas si se desarrollan en presencia de
5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU), análogo de la timidina, y
se tiñen con el colorante fluorescente Hoechst 33258. Este
método utiliza el hecho de que diversas regiones del com-
plemento del cromosoma se replican en diferentes etapas
durante la fase S; también confía en la incorporación de la
marca dentro del DNA, así que BrdU se agrega a células
vivas en un cultivo tisular. Controlando la sincronización
cuando el pulso de BrdU se administra a los cultivos celu-
lares relativa al tiempo de recolección, un patrón de bandeo
que se replica temprano o tardíamente puede producirse. Si
 BANDEO CROMOSÓMICO
Figura 36-8 Metafase prolongada después del bandeo de repli-
cación. Esta preparación se obtuvo a partir de cultivos sanguíneos
a los cuales se agregó BrdU seis horas antes de la recolección.
Los cromosomas muestran un patrón de bandeo R. Este paciente
porta una translocación t(X;11). En este caso, X normal es repli-
cado tardíamente. Con cultivos con pulsos tardíos de BrdU, el X
que se replica tarde se tiñe ligeramente (flechas).
la BrdU se agrega al iniciar el cultivo, pero se elimina alre-
dedor de 6 h antes de la recolección a las 48 h, se obtiene
un patrón de bandeo G. Si la BrdU se agrega sólo cerca de
6 h antes de que los cultivos sean recolectados, se producen
bandas R (fig. 36-8).
Si las células experimentan dos ciclos completos de re-
plicación en presencia de BrdU, las cromátides hermanas de
cada cromosoma se tiñen diferencialmente. El patrón de la
coloración doble que se obtiene permite la detección de los
intercambios de cromátides hermanas (ICH), que son pun-
tos a lo largo de los cromosomas donde el material de la
cromátide se intercambia entre cromátides hermanas. Las
preparaciones de ICH se tiñen con el fluorocromo Hoechst
33258. Entonces o son vistos por microscopia de fluores-
cencia (360 a 400 nm) o, si primero se exponen a la luz
UV y en seguida se tiñen con el colorante Giemsa (fluores-
cencia más tinción Giemsa [FPG]), pueden analizarse por
medio de la microscopia de luz (fig. 36-9).
Mecanismo
El BrdU es un análogo de la timidina que se incorpora muy
rápido dentro de los cromosomas. Cuando los cromosomas
se tiñen con el fluorocromo Hoechst 33258 (que se une a
351
Figura 36-9 Prolongaciones de la metafase teñidas para los
intercambios de cromátides hermanas (ICH). a) Metafase de
cultivos sanguíneos con sólo tres ICH espontáneos señalados. b)
Metafase de cultivos sanguíneos del mismo individuo, incubados
con el agente intercalante (alquilante) mitomicina C, mostrando
un aumento muy significativo en el nivel de ICH (> 100/célula).
pares de bases ricas en AT), las regiones del cromosoma
que se replican en presencia de BrdU contienen DNA sus-
tituido con BrdU. Cuando BrdU está presente al inicio del
cultivo, sólo se observa durante la parte temprana de un
ciclo de la replicación del DNA, y por tanto las regiones
cromosómicas que se replican temprano en la fase S (ban-
das R) llegan a sustituirse con BrdU, y por tanto despiden
luz fluorescente débil o se tiñen ligeramente con Giemsa.
Las bandas G que se replican tarde en la fase S, después de
que BrdU se ha eliminado de los cultivos, y se incorpora la
timidina, despiden luz fluorescente brillante, o se tiñen de
oscuro con Giemsa (bandeo G). De manera alterna, si sólo
se añade BrdU a los cultivos alrededor de 6 horas antes de
la recolección, sólo está presente en la última parte de un
ciclo de la réplica del DNA y a las regiones que se replican
temprano (bandas R) se les incorpora timidina, y despiden
luz fluorescente brillante o se tiñe oscuro con Giemsa. Sólo
352 CAP. 36 BANDEO Y ANÁLISIS CROMOSÓMICO
las regiones que se replican tarde (bandas G) llegan a sus-
tituirse con BrdU y, por tanto, despiden luz fluorescente
débil o se tiñen ligeramente con Giemsa (bandeo R).
Aunque los cromosomas homólogos muestran patrones
similares de replicación, en mujeres pueden distinguirse
los cromosomas X que se replican temprana y tardíamente.
El cromosoma X que se replica tarde se tiñe más oscuro
con bandeo de replicación BrdU de pulso temprano y se
tiñe levemente con bandeo de replicación BrdU de pulso
tardío (fig. 36-8).
El patrón de tinción de dos colores que se obtiene cuan-
do BrdU está presente en los cultivos celulares durante dos
ciclos de replicación refleja la incorporación asimétrica de
BrdU dentro del DNA cromosómico. Mediante replicación
semiconservadora, cada hebra nueva de DNA consiste de
una original de DNA y una nueva construida. Después de dos
ciclos de replicación en presencia de BrdU, una cromátide
contiene DNA con BrdU sustituido dentro de una hebra
de DNA, mientras que su cromátide hermana contiene dos
hebras de DNA sustituidas con BrdU. Esta diferencia quí-
mica entre las cromátides hermanas explica la que existe
en la intensidad de teñido que se obtiene. La intensidad es
proporcional a la cantidad de DNA que contiene timidina
presente en cada cromátide. Cuando las preparaciones cro-
mosómicas se tiñen usando la fluorescencia y el método de
Giemsa, más DNA se pierde a partir de la cromátide herma-
na sustituida con BrdU que su contraparte, por eso produce
el patrón de teñido oscuro y claro característico.
Aplicación
Además de aportar métodos alternativos para los bandeos
G y R, los patrones de teñido que se obtienen después de
administrar un pulso de BrdU temprano o tardío en el ciclo
celular se utilizan sobre todo para los estudios de replica-
ción. En mujeres normales un cromosoma X se inactiva
en cada célula por un proceso aleatorio, y este X inactivo
siempre es el último cromosoma en completar su replica-
ción en cada ciclo celular. El bandeo de replicación es útil
para investigar el patrón de la inactivación X en las muje-
res que portan alteraciones estructurales que involucran el
cromosoma X, donde el patrón de la inactivación del X por
lo general es un evento no aleatorio. El ejemplo ilustrado
en la figura 36-8 muestra una paciente que porta una trans-
locación equilibrada t(X;11). La tinción de replicación
muestra que el cromosoma X normal se replica tarde en
todas las células. Este sesgo del patrón de la inactivación
X aleatorio normalmente asegura que los segmentos auto-
sómicos implicados en tales translocaciones autosoma-X
no estén también inactivados, lo que tendría un impacto
clínico deletéreo.
La producción de patrones de teñido cromosómico de do-
ble color permite la detección de los intercambios de cromáti-
des hermanas. Éstos son puntos a lo largo de las cromosomas
donde hay intercambio de material entre las dos cromátides
hermanas de cromosomas individuales, creando un aspecto
de “tablero de damas”. Las células humanas normales mues-
tran una frecuencia media de 5 a 8 ICH/célula, pero se ob-
serva que los niveles de ICH aumentan con la exposición a
muchos mutágenos. El uso principal de esta técnica es, por
tanto, un método para el monitoreo de daño cromosómico
inducido por mutágenos, en pacientes o células. En muchos
casos, ICH es más sensible para la detección del daño cromo-
sómico que para la medición de las aberraciones cromosó-
micas (fig. 36-9). Sin embargo, no todos los mutágenos de la
prueba muestran una correlación positiva entre la rotura cro-
mosómica inducida y los ICH inducidos, indicando por ello
que estos dos parámetros reflejan expresiones diferentes e in-
dependientes del daño inducido por mutágenos. Este método
también se utiliza como prueba diagnóstica para el desorden
de la inestabilidad cromosómica, el síndrome de Bloom, en
el cual las células muestran un aumento significativo del ni-
vel basal normal de los ICH espontáneos. Los ICH también
pueden utilizarse para estudiar la cinética celular indicando la
duración de las diversas etapas del ciclo celular.
Análisis cromosómico
La mayor parte de los análisis citogenéticos rutinarios se
realiza examinando las preparaciones en metafase bandea-
das (principalmente por bandeo G o R). El análisis citoge-
nético es una disciplina muy especializada del laboratorio
y se requiere un entrenamiento de varios años antes de que
un citogenetista llegue a ser competente en el reconoci-
miento del cariotipo normal y en la detección de la varie-
dad de alteraciones cariotípicas que puedan encontrarse.
Clasificación de cromosomas bandeados y nomenclatura
Los cromosomas se identifican, se clasifica su cariotipo y
describen usando las pautas propuestas por el Sistema In-
ternacional de Nomenclatura Cromosómica (ISCN). Éste
es el informe publicado por el Comité Permanente sobre
Nomenclatura Citogenética Humana. La terminología
básica para describir el cariotipo humano lo propuso este
grupo en 1971 (nomenclatura de París). Las características
principales que distinguen los cromosomas son longitud,
posición del centrómero, presencia de las constricciones
secundarias (satélites) y patrón de bandeo. El centróme-
ro es la constricción primaria que divide cada cromosoma
en un brazo corto (brazo p) y en uno largo (brazo q). Los
 ANÁLISIS CROMOSÓMICO
satélites son constricciones secundarias situadas en los ex-
tremos de los cromosomas 13 a 15, 21 y 22. Los autosomas
son numerados en pares por tamaño decreciente a partir
de 1 a 22, dejando aparte los cromosomas del sexo (X y
Y). De acuerdo con la longitud, la posición del centrómero
y los satélites, los cromosomas del cariotipo humano sólo
pueden clasificarse en siete grupos, A-G (cromosoma X in-
cluido en el grupo C/cromosoma Y incluido en el grupo G)
(fig. 36-10).
Figura 36-10 Cariotipo con bandeo G de un paciente con una
translocación recíproca equilibrada, que involucra el brazo corto del
cromosoma 5 y el brazo largo del cromosoma 14. Los cromosomas
anormales están señalados.
De acuerdo con la posición del centrómero, hay tres
tipos de cromosoma: metacéntrico (centrómero en el cen-
tro), acrocéntrico (centrómero en un extremo) y submeta-
céntrico (centrómero excéntrico). Los pares cromosómicos
individuales pueden, sin embargo, sólo identificarse y cla-
sificarse exactamente a partir de sus patrones de bandeo. El
ISCN incluye un sistema completo de mapas cromosómi-
cos diagramáticos (ideogramas). Estos ideogramas ilustran
cada cromosoma, dividiéndolos en segmentos convenientes
(regiones) de longitud casi igual definiendo varios puntos
establecidos (marcas). Estas marcas incluyen los extremos
del cromosoma (telómeros), los centrómeros y otras ban-
das prominentes. Cada región se numera secuencialmen-
te, moviéndose hacia afuera, en cualquier dirección de los
centrómeros. Por ejemplo, 1p3 representa el cromosoma
1, brazo corto, región 3. Cada banda importante dentro de
353
una región también se numera en secuencia, iniciando con
la banda 1, la más cercana al centrómero. Por tanto, 1p31
indica el cromosoma 1, brazo corto, región 3, banda 1. La
calidad de las preparaciones cromosómicas ha mejorado a
través de los años, con la producción de cromosomas más
alargados. Con esta mejora, se muestra que ciertas bandas,
vistas en preparaciones cromosómicas como más cortas, ac-
tualmente se resuelven en diferentes bandas más finas. Por
esta razón, el ISCN produce actualizaciones de los ideo-
gramas cromosómicos que corresponden a cromosomas
con extensiones mejoradas más largas. Donde se encuentra
que bandas cromosómicas se subdividen en más bandas, se
asignan números a las sub-bandas. Por convenio, un punto
decimal se coloca antes de cualquier sub-banda y hasta dos
nuevos números se añaden después de esto para describir
las nuevas sub-bandas. Por tanto, 1p31.2 describe el cro-
mosoma 1, brazo corto, región 3, banda 1, sub-banda 2 (fig.
36-11).
Figura 36-11 Ideograma del cromosoma 1, destacando los brazos
p y q, las regiones cromosómicas sobre el brazo p y las marcas sobre
el brazo q.
El sistema ISCN permite la descripción exacta de
los puntos de rotura en todas las reestructuraciones cro-
mosómicas. Al usar ISCN para describir alteraciones ca-
riotípicas, el citogenetista debe utilizar el ideograma más
apropiado que muestre la resolución de bandeo equivalente
al cromosoma que se analiza.
354 CAP. 36 BANDEO Y ANÁLISIS CROMOSÓMICO
Variación cromosómica
Para reconocer alguna alteración cromosómica presente en
cualquier preparación de los cromosomas humanos, el ci-
togenetista debe estar muy familiarizado con el aspecto del
cariotipo humano normal. Esto es complicado por la ocu-
rrencia de variación considerable en ciertas regiones he-
terocromáticas, incluyendo polimorfismos centroméricos
y satélites. Es importante que estas regiones de variación
cromosómica normal se reconozcan y distingan de otras
alteraciones cromosómicas clínicas significativas.
Análisis cromosómico
La mayor parte de los análisis rutinarios del cromosoma
se ejecuta examinando microscópicamente preparaciones
en metafase bandeadas. Las metafases convenientes se lo-
calizan primero tamizando las laminillas bandeadas, con
microscopia de bajo aumento (magnificación 100⫻). Las
metafases convenientes entonces se examinan con una
magnificación más alta (generalmente 1 000⫻). Para el
análisis de la constitución del cariotipo, sólo cinco o seis
metafases de calidad conveniente necesitan examinarse,
excepto donde un posible mosaicismo del cromosoma
puede esperarse, y más células deben analizarse. La cali-
dad de las metafases seleccionadas para el análisis depende
en gran parte del objetivo de la investigación citogenética.
Si se verifica una alteración numérica obvia (p. ej., trisomía
21) entonces no se requieren metafases de alta calidad. Sin
embargo, si una alteración sutil puede estar presente (como
una deleción o reestructuración pequeña que involucre seg-
mentos mínimos), entonces deben examinarse más prepa-
raciones cromosómicas alargadas.
Si el citogenetista está satisfecho porque todos los pares
cromosómicos muestran el patrón de bandeo normal reco-
nocido, puede informarse un cariotipo normal. Los carioti-
pos se describen usando la nomenclatura ISCN. En general,
ésta tiene el orden siguiente: número total de cromosomas,
constitución del cromosoma del sexo, descripción de la al-
teración (si está presente), y cada uno de éstos es separado
por una coma. Así, la fórmula del cariotipo femenino nor-
mal es 46,XX y el cariotipo masculino normal es 46,XY.
Donde se reconoce una alteración del cromosoma, se asig-
na la fórmula apropiada del cariotipo. Cada tipo de altera-
ción estructural tiene una abreviatura ISCN asociada, por
ejemplo, “t” para la translocación, “i” para la inversión, etc.
Los cromosomas implicados y cualquier punto de rotura se
incluyen en la fórmula del cariotipo asignada, por ejem-
plo, el cariotipo anormal ilustrado en la figura 36-10 tie-
ne la fórmula 46,XY,t(5;14)(p15.2;q24.1). Esto indica que
el cromosoma 5 está fracturado en el brazo p en la banda
15.2, mientras que el cromosoma 14 presenta una rotura
en el brazo q en la banda 24.1. Si la alteración es indistinta
o los puntos de rotura son confusos en el examen micros-
cópico, la preparación de cariotipos puede ayudar a carac-
terizar la naturaleza exacta de la alteración. Esto habría
implicado anteriormente fotografiar las células anormales
usando la fotomicroscopia, desarrollar e imprimir la pelí-
cula, cortando y recambiando los cromosomas en el orden
del cariotipo estándar. En la actualidad, la producción de
cariotipos en los laboratorios citogenéticos de diagnóstico
se hace más fácil usando sistemas de análisis de imagen
especializados. Estos sistemas acoplan al microscopio con
una cámara fotográfica digital que se usa para capturar una
imagen digital de la preparación metafásica que se preten-
de analizar. El software citogenético especializado enton-
ces permite el arreglo de los cromosomas en la pantalla de
la computadora para generar un cariotipo final, que pue-
de imprimirse o almacenar, o ambos, electrónicamente.
Análisis cromosómico para las alteraciones
adquiridas del cromosoma
El análisis citogenético de alteraciones malignas (leuce-
mias y tumores sólidos) se realiza de rutina para detectar
cualquier alteración cromosómica adquirida asociada. La
detección de tales alteraciones proporciona la información
vital del diagnóstico de la enfermedad, el pronóstico del pa-
ciente y para monitorear la respuesta a la terapia. El análisis
cromosómico para las alteraciones cromosómicas adquiri-
das produce algunas diferencias importantes del análisis
de constitución. Las alteraciones cromosómicas adquiridas
son clonales, confinadas sólo a las células malignas. Ade-
más, las metafases que se obtienen de las células malignas
muestran típicamente morfología inferior (bandas cortas y
pobres) comparadas con las células benignas. Es impor-
tante, primero, que el citogenetista analice un número más
grande de células para permitir la detección de alteracio-
nes clonales pequeñas (es decir, no todas las células que se
detectan pueden pertenecer al clon anormal), y segundo,
que una selección representativa de todas las metafases sea
examinada para evitar la selección inadvertida de la mejor
calidad, pero posiblemente de las células benignas.
Citogenética molecular
El desarrollo significativo más reciente en el campo de la
citogenética de diagnóstico rutinario ha sido la introduc-
ción de técnicas citogenéticas moleculares en la década
de 1980. Existe una amplia gama de sondas, disponibles
en el comercio, las cuales pueden utilizarse para resaltar
regiones específicas del cariotipo humano por la técnica
de hibridación in situ fluorescente (FISH). Ésta permite la
 LECTURAS ADICIONALES
detección de algunas alteraciones muy sutiles que están
más allá de los límites de cualquier técnica de bandeo. Las
sondas FISH pueden utilizarse para caracterizar rápido y
con exactitud las alteraciones complejas o no identificadas
del cromosoma, que se detectan usando técnicas de bandeo.
Además, las sondas FISH permiten que sean tamizados es-
pecímenes para alteraciones citogenéticas importantes, aún
cuando extensiones de la metafase dividiéndose no están
disponibles. Esto permite el diagnóstico prenatal rápido, ya
que las muestras del líquido amniótico pueden tamizarse
para alteraciones específicas por FISH después de 24 ho-
ras, en lugar de esperar dos semanas para que suficientes
células crezcan en cultivo para producir preparaciones cro-
mosómicas. La FISH también es particularmente útil en los
estudios de malignidad donde las células mitóticas pueden
ser difíciles de obtener.
Todos los laboratorios citogenéticos de diagnóstico ruti-
nario ahora confían mucho en estas pruebas FISH, las cua-
les complementan los métodos rutinarios de bandeo. En
muchos casos las pruebas FISH son realmente más apro-
piadas que el análisis alternativo del cariotipo completo.
Lecturas adicionales
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techniques. In Human Cytogenetics Constitutional Analysis:
355
A Practical Approach, 3rd edn, Rooney DE (ed.). Oxford Uni-
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Verma RS, Babu A (eds) Human Chromosomes: Manual of Basic
Techniques. 1989: Pergamon, New York.
 37
Hibridación in situ fluorescente
Ivor Hickey
La hibridación in situ fluorescente (FISH) es una técnica
poderosa que desempeña una parte significativa en varias
áreas actuales de la investigación genética. Se refiere a una
serie de procedimientos relacionados, en los cuales molé-
culas de ácido nucleico de cadena sencilla (sondas) mar-
cadas con químicos que por sí mismos son fluorescentes o
pueden detectarse por microscopia de inmunofluorescen-
cia, son útiles para identificar secuencias específicas del
ácido nucleico objetivo en preparaciones citológicas.
Esta técnica se deriva directamente de los primeros ex-
perimentos originales de hibridación del ácido nucleico ini-
ciados por Speigleman en la década de 1960, que adaptaron
varios grupos, usando sondas marcadas con radiactividad
para identificar secuencias de ácidos nucleicos en material
fijado sobre el portaobjetos que se observa al microscopio.
Los ejemplos iniciales incluyeron la identificación de los ge-
nes del RNA ribosómico en los nucleolos de los oocitos de
Xenopus y del DNA satélite centromérico en los cromoso-
mas en metafase del ratón. Aunque los protocolos avanza-
ron mucho desde entonces, los pasos básicos permanecen
en gran parte inalterados. Todas las variaciones de la técnica
incluyen una sonda de ácido nucleico, una preparación cito-
lógica y un sistema de detección. Los pasos principales en
el sistema se describen en este punto; antes, las variaciones
y las aplicaciones de la técnica se comparan.
Elección de la sonda
En muchos casos un clon de DNA genómico puede utili-
zarse, aunque, como se verá más adelante, otras fuentes de
DNA también pueden utilizarse para el teñido de cromo-
somas. En algunas aplicaciones se usan las moléculas de
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
RNA, aunque es muy raro en la actualidad. La sonda debe
marcarse antes de usarse, por orden de detección, el ma-
terial se hibrida al final del procedimiento. Es importante
tomar en cuenta que un factor en la detección de sonda
es la longitud de la misma. Bajo los mismos sistemas de
marcado y de detección, una sonda más pequeña proyecta
siempre una señal más débil que una más larga. Aunque
las sondas tan pequeñas como de 500 bases es posible de-
tectarlas en ciertas circunstancias, los cósmidos, vectores
derivados del bacteriófago ␭, que contienen casi 40 kb del
DNA clonado, son las fuentes más utilizadas de la sonda.
El DNA clonado en vectores que transportan insertos más
grandes, como los cromosomas artificiales bacterianos
(BAC), los cromosomas artificiales P1 (PAC) o los cro-
mosomas artificiales de levadura (YACS), trabaja bien en
todos los casos.
Marcación de las sondas
Los marcadores que se utilizan con más frecuencia en los
experimentos de FISH son los trifosfatos deoxiuridina modi-
ficados. Las modificaciones implican la adición de haptenos,
grupos inmunorreactivos tales como digoxigenina o biotina,
los cuales se enlazan a la posición 5 del anillo de pirimidina
por un brazo largo espaciador. Éstos pueden detectarse por
técnicas de inmunofluorescencia indirecta. Alternativamen-
te, las sondas se pueden marcar con nucleósidos trifosfatos
que contienen un fluorocromo tal como la fluoresceína y de-
tectarse directamente por su propia fluorescencia. Es posi-
ble marcar las sondas usando algunos de los sistemas que se
emplean con frecuencia en otra parte en biología molecular.
Éstos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
358 CAP. 37 HIBRIDACIÓN IN SITU FLUORESCENTE
nick translation y el marcado por medio de iniciadores de
secuencia aleatoria (random primer). De éstos, el nick trans-
lation es, probablemente, el más popular puesto que produce
fragmentos de DNA pequeños y marcados. El tamaño de la
sonda es importante, ya que las moléculas de sondas grandes
tienen dificultad para difundirse a través del material citológi-
co para alcanzar su DNA objetivo, y su uso resulta a menudo
en mucha fluorescencia del fondo. El tamaño óptimo de la
sonda está entre 200 y 500 bases. Las sondas que se producen
por PCR son cada vez más importantes en las técnicas de pin-
tado del cromosoma y de la FISH de fibra que se describen
con detalle más adelante.
Hibridación
Aquí los procedimientos siguen ampliamente los de otros
protocolos moleculares de hibridación de ácidos nucleicos.
Las diferencias se relacionan con las tentativas de mantener
la morfología de la preparación citológica en buenas condi-
ciones, y para prevenir la unión de la sonda a las secuencias
repetidas distribuidas por todo el genoma. Para mantener
la integridad de la preparación citológica, la hibridación se
lleva a cabo normalmente a temperaturas reducidas típicas
de 35 a 42°C, en formamida a 50%. La mayor parte de los
genomas eucariotas contienen abundantes secuencias de
DNA repetidas y dispersas. Por esta razón, si el material
genómico se utiliza como sonda, es probable que conten-
ga secuencias de DNA que se repiten en otra parte en el
genoma. Esto resulta en un nivel de fluorescencia a través
de todas las regiones de los cromosomas, lo que reduce la
especificidad de la sonda. Para prevenir esto y mejorar la ca-
lidad y la sensibilidad de la imagen final, el DNA sin marcar
de la fracción repetitiva del genoma (Cot 1 DNA) se agrega
a la sonda durante la hibridación.
Detección de la sonda hibridada
Cuando las sondas se marcan directamente con los nucleó-
tidos fluorescentes, la detección requiere sólo una sencilla
observación del material usando un microscopio de fluo-
rescencia con los filtros apropiados. Puesto que la señal no
se amplifica, este método detecta una fluorescencia menos
intensa, pero el nivel fluorescente del fondo es bajo. El uso
de cámaras con dispositivo acoplado de cargas (CCD) para
detectar fluorescencia de nivel bajo puede hacer este método
bastante sensible para emplearse con pequeños DNA objeti-
vos. Cuando las sondas se marcan con haptenos, su presencia
se detecta con los anticuerpos conjugados con fluorocromos.
Las sondas marcadas de biotina y digoxigenina pueden
detectarse de esta manera, pero la biotina tiene la ventaja
agregada de tener una afinidad en extremo alta por la proteí-
na de la clara de huevo, la avidina. Esto permite el uso de la
avidina conjugada con los fluorocromos para utilizarse en
la detección. El único defecto de esta técnica se localiza en el
tejido a analizar que contiene mucha biotina para dar origen a
la fluorescencia del fondo. En el caso de la citogenética esto
no es un problema importante. Con frecuencia la señal fluo-
rescente de un objetivo se amplifica usando más de una capa
del anticuerpo en el proceso de detección.
Una de las ventajas principales de la tecnología de FISH
está en que diferentes fluorocromos pueden utilizarse si-
multáneamente junto con una serie de sondas marcadas
con diferentes haptenos. El resultado es una imagen de
FISH en dos colores. Por ejemplo, dos sondas pueden hi-
bridarse para la misma preparación del cromosoma. Si una
está marcada con biotina y se detecta con los anticuerpos
conjugados con fluoresceína, y la otra se marca con la
digoxigenina y se detecta usando el rojo Texas, después
ambos loci se detectan de manera simultánea como áreas
de fluorescencia verde o roja. Este acercamiento puede
extenderse también cuando se usan sondas directamen-
te marcadas en el mismo experimento, o cuando las sondas
marcadas con una mezcla de dos haptenos se utilizan. Si ta-
les sondas se detectan con los anticuerpos conjugados de dos
diferentes fluorocromos, el resultado es una señal de color
intermedio; la fluorescencia roja por el rojo Texas y la fluo-
rescencia verde de la fluoresceína emiten una señal anaran-
jada. Una serie de sondas se pueden marcar con diferentes
cocientes de los mismos dos haptenos. La fluorescencia
resultante se convierte en una señal digital en una cáma-
ra CCD y el software reconoce las diferencias sutiles en
la fluorescencia. Éstas entonces serán colores falsos asig-
nados. Este acercamiento condujo al desarrollo del carioti-
po espectral, que se describe más adelante.
Después de la detección de las sondas, es necesario
seguir localizando las áreas restantes de los cromosomas
o de los núcleos a los cuales la sonda no ha hibridado. Esto
se hace usando los fluorocromos 4,6-diamino-2-fenil-indol
(DAPI), Hoechst 33258 o yoduro de propidio. La combina-
ción del yoduro de propidio y del DAPI produce un patrón
de bandas que puede ser útil en la identificación del cromo-
soma. Sin embargo, debido a que el yoduro de propidio es
excitado por más de una longitud de onda y fluorescencias
de varias longitudes de onda diferentes, puede producir
problemas donde las imágenes se capturan usando cámaras
CCD monocromáticas.
Aplicaciones en la investigación básica
Aunque esta tecnología puede utilizarse potencialmente
con todas las especies de eucariotas, este capítulo se con-
centra en los usos en la genética humana. La FISH puede
utilizarse para detectar genes u otras secuencias de DNA
 APLICACIONES EN LA INVESTIGACIÓN BÁSICA
de regiones cromosómicas específicas. La precisión reque-
rida por el experimento determina el acercamiento que se
utiliza. En el nivel más simple, el proceso es posible em-
plearlo para identificar cromosomas enteros, una técnica
conocida como “pintado cromosómico”. En este caso es
necesario aislar el DNA de un solo cromosoma humano
para hacer una sonda. Esto se realiza por dos métodos. Por
principio, los híbridos celulares somáticos humanos más
roedor se utilizaron como una fuente de DNA. En estos
híbridos celulares es posible aislar clones que contienen un
solo cromosoma humano. El DNA se aísla de tales clones
y el DNA humano se amplifica usando iniciadores com-
plementarios a las secuencias alu. Éstas representan una
secuencia muy repetida que se encuentra en el ser humano
pero está ausente en el DNA del roedor.
Ahora es posible aislar cromosomas humanos específi-
cos en metafase directamente, usando la selección celular
activada por fluorescencia (FACS). El DNA del sedimen-
to de los cromosomas purificados es amplificado por PCR
usando los iniciadores degenerados; es ahora el método de
opción para los proveedores comerciales del pintado cro-
mosómico. El pintado cromosómico es en particular útil
para el estudio de las translocaciones; se ilustra en la figura
37-1. Aquí pintado de cromosoma se utiliza para identificar
los cromosomas implicados en una translocación que se ha
presentado en un tumor humano. Los fragmentos translo-
cados pequeños de cromosomas son, con frecuencia, sólo
perceptibles con este acercamiento.
El refinamiento del principio del pintado de cromoso-
mas condujo a protocolos en los cuales cada par de cromo-
359
somas en una célula puede identificarse de manera simul-
tánea. Esto se conoce como “cariotipo espectral”. En esta
técnica, los tintes para cada par de cromosomas se hibridan
a los cromosomas en la misma reacción. Cada tinte del cro-
mosoma es una mezcla de varios fluorocromos diferentes,
combinados en diversos cocientes. Esto significa que la
fluorescencia emitida por cada cromosoma tiene un espec-
tro específico, el cual lo detecta el sensor, y el software
atribuye un color falso diferente a cada espectro. El resul-
tado es una imagen por computadora en la cual todos los
cromosomas pueden detectarse con un color específico.
Un uso más sofisticado de la FISH se requiere para ma-
pear la ubicación cromosómica de una secuencia específica
de un gen. Para esta tarea, el DNA clonado en YAC, BAC
o cósmidos se utiliza normalmente como sonda. Esto emite
suficiente fluorescencia fácilmente perceptible. Los ejem-
plos se muestran en la figura 37-1. Los procedimientos im-
plicados son similares a los que se emplean para el teñido
de cromosoma, pero suele requerirse una amplificación
más grande de la señal. La FISH es mucho más fructífera
para esta tarea que las sondas marcadas con radiactividad
previamente utilizadas, debido al fondo reducido y al corto
tiempo que se requiere para completar el experimento (dos
días, comparado con las varias semanas necesarias para la
exposición de autorradiografías). Según lo descrito antes,
más de una sonda puede utilizarse simultáneamente. Este
acercamiento se emplea de diferentes maneras. Cuando se
intenta localizar una sonda en un cromosoma, es a menudo
necesario identificar el cromosoma con mucha claridad, al
mismo tiempo. Esto se logra usando una sonda para una
Figura 37-1 a) Parte de una metafase de una célula tu-
moral humana teñida con DAPI. Un cromosoma mor-
fológicamente atípico es indicado por la flecha blanca.
b) El mismo cromosoma de una metafase hibridado
con tinción del cromosoma 2. Sin duda, la región dis-
tal del cromosoma (flecha) está compuesta del material
derivado del cromosoma 2. La tinción cromosómica
marrón es yoduro de propidio y el tinte está marcado
con FITC. Una copia normal del cromosoma 2 está tam-
bién presente en la estructura. Un acercamiento similar
mostró que el resto del cromosoma está compuesto del
cromosoma 17. c, d) Cómo la FISH puede utilizarse
para mapear el punto de la translocación. Un BAC que
mapea la región distal del cromosoma 17, 17q25.3
como se muestra en (c), fue hibridado al cromosoma
de translocación en la célula tumoral. El hecho es que
se ha visto en (d) mapas la translocación al telómero
extremo distal del cromosoma 17. c) y d) Son imágenes
digitales que se obtienen usando una cámara CCD.
360 CAP. 37 HIBRIDACIÓN IN SITU FLUORESCENTE
secuencia de repetición de DNA centromérico específico
del cromosoma en cuestión. Para determinar el orden de
los genes estrechamente ligados a lo largo del cromosoma,
la FISH de doble o triple color puede utilizarse. Debido
a los colores que se emplean, este proceso se conoce con
frecuencia como “iluminación de semáforo”. La posición
de la sonda en un cromosoma puede algunas veces identi-
ficarse por el patrón de bandas, pero a menudo se expresa
simplemente como unidades F/pter. Éstas representan la
distancia mínima del telómero del brazo p del cromosoma,
en comparación con la extensión del cromosoma entero.
Una limitación importante para mapear los genes por
medio de la FISH la produce el estado relativamente con-
densado de los cromosomas mitóticos en metafase. Esto
significa que las señales de los genes falsean en cerca de 1
a 2 Mb, una señal de otra, y ocurre un traslape que impide
distinguir las dos señales. Para superar este problema se
usan diferentes estrategias. La cromatina está mucho me-
nos condensada durante la interfase, y las secuencias que no
es posible separar en los cromosomas en metafase se re-
suelven con frecuencia por hibridación de las sondas en
los núcleos de las células que no se están dividiendo. Una
desventaja en este sistema es que no es posible orientar
los genes en relación con el centrómero. Un proceso al-
ternativo que permite esto es el uso de las preparaciones
meióticas del cromosoma. Éstas son más alargadas que las
mitóticas. Sin embargo, tiene inconvenientes al preparar-
se. Un acercamiento exitoso para producir los cromosomas
mitóticos alargados consiste en utilizar las preparaciones
de citocentrifugación de metafases sin fijar. Una citocen-
trífuga es un dispositivo que se emplea frecuentemente en
hematología para preparar portaobjetos con células san-
guíneas. Este dispositivo usa una centrifugadora modifica-
da en la cual las células se hacen girar de manera directa
sobre el portaobjetos. Cuando las metafases sin fijar que se
hinchan en solución salina hipotónica se tratan de esta mane-
ra, las fuerzas de corte producidas durante la centrifuga-
ción estiran los cromosomas hasta veinte veces su longitud
normal. Aunque esto causa que muchas de las metafases se
interrumpan y que los cromosomas se deformen, tiene una
ventaja sobre el análisis de la interfase, en que los cromo-
somas individuales pueden ser identificados, y la orienta-
ción de las señales de la FISH hacia los centrómeros y los
telómeros es posible observarlos.
El último grado de resolución que se obtiene con el aná-
lisis de FISH se encuentra en la técnica de FISH de fibra.
Aquí la sonda se hibrida al DNA, que es extendido en un
portaobjetos después de la eliminación de la mayor parte
o de la totalidad de su cromatina empaquetada. Ninguna
información en lo absoluto se obtiene sobre la orientación
de la señal en el cromosoma, pero la técnica es muy pode-
rosa para el análisis a escala fina de las regiones pequeñas
del genoma. La dispersión y elongación del DNA se puede
conseguir de muchas maneras. Las fibras extendidas de cro-
matina se pueden obtener de los núcleos de las células en
interfase sin fijar tratadas sobre portaobjetos con detergente
y sal concentrada para quitar las histonas. Esto causa que
la estructura de la cromatina se desenrolle y se extienda el
DNA en una longitud comparable con la del DNA puro.
Tales técnicas se conocen como “producción del halo” o
DIRVISH (hibridización visual directa). Éstas permiten el
ordenamiento de la sonda a un límite de resolución más bajo,
de 3 a 5 kb. El DNA purificado también puede extenderse so-
bre el portaobjetos del microscopio para usarse en el análisis
de estructura fina. El DNA se entrampa en bloques de agaro-
sa, como los que se usan en la electroforesis en gel de cam-
po pulsado, que se funden y se extienden suavemente en el
portaobjetos, o el DNA en solución puede permitir que se
extienda en portaobjetos silanizados. En este caso, el extre-
mo de la molécula se une al vidrio y el resto del DNA se
rastrea fuera, en un patrón que es más o menos lineal en el
menisco de la solución que se evapora.
Ambos protocolos facilitan el estudio a escala fina. Los
ejemplos típicos incluyen la ordenación de las sondas pro-
ducidas por PCR a lo largo del DNA clonado en los YAC
o los cósmidos. Esto puede ser muy útil en circunstancias
donde un contiguo (un grupo de fragmentos de DNA clo-
nados ordenados que se traslapan) está incompleto y el ta-
maño de los espacios necesita estimarse.
Aplicaciones en la genética médica
Como se señala antes, el pintado del cromosoma es parti-
cularmente útil para detectar las translocaciones demasia-
do pequeñas para resolverse con claridad por el bandeo G
convencional. Otros usos de la FISH incluyen la detección
de aneuploides, particularmente en la amniocentesis. Aquí
el análisis de los núcleos en interfase puede emprenderse de
nuevo. En lugar de usar el teñido de cromosoma completo
para detectar los números de los homólogos, se utilizan las
sondas específicas para las secuencias de DNA repetidas en-
contradas en los centrómeros de diferentes cromosomas. Esto
puede detectar la presencia de copias adicionales de los cro-
mosomas implicados en los síndromes aneuploides comunes,
como los síndromes de Down, Edward y Pateau. El sexo de
un embrión puede determinarse también en las células amnió-
ticas usando las sondas de dos colores para los cromosomas
X y Y. En estos procedimientos la FISH permite que un resul-
tado se obtenga en un tiempo mucho más corto que el aná-
lisis convencional del cromosoma, donde las células deben
cultivarse, y tiene la ventaja agregada que, como sólo las cé-
lulas en interfase son necesarias, el número de las células
registradas puede ser muy alto. No obstante, es más costoso
 APLICACIONES EN EL DIAGNÓSTICO E INVESTIGACIÓN DEL CÁNCER
y no aporta tanta información sobre la naturaleza de alguna
anormalidad citogenética como el bandeo G; por ejemplo,
no distingue entre la presencia de un cromosoma adicional
intacto y un fragmento del que contiene el centrómero.
Aplicaciones en el diagnóstico
e investigación del cáncer
La FISH realiza su mayor contribución a la medicina en
el estudio y el diagnóstico exacto de los diferentes tipos
de cáncer y la leucemia. En la mayor parte de los casos, el
tejido maligno muestra al menos algunas aberraciones ci-
togenéticas. La citogenética convencional puede aplicarse
sólo con dificultad en estas situaciones, pero la FISH, par-
ticularmente sobre los núcleos en interfase, puede producir
resultados exactos y en un periodo corto, dos criterios que
son de importancia evidente en el cuidado del paciente.
Aunque las translocaciones aleatorias son comunes en
las células tumorales, muchos tipos de cáncer, en particular
leucemias y linfomas, portan translocaciones específicas
que pueden utilizarse para hacer un diagnóstico exacto.
Éstas son a menudo de la fusión de copias de dos genes
diferentes, creando un gen original. Un ejemplo clásico
es el cromosoma Filadelfia, que se detecta en la leucemia
mieloide crónica. Aquí, las translocaciones específicas al-
tas entre los cromosomas 9 y 22 ocasionan la fusión de
los oncogenes abl y BCR para producir una tirosina cinasa
original. Aquí el bandeo G convencional es problemático.
Esto ocurre porque las células malignas pueden no aportar
números significativos de metafases in vitro y la calidad de
las extensiones del cromosoma es frecuente que esté muy
por debajo de la obtenida de los linfocitos normales. El
teñido de cromosoma puede aplicarse incluso donde la ca-
lidad de las preparaciones del cromosoma es deficiente, ya
que los cromosomas blanco se identifican por la fluorescen-
cia, aun cuando ellos no puedan detectarse claramente por
el bandeo G. La ventaja principal de la tecnología de FISH,
en este caso, es otra vez la capacidad para obtener informa-
ción citogenética de las células que no se están dividiendo.
El uso de las sondas fluorescentes, con frecuencia cósmi-
dos, para las regiones en cada lado de la translocación es-
pecífica del tumor permite un diagnóstico exacto. Las dos
sondas se marcan con haptenos diferentes, de modo que
se detecten con dos colores distintos: rojo y verde. En las
células normales, donde no está presente la translocación,
dos sitios rojos y dos verdes fluorescentes aparecen en el
núcleo. Los puntos se distribuyen aleatoriamente a través
del núcleo. En presencia de una translocación, un punto
rojo y uno verde se localizan muy cerca uno del otro en
cada célula tumoral. El traslape ocurre con frecuencia y
una región amarilla de la señal mezclada se observa. Este
361
acercamiento permite una detección neta de la translocación
en una gran cantidad de células, y es posible distinguir las
células normales y las leucémicas en la muestra. Además del
trabajo de diagnóstico, este sistema se emplea también para
buscar células leucémicas residuales en los pacientes después
de la terapia. Los aneuploides específicos pueden detectar-
se en el tejido leucémico con los mismos métodos descritos
antes para las células amnióticas.
El análisis citogenético de los tumores sólidos siempre
se ha quedado atrás de los cánceres de la sangre. Esto es en
parte una consecuencia de la mayor dificultad para obtener
preparaciones aprovechables del cromosoma. A pesar de
esto, muchos tumores sólidos se han encontrado que por-
tan aberraciones cromosómicas específicas. Éstas pueden
buscarse por FISH en la interfase, o bien en preparacio-
nes de contacto, donde el material extirpado del tumor es
“contactado” sobre los portaobjetos para dejar un frotis de
células, o bien por el uso de frotis citológicos de una pe-
queña cantidad de células que se obtienen en aspirados con
aguja fina.
Además de las translocaciones y de los cambios en el
número de cromosomas, los tumores contienen con fre-
cuencia copias múltiples de oncogenes o de genes que con-
fieren resistencia a fármacos quimioterapéuticos. Éstos se
presentan, o bien como regiones alargadas de los cromoso-
mas donde el gen es amplificado in situ, conocidas como
regiones homogéneas teñidas (HSR), o bien como elemen-
tos extracromosómicos pequeños, llamados “diminutos
dobles” (DM). La amplificación del oncogén es un factor
importante en el pronóstico. La FISH tiene en cuenta la
detección de la amplificación en los núcleos de interfase de
las muestras del tumor. Un ejemplo de esto es el tamizaje
de las biopsias de cáncer de mama para la amplificación del
oncogén erbB-2 en el cromosoma 17. Las células norma-
les en la biopsia aportan un control, mostrando dos puntos
fluorescentes pequeños que corresponden a las dos copias
sin amplificar del presente gen, mientras el área de fluores-
cencia es mucho mayor donde se amplifica. Los ejemplos
de esto se muestran en la figura 37-2.
Una aplicación algo diferente de la FISH, en la investi-
gación y el tratamiento de cáncer, es el desarrollo de una
técnica que aporta una estimación total de ganancias y de
pérdidas específicas de cromosomas, o regiones del cromo-
soma de un tumor particular; se conoce como hibridación
comparativa del genoma. Aquí el DNA se extrae del tumor
después de la remoción del paciente. Este DNA se marca
con un fluorocromo (verde); se mezcla con el DNA extraí-
do de las células normales, las cuales se marcan con rojo, y
con la mezcla hibridizada sobre los cromosomas normales
en metafase. Las sondas diferentemente marcadas compi-
ten para situar los cromosomas. Si el tumor no muestra ga-
nancia o pérdida de material cromosómico, la hibridación
362 CAP. 37 HIBRIDACIÓN IN SITU FLUORESCENTE

Figura 37-2 a) Células en interfase de un aspirado de aguja fina de un tumor de pecho que se ha hibridado con una sonda para el on-
cogén erbB-2. En este caso las células muestran amplificación del oncogén, mientras en (b) el aspirado contiene células en las cuales el
oncogén no se ha amplificado, y cada célula muestra uno o dos puntos, que corresponden a los genes normales. En las preparaciones
de frotis hechas de los aspirados por aguja fina las células no se dispersan, lo que se explica porque la señal erbB-2 no está en el mismo
plano focal en cada célula. En estos ejemplos la sonda fue directamente marcada con FITC y los núcleos contrateñidos con DAPI. Cor-
tesía del Dr. Damien McManus, Royal Victoria Hospital, Belfast.

in situ resultante contiene 46 cromosomas, la totalidad de los
cuales con una fluorescencia amarilla uniforme. Sin embar-
go, las regiones del tumor que experimentan amplificación
están sobrerrepresentadas en el DNA extraído y superan al
DNA que emite fluorescencia roja. Tales regiones, por tan-
to, aparecen verdes. Inversamente, las regiones perdidas del
tumor, que es probable que contengan genes supresores,
aparecen en rojo fluorescente. El análisis de esta hibridación
competitiva a dos colores requiere software del computador
sofisticado, pero puede convertirse en una herramienta im-
portante que aporte un análisis molecular de amplio espectro
de los tumores individuales.
La FISH parece tener un papel establecido en la biología
molecular. Cómo se desarrolle en el futuro la técnica depen-
de de la comprensión creciente de los procesos genéticos
en esta enfermedad. En algunas de las aplicaciones en las
cuales se sitúa puede reemplazarse por técnicas no citoge-
néticas, tales como la PCR. Áreas donde esto puede suceder
incluye la detección de las translocaciones específicas del
cáncer, o la determinación del sexo en las células amnióti-
cas. Sin embargo, una de las ventajas más importantes de la
FISH es que no destruye las células en las cuales se lleva a
cabo. En muchas áreas esta capacidad para obtenerse infor-
mación genética molecular mientras aún puede identificarse
la estructura celular y tisular es esencial, por ejemplo, en la
patología molecular del cáncer. Además, el acoplamiento de
técnicas moleculares y citológicas agrega un control valioso
contra los resultados erróneos que se presenten de la con-
taminación de las muestras. Por estas razones, la técnica es
probable que mantenga su importancia en la investigación y
las biociencias aplicadas por un tiempo considerable.
Lecturas adicionales
Haaf T, Ward D C. Structural analysis of a-satellite DNA and cen-
tromere proteins using extended chromatin and chromosomes.
Hum Mol Genet 1994; 3: 697-709.
Heiskanen M, Hellsten E, Kallioniemi O-P et al. Visual maping
by fibre-FISH. Genomics 1995; 30: 31-36.
Kallioniemi A, Kaltioniemi O-P, Sudar D et al. Comparative ge-
nomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of so-
lid turnouts. Science 1992; 258: 818-821.
Pardue M L, Gall J G. Chromosomal localization of mouse sate-
llite DNA. Science 1970; 168: 1356-1358.
Schrock E, duManoir S, Veldman T et al. Multicolor spectral
karyotyping of human chromosomes. Science 1996; 273: 494-
497.
 SECCIÓN 7
QUÍMICA CLÍNICA
KWWSERRNVPHGLFRVRUJ
 38
Adquisición, aplicaciones e interpretación
de los datos bioquímicos clínicos
William J Marshall
Introducción
Las investigaciones en bioquímica clínica se utilizan am-
pliamente en la medicina con gran variedad de propósitos
(cuadro 38-1). La mayor parte de las investigaciones más
familiares implica la medición de un componente de algún
fluido corporal, suero (o plasma) u orina. Los ensayos pue-
den también hacerse en otros fluidos, por ejemplo, el espi-
nal, el obtenido por paracentesis, secreciones intestinales y
heces, y sobre muestras de biopsia de tejidos corporales.
Los resultados de la mayor parte de las investigaciones
bioquímicas clínicas se expresan cuantitativamente como
una concentración o con frecuencia, en el caso de medicio-
nes enzimáticas, como una actividad. El análisis genético
molecular, aunque aumenta en el repertorio de los labora-
torios bioquímicos clínicos, no se discute en este capítulo.
El hecho de que los resultados se expresen en forma nu-
mérica permite el lujo de una simplicidad evidente: pare-
cen fáciles de evaluar y comparar con rangos de referencia
(“normales”) o con resultados que se obtienen previamente
en el mismo paciente. Mientras, por ejemplo, un signo sutil
sobre una radiografía puede estar abierto a una variedad
de interpretaciones (o puede ser ignorado por un observa-
dor inexperto), una concentración de sodio sérico de 143
mmol/L parece inequívocamente “normal” (el rango de
referencia es 135 a 145 mmol/L) y es sin duda su valor
diferente a 147 mmol/L, que es por definición “anormal”.
Pero, ¿en realidad lo es? Examinemos estas afirmaciones
con cierto detalle. Una concentración de sodio sérico puede
The Science of Laboratory Diagnosis, second edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
estar dentro del rango normal, pero eso no excluye la posi-
bilidad de que una anormalidad sutil de la homeostasis del
sodio o del agua esté presente, tampoco significa que el in-
dividuo sea sano. Inversamente, encontrar que un individuo
tiene una concentración de sodio sérico de 147 mmol/L no
significa que un desorden homeostático del sodio o del agua
esté presente; de hecho, el individuo puede estar perfecta-
mente sano. Estas afirmaciones provienen de que, como se
discute más adelante en este capítulo, se esperaría que 5%
de los individuos “normales” tuviera valores fuera del ran-
go de referencia, aunque es evidente que en cuanto un valor
medido esté más alejado de los límites del rango de referen-
cia, es más probable que tenga una importancia patológica.
La comparación de un resultado con un rango de refe-
rencia puede tener valor cuando la medición se hace en un
individuo por primera vez. En la práctica, las mediciones
se realizan con frecuencia, por ejemplo, para determinar el
progreso de una condición o de una respuesta al tratamien-
to. Un valor medido establecido puede entonces comparar-
se con uno anterior para considerar si ha ocurrido un cam-
bio significativo. Pero si, por ejemplo, una concentración
de sodio sérico de 145 mmol/L en un día es significativa-
mente diferente (es decir representa un cambio fisiológico
o patológico verídico) a partir de una de 147 mmol/L del
día anterior se requiere un conocimiento de la confiabili-
dad de los datos, no sólo en términos de calidad analítica,
sino también de cualquier variación biológica que afecte
la concentración del sodio in vivo. Por último, cualquier
conclusión que se arrastre no es confiable si la muestra que
366 CAP. 38 ADQUISICIÓN, APLICACIONES E INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS BIOQUÍMICOS CLÍNICOS
Cuadro 38-1 Usos de las pruebas bioquímicas en la medicina
Usos Ejemplo
Diagnóstico Concentración de la glucosa
sanguínea (diabetes)
Valoración de la Concentración de la creatinina
gravedad sérica (insuficiencia renal)
Pronóstico Tiempo de protrombina, gravedad
de la acidosis, etc. (insuficiencia
hepática aguda)
Monitoreo de la Hemoglobina glucosilada
enfermedad/tratamiento (diabetes)
Seguimiento a largo Algunos marcadores tumorales
plazo (cáncer)
Tamizaje TSH sanguíneo neonatal
(hipotiroidismo congénito)
Detección de la Pruebas de la función tiroidea
toxicidad del fármaco (para pacientes tratados con litio)
Estratificación para Concentración del colesterol en
los ensayos clínicos plasma (para ensayos de fárma-
cos que disminuyen el colesterol)
se analiza no se recolecta y maneja antes del análisis de una
manera que no afecte la concentración de sodio.
A fin de que los lectores dejen de preocuparse porque
ninguna conclusión categórica pueden sacarse de los datos
bioquímicos clínicos (o, peor, pensar que estas cuestiones
son triviales y sin ninguna consecuencia), debe enfati-
zarse que el personal de laboratorio emprende esfuerzos
considerables para asegurarse de que los datos que aporta
sean confiables (una medición verdadera de la variable en
cuestión) y precisos (reproducibles). También es importan-
te que el analito (componente de interés analítico) pueda
medirse sobre un rango de concentración clínica útil, y que
los resultados estén disponibles lo suficientemente rápido
para informar a la gerencia clínica. Alcanzar esto requiere
de metodología e instrumentación apropiadas, y el apego a
procedimientos diseñados para maximizar la calidad.
Sin embargo, sigue siendo importante que los usuarios
de datos del laboratorio bioquímico clínico estén conscien-
tes de las fuentes de error (no todas se encuentran en el
laboratorio), y de trampas en la interpretación de los re-
sultados, si se esfuerzan para obtener el máximo de infor-
mación clínicamente útil. La mayor parte del resto de este
capítulo está dividida en dos secciones: la primera se ocupa
de la recolección y análisis de la muestra; la segunda, de las
aplicaciones e interpretación de los datos bioquímicos.
Recolección y análisis de la muestra
Los factores que pueden perjudicar la calidad de los resul-
tados se dividen de manera convencional en preanalíticos,
analíticos y posanalíticos, es decir, se presentan en este or-
den antes de que la muestra se analice, durante el análisis,
y una vez que se han generado los resultados.
Factores preanalíticos
Las variables bioquímicas son afectadas por muchas de las
fisiológicas (cuadro 38-2). Además, todas las variables bio-
químicas están sujetas a una variación biológica aleatoria.
Cuadro 38-2 Ejemplos de factores fisiológicos que afectan los
resultados de pruebas bioquímicas
Factor Prueba (todas en suero o en plasma)
Edad Colesterol, urato, fosfatasa alcalina
Sexo Esteroides gonadales, gonadotropinas,
colesterol HDL
Masa corporal Triglicéridos
Tiempo Cortisol (variación diurna)
Gonadotropinas (variación del
catamenial en mujeres)
25-Hidroxicolecalciferol (variación
estacional)
Estrés Cortisol, prolactina, hormona del
crecimiento, catecolaminas, glucosa
Postura Renina, aldosterona, proteínas del
plasma
Ingesta de alimentos Glucosa, triglicéridos, fosfato
Para algunos, particularmente aquellos que están sujetos al
control rígido de la retroalimentación, la concentración de
calcio plasmático puede ser pequeña, pero para otros es un
factor significativo que debe considerarse cuando se inter-
pretan los resultados.
El efecto de los fármacos sobre las variables bioquími-
cas in vivo es un problema potencial enorme, aunque en la
práctica el número de ejemplos importantes es relativamen-
te pequeño. La hipocalcemia, que ocurre con frecuencia en
pacientes tratados con diuréticos, es uno de ellos. Las medi-
ciones bioquímicas también se realizan con frecuencia para
evaluar el efecto de los fármacos, por ejemplo, medición
de la glucosa y de la hemoglobina glucosilada en pacientes
con diabetes tratados con agentes hipoglucemiantes. Los
fármacos también pueden convertirse en una fuente poten-
cial del error analítico; por ejemplo, la reacción cruzada de
prednisolona con el cortisol en muchos inmunoensayos.
Los errores preanalíticos, al final, suelen ocurrir por una
recolección incorrecta de la muestra, por ejemplo, al medir
la glucosa en una muestra sanguínea que no es recolectada
en un envase con fluoruro para inhibir la glucólisis; o por el
 INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS DE LABORATORIO
manejo, por ejemplo, causando hemólisis o la evaporación
del agua. Todos los laboratorios publican manuales que de-
ben incluir la información sobre el tipo de muestra que
colecta y cualquier condición especial que deba observar.
Los errores pueden presentarse, excepcionalmente, por
una identificación errónea de las muestras. La vigilancia
extrema es necesaria para prevenir el error en la identifica-
ción. Las formas de solicitud deben llenarse con los datos
correctos adecuados y cotejarse directo con el paciente, y
que las muestras se identifiquen positivamente en todas las
etapas de la manipulación, por ejemplo, si el suero tiene
que transferirse del envase inicial (primario) a uno secun-
dario para el análisis. En muchos hospitales y clínicas, la
sangre y otras muestras las recolectan las enfermeras o los
flebotomistas entrenados. Muchos laboratorios encuentran
que es más probable que ocurran los errores si las mues-
tras las recolectan los médicos. En medicina de laboratorio,
como en la clínica, es buena práctica tener mucho cuida-
do con procedimientos en apariencia simples, es decir,
igual al que se tiene con los complicados.
Factores analíticos
Una discusión detallada de los procedimientos de labo-
ratorio está más allá del alcance de este capítulo. Es una
condición de acreditación por CPA (UK) Ltd (Acreditación
del Laboratorio Clínico) que los laboratorios usen proce-
dimientos aceptables para el control de calidad interno y
el aseguramiento de calidad externa. Los problemas que
pueden afectar la calidad de los resultados se discuten en
los capítulos sobre técnicas analíticas individuales.
Factores posanalíticos
Una vez que se han generado y validado los resultados,
los errores todavía pueden presentarse antes de que lle-
guen las anotaciones de los pacientes. Con el uso creciente
de la transmisión electrónica de los resultados desde el la-
boratorio a la sala o clínica, el riesgo de tales errores dismi-
nuye considerablemente, pero nunca puede eliminarse del
todo. También, es un riesgo particular si los resultados se
comunican por teléfono al médico, debido a una urgencia.
Es irónico que justo durante el manejo de los resultados
es cuando un error podría tener consecuencias específicas
perjudiciales.
Interpretación de los datos de laboratorio
Aunque los datos bioquímicos se utilizan de manera ex-
tensa en el diagnóstico y control de pacientes, es raro que
367
aporten un diagnóstico completo. Más bien con frecuencia
reflejan procesos patológicos que enfermedades específi-
cas, y pueden incluso no ser determinantes para un proce-
so, aunque en una situación clínica particular o tomando
en cuenta otras investigaciones, es probable que una puede
ser mejor que la otra. Por ejemplo, una concentración baja
de albúmina sérica tiene muchas causas potenciales, que
incluyen disminución de la síntesis, incremento en el volu-
men de distribución o aumento en la pérdida o catabolismo
y cada uno de éstos por sí mismo tiene varias causas po-
tenciales. En un paciente conocido por tener enfermedad
hepática crónica, la disminución en la síntesis es probable
que sea la causa más importante.
Los resultados bioquímicos pueden evaluarse en rela-
ción con varios criterios, de acuerdo con las razones de
realizar la prueba: el rango de referencia comparable para
personas sanas; el rango de valores esperados en condicio-
nes particulares; valores de corte o límites de acción, o re-
sultados obtenidos previamente en el mismo individuo.
Rangos normales e intervalos de referencia
El término “normal” tiene varios significados. Una distri-
bución normal (gaussiana) describe una distribución simé-
trica de datos alrededor de una media que puede detallarse
con una función matemática específica. Estadísticamente
el rango normal es el rango de los valores para tales datos
a partir de la media menos dos desviaciones estándar para
la media más dos desviaciones estándar, y abarca cerca de
95% de los valores. Para mucha gente, sin embargo, nor-
mal significa “conforme al tipo” o, implícitamente, “sano”,
puesto que rangos normales para variables biológicas huma-
nas están con frecuencia basados sobre mediciones hechas
en una muestra de individuos de una población “normal”
(en el sentido de “saludable”).
Hay muchas trampas en el uso de rangos normales.
Dentro de las disciplinas de la medicina de laboratorio, se
discute en forma extensa que el término no debe usarse.
En vez de “población normal” se prefiere el término “po-
blación de referencia”, puesto que éste no implica ninguna
característica específica (p. ej., salud) en la población. (De
hecho, no existe razón por la que no deba procurarse defi-
nir los rangos característicos de los resultados de la prueba
de una población de referencia integrada de pacientes con
enfermedades particulares.) Los valores superiores e infe-
riores de la distribución se llaman “límites de referencia”
y el rango entre ellos, “intervalo de referencia”. Pero aun-
que sea loable este esfuerzo para dirigir un análisis más
objetivo de los datos, los términos no se usan de forma
amplia fuera de los laboratorios y, en la práctica, muchos
los continúan refiriendo como “rangos normales”. Ade-
más, los intervalos de referencia se basan con frecuencia
368 CAP. 38 ADQUISICIÓN, APLICACIONES E INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS BIOQUÍMICOS CLÍNICOS

en los mismos datos que se utilizan para calcular rangos

normales y son idénticos a ellos.

creatinina sérica (␮mol/L)

Por definición, puesto que el rango normal abarca sólo
95% de los valores de la población que se estudia, 5% de

Concentración de
los valores caen fuera de este rango, 2.5% arriba y 2.5%
abajo. Asimismo, algunos valores de la gente sana caen
inevitablemente fuera del rango normal para la población,
aunque el sentido común nos dice que cuanto más lejos
esté un resultado de los límites del rango, es más probable
que sea “anormal” en el sentido patológico significativo.
Cuanto más variables se midan, es más probable que por lo
menos una caiga fuera del rango normal importante. Si 20
analitos independientes fueran medidos, la probabilidad de
Eliminación de la creatinina (ml/min)
que uno sea anormal es 0.64, es decir, mejor que constante.
Puesto que los analizadores automatizados miden en forma Figura 38-1 Concentración de la creatinina sérica y eliminación
rutinaria este número de analitos, resultados falsos, “anor- de la creatinina. Debido a que la eliminación (una medida de la tasa
males”, son una ocurrencia inevitable. glomerular de filtración, GFR) se relaciona de manera inversa con
Otro problema en la interpretación proviene de que el la concentración de la creatinina sérica, la eliminación puede des-
rango de variación de un resultado de la prueba en un indi- cender a la mitad de su valor normal (casi 120 ml/min) antes de
que la concentración de la creatinina sérica llegue a ser anormal.
viduo es probable que sea menor al rango observado en la
El área sombreada muestra el rango de referencia normal para las
población, ya que la población, aun cuando es comparable
concentraciones de creatinina sérica.
en términos, por ejemplo, de edad, sexo y origen étnico, se
compone de individuos genéticamente distintos. El rango
normal para la concentración de creatinina plasmática en va- normal, pero está bien establecido que el incremento en las
rones adultos es aproximado a 60 a 120 µmol/L, pero el ran- concentraciones del colesterol está ligado a un incremento
go de valores que se observa con mediciones repetidas en un en el riesgo de la enfermedad cardiaca coronaria, incluso
solo individuo es mucho menor que ése. Un individuo puede dentro de este rango (fig. 38-2). Para el colesterol, por con-
aportar un resultado dentro del rango normal cuando se defi- siguiente, el concepto de un rango normal es engañoso.
ne para la población que es realmente anormal para él. Más bien, definimos las concentraciones ideales (las cuales
En seguida se presentan algunos ejemplos específicos, hasta cierto punto ellas mismas dependen de la presencia
donde los rangos normales no son estándares apropiados de otros factores de riesgo para la enfermedad coronaria)
contra los cuales juzgar los resultados de los pacientes. y valores de umbral para los valores de intervención y del

Ejemplo 1: un resultado dentro del rango normal puede Riesgo de enfermedad

sugerir falsamente una función normal cardiaca coronaria

La creatinina se mide en suero como índice de la función

Número de sujetos

renal, específicamente de la tasa de filtración glomerular

(GFR). La concentración de creatinina es inversamente
proporcional a la GFR (fig. 38-1) y en la práctica, la GFR
puede caer hacia la media normal (equivalente a la pérdida
de un riñón funcionando) antes de que la concentración de
la creatinina sérica exceda el límite superior de la normal.
La concentración de la creatinina sérica es entonces un ín-
dice insensible de la pérdida temprana de la función renal.
Colesterol sérico (mmol/L)

Ejemplo 2: un resultado dentro del rango normal puede
sugerir falsamente ningún riesgo de enfermedad
Si las concentraciones del colesterol plasmático se miden
sobre un grupo de gente sana, es posible derivar un rango
Figura 38-2 Distribución de las concentraciones del colesterol
sérico en adultos saludables y el riesgo de enfermedad cardiaca
coronaria. Cerca de un tercio de los valores excede la concentra-
ción ideal recomendada (5.0 mmol/L) y están relacionados con un
riesgo significativo incrementado de la enfermedad coronaria.
 INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS DE LABORATORIO
blanco para el tratamiento. El valor del blanco para la pre-
vención secundaria de la enfermedad coronaria en el Reino
Unido es en la actualidad una concentración de colesterol
total de menos de 5.0 mmol/L (LDL menor de 3.0), aunque
hay evidencia de que incluso blancos más bajos pueden ser
más apropiados.
Ejemplo 3: cualquier concentración es anormal
Puesto que los fármacos no son componentes fisiológicos del
cuerpo, las concentraciones de éstos medidas en pacientes no
pueden compararse con rangos normales. En el contexto del
monitoreo terapéutico del fármaco, rangos “terapéuticos” y
“tóxicos” son más apropiados (aunque incluso estos términos
deben interpretarse con cautela), mientras en el contexto del
envenenamiento, “niveles de acción” se utiliza para ayudar a
determinar el control apropiado.
Diferencias críticas
La discusión precedente se relaciona con la comparación
de datos medidos con valores esperados basados sobre ob-
servaciones en otras personas. Cuando se repite una me-
dición, es más pertinente considerarla en relación con el
valor anterior. La pregunta adecuada es si los dos valores
difieren significativamente.
Esto depende de dos factores: la variabilidad innata del
parámetro que se mide, aun cuando las condiciones de
muestreo sean idénticas (variación biológica), y la varia-
ción analítica, es decir, el error concomitante inevitable en
cualquier medición (no obstante, debe esperarse que sea
muy pequeño). Ambos pueden determinarse a partir de los
resultados de mediciones repetidas del mismo y de una
serie de muestras similares, y con una función conocida
como la diferencia crítica (CD) calculada con la ecuación:
CD = 2.8 ⫻ (SDA2 + SDB2 )½, donde SDA y SDB son las
desviaciones estándares analíticas y biológicas, respecti-
vas. La CD indica la diferencia mínima entre dos valores,
que es improbable que ocurran como resultado de la varia-
ción biológica y analítica en una probabilidad de 0.95 (p =
0.05). Si cualquier cambio es clínicamente significativo es
otro asunto, pero sin duda que un cambio no puede consi-
derarse que es de importancia clínica potencial si es menor
que la CD.
El concepto de diferencia crítica no es ampliamente en-
tendido fuera de los laboratorios, aunque es fundamental
para el uso de los datos de laboratorio en el monitoreo de
la historia natural de la enfermedad y de la respuesta al
tratamiento. Los valores para algunas CD deben estar dis-
ponibles a partir del laboratorio local. Las diferencias críti-
cas son independientes de rangos normales. De hecho, dos
369
resultados pueden ser extremadamente diferentes aunque
ambos estén dentro del rango normal. Si se considera, por
ejemplo, un incremento en la concentración de la creati-
nina sérica desde 80 a 100 µmol/L entonces la CD para
la creatinina en este rango de concentraciones es cerca de
17 µmol/L. Así, un aumento de 20 µmol/L es de impor-
tancia clínica potencial (implicando una disminución en la
función renal), aun cuando ambos valores estén dentro del
rango normal. Esta discusión acentúa el hecho de que las
mediciones seriales en individuos pueden (y en la práctica
frecuentemente lo son) ser más informativas que las medi-
ciones “únicas”.
Límites de acción, valores del blanco, puntos
de corte y valores predictivos
Para algunas investigaciones de laboratorio, es apropiado
considerar los resultados contra los límites de acción, es
decir, valores usados para determinar si una acción espe-
cífica debe tomarse. Ejemplos obvios incluyen límites de
acción de concentraciones de venenos para tratamiento di-
recto, como la concentración de paracetamol sérico para
indicar si el tratamiento con N-acetilcisteína debe iniciarse
(o continuarse) para prevenir daño hepático. Muchos la-
boratorios tienen límites de acción para determinar cómo
responden a un resultado; por lo común, cuando un valor
anormal debe telefonearse al médico que lo requiere, o
cuando una investigación adicional se debe realizar para
obtener más información, por ejemplo, accionar electrofo-
resis de proteínas del suero para buscar una paraproteína
cuando la concentración de globulina total de un paciente
es inesperadamente alta.
Debido a que para la mayor parte de los datos de la-
boratorio existe un traslape entre el rango de los valores
que normalmente se observan en la gente sana y los que se
producen en la enfermedad (sobre todo en las etapas ini-
ciales de esta última, o cuando es relativamente leve), la
selección de los puntos de acción es en particular crítica
cuando las pruebas se utilizan para el tamizaje (que detecta
la enfermedad subclínica). Fijando el límite de acción (con
más frecuencia llamado valor de corte en este contexto)
demasiado bajo significa que, mientras a todos los pacien-
tes con esta condición se les diagnostica correctamente
usando la prueba, se mantiene, a expensas de una mala ca-
tegorización de un número significativo de personas sanas,
a otros como posibles poseedores de la enfermedad (falsos
positivos). Fijando el valor de corte demasiado alto excluye
a todos los individuos sanos, pero algunos con la enferme-
dad no serán detectados (los falsos negativos; fig. 38-3).
En el tamizaje para una condición seria, pero en potencia
tratable, es deseable no tener ningún falso negativo (casos
errados). Un ejemplo clásico es el extenso programa de
370 CAP. 38 ADQUISICIÓN, APLICACIONES E INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS BIOQUÍMICOS CLÍNICOS
Figura 38-3 Efecto del movimiento del punto de corte que de-
termina la positividad/negatividad de un resultado de la prueba.
Se muestran las distribuciones hipotéticas para la concentración
de un analito en pacientes con y sin enfermedad. Debido a que
éstos se traslapan, si el corte se selecciona para disminuir la can-
tidad de resultados falsos positivos (y por tanto aumentar la es-
pecificidad) (a), hay cantidades significativas de resultados falsos
negativos (sensibilidad disminuida). Si el corte se fija más abajo
(b), los falsos negativos se eliminan (maximizando la sensibili-
dad) pero a expensas de aumentar el número de los falsos positi-
vos (disminuyendo así la especificidad). Las distribuciones de los
valores para individuos con enfermedad se muestran por debajo
del eje horizontal, para mayor especificidad
tamizaje neonatal para la fenilcetonuria y el hipotiroidismo
congénito. Debe enfatizarse que las pruebas de tamizaje
no son diagnósticas. Además, en definitiva, las investiga-
ciones se requieren para establecer el diagnóstico, y, en los
falsos positivos, para excluirlo.
El desempeño de las pruebas de tamizaje puede medir-
se calculando funciones que se conocen (en este contex-
to) como la sensibilidad (una medida de la capacidad de
la prueba de detectar a la gente que tiene la enfermedad)
y especificidad (una medida de su capacidad de identificar
a la gente que no la tiene) (cuadro 38-3). Tales cálculos
requieren la identificación confiable de verdaderos y falsos
positivos y negativos, que a su vez necesitan un “estándar
de oro” o prueba de diagnóstico definitiva que identifique,
Cuadro 38-3 Sensibilidad, especificidad y el valor predictivo
(b)
de las pruebas
Resultado de la prueba
Positivo Negativo
Estado de la Positivo Verdadero Falso
enfermedad positivo (TP) negativo (FN)
Negativo Falso Verdadero
positivo (FP) negativo (TN)
Sensibilidad (positividad en la enfermedad) ⫽ TP/(TP ⫹ FN)
Especificidad (negatividad en la salud) ⫽ TN/(TN ⫹ FP)
Valor predictivo positivo (PV⫹) ⫽ TP/(TP ⫹ FP)
Valor predictivo negativo (PV⫺) ⫽ TN(TN ⫹ FN)
inequívocamente, la presencia o la ausencia de la enfer-
medad. El examen histológico del tejido o el análisis ge-
nético molecular pueden proporcionar el estándar de oro,
pero algunas veces la positividad o negatividad verdaderas
pueden determinarse sólo en retrospección, observando el
resultado.
Las cantidades de resultados positivos y negativos ver-
daderos y falsos pueden también utilizarse para calcular
el valor predictivo (PV) de un resultado positivo o nega-
tivo, es decir, la probabilidad de que una prueba positiva
(o negativa) clasifique correctamente a la persona que se
examina.
Los conceptos de sensibilidad, de especificidad y de va-
lores predictivos pueden también utilizarse para describir el
desempeño de las pruebas hechas para propósitos de diag-
nóstico, pero en este caso y en el tamizaje son importantes
para apreciar que sólo pueden aplicarse con confianza en pa-
cientes similares a aquellos sobre quienes los datos fueron
derivados. Una prueba, por ejemplo para la artritis reuma-
toide puede parecer tener sensibilidad y especificidad altas
cuando se aplica a un grupo de pacientes con la enfermedad
establecida. Sin embargo, es probable que la sensibilidad
sea mucho más baja en un grupo de personas en quienes la
enfermedad tuvo un predominio muy bajo, o en quienes tu-
vieron la enfermedad en un periodo más temprano. Esto es
un inconveniente (y fuente frecuente de error) para el uso de
estos conceptos.
Cocientes de probabilidad
Estas funciones expresan la probabilidad de que un ha-
llazgo, por ejemplo un resultado de la prueba, ocurriría en
una persona con cierta condición, en comparación de sin
ésta. El cociente de probabilidad (LR) para un resultado
positivo es LRpos = sensibilidad/(1⫺especificidad). La pro-
babilidad que un resultado negativo ocurriera en una per-
sona con una condición particular (LRneg), en comparación
 BIOQUÍMICA CLÍNICA BASADA EN EVIDENCIA
en una sin ésta, está dada por LRneg = (1⫺sensibilidad)/
especificidad). Los cocientes de probabilidad pueden uti-
lizarse para convertir la probabilidad de la preprueba (en
una prueba de tamizaje, ésta será el predominio de la con-
dición en la población que es tamizada) en la probabilidad
de posprueba de la condición que está presente. Tales datos
es posible utilizarlos para el control directo y son de gran
valor en la auditoría clínica.
Bioquímica clínica basada en evidencia
Los resultados bioquímicos y otros de prueba de labora-
torio deben interpretarse con cuidado. Muchas pruebas en
la actualidad disponibles proporcionan menos informa-
ción confiable que es a menudo apreciada o asumida, no
usualmente debido a problemas analíticos sino, más bien,
a sensibilidad y especificidad escasas. Las nuevas pruebas
de diagnóstico se desarrollan e introducen todo el tiem-
po, y por lo regular las promueven con mucho entusiasmo
los fabricantes de kits de prueba, con el apoyo de médi-
cos que buscan un desempeño diagnóstico mejorado. Su
evaluación, sin embargo, es a menudo pobre. Lo ideal es
que todas las pruebas de laboratorio deben evaluarse con
un rigor similar al requerido antes de la introducción de
nuevos tratamientos, de tal manera que puedan utilizarse
de forma racional, sobre la base de evidencia bien fundada
científicamente.
Conclusión
Las pruebas bioquímicas se han vuelto una parte esencial de
la práctica médica moderna. Tienen diversas aplicaciones po-
371
tenciales pero, en muchas, la facilidad con que ellas pueden
solicitarse y realizarse contradice su complejidad. Deben rea-
lizarse con cuidado e interpretarse a través de una apreciación
de los principios fisiológicos y patológicos fundamentales,
cualquiera que sea el propósito para el cual deben usarse.
Lecturas adicionales
Fraser CG, Fogarty Y. Interpreting laboratory results. Br Med J
1989; 298: 1659-1660.
Jones R, Payne B. Clinical Investigation and Statistics in Labora-
tory Medicine. 1997: ACB Venture Publications, London.
Marshall WJ. The uses of biochemical data in clinical medicine.
The acquistion of biochemical data. The interpretation of bio-
chemical data. In Clinical Biochemistry, Marshall WJ, Bangert
SK (eds). 1995: Churchill Livingstone, Edinburgh, 1-24.
Moore RA. Evidence-based clinical biochemistry: a personal
view. Ann Clin Biochem 1997; 34: 1-7.
Oxfor Centre for Evidence-Based Medicine. Likelihood ratios.
http://www.cebm.net/likelihood_ratios.asp
Price CP. Christenson RH (eds). Evidence-based Laboratory Me-
dicine. 2003. Washington: AACC Press.
Read MC, Lachs MS, Feinstein AR. Use of methodological stan-
dardized in diagnostic test research: getting better but still not
good. J Am Med Assoc 1995; 274: 645-651.
Tape TG. Interpreting diagnostic tests. http://gim.unmc.edu/dxtests/
Default.htm
 39
Inmunoensayo en bioquímica clínica
Joan Butler y Susan M Chambers
Introducción
El inmunoensayo utiliza la reacción antígeno-anticuerpo
como un medio de cuantificación del antígeno o del anticuer-
po. La mayor parte de las aplicaciones en bioquímica clínica
utiliza la técnica para cuantificar el antígeno, mientras en in-
munología y microbiología también se emplea para cuantifi-
car (o detectar) el anticuerpo circulante. Los anticuerpos se
incrementan frente a una amplia variedad de sustancias. Las
moléculas pequeñas pueden hacerse inmunogénicas por el
acoplamiento químico a una molécula grande, como albúmi-
na o polilisina, y son entonces conocidas como haptenos.
Diseño del ensayo
A pesar de la complejidad aparente de los métodos que se
publican, hay dos diseños básicos del ensayo: los métodos
competitivos o limitados del anticuerpo, que usan el mar-
cado del antígeno con una molécula trazadora o reportera
y teniendo el “inmunoensayo” de titulación genérica; y los
métodos no competitivos o de exceso del anticuerpo, que
emplean anticuerpo marcado y teniendo el ensayo “inmu-
nométrico” de titulación genérica.
En un ensayo competitivo, el antígeno en la muestra (o
el estándar) compite con el marcado por los sitios de unión
en una cantidad limitada de anticuerpo. Es esencial que la
cantidad de anticuerpo sea insuficiente para ligar todo el
antígeno marcado, de modo que la competición por los si-
tios de unión ocurra. En equilibrio la cantidad del antígeno
marcado ligado al anticuerpo está inversamente relaciona-
do con la cantidad del antígeno sin marcar en la muestra o
el control estándar. La determinación del marcador en la
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker,
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
fracción ligada aporta una medida de la cantidad de antíge-
no, en la comparación de una curva de calibración:
Ag ⫹ Ag* ⫹ Ab AgAb ⫹ Ag*Ab ⫹ Ag*
estado inicial estado final
Para determinar la cantidad de antígeno marcado en la
fracción ligada (o libre), estas fracciones deben separarse,
excepto en los casos raros donde la señal del marcador es
modificada por la unión del antígeno marcado al anticuerpo.
En un ensayo inmunométrico o no competitivo, las con-
diciones son tales que el antígeno puede reaccionar con un
exceso del anticuerpo marcado. El anticuerpo sin reaccio-
nar entonces se separa, y la cantidad del anticuerpo marca-
do ligado al antígeno se mide:
Ag ⫹ Ab* AgAb* ⫹ Ab*
estado inicial estado final
Este diseño simple es la base para un número de forma-
tos más complejos. Los antígenos que son moléculas gran-
des pueden reaccionar con otro anticuerpo, denominado el
anticuerpo de captura, dirigido contra un epítopo diferente
y espacialmente distinto sobre la molécula del antígeno, y
usualmente enlazado a una fase sólida:
Ab1 ⫹ Ag ⫹ Ab*2 Ab1AgAb*2 ⫹ Ab1 ⫹ Ab*2
estado inicial estado final
donde Ab1 ⫽ anticuerpo de captura, Ab*2 ⫽ anticuerpo
marcado.
Este diseño del ensayo es el llamado ensayo inmunomé-
trico sándwich, o ensayo inmunoenzimático de dos sitios,
y es el más utilizado en la actualidad para el ensayo de
374 CAP. 39 INMUNOENSAYO EN BIOQUÍMICA CLÍNICA

polipéptidos. El antígeno debe ser bastante grande para la

unión simultánea de dos anticuerpos. La adición del anti-
cuerpo a la muestra puede ser simultánea (formato de un
paso) o secuencial (con la eliminación de la muestra antes
de la adición del anticuerpo marcado, un formato de dos
pasos). Es posible utilizar más de un anticuerpo de captura
o marcado, dando un ensayo de varios sitios.
Al requerir dos epítopos distintos pero conectados, el
diseño del ensayo con dos sitios ofrece una especificidad
considerable mayor que un diseño competitivo de un solo
anticuerpo. Aunque los antisueros policlonales pueden uti-
lizarse en ensayos sándwich, este diseño entró en uso ge-
neral sólo cuando los anticuerpos monoclonales llegaron a
estar disponibles.
En los ensayos inmunométricos para los antígenos pe-
queños, el anticuerpo marcado sin reaccionar es frecuen-
te que sea eliminado por la adición del antígeno acoplado
a una fase sólida. La unión a una fase sólida deteriora la
reactividad y el antígeno acoplado, por tanto, no competirá
con el antígeno libre de la muestra. De forma alternativa,
puede utilizarse el anticuerpo específico para el complejo
del hapteno y el anticuerpo antiantígeno, y no reactivo a
cualesquiera de estos componentes por separado (complejo
antiinmunitario o anticuerpo antimetatipo):

Ag ⫹ Ab1 AgAb1 ⫹ Ab1 ⫹ Ab*2 AgAb1Ab*2 Figura 39-1 Curvas estándar típicas para a) un inmunoensayo
⫹ Ab1 ⫹ Ab*2 competitivo, b) un ensayo inmunométrico con dos sitios.
estado inicial estado final

donde Ab1 ⫽ anti-Ag, Ab2 ⫽ anti-(AgAb1).
Con este formato se muestra la diferencia fundamental
entre los inmunoensayos competitivos y el de exceso de
anticuerpos; el primero mide la señal a partir del anticuer-
po no ligado al antígeno y el último, la señal del anticuerpo
ligado al antígeno u ocupación del anticuerpo; por lo tanto
es más sensible, puesto que es más fácil distinguir un nú-
mero pequeño desde cero que uno grande de un número
levemente más elevado. Por otra parte, los métodos de ex-
ceso de anticuerpos son más rápidos, se afectan menos por
las variaciones en calidad y cantidad del reactivo y pueden
tener un rango de funcionamiento más amplio. La figura
39-1 muestra las curvas de calibración comunes para un in-
munoensayo competitivo y uno inmunométrico con dos sitios.
Condiciones del ensayo y calibradores
La concentración del anticuerpo o de los anticuerpos que
se elige para optimizar el rango de funcionamiento del
ensayo para su propósito clínico, en general, iguales con-
centraciones, más bajas, del anticuerpo y del antígeno. La
parte inclinada de la curva estándar y el rango de precisión
más alto deben corresponder al rango de la concentración so-
bre el que los valores son requeridos clínicamente. Se dedu-
ce que el rango de funcionamiento tiene limitaciones, por
ejemplo, en el ensayo de gonadotropina coriónica humana,
que se diseña para la oncología, no es útil en la determina-
ción de concentraciones en el embarazo.
Muchos factores, además de las cantidades de los reacti-
vos deben controlarse dentro de y entre los lotes para mante-
ner la optimización de un ensayo. La cinética de la reacción
y la posición de equilibrio dependen de la temperatura, pH y
fuerza iónica. La reactividad cruzada de moléculas que tiene
una relación estructural también será afectada por los cam-
bios en estas variables. En la medida de lo posible, estos fac-
tores, en especial la matriz de la muestra, deben mantenerse
constantes. Si a una reacción no se le permite alcanzar el
equilibrio, la falta de constancia de la sincronización puede
conducir a una desviación, es decir, a un error sistemático en
el resultado, de acuerdo con la posición de la muestra en el
lote. En analizadores automáticos estos factores pueden con-
trolarse de manera precisa, conduciendo a la consistencia de
resultados en y entre laboratorios.
Los reactivos para calibrar o los estándares pueden plan-
tear una dificultad especial en el inmunoensayo, puesto
que para muchas sustancias no hay un sistema de ensayo
alternativo practicable. En el caso del polipéptido de las
 MARCADORES
hormonas, hasta el advenimiento de la tecnología del DNA
recombinante no era posible preparar suficiente material
purificado para la medición por métodos fisicoquímicos y
de esta forma obtener calibradores para el inmunoensayo.
Por esta razón, se adoptaron los estándares internacionales
preparados para los bioensayos en los inmunoensayos, con
el valor asignado como el consenso de estudios de colabo-
ración que usan diferentes sistemas de bioensayos. Estos
estándares contienen algunos microgramos de antígeno o
problema con miligramos de albúmina transportadora y de
excipientes; y los métodos absolutos de análisis, como el
del aminoácido, no pueden utilizarse. Los ensayos de la hor-
mona del crecimiento y de la prolactina en Estados Unidos
están calibrados inadecuadamente en términos de masa.
La heterogeneidad inherente de la glucoproteína de las
hormonas es una barrera importante para la estandariza-
ción, y condujo a diferir los cocientes de bioactividad/in-
munoactividad en los estándares internacionales sucesivos.
El uso de estándares internacionales tiende a minimizar,
pero no elimina, las diferencias entre los ensayos. Los
materiales de referencia, estándares basados en el suero,
o los certificados, no se utilizan como calibrantes prima-
rios, puesto que los inmunoensayos están sujetos a efectos
de la matriz. El último objetivo es calibrar los ensayos de
proteína en términos de masa o molaridad, un desafío para
muchos antígenos. Para una discusión de las dificultades de
la calibración, véase Bristow, 1998; Stenman, 2001.
Marcadores
Muchos diferentes tipos de moléculas tipo marcador o re-
portera se usan en la actualidad. Los procedimientos de mar-
caje se diseñan para no deteriorar la unión de la molécula
marcada a su anticuerpo o antígeno apropiado. La medición
(detección) del marcador puede requerir otros reactivos o
un equipo muy especializado, o ambos. Los tipos de marca-
dor que más se emplean se listan en el cuadro 39-1.
Cuadro 39-1 Tipos de marcador de uso corriente
Radioisótopos
Quimioluminiscencia
Quimioluminiscencia incrementada
Electroquimioluminiscencia
Fluorescencia
Fluorescencia de tiempo resuelto
Enzimas
Colorimetría, colorimetría cinética
Fluorescencia
Quimioluminiscencia
Amplificación (cascadas)
375
Los radioisótopos son fácilmente detectables, pero el
peligro que representan es una desventaja, además se re-
quiere de procedimientos específicos de manipulación y de
eliminación. También tienen una “vida útil” corta, ya que la
molécula marcada se daña por decaimiento radiactivo. Con
el advenimiento de la automatización, han llegado a restrin-
girse a ensayos más especializados y de bajo volumen.
La polarización de la fluorescencia sólo es conveniente
para valorar haptenos pequeños y de fármacos, pero otros
métodos fluorescentes se aplican a un amplio rango de antí-
genos. Los fluoróforos utilizados con más frecuencia inclu-
yen la fluoresceína, la umbeliferona, el luminol y los metales
raros. Las técnicas de fluorescencia de tiempo resuelto usan
quelatos de lantánido, que producen una fluorescencia rela-
tiva duradera; la sensibilidad se mejora tomando las lecturas
después que la fluorescencia de fondo de corta duración pro-
ducida por los componentes endógenos de la muestra ha de-
caído. La sensibilidad también se incrementa por el cambio
de Stokes amplio de los quelatos de lantánido (es decir, la di-
ferencia en la longitud de onda entre los picos de excitación
y de emisión) y sus máximos de emisión muy estrechos, que
reducen la fluorescencia del fondo. El marcado múltiple,
empleando diferentes lantánidos, es también posible, y ofre-
ce gran potencial para el análisis multiplexado y miniaturi-
zado. Los iones del lantánido son también un componente
de los marcadores de criptato; los iones se incluyen dentro de
una molécula orgánica grande “como jaula”, un criptando, y
el criptato que resulta es muy estable e inerte. La técnica de
emisión amplificada de tiempo resuelto del criptato se basa en
la transferencia no radiactiva amplificada de la energía desde
un donante fluorescente (el criptato) a una molécula acepto-
ra espacialmente próxima. Así, el marcador ligado y libre
puede distinguirse por sus espectros de emisión, permitien-
do un sistema de ensayo homogéneo aplicable a moléculas
grandes y pequeñas.
En la quimioluminiscencia, la molécula excitada se pro-
duce por una reacción química; los sustratos quimiolumi-
niscentes producen fotones (luz), por lo general con una
reacción oxidativa. En la electroquimioluminiscencia, la
emisión de luz se inicia electrónicamente al aplicar un vol-
taje a la solución de la reacción, eliminando los problemas
relacionados con la adición y mezcla del reactivo.
El marcaje con enzimas y la detección con sustratos que
dan puntos finales colorimétricos, índices colorimétricos,
fluorimétricos o quimioluminimétricos aportan mayor sen-
sibilidad y un rango más amplio de funcionamiento. Esta
técnica, cuando se aplica con fluorescencia o quimiolumi-
niscencia, se describe como “enzima realzada” o “enzima
amplificada”. Una forma de ensayo de fase sólida heterogé-
nea que ha conseguido aplicación extensa en muchos siste-
mas antígeno-anticuerpo es el ensayo de inmunoabsorción
ligado a enzimas, o ELISA. La muestra primero se incuba
376 CAP. 39 INMUNOENSAYO EN BIOQUÍMICA CLÍNICA
con un anticuerpo que está unido a una fase sólida (por lo co-
mún sobre una placa de microtitulación), entonces cualquier
antígeno no ligado se elimina por lavado, después, se agrega
un segundo anticuerpo acoplado a una enzima. La actividad
de la enzima unida a la fase sólida es proporcional a la con-
centración del antígeno capturado (es decir, el antígeno).
La búsqueda para el marcador “ideal” continúa (véase
Kricka, 1994); los estudios de desarrollo biotecnológico
recientes incluyen marcadores particulares con tamaños
submicrométricos acoplados a los agentes de unión especí-
fica, que ofrecen mayor sensibilidad.
Ensayos homogéneos
El término “homogéneo” se utiliza para los inmunoensayos
en los cuales no se requiere la separación del marcador ligado
o libre. En tales sistemas la señal es modificada por la unión
del anticuerpo, con lo que resulta que el marcador ligado o
libre puede distinguirse en la mezcla de reacción, por ejem-
plo, la unión del antígeno marcado con enzima al anticuerpo
puede inhibir la actividad de la enzima, por impedimento es-
térico o induciendo cambio de conformación del sitio activo.
Este sistema (EMIT®, técnica de inmunoensayo multiplicado
por enzimas, Syva) puede utilizarse en analizadores de quí-
mica; en la práctica se emplea ampliamente para la medición
de fármacos. La polarización de la fluorescencia también se
usa para los ensayos de fármacos. Otro ejemplo es el inmu-
noensayo turbidimétrico para las moléculas pequeñas, en los
cuales la unión del anticuerpo cruzada con las partículas de
látex revestidas con el antígeno es inhibida por el antígeno
libre de la muestra, causando una disminución en la turbie-
dad. Si el antígeno es una molécula grande y en la concentra-
ción es suficientemente alta, la formación de los complejos
antígeno-anticuerpo puede medirse por nefelometría y no
es necesario el marcador. Los ensayos homogéneos para los
antígenos grandes y pequeños son factibles con los criptatos
recién desarrollados (véase la sección sobre Marcadores). Al-
gunos tipos de ensayo homogéneo disponibles se describen
en el cuadro 39-2. Sin embargo, la mayoría de estas técnicas
casi no se aplican, y gran parte de los inmunoensayos son del
Cuadro 39-2 Inmunoensayos homogéneos
Inhibición o activación enzimática (EMIT®)
Polarización de la fluorescencia
Transferencia de energía no radiactiva (+ fluorescencia de
tiempo resuelto)
Nefelometría
Turbidimetría
tipo heterogéneo, en el cual se requiere de la separación del
marcador ligado y libre.
Métodos de separación
Cualquier técnica para separar el antígeno ligado del libre o
del anticuerpo no debe perturbar la reacción primaria.
La diferencia en el tamaño molecular entre el antígeno
libre y el ligado al anticuerpo se aprovecha en los primeros
sistemas, como en la precipitación de la proteína con sul-
fato de amonio o polietilenglicol y la adsorción del antíge-
no libre con carbón vegetal. La separación inmunológica a
través del uso de un anticuerpo antiespecie resultó mucho
más confiable. Por ejemplo, ya que los anticuerpos son bi-
o multivalentes, si el anticuerpo primario fue elevado en
un conejo, los anticuerpos para las inmunoglobulinas del
conejo elevados en un burro producirán complejos con
las inmunoglobulinas del conejo que son suficientemente
grandes e insolubles para formar un precipitado. Algún
suero o inmunoglobulinas de un conejo no inmunizado
(suero portador) se agrega regularmente para asegurar la
precipitación. Tales reactivos son de aplicabilidad general.
Este sistema de separación (en el ejemplo del anticonejo
del burro) se llama un “anticuerpo secundario”, y los ensa-
yos que lo usan, métodos de doble anticuerpo, aunque este
nombre en ocasiones también se utiliza para describir un
ensayo con dos sitios. La formación del precipitado del an-
ticuerpo secundario es lenta, por tanto, en estos ensayos es
frecuente que se deje que ocurra el precipitado toda la no-
che, pero esta etapa puede acortarse en forma considerable
agregando polietilenglicol. Después de la centrifugación, el
sobrenadante es removido por aspiración o decantación,
procedimientos que requieren habilidad y experiencia con
los precipitados muy pequeños que se producen.
Métodos de separación en fase sólida
Estas técnicas, que han reemplazado en gran parte al res-
to de los métodos, implican ligar los reactivos a las fases
sólidas por unión covalente o por adsorción. La fase sólida
puede ser la pared de un tubo plástico, la celdilla de una
placa de microtitulación o la superficie de perlas grandes o
de partículas pequeñas. Las partículas con una base mag-
netizable ofrecen separación excepcionalmente rápida y
eficiente. La separación es por decantación simple y conve-
niente o aspiración de la fase líquida, seguida normalmente
por el lavado de la fase sólida con amortiguador para ase-
gurar la terminación de la separación y reducir la unión no
específica (la unión evidente en ausencia del anticuerpo).
El ensayo simultáneo de dos o más antígenos es factible
ahora con la instrumentación capaz de separar las mezclas
 CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
de perlas revestidas de anticuerpos dentro de grupos codi-
ficados con una tinción específica para el antígeno en la
etapa final del ensayo de medición separada. Tal sistema
permite, por ejemplo, el inmunoensayo de múltiples antí-
genos en un solo punto Guthrie para el tamizaje neonatal.
La fase sólida puede ser un reactivo multipropósito,
realizado al cubrir con el segundo anticuerpo o con estrep-
tavidina, un reactivo específico que se acopla con biotina,
la cual tiene una afinidad muy alta con la estreptavidi-
na. Otros pares incluyen fluoresceína con antifluoresceína.
Esta técnica tiene la ventaja adicional de que las reacciones
específicas ocurren en la fase líquida. El acoplamiento a una
fase sólida disminuye la afinidad de un anticuerpo y la velo-
cidad de reacción, y puede alterar otras características. Las
técnicas en fase sólida también permiten variaciones del
protocolo del ensayo de la forma básica de la adición simul-
tánea de todos los reactivos a la muestra. Tales variaciones
pueden resultar en el incremento de la especificidad y otras
mejoras. Los reactivos inmovilizados sobre tiras de papel
forman la base de las pruebas con tira reactiva, por ejemplo,
para la prueba del embarazo. Otros dispositivos también
disponibles para inmunoensayo en el lugar de atención in-
cluyen pruebas para los marcadores cardiacos y fármacos.
Automatización
La automatización de los inmunoensayos requiere la apli-
cación de una técnica muy exigente debido a la necesidad
de la separación de los marcadores ligado y libre en la ma-
yor parte de los métodos. Los primeros instrumentos eran
analizadores de lote que usaban un solo formato del ensayo
homogéneo, para un número limitado de antígenos. Los sis-
temas actuales de alto rendimiento, totalmente automáticos,
disponibles a finales de la década de 1980, pueden ser anali-
zadores de lote u ofrecer el acceso aleatorio con calibración
poco frecuente (con intervalos de semanas o de meses) deri-
vada de un nivel alto de estabilidad del instrumento y de los
reactivos. El acceso aleatorio evita la necesidad del muestreo
por lotes incluso para las pruebas solicitadas con poca fre-
cuencia y da tiempos de espera cortos. Formatos de ensayos
diferentes, pero con un sistema común de medición, pueden
incluirse en un solo instrumento. La sincronización exacta
permite tiempos de reacción cortos sin la incubación para
el equilibrio. La precisión debe ser siempre superior que
la de los ensayos manuales, pero difiere considerablemente
entre los diferentes tipos de instrumento. Las desventajas
inherentes son la complejidad y la inflexibilidad.
Miniaturización
Los desarrollos en otras disciplinas han permitido la miniatu-
rización de los dispositivos del inmunoensayo. A la placa de
377
microtitulación de 96 celdillas pueden sucederle placas de
alta densidad con muchos múltiplos de este número, requi-
riendo sistemas especializados de manipulación del líquido
para los volúmenes muy pequeños de muestra y de reactivos.
De interés particular en áreas de la medicina, donde una gran
cantidad de pacientes requiere series idénticas de pruebas,
como en el tamizaje de fármacos o del marcador tumoral,
es el desarrollo de sistemas que usen microarreglos de reac-
tivos. Tal microarreglo consiste en microgotas discretas
múltiples del reactivo impresas o formadas de otra manera
en un soporte inerte (p. ej., un arreglo de puntos de 5 ⫻ 5
sobre un sustrato o chip de 1 ⫻ 1 cm, o un arreglo de 8 ⫻ 8 en
cada celdilla de una placa estándar de microtitulación). Para
el inmunoensayo el reactivo inmovilizado es normalmente
un anticuerpo específico, y cada microgota puede ser un an-
ticuerpo diferente, permitiendo la estimación simultánea de
antígenos. La incubación con la muestra y una mezcla de los
otros reactivos específicos y el resto del procedimiento del
inmunoensayo, se lleva a cabo de manera normal, y la señal
(con frecuencia fluorescencia o quimioluminiscencia) es de-
tectada o registrada con un dispositivo de cámara fotográfica
digital. Algunas microgotas en el arreglo pueden diseñarse
para detectar interferencias en la muestra, por ejemplo, anti-
cuerpos heterofílicos, y para garantizar el control de calidad
de los reactivos, un nivel de inspección de calidad no se lo-
gra fácilmente en sistemas más simples. Estos dispositivos
ofrecen ahorros sustanciales de la muestra, de los reactivos
y del tiempo comparados con los sistemas automáticos con-
vencionales.
En el futuro, los microchips completamente integrados
al inmunoensayo pueden llegar a estar disponibles, conte-
niendo estructuras microfabricadas capaces de llevar a cabo
todos los pasos de la preparación de la muestra para la detec-
ción de la señal. Para una descripción de los logros en el in-
munoensayo con microchip, véase Kricka y Wilding (1998),
y para un estudio de la literatura sobre el desarrollo de la
miniaturización en general, véase Kricka y Fortina (2001).
Cálculo de los resultados
Ya que la curva de calibración para el inmunoensayo (una
representación del marcador ligado contra la concentración
del antígeno) no es una línea recta, ajustar una curva a los
datos, con su imprecisión concomitante, es una cuestión de
juicio. Varias manipulaciones empíricas se han empleado
para hacer parte o la totalidad del gráfico lineal. El mar-
cador ligado (o el porcentaje ligado si la cantidad total del
marcador adicionado es conocida) en comparación con la
concentración o log de concentración; el log del marca-
dor ligado contra el log de concentración, y las gráficas
logit-log se utilizan normalmente ([logit = log{(B/B0)/L
⫺ (B/B0)}], donde B0 = marcador ligado en el calibrador
378 CAP. 39 INMUNOENSAYO EN BIOQUÍMICA CLÍNICA
cero). Los papeles graficados lin-log, log-log y logit-log se
encuentran disponibles. Los instrumentos modernos dise-
ñados para el inmunoensayo tienen programas de compu-
tadora para ajustar la curva, incluyendo métodos complejos
como ajustes de la curva por Spline cúbico o por log-logís-
tico de cuatro parámetros.
Exactitud y precisión
La exactitud del resultado de un ensayo es la proximidad
a la concentración verdadera del antígeno; para muchas
sustancias aún es tema de investigación y discusión. La
precisión es la variabilidad del resultado que se obtiene, y
la imprecisión se puede minimizar por el uso de reactivos
apropiados, por ejemplo, un marcador con detectabilidad
superior, con la reducción del número de pasos y con el
control estrecho de la técnica. El control de calidad inter-
no proporciona información sólo sobre la imprecisión. Los
ensayos manuales se realizan por duplicado. La impreci-
sión varía con la concentración del antígeno. Un ejemplo
típico se muestra en la figura 39-2.
Figura 39-2 Un perfil de precisión típico.
El rango de concentración de imprecisión baja debe, ideal-
mente, igualar el rango sobre el cual los resultados clínicos
se obtienen, y la imprecisión ser apropiada para una utilidad
clínica de los resultados. Algunos trabajadores definen el ran-
go de funcionamiento de un ensayo como aquel sobre el cual
el coeficiente de variación (CV) es menor de 10%.
La sensibilidad o la concentración mínima perceptible
puede definirse de varias maneras, por ejemplo, como la
concentración que corresponde a 2, 2.5 o 3 desviaciones
estándar (SD) de la señal del calibrador cero arriba de (para
los ensayos inmunométricos) o debajo (para los ensayos
competitivos) del valor medio para el calibrador cero, la
SD que se obtiene de, digamos, 20 réplicas del calibrador
cero en un solo lote. Esto a veces se denomina sensibilidad
analítica. Más realista pueden ser el uso de SD entre lote,
y el suero antígeno libre, dando el “límite biológico de de-
tección”. Otros utilizan la concentración en la cual el CV
entre lote es de 20% en las muestras biológicas, para un
valor denominado “sensibilidad funcional”.
Cuando el término “sensible” se utiliza en la descrip-
ción de un ensayo, implica no sólo que las concentracio-
nes bajas del antígeno pueden distinguirse desde cero, o
la ausencia del antígeno, sino también que la precisión a
niveles bajos es bastante buena para los cambios pequeños
en concentraciones bajas del antígeno para medirse confia-
blemente. Esto es en particular importante en el campo de
los marcadores tumorales.
Nótese que “sensibilidad” tiene significados alternativos;
es también la pendiente de la curva estándar en cualquier
concentración, y la sensibilidad clínica es una medida de la
capacidad de una prueba para detectar la presencia de una
enfermedad.
Control de calidad
El control de calidad interno (CCI) proporciona información
sobre la precisión dentro de y entre los ensayos, y sobre la
variabilidad de la calidad del reactivo, pero no de la exactitud
ni validez, o errores con, o interferencia en, las muestras indi-
viduales. El CCI requiere materiales de composición similar
(antígeno y matriz) para las muestras clínicas en suficiente
cantidad para el uso repetido dentro de y entre los lotes de
un ensayo, o para el uso a largo plazo en un analizador au-
tomatizado. Los materiales líquidos por lo común se alma-
cenan congelados. Los materiales comerciales de control de
calidad se suministran liofilizados. Durante la liofilización (y
el almacenaje subsiguiente) algunos componentes se pueden
dañar, por ejemplo, los antígenos inestables o las proteínas de
unión para los esteroides. Las concentraciones del antígeno
elegido para los materiales del control de calidad (con valores
bajos, medios y altos) deben corresponder a los puntos signi-
ficativos del ensayo, como en los puntos de decisión clínicos,
pero evitarse las áreas de alta imprecisión, que hagan la inter-
pretación difícil. Con los materiales comerciales del control
de calidad se consiguen los valores requeridos por el uso de
suero tratado y la adición del antígeno, que pueden limitar la
similitud con las muestras clínicas. Los materiales de origen
humano deben utilizarse.
El registro continuo de los resultados del CCI es esen-
cial; la demostración del desempeño aceptable se requie-
re para la acreditación del laboratorio, y los registros pueden
también ser invaluables en la localización y resolución de
problemas (en el local o por el fabricante). El software del
ICC se suministra en los instrumentos automatizados pero
puede no ser ideal, haciendo necesaria la transferencia de
 ESPECIFICIDAD, REACTIVIDAD CRUZADA E INTERFERENCIA
datos a un sistema o programa alternativo. Para las normas
sobre el uso de los resultados del control de calidad, véase
Westgard (2005) y Price & Newman (1997).
Los esquemas externos de la garantía de calidad (EEGC)
intentan aportar información sobre la comparabilidad de mé-
todos e investigar la validez, vía recuperación del estándar
agregado, linearidad en la dilución, especificidad, rendimien-
to con el suero bajo antígeno, interferencia y otros factores.
Tales esquemas están disponibles sólo para los ensayos esta-
blecidos, y es común en los laboratorios que ensayan com-
puestos esotéricos, posiblemente con poca frecuencia, para
cambiar muestras para la comparación y el reaseguramiento.
Especificidad, reactividad cruzada
e interferencia
La alta especificidad del sitio de unión de un anticuerpo
para su antígeno es una ventaja principal de los inmunoen-
sayos. Un solo epítopo en una molécula compleja puede
involucrar aminoácidos espacialmente próximos sólo en
la estructura terciaria o cuaternaria de la molécula, y un
anticuerpo para tal epítopo, por tanto, no reacciona con las
formas o los fragmentos desnaturalizados. Sin embargo, un
antisuero policlonal contiene anticuerpos de afinidades y
de especificidades que difieren. Si la preparación del antí-
geno que se utiliza para la inmunización es impura, enton-
ces el antisuero contiene anticuerpos para las impurezas, y
la falta resultante de especificidad compromete la validez
del ensayo, sobre todo si el calibrante y el marcador son
también impuros. La selección de los anticuerpos mono-
clonales puede minimizar la reactividad cruzada, pero las
moléculas que se relacionan de manera estrecha pueden aun
ser reconocidas por el anticuerpo, en especial en el caso de
moléculas pequeñas, tales como esteroides y fármacos.
La hiperespecificidad de un ensayo puede ocurrir si un
anticuerpo monoclonal se dirige a un epítopo, que ocurre
en algunas formas biológicamente activas de un antígeno
heterogéneo.
La reactividad cruzada en un ensayo competitivo se de-
fine de manera arbitraria como aquella concentración del
reactivo cruzado que emite 50% de la señal encontrada en
ausencia del antígeno, que se expresa como porcentaje de
la concentración del antígeno que emite la misma señal. La
reactividad cruzada medida varía en diferentes puntos de
la curva dosis-respuesta, y también con la presencia o la
ausencia del antígeno, y con el formato del ensayo y las con-
diciones de la reacción, como temperatura y tiempo de in-
cubación. Es, por tanto, imposible calcular la concentración
verdadera del antígeno en presencia de una reacción cruza-
da, aun si la reactividad cruzada se conoce. La interferencia
negativa en ciertos diseños del ensayo de reactivos cruzados
—en los que se incluyen varios fármacos de uso corrien-
379
te— se reconocen hoy como un problema potencial serio en
la vigilancia de la digoxina (Valdes y Jortani, 2002).
En ensayos inmunométricos con dos sitios es importante
probar los reactivos cruzados potenciales en ausencia y en
presencia del antígeno, puesto que el reactivo cruzado puede
reaccionar con cualquiera de los dos o con ambos anticuer-
pos. La reacción de éstos dará un aumento en la señal, mien-
tras la reacción con uno puede producir una disminución en
la señal con altas concentraciones del reactivo cruzado, que
se pueden detectar sólo en presencia del antígeno.
La reactividad cruzada de compuestos conjugados o me-
tabolitos con estructuras relacionadas es un problema espe-
cífico con los ensayos de esteroides. En algunos casos, por
ejemplo, el cortisol y la testosterona en plasma, un método
directo se utiliza de rutina (aunque las limitaciones deben
considerarse). En otros, con el cortisol en la orina, se requie-
re un paso preanalítico de extracción en algunos ensayos,
pero hay casos en los cuales esto es esencial, por ejemplo,
para eliminar los reactivos cruzados potenciales cuando se
ensaya la 17-hidroxiprogesterona en los infantes que se sos-
pecha un diagnóstico de hiperplasia suprarrenal congénita.
La interferencia de sustancias aparentemente sin relación
en muestras clínicas puede ocurrir de distintas maneras. La
sustancia, mal caracterizada, denominada inmunorreacti-
va parecida a la digoxina, que se administra en el suero
de pacientes en ciertas condiciones, sin tomar en cuenta la
terapia con digoxina, da resultados falsamente altos en los
ensayos con digoxina, y parece ser una reactividad cruzada
fortuita. Los autoanticuerpos pueden interferir al contribuir
con el antígeno del ensayo el cual in vivo es secuestrado
por el autoanticuerpo y, por tanto, es biológicamente inac-
tivo, como en el caso de la macroprolactina. De manera al-
terna, los autoanticuerpos pueden participar en la reacción
del ensayo; el efecto sobre el resultado depende del dise-
ño del ensayo (p. ej., antitriyodotironina y antitiroxina en
los ensayos para las hormonas tiroideas libres). Para algu-
nos antígenos, la aparición de la interferencia de los au-
toanticuerpos es muy frecuente para requerir el tamizaje de
las muestras, por ejemplo, para el ensayo de tiroglobulina,
o el reensayo después de la eliminación del autoanticuerpo,
por ejemplo, la prolactina.
La unión del complemento puede conducir a la destruc-
ción del complejo antígeno-anticuerpo. Este efecto puede
prevenirse con la adición de EDTA para quelar los iones
del calcio. Los anticuerpos antianimal, los de suero huma-
no para inmunoglobulinas de otras especies, por ejemplo,
anticuerpos humanos antirratón (HAMA) y los heterofíli-
cos, ahora se conoce que ocurren en una proporción alta
de pacientes; los HAMA que están presentes en cantidades
grandes en los pacientes proporcionan anticuerpos mono-
clonales para estudios por imágenes y propósitos terapéuti-
cos. Los anticuerpos antianimal y probablemente también
380 CAP. 39 INMUNOENSAYO EN BIOQUÍMICA CLÍNICA
el factor reumatoide pueden ligar un solo anticuerpo, re-
duciendo su afinidad para su antígeno, o lograr el enlace
cruzado de dos anticuerpos, de tal modo se imita al antí-
geno. Las concentraciones muy altas pueden producir in-
terferencia negativa de una manera análoga al “efecto de
gancho” por dosis alta. Estos efectos pueden bloquearse
por la adición de inmunoglobulinas de la misma especie
animal que los anticuerpos reactivos. Los fabricantes de
equipo ahora incluyen de rutina inmunoglobulinas de ratón
y de otra especie y anticuerpos bloqueadores específicos en
formulaciones del reactivo con el anticuerpo.
Una prueba simple para detectar la presencia de un in-
terferente se realiza examinando la linealidad en la dilu-
ción con un diluyente de matriz similar. La falta de linea-
lidad sugiere un problema, aunque la buena linealidad no
excluye alguno.
Para una revisión de todos los tipos de interferencia,
véase Selby (1999).
“Efecto de gancho” por dosis alta
En un ensayo inmunométrico de dos sitios con la adición
simultánea de dos anticuerpos a la muestra (un ensayo de
un solo paso), cuando la concentración del antígeno es muy
alta y los anticuerpos no son muy superiores, la unión cru-
zada de los anticuerpos de captura y marcados por el antí-
geno decrecen, con los sitios de unión en cada anticuerpo
ocupados por las moléculas separadas del antígeno. La se-
ñal que se observa, por tanto, es débil. En concentraciones
extremas altas de antígeno, la señal puede caer por debajo
de la del calibrador superior y un resultado falso bajo se
lee (fig. 39-3). Este fenómeno se conoce como “efecto de
gancho” por dosis alta, o respuesta bifásica, y es importan-
te sólo para aquellos antígenos que ocurren clínicamente
Figura 39-3 El “efecto de gancho” por dosis alta, x = concen-
tración del calibrador más alto; y = concentración arriba de la cual
valores falsos bajos se obtienen en muestras sin diluir.
en un rango de concentración de varios órdenes de magni-
tud, como se observa para los marcadores tumorales como
la gonadotropina coriónica humana, la ␣-fetoproteína y la
prolactina. La posición de gancho depende de las concen-
traciones de los anticuerpos.
Es difícil mantener la vigilancia constante para la pre-
sencia posible de este efecto, pero como un incorrecto
(quizás en apariencia “normal”) resultado puede conducir
a que se tome la acción inadecuada y posiblemente perjudi-
cial, cada esfuerzo práctico debe realizarse. La dilución de
rutina de las muestras con valores en la parte superior de la
curva estándar, o aquellas con la información clínica apro-
piada, por ejemplo, “tumor hipofisario grande”, se utiliza a
veces. Los dispositivos individuales, como aquellos para la
prueba de embarazo, son también vulnerables. El “efecto
de gancho” puede evitarse usando un formato de dos pasos,
en el cual la muestra se incuba con el anticuerpo de cap-
tura en fase sólida, el exceso del antígeno se elimina con
lavado y el anticuerpo marcado se adiciona después. En
este formato, las concentraciones muy altas se leen como
más “grande que el calibrador superior”, sin la indicación
de cuánto más grande. Sin embargo, el paso adicional au-
menta la imprecisión total del ensayo, un factor de cierta
importancia para los marcadores tumorales. Los sistemas
que pueden emplear una lectura cinética muy temprana en
el tiempo de reacción permiten una “estimación” del resul-
tado final, la dilución automática y el reensayo, con lo que
se elimina prácticamente este problema.
Lecturas adicionales
Bristow AF. Standardisation of protein hormone assays: current
controversies. Proc UK National External Quality Assurance
Schemes Meeting 1998; 3: 66-73.
Kricka LJ. Selected strategies for improving sensitivity and relia-
bility of immunoassays. Clin Chem 1994; 40: 347-357.
Kricka LJ, Wilding P. Miniaturization of immunoassay devices.
Proc UK National External Quality Assurance Schemes Mee-
ting 1998; 3: 166-171.
Kricka LJ, Fortina P. Microarray technology and applications:
and all-language literature survey including books and pa-
tents. Clin Chem 2001; 47: 1479-1482.
Price CP, Newman DJ (eds). Principles and Practice of Immu-
noassay, 2nd edn. 1997: Macmillan, London.
Selby C. Interference in immunoassays. Ann Clin Biochem 1999;
36: 704-721.
Stenman U-H. Immunoassay standardization: is it possible, who is
responsible, who is capable? Clin Chem 2001; 47: 815-820.
Valdes R, Jortani SA. Unexpected suppression of immunoassay
results by cross-reactivity: now a demonstrated cause for con-
cern (Editorial). Clin Chem 2002; 48: 405-406.
Westgard JO. 2005: http://www.westgard.com
Wild D (ed.). The Immunoassay Handbook, 2nd edn. 2001: Natu-
re Publishing Group, New York.
 40
Electrodos ion-selectivos
Alan D Hirst

Introducción • Electrodos secundarios o complejos: por ejemplo, glu-

La mayor parte de las formas convencionales de medición
de la bioquímica clínica se basan en la producción de un
compuesto coloreado. La electroquímica difiere en que la
medición está fundamentada en la generación de un voltaje
(potencial) o corriente, y el sistema que la mide es un voltí-
metro o un amperímetro en lugar de un fotómetro.
Un detector electroquímico, que responde específica-
mente a un analito, se llama electrodo ion-selectivo (ISE).
Los primeros electrodos reaccionaron a los iones, de ahí el
nombre, pero en los últimos adelantos, éstos se han desa-
rrollado para responder a metabolitos como glucosa y urea
aunque se incluyen normalmente en la misma categoría
porque comparten una tecnología común. Los sensores de
glucosa que se usan en áreas clínicas son con frecuencia
dispositivos de ISE, y todos los analizadores de cuidado
crítico se basan en la tecnología de ISE.
El fundamento de función de los ISE es que ellos pro-
ducen una respuesta potenciométrica (cambio de voltaje)
o amperimétrica (cambio de corriente) a los cambios en el
analito, es decir, existen dos tipos de electrodos primarios.
Los electrodos secundarios utilizan otras características,
como las enzimáticas, para alcanzar especificidad y liberar
un producto que pueda detectarse con un ISE.
Los electrodos se emplean en varias aplicaciones clíni-
cas. Los que se usan con más frecuencia son para:
• Iones: por ejemplo, hidrógeno (pH), sodio, potasio, clo-
ruro, fluoruro, calcio, magnesio, litio, amonio (NH+4).
• Gases: por ejemplo, oxígeno, dióxido de carbono, amo-
niaco (NH3).
cosa, urea, lactato, creatinina.
Las ventajas de los dispositivos ISE en aplicaciones clíni-
cas consisten en que:
• No son fotométricos, lo que significa que una solución
óptica transparente no es necesaria, es decir la sangre
completa puede usarse.
• Son rápidos y directos, permitiendo la medición de la
concentración verdadera o de la actividad biológica.
Teoría
Una celda potenciométrica y fuentes de potenciales
Cuatro elementos son requeridos para realizar una medi-
ción con un ISE potenciométrico:
• Una media celda para la medición.
• Una media celda de referencia.
• Un puente salino o una conexión eléctrica equivalente.
• Un dispositivo de medición.
Una vista esquemática de este arreglo se muestra en la fi-
gura 40-1.
Un electrodo funcional (celda) se compone de dos me-
dias celdas, un electrodo medidor y un electrodo de refe-
rencia. Cada media celda produce un potencial, pero un
“potencial” como tal no puede medirse de manera direc-
ta. Es la diferencia de potencial (es decir voltaje) entre las

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
382 CAP. 40 ELECTRODOS ION-SELECTIVOS

Milivoltímetro

Electrodo de referencia Electrodo medidor

V

Puente salino

Solución Solución para

de referencia la medición

Figura 40-1 Un electrodo simple consistente en una

media celda para la medición y una media celda de re-
ferencia conectadas por un puente salino. Media celda Media celda para
de referencia la medición

dos medias celdas lo que produce una señal mensurable.

La media celda de referencia debe diseñarse para tener un
potencial constante, mientras el electrodo medidor tiene
un potencial, el cual varía con la concentración de la sus-
tancia que es medida, y así la diferencia de potencial, o el
voltaje, varía en una forma reproducible con la concentra-
ción de la sustancia.

Medición y medias celdas de referencia

(que dan lugar a potenciales del electrodo)

El potencial de cada media celda se produce a partir de una

separación de la carga creada por la migración de iones
como sigue. En la superficie del electrodo, o en cualquier
unión, líquido o sólido, habrá una tendencia para que los
iones pasen de una fase a otra, por ejemplo, esto es, en la
superficie del electrodo los iones viajan desde el electro-
do, dentro de la solución. Si éstos son iones de hidróge-
no, por ejemplo, para un electrodo de pH, y entran en la
solución sin un ion con la carga negativa correspondiente,
una separación de la carga se crea, con una solución más
cargada positivamente (con iones hidrógeno) y un electro-
do con más carga negativa (con electrones). A medida que
este proceso continúa, el incremento de la separación de la
carga produce un aumento en el potencial entre el electrodo
y la solución, el cual se opone a la migración iónica adi-
cional, hasta que se alcance un equilibrio, en el cual no hay
otro movimiento neto de iones. Este proceso se ilustra con
un electrodo de zinc en la figura 40-2.
Figura 40-2 Una media celda de zinc que consiste en un electro-
do del metal zinc en contacto con una solución de sulfato de zinc;
los iones zinc emigran desde el electrodo dentro de la solución,
dejan una pequeña carga negativa sobre el electrodo y producen
una solución con carga más positiva.
Si el electrodo permanece en contacto con una solución
de concentración iónica baja, se crea una salida grande de
iones desde el electrodo, antes que se alcance el equilibrio,
y un potencial grande se establece. De manera inversa,
una solución concentrada tiende a oponerse a la migración
iónica desde el electrodo y produce un potencial más bajo.
En otras palabras, el potencial que se produce varía inver-
samente con la concentración de iones en la solución.
 TEORÍA
El electrodo de referencia trabaja de la misma forma
que el electrodo medidor, pero está en contacto con una
solución de concentración constante y debe tener un poten-
cial constante.
Puente salino (dando lugar a un potencial de unión)
Para poder medir la diferencia de potencial entre dos me-
dias celdas allí debe existir un circuito eléctrico, y un con-
tacto eléctrico entre la solución del electrodo de referencia
y la del electrodo medidor. Esto es normal que ocurra por
contacto directo o con un “puente salino”, como se muestra
en la figura 40-1.
Existe migración iónica entre las soluciones en contacto,
similar a la migración iónica entre electrodos y soluciones.
Si los aniones y cationes en una de las soluciones son de
diferentes tamaños, emigrarán a diferentes tasas, como se
muestra en la figura 40-3, y esto también produce una se-
Figura 40-3 Ilustración del potencial de unión. La solución 1
es una sal que consiste de un ion de metal relativamente pequeño
(M) y un anión grande (X). En la unión líquida, el ion de metal
más pequeño se difunde dentro de la otra solución (NY) a una
tasa mayor que el anión, causando una separación de la carga, el
potencial de unión.
paración de la carga, que crea un potencial que se opondrá
a la separación adicional de la carga. Todos los sistemas
del electrodo tienen uniones líquidas y, por tanto, poten-
ciales de unión. Una de las características principales del
diseño de un electrodo de referencia es reducir al mínimo
el tamaño y la variabilidad del potencial de unión. Por esta
razón, el electrodo de referencia de “calomel” es el más
común (cloruro mercúrico). Éste utiliza cloruro de potasio
saturado como solución del electrodo de referencia, por-
que los iones de potasio y los de cloruro tienen un tamaño
iónico similar y emigran a una tasa similar. Sin embargo,
esto no elimina por completo el potencial de unión, porque
la solución desconocida que está en contacto contiene una
composición variable.
383
Los electrodos descritos hasta ahora son sistemas sim-
ples, sin el elemento de selectividad, y de resistencia baja,
y son la base de la batería común. Para los propósitos de
medición, una membrana selectiva necesita introducirse.
Un sistema de trabajo típico se muestra en la figura 40-4.
Cuando el electrodo está rodeado por una membrana se-
lectiva —cristal en este ejemplo— existe una separación de
carga adicional en la superficie de la membrana. Este es el
“potencial de membrana” que se describe con más detalle
en la siguiente sección.
Potenciales circulantes
El movimiento en una de las soluciones, por ejemplo, que
se inicia con un mezclador mecánico o con un analizador
de flujo continuo, puede también producir un potencial cir-
culante. La mayor parte de los instrumentos toma lecturas
estáticas para evitar esta fuente de error.
Sistema medidor
La diferencia de potencial se mide con un milivoltímetro,
como se muestra en la figura 40-4. Los voltajes típicos medi-
dos son de 59 mV para cada cambio de decena (diez veces)
en la concentración para un ion monovalente como hidróge-
no y sodio, y 29.5 mV para un ion bivalente como calcio. Un
error de medición de 1 mV, a partir de cualquier fuente (p.
ej., potencial de unión), produce un error de lectura de 4%
para un ion monovalente y de 8% para uno bivalente. Esto
significa que se requieren milivoltímetros sensibles estables
para la medición.
El circuito debe permitir una corriente mínima, porque
una corriente grande perturba el equilibrio iónico en las su-
perficies del electrodo. Las membranas del electrodo deben
ser teóricamente capaces de conductancia eléctrica, pero
en la práctica tienen una resistencia muy alta, del orden
de 109 ohmios. De manera similar, el milivoltímetro debe
derivar una corriente mínima a partir del circuito que tiene
una resistencia de entrada muy alta. Esto requiere el diseño
especial del voltímetro, y uno estándar no es el adecuado.
Es innecesario mencionar que en un sistema tal, el cual
requiere resistencia eléctrica alta y una corriente insigni-
ficante para funcionar, la limpieza es muy importante, y
necesitan sellarse y aislarse cuidadosamente para dar re-
sultados reproducibles.
Calibración
Para realizar mediciones útiles con un sistema de funcio-
namiento del electrodo, como se muestra en la figura 40-4,
éste debe calibrarse primero. La respuesta de un sistema
384 CAP. 40 ELECTRODOS ION-SELECTIVOS
Electrodo
de referencia
Calomel
(Hg2Cl2)
Cloruro
de potasio
Figura 40-4 Típico sistema de funcionamiento del saturado
electrodo, consiste de un electrodo de pH de vidrio y (KCl)
de uno de referencia de calomel (cloruro mercurio-
so), ambos sumergidos en una solución cuyo pH es Tapón
medido. El tapón de cerámica poroso forma el puente de cerámica
salino y controla la pérdida de la solución interna del poroso
electrodo de referencia.
del electrodo es una respuesta logarítmica inversa definida
por la ecuación de Nernst:
EMF (voltaje) = Ereferencia – Edesconocido
(Areferencia)
= RT loge
nF (A desconocida)
donde A = actividad, R = la constante del gas, T = tempe-
ratura absoluta, n = carga de la valencia y F = constante
de Faraday. Puede verse, a partir de ésta, que hay una re-
lación logarítmica inversa compleja entre la concentración
(estrictamente, la “actividad”) de un ion y el voltaje que
produce un electrodo. Esto significa que la calibración del
sistema y la producción de una lectura no es algo fácil,
como lo es, por ejemplo, para un sistema colorimétrico de
glucosa sanguínea.
La aproximación por lo general es medir la “pendiente”
logarítmica del electrodo, y también el voltaje a dos con-
centraciones. Idealmente éste debe ser de 59 mV para un
cambio de diez veces en la concentración. Sin embargo, es
raro que los electrodos sean ideales, y la señal se deteriora
con el tiempo, así que la pendiente necesita comprobarse
regularmente.
Especificidad: cómo los electrodos
se hacen selectivos
Formas de lograr especificidad (¿cómo mide
lo que se necesita?)
En los electrodos simples, la especificidad para un ion
particular es determinada por una membrana selectiva que
V
Electrodo
medidor (pH)
Platino
Ácido
clorhídrico
Membrana
de vidrio
Solución
desconocida
rodea al electrodo, la que actúa por intercambio iónico se-
lectivo, por ejemplo, el electrodo de pH tiene una mem-
brana de cristal, que actúa como intercambiador de ion
hidrógeno. El cristal es un enrejado cristalino de silicona
complejo, que contiene los iones cargados (sodio para el
cristal de sosa). En la superficie hay una capa hidratada
muy delgada donde estos iones pueden intercambiarse por
los iones en el líquido en contacto (fig. 40-5). El intercam-
bio iónico entre la membrana y el líquido sólo ocurre con
la condición de que el tamaño físico del ion y su carga elec-
trostática sean compatibles con la estructura del enrejado
cristalino, pero cuando las membranas llegan a ser más
complejas otros factores tienen una parte más importante.
Con el cristal estándar de silicato de sodio, se favorece el
intercambio del ion hidrógeno, pero un “error alcalino” ocu-
rre debido a interferencia de los iones de sodio en pH alcalino.
En las condiciones de pH alcalino, cuando la concentración
del ion hidrógeno llega a ser muy baja, la contribución relati-
va a la respuesta del electrodo a partir de los iones sodio llega
a ser más significativa hasta que excede la respuesta del ion
hidrógeno. Esto se conoce como el “error álcali”. Al variar
la composición del cristal se pueden exagerar estos efectos,
de modo que el cristal se convierta en un electrodo diferente.
Las variaciones comunes en la estructura del cristal se mues-
tran en la figura 40-6.
En la práctica, ningún electrodo es absolutamente es-
pecífico para un solo ion, y la preferencia que demuestra
por un ion en particular se llama “selectividad”. En este
ejemplo, en el pH neutral/ácido el electrodo de cristal es un
electrodo de ion hidrógeno con una alta selectividad para
los iones hidrógeno sobre los de sodio, pero en un pH al-
calino tiene características inversas. El primer objetivo del
 ESPECIFICIDAD: CÓMO LOS ELECTRODOS SE HACEN SELECTIVOS 385

Figura 40-5 Un electrodo de pH opera sobre

el principio del intercambio del ion hidrógeno en
ambos lados de la membrana. No hay transferen-
cia de iones hidrógeno a través de la membrana
—se establece un equilibrio— aunque en teoría
debe existir conducción electrónica para que el
electrodo forme parte de un circuito de medición.
La membrana tiene en la práctica una resistencia
de 109 ohmios y una corriente insignificante.

Alterando la composición del cristal, se producen elec-

a) Sílice puro Si(iv) O Si(iv) trodos para que respondan al sodio y al potasio. El mejor
electrodo de sodio tiene una selectividad para sodio sobre
potasio de 100:1, y esto es clínicamente útil para los fluidos
b) Sílice
biológicos con concentraciones de sodio altas y de pota-
+ metal Si(iv) O Selectivo sio bajas. Sin embargo, el electrodo de cristal de potasio
álcali para H+
tiene una mejor selectividad para el potasio sobre el so-
dio de 20:1, que no es ideal para uso en sangre, donde la
concentración normal de sodio es alrededor de 30 veces
c) Sílice
+ alúmina R(III) O Si(iv) Selectivo pa la concentración de potasio. Para estos usos, se necesitan
otros catione
membranas más selectivas.

d) Sílice Zr (iv) O Si(iv) Selectivo pa Membranas selectivas a los iones

+ tierra rara iones divalen

La paradoja al desarrollar membranas selectivas a los iones

Figura 40-6 Diferentes tipos de vidrio que se usan para los elec-
trodos.
diseño de la membrana es maximizar la selectividad para
evitar interferencia de otros iones similares. En el caso de
haluros, por ejemplo en el cloruro, esto puede alcanzarse
fácilmente si se usa una membrana cristalina de cloruro
de plata, en la cual sólo un ion cloruro puede alojarse con
facilidad en el enrejado cristalino. Problemas más difíci-
les se presentan al intentar medir el calcio en presencia de
magnesio y viceversa (ambos están presentes en concen-
traciones sanguíneas similares), ya que los dos tienen un
tamaño similar. Aún más difícil es el diseño de un electro-
do para detectar el litio sanguíneo en una concentración de
1 mmol/L contra un fondo de 140 mmol/L del sodio.
ocurre porque la membrana debe ser impermeable al agua,
de modo que haya una conducción eléctrica insignificante,
lo cual evita el corto circuito en el electrodo, pero los iones
por su naturaleza tienen una preferencia por las solucio-
nes en agua. La membrana necesita tener un componente
por el cual el ion tenga una preferencia equivalente, o por
atracción electrostática, como en el caso del intercambio
iónico, o por sustitución de la capa de hidratación (apor-
tada por el solvente agua), como en el caso de portadores
neutros. Las células vivas utilizan con frecuencia tales
portadores para transportar iones y nutrientes flotantes a
través de las membranas celulares, que por lo general son
barreras hidrofóbicas, y esto ha generado los modelos para
el diseño de las membranas ISE.
Para tener una membrana funcional que utilice un inter-
cambiador iónico o un portador neutro, ésta necesita un
apoyo inerte, que debe ser capaz de contener y retener al
386 CAP. 40 ELECTRODOS ION-SELECTIVOS

Ionóforo En un electrodo ideal, el portador es en su totalidad in-

soluble en agua, pero en la práctica es lixiviado a distancia
Alquil O O
de manera gradual, conduciendo a una pérdida gradual de
O O Alquil
la respuesta del electrodo, porque las membranas del elec-
trodo tienen que cambiarse con regularidad.
P Los portadores neutros son una alternativa al intercam-
P
bio iónico, y el más utilizado es la valinomicina para los
Alquil O O Ca O O Alquil electrodos de potasio. Los compuestos éteres corona son es-
Alquil fosfato
tructuras anilladas que contienen varios átomos de oxígeno
que pueden imitar la capa de hidratación de un átomo, como
Mediador se muestra en la figura 40-8. La valinomicina (fig. 40-9) es
C8 H17 O O un compuesto similar a un anillo grande complejo que con-
tiene seis átomos de oxígeno dentro de su estructura; puede
P también acomplejar al potasio, es decir, el ion intercambia
su capa de hidratación acuosa por la valinomicina y emigra
de una solución acuosa a una membrana hidrofóbica.
C8 H17 C6 H5 Una de las ventajas de los portadores neutros es que
di-n-octilfenil fosfonato tienden a ser menos solubles en agua que los intercambia-
dores iónicos, que deben tener necesariamente solubilidad
Figura 40-7 Portador de calcio. leve. Producen membranas, las cuales tienen una vida más
larga. Se han desarrollado portadores neutros para varios
portador iónico; esto normalmente significa atrapar el sol- iones, incluso de sodio, cloruro, calcio, magnesio, litio,
vente en el cual el portador se disuelve. amoniaco (fig. 40-10) y carbonato (fig. 40-11).
En el caso de los sensores de calcio se ha encontrado La explicación precedente está relacionada con los elec-
que los materiales de intercambio iónico se unen al calcio trodos potenciométricos, los cuales se utilizan en la ilustra-
con una alta selectividad (fig. 40-7). El electrodo consiste ción porque incluyen todos los problemas relacionados con
de una sal de calcio de un alquil fosfato disuelto en di-n- la electroquímica.
octofenil fosfonato, un solvente que no es volátil e in-
soluble en agua. Esto se mezcla con PVC disuelto en un
solvente volátil, y se vierte sobre una superficie plana, lo Reacciones electroquímicas
que permite al solvente volátil evaporarse. Esto deja una
capa fina de PVC en el intercambiador de calcio atrapado La descripción de potencial del electrodo mencionada an-
dentro de él. tes es una simplificación de la situación real para ayudar

Capa Ion potasio Capa

de hidratación
de hidratación
interna
externa
H H
O H O O H
H H H H
O O
O
H O H
O
H H
+ O K+ O
K H H H
O H
O O
O O H H
H H
O H O O
H
H H

Figura 40-8 a) Un ejemplo de un compuesto éter corona (diciclohexil-18-corona-6) que actúa como capa sustituta de hidratación para
un ion como el de potasio, y es capaz de transportarlo a través de una membrana hidrofóbica. b) Un ion potasio en la solución rodeado por
una capa de hidratación interna, una de hidratación externa y una de hidratación externa de moléculas de agua.
 REACCIONES ELECTROQUÍMICAS 387

)2 (C
H3 H3 H
(C H C 3)

CH
C 0 2
0
H
0 N 0
)2

)2
CH
3
3

N
(CH

0 (
CH
H
C

0
0
0
0

NH
(CH3)2 HC CH (CH3)2
N
H

0
0
0

C
3
0

H
C
H3

0
N
0 H
N 0
H
(C CH
H
3)
0 CH 0 CH )2
2 (CH3)2 H3
(C Figura 40-9 Estructura de la valinomicina.

Figura 40-10 Un grupo de compuestos ETH usados como ionóforos sobre ISE.
388 CAP. 40 ELECTRODOS ION-SELECTIVOS
OH
R C CF3 R C
..
OH
..
H H
p-Decil-,,-trifluoroacetofenona
−O
OH
R C CF3 C=O
−O
OH
2
− de medir el voltaje producido por una separación de carga.
H acción es:
R C CF3 C=O
H
Figura 40-11 Ionóforos usados en un electrodo de carbonato.
a ilustrar cómo funciona el electrodo. Lo que en realidad
sucede en la superficie del electrodo es una reacción elec-
troquímica que produce una especie cargada antes de la
separación de la carga, por ejemplo:
Zn Zn  2e
En un material que conduce como un electrodo de me-
tal, la estructura del electrón es similar a un “mar” en el
cual los electrones están libres para moverse a través del
sólido. Las energías de los electrones se llenan a un ni-
vel, llamado de Fermi. En la solución existe una situación
diferente. Los iones están rodeados por una capa de hi-
dratación (fig. 40-8), que los separa con eficacia de otros
iones, y los electrones se restringen a diferentes bandas de
energía (más bajas). Al instante el electrodo entra en con-
tacto con la solución, la diferencia en niveles de energía
favorece un flujo de electrones para igualar la energía y
un equilibrio se alcanza rápidamente al estado de energía
libre más bajo (conocido como el nivel de energía libre de
Gibbs). Ésta es la base del potencial del electrodo.
Esta reacción electroquímica ocurre de manera espon-
tánea debido a la propiedad del material del electrodo, que
es capaz de perder un electrón y formar un ion, así que el
uso principal de estos electrodos (potenciométricos) es la
medición iónica. El concepto de reacciones electroquími-
cas puede ampliarse para incluir otras reacciones químicas,
que no ocurren de repente pero se originan por un potencial
CF3 aplicado. Esto abre la posibilidad del análisis de sustan-
cias que no existen necesariamente como iones en solución
sino que dan lugar a una reacción electroquímica en cir-
cunstancias convenientes.
Electrodos amperométricos
Hay otra clase de electrodos, llamados amperométricos
porque producen una corriente en lugar de un voltaje. Este
tipo de electrodo se diseña para medir una reacción elec-
troquímica —una reacción química que produce o consu-
me electrones— midiendo una corriente eléctrica en vez
El más común de éstos, en uso clínico, es el electrodo de
oxígeno (pO2). En el caso del electrodo de oxígeno la re-
0.7 V
O2  2H2O  2e H2O2  2OH
Para el electrodo de peróxido relacionado, la reacción es:
0.7 V
H2O2 2H  O2  2e
La primera reacción se utiliza en el electrodo estándar de
oxígeno (pO2) (electrodo de Clarke), mientras el segundo
se emplea en algunos electrodos de glucosa, como se des-
cribe más adelante, para medir el peróxido producido por
la enzima glucosa oxidasa.
Puede observarse a partir de estas reacciones electro-
químicas que las reacciones son facilitadas por un voltaje
aplicado (0.7 V) y éste puede adicionarse a la especificidad
de la respuesta del electrodo. La característica principal de
estos electrodos es que un voltaje constante se aplica a los
electrodos medidores, y la corriente resultante (en micro-
amperios) es proporcional a la cinética de la reacción. Esta
es una relación lineal directa, en contraste con la respuesta
logarítmica inversa compleja de los electrodos potenciomé-
tricos. Ya que se está midiendo la corriente, estos electrodos
(p. ej., un electrodo pO2) no necesitan uno de referencia.
Sin embargo, la reacción y la corriente también se rela-
cionan con el área superficial del electrodo.
Polarografía
Es una aplicación de la electroquímica. El voltaje aplicado
es polarizante, y la celda electroquímica una celda polaro-
gráfica.
Para conseguir una medición del analito involucrado o,
por ejemplo, del pO2 (la presión parcial del oxígeno no es
en sentido estricto “concentración”, pero es equivalente en
 ELECTRODOS DE GLUCOSA 389

términos gaseosos), la cinética de reacción debe ser cons-

tante y, por tanto, el pO2 también. Un requerimiento clave
de este tipo de sistema es que el electrodo no debe consu-
mir el oxígeno en su superficie a una tasa más rápida de
lo que el oxígeno puede difundirse a través de la solución
del electrodo hacia la superficie de éste, de otra forma la
corriente declina cuando el pO2 en contacto con ésta falla.
Para mantener un estado constante que permita la medi-
ción, las celdas que se miden deben diseñarse de modo que
el electrodo en el cual la reacción ocurre sea muy pequeño
(p. ej., la punta de una aguja), para consumir una cantidad
mínima del analito en la medición. Esto significa que un
sistema típico producirá sólo una corriente de proporciones
en microamperios, que requiere un amperímetro diseñado
específicamente para tal medición.

Electrodo de oxígeno Figura 40-12 Un electrodo de oxígeno de Clarke. Éste consiste

Para tener un electrodo funcional, los electrodos en los
cuales la reacción electroquímica tiene lugar deben estar
en contacto con una solución constante —con una resisten-
cia constante— de modo que no ocurra ninguna variación
en la resistencia, lo cual afecta el voltaje aplicado y en-
tonces la corriente producida. El electrodo de oxígeno de
Clarke consiste de electrodos en contacto con una solución
electrolítica, la cual está contenida por una membrana de
caucho de silicona. El oxígeno gaseoso puede pasar libre-
mente a través de la membrana, pero ésta es hidrófoba y
no permite que el agua o electrólitos disueltos pasen de
un lado a otro y cambien la composición y resistencia de la
solución electrolítica. Esto se muestra en la figura 40-12.
Electrodos de glucosa
en un cátodo de platino de área muy pequeña rodeado por un áno-
do anular de plata. Ambos están en contacto con un amortiguador
interno incluido dentro de una membrana hidrofóbica de caucho
de silicona. El oxígeno puede difundirse libremente a través de
la membrana y disolverse en el amortiguador interno. Se mide la
reacción electroquímica resultante en el cátodo de platino.
Debido a estos problemas, se han desarrollado mejores
aplicaciones:
• El electrodo glucosa oxidasa/peróxido. Éste se utiliza
para detectar el peróxido producido por la reacción, con
un potencial aplicado de +0.7 V.
• El electrodo glucosa oxidasa/ferroceno. Este electrodo
utiliza ferroceno como agente de transferencia electró-
nica en la reacción electroquímica siguiente:

Los electrodos de glucosa emplean una combinación de Glucosa gluconolactona 80 mv e−

glucosa oxidasa
una enzima y de un voltaje de polarización específicos para   
ferricinio ferroceno (Fe2) ferricinio (Fe3)
generar una respuesta específica para la glucosa. En la ac-
tualidad existen dos diferentes enzimas y tres reacciones de
transferencia electrónica distintas en uso común. Ésta es la base del ensayo de la cinta de glucosa de Medi-
La forma más simple de formar un electrodo de glucosa sense®, y se ilustra en la figura 40-13.
es utilizar la enzima glucosa oxidasa junto con un electro- • El electrodo de glucosa deshidrogenasa/ferricianuro.
do de oxígeno. La glucosa oxidasa cataliza la reacción: Este electrodo funciona de una manera similar, pero con
una enzima diferente y un agente de transferencia elec-
glucosa  O2  2H2O ácido glucónico  H2O2
trónica:
El electrodo de oxígeno puede medir la caída dentro del
Glucosa glucosa deshidrogenasa ácido glucurónico 80 mv e−
pO2 como una medición de la glucosa consumida en la + + +
reacción. Desafortunadamente, si la celda está abierta a Fe(CN) 36− Fe(CN)46− Fe(CN)36−
la atmósfera, se llena de oxígeno atmosférico, y también
hay problemas si se utiliza sangre entera, por los efectos Esta es la base del ensayo de la cinta de glucosa de Boehrin-
que se crean por la unión del oxígeno con la hemoglobina. ger Mannheim Corporation (BMC) Advantage®.
390 CAP. 40 ELECTRODOS ION-SELECTIVOS

Figura 40-13 Ejemplo de un electrodo de glucosa en estado líquido, sistema Medisense®. Este sistema tiene tres contactos: un elec-
trodo común central, uno en contacto con el ferroceno solamente (para las reacciones no específicas) y otro en contacto con la glucosa
oxidasa más ferroceno. La diferencia en las dos señales proporciona una medición de la concentración de glucosa.

Interferencia del fármaco HO O

Los tres tipos de electrodo de glucosa descritos antes son
de uso común y, en general, aparatos de medición eficaces,
pero varias sustancias, incluyendo medicamentos comunes
como el paracetamol, pueden interferir y dar una señal con
estos sistemas. Esto ocurre porque casi todos los compues-
tos pueden producir una reacción electroquímica, dando un
voltaje polarizante bastante elevado, y esta reacción invo-
lucra la mayor parte de los fármacos. Con base en esto los
fármacos terapéuticos y muchos otros compuestos bioló-
gicos pueden medirse con cromatografía usando una celda
polarográfica como detector electroquímico.
Detectores electroquímicos
Estos detectores son el resultado de un desarrollo del elec-
trodo polarográfico, para empleo como detectores en cro-
matografía líquida de alta resolución (HPLC). Una aplica-
ción típica de estos detectores en el laboratorio mide las
catecolaminas (adrenalina, noradrenalina) para la detec-
ción del feocromocitoma. La reacción electroquímica se
muestra en la figura 40-14.
Los electrodos descritos funcionan en condiciones es-
tables, por ejemplo, están en contacto con una solución
constante. En un sistema cromatográfico, la selectividad se
obtiene con la separación cromatográfica (es decir, física)
R
R
+ 0.5 V
+ 2H+ + 2e
O
HO
Adrenalina
Figura 40-14 Reacción electroquímica por catecolaminas.
de compuestos similares, por ejemplo, adrenalina y nor-
adrenalina (en comparación con el uso de una membrana
selectiva), pero los sistemas solventes que se emplean para
la separación son variables, así que la resistencia de la so-
lución en la celda de medición es variable, y eso afecta el
voltaje aplicado. Para superar este problema, se utiliza un
tercer electrodo en la celda de medición HPLC, que tiene
la función de supervisar el voltaje aplicado y mantenerlo
en un valor constante a través de un circuito de retroali-
mentación.
Electrodos complejos
Éstos consisten de un electrodo dentro de otro, el ejemplo
más común es el electrodo pCO2 (dióxido de carbono) en-
contrado en todos los analizadores de gases sanguíneos.
 OTROS ELECTRODOS COMPLEJOS MEDIADOS POR LAS ENZIMAS 391

Electrodo pCO2 Otros electrodos complejos mediados

Este electrodo consiste de un electrodo de pH estándar en
contacto con un amortiguador débil de bicarbonato y enca-
jonado en una membrana de cloruro de polivinilo (PVC);
se muestra en la figura 40-15.
por las enzimas
Electrodo de lactato
Éste es de uso general en unidades de cuidado crítico, y por
atletas para comprobar el estado anaeróbico después del
ejercicio. Funciona de la misma forma que uno de glucosa
(por lo común es un electrodo de glucosa modificado) em-
pleando un enzima lactato oxidasa diferente:

Lactato + O2 + H2O piruvato + H2O2

El peróxido formado es medido con un electrodo de per-

óxido.

Electrodo de urea (Roche Diagnostics)

Éste es más complejo y utiliza la enzima ureasa; descom-

pone la urea para formar dióxido de carbono y amoniaco;
el último se convierte en iones amonio, que entonces se
detectan con un electrodo de amonio:

CO2  H2O H  HCO3

Ureasa
Urea  H2O 
Figura 40-15 Un electrodo pCO2 que consiste en uno de pH y
2NH3  H2O NH
4  OH


uno de referencia plata/cloruro de plata interno. El CO2 se difunde

a través del PVC y cambia el pH del amortiguador interno.
La membrana de PVC es permeable a los gases, por
ejemplo, dióxido de carbono, pero impermeable al agua. El
dióxido de carbono se difunde a través de la membrana y
se disuelve en el amortiguador cambiando el equilibrio del
amortiguador de bicarbonato.
Al contrario del electrodo de amoniaco, el de amonio
tiene escasa selectividad, pero se utiliza porque la enzima
ureasa puede trabajar sólo a un pH bajo, en el cual el amo-
niaco se convierte en iones amonio. El electrodo de amonio
sufre la interferencia del potasio, así que se emplea en serie
con uno de potasio compensador. Esto se muestra en la fi-
gura 40-16.

CO2  H2O H2CO3 HCO3  H

Al efectuarse lo anterior el pH del amortiguador cambia, y

se mide con el electrodo de pH. Señal
Los electrodos de amoniaco se hacen de la misma ma- amplificada
nera, con un electrodo de pH sumergido en un amortigua-
dor. Las diferencias consisten en que el amortiguador que
Muestra
se crea es diferente:

Electrodo
NH3  H2O NH
4  OH

de referencia
Urea NH4 K
Electrodos

y la membrana contiene el portador neutro nonactina (véase Figura 40-16 Diagrama esquemático de los principios analíti-
fig. 40-10f) para ayudar en la transferencia del amoniaco. cos de un sensor potenciométrico para la medición de la urea.
392 CAP. 40 ELECTRODOS ION-SELECTIVOS

Electrodo de creatinina (Nova Biomedical, UK)

Éste usa una serie compleja de enzimas:

creatinina amidohidrolasa
Creatinina + H2O creatina
creatinina amidohidrolasa
Creatina + H2O sarcosina
+ urea
sarcosina oxidasa
sarcosina + O2 + H2O formaldehído
+ glicina + H2O2

El peróxido se mide con un electrodo de peróxido.

Comprobación en los puntos de cuidado

(POCT)

Los electrodos selectivos a los iones (ISE) son muy utili-

zados en instrumentos POCT, sobre todo porque emplean
sangre completa, en lugar de suero, y pueden producir un
resultado en menos de un minuto. Figura 40-17 Un glucómetro Roche Advantage®.

Analizadores de cuidado crítico

Glucómetros
Éstos son empleados por enfermeras y médicos y por mu-
chos pacientes. Son baratos (~ 20 dólares) y fáciles de uti-
lizar. Los principios de los componentes del ISE de tales
sensores son descritos en la página 389. La figura 40-17
muestra un glucómetro típico (Roche Instruments plc) y la
cinta de medición. La última está disponible.
Éstos son instrumentos más complejos, usados en casi to-
das las unidades de cuidados criticos, por ejemplo, salas de
traumatismos y urgencias, unidades de cuidado intensivo/
terapia, de cuidado especial del bebé, de cuidado corona-
rio, y áreas de recepción. Contienen una serie de electro-
dos y de otros sensores, normalmente en grupos, como se
muestra en la figura 40-18.

Amplificador Indicador

Electrodo
Electrólito de referencia
de referencia (KCl) Na, pH, K , Ca,
Li , Mg , CI-

Electrodo de Calomel
Electrodos
Unión líquida

Muestra

Figura 40-18 Una serie de electrodos como se Capilar

selectivo de cristal Membrana Tierra (GND) de
utiliza en un analizador típico para el cuidado de sodio/H ion selectiva la cámara
crítico. de medición
 RESPALDO
• Gases sanguíneos: pH, pO2, pa CO2. Este grupo mide el
estado ácido-base de la sangre como un índice de fun-
ción renal y respiratoria.
• Iones: sodio, potasio, cloruro, calcio y magnesio. Este
grupo se usa en las unidades de cuidado crítico para la
valoración de condiciones como volumen del fluido cor-
poral y la función renal y cardiaca.
• Metabolitos: glucosa, urea, creatinina, lactato. Este gru-
po se usa para la valoración de condiciones como fun-
ción renal y hepática.
• Co-oximetría: hemoglobina, oxihemoglobina, carboxi-
hemoglobina. Estos componentes se miden usando es-
pectrofotometría en lugar de los ISE. Se combina con
otras pruebas porque proporcionan información adicio-
nal, en particular sobre la respiración.
Respaldo
Conexión de la red
Los instrumentos en el lugar de cuidado producen resul-
tados que afectan de manera directa el tratamiento del pa-
ciente. Los primeros instrumentos eran independientes, y
todo el mantenimiento de registros, manual e inconsistente.
Esto se identificó como un problema de control de riesgo
mayor, y condujo a una nueva generación de instrumentos,
que pueden conectarse vía una red a un controlador central
de los datos. Esto tiene varias ventajas:
• Los datos se recolectan y almacenan centralmente. Esto
incluye los resultados de la prueba, la identificación del
paciente y del operador, y la fecha/hora, es decir un ras-
treo completo de auditoría.
• La identificación del operador puede controlarse de
modo que sólo los entrenados utilicen los instrumentos.
• El funcionamiento del instrumento puede supervisarse
centralmente.
Es importante que los instrumentos de cuidado crítico sean
siempre operacionales. El control de la red permite aportar
a los laboratorios apoyos las 24 h para estos analizadores.
Uno de los primeros problemas con el control de la red
fue que las compañías estaban utilizando diferentes siste-
mas de comunicación, los cuales eran incompatibles. Este
problema fue resuelto cuando las compañías de diagnósti-
co formaron CIC (Communications Industry Consortium)
para resolver el problema. El CIC produjo un grupo de es-
tándares de comunicaciones, que adoptó el National Com-
393
mittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) como
estándar NCCLS-POCT-IA.
Política
Una de las principales aplicaciones de ISE es la comproba-
ción en los puntos de cuidado (POCT), donde las pruebas se-
rán hechas por enfermeras y médicos sin el entrenamiento de
laboratorio formal. Como existen numerosos problemas que
pueden ocurrir con las mediciones ISE, debe haber respaldos
incorporados en todo el proceso (no sólo en el sistema de me-
dición) para que esta aplicación sea aceptable, y deben elabo-
rarse por completo dentro de una política del hospital sobre
POCT. Sin este respaldo, se coloca en riesgo a los pacientes y
la institución tiene un problema de control de riesgos.
La entrada de datos principal del laboratorio es la produc-
ción de la especificación que el instrumento debe satisfacer
(es decir, el desempeño del instrumento). La especificación
debe tratar problemas como selectividad de los electrodos.
Por fortuna, la tecnología moderna permite elaborar res-
guardos convenientes, como se perfila más adelante.
Verificación del instrumento
Los instrumentos modernos son operados por computado-
ras, que verifican el desempeño del electrodo sobre fun-
ciones como señal del electrodo (p. ej., pendiente: mV/
decada) y el tiempo de reacción, y otras verificaciones
como temperatura, burbujas de aire, fugas de la membrana,
etc. Para un laboratorio apoyado en instrumentos, donde el
personal debe entender las características del electrodo, es
aceptable tener un alto nivel de facilidad en su manejo para
producir mediciones en una situación de urgencia. Para las
aplicaciones de POCT, si una respuesta del electrodo cae
fuera de los límites especificados, la prueba debe desacti-
varse hasta que el problema esté resuelto.
Existen otras funciones útiles, que están permitidas con
un instrumento controlado por computadora:
• Identificación del operador. El entrenamiento es una
característica importante de POCT, y una función ope-
ratoria sólo debe ejecutarse por el personal entrenado y
autorizado para operar el instrumento.
• Interrupción remota. Esta es una instalación en la que
el instrumento está conectado con la computadora del
laboratorio, que monitorea el requerimiento del control
de calidad del instrumento, y lo bloquea si el CC no
cumple los límites predefinidos. La computadora del
laboratorio entonces alerta al personal del laboratorio
sobre el problema.
394 CAP. 40 ELECTRODOS ION-SELECTIVOS
• Control de calidad (CC) y aseguramiento de la calidad
(AC). El control de calidad es la verificación, en tiempo
real, del instrumento. Esto implica analizar el material
de composición conocido y verificar que los resultados
que se obtienen estén dentro de los límites clínicos sig-
nificativos, según lo definan los organismos profesiona-
les (como los organismos nacionales del aseguramiento
de la calidad). El control de calidad lo deben realizar
regularmente los operadores (p. ej., enfermeras y mé-
dicos) que efectúan las pruebas, y una parte esencial de
su entrenamiento se centra en la importancia de realizar
el control de calidad, registrando los resultados, y qué
acción tomar si la verificación de control de calidad fa-
lla. Este entrenamiento deben enseñarlo profesionales
laboratoristas experimentados.
Para asegurar la calidad se realiza un examen retrospec-
tivo del desempeño del instrumento, el cual se hace con
frecuencia como parte de un esquema externo del AC. La
agencia británica de acreditación del laboratorio, CPA(UK)
Ltd, requiere que los laboratorios participen en un esquema
reconocido de CC y mantengan un funcionamiento ade-
cuado. Si los instrumentos de POCT están bajo el control
del laboratorio principal, la acreditación del laboratorio se
aplica al servicio de POCT, a condición de que se opere
en un estándar aceptable. Este acercamiento se recomienda
como la mejor manera de aportar calidad al cuidado del
paciente con un riesgo mínimo.
• Mantenimiento. Las verificaciones de mantenimien-
to están normalmente planeadas como mantenimiento
preventivo, por ejemplo, el reemplazo de la tubería, se-
llo, electrodos, etc. Estas pruebas las realizan mejor los
profesionales laboratoristas experimentados, pero si las
hace personal no laboratorista, el entrenamiento riguro-
so sobre la importancia de las verificaciones es vital.
• Entrenamiento. El entrenamiento de todos los usuarios
es una característica esencial de una política POCT del
hospital. Para los instrumentos modernos, el entrena-
miento no requiere ser de gran profundidad o consumi-
dor de tiempo, con la condición de que los resguardos
adecuados se hayan realizado sobre el instrumento. El
entrenamiento debe incluir no sólo la operación del ins-
trumento, sino una comprensión de todas las señales de
error, la importancia de los resultados, y la importancia
de registrar resultados y los procedimientos del CC.
Reconocimientos
Quiero agradecer a Roche Diagnostics por su ayuda con el
suministro de un número de diagramas, y en particular a
Christoph Ritter, de Nova Biomedical UK, por la informa-
ción sobre los electrodos, y a Andrew St John por permitir-
me el uso de varios diagramas. Muchas gracias también a
Janet Gourlay por toda la mecanografía y la preparación.
Lecturas adicionales
Hirst AD, Stevens JF. Electrodes in clinical chemistry. Ann Clin
Biochem 1985; 22: 460-488.
Crompton RG, Sanders GHW. Electrode Potentials. Oxford Uni-
versity Press, Oxford.
Ed Van Ysek P. Modern Techniques in Electroanalysis. 1996:
Wiley, Chichester.
Accreditation and point of care testing. Ann Clin Biochem David
Burnett 2000; 37: 241-243.
Price CP, Hick JM (eds.). Point of care testing. 1999: AACC
(www.aaccdirect.org).
Kost GJ (ed.). Principles and Practice of Point of Care Testing.
2002; Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelpphia, PA.
Management and use of IVD point of care test devices. MDA De-
vice Bull 2002; 3. (www.medical-devices.gov.UK).
Annexe D of ISO 15189—Medical Laboratories. Particular re-
quirements for quality and competence. ISO (International
Standards Organization), Geneva (Annexe D, wich relates to
quality management of point of care testing, is under discus-
sion at the time of going to press, but should be agreed by the
time of publication).
Structures of ionophores. Fluka catalogue. 2003: Sigma- Aldrich
Company Ltd (www.sigma–aldrich.com).
 41
Absorción de la luz, dispersión y técnicas
de luminiscencia en bioquímica clínica rutinaria
Bernard F Rocks
Introducción
Algunos de los constituyentes químicos de la sangre, plas-
ma u orina pueden medirse en forma directa. Los químicos
analíticos, sin embargo, han desarrollado medios indirec-
tos para detectar y medir de manera cuantitativa muchos
de los componentes de interés clínico. El método implica
con frecuencia añadir a la muestra diluida una sustancia (el
reactivo) que químicamente reaccione en forma específica
con el componente particular que se quiere cuantificar (el
analito), para formar un producto que pueda medirse con
relativa facilidad. Siempre que sea posible, las condiciones
del ensayo producen un producto cuya cantidad es propor-
cional a la concentración original del analito.
Cuando la luz incide en la materia de cualquier tipo,
la interacción puede cambiar la intensidad, dirección, lon-
gitud de onda o la fase de la luz incidente. La absorción,
dispersión y luminiscencia de la luz son tres de los muchos
efectos ópticos que se han explotado con más frecuencia
con propósitos analíticos. La mayor parte de las medicio-
nes cuantitativas hechas en laboratorios de bioquímica
clínica se fundamentan en la elaboración de productos de
reacción teñidos, así que es muy frecuente que se utilicen
dispositivos fotoeléctricos de absorbancia como coloríme-
tros o espectrofotómetros. Otros métodos de amplio uso
basados en la medición de la luz incluyen la turbidimetría,
nefelometría, fluorimetría y la medición de la quimiolumi-
niscencia. Las características esenciales de estas técnicas
se discuten en este capítulo.
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
Técnicas de absorción de la luz
La fotometría de absorción es la base de la mayor parte
de los análisis cuantitativos realizados en laboratorios de
bioquímica clínica. Las razones primarias para emplear
esta técnica son la facilidad de la medición, la exactitud y
la precisión satisfactorias, y la instrumentación, la cual es
estable, confiable y relativamente económica.
Fotómetros y espectrofotómetros
Los absorciómetros pueden dividirse en dos tipos básicos:
instrumento de haz sencillo y de haz doble. En cada tipo,
aunque las trayectorias de la luz son diferentes, muchos de
los componentes básicos son similares. Un fotómetro sim-
ple de una viga se ilustra en la figura 41-1. Los bioquímicos
clínicos se refieren con frecuencia a este tipo de fotómetro
como colorímetro.
La fuente de luz provee energía radiante sobre las longi-
tudes de onda de interés. Para trabajar en el rango visible,
ahora es común utilizar las lámparas de tungsteno-cuarzo-
halógeno. Estas lámparas también se utilizan para las medi-
ciones cercanas del infrarrojo y ultravioleta (340 a 800 nm).
Para el trabajo en longitudes de onda UV más cortas, es
común que se utilice una lámpara de descarga de deuterio.
Por abajo de 360 nm estas fuentes aportan una continuidad
intensa que, junto con las cubetas de sílice fundido, satisfa-
ce casi todas las necesidades en la región UV. El suministro
de energía a la lámpara debe ser de alta estabilidad.
396 CAP. 41 ABSORCIÓN DE LA LUZ, DISPERSIÓN Y TÉCNICAS DE LUMINISCENCIA EN BIOQUÍMICA CLÍNICA RUTINARIA
Figura 41-1 Componentes básicos de un fotómetro.
La longitud de onda apropiada para el ensayo particular se
selecciona con filtros de interferencia de amplitud de banda
estrecha y de alta transmitancia. Los filtros de interferencia
son costosos y algunos colorímetros económicos utilizan fil-
tros de cristal coloreado o gelatina teñida (intercalada entre
las capas del cristal). Los espectrofotómetros generan luz
monocromática por medio de un prisma o de un monocro-
mador de rejilla, más bien que por medio de filtros.
La cubeta es un recipiente transparente que contiene la
solución que se prevé medir. El diseño de la cubeta y los me-
dios de administrar la muestra y posteriormente eliminarla
varían con el tipo de instrumento y de analizador. La solución
de la muestra, que contiene la cubeta, absorbe una cantidad
proporcional de la radiación incidente; el resto se transmite a
un detector de luz, donde se genera una señal eléctrica.
Muchos tipos de fotodetectores diferentes se emplean en
la actualidad. Ahora, con frecuencia se utilizan varios foto-
diodos en estado sólido y series de diodos en instrumentos
de luz visible y cerca del infrarrojo. Estos detectores son re-
sistentes, baratos y tienen una respuesta lineal sobre varias
decenas de intensidad de luz. Sin embargo, dan una res-
puesta inferior a la luz UV. Donde se requiere sensibilidad
alta, y para trabajar con UV, se utilizan tubos fotomulti-
plicadores de vacío. La salida del detector puede necesitar
amplificarse y que se exprese como su logaritmo para que
sea relacionada linealmente con la concentración. Ambas
operaciones se realizan por medio de un amplificador lo-
garítmico. La señal, después de algunas transformaciones
necesarias (a menudo de analógicas a digitales), puede ex-
hibirse en el aparato, imprimirse o almacenarse.
Instrumentos de haz sencillo
En los instrumentos de haz sencillo un blanco (p. ej., una
cubeta que contiene agua) se utiliza para fijar a cero, enton-
ces los estándares y las muestras son leídas. Interferencias
por variaciones en la turbiedad de la muestra y los cambios
de intensidad de la fuente y otras fluctuaciones del instru-
mento no se compensan de manera automática. En algunos
diseños modernos, un segundo detector se emplea para mo-
nitorear la intensidad de la fuente de luz y compensar elec-
trónicamente la desviación de la lámpara. Los instrumentos
de haz sencillo están bien adaptados para las mediciones
cuantitativas de absorción en una sola longitud de onda. El
fácil mantenimiento y bajo costo son ventajas distintivas de
este tipo de fotómetro, que se encuentra en la mayor parte
de los analizadores automáticos de la química clínica.
Espectrofotómetros de haz doble
Un instrumento de haz doble tiene dos trayectorias de luz,
ambas se originan a partir de la misma fuente. Un haz pasa
a través de la cubeta de la muestra y el otro por la cubeta
del blanco o de referencia. Esto normalmente se consigue
dirigiendo el haz de luz desde el monocromador hacia un
espejo que rota muy rápido o hacia un interruptor que diri-
ge la luz de manera alterna hacia la cubeta de referencia y a
la cubeta de la muestra. La luz que emerge de cada cubeta
se refleja hacia el detector. La salida del detector es, por
tanto, una señal que se alterna con una amplitud proporcio-
nal al cociente de las intensidades del haz de la muestra y
del haz de referencia. Las señales eléctricas que se produ-
cen se procesan electrónicamente para dar la absorbancia
en un dispositivo de lectura. Sistemas de haz doble auto-
máticos corrigen los cambios en la intensidad de la luz a
partir de la fuente lumínica, fluctuaciones electrónicas en
el instrumento y absorción por el blanco. Un instrumento
de esta clase se consigue con frecuencia con un monocro-
mador impulsado por motor, de modo que la exploración
y la grabación automáticas de un espectro completo sean
posibles. Esto permite su uso para el análisis cualitativo (p.
ej., identificación del fármaco) y el cuantitativo.
Ley de Beer
La base matemática para las mediciones cuantitativas se
basa en la derivación experimental de la relación Beer-
 TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA
Lambert. La ley de Lambert indica que la proporción de
energía radiante absorbida por una sustancia es indepen-
diente de la intensidad de la radiación incidente. La ley de
Beer indica que la absorción de energía radiante es pro-
porcional al número de moléculas en la trayectoria de la
luz. No es posible medir de forma directa la cantidad de
radiación absorbida por una sustancia y es normal que se
determine midiendo el cociente de radiación incidente que
cae sobre la muestra, I0, y la radiación transmitida, que al
final emerge de la muestra, I. Usando estas mediciones, la
ley de Beer-Lambert se puede expresar como:
Log10(I0/I ) ⫽ ecI
donde c es la concentración de la sustancia en moles/litro,
I es la longitud de la trayectoria óptica en centímetros y e
es el coeficiente de absorción molar para la sustancia, ex-
presado en litros/mol/centímetro. Los valores para I y I0 no
pueden medirse en términos absolutos y las mediciones se
hacen de una forma más conveniente expresando I como un
porcentaje de I0. Este valor se conoce como transmitancia
porcentual T, y da una relación lineal con la concentración
si el logaritmo de su recíproco se utiliza. Esta función loga-
rítmica recíproca de I y de I0, se conoce como absorbancia
(A):
%T ⫽ (I/I0) ⫻ 100
A ⫽ log10(100/T) ⫽ ⫺ log10 (I0/I)
La absorbancia es un parámetro más conveniente puesto
que, a partir de la ley de Beer, es directamente proporcional
a la concentración de las especies absorbentes.
Los espectrofotómetros son por lo común lineales sobre
el rango 0 a 2 Å, y los cromóforos pueden medirse en con-
centraciones tan bajas como 10-6 mol/L. Los valores de la
prueba se calculan comparando las lecturas de absorbancia
de las muestras de la prueba con las que se obtienen en-
sayando una serie de estándares o calibradores de valores
conocidos.
Aplicaciones
En la mayor parte de las determinaciones realizadas en
laboratorios de bioquímica clínica se confía en métodos fo-
tométricos. Un laboratorio típico de hospital provee informa-
ción de casi 5 000 análisis fotométricos/día y puede incluir
la medición de algunos de los analitos siguientes: albúmina,
bilirrubina, calcio, colesterol, creatinina, glucosa, hierro,
fosfato, proteína total, urea, ácido úrico y muchas enzimas,
por ejemplo, fosfatasa ácida, fosfatasa alcalina, alanina tran-
saminasa, creatina cinasa y lactato deshidrogenasa.
397
Turbidimetría y nefelometría
Estas técnicas relacionadas se emplean mucho en los la-
boratorios clínicos como los medios de conducir ciertos
inmunoensayos. Ambas se basan sobre la medición de la
dispersión de la luz inducida por partículas. Cuando la luz
se dirige a través de una solución que contiene partículas
suspendidas, parte de la luz se dispersa, otra se absorbe y
el resto se transmite a través del líquido. Esta interacción
puede utilizarse para medir la concentración de partículas
en la suspensión por la medición de la luz transmitida (tur-
bidimetría) o midiendo la luz dispersada (nefelometría).
La dispersión de la luz implica una interacción directa
entre la luz y la partícula que golpea. Cuando un haz de luz
golpea una partícula, su campo eléctrico mueve los electro-
nes de la partícula en una dirección próxima al núcleo. Los
electrones se mueven hacia adelante y en reversa en fase con
la frecuencia de la onda de la luz incidente. Esto produce
un dipolo oscilante, cuyo tamaño depende de la fuerza del
campo eléctrico (relacionado con la frecuencia) y de la po-
laridad de los electrones de la partícula. El dipolo oscilante
se convierte en una fuente de radiación electromagnética e
irradia luz, de la misma frecuencia que la luz incidente pero
en todas direcciones. La cantidad y distribución de la luz
dispersada también depende del tamaño y de la concentra-
ción de la partícula, y de la polarización del haz de luz.
Para las partículas más pequeñas que un décimo de la
longitud de onda de la luz incidente, las ondas de luz re-
irradiadas están en fase y se refuerzan una con otra, pro-
duciendo un simétrico, aunque no esférico, patrón de luz
dispersa. Esto se llama dispersión de Rayleigh. Partículas
más grandes (p. ej., complejos inmunoglobulina-antígeno)
actúan como fuentes del punto aleatoriamente espaciadas,
y la interferencia destructiva entre la luz que emerge de
diversos sitios dentro de la partícula ocurre, creando un
patrón máximo y mínimo de la luz reirradiada. Se conoce
como la dispersión de Rayleigh-Debye y, junto con la dis-
persión de Rayleigh, se ilustra en la figura 41-2. Entre más
luz se dispersa hacia adelante el tamaño de la partícula se
incrementa, y la medición de la dispersión de luz asimétri-
ca se puede utilizar para medir el tamaño de la partícula. La
luz de longitud de onda corta (azul) se esparce mucho más
que la luz de longitud de onda más grande (rojo).
Aplicaciones
Los inmunoensayos que implican sistemas de detección
nefelométricos o turbidimétricos, o ambos, se utilizan para
medir ciertos analitos para los cuales ningún reactivo colo-
rimétrico específico esté disponible, por ejemplo, proteína
C reactiva (CRP), componentes C3 y C4 del complemento,
398 CAP. 41 ABSORCIÓN DE LA LUZ, DISPERSIÓN Y TÉCNICAS DE LUMINISCENCIA EN BIOQUÍMICA CLÍNICA RUTINARIA
Figura 41-2 Patrones de la distribución angular bidimensio-
nales para: a) Dispersión de luz Rayleigh a partir de una partícula
pequeña. b) Dispersión de luz Rayleigh-Debye a partir de una
partícula más grande, inmunoglobulina-antígeno.
Figura 41-3 Componentes básicos de un turbidímetro, que mide la luz transmitida, y un nefelómetro que mide la dispersión de luz.
e inmunoglobulinas individuales. Se mezclan la solución
de la proteína y el anticuerpo apropiado y se dejan que re-
accionen para formar complejos grandes que dispersan más
luz que un anticuerpo o la proteína. La sensibilidad está por
lo común dentro del rango bajo mg/L. La dispersión grande
de luz que se produce cuando el cloruro de cetilpiridinio
se agrega a la orina que contiene mucopolisacáridos es un
ejemplo de un uso no inmunológico de la turbidimetría.
Turbidímetros
En teoría, la turbidimetría puede medirse por cualquier
fotómetro o espectrofotómetro estándar. Debido a que un
pequeño cambio en la luz transmitida se mide en presencia
de una señal grande del fondo, los instrumentos con un co-
ciente señal:ruido alto son deseables. Un turbidímetro es-
pecializado simple consiste en una fuente de luz halógena
de cuarzo, un filtro de interferencia de banda estrecha, una
pinza de sujeción para la cubeta de la muestra y un foto-
diodo o un fotomultiplicador (fig. 41-3) de la cubeta de la
muestra. El uso de la luz de longitud de onda corta ofrece
la ventaja del incremento de la dispersión y por tanto de
una señal más grande, pero en soluciones biológicas la ab-
sorción de luz también aumentará. Consecuentemente la
formación del complejo antígeno-anticuerpo por lo general
se mide en el rango 340 a 400 nm. Para una buena medición
es necesario una sincronización, la adición, el mezclado y
 LUMINISCENCIA
la lectura del reactivo. Cuando el tamaño de la partícula
aumenta de manera lenta con el tiempo, la tasa de dismi-
nución en la luz transmitida se calcula de mejor manera a
partir de mediciones multipuntuales. Los analizadores fo-
tométricos discrecionales automatizados son utilizados de
manera extensa por inmunoensayos turbidimétricos.
Nefelómetros
Los nefelómetros comprenden una fuente de luz, un filtro
de la luz incidente, un dispositivo de sujeción de la muestra
y un detector en ángulo fijo, para evitar la transmisión di-
recta de la luz. Con tal de que los filtros (o los monocroma-
dores) para las luces incidente y emitida se fijen a la misma
longitud de onda, pueden usarse fluorómetros en los cuales
la luz dispersa se mide a 90°, aunque con sensibilidad li-
mitada. La dispersión de luz medida a 90° es más débil
que la dispersión de luz hacia adelante. En teoría, la mejor
sensibilidad se obtiene colocando el ángulo del detector tan
cerca a 180° como sea posible. Esto requiere un haz de luz
incidente enfocado firmemente y una óptica excelente. En
la práctica, los nefelómetros clínicos emplean ángulos del
detector entre 90° y 170° al eje de la luz del incidente (véa-
se fig. 41-3). Las mediciones nefelométricas en ángulos,
excepto el de 90° para la luz incidente se mejoran a partir
de cubetas de perfil redondo que sustituyen a las de perfil
cuadrado. A estos ángulos del detector, las cubetas redon-
das reducen al mínimo la reflexión de la luz medida por las
paredes de la cubeta. Los nefelómetros con frecuencia se
ajustan con un filtro de corte para evitar que la luz fluores-
cente alcance el detector.
Un bulbo de halógeno-cuarzo-tungsteno, se utiliza con
frecuencia. Las fuentes alternativas incluyen lámparas de
xenón y de arco de mercurio, diodos que emiten luz y láse-
res. El láser de helio-neón es en especial útil para la nefelo-
metría porque tiene un haz estrecho de alta intensidad, que
no requiere enfocarse o una óptica para enfocar. Desafor-
tunadamente, la luz roja de longitud de onda larga (632.8
nm), no se dispersa tanto como la luz de longitud de onda
corta. El detector debe blindarse de forma correcta para re-
ducir al mínimo la interferencia a partir de la desviación
de la luz. Para la sensibilidad máxima, los nefelómetros
especializados emplean detectores fotomultiplicadores de
bajo ruido.
La longitud de onda para la dispersión óptima por com-
plejos anticuerpo-antígeno en su totalidad formados se
acerca a 460 nm. Sin embargo, en inmunoensayos cinéticos
se ha demostrado que la longitud de onda óptima cambia
mientras los complejos inmunitarios se elevan. Para estos
ensayos, muy utilizados, la luz monocromática es indesea-
ble y la luz incidente sobre una banda amplia (entre 450 y
550 nm) aporta tasas máximas más reproducibles.
399
El equipo Beckman Immage® es un ejemplo bien esta-
blecido de un nefelómetro del laboratorio clínico. La dilu-
ción automática de la muestra, la adición del antisuero y
la verificación del exceso de antígeno son algunas de las
características de este tipo de analizador especializado. La
diferenciación electrónica de la señal de luz se utiliza para
identificar y registrar la tasa máxima de reacción y, a través
de una curva de calibración almacenada, para relacionarla
con la concentración.
¿Nefelometría o turbidimetría?
En general, la nefelometría tiene el potencial para ser lige-
ramente más sensible y proporciona resultados más rápidos
que la turbidimetría. Ésta, por otra parte, no requiere un
detector especial y puede realizarse en muchos de los ana-
lizadores clínicos automáticos disponibles en la actualidad
que emplean la medición fotométrica.
Luminiscencia
La luminiscencia es la emisión de luz o energía radiante que
surge cuando un electrón vuelve desde un nivel de energía
excitado o más alto a un nivel de energía más bajo. Exis-
ten varios tipos de fenómenos luminiscentes, que incluyen
la fluorescencia, la fosforescencia y la quimioluminiscen-
cia. Aunque los fenómenos luminiscentes se diferencian
en cómo un electrón es activado al estado excitado, produ-
cen emisiones similares de energía radiante.
Fluorescencia
Cuando la luz choca con una sustancia molecular, bastante
energía a una longitud de onda específica puede absorberse
y ocasionar que la sustancia altere su configuración elec-
trónica colocando algunos de los electrones en un estado
excitado. Esta condición es de breve duración y los elec-
trones excitados vuelven rápido al estado fundamental.
Si la sustancia es de una estructura química particular, la
transición puede ser un proceso multietapa, en cuya etapa
principal libera luz emitida con una energía más baja que
la luz de excitación. Los otros pasos en la transición al
estado fundamental son sobre todo la pérdida de energía
vibratoria, debido a las colisiones del electrón. La luz emi-
tida que se produce cuando la sustancia pasa de un esta-
do excitado al estado fundamental se llama fluorescencia.
Muchas moléculas muestran fluorescencia (fluoróforos)
que proporciona la base de un método sensible de cuan-
tificación. La mayor parte de los compuestos que exhiben
fluorescencia contienen por lo general sistemas de unión
400 CAP. 41 ABSORCIÓN DE LA LUZ, DISPERSIÓN Y TÉCNICAS DE LUMINISCENCIA EN BIOQUÍMICA CLÍNICA RUTINARIA
múltiple conjugado con electrones π sin localización re-
lacionados. Casi todos los fluoróforos que despiden luz
fluorescente intensa tienen estructuras planares rígidas y
grupos donadores de electrones. Para soluciones diluidas,
la intensidad de la fluorescencia es directamente propor-
cional a la concentración del fluoróforo. Los máximos de
longitud de onda de la absorción y de la emisión son tam-
bién útiles en la identificación de sustancias. La diferencia
entre los máximos de la longitud de onda de excitación y
de la emisión es conocida como el cambio de Stokes, y la
eficiencia del “quanto” es una medida de la cantidad de
luz emitida. Si el cambio de Stokes es grande, es más fácil
medir la luz emitida sin interferencia de la luz incidente.
También, si la eficiencia del quanto es alta, la señal es más
fuerte y el ensayo más sensible. El análisis sanguíneo y de
orina para porfirinas es un buen ejemplo del uso cualitativo
y cuantitativo de la fluorescencia.
Fluorescencia en comparación con fotometría
Las mediciones de la fluorescencia son más sensibles que las
mediciones de la absorbancia y de la dispersión de la luz. La
magnitud de la absorbancia de un cromóforo en la solución es
determinada por su concentración y la longitud de la trayec-
toria de la cubeta. La magnitud de intensidad de la fluores-
cencia de un fluoróforo es determinada por su concentración,
Figura 41-4 Componentes básicos de un fluorómetro
la longitud de la trayectoria y la intensidad de la fuente de luz.
Para las soluciones diluidas, la intensidad de la fluorescencia
es directamente proporcional a la concentración del fluoró-
foro. Con el uso de fuentes de luz más intensas, de técnicas
de filtración de la señal digital y de fotómetros de emisión
sensible, la sensibilidad de las mediciones de la fluorescencia
puede ser 100 a 1 000 veces más grande que la sensibilidad
de las mediciones de la absorbancia.
Aplicaciones de fluorescencia
Los ensayos que emplean técnicas de medición fluorescente
se utilizan de rutina en el laboratorio clínico para determi-
nar porfirinas, fármacos, hormonas, proteínas específicas y
anticuerpos, y para la fenotipificación celular. Los métodos
usados incluyen la medición directa de la luz emitida y una
variedad de inmunoensayos que usan técnicas como po-
larización fluorescente, fluorescencia de tiempo resuelto,
fluorescencia/citometría de flujo inducida por láser y, en
los laboratorios de serología, la microscopia fluorescente.
Fluorómetros
La figura 41-4 ilustra el arreglo óptico en un fluorómetro
simple. La longitud de onda de excitación apropiada se fil-
 LUMINISCENCIA
tra desde la fuente y se dirige dentro de la solución conte-
nida en la cubeta. La luz fluorescente resultante se emite
en todas las direcciones, pero es importante monitorear la
luz que emerge perpendicular al haz incidente, la parte sin
absorber que pasa a través de la cubeta y entra a una tram-
pa de luz. La emisión de la longitud de onda se selecciona
a partir de luz emitida o secundaria y el haz se dirige ha-
cia el detector, por lo común un fotomultiplicador. La sali-
da de éste se amplifica y procesa tanto como se necesite. Si
el aumento del amplificador y la fuente de excitación son
constantes, la lectura de la señal fluorescente se relaciona
de manera lineal con la concentración. Un espectrofluoró-
metro emplea monocromadores en vez de filtros para la
selección de la longitud de onda.
Los fluorómetros de primera generación empleaban
con frecuencia lámparas de vapor de mercurio. Estas lám-
paras tienen su salida concentrada dentro de una cantidad
relativamente pequeña de bandas finas muy definidas que
limitan la selección de la longitud de onda de excitación.
Una fuente de alta intensidad con un espectro casi con-
tinuo es el arco de xenón. Sin embargo, esta fuente ge-
nera ozono y funciona con una temperatura muy elevada.
La mayor parte de los fluorómetros dirigidos al mercado
clínico usan una lámpara de halógeno-tungsteno o, para
mayor sensibilidad, un tubo de destello de xenón que pro-
yecta rápidamente.
Espectrofluorómetros de doble haz. En estos instrumen-
tos, el haz de luz de la fuente se divide y se reparte entre
la cubeta de la muestra y una de referencia. La fluorescen-
cia que se produce en cada cubeta es monitoreada por un
tubo fotomultiplicador simple colocado eléctricamente en
fase con el interruptor. La señal de la diferencia permite la
sustracción de la fluorescencia producida en la cubeta de
referencia y también compensa la desviación y el parpadeo
de la lámpara.
Analizadores de polarización fluorescente. Estos instru-
mentos son básicamente fluorómetros de filtro a los cua-
les se ha incorporado un grupo de polarizadores de luz de
excitación y de emisión. La intensidad de la fluorescencia
se mide tanto en paralelo como perpendicular al plano del
haz de excitación. El grado de despolarización fluores-
cente depende de la rotación molecular, que se relaciona
con el tamaño molecular. Esta técnica se ha aplicado a los
inmunoensayos homogéneos (sin separación). En estas
aplicaciones, por lo común se realiza un inmunoensayo de
unión competitiva en el cual un antígeno y uno marcado
con fluoresceína compiten por los sitios de unión sobre
un anticuerpo. El acoplamiento del marcador fluorescen-
te al anticuerpo grande, que rota de manera lenta, ocasiona
que la luz fluorescente siga con una polarización muy alta. Y
401
en sentido inverso, el antígeno no unido marcado con fluo-
resceína está libre para rotar más rápido y producir fluores-
cencia despolarizada.
Algunos fluorómetros clínicos de este tipo están espe-
cializados para medir sólo una especie fluorescente. Por
ejemplo, el sistema del analizador Abbott TDx® usa reac-
tivos de inmunoensayo marcados con fluoresceína de ma-
nera exclusiva. Debido a que la fluoresceína se absorbe en
la región visible, una fuente de luz halógena de tungsteno
puede usarse. Comparado con otras técnicas fluorimétri-
cas, la sensibilidad es baja y es aplicable sólo al ensayo de
moléculas pequeñas. El analizador de polarización TDx®
es relativamente simple de operar y es muy útil para el mo-
nitoreo del fármaco terapéutico.
Fluorómetros de tiempo resuelto. Un problema encontra-
do con frecuencia en los inmunoensayos fundamentados en
la fluorescencia (en particular en los ensayos homogéneos)
es la alta fluorescencia de fondo causada por algunos de los
componentes en las muestras sanguíneas (p. ej., proteínas,
bilirrubina y NADH del suero). El uso de mediciones de
tiempo resuelto y marcadores con tiempos largos de de-
caimiento de la fluorescencia (> 500 ns) han mejorado esta
limitación. Cuando se emplea esta técnica, la fluorescen-
cia del analito se monitorea sólo después que la de fondo
ha declinado. Los sistemas automatizados que usan quela-
tos de lantánido con una muy elevada fluorescencia están
disponibles en el comercio para una amplia gama de inmu-
noensayos. En el sistema Perkin-Elmer AutoDELFIA®, la
medición se realiza con un fluorómetro de tiempo resuelto
que, por los quelatos de europio, suministra 1 000 pulsos
de luz/segundo. El detector se enciende por 400 microse-
gundos (µs) después de cada emisión de pulso y recolecta
la luz emitida, a 613 nm, por 400 µs (fig. 41-5). Son posi-
bles límites de detección tan bajos como 10-14 mol/L de
quelatos de lantánido.
Quimioluminiscencia
La quimioluminiscencia difiere de la fluorescencia en que
la excitación es causada por una reacción química o elec-
troquímica y no por fotoiluminación. El evento físico de la
emisión de luz es similar a la fluorescencia, en que ocurre
de un estado singlete excitado, y la luz se emite cuando el
electrón vuelve al estado fundamental. La quimioluminis-
cencia implica normalmente la oxidación de un compuesto
orgánico, como luminol, ésteres de acridinio o luciferina,
por un oxidante (p. ej., peróxido de hidrógeno, hipoclo-
rito u oxígeno); la luz la emite el producto excitado que
se forma en la reacción de oxidación. Estas reacciones se
realizan por lo regular en presencia de catalizadores como
402 CAP. 41 ABSORCIÓN DE LA LUZ, DISPERSIÓN Y TÉCNICAS DE LUMINISCENCIA EN BIOQUÍMICA CLÍNICA RUTINARIA
Figura 41-5 Principio de la fluorometría de tiempo resuelto. El
tiempo de declinación largo del marcador es medido después de
que la fluorescencia de fondo se extingue.
enzimas (p. ej., fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano),
iones metálicos o complejos metálicos.
Luminómetros
Ya que los inmunoensayos quimioluminiscentes dependen
del uso de compuestos luminiscentes que emiten la luz du-
rante el curso de una reacción química, no hay necesidad
de una fuente de luz incidente. La única señal que ema-
na de las moléculas luminiscentes y, por tanto, debido a
la proporción alta de señal de ruido, estos ensayos son en
potencia muy sensibles. En principio, la instrumentación
es relativamente simple, consistiendo en una cubeta para la
reacción y un dispositivo sensible que mide la luz conteni-
da en un compartimiento hermético a la luz.
Aplicación de la quimioluminiscencia
La naturaleza de la emisión de luz de ensayos quimiolu-
miniscentes exige adiciones del reactivo exactas y sincro-
nizadas y procedimientos de mezclado muy reproducibles.
Por tanto, su uso, por lo menos en el laboratorio rutinario,
se confina para utilizarlo en analizadores de inmunoensa-
yos automáticos especializados. Su uso como marcadores
en inmunoensayos ahora domina este sector importante
del mercado de diagnóstico global. Los ejemplos de las
técnicas quimioluminiscentes específicas disponibles en
el comercio se describen en seguida. Los inmunoensayos
quimioluminiscentes son muy utilizados para medir hor-
monas, proteínas específicas y ciertos fármacos. Para una
explicación de inmunoensayos, véase el capítulo 39.
Quimioluminiscencia directa. Los ésteres de acridinio
son marcadores quimioluminiscentes que pueden unirse de
forma directa a los antígenos o a los anticuerpos e incor-
porarse en diversas estrategias con inmunoensayos. En la
etapa de generación de la señal del ensayo, el enlace del
éster se rompe bajo condiciones alcalinas para liberar la
N-metilacridona, compuesto inestable, que se descompone
con la emisión de un flash de la luz. La intensidad máxima
ocurre 0.4 seg después de la iniciación, y el periodo del
decaimiento a 0.9 seg. Éste es el principio que se emplea
en los sistemas Bayer ACS180® y Centaur®.
Quimioluminiscencia realzada. La adición de ciertos pro-
ductos químicos puede aumentar mucho la salida de la luz,
por ejemplo, la peroxidasa de rábano, en presencia del pe-
róxido de hidrógeno, causa la oxidación del luminol con la
emisión de luz. La salida de la luz se aumenta más de 1 000
veces en presencia de fenoles y de naftoles sustituidos. La
luminiscencia realzada es un resplandor más bien que un
flash de la luz y persiste por horas, aunque la lectura de la
señal ocurre después de algunos minutos. Este tipo de ge-
neración de señal se explota en el sistema de inmunodiag-
nóstico Vitros ECi® (Ortho-Clinical Diagnostics).
Inmunoensayos enzimáticos quimioluminiscentes. Exis-
ten sustratos que dan lugar a límites luminiscentes para
todos los marcadores enzimáticos de uso general, por
ejemplo, el adamantil 1,2-dioxetano arilfosfato se utiliza
con la fosfatasa alcalina como marcador. La separación del
enlace del grupo fosfato produce un anión inestable que se
descompone con la emisión de luz, por ejemplo, como
se utiliza en el analizador DPC Immulite®.
Electroquimioluminiscencia. La electroquimioluminiscen-
cia difiere de la quimioluminiscencia convencional en que
las especies reactivas que producen las reacciones quimio-
luminiscentes se generan de manera electroquímica a partir
de precursores estables en la superficie de un electrodo. Los
procesos electroquimioluminiscentes se han demostrado
en muchas moléculas diferentes por diversos mecanismos,
incluyendo una reacción tipo oxidorreducción con rutenio
(Ru2+), tris(bipiridil) y tripropilamina. Este principio se em-
plea en los analizadores Roche Elecsys® y E-170®.
Cuando se aplica un potencial eléctrico, el marcador de
rutenio se oxida y de forma simultánea la tripropilamina
es también oxidada a un catión inestable que pierde de
 LECTURAS ADICIONALES 403

manera espontánea un protón. El radical de tripropilamina Lecturas adicionales

resultante reacciona con el rutenio oxidado, produciendo
un marcador de rutenio excitado que declina con la emisión
de un fotón. La emisión de luz subsiguiente se mide enton-
ces con un fotomultiplicador y se procesa como apropiado
para la cuantificación.
Skoog DA, Holler FJ, Nieman TA. Principles of Instrumental
Analysis. 1997: Thomson Learning, Philadelphia, PA.
Wild DG (ed.). The Immunoassay Handbook, 2nd edn. 2001:
Stockton Press, New York.
 42
Espectrometría atómica analítica
Andrew Taylor
Introducción
La espectrometría atómica analítica es el término que se
emplea para incluir un número de técnicas que se aplican
de manera extensa para la determinación de elementos in-
dividuales en los líquidos y tejidos corporales. Las más im-
portantes son la espectrometría de absorción atómica y la
de masas por plasma inductivamente acoplado, que con
la de emisión atómica, la de fluorescencia atómica y la de
fluorescencia de rayos X también tienen papeles útiles. Se
aplican sobre todo en la medición de minerales esenciales
y oligoelementos, por ejemplo, sodio, magnesio, zinc y co-
bre, y en sustancias tóxicas como aluminio y plomo. Estas
técnicas consideran las mediciones exactas de concentra-
ciones muy bajas en muestras biológicas complejas.
Principios
La espectroscopia es el estudio de las interacciones entre
la radiación de la materia y la electromagnética; cuando se
aplica al análisis cuantitativo, se utiliza el término espec-
trometría. Diferentes tipos de espectrometría conciernen a
varias regiones del espectro electromagnético (p. ej., rayos
X, luz UV, radiación infrarroja), las propiedades de la ma-
teria con las cuales las interacciones suceden (vibración
molecular, transiciones del electrón) y las interacciones fí-
sicas implicadas (es decir, dispersión, absorción o emisión
de radiación).
Las técnicas espectrométricas atómicas analíticas cuan-
titativas incluyen la espectrometría de absorción atómica
(AAS), de emisión atómica (AES), de fluorescencia atómi-
ca (AFS), de masas inorgánicas y la fluorescencia de rayos
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
X (XRF). Las AAS, AES y AFS explotan las interacciones
entre la luz UV y la visible y los electrones de la capa exte-
rior de átomos libres, gaseosos y no cargados. En la XRF,
partículas de alta energía colisionan con los electrones de
la capa exterior de los átomos para iniciar las transiciones
que culminan en la emisión de los fotones de rayos X. En la
espectrometría de masa (MS) inorgánica, un campo mag-
nético separa los átomos ionizados del analito de acuerdo a
su masa: proporción de la carga.
Emisión, absorción y fluorescencia atómica
Cada elemento tiene una estructura atómica característica,
con un núcleo con carga positiva rodeado por el número
de electrones necesario para mantener una neutralidad. Es-
tos electrones ocupan niveles de energía discreta, pero es
posible para un electrón moverse de un nivel a otro, dentro
del átomo, por la introducción de energía (figs. 42-1, 42-2 y
42-3). Esta energía puede suministrarse durante colisiones
con otros átomos o con electrones libres, o como fotones a
partir de la luz. Tales transiciones ocurren sólo si la ener-
gía disponible es igual a la diferencia entre los dos niveles
(⌬E). Los átomos no cargados pueden existir en el nivel de
energía más bajo, o estado basal, o en cualquiera de una
serie de estados excitados dependiendo de cuántos elec-
trones se mueven a niveles de energía más altos, aunque es
normal considerar sólo la primera transición. Los niveles
de energía y las ⌬E relacionadas con las transiciones del
electrón son únicas en cada elemento.
La ⌬E para los movimientos de los electrones de la capa
exterior en la mayor parte de los elementos corresponde a
la energía equivalente a la radiación UV visible y son es-
406 CAP. 42 ESPECTROMETRÍA ATÓMICA ANALÍTICA
tas transiciones las que se utilizan en la espectrometría de
AA, AE, y AF. La energía (E) de un fotón se caracteriza
por:
E = hv (1)
donde h = constante de Planck y v = frecuencia de la forma
de onda correspondiente a ese fotón (el concepto dual de
la luz como la forma de onda y partículas discretas no se
considera más aquí). Además, la frecuencia y la longitud
de onda están relacionadas, ya que:
v = c␭ (2)
donde c = velocidad de la luz y ␭ = longitud de onda. Por
tanto:
E = hc / ␭ (3)
donde se deduce que una transición específica, ⌬E, se rela-
ciona con una longitud de onda única.
Bajo las condiciones apropiadas, los electrones de la
capa exterior de los átomos del estado basal, vaporizados
dentro del sistema analítico pueden excitarse por energía
térmica (es decir, colisiones con otros átomos). Como estos
átomos regresan al estado basal más estable, la energía se
pierde, parte de ella en forma de luz emitida, la cual puede
medirse con un detector (fig. 42-1). La intensidad de esta
Figura 42-1 Diagrama parcial del nivel de energía mostrando la
emisión de energía como luz cuando los átomos descienden desde
un nivel excitado hacia el estado basal.
luz es proporcional al número de átomos presentes, y el
proceso es una espectrometría de emisión atómica (AES).
Cuando la luz (energía radiante) de una longitud de
onda característica entra en un sistema analítico, los elec-
trones de la capa exterior de los átomos que están dentro
de la trayectoria de la luz se excitan cuando la energía se
absorbe (fig. 42-2). Por consecuencia, la cantidad de luz
transmitida por el sistema desde una fuente hacia el detec-
Figura 42-2 Diagrama parcial del nivel de energía mostrando
la absorción de la energía de luz cuando los átomos se mueven
desde el estado basal hacia un nivel excitado. La luz transmitida
hacia el detector se ha atenuado.
tor se atenúa. La pérdida de luz es proporcional al número
de átomos y se entiende como espectrometría de absorción
atómica (AAS).
Parte de la energía radiante que absorben los átomos
del estado basal puede emitirse como luz cuando los áto-
mos retornan al estado basal. Esta emisión se describe
como fluorescencia de resonancia y, de nuevo, su intensi-
dad es proporcional al número de átomos que están en la
trayectoria de la luz. La técnica se conoce como espectro-
metría de fluorescencia atómica (fig. 42-3).
Figura 42-3 Diagrama parcial del nivel de energía mostrando
la absorción de la energía de luz cuando los átomos se mueven
desde el estado basal hacia un estado excitado, seguido por la
emisión de energía (luz) cuando los átomos vuelven a descender
al estado basal.
De las ecuaciones (1) y (2) se deduce que las longitudes
de onda de la luz absorbida y emitida son las mismas, y
únicas, para un elemento dado. Esto es lo que hace a las
AAS, AES y AFS específicas, de modo que un elemento
puede medirse aun con la presencia de un exceso enorme
de un elemento químicamente similar.
La ecuación de Boltzmann (Haswell, 1991) relaciona
las energías con estados diferentes a la estructura atómi-
 INSTRUMENTACIÓN
ca y, desde la ecuación, la proporción de una población
atómica presente, como átomos excitados, comparada con
los átomos del estado basal puede calcularse. La propor-
ción está influida por dos características, la temperatura y
el elemento. En las temperaturas operativas típicas, la pro-
porción es al menos de 10 –6:1 para la mayor parte de los
elementos, y las AAS y AFS proporcionan sensibilidad su-
perior a la AES. Con los sistemas que proveen temperatu-
ras más altas (véase Instrumentación) la proporción cambia
y la AES puede ser favorecida. Las estructuras atómicas de
los metales alcalinos (p. ej., sodio, potasio, litio) son tales
que las ⌬E son relativamente pequeñas, correspondiendo
a longitudes de onda más largas, y aunque a unos 2 000°C
la proporción de átomos excitados no es alta (de 10–4 a
10–6:1), las concentraciones de sodio y potasio en las mues-
tras biológicas son suficientes para que la AES de flama
(también denominada fotometría de flama) sea una técnica
conveniente y bien establecida para medir estos metales en
los laboratorios clínicos.
La espectrometría de absorción atómica puede utilizar-
se para determinar más de 60 elementos con instrumentos
que son relativamente económicos y simples de manejar,
y la cual provee suficiente sensibilidad para medir muchos
de estos elementos en las concentraciones presentes en las
muestras clínicas (Haswell, 1991). Un rango similar de ele-
mentos puede medirse con la espectrometría de emisión
atómica. La fotometría de flama es conveniente para los
metales alcalinos en concentraciones altas, pero la AES es
más útil con fuentes de energía de alta temperatura (véa-
se Instrumentación) cuando el análisis multielemento pue-
de emprenderse. La fluorescencia atómica efectiva requiere
fuentes de luz intensa, estable y éstas son difíciles de cons-
truir fiablemente. El mayor éxito se obtiene con lámparas
de descarga sin electrodos para los elementos metaloides de
los grupos 4 a 6 de la tabla periódica. Límites de detección
muy bajos se alcanzan para estos elementos con la AFS.
Fluorescencia de rayos X
Cuando los fotones, electrones o protones de alta ener-
gía golpean una muestra sólida, un electrón de las capas
interiores (K, L o M) de un átomo constitutivo puede ser
desplazado. La vacante orbital que surge la ocupa un elec-
trón de la capa exterior; con la emisión acompañante de
un fotón de rayos X, esta energía es igual a la diferencia
entre los niveles de energía implicados. Esta emisión se co-
noce como fluorescencia de rayos X (XRF). La energía de
emisión, es decir, la longitud de onda, es una característica
del átomo (elemento) a partir del cual se origina, mientras
la intensidad de la emisión se relaciona con la concentra-
ción de los átomos en la muestra. Dependiendo del tipo
de espectrómetro que se emplee para medir la emisión, la
407
XRF se caracteriza como de longitud de onda dispersiva
(WDXRF) o de energía dispersiva (EDXRF). La XRF por
reflexión total (TXRF) se describe como una técnica, aun-
que es una variación de EDXRF.
Espectrometría de masas inorgánica
Puesto que las muestras se toman a altas temperaturas, los
componentes orgánicos se destruyen, algunos o la totali-
dad de los elementos inorgánicos se ionizan. Cuando estos
iones se controlan con un espectrómetro de masas, pueden
separarse al pasar por un campo magnético establecido por
un cuadrupolo o algún otro filtro de masa. Estos iones se-
parados de acuerdo a la masa, cociente (m/z) de carga, se
detectan y contabilizan usando un multiplicador de electro-
nes. Este proceso por lo general se describe como espectro-
metría de masas inorgánica o atómica.
Se han empleado varias fuentes de iones, pero para el
manejo más reciente del análisis clínico se usa un plasma
inductivamente acoplado (ICP-MS). La técnica es un ver-
dadero multielemento y provee límites de detección que
están en el rango de µg/L o, en especial para los elementos
con número de masa atómica alto, todavía más bajos. Los
elementos que hasta la fecha se han determinado pueden
ahora ser cuantificados con confianza. La otra característi-
ca principal de la espectrometría de masas es la capacidad
para medir isótopos diferentes del mismo elemento.
Instrumentación
Absorción atómica
Un espectrómetro de absorción atómica consiste de los si-
guientes módulos:
Fuente Lectura/
Atomizador Monocromador Detector
de luz visualizador
donde el monocromador, el detector y el visualizador son
similares a los de otros espectrómetros. La característica
esencial de una fuente de luz óptima para la AAS se consigue
suministrando una potencia monocromática de alta intensi-
dad, con lámparas de cátodo hueco, las cuales se constru-
yen con el elemento a medirse como un componente prin-
cipal del cátodo, de modo que la luz emitida es de la misma
longitud de onda que se requiere para la absorción atómica
por la muestra. Por consiguiente, se requiere una lámpara
diferente para cada elemento que se mide, y por los costos
implicados, un rango comprensivo de lámparas se mantie-
ne por lo general en pocos laboratorios especializados.
408 CAP. 42 ESPECTROMETRÍA ATÓMICA ANALÍTICA

El atomizador es cualquier dispositivo que genera áto-
mos del estado basal como un vapor dentro de la trayec-
toria de la luz instrumental. Si se considera el calcio en una
muestra de suero, el elemento está presente en la solución,
ligado a la proteína, junto con el fosfato y parte del Ca2⫹
inorgánico. La formación del vapor atómico (atomización)
requiere de los siguientes pasos:
• Eliminación del solvente (secado).
• Separación del anión u otros componentes de la matriz
Ca2⫹.
• Reducción: Ca2⫹ ⫹ 2e⫺ Ca°.
La energía necesaria para realizar estos pasos se suministra
como calor, ya sea de una flama o de un horno eléctrico.
Al final, dentro del atomizador hay absorción de la energía
radiante.
Atomizadores de flama
La disposición típica de este atomizador implica un nebu-
lizador neumático, cámara de premezclado y una flama de
acetileno laminar con una longitud de la trayectoria de 10 cm
(fig. 42-4). El flujo de aire de alta velocidad auxiliar causa
la dilución de la muestra al aspirarse de forma continua por
capilaridad, debido al efecto Venturi. La muestra emerge
del nebulizador, como un aerosol con un amplio rango de
tamaños de gotitas, que se mezcla con los gases de la flama
y se transporta a la flama para la atomización. Sin embargo,
sólo las gotitas menores de 10 µm en realidad entran a la
flama, porque aquellas de tamaño más grande caen hacia los
lados de la cámara de premezclado y se desperdician. Por
consiguiente, menos de 15% de la muestra entra a la flama.
Así, con el nebulizador neumático, la muestra original ex-
perimenta dilución con los gases de la flama, pérdidas en la
cámara de premezclado y considerable expansión térmica
(es decir, dilución adicional) dentro de la flama. Además de
la dispersión de la muestra a través de la flama, hay pérdidas
de átomos debido a la formación de óxidos u otras especies
en los márgenes de la flama. La tasa normal de captación de
la muestra del nebulizador es de casi 5 ml/min y se necesita
una aspiración por varios segundos para lograr una señal
constante.
Las ventajas y desventajas del sistema de atomización
con nebulizador neumático de flama se muestran en el
cuadro 42-1. Por su sencillez, velocidad y libertad de in-
terferencias, este planteamiento se prefiere donde la con-
centración del analito es apropiada. Las concentraciones
típicas más bajas que pueden determinarse se aproximan a
1 µg/ml. El aire acetileno se quema a casi 2 000°C, en tan-
to que la flama de óxido nitroso acetileno es más caliente,

Flama

Mechero

Mezclado del
Combustible y
aerosol y los
oxidante auxiliar
gases de la flama
Nebulizador

Cámara de
Muestra premezclado
Desechos
Ampliación de A

Muestra Aerosol

Gas de soporte

Figura 42-4 Diagrama de un nebulizador neumático, cámara de premezclado y mechero; la imagen inferior muestra el nebulizador con
más detalle.
 INSTRUMENTACIÓN 409

Cuadro 42-1 Características de la nebulización neumática con Trayectoria

atomización por flama de la luz
Tubo de sílice
calentado
Rápida Sólo 15% de la muestra entra en la
flama
Reproducible Amplio rango del tamaño de las gotitas
Poca interferencia Densidad atómica baja de la muestra
en la flama
N2
Señal constante Las condiciones del mechero imponen
limitaciones sobre el nebulizador
Hidruro, por
ejemplo, AsH3

tiene una temperatura cercana a 3 000°C y se utiliza en los Matraz de reacción

elementos que forman óxidos refractarios y no tienen una
atomización eficaz en la flama de aire acetileno. NaBH4 Muestra acidificada
Una mejoría en la sensibilidad se obtiene con dispo-
sitivos que superan las limitaciones de los nebulizadores
neumáticos listados antes. Estos: a) atrapan átomos para Figura 42-5 Diagrama de un sistema para la generación del hi-
druro y atomización.
dar una densidad más grande dentro de la trayectoria de la
luz, b) circunvalan el nebulizador, de modo que 100% de
la muestra se atomiza, y c) introducen la muestra como un
Generación de vapor de mercurio
impulso simple, rápido, más bien que como un flujo conti-
nuo. Algunos emplean una combinación de estas caracte-
El mercurio forma un vapor a la temperatura ambiente y esta
rísticas. Los dispositivos que se utilizan en una flama, por
característica es la base para la generación de vapor frío. Un
ejemplo, el tubo ranurado de cuarzo y la cubeta de Delves,
agente de reducción se agrega a la solución de la muestra
son más eficaces con los elementos más volátiles, como el
para convertir el Hg2+ a mercurio elemental. La agitación o
zinc, el cadmio y el plomo. Estos tres planteamientos para
el burbujeo del gas a través de la solución producen la vapo-
mejorar la sensibilidad también figuran en otros atomiza-
rización rápida del mercurio atómico, que entonces se trans-
dores utilizados en las AAS, AES, AFS, ICP-MS.
fiere a una celda, a través del flujo, puesta en la trayectoria de
la luz (fig. 42-6). Como ocurre en la generación del hidruro,
Generación de hidruros el límite de detección es de unos pocos nanogramos y la ins-
trumentación común para lograr ambos procedimientos la
Ciertos elementos, como arsénico, selenio y bismuto for- han desarrollado algunos fabricantes.
man con facilidad hidruros gaseosos, por ejemplo, la ar-
sina (AsH3). Usando instrumentación adicional simple,
un reductor, como el borohidruro de sodio, se agrega al
Trayectoria de la luz
matraz de reacción que contiene la muestra acidificada. El
hidrógeno se forma y éste reacciona con el analito, se de-
sarrolla el hidruro gaseoso y se transfiere por un flujo de
Desechos
gas inerte hacia un tubo de sílice calentado ubicado en la
Aire empujado a
trayectoria de la luz. El tubo se calienta con una flama de través del sistema
aire acetileno o una corriente eléctrica y la temperatura es
suficiente para causar la disociación del hidruro y la ato-
mización del analito (fig. 42-5). Así, no hay pérdida de la
muestra, todos los átomos entran a la trayectoria de la luz
en unos pocos segundos, y son atrapados dentro del tubo de
sílice, que retarda su dispersión. La generación de hidru- Trampa fría para Muestra + agente de reducción
colectar el vapor Hg2+ + 2e– S Hg°
ros por AAS permite la detección de unos cuantos nano- de agua
gramos de analito a partir de cualquier volumen de muestra
que se coloca en el matraz de reacción. Las variaciones de
la instrumentación son posibles para procurar una disposi- Figura 42-6 Diagrama de un sistema para la generación de va-
ción de flujo continuo, que es más sencillo de automatizar. por de mercurio.
410 CAP. 42 ESPECTROMETRÍA ATÓMICA ANALÍTICA
Atomización electrotérmica
La mayor parte de los sistemas utiliza un tubo de grafito
calentado eléctricamente; esta técnica a menudo se deno-
mina atomización con horno de grafito, aunque se emplean
a veces diversos materiales. El contacto eléctrico se hace
con el horno y se aplica un voltaje. La resistencia al flu-
jo de corriente provoca el aumento de la temperatura del
horno (como con el elemento de una estufa eléctrica). Una
secuencia programada de la temperatura (fig. 42-7) puede
Figura 42-7 Un ejemplo de un programa de calentamiento sim-
ple para la atomización electrotérmica.
establecerse de modo que la solución puesta dentro del hor-
no se seque cuidadosamente; el material orgánico entonces
se destruye y los iones del analito se disocian de los anio-
nes. Con un aumento rápido en la temperatura, los iones se
reducen a átomos del estado basal por la absorción de luz.
Un aumento pequeño adicional de la temperatura asegura
que el tubo de grafito esté limpio para la muestra siguiente.
Las temperaturas de atomización que pueden alcanzarse
por esta técnica, hasta 3 000°C, permite que los elemen-
tos refractarios como el aluminio y el cromo sean posible
medirlos. Por lo común, sólo 10 a 50 µl de la muestra se
inyecta en el horno, así las muestras muy pequeñas pueden
acomodarse, y porque toda la muestra se atomiza dentro
de un volumen pequeño, una población densa del átomo se
produce en la trayectoria de la luz. La técnica es, por tanto,
muy sensible, lo que permite la medición de las concentra-
ciones en µg/L. Aunque es lento comparado con la AAS de
flama, el análisis puede ser automatizado, y los instrumen-
tos modernos se suspenden al final de una corrida, de modo
que la operación de toda la noche sin vigilancia es posi-
ble. La atomización electrotérmica de la AAS (ETAAS)
está sujeta a mayores interferencias que la AAS de flama
y se requieren varios procedimientos para eliminarlas o
compensarlas. De la misma manera, se utilizan formas
diferentes de materiales de grafito (electrografito, grafito
pirolíticamente recubierto y grafito pirolítico total), y el di-
seño del horno y el calentamiento pueden optimizarse para
promover la atomización y reducir las interferencias. El
establecimiento del detalle metodológico y de la atención
cuidadosa cuando el instrumento se suspende cada día es
necesario para obtener resultados correctos y precisos. Los
estudios de funcionamiento del laboratorio demuestran que
tal destreza se encuentra en centros donde el análisis del
oligoelemento es una actividad principal.
Interferencias
La mayor parte de las técnicas pueden considerarse razona-
blemente maduras; en ellas las interferencias se subentien-
den y hay procedimientos para superarlas. Los dispositivos
que implican el flujo de soluciones, como en los nebulizado-
res o los sistemas de inyección de flujo, proveen resultados
erróneos si las muestras y los elementos de calibración tie-
nen viscosidades desiguales, causando diferentes ritmos de
introducción en el analizador. Donde ocurre esto, estrate-
gias como la estandarización interna, la incorporación de
estándares o la adición de reactivos para igualar los ritmos
de flujo proporcionan determinaciones exactas. Las inter-
ferencias químicas influyen en el ritmo de la atomización.
El calcio ligado al fosfato en el suero no se separa por com-
pleto a 2 000°C y envía una señal más baja que una concen-
tración equivalente de un calibrante acuoso. La adición de
un agente de emisión, como el La3+, que se liga al fosfato,
evita esta interferencia. Las interferencias químicas tam-
bién ocurren dentro del horno de grafito, como la matriz de
la muestra que causa que los átomos del analito se volatili-
cen y se pierdan durante la fase de incineración. Los modi-
ficantes químicos se agregan para estabilizar los átomos o
para facilitar la eliminación de la matriz, o ambas, en una
etapa temprana del ciclo de calentamiento. Las interferen-
cias más difíciles son aquellas que causan la absorción no
atómica del haz de luz y son por lo común un resultado de
la naturaleza compleja de los fluidos biológicos. La com-
pensación para la absorción no atómica se logra usando
modificantes químicos para promover la destrucción de la
matriz orgánica, con dispositivos para establecer las condi-
ciones de la atomización isotérmica y con las técnicas de
corrección del fondo (cuadro 42-2).
 INSTRUMENTACIÓN 411

Cuadro 42-2 Planteamientos para eliminar la absorción no atómica

Técnica Motivo Ejemplos

Modificantes químicos
Atomización isotérmica
Corrección del fondo
Promover la destrucción de la matriz de la muestra O2, Mg(NO3)2, (NH4)2HPO4
Retrasar la atomización del analito Pd2+, Ru2+
Reducir las interacciones de la fase de vapor retrasando Plataforma L’Vov, sonda de grafito,
la atomización hasta que el horno alcance hornos originales
temperatura constante
Medir por separado la absorción total y la no atómica; BC de deuterio, BC efecto de Zeeman,
la diferencia = absorción atómica BC Smith-Heijfte

Emisión atómica Las lecturas simultáneas es posible hacerlas con el segundo

La instrumentación para la emisión atómica incluye:
Atomizador/
Monocromador Detector Lectura/
fuente de excitación visualizador
Como se indica antes, la fuente de calor para la atomización
y la excitación a un nivel de energía más alto puede ser una
flama. Las alternativas históricas incluyen arcos y chispas,
pero los instrumentos modernos utilizan el argón o algún
otro gas en un estado ionizado, que se llama plasma.
arreglo, como cuando en cada uno de los monocromado-
res se coloca para transmitir la luz de longitudes de onda
predeterminadas. Un instrumento de lectura secuencial es
menos costoso que un instrumento de lectura simultánea,
pero más muestras se requieren para tomar una serie de lec-
turas. Para la mayor parte de los elementos, la sensibilidad
analítica del ICP-AES es similar a la que se obtiene con la
AAS de flama.

Plasmas acoplados inductivamente

El plasma se inicia por el sembrado de una chispa de alto

voltaje para ionizar los átomos:

Ar ⫹ e⫺ Ar⫹ ⫹ 2e⫺

y se sostiene con la energía de una bobina de inducción co-

nectada a un generador de radiofrecuencia. Esto se conoce
como plasma inductivamente acoplado (ICP).
Los plasmas persisten a temperaturas de hasta 10 000°C
y en el instrumento tienen el aspecto de una antorcha (fig.
42-8). Las muestras pueden introducirse vía nebulizador
o, en cuanto a la AAS, por la generación de hidruro, la
generación de vapor frío o la vaporización electrotérmica
desde un atomizador de grafito. La característica principal
de la AES es que permite el análisis multielemento. Los
sistemas ópticos dirigen la luz emitida ya sea vía monocro-
mador hacia un solo detector o un conjunto de monocroma-
dores y detectores colocados alrededor del plasma. Con el
primer arreglo, una serie secuencial de lecturas puede ha-
cerse con los monocromadores guiados para proporcionar, Figura 42-8 Unidad de la linterna para el plasma inductivamen-
a su vez, cada una de las longitudes de onda de interés. te acoplado.
412 CAP. 42 ESPECTROMETRÍA ATÓMICA ANALÍTICA
Interferencias
En las altas temperaturas operativas del ICP, ocurren mu-
chas transiciones de energía, dando lugar al potencial para
las interferencias espectrales, donde la emisión de luz de
elementos diferentes ocurre en longitudes de onda que es-
tán tan juntas que no es fácil que se logre separarlas por
el ancho de banda del espectrómetro. La mayor parte de
éstas se documentan, de modo que donde se sospecha una
interferencia puede utilizarse una línea alternativa de reso-
nancia para la medición.
Fluorescencia atómica
Pocos instrumentos comerciales para AFS están disponibles,
y éstos se confinan a la medición de elementos que forman
hidruros y mercurio. Los componentes son similares a los
de la AAS. Las lámparas de descarga sin electrodos se uti-
lizan para la fuente de luz y la trayectoria óptica se modi-
fica de modo que sólo la luz emitida fluorescente alcanza
el detector. Ciertas interferencias son comunes a la genera-
ción del hidruro, cualquiera que sea el detector utilizado. Si
un elemento que forma hidruros está presente en la muestra
en cantidades grandes, consumirá el agente de reducción de
manera que otros elementos no se detecten. Las altas con-
centraciones de los elementos de transición también inhiben
la formación del hidruro. Donde esto puede ser un problema
el analito puede separarse de la matriz, por ejemplo, por que-
lación y la extracción del solvente o por cromatografía.
Fluorescencia de rayos X
Las muestras son irradiadas por fotones de alta energía,
casi siempre el haz policromático primario de los tubos de
rayos X. Sin embargo, el uso de isótopos radiactivos como
244Cm, 241Am, 55Fe y 109Cd son las fuentes de interés en las
aplicaciones clínicas. El último es en particular importante
como fuente en los instrumentos portátiles desarrollados
para la XRF in vivo (véase adelante, Aplicaciones).
Mientras la matriz de la muestra contribuye de manera
considerable a la intensidad de la señal, la calibración pue-
de ser difícil, requiriendo por lo general el uso de diferen-
tes materiales de referencia o de estandarización interna,
o ambos. Pocos problemas se encuentran si las muestras
son preparadas como frotis muy finos y en la TXRF. Junto
con el efecto de la matriz, la sensibilidad también está in-
fluida por la longitud de onda, de modo que los elementos
más ligeros presentan un desafío analítico difícil.
En WDXRF, los rayos X de alta intensidad se utilizan
para inducir la emisión de fluorescencia, que es dispersada
en líneas espectrales individuales por la reflexión en un
cristal del analizador. Los rayos difractados se enfocan y se
dirigen sobre un detector del fotón. Como con el ICP-AES,
los espectrómetros pueden funcionar en secuencia con un
número de cristales intercambiables para permitir la medi-
ción del rango completo de elementos, o en un modo mul-
ticanal (simultáneo), normalmente preestablecidos para
los analitos específicos. Los límites de detección para los
elementos ligeros son 10 a 100 veces más bajos que con la
EDXRF. La resolución es buena, aunque menor a tales lon-
gitudes de onda más cortas. Los instrumentos secuenciales
requieren tiempos de análisis largos para medir varios ele-
mentos, comparados con los instrumentos simultáneos o la
tecnología de la EDXRF.
Para EDXRF, los rayos X emitidos de la muestra se diri-
gen juntos en un detector de cristal. Un pulso de la corrien-
te se genera con una altura que es proporcional a la energía
del fotón de rayos X. Las diferentes energías relacionadas
entre varios átomos (elementos) en la muestra se clasifican
electrónicamente; se utilizan fuentes de energía más bajas
(un tubo de rayos X de bajo poder o una fuente isotópica).
El detector tiene que mantenerse a una temperatura muy
baja y en un vacío limpio. Los tiempos del análisis son 10
a 30 veces más largos que con la WDXRF pero, con una
técnica verdadera multielemento, el tiempo total no es ne-
cesario que sea mayor.
Cuando un haz enfocante de rayos X se dirige contra una
superficie óptica plana en un ángulo de alrededor de 5´ (5/60
de un grado), la reflexión total ocurrirá. Éste es el princi-
pio de la TXRF, en la cual la muestra se expone a los rayos
primarios y reflejados totales y se excita para fluorescencia.
La radiación emitida se resuelve y se mide como un espectro
ED. Puesto que de hecho no hay absorción por la matriz, la
medición y la calibración son mucho más simples y las sensi-
bilidades son mayores que con otras técnicas de rayos X.
Espectrometría de masas inorgánica
Los módulos requeridos para la espectrometría de masas
inorgánica incluyen:
Introducción
de la muestra/ge- Enfocamiento Separación Lectura y
neración del ion del ion del ion Detector visualización
Fuentes del ion
Según se menciona antes, hay un número de dispositivos
de generación de ion, pero el más utilizado es el ICP. Las
muestras se introducen por lo común al plasma vía nebuli-
zador o por vaporización química (generación del hidruro
y del vapor frío de mercurio). A veces se utilizan la va-
porización electrotérmica y la vaporización causada por la
ablación láser de una muestra sólida .
 APLICACIONES
Analizadores de masa
La antorcha del plasma inductivamente acoplado es inter-
conectada al analizador de masas vía dos conos metálicos
(colector de la muestra y muestreador), a través de los
cuales los iones se extraen dentro de la unidad de focali-
zación del ion, donde un sistema de lentes del ion dirige los
iones al analizador de masas. Varias configuraciones del
analizador están disponibles en el comercio. Aquellos con
un sistema de cuadrupolo tienen un poder de resolución
limitado, permitiendo la separación de la especie sobre una
base de la unidad m/z. Para explotar la capacidad máxima
de la técnica, la fuente del ICP tiene que ser acoplada a un
analizador de masas de sector del campo de alta resolución,
que puede alcanzar una resolución mucho mayor y con una
sensibilidad más alta que con ICP-MS de cuadrupolo. Los
espectrómetros de masas por tiempo de vuelo son en parti-
cular útiles para el análisis de señales rápidas, transitorias,
como las generadas por la vaporización electrotérmica.
Interferencias
El ICP-MS está sujeto a muchas interferencias espectrales
causadas por el traslape de los isótopos, o de diferentes
elementos o iones formados de los componentes de la ma-
triz y del gas del plasma. Ejemplos importantes para los
análisis clínicos incluyen 40Ar+ sobre 40Ca, 31P16O2+ sobre
63Cu, 40Ar+35Cl+ sobre 75As y 40Ar + sobre 80Se. El ICP-MS
2
del sector de campo no está sujeto a la mayor parte de estas
interferencias, aunque la pérdida de sensibilidad se observa
cuando se emplea alta resolución. Esto puede conducir a
problemas con algunas aplicaciones. Un desarrollo relati-
vamente nuevo de instrumentos cuadrupolo se está usando
en las celdas de colisión, donde una celda llena de gas se
incluye en la unidad de focalización. Las colisiones entre
los iones poliatómicos y el gas llenador causa que los pri-
meros se disocien y las interferencias espectrales se reduz-
can mucho. Otro acercamiento implica la separación de los
iones del analito de aquellos implicados en la formación
de las especies poliatómicas. La separación puede lograr-
se con la vaporización de la muestra, por ejemplo, con la
generación del hidruro o la vaporización electrotérmica, o
preanalíticamente con cromatografía o alguna técnica si-
milar. La adición de nitrógeno, de helio o de metano al gas
portador o al solvente orgánico del diluyente reduce algu-
nas de las interferencias basadas en el argón.
Las interferencias no espectrales, relacionadas con la in-
troducción de la muestra, con las fluctuaciones del plasma,
etc., se eliminan de forma eficaz usando un estándar inter-
no. Éste debe ser un elemento no presente en la muestra
original, ni sujeto a las interferencias espectrales, y con una
413
masa y energía de ionización próxima a la de los analitos.
También se usa con frecuencia para las muestras biológicas
en el escandio, para las masas de hasta 80 unidades ató-
micas (amu); en el indio, de 80 a 150 amu; e iridio, en las
masas arriba de 150 amu.
Aplicaciones
Se requieren mediciones de minerales y de oligoelemen-
tos para investigaciones clínicas diferentes (Taylor, 1996).
Ciertos grupos pueden tener ingestas nutricionales deficien-
tes de los elementos esenciales, por ejemplo, los ancianos,
los niños desfavorecidos y las mujeres durante el embarazo,
y las deficiencias de hierro, zinc y de selenio son frecuen-
tes en estos grupos. La deficiencia de los oligoelementos
esenciales también puede ocurrir durante la alimentación
parenteral total, por lo que los protocolos para la monito-
rización regular de pacientes por lo general se recomien-
dan. En otras situaciones, el envenenamiento yatrogénico
puede ocurrir. Las concentraciones séricas de aluminio se
miden de manera regular en pacientes con falla renal cróni-
ca, debido al uso de agentes orales ligadores de fosfato que
contienen aluminio y también por posible contaminación de
los fluidos de la diálisis. Los fluidos de la diálisis pueden
llegar a contaminarse con otros elementos; en este sentido
se han reportado casos tóxicos relacionados con el cobre
y el zinc. El diagnóstico y el monitoreo de errores innatos
del metabolismo del oligoelemento requiere por lo común
mediciones del elemento implicado.
La exposición aumentada a los minerales y oligoelemen-
tos puede causar morbilidad; algunos son carcinogénicos
(Baldwin y Marshall, 1999). Mientras que las funciones
de muchos órganos se pueden perturbar por la acumula-
ción de metales; los sistemas del riñón, del hígado, nervio-
sos, intestinales y hematopoyéticos es más probable que
estén implicados. Las exposiciones accidentales (incluso
suicidas u homicidas deliberadas) a los oligoelementos se
consideran en el diagnóstico diferencial al considerar los
signos y síntomas que implican estos sitios. La exposición
indebida puede ser resultado de las fuentes dentro del am-
biente, o en la casa, relacionado con los pasatiempos, o los
cosméticos y los remedios poco comunes.
En el escenario ocupacional, puede haber exposición
aumentada a los materiales con potencial tóxico reconoci-
do. La determinación de las concentraciones en las mues-
tras adecuadas es un requisito estatutario para el plomo,
y la monitorización biológica es también importante en la
implementación de regulaciones del UK Control of Subs-
tances Hazardous to Health (COSHH).
Las muestras habituales para el análisis son los fluidos
corporales, sangre, suero y orina (Walker, 1998; www.
414 CAP. 42 ESPECTROMETRÍA ATÓMICA ANALÍTICA
sas-centre.org). El pelo y las uñas se toman de cuando en
cuando para investigar situaciones de sobreexposición.
Las condiciones clínicas en las cuales los tejidos es más
probable que se analicen son la enfermedad de Wilson y la
hemocromatosis, las concentraciones de cobre y hierro,
respectivamente, en el hígado son tales que aun las mues-
tras de biopsia pueden investigarse. Las muestras más
grandes de tejidos removidos durante la cirugía o post mor-
tem pueden analizarse para investigaciones especiales.
Muchas investigaciones clínicas se relacionan con las
mediciones de apenas uno o dos elementos en una muestra:
o los síntomas son sugestivos de, o hay perturbación cono-
cida de la exposición a ese elemento. En estas situaciones
las AAS y AFS son técnicas ideales sensibles y exactas. Los
panoramas donde los análisis multielemento son útiles están
llegando a ser más comunes hoy. La AES no es a menudo
apropiada para el análisis de los fluidos biológicos pero sí
para el análisis multielemento en las muestras de tejidos y
alimentos, donde las concentraciones son más altas. Para los
estudios que requieren el análisis multielemento de la sangre
u orina, o ambas, por ejemplo, posible insuficiencia nutricio-
nal, lanzamiento de implantes prostéticos y envenenamien-
tos no identificados, el ICP-MS aporta la técnica más simple,
rentable y, con frecuencia, la más sensible.
Los resultados pueden ser más informativos cuando se
presentan como concentraciones del elemento en proteínas
específicas o algún otro complejo o molécula, más bien que
como la concentración total en la muestra. Se han descrito
varias técnicas para el muestreo; algunas de ellas pueden aco-
plarse de manera directa al espectrómetro en un arreglo tán-
dem para el análisis. La fluorescencia atómica, el ICP-AES y
el ICP-MS se utilizan por lo general para la detección.
La facilidad adicional del ICP-MS, para determinar los
isótopos estables individuales, se explota en los estudios
metabólicos y en las mediciones de la absorción intestinal.
Las dosis del trazador con un contenido enriquecido de un
isótopo pueden administrarse sin exponer a los sujetos a la
radiactividad en potencia dañina, como ocurre cuando los ra-
dioisótopos se emplean para tal trabajo. En los elementos,
como plomo y estroncio, los isótopos se generan de forma
parcial por el decaimiento radiactivo de otros elementos; los
cocientes entre los isótopos son característicos en diferentes
localizaciones geográficas. A partir de la medición de los
cocientes del isótopo en los materiales biológicos y ambien-
tales, las fuentes de la exposición pueden identificarse.
La XRF no desempeña un papel importante en las
mediciones de los oligoelementos en las investigaciones
clínicas, pero los desarrollos recientes abren algunas po-
sibilidades interesantes. Instrumentos convenientes se
diseñan para utilizarse al analizar tejidos próximos a las
superficies más externas del cuerpo, tales como los huesos
en la rodilla, los dedos y el cráneo. Las mediciones in vivo
del plomo se han emprendido para determinar las exposi-
ciones acumulativas en los trabajadores del plomo, y para
investigar la remoción desde las reservas del hueso dentro
de la circulación durante el embarazo.
Aseguramiento de la calidad
Aparte del análisis real, la contaminación adventicia es el
factor que tiene el impacto más grande en la calidad de
resultados. La contaminación puede ocurrir durante la co-
lecta y el almacenaje de las muestras del procedimiento
preparatorio y de la medición espectrométrica. La aten-
ción escrupulosa en la limpieza y el detalle metodológico
son esenciales para obtener resultados significativos. Los
datos de los esquemas de valoración de la calidad indican
que, mientras algunos laboratorios generales del hospital
obtienen buenos resultados, son los centros especialistas en
oligoelementos los que tienden a mantener los estándares
más altos de funcionamiento. Esta observación refleja la
aplicación continua de prácticas para reducir al mínimo
la contaminación, y su destreza y experiencia en asegurar
el funcionamiento óptimo del equipo. Tales centros tam-
bién acumulan experiencia con los casos clínicos raros y
están bien posicionados para proporcionar la asesoría y la
interpretación.
Debido a la estabilidad de los analitos inorgánicos y la pu-
reza con la cual los materiales estándares pueden prepararse,
hay una cantidad razonable de materiales de referencia dispo-
nibles para emplear en la validación de los métodos y para el
control de calidad interno y externo. A diferencia de muchos
otros procedimientos clínicos de laboratorio, y en parte como
una consecuencia del uso amplio de los materiales de refe-
rencia certificados, la exactitud es un concepto directo y no se
define en el contexto de metodologías particulares.
Conclusiones
Con las mejoras recientes en la confiabilidad del equipo y
su desarrollo para reducir las interferencias, la ETAAS y el
ICP-MS son las técnicas más convenientes para la medición
de los minerales y de los oligoelementos en las muestras
clínicas. Para ciertas aplicaciones específicas las AES, AFS
y XRF son en particular adecuadas. La importancia clínica
de la fotometría de flama disminuye con la introducción de
los electrodos selectivos de ion sodio y potasio.
La descripción de los principios de las técnicas espec-
trométricas atómicas y los considerables detalles de la ins-
trumentación y las aplicaciones se encuentran en muchos
libros de texto (p. ej., Haswell, 1991; Sneddon, 2002). Una
fuente de información valiosa que describe los desarrollos
 REFERENCIAS
actuales en la espectrometría atómica analítica para los ma-
teriales biológicos y clínicos, los alimentos y las bebidas se
da en una revisión anual, por parte del Atomic Spectrome-
try Update (Taylor et al., 2003).
Referencias
Baldwin DR, Marshall WJ. Heavy metal poisoning and its labora-
tory investigation. Ann Clin Biochem, 1999; 36: 401-407
Haswell S (ed.). Atomic Absorption Spectrometry. Theory, Design
and Applications 1991: Elsevier, Amsterdam.
415
Sneddon J (ed.). Advances in Atomic Spectroscopy, vol. 7, 2002;
Elsevier, Amsterdam.
Taylor A. Detection and monitoring of disorders of essential trace
elements. Ann Clin Biochem 1996; 33: 486-510.
Taylor A, Branch S, Halls DJ, Patriarca M, White M. ASU: clini-
cal and biological materials, foods and beverages. J Anal Atom
Spectrom 2004; 19, 505-556.
Walker AW (ed.). SAS trace element laboratories. In Clinical and
Analytical Handbook, 3rd edn. 1997: Royal Surrey County
Hospital, Guildford, UK.
 43
Técnicas químicas de reactivo seco
JA Schroeder, JC Osypiw y GS Challand
Introducción
Química del reactivo seco, química de la capa fina, química
de la tira reactiva y química analítica de soporte sólido son
sinónimos. Describen técnicas basadas sobre la incorpora-
ción de uno o más reactivo químicos en una unidad portátil
conveniente, que se puede entonces utilizar para realizar
análisis químicos sin la necesidad de preparar y transpor-
tar reactivos en forma líquida. El ejemplo probablemente
más antiguo y familiar es el papel tornasol, que todavía se
emplea en las aulas de química de la escuela, laboratorios
analíticos y en el campo para comprobar el pH del suelo.
Se elabora incorporando un pigmento vegetal derivado del
musgo (descrito primero en inglés en 1502) en los intersti-
cios entre las fibras de celulosa del papel; fue utilizado por
Peacham para colorear el papel azul en 1606 (OED, 1989)
y es probable que se haya usado como indicador (“la prue-
ba ácida”) por lo menos durante 300 años.
Un estímulo profundo al desarrollo de las técnicas quí-
micas de la capa fina fue la invención de la fotografía. La
propiedad de los haluros de plata para cambiar de color al
exponerse a la luz, la observa por primera vez Fabricius en
1556, y las fotografías en su fase temprana pudo haberlas
producido Schultze en 1727 (Stenger, 1939). Las primeras
películas y papeles fotográficos prácticos se desarrollaron
en el siglo xix, y hoy una película instantánea moderna
de impresión a color puede tener hasta 15 capas discretas,
cada una incluyendo una reacción química o una función
física distintas, incorporadas en una sola unidad, estable y
portátil.
La primera aplicación de estas técnicas en la bioquímica
clínica aparece a mediados de la década de 1950, con el de-
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
sarrollo de las tiras reactivas para medir la glucosa en orina
(Adams y cols., 1957). Un analista, enfermera o paciente
comparativamente inexpertos podrían sumergir la tira reac-
tiva dentro de una muestra de orina, y dentro de un par de
minutos podrían obtener una medición semicuantitativa
de la concentración de glucosa comparando el color desa-
rrollado por la tira con un patrón de color impreso. Esto,
junto con la aplicación subsiguiente de tecnología simi-
lar al análisis de la glucosa sanguínea (Marks y Dawson,
1965), revoluciona la vigilancia en pacientes diabéticos.
La cuantificación exacta se mejora con el desarrollo de
fotómetros simples al medir la luz reflejada mediante la
lectura de tiras reactivas para la glucosa sanguínea (Maz-
zaferri y cols. 1970), llamadas medidores de glucosa, y con
otros progresos importantes que ocurrieron en la década de
1970, cuando la tecnología de la fabricación de la película
fotográfica se aplica a los análisis de la química clínica.
Hoy, centenares de análisis están disponibles en formato
de película fina, y se han desarrollado máquinas capaces de
medir colores u otras señales de una amplia gama de tiras
reactivas y de producir un resultado exacto y preciso en
segundos.
La tecnología tiene el potencial para revolucionar la
práctica de la química clínica, tanto en la reducción del
requerimiento para las habilidades analíticas tradicionales
en análisis comunes, como en la capacidad para que és-
tos se realicen simple y rápidamente fuera de un labora-
torio analítico, por ejemplo, en consultorios o clínicas, en
las oficinas del médico de cabecera y en el propio hogar
del paciente. Walter y Boguslawski (1988) han revisado el
campo de estudio y han descrito la gama y la tecnología de
los análisis disponibles.
418 CAP. 43 TÉCNICAS QUÍMICAS DE REACTIVO SECO
Principios de la metodología
En su forma más simple, los análisis químicos de capa fina
consisten de pigmento u otro reactivo atrapado dentro de
las fibras de celulosa de una tira de papel. Éstos producen
una reacción visible cuando un analito se difunde dentro
de la matriz, o en forma líquida, por ejemplo, papel torna-
sol y otros papeles indicadores para la valoración del pH
de un líquido, o en la forma gaseosa, por ejemplo, papel de
hidróxido ferroso para la detección del cianuro de hidróge-
no; papel de bromuro mercúrico para la detección de arsina
(Curry, 1988).
Sistemas más complejos se forman con una serie de ca-
pas (véanse los ejemplos específicos, más adelante), cada
una de las cuales contiene una o más funciones. Básica-
mente, éstas son:
1. Una capa de soporte. Ésta sostiene los elementos del
reactivo seco. Es por lo general plástico delgado, que
puede transmitir o reflejar la luz.
2. Una capa reflexiva. Su propósito es reflejar de nuevo al
ojo o al detector mecánico tanto cuanto sea posible la
luz emitida por el químico de las capas reactivas. Puede
incluirse con la capa de soporte usando un plástico re-
flexivo. Como una alternativa, puede colocarse una capa
de un pigmento, como el dióxido de titanio, o un mate-
rial reflexivo, como una lámina de metal.
3. Una o más capas analíticas. Éstas por lo general con-
sisten de películas delgadas porosas de gelatina en las
cuales uno o más reactivos se han incluido durante la
fabricación de la película. Los reactivos deben perma-
necer estables una vez que la capa de la gelatina se haya
secado. Una sola capa es adecuada cuando los reactivos
incorporados no interactúan uno con otro en ausencia de
un analito. Las capas múltiples (cada una de las cuales
se seca antes que se aplique la siguiente) son necesarias
para separar los reactivos que interactúan recíprocamen-
te en ausencia de un analito. Así es como la gelatina, o
materiales fibrosos como celulosa, pueden emplearse.
Éstos suelen funcionar como filtros (p. ej., separar los
eritrocitos del plasma) o como tamices moleculares,
al separar un producto de reacción de otro. De manera
alterna, los reactivos pueden introducirse sumergiendo
el material fibroso dentro de una solución apropiada, y
secarlos de inmediato.
4. Una capa extendida. Ésta consiste de un material fibro-
so o una membrana. Cuando una gota de la muestra se
aplica, separa muy rápido la muestra hacia fuera, de for-
ma lateral, y permite una difusión uniforme en las capas
analíticas.
Las tiras reactivas complejas requieren de una fabrica-
ción muy exacta, en particular cuando son para las capas
analíticas, en las cuales la concentración de reactivo en la
gelatina, el tamaño del poro de la gelatina, el grueso de cada
capa, y el grado de secado de cada capa deben ser cuidadosa-
mente controlados (Bevan, 1996). Sin embargo, una vez que
está fabricada, cada tira contiene todos los pasos analíticos
requeridos para realizar un ensayo. Ninguna reconstitución
previa de los reactivos se necesita, la tira es portátil y puede
permanecer estable durante semanas o meses, y el analista
sólo necesita aplicar la muestra para comenzar el análisis.
Resultados semicuantitativos pueden obtenerse igualan-
do el color desarrollado, después de un tiempo fijo, con los
patrones de color impresos. Con la luz del día o buena luz
artificial, un analista experimentado con visión normal del
color debe generar resultados dentro de ±25% del valor ver-
dadero. Para reacciones evaluadas por UV o por detección
de fluorescencia, y donde es necesaria una cuantificación
más exacta, se requiere un medidor para evaluar el color
u otra señal. La mayor parte de los químicos del reactivo
seco son vigilados y supervisados por la fotometría reflec-
tante difusa (Kortum, 1969); la fluorescencia frontal (Pesce
y cols., 1971) también puede usarse.
Vigilancia de las reacciones
Puede no ser obvio, con excepción para un artista, fotógrafo
o físico, que las propiedades de la luz reflejada son diferentes
a las de la luz transmitida y absorbida que es muy conocida
por los analistas. Pero los supuestos colores primarios de las
pinturas y de otros pigmentos (rojo, amarillo y azul) no son
iguales que los de la luz transmitida (rojo, amarillo y verde).
En una galería de arte, se mira una pintura de frente, con la
iluminación desde arriba. Si una pintura se ilumina en forma
directa de frente, el colorante y el detalle se pierden al obser-
vador debido a la luz reflejada no coloreada y dispersada de
su superficie. Estas son las leyes de la fotometría reflectante.
Algo de la luz que cae sobre una tira reactiva simple-
mente se refleja en su superficie (reflexión especular).
Puesto que ésta no ha interactuado con cromóforos dentro
de las capas analíticas, tiene las mismas propiedades que la
luz de origen, y no puede usarse para vigilar una reacción.
Parte de luz se incorpora en las capas analíticas e interactúa
con cromóforos antes de regresarse debido a la capa reflec-
tante en la tira. La dispersión y la reflexión de la luz sin la
interacción con cromóforos ocurren también dentro de las
capas analíticas. La luz que regresa después de la transmi-
sión a través de las capas analíticas (reflexión difusa), que
contiene una mezcla de luz interactuada y dispersada, se
utiliza para vigilar una reacción. Ésta se detecta midiendo
la luz que regresa en un ángulo lejos del haz de reflexión
especular principal.
 EJEMPLOS ESPECÍFICOS
Después de la reacción, la concentración del analito en
una muestra puede calcularse comparando la cantidad de
luz difusa reflejada con una estándar. La relación se rige
por la ecuación:
Ru ⫽ Rs · Iu /Is
donde Ru es la reflectividad porcentual de la muestra, Rs es
la reflectividad porcentual del estándar, Iu es la intensidad
de la luz reflejada por la muestra, e Is es la intensidad de la
luz reflejada por el estándar. Las mediciones de la reflec-
tividad porcentual, como la transmitancia, no son lineales
con respecto a la concentración, y en la práctica los algo-
ritmos linearizantes, como los de Williams y de Clapper
(1953), se emplean para convertir una medición de reflecti-
vidad porcentual a concentración.
Los productos fluorescentes de una reacción pueden
vigilarse usando la fluorimetría frontal. Los monocroma-
dores se utilizan para separar la luz fluorescente emitida
por las capas analíticas de luz reflejada. Si la extinción
dentro de la tira reactiva es despreciable, la medición de
la fluorescencia es lineal con respecto a la concentración
del fluoróforo.
Ejemplos específicos
La química del reactivo seco puede utilizarse para medir
muchos centenares de analitos urinarios, metabolitos y pro-
teínas sanguíneos. Algunas mediciones se realizan usando
una capa analítica, otras requieren capas múltiples o incor-
poración de estructuras físicas, o ambas, dentro de las ca-
pas analíticas. Incluso cantidades traza de analitos, como
hormonas y fármacos, pueden medirse utilizando técnicas
de inmunoensayo dentro de las capas analíticas. Los desa-
rrollos más recientes que usan anticuerpos monoclonales y
sistemas de ensayo inmunométricos son de uso rutinario en
la actualidad. La mayor parte de estos ensayos los han desa-
rrollado las compañías comerciales, y las consideraciones de
la patente han forzado el desarrollo de diversas soluciones
para los mismos problemas: por lo común en las uniones de
anticuerpos acoplados a soportes sólidos; y la elección del
reactivo para desarrollar una señal de color final. Una selec-
ción de ejemplos específicos se describe más adelante.
Glucosa
La glucosa fue el primer analito biológico en ser medido
usando las técnicas del reactivo seco (Adams y cols., 1957;
Marks y Dawson, 1965) debido a su presencia en una con-
centración comparativamente alta, la simplicidad relativa
de la reacción usada y su importancia en la vigilancia de
419
Figura 43-1 Estructura de una tira reactiva para glucosa Dex-
trostix® (adaptada de Walter y Boguslaski, 1988).
pacientes con diabetes mellitus. Los métodos modernos de
glucosa confían en los análisis enzimáticos que utilizan por
lo general la enzima glucosa oxidasa. Un ejemplo típico
es la tira reactiva Dextrostix® de tres capas, ilustrada en
la figura 43-1. Una muestra sanguínea se aplica a la capa
superficial, la cual actúa como una capa difusora y mem-
brana semipermeable que separa las células sanguíneas del
plasma. El plasma de la muestra se difunde en la capa ana-
lítica del papel, que contiene el sistema amortiguador de
la reacción enzimática, activada por el agua del plasma.
Dentro de la capa analítica, la glucosa y el oxígeno atmos-
férico reaccionan con la glucosa oxidasa para producir per-
óxido de hidrógeno y ácido glucónico. En presencia de la
peroxidasa, también contenida dentro de la capa analítica,
el peróxido de hidrógeno oxida a un indicador redox para
producir un cambio de color visible. La capa de soporte
plástico también actúa en forma reflexiva, y después de que
las células sanguíneas se retiran de la superficie, el color
desarrollado puede leerse en la parte superior, en forma vi-
sual (comparando con un patrón de color impreso) o usan-
do un medidor de glucosa.
Se han desarrollado muchas alternativas de esta tira
reactiva simple para la glucosa, por ejemplo, la tira de
Fuji® (Kobyashi y cols., 1982) incorpora una capa enmas-
caradora y reflexiva que contiene el pigmento blanco dióxi-
do de titanio entre las capas dispersora y analítica. La capa
de soporte es transparente, en lugar de plástico reflexivo, y
el cambio del color se lee de la parte inferior. Esto elimina
la necesidad de retirar las células sanguíneas de la tira.
Alanina aminotransferasa
Muchas enzimas plasmáticas pueden medirse usando
técnicas de reactivo seco, aunque los sistemas analíticos
son más sofisticados, porque las enzimas son moléculas
grandes que no se difunden fácilmente a través de matri-
ces. También, en la medición enzimática se confía con fre-
cuencia en reacciones multietapas que son en sí mismas
enzimáticas. El control de fabricación cuidadoso tanto de
420 CAP. 43 TÉCNICAS QUÍMICAS DE REACTIVO SECO
Figura 43-2 Estructura de una tira reactiva de creatinina Vitros.
los reactivos enzimáticos como de otros reactivos partici-
pantes, como los cofactores, es por consiguiente necesario.
Algunas capas del reactivo seco para el análisis enzimático
tienen entretejidos abiertos que permiten que las enzimas
del suero se incorporen en las capas de una tira reactiva,
por ejemplo, Walter y cols. (1983a, 1983b), mientras que
otros han cerrado los entretejidos que retienen las enzimas
sobre la capa superficial de una laminilla.
Un ejemplo típico de un sistema de entretejido cerrado es
el método de Vitros (antes Ektachem®) (Eastman Kodak Co.,
1992) para la alanina aminotransferasa (ALT). La capa dis-
persante, que es semipermeable y conserva la enzima sérica,
también contiene sustratos de ALT de L-alanina y ␣-oxogluta-
rato de sodio. La ALT cataliza la transferencia de un grupo
amino desde la L-alanina a la ␣-oxoglutarato para producir
piruvato y glutamato. Los reactivos sin cambio y los pro-
ductos de reacción se difunden dentro de la capa analítica,
que contiene la lactato deshidrogenasa (LDH) y NADH. El
piruvato que produce la ALT en la muestra reacciona con la
LDH para producir lactato, mientras la NADH se convierte
a NAD⫹. El cambio de absorbancia a 340 nm se mide desde
la parte inferior usando la fotometría reflectante.
En este sistema, la capa dispersante también se utiliza para
iniciar la reacción, y la actividad de la ALT puede medirse
sin la misma enzima incorporando la capa analítica tradicio-
nal. Aunque el piruvato en la muestra puede participar por sí
mismo en la reacción, la concentración normal en el suero es
demasiado baja para causar interferencia significativa.
Creatinina
La creatinina del suero se mide usando una laminilla de
varias capas que tenga un dispersante interno (Sunberg y
cols., 1983). La estructura de una típica tira reactiva se
muestra en la figura 43-2.
Para esta tira, la capa dispersante contiene dióxido de ti-
tanio, que permite que también sirva como capa reflectante.
Cuando se aplica el suero, la creatinina se incorpora a la pri-
mera capa analítica. Aquí, el amoniaco se produce a partir
de la creatinina por la enzima específica creatinina imino-
hidrolasa, la cual está incorporada dentro de la capa. La
membrana permeable al gas en la parte inferior de la pri-
mera capa analítica permite que el amoniaco se difunda
en la segunda capa analítica, pero los componentes como
amortiguadores y iones hidroxilo, que podrían interferir
con la reacción subsiguiente, no pueden atravesar la mem-
brana y son atrapados en la primera capa analítica. La se-
gunda capa contiene un indicador, el azul de bromofenol,
que cambia de color en respuesta al amoniaco. Visto desde
la parte inferior, el cambio de color del azul de bromofenol
puede relacionarse con la concentración de la creatinina. El
amoniaco puede interferir, pero la concentración en suero
es, por lo general, demasiado baja para aportar resultados
erróneos.
Potasio
Los electrólitos pueden medirse usando electrodos ion-se-
lectivos (cap. 40) elaborados como tira reactiva. En un tí-
pico electrodo ion-selectivo, una membrana eléctricamente
conductora separa la muestra de una solución interna de
composición constante. Una diferencia en la concentración
produce un gradiente electroquímico a través de la mem-
brana, que produce una diferencia potenciométrica. Un
electrodo de referencia interno, normalmente plata/cloruro
de plata, también se sumerge en la solución llenadora. El
 EJEMPLOS ESPECÍFICOS
Figura 43-3 Estructura de una tira de electrodo selectivo a iones de potasio Vitros
cambio en el potencial en el electrodo de referencia interno
se mide comparándolo con un electrodo de referencia ex-
terno (Russell y Buckley, 1988).
La figura 43-3 muestra la estructura de una tira reactiva
del electrodo ion selectivo Vitros. Como en un electrodo
ion selectivo convencional, la concentración de un ion se
mide por la diferencia potenciométrica entre dos electro-
dos; el puente forma una unión líquida estable que conecta
dos electrodos. Al contrario de un electrodo ion selectivo
convencional, una solución de composición conocida se
aplica al segundo electrodo (de referencia externa), así que
la muestra se refiere directamente a una solución estándar.
Diversos iones se miden empleando diferentes membranas
selectivas a los iones. Para la medición del potasio, cada
electrodo incluye una película hidrofóbica que contiene
una alta concentración de valinomicina. Ésta permite el
paso de los iones del potasio pero excluye otros cationes y
aniones. Una diferencia potenciométrica, entonces, refleja
cualquier diferencia en la concentración de potasio entre la
muestra y la solución estándar.
Los iones potasio también pueden medirse usando una
química del reactivo seco más convencional. La capa ana-
lítica contiene una fase orgánica hidrofóbica, que excluye
todos los iones excepto aquellos cuyo pasaje es mediado
por un ionóforo, como la valinomicina para el potasio. El
ionóforo media el intercambio de catión H+ entre las fases
acuosa (muestra) y orgánica. El cambio resultante en el pH
dentro de la fase orgánica modifica el color de un coloran-
te redox incorporado dentro de la capa analítica (Charlton
y cols., 1982). Un acercamiento similar también se utiliza
para la medición de la “gravedad específica” en tiras reac-
tivas para el análisis de la orina, en la actualidad una medi-
ción de la actividad iónica total.
421
Gonadotropina coriónica humana
Es probable que las tiras de la química del reactivo seco
más usadas sean aquellas que miden la gonadotropina co-
riónica humana (HCG). Diseñadas para la lectura visual
y disponibles para venta al público, pueden ser bastante
sensibles para permitir el diagnóstico del embarazo unos
días después de la concepción.
Las técnicas clásicas para la medición de las cantidades
traza de hormonas como la HCG confiaron en las técnicas
de inmunoensayo que se desarrollaron en la década de 1960.
Tales técnicas, que confiaban en cantidades limitadas de un
anticuerpo y en una diferenciación posterior entre antígenos
ligados y libres, se adaptaron para la metodología de capa
fina. La estructura de un formato típico para la medición hor-
monal, el ensayo de la tiroxina sérica total, se muestra en la
figura 43-4 (Nagatoma y cols., 1981). La primera capa ana-
lítica incorpora la tiroxina marcada con peroxidasa, la cual
se transporta con la tiroxina sérica dentro de la segunda capa
analítica. Esta última consiste de un anticuerpo para la ti-
roxina, covalentemente unido a la matriz. La difusión de la
muestra, a través de esta capa, proporciona la repartición
entre la tiroxina en la muestra y la tiroxina marcada con pe-
roxidasa: cuanto mayor es la concentración de la tiroxina en
la anterior, más baja resulta la concentración de la tiroxina
marcada con peroxidasa que está unida, y más grande es
la concentración de la tiroxina marcada con peroxidasa libre
que está disponible para difundir a través de la tercera capa
analítica (que contiene la glucosa) y dentro de la cuarta, que
incorpora la glucosa oxidasa para generar peróxido de hi-
drógeno a partir de la glucosa y del oxígeno atmosférico.
La peroxidasa de la tiroxina marcada con peroxidasa libre
entonces cataliza la oxidación de un colorante redox, que
422 CAP. 43 TÉCNICAS QUÍMICAS DE REACTIVO SECO
Figura 43-4 Estructura de una tira reactiva de tiroxina Fuji®.
produce un cambio de color proporcional a la cantidad del
marcador libre, que a su vez se relaciona con la cantidad de
tiroxina en la muestra original.
Tales tiras reactivas son complejas para fabricar, y porque
las técnicas de inmunoensayo clásicas requieren tiempos de
incubación largos, la sensibilidad de estos métodos en for-
matos de reactivo seco (quizás 10 µmol/L) es inadecuada
para detectar cantidades traza de hormonas, como la HCG
en los inicios del embarazo. La mayor parte de los equipos
modernos para prueba del embarazo analizan la orina utili-
zando técnicas inmunométricas, en las cuales un exceso de
anticuerpo está presente y donde los tiempos cortos de incu-
bación son posibles. Las primeras versiones emplearon una
mezcla de técnicas con reactivos húmedos y secos. Aquí un
anticuerpo monoclonal para la subunidad ␣ de HCG estaba
covalentemente unido a una matriz. La muestra se agrega-
ba primero; cualquier HCG se presentaba vinculada a la
matriz unida al anticuerpo. Una solución que contenía un
anticuerpo marcado enzimáticamente para la subunidad ␤
de HCG se añadía e incubaba durante un tiempo corto, per-
mitiendo la interacción en la cual la HCG intacta se inter-
calaba entre el anticuerpo ligado a la matriz y el marcado.
Después de adicionar una solución amortiguadora para lavar
la muestra sobrante y el anticuerpo marcado enzimáticamen-
te libre de la tira, una tercera solución se añadía, conteniendo
un sustrato del colorante para el marcador enzimático que
generaba un producto coloreado. En ausencia de HCG en
la muestra para formar el emparedado, no se desarrollaba
ningún producto coloreado unido a la matriz. Un control
positivo conveniente para la reacción podría incorporarse
uniendo a un área de la tira el primer anticuerpo que ya había
reaccionado con la HCG intacta. Esta área de la tira entonces
daba una reacción positiva, incluso en ausencia de HCG en
la muestra original.
Versiones más recientes de la tecnología del ensayo in-
munométrico incluyen todos los componentes de las reac-
ciones del anticuerpo monoclonal en un formato de reac-
tivo seco. Algunas han utilizado técnicas de aglutinación
de partículas, confiando en la capacidad de las partículas,
como aquellas que contienen un solenoide de oro, para
el cambio de color cuando se combinan en presencia de
la HCG. Otras han confiado en una región del anticuerpo
inmovilizado de la HCG unido covalentemente a una tira
reactiva. La orina (que viaja a lo largo de la tira y no a tra-
vés de ella) moviliza las partículas teñidas amortiguadas y
ligadas a un anticuerpo diferente de la HCG. En presencia
de la HCG en la muestra de orina, éstas forman un empa-
redado y producen una región coloreada discreta sobre el
anticuerpo inmovilizado. Una vez más, un control positivo
puede incorporarse dentro de la tira incluyendo una región
del anticuerpo inmovilizado todavía unido a la HCG.
Troponina T cardiaca
La troponina T, llamada marcador cardiaco, es muy emplea-
da en la actualidad para “confirmar” o “descartar” el infarto
del miocardio en pacientes que presentan dolor de pecho
(Collinson y cols., 2001). Debido a la velocidad con la cual
se obtienen los resultados y la facilidad para usar en el lugar
de atención, las técnicas químicas de capa fina se han adop-
tado ampliamente para su medición. Un ejemplo típico es
el inmunoensayo GLORIATM desarrollado por Roche, que
utiliza sangre entera. En este inmunoensayo la capa que se
separa de la fibra de vidrio atrapa las células sanguíneas.
Dos anticuerpos monoclonales para diferentes sitios de la
troponina T se incluyen en la primera capa analítica. Uno
de estos anticuerpos se conjuga con la biotina, el otro, con
las partículas de oro. Los anticuerpos forman un complejo
en presencia de la troponina T. La segunda capa analítica
contiene estreptavidina ligada al soporte, que se une con
la biotina y entonces inmoviliza cualquier complejo de la
troponina T. La acumulación de las partículas del oro en el
complejo de la troponina T causa la formación de un color
púrpura, que puede evaluarse visualmente o usando un me-
didor de la reflexión (Wilding y Ciaverelli, 1999).
Abuso de fármacos
El “urinálisis”, el uso de una sola tira reactiva para medir
diferentes componentes urinarios, se ha usado por varias
décadas. La selección de diversas químicas para usar en
tales tiras reactivas se ha regido más por realización técnica
 CONTROL DE CALIDAD DE LA QUÍMICA DE REACTIVO SECO
que por utilidad clínica: un buen ejemplo es la incorpora-
ción de un soporte de la reacción sensible a la bilirrubina
dentro de tales multitiras. Aunque todavía se utilizan mu-
cho, su utilidad clínica dentro de un ambiente hospitalario
es polémica (NICE, 2003).
Una aplicación moderna de tal tecnología multitira ocu-
rre en el desarrollo de sistemas para la detección de fárma-
cos adictivos en la orina. Una fuerza impulsora importante
en la detección son los requerimientos para evaluar asun-
tos de preempleo o durante el empleo en un rango muy
amplio de situaciones. Tales sistemas también se usan en
departamentos de accidentes y de urgencia hospitalarios,
sobre todo en evaluar la presencia de fármacos adicti-
vos, que contribuyen a una conciencia mental alterada. Mu-
chas variantes de la tecnología existen, pero todas utilizan
dos anticuerpos monoclonales, como base, para cada fár-
maco o grupo de fármacos; uno de ellos es capaz de unirse
a un soporte sólido, y el otro, de generar una señal colorea-
da (Wilding y Ciaverelli, 1999). Un panel típico de fárma-
cos incorporado en una multitira incluye pruebas para los
grupos de fármacos, como barbitúricos, benzodiazepinas,
narcóticos; aminas simpatomiméticas, como anfetaminas y
antidepresivos tricíclicos; y fármacos o metabolitos especí-
ficos, como cocaína, metadona y tetrahidrocanabinol.
Técnicamente, el desarrollo de esas tiras plantea grandes
problemas. Éstos incluyen minimización de interferencia
por fármacos muy relacionados; asegurar un límite apropia-
do de la sensibilidad aun cuando se enfrente con uno de un
grupo de fármacos, los cuales pueden tener reactividad cru-
zada diferente con el anticuerpo incorporado (el grupo de
la benzodiazepina es un ejemplo obvio); y la diferenciación
entre fármacos recetados o prescritos y fármacos adictivos
(p. ej., seudoefedrina y anfetamina). Incluso con controles
positivos y negativos incorporados, tales tiras pueden ser
leídas en forma errónea, en particular cuando son utilizadas
por personal inexperto o sin experiencia en instalaciones
alejadas de un laboratorio analítico. Después de encontrar
un resultado positivo por este procedimiento de tamizaje
debe continuarse con la verificación mediante otro método
independiente (Wilding y Ciaverelli, 1999).
Control de calidad de la química
de reactivo seco
El control de calidad de los resultados dados por las tiras
reactivas plantea problemas diferentes a aquellos del aná-
lisis de la química húmeda tradicionales. Para la última,
pueden elaborarse reactivos nuevos, y las concentraciones
del reactivo usadas en el análisis puede modificarlas el ana-
lista. Es, por tanto, fácil cambiar los ingredientes del
análisis en respuesta al desempeño inaceptable. Pero las
tiras reactivas secas no puede modificarlas el analista, y
423
rara vez es obvio a partir de la inspección de la propia tira,
que el desempeño analítico sea inaceptable. Un problema
importante para el control de calidad, por tanto, es la iden-
tificación del desempeño pobre y la determinación de su
causa. En la práctica, la causa rara vez es la propia tira
reactiva.
Para el fabricante y el analista, las químicas del reactivo
seco plantean otro problema, porque la estabilidad a largo
plazo de cada lote de tiras puede predecirse sólo a partir de
la estabilidad de lotes anteriores. En la práctica, existe cier-
ta variación de lote a lote en la estabilidad, aun cuando tiras
reactivas se almacenan en condiciones ideales. Como parte
de un programa para el control de calidad es necesario, por
tanto, supervisar tendencias a largo plazo en el desempeño,
para poder tomar la acción apropiada antes de que el con-
trol de calidad llegue a ser inaceptable.
Identificación del desempeño inaceptable:
ensayos semi-cuantitativos adicionales de laboratorio
En la actualidad, el área principal del uso clínico para la
utilización del reactivo seco semicuantitativo es la com-
probación de la orina. Una amplia gama de tiras reactivas
está disponible; en ellas pueden incluirse simplemente un
analito (p. ej., para glucosa o proteína), o una diversidad
de analitos, los colores de cada soporte del reactivo que tie-
nen que igualarse visualmente dentro de una secuencia de
tiempo estricta con un patrón de color impresa (fig. 43-5).
Aunque los ensayos semicuantitativos para la glucosa san-
guínea se han reemplazado en gran parte por el uso de tiras
reactivas leídas en los medidores de glucosa sanguínea, es-
tos ensayos plantean problemas similares para el control de
calidad. Además, se han introducido muchas pruebas nue-
vas de las tiras reactivas de laboratorio adicionales, desde
la medición de fracciones de lípidos de sangre entera has-
ta la detección de fármacos adictivos en orina o saliva. Es-
tos ensayos semicuantitativos pueden realizarse en diversos
sitios: consultorios, clínicas, prácticas clínicas primarias,
escuelas y el hogar. Poca atención se presta al desempeño,
debido a que existe una creencia extendida que tales en-
sayos son seguros, y en una instalación hospitalaria están
delegados con frecuencia al miembro más subordinado del
personal del consultorio, que puede carecer de experiencia
en la química analítica y sin ningún entrenamiento.
La primera inspección del desempeño de los análisis
de orina en las salas hospitalarias (Challand, 1987) mostró
que el resultado correcto (es decir igualando el soporte del
color correcto) sólo se obtuvo en casi 50% de los análisis.
Alrededor de 5% de todas las mediciones dieron valores
absurdos incorrectos. Hallazgos similares se han obtenido
en estudios posteriores a partir de diferentes situaciones.
424 CAP. 43 TÉCNICAS QUÍMICAS DE REACTIVO SECO

Figura 43-5 Patrón de color impreso para una tira reactiva de análisis urinario de Bayer Multistix® 8SG. Reproducida con el permiso
de Bayer Health Care, LLC.
 CONTROL DE CALIDAD DE LA QUÍMICA DE REACTIVO SECO
Figura 43-6 Sesgo en ensayos de la tira reactiva de proteína en
orina. Seis muestras de orina prepreparadas con concentraciones
proteicas correspondientes a un bloque de color diferente fueron
distribuidas “a ciegas” a 11 enfermeras analistas. La figura com-
para concentraciones proteicas con el número de analistas que
reportan cada bloque de color. Así como en la dispersión prevista
de los resultados existe un sesgo sistemático, los analistas tienden
a subestimar la concentración verdadera de la proteína con un
bloque de color.
Con ensayos cuantitativos, es comparativamente fácil
definir el desempeño numérico aceptable, o en términos de
realización analítica [la aproximación de la mayor parte de
los esquemas del aseguramiento de la calidad (QA) exter-
no] o en términos de utilidad clínica (Fraser y cols., 1993,
1997). Los ensayos semicuantitativos no se prestan a un
acercamiento numérico fácil. No es posible utilizar el valor
medio obtenido de las distribuciones de QA como la mejor
estimación del valor verdadero porque éste tiene con fre-
cuencia un sesgo introducido por la aproximación a igualar
el color más cercano o por deficiencias en la técnica (fig.
43-6). Las muestras distribuidas como parte de una inspec-
ción o de un programa de QA son, por tanto, en general
sintéticas, con componentes ponderados que definen el va-
lor verdadero (aunque esto es difícil para algunos analitos,
como bilirrubina o eritrocitos). Cuando el valor pondera-
do corresponde a la concentración requerida para igualar
exactamente un bloque de color impreso para cada analito,
en la práctica sólo cerca de la mitad de quienes realizan el
análisis logra la igualación correcta; casi 95% alcanza una
igualación dentro de un bloque de color en forma correcta.
Los resultados fuera de este rango se consideran un des-
empeño inaceptable. Un acercamiento alternativo es pon-
425
Cuadro 43-1 Algunas causas identificadas del pobre desem-
peño en la realización de ensayos manuales con tira reactiva
• Uso de tiras reactivas caducas
• Almacenamiento de tiras reactivas en condiciones que
acortan la vida media
• Retiro de la tapa del envase de la tira, o eliminación del
desecante
• Cortar la tira por la mitad para ahorrar dinero
• Usar un recipiente inadecuado para la muestra (p. ej., un
recipiente blanqueado para una muestra urinaria)
• Error al sumergir la tira completa reactiva para orina en la
muestra
• Muestra insuficiente aplicada a la tira reactiva para sangre
• Realizar la prueba a una temperatura incorrecta
• Lectura del soporte de color demasiado pronto, o demasiado
tarde
• Lectura del soporte de color equivocado sobre una tira
reactiva multianalito
• Condiciones insuficientes de iluminación
• Visión defectuosa del analista sobre el color
• Transcripción errónea de un resultado en la forma del
informe
• Uso de unidades incorrectas al informar
derar cantidades de componentes que produzcan un color
intermedio entre dos bloques del color. Los resultados que
correspondan a cualquiera de los dos bloques adyacen-
tes del color se consideran aceptables; en encuestas en el
consultorio, 10 a 20% de las entregas son inaceptables por
un criterio muy escaso (Tighe P, comunicación personal).
Cuando se identifica el desempeño inaceptable, se requiere
encontrar la causa; algunas de las posibles causas se enu-
meran en el cuadro 43-1. Casi todas se deben a deficien-
cias en la comprensión, en el entrenamiento, o en la técnica
(las cuales pueden remediarse de manera local). Es raro
que la causa se deba a deficiencias en la fabricación de la
tira reactiva, aunque debe mencionarse que las demandas
exageradas para la exactitud probable de estas tiras en la
comprobación en el lugar de atención son hechas a veces
por los fabricantes.
Valoración de las tendencias a largo plazo,
ensayos cuantitativos
Los instrumentos automáticos que usan el análisis quí-
mico de reactivo seco han estado disponibles por varios
años. Éstos pueden realizar muchos análisis diferentes so-
bre cantidades pequeñas de suero, con una productividad
y precisión de estudio que igualan a los analizadores más
tradicionales de química húmeda. Las laminillas reactivas
426 CAP. 43 TÉCNICAS QUÍMICAS DE REACTIVO SECO

se compran en suficientes lotes únicos para seis meses.

Si se almacenan en condiciones ideales, cada lote puede
necesitar de una simple calibración antes de usarse; la es-
tabilidad, que es bastante buena, mantiene la calidad du-
rante la vida media del lote. Sin embargo, en la práctica,
las condiciones de almacenaje pueden no ser las ideales
(la diferencia de temperatura entre el piso y el techo de
una cámara fría, en ocasiones es suficiente para cambiar la
estabilidad) y el deterioro muy lento de las tiras reactivas
no es idéntico de lote a lote. El control de calidad, por tan-
to, está dirigido a asegurar que la calibración inicial sea la
adecuada, y vigilar el desvío lento para identificar el punto
en el cual se requiere una segunda calibración, o qué lami-
nillas sin usar deben desecharse.
Los sueros convencionales para el control de calidad
(QC) pueden utilizarse para ambos propósitos, pero sobre-
llevan desventajas. Son costosos los efectos de la matriz,
en particular los relacionados con la viscosidad y con la
difusión siguiente a través de las capas de una laminilla;
pueden provocar que su comportamiento sea diferente en
las muestras de los pacientes, y los resultados para algu-
nos analitos cambiar de manera notable en las primeras Figura 43-7 Promedios diarios de pacientes, análisis de sodio.
horas posteriores a la reconstitución. Los resultados que La grafica muestra valores promedio diarios sucesivos para los
se obtienen de muestras de pacientes pueden proporcionar análisis de sodio sérico realizados empleando un analizador Vi-
información QC más confiable. Aunque dichos resultados tros después de la calibración. Una caída en los resultados es
están obviamente más dispersos que los de un suero QC evidente, la cual promedia casi 0.04 mmol/L cada día. La recali-
convencional, más datos están disponibles para el análisis bración se realiza después del día 34.
estadístico. Para la mayor parte de los analitos, los paráme-
tros como el resultado del paciente medio (después de la
exclusión de valores extremos) y el número de resultados los análisis de la química de capa fina realizados en el lu-
que caen fuera de un límite preestablecido (como un “lími- gar de atención (Bullock, 1999), y son, es probable, los
te teléfonico” automático para la concentración del sodio más utilizados para los análisis de glucosa sanguínea en
sérico) son suficientemente sensibles y proporcionan casi el consultorio; la participación en tales esquemas ahora se
toda la información QC necesaria. La calibración inicial requiere para la acreditación del laboratorio en el Reino
puede calificarse con la comparabilidad de un promedio Unido (Burnett, 2000).
diario del paciente posterior a las calibraciones previas. Un Las temperaturas de la tira reactiva seca y de la muestra
desvío en el promedio diario puede utilizarse para calificar afectan la velocidad de difusión de la muestra y la veloci-
el punto en el cual la recalibración o las nuevas laminillas dad de reacción dentro de la tira, por ello el buen control de
son necesarias. La figura 43-7 muestra una gráfica del pro- la temperatura es esencial. El funcionamiento global, según
medio diario del paciente para los análisis del sodio sérico, lo calificado por datos QA externos, de dos analizadores de
mostrando la recalibración antes y después del periodo. la tira reactiva en un periodo de dos años se muestra en la
La estadística para el control de calidad con base en figura 43-8. El control de temperatura en el laboratorio en
muestras de pacientes puede emplearse para asegurar la el cual estaban situados fue menor que el ideal, y su dete-
comparabilidad a largo plazo de los resultados dentro de rioro en los meses cálidos del verano es obvio.
un laboratorio, pero no se asegura que los resultados sean Los analizadores automáticos, usando la química del
comparables con aquellos producidos por otros laborato- reactivo seco y del húmedo, en ocasiones producen resul-
rios. La participación en esquemas externos del asegura- tados aparentemente correctos pero absurdos. Quizá el pre-
miento de la calidad puede aportar esta información, y dar dominio de éstos sea < 0.2%. Analizando todas las muestras
información más confiable que, por ejemplo, los resultados por duplicado, es mínimo; y tales errores pueden detectarse
que se obtienen analizando una muestra por control de ca- sólo comparando los resultados con los previos del mismo
lidad de composición conocida. Los esquemas externos del paciente o estando alertas para detectar discrepancias entre
aseguramiento de la calidad están disponibles ahora para los resultados y la información clínica provista.
 RESUMEN
Figura 43-8 Resultados QA externos globales: tendencias estacionales. Puntaje del índice de variación del funcionamiento promedio
global (OMRVIS, un índice de imprecisión) para dos analizadores Vitros idénticos ubicados en el mismo laboratorio sobre un periodo de
dos años. La precisión en los meses de verano es deficiente en comparación con los meses de invierno, debido tal vez al control inade-
cuado de la temperatura en el laboratorio.
Resumen
La tecnología de la química del reactivo seco en la actuali-
dad ha avanzado al punto en el cual casi todos los análisis
convencionales de la química clínica con reactivos líquidos
se pueden reproducir en formato del reactivo seco. Aun-
que los costos del reactivo son por lo general más altos
para el último, ofrece ventajas importantes. Los volúmenes
de muestra son bajos, las sensibilidades comparables con
las técnicas convencionales, la precisión puede ser por lo
menos buena, las técnicas son rápidas y confiables, y reali-
zarlas requiere poca destreza analítica específica; por tanto,
son apropiadas en un laboratorio de química clínica, don-
de su uso libera los recursos técnicos y científicos escasos
para el desarrollo de nuevos ensayos y de nuevas técnicas.
También se adaptan con facilidad a un ambiente cercano al
paciente, por ejemplo, dentro de las aulas, en clínicas, en
asistencia primaria y para que los usen los pacientes.
A pesar de su evidente simplicidad, esta tecnología no es
segura. Sin una atención cuidadosa que asegure la identidad
del paciente, la conveniencia de la muestra, el procedimien-
to correcto del análisis, incluyendo coordinación, tempera-
tura y control de calidad, y el registro exacto y apropiado
de la reacción, los análisis pueden proporcionar resultados
engañosos. Con una utilización cada vez más amplia de la
tecnología, existen beneficios importantes para el paciente
427
y para el médico en la velocidad con que los resultados pue-
den obtenerse. El desafío para el fabricante es el desarrollo
continuo, no sólo en introducir nuevos análisis sino también
en la simplificación de los actuales al verificar que son tan
exactos y tan libres de interferencias como sea posible. El
desafío para el laboratorio analítico consiste en asegurar
que dondequiera que esta tecnología se utilice, el analista
está entrenado en los procedimientos analíticos apropiados
y educado para estar consciente tanto de las fortalezas como
de las limitaciones de la técnica.
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 44
Técnicas de separación
Roy Sherwood
¿Por qué separar?
La mayor parte de los análisis que se realizan en labora-
torios clínicos implican la detección y cuantificación de
los compuestos individuales en fluidos corporales, por lo
común en sangre u orina. Para este propósito, se utilizan
métodos químicos o inmunológicos específicos en el com-
puesto de interés. Si bien tales ensayos explican la mayor
parte de los análisis en el laboratorio clínico, a veces una
familia de compuestos muy relacionados requiere una me-
dición. Aunque ensayos específicos podrían desarrollarse
para cada compuesto del grupo familiar, este acercamiento
no es con frecuencia económico o en la práctica es menos
viable que usar una técnica que pueda separar y cuantificar
todos los compuestos de manera simultánea. Una variedad
amplia de técnicas de separación se utiliza en los laborato-
rios clínicos, pero casi siempre se basa en el principio de
la separación cromatográfica o electroforética. La croma-
tografía en todas sus variantes, por ejemplo, de capa fina
(TLC), de alto rendimiento (HPLC) o la gaseosa (GC),
puede utilizarse para separar muchos tipos diferentes de
compuestos desde moléculas pequeñas, como aminoácidos
y fármacos hasta proteínas como la hemoglobina gluco-
silada. La electroforesis, por otra parte, se emplea para la
separación de proteínas, casi cualquier proteína (p. ej., pro-
teínas séricas), o para identificar variantes de una en parti-
cular (p. ej., variantes heredadas de hemoglobina).
Cromatografía
La cromatografía cumplió 100 años en 2003. M.S. Tswett
de la Universidad de Varsovia describió primero el uso de la
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
adsorción para separar los pigmentos de una hoja de planta
en marzo de 1903. El principio de los diferentes tipos de
cromatografía es la interacción de las moléculas de interés
entre una fase móvil (líquida o gaseosa) y una estacionaria
(sólida). Esas moléculas que interactúan con la fase esta-
cionaria se mueven más lento a través de una placa, o de
una columna, que las que no interactúan y, por consiguien-
te, se produce una separación de moléculas desde el inte-
rior de una mezcla. El control de estas interacciones, y por
tanto de la separación, se alcanza explotando las diferen-
cias sutiles de ciertas propiedades físicas de las diferentes
moléculas en las muestras, por ejemplo, su solubilidad en
agua o en solventes orgánicos, la carga neta y el tamaño. El
cuadro 44-1 detalla las propiedades moleculares que rigen
la separación en las diversas formas cromatográficas.
Cromatografía de capa fina (TLC)
Principios
La TLC reemplazó a la cromatografía de papel en la déca-
da de 1960 y en la actualidad se le está sustituyendo en una
gran parte por la HPLC. En la TLC la fase estacionaria (por
lo común alúmina, gel de sílice o celulosa) se fija sobre una
placa de cristal, plástico o metal. Una mezcla solvente (fase
móvil) aplicada a un extremo de la placa viaja a lo largo de
ella por atracción capilar y produce la separación cromato-
gráfica de los solutos en una muestra aplicada a la placa. A
menos que sean fluorescentes, la mayor parte de los com-
puestos requieren la derivación (modificación química)
para que puedan ser visualizados; esto se logra rociando
con, o sumergiendo la placa en, reactivos cromogénicos.
430 CAP. 44 TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
Cuadro 44-1 Propiedades moleculares que gobiernan
la separación dentro de las varias formas cromatográficas
Propiedad Tipo de cromatografía
Propiedades de adsorción TLC, HPLC
Partición GC, HPLC
Interacciones antígeno- Afinidad
anticuerpo o enzima-sustrato
Tamaño y forma molecular Filtración en gel
Carga iónica Intercambio iónico
La información cualitativa puede obtenerse observando
simplemente la placa y la identificación de las manchas
individuales con mediciones del factor de retención (Rf,
distancia recorrida por la muestra dividida por la distancia
total recorrida por el frente del solvente). La mayor resolu-
ción se obtiene corriendo la placa una segunda vez, pero en
la dirección del solvente a 90° de aquella primera corrida
(TLC bidimensional [TLC 2-D]). La desventaja de la TLC
2-D es que sólo una muestra se aplica a cada placa. La
cuantificación requiere el uso de un densitómetro que pue-
da examinar la placa, o la elución de la mancha a partir de
la fase estacionaria seguida por una medición colorimétri-
ca. La TLC 2-D experimenta, sin embargo, un interesante
resurgimiento por los progresos en el campo de los proteó-
micos. Después de la TLC 2-D, el patrón de las manchas
correspondientes a las proteínas individuales se compara
entre los individuos con una enfermedad particular y con
los controles, y las manchas que difieran en intensidad en-
tre los grupos son eluidas de la placa para identificar la
proteína específica implicada.
Aplicaciones
La TLC se utiliza ahora más como una técnica de tamizaje,
ya que es relativamente rápida, económica y fácil respec-
to a otros métodos cromatográficos. Las aplicaciones para
TLC en un laboratorio clínico incluyen ensayos de amino-
ácidos, fármacos y carbohidratos.
Aminoácidos
Los programas de tamizaje neonatal existen en muchos
países para la detección temprana de niños con fenilceto-
nuria. Aunque los métodos espectrofotométricos o HPLC
específicos existen para la fenilalanina, muchos laborato-
rios de tamizaje prefieren utilizar un método TLC 1-D que
separe los aminoácidos básicos, neutros y ácidos, debido
a que este método tiene el potencial para la identificación
de otros desórdenes del aminoácido, por ejemplo, tirosi-
nemia, enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce,
etc. La confirmación de la identidad de un aminoácido
incrementado anormalmente puede conseguirse por TLC
2-D o HPLC, por ejemplo, el patrón característico de los
aminoácidos con cadena ramificada incrementados de for-
ma anormal (leucina, isoleucina y valina) en la enfermedad
de la orina con olor a jarabe de arce. Avances recientes en
la tecnología relacionados con la cromatografía líquida,
en particular en combinación con espectrometría de masa
(LC-MS; véase más adelante), condujeron a una reducción
en el uso de TLC en los programas de tamizaje neonatal.
Fármacos
El tamizaje de fármacos urinarios es complicado por la di-
versidad de fármacos disponibles para uso “recreacional”
o tomados de manera deliberada o accidental en sobredo-
sis, incluyendo compuestos básicos, neutros y ácidos. En
el paciente inconsciente o no cooperativo, poca informa-
ción puede estar disponible sobre el consumo de fármacos
específicos. La TLC es con frecuencia la técnica elegida
para el tamizaje inicial, y sistemas comerciales, por ejem-
plo, Toxilab®, están disponibles. Éstos tienden a tener pla-
cas separadas y sistemas de solventes para fármacos ácidos
y básicos, incluidos los neutros en cualesquiera de los sis-
temas. La nebulización secuencial de diversos reactivos
cromogénicos produce colores diferentes que tiñen a los
diferentes fármacos, permitiendo así una identificación
más sencilla. En años recientes, sin embargo, surge un
movimiento significativo que se dirige a emplear inmu-
noensayos enzimáticos en analizadores automáticos para
el tamizaje de primera línea de fármacos adictivos.
Carbohidratos
La TLC es la técnica elegida para el tamizaje inicial de
muestras de orina o fecales de infantes sintomáticos con
desórdenes metabólicos de carbohidratos, por ejemplo,
fructosuria, etc. Sólo se requieren resultados cualitativos
para esta aplicación, pero el desarrollo de pruebas para la
función y la integridad del tracto gastrointestinal que usan
azúcares administrados por vía oral crea la necesidad de
una TLC cuantitativa de los azúcares. Ocurre, por ejemplo,
cuando se emplea una mezcla de mono y disacáridos (xi-
losa, ramnosa, 3-o-metilglucosa y lactulosa), que cruzan la
pared del tracto gastrointestinal vía diversos mecanismos,
para evaluar la permeabilidad del intestino por el diagnósti-
co diferencial de la enfermedad del tracto gastrointestinal.
La reducción de la superficie intestinal disponible para la
absorción (p. ej., enfermedad celiaca) conduce a una re-
ducción progresiva en la absorción intestinal de monosacá-
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
ridos, mientras el daño a la integridad de la pared intestinal
(p. ej., enfermedad de Crohn) se perfila como un aumento
en la absorción de disacáridos.
Cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC)
Principios
La HPLC es la forma más común de cromatografía que se
emplea en el laboratorio clínico. Un mejor funcionamiento
se logra al contener la fase sólida en columnas estrechas
(de 150 ⫻ 5 mm) y bombeando la fase móvil a través de la
columna bajo presión (de 1.5 a 2.0 ⫻ presión atmosférica).
Aunque los mecanismos de intercambio iónico o de exclu-
sión por tamaño de separación se utilizan de cuando en
cuando en la HPLC, la mayor parte de los métodos se basa
en la adsorción de las moléculas en la fase sólida. En la
HPLC, en fase normal, los grupos de enlace hidrófilos sobre
la superficie de un material de embalaje de silicona atraen
moléculas hidrofílicas pero no hidrofóbicas, lo contrario es
verdad para HPLC en fase inversa. Así, en la HPLC en fase
normal una fase móvil de polaridad incrementada remueve
con más eficacia moléculas polares de la fase sólida, mien-
tras en la HPLC en fase inversa las fases móviles (orgáni-
cas) remueven más rápido moléculas no polares de la fase
sólida. La HPLC en fase inversa, por tanto, favorece la se-
paración de las moléculas neutras, que predominan en los
fluidos biológicos.
Equipo para HPLC
Los componentes de un sistema de HPLC comprenden una
bomba o bombas, sistema de introducción de la muestra (in-
yector de jeringuilla o automuestrador), columna, detector y
un sistema de recolección de datos (registrador de gráficas
o computadora). Para la mayor parte de las aplicaciones,
una sola fase líquida puede utilizarse todo el tiempo a una
tasa de flujo constante (1 a 2 ml/min), es decir una elución
isocrática. Sin embargo, en algunas aplicaciones complejas
donde compuestos que se separan son similares en estruc-
tura, es necesario variar la composición de la fase líquida
durante el análisis, es decir, la elución por gradiente. Un
ejemplo donde ocurre ésta es en la separación de aminoáci-
dos en sangre u orina.
La selección del método de detección para HPLC es
dependiente del tipo de analito con detección ultravioleta
(UV), fluorescente y electroquímica (EC), la que se utiliza
de rutina. La detección UV predomina en la HPLC en fase
inversa pero es raro que se emplee en métodos de fase nor-
mal, ya que la concentración alta del solvente orgánico en
431
la fase móvil produce una absorción de fondo grande entre
190 y 230 nm. La detección fluorescente tiene sensibilidad
alta, pero requiere compuestos que tengan fluorescencia
natural o que químicamente se modifiquen para inducir
fluorescencia. La detección electroquímica se basa en la
oxidación de los compuestos en un electrodo de carbón o
metálico; puede ofrecer sensibilidad y especificidad exce-
lentes para compuestos particulares.
La espectrometría de masa (MS) se utiliza como un
modo de detección en combinación con la cromatografía
gaseosa desde hace muchos años. Los grandes volúmenes
de líquido fluyendo a través de un sistema de cromatografía
líquida (LC) típico con una velocidad de flujo de 1 ml/min
evitaron la combinación de LC y de MS al inicio. La in-
troducción de LC microporo (diámetro interno < 1) y los
avances en la producción de los aerosoles líquidos muy fi-
nos (electronebulización) han impulsado para que LC-MS
se torne una técnica viable. La LC-MS o MS en tándem
(MS-MS) es probable que sean las técnicas de separación
que crecen más rápido en el laboratorio clínico.
Preparación de la muestra para muestras biológicas
Una complicación que surge en el análisis de las muestras
biológicas usando la HPLC se debe al alto contenido proteico
en muchos fluidos corporales (cerca de 70 g/L en plasma y
suero); que puede producir interferencia de fondo y condu-
cir a la obstrucción de la columna, así que alguna forma de
preparación de la muestra se requiere, por lo regular, antes
del análisis. La forma exacta de preparación de la muestra
varía con el uso específico, pero por lo común, se realiza la
desproteinización o la extracción del compuesto de interés,
o ambas. Las extracciones líquido-líquido y en fase sóli-
da se utilizan para los métodos de HPLC que involucran
muestras sanguíneas. Cuando se utiliza orina, la interferen-
cia en los métodos de detección UV o fluorescentes suele
ocurrir si pigmentos coloreados o fluorescentes están pre-
sentes, y alguna forma de extracción es a menudo necesaria,
ya sea líquido-líquido o en fase sólida.
Aplicaciones
La mayor parte de las aplicaciones de la HPLC en la medi-
cina de laboratorio cae dentro del campo de la bioquímica
clínica, aunque los hematólogos también utilizan la técni-
ca. Los grupos de compuestos que por lo regular se anali-
zan por la HPLC en el laboratorio clínico incluyen aminas
biogénicas, aminoácidos, porfirinas, fármacos, vitaminas,
hemoglobina y carbohidratos. Se han descrito muchas otras
aplicaciones específicas para propósitos de investigación,
incluyendo los nucleósidos, productos de degradación del
432 CAP. 44 TÉCNICAS DE SEPARACIÓN

colágeno y esteroides, pero éstos no se convierten con fre- redados (porfirias) con deficiencias específicas enzimá-
cuencia en parte del repertorio de rutina de las pruebas. ticas que conducen a la acumulación de precursores. La
presentación clínica de las porfirias es diversa, desde fo-
tosensibilidad crónica a dolor abdominal agudo, y aunque
Aminas biogénicas cierta idea del diagnóstico exacto puede conocerse por los
síntomas, la caracterización del tipo de porfiria requiere la
Las catecolaminas, adrenalina, noradrenalina y dopamina, identificación de su patrón en sangre, orina y heces. Ésta
y sus metabolitos, se miden en muestras plasmáticas y uri- es posible lograrla por la extracción líquido-líquido de las
narias para la detección de tumores. Los feocromocitomas porfirinas, seguida por la HPLC en fase inversa con de-
secretan cantidades grandes de adrenalina o noradrenalina, tección UV o fluorescente, puesto que las porfirinas tienen
o ambas, que se metabolizan con ácido 4-hidroxi-3-metil- fluorescencia natural. Un ejemplo de separación de porfiri-
mandélico (HMMA). El incremento en las concentraciones nas por la HPLC se muestra en la figura 44-1.
de catecolaminas y HMMA puede detectarse en la orina de
pacientes con feocromocitoma empleando la HPLC en fase
inversa con detección electroquímica. Esta técnica se utili- Mezcla estándar de porfirianas
HPCL sobre Hipersil SAS con detección fluorimétricas
za también para detectar cantidades anormalmente altas de
dopamina y de su metabolito el ácido homovanílico (HVA),
producido por los neuroblastomas en niños.
La serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) se sintetiza a
partir del triptófano y se metaboliza a ácido acético 5-hi-
droxiindol (5-HIAA) por monoaminooxidasas. Los tumo-
res carcinoides secretan cantidades anormales de 5-HT y
la medición de las concentraciones de serotonina sanguí-
nea/urinaria o de la excreción urinaria de 5-HIAA es útil
en la detección de tumores y en la vigilancia de la terapia.
Los métodos para la determinación simultánea de HMMA,
HVA y 5-HIAA por la HPLC en fase inversa están dentro
de los métodos de rutina en los laboratorios clínicos.

Aminoácidos

El uso de la TLC para la identificación cualitativa de anor-

malidades en el metabolismo de los aminoácidos se descri-
bió antes. La cuantificación de aminoácidos específicos es
con frecuencia necesaria, en particular para la vigilancia
terapéutica en desórdenes como fenilcetonuria, tirosinemia
o enfermedad de la orina de jarabe de arce. El primer sis-
tema HPLC especializado que se crea es el analizador de
aminoácidos, que se fundamenta en la detección espectro-
fotométrica después de la reacción poscolumna con ninhi-
drina para producir derivados a color. En la actualidad se
han creado muchos métodos alternativos de la derivación
para separar aminoácidos por la HPLC en fase inversa con
detección UV, fluorescente o electroquímica (véanse Lec-
turas adicionales).
Porfirinas
Los porfirinas son tetrapirroles cíclicos que se forman por
oxidación de los porfirinógenos, intermediarios de la vía
biosintética del hem. Existe una clase de desórdenes he-
Figura 44-1 HPLC de una mezcla estándar usada para el aná-
lisis de porfirina urinaria. Los picos corresponden a uroporfirina
(8COOH), heptaporfirina (7COOH), hexaporfirina (6COOH),
pentaporfirina (5COOH), coproporfirina (4COOH) y mesopor-
firina (2COOH). Columna, 0.8 ⫻ 15 cm Hipersil SAS (5 ␮m).
Elución por gradiente y detección UV (400 nm).
Fármacos
Las técnicas de inmunoensayo sustituyen en la actualidad
a la HPLC como método de rutina para muchos de los an-
ticonvulsivos establecidos, por ejemplo, fenitoína, feno-
barbital, valproato y carbamazepina. Sin embargo, la más
nueva generación de anticonvulsivos, incluyendo lamotri-
gina, vigabatrina, gabapentina, topiramato, leviteracetam
y oxacarbazepina, se mide por la HPLC en fase inversa
con detección UV. La vigilancia terapéutica del fármaco,
sin embargo, se considera que es menos importante para
 CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC)
muchos de los anticonvulsivos más nuevos respecto de los
más antiguos, pues tienen amplias vistas terapéuticas (la-
motrigina, topiramato y leviteracetam) o su concentración
plasmática se correlaciona de manera escasa con la efica-
cia clínica (gabapentina, vigabatrina). La vigilancia, por lo
tanto, se realiza sobre todo si se sospecha inconformidad
con la terapia.
Otros fármacos
Se han desarrollado ensayos para miles de otros fármacos
en fluidos biológicos. Los lectores que buscan informa-
ción adicional deben consultar la sección Lecturas com-
plementarias al final de este capítulo. El uso de técnicas
de separación, que incluyen la LC, tiene una importancia
particular cuando un fármaco contiene un metabolito ac-
tivo que necesite medirse junto al fármaco de origen, por
ejemplo, amiodarona, dotiepina, etcétera.
Vitaminas
Las vitaminas son un grupo diverso de compuestos, pero
casi todas se han medido en sangre u orina por la HPLC
(véanse Lecturas adicionales para consultar detalles).
Hemoglobinas incluyendo la hemoglobina glucosilada
Más de 400 variantes estructurales de la hemoglobina se
conocen, la mayor parte de las cuales no tiene ninguna
secuela clínica para el individuo. Sin embargo, algunas
variantes se relacionan con patologías, por ejemplo, HbS
(hemoglobina de la enfermedad de la célula falciforme).
Un diagnóstico definitivo requiere la identificación de la
variante presente. Recientemente, la separación de hemo-
globinas se logró por electroforesis, pero han aparecido
varios sistemas comerciales de HPLC especializados con
base en la cromatografía de intercambio iónico. Éstos tie-
nen una ejecución más rápida de la muestra y son útiles en
el tamizaje poblacional para hemoglobinopatías. Las mo-
dificaciones a estos sistemas permiten que se les emplee
para cuantificar la fracción glucosilada de la hemoglobina,
HbA1c, con un tiempo analítico cíclico de 4 a 8 minutos.
Una versión de la HPLC del método cromatográfico de afi-
nidad al gel boronato, también disponible, tiene la venta-
ja de que no lo afecta la presencia de variantes heredadas
de la hemoglobina. Un método de referencia establecido
para la medición de HbA1c implica la descomposición de
la hemoglobina en péptidos que realiza la endoproteinasa
Glu-C, seguida por la separación y cuantificación de los
hexapéptidos por HPLC-ionización por electronebuliza-
433
ción y análisis de espectrometría de masas (ESI-MS) o
electroforesis por HPLC capilar.
Carbohidratos
La tamización de desórdenes heredados del metabolismo de
los carbohidratos se realiza por lo general por TLC, como
se describe antes. La cuantificación de carbohidratos espe-
cíficos no es con frecuencia necesaria, pero el desarrollo de
estudios de absorción/permeabilidad intestinal de azúcares
hace necesaria la medición exacta de azúcares específicos
en orina, por ejemplo, lactulosa, ramnosa, xilosa, cuando
se requiere la cuantificación. La separación puede alcan-
zarse usando la cromatografía de intercambio iónico pero
la detección es difícil, pues los carbohidratos no tienen pro-
piedades UV ni fluorescencias utilizables. La aparición de
la detección electroquímica amperimétrica pulsada mejora
mucho la situación, aunque el progreso es lento.
Cromatografía de gases (GC)
Principios
En la GC, los compuestos de interés se separan por la parti-
ción entre el soluto en una corriente de un gas transportador
inerte (nitrógeno, argón o helio) y un líquido de volatilidad
baja sujeto a un soporte inerte (de ahí su nombre anterior,
cromatografía gas-líquido, o GLC). El soporte inerte es,
por lo general, de microperlas de cristal o polímeros halo-
genados sintéticos y un polialcohol derivado o silicona. Por
convención las columnas de GC son de 1 a 3 m de largo con
un diámetro interno de 2 a 6 mm, pero en la mayor parte
de las aplicaciones clínicas se emplean columnas capilares,
que pueden ser de hasta 40 m de longitud con un diámetro
interno de 0.2 a 0.5 mm. Las ventajas de la GC capilar son
por lo general una resolución mejorada y tiempos de corri-
da más cortos. Los sistemas de detección disponibles para
GC son ionización a la flama (FID), captura de electrones
(ECD) y espectrometría de masas (GC-MS). Una compa-
ración de GC normal contra GC capilar y de los detalles de
la forma de acción de los tipos de detectores se presenta la
en revisión de Lewis y Sampson (1994).
Aplicaciones
Los compuestos que pueden separarse por GC deben ser
volátiles o capaces de convertirse a un estado volátil por
derivación. Éstos incluyen alcoholes, esteroides, fármacos,
ácidos orgánicos y ácidos biliares.
434 CAP. 44 TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
Alcoholes
El etanol y el metanol son compuestos volátiles que se mi-
den muy rápido por GC con FID. Una columna de GC nor-
mal puede utilizarse, pues la resolución adicional de la GC
capilar es innecesaria. Las mediciones del glicol de etileno
en toxicidad sospechada son también factibles.
Esteroides
El perfil esteroideo urinario proporciona información sobre
la producción y metabolismo de esteroides a partir de la
glándula suprarrenal, testículos y ovarios. Es en particular
importante en la evaluación de niños de género incierto o
con desarrollo sexual precoz. También existe considerable
interés en esta medición para detectar el abuso de esteroi-
des anabólicos en los atletas. Usando la GC capilar con
FID después de la derivación de los esteroides, hasta 25
esteroides y metabolitos pueden detectarse y cuantificar en
una corrida (fig. 44-2). La disponibilidad y la reducción
más amplias, por el costo de instrumentos GC-MS condu-
Figura 44-2 Cromatograma típico a partir de un análisis por
GC capilar de derivados del éter metil oxima-trimetilsilil (MO-
TMS) de esteroides en la orina de una mujer adulta normal. Los
picos máximos son como sigue: A, B, C, estándares internos;
1, androsterona; 2, etiocolanolona; 3, dehidroepiandrosterona;
4, 11-oxo-etiocolanolona; 5, 11␤-OH androsterona; 6, 11␤-OH
etiocolanolona; 7, 16␣-OH dehidroepiandrosterona; 8, pregnane-
diol; 9, pregnanetriol; 10, androstenetriol; 11, tetrahidrocortisona;
12, tetrahidro-11-dehidrocorticosterona; 13, allo-tetrahidrocorti-
costerona; 14, tetrahidrocortisol; 15, allo-tetrahidrocortisol; 16,
␣-cortolona; 17, ␤-cortolona; 18,␣-cortol.
cen hacia el reemplazo de la GC capilar convencional de
esteroides por GC-MS.
Fármacos
Los fármacos que no se miden fácil por HPLC, por ejem-
plo, valproato, antidepresivos tricíclicos, etc., su ensayo
se practica con frecuencia por GC, o para la vigilancia de
fármacos terapéuticos o para propósitos toxicológicos. La
mayor parte de los sistemas utiliza columnas normales de
la GC con FID, pero GC-MS tiene un papel particular en la
confirmación de exámenes positivos de fármacos adictivos
que se obtienen por TLC, EMIT u otros inmunoensayos.
Los métodos específicos para varios fármacos se pueden
encontrar en el texto de Ghosh (1992).
Ácidos orgánicos
Las enfermedades heredadas que producen cambios en la
excreción ácida orgánica incluyen enfermedades específi-
cas, por ejemplo, acidemia propiónica, y a las relacionadas
con anormalidades del ciclo de la urea. Las mediciones de
ácido orgánico urinario se realizan por lo común usando
GC-MS capilar. La ventaja adicional de MS como detector
es la identificación positiva de cualquier compuesto poco
común.
Electroforesis
Principios
La separación electroforética se basa en la migración di-
ferenciada de moléculas cargadas bajo influencia de un
potencial eléctrico aplicado. Las moléculas que pueden
separarse por electroforesis deben llevar una carga neta
positiva o negativa en su estado natural, por ejemplo, mu-
chas proteínas y aminoácidos, o deben aceptar una carga,
por ejemplo, carbohidratos acomplejados con iones borato.
El ambiente químico alrededor de la molécula, la solución
electrolítica, debe ser capaz de conducir una corriente eléc-
trica, pero también tiene un papel crítico en la determina-
ción del estado de ionización y, por tanto, en la carga de
cualquier molécula en contacto con él. La opción del elec-
trólito y de su pH es crítica para alcanzar movilidad y se-
paración óptimas. El movimiento de la partícula cargada es
causado por la acción de la fuerza eléctrica. La velocidad
de la migración depende de la relación entre el potencial
aplicado y la distancia entre los electrodos, la migración
más grande puede obtenerse al aumentar el voltaje aplica-
do o al disminuir la distancia entre los electrodos. El paso
 ELECTROFORESIS
de una corriente eléctrica genera calor, y las condiciones
óptimas tienen que equilibrarse con la maximización de la
separación. Una fuerza que retarda, la cual está en función
del tamaño molecular y de la viscosidad de la solución,
neutraliza la migración hacia adelante inducida por el cam-
po eléctrico. La velocidad de la migración es, por tanto, di-
rectamente proporcional a la fuerza del campo y a la carga
neta de la molécula e inversamente proporcional al tamaño
de la partícula y a la viscosidad de la solución.
La separación electroforética se puede llevar a cabo en
solución libre pero por lo general se utiliza alguna forma
de medio de soporte sólido, por ejemplo papel, acetato de
celulosa, gel de agar o gel de poliacrilamida. En los últimos
10 años, el interés se ha centrado en realizar la electrofo-
resis en tubos capilares estrechos a voltaje alto, es decir,
electroforesis capilar.
Aplicaciones
La electroforesis se empleó por primera vez en el laborato-
rio clínico en la década de 1950 para la separación de pro-
teínas séricas. Desde entonces, se desarrollan aplicaciones
para separar proteínas del suero, isoenzimas (p. ej., creatina
cinasa, fosfatasa alcalina, etc.), variantes de la hemoglobina
y fragmentos de DNA resultado de la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR). En cuanto a la cromatografía, exis-
ten muchas otras aplicaciones, por ejemplo la separación de
Albúmina
Figura 44-3 Electroforesis de proteínas séricas en gel de agar: a) patrón normal; b) aumento monoclonal en ␥-globulinas debido a cir-
rosis hepática; c) gammapatías monoclonales (IgG) con paresia inmunitaria.
435
lipoproteínas, pero éstas permanecen en el dominio de la
investigación y no se emplean como pruebas de rutina.
Electroforesis de proteínas séricas
El uso principal de la separación electroforética de las pro-
teínas séricas es para la identificación de gammopatías mo-
noclonales, aunque se continúa utilizando para demostrar
los cambios relacionados (no específicos) con una variedad
de condiciones, por ejemplo, el síndrome nefrótico. Los
métodos iniciales para la electroforesis de proteínas séricas
utilizaron acetato de celulosa como medio de soporte, pero
éste produjo resolución limitada de las proteínas séricas y se
han reemplazado en gran parte por la electroforesis en gel
de agarosa. Las proteínas séricas se separan en las bandas
principales correspondientes a la albúmina, ␣1-globulinas,
␣2-globulinas, ␤-globulinas (␤1 y ␤2) y ␥-globulinas. Si se
utiliza plasma en lugar de suero, una banda adicional de fi-
brinógeno está presente, por lo común entre las regiones ␤-
y ␥-globulina (fig. 44-3). La visualización después de teñir
con rojo de Ponceau o azul brillante de Coomassie es por lo
general adecuada para detectar alteraciones a grosso modo,
pero la exploración densitométrica puede emplearse si se
requieren datos cuantitativos sobre las fracciones indivi-
duales, es decir, si una paraproteína está presente. Incluso la
mayor resolución se puede obtener usando los geles de po-
liacrilamida, pero este valor es raro en el uso clínico de ru-
436 CAP. 44 TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
tina. Los sistemas automatizados para la electroforesis de
proteínas séricas están disponibles en la actualidad.
Isoenzimas
Muchas de las enzimas que se miden de rutina en suero
existen como mezclas de isoenzimas, cada una de las cuales
puede producirse por un sistema orgánico diferente en el
cuerpo, por ejemplo, la creatina cinasa (CK) sérica es una
mezcla de CK-MM (del músculo esquelético), de CK-MB
(predominante del corazón) y de CK-BB (del cerebro). Con
la electroforesis puede distinguirse si la causa de una CK
total elevada es un daño del músculo cardiaco o el esquelé-
tico. La separación se consigue usando geles de agar recu-
biertos con un sustrato sintético para la enzima que produce
un compuesto fluorescente visible bajo luz UV cuando es
activado por la CK. Aunque la medición de las troponinas
específicas del corazón ha sustituido en gran parte las me-
diciones CK-MB en muchos laboratorios, la electroforesis
sigue como el único método capaz de detectar la presencia
de los complejos macro-CK. La electroforesis también se
utiliza para separar la fosfatasa alcalina en formas hepática,
ósea, placentaria e intestinal, y para determinar el patrón de
isoenzimas de la lactato deshidrogenasa.
Hemoglobina
Hasta la reciente introducción de los métodos de HPLC
para la identificación de las variantes de la hemoglobina,
los métodos electroforéticos se emplearon con mucha fre-
cuencia, fundamentados sobre la carga global diferente
en la molécula de la hemoglobina causada por las susti-
tuciones del aminoácido. El acetato de celulosa se man-
tuvo como el medio de soporte normal para los métodos
de tamizaje, con la electroforesis del gel de agar citrato
usada para la identificación positiva de cualquier variante
anormal vista en el tamizaje. La separación de las varian-
tes de la hemoglobina por electroforesis con gel de citrato
confía en las interacciones de los aminoácidos sustituidos
con agaropectina. Las hemoglobinas variables con sustitu-
ciones cerca de la superficie, por ejemplo, HbS y HbC, se
retienen, mientras que en las sustituciones más profundas
no ocurre, como HbD y HbG. Combinaciones comple-
jas de electroforesis o el enfoque isoeléctrico se requieren
para identificar hemoglobinopatías raras.
Fragmentos de DNA obtenidos por PCR
Aunque fuera del alcance de esta sección, merece la pena
recordar que muchas de las técnicas moleculares actuales
introducidas en el laboratorio clínico incluyen la separa-
ción electroforética de fragmentos de la restricción del
DNA, después de amplificación por PCR. El gel de agar es
el medio usado en la mayor parte de las aplicaciones en la
biología molecular, con la visualización por radiomarcaje o
por tinción con bromuro de etidio. Un ejemplo del empleo
de tales técnicas es la detección de las dos mutaciones en
el gen HFE relacionado con hemocromatosis genética: los
cambios aminoacídicos C282Y y H63D.
Electroforesis capilar (EC)
Aunque la electroforesis en un capilar estrecho se describió
primero en 1937, es desde 1985 que la técnica se emplea
de manera independiente. Se utilizan capilares de 25 a 100
µm de diámetro y de 25 a 100 cm de longitud; sus extre-
mos se colocan en viales con amortiguador, que también
contienen los electrodos. Voltajes muy altos (10 a 30 kV)
se aplican para producir el flujo electroendosmótico dentro
del capilar. El tipo pH y la fuerza iónica del amortiguador
que llena el tubo capilar son críticos para lograr la separa-
ción deseada.
Existen cuatro formas importantes de separación por
electroforesis capilar: electroforesis capilar de zona (CZE)
o separación en solución libre; cromatografía capilar elec-
trocinética micelar (MECC); enfoque isoeléctrico capilar
(CIEF) e isotacoforesis capilar.
Los principios de estas formas diferentes de separación
y los usos potenciales en la medicina de laboratorio fueron
revisados hace poco. Se ha desarrollado un instrumento
comercial que usa CE para la electroforesis de proteínas
séricas (Beckman Instruments). Éste utiliza varios tubos
capilares en paralelo para alcanzar un alto rendimiento e
incluye la identificación de paraproteínas usando la técnica
de inmunosustracción. La CE se convirtió en la metodolo-
gía dominante en el Proyecto del Genoma Humano, y es
la base para la generación actual de los secuenciadores de
DNA del banco principal.
Lecturas adicionales
Chace DH. Mass spectrometry in the clinical laboratory, Chem
Rev 2001; 101: 445-477.
Ghosh MK. HPLC Methods in Drug Analysis. 1992: Springer
Verlag, Berlin.
Lehmann R, Voelter W, Liebich HM, Capillary electrophoresis in
clinical chemistry, J. Chromatogr B1997; 697: 3-35.
Lewis J, Sampson D. Chromatography for the clinical bioche-
mist. Clin Biochem Rev 1994; 15: 56-63.
Sherwood RA. Liquid chromatography: applications in clinical
analysis. In Encyclopaedia of Analytical Science, 2nd edn.
2004: pp. 267-76 Academic Press, London.
 SECCIÓN 8
INMUNOLOGÍA

KWWSERRNVPHGLFRVRUJ
 45
Ensayos proteicos
David Burnett
Introducción
Las técnicas cualitativas y cuantitativas para el análisis pro-
teico son herramientas esenciales en el laboratorio rutina-
rio de inmunología, cuya remisión incluye el análisis de
algunas proteínas en sangre y en otros fluidos corporales.
Entre las proteínas de mayor interés específico para el in-
munólogo se incluyen las inmunoglobulinas (anticuerpos),
las proteínas del sistema del complemento y, más reciente-
mente, las citocinas, que tienen una función en el sistema
inmunitario. El propósito de este capítulo es aportar una
descripción breve de los principios de los métodos que se
usan para el análisis proteico rutinario. Aunque algunos de
los métodos descritos se utilizan para el estudio de las pro-
teínas del sistema del complemento, la naturaleza de este
sistema exige consideraciones especiales para la interpre-
tación exacta. Por tanto, los ensayos para las proteínas del
complemento se describen con detalle en el capítulo 46.
De manera similar, los ensayos para los anticuerpos autoin-
munitarios se tratan en el capítulo sobre enfermedades del
complejo inmunitario y crioglobulinas (cap. 48).
El propósito principal de los análisis rutinarios de labo-
ratorio en inmunología es detectar, caracterizar y medir la
cantidad de:
1. Deficiencias de proteínas específicas, como en la defi-
ciencia de inmunoglobulinas.
2. Expresión anormal o inadecuada de proteínas, por ejem-
plo, en gammapatías monoclonales, enfermedad autoin-
munitaria o atopía.
Los métodos para el análisis de proteínas confían en una
variedad de principios. Para la mayoría de los ensayos ruti-
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
narios, como los descritos en este capítulo, existen, sin em-
bargo, realmente sólo dos propiedades básicas utilizadas:
1. Las proteínas individuales tienen una carga eléctrica
característica, lo que significa que diferentes proteínas
específicas pueden separarse por electroforesis.
2. Cada proteína humana específica tiene una estructura
única, que puede emplearse para generar anticuerpos
contra esa proteína, del tipo de los anticuerpos policlo-
nales al inmunizar animales con la proteína en cuestión,
o anticuerpos del tipo monoclonal mediante la tecnolo-
gía del hibridoma. Los anticuerpos específicos para una
proteína son la base de los ensayos inmunitarios.
La selección de un método de ensayo apropiado depen-
de del requerimiento de un resultado cualitativo o cuanti-
tativo. Además, la concentración de la proteína de interés
es crucial para la elección de la prueba, por ejemplo, la
detección o medición de inmunoglobulinas monoclonales
y oligoclonales en líquido cefalorraquídeo (LCR) y orina
puede requerir la concentración de la muestra o la selec-
ción de un método más sensible que el elegido para espe-
címenes del suero.
Una breve perspectiva histórica
Los principios de la electroforesis, el método de separación
molecular en una carga eléctrica, sólo se conocieron por al-
gún tiempo cuando el sueco Arne Tiselius, en 1930, sospe-
chando la naturaleza compleja de las proteínas sanguíneas,
comenzó a experimentar con la electroforesis del suero
en un medio líquido con amortiguador. En 1937 identifi-
440 CAP. 45 ENSAYOS PROTEICOS
có varias zonas discretas de la proteína, que podrían verse
después de la electroforesis del suero; las llamó albúmina,
␣-globulina, ␤-globulina y ␥-globulina, teniendo la prime-
ra la movilidad más rápida hacia el ánodo y la ␥-globulina
la más lenta. Esta nomenclatura básica sigue vigente (véase
adelante). En la década de 1950 desempeñó un importante
papel como medio de soporte; posteriormente se introdujo
el uso del acetato de celulosa y de los geles como el agar,
la agarosa y la poliacrilamida. En la actualidad, la elec-
troforesis, en fase líquida, se reintrodujo para las pruebas
rutinarias (véase adelante).
Bechhold, en 1905, demostró que un antígeno proteico y
un anticuerpo para ese antígeno pueden formar un precipita-
do. Sin embargo, Oudin, en 1946 describió un desarrollo útil
de este principio y en 1948 Elek y Ouchterlony introdujeron
la “difusión doble” en un gel independiente. Este método
simple, que todavía se utiliza (se describe más adelante),
se continúa llamando “método de Ouchterlony”. Grabar y
Williams, en 1953, combinaron la separación electroforética
de las proteínas séricas con la inmunoprecipitación (inmuno-
electroforesis cualitativa), usando anticuerpos policlonales
para suero completo, y lograron que la naturaleza verdadera
de la heterogeneidad de las proteínas del suero fuese recono-
cida. Cuando las proteínas específicas comenzaron a purifi-
carse y los anticuerpos para ellas se crearon en animales, se
logró realizar análisis inmunitarios cuantitativos específicos.
La inmunodifusión radial (técnica de Mancini) se introdujo
en 1965 y ésta todavía se emplea de rutina (véase adelante).
La sensibilidad del ensayo cuantitativo de la proteína mejoró
desde entonces, con radioinmunoensayos e inmunoensayos
enzimáticos que permiten mediciones realistas bajo el orden
de varios ng/ml.
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(gel de electroforesis
de proteínas del suero)
Figura 45-1 a) Electroforesis en agarosa de muestras séricas, teñidas para proteína. Las muestras fueron cargadas en el cátodo (base).
La banda en el extremo superior de cada carril representa la albúmina. Las bandas con teñido denso en el extremo del cátodo representan
paraproteínas. b) Escaneo por densitometría de la electroforesis en agarosa del suero de un sujeto sano. El pico alto a la derecha repre-
senta la albúmina.
Técnicas cualitativas
Electroforesis
La electroforesis de la proteína del suero, aunque presen-
ta una resolución limitada, es un método fundamental para
analizar muestras para anormalidades de la proteína a gros-
so modo. El medio de soporte para la electroforesis en gel
es, por lo general, una membrana de acetato de celulosa o
gel de agarosa. Los amortiguadores varían pero se basan
en barbitona, con un pH cercano a 8.5. Geles o membra-
nas para la electroforesis rutinaria están disponibles en
el comercio y se utilizan con frecuencia para minimizar el
tiempo de preparación y asegurar resultados constantes. La
membrana de soporte se coloca sobre un tanque de electro-
foresis, conectada en cada extremo a la solución amortigua-
dora. La muestra que se quiere analizar se carga en el extre-
mo del cátodo y se aplica una corriente eléctrica de 30 min a
una hora. Las proteínas en la muestra migran en la corriente
con velocidades proporcionales a su carga. Al término de la
separación electroforética, se retira el gel o la membrana y
las proteínas se insolubilizan por fijación, por lo general en
una solución con ácido acético, y se visualizan si se tiñen con
un colorante proteico apropiado (fig. 45-1). El gel puede
semicuantificarse por densitometría; es decir, el gel se exa-
mina usando un densitómetro, que mide la densidad del te-
ñido (fig. 45-1).
Sólo las proteínas con una concentración de 0.1 a 0.5
g/L, o mayor, contribuyen a constituir las bandas de las
proteínas séricas observadas, de las cuales regularmente se
representan seis. Éstas se señalan, en orden de movilidad
electroforética, como:
 TÉCNICAS CUALITATIVAS
1. Banda de albúmina (representada por la albúmina del
suero).
2. Banda ␣1 (se representa por ␣1-antitripsina, orosomu-
coide y ␣-lipoproteína).
3. Banda ␣2 (representada por la haptoglobina y ␣2-ma-
croglobulina).
4. Banda ␤1 (se representa por la transferrina).
5. Banda ␤2 (representada por proteínas y ␤-lipoproteína
del complemento).
6. Banda ␥ (se representa por las inmunoglobulinas IgG,
IgM e IgA).
La mayor parte de las proteínas del suero, cuando es-
tán presentes en la sangre en concentraciones inferiores
al umbral para este método, no contribuyen a las bandas
observadas. Sin embargo, para el inmunólogo quizás la in-
formación más relevante que se obtiene de la electroforesis
es la detección de la deficiencia de inmunoglobulinas o de
gammapatías monoclonales. Debido a que las inmuno-
globulinas representan diversas moléculas del anticuerpo
son, por naturaleza, heterogéneas y no están representadas
por una banda ␥ discreta. Más bien, esta banda se observa
como una banda amplia a menos que exista una banda mo-
noclonal (o “M”). En casos de gammapatía monoclonal,
hay una producción predominante por un clon expandido
de células que producen inmunoglobulinas, de inmunoglo-
bulina de un isotipo (IgG, IgM o IgA) con especificidad
discreta. Estas moléculas de inmunoglobulina son idénti-
cas y producen una banda ␥ o M discreta (fig. 45-1). La
identificación de la naturaleza de la proteína M monoclonal
en el suero y las cadenas ligeras libres (proteínas de Ben-
ce-Jones) en orina puede realizarse usando inmunofijación
precipitando la proteína en el medio de soporte, después
de la electroforesis, con un anticuerpo específico para cada
isotipo. Las proteínas no precipitadas se eliminan con un
lavado y el precipitado restante se visualiza tiñendo con
un colorante proteico (fig. 45-2). La proteína M también se
puede caracterizar por inmunodifusión o inmunoelectrofo-
resis y la concentración medirse por inmunoensayo cuan-
titativo (estos métodos se describen más adelante). Por el
contrario, una banda ␥ reducida sugiere una deficiencia de
la inmunoglobulina y esto debe investigarse más a fondo
por ensayo cuantitativo (véase adelante).
Exactamente como la secuenciación de DNA en geles
se ha sustituido en gran parte por los sistemas capilares,
la electroforesis proteica puede realizarse ahora en tubos
capilares que contienen una fase líquida. El modelo CZE
2000 de Beckman-Coulter es un ejemplo. Se le diseña para
permitir el análisis rápido de muchos especímenes: 70 mues-
441
THE BINDING SITE
(gel de electroforesis de proteínas del suero)
Figura 45-2 Inmunofijación y tinción de proteínas del suero
después de la electroforesis. El carril marcado con TSP muestra el
patrón de tinción para todas las proteínas. La banda en el extremo
superior es albúmina. La banda más cercana al extremo inferior
es una paraproteína. La inmunofijación con anticuerpos para IgM,
IgA e IgM humanos revela que la paraproteína es IgM. La fijación
con anticuerpos para las cadenas ligeras ␬ y ␭ muestra que la
paraproteína es IgMk.
tras en 90 min. La resolución es similar a la de los geles.
En realidad, el resultado, que tiene el formato equivalente a
un escaneo por densitometría del gel, puede ser “invertido”
para dar la imagen simulada de un gel teñido.
Inmunodifusión de Ouchterlony
La inmunodifusión se realiza en geles de agar o de agarosa.
Por lo común, una roseta de pozos se corta en el gel con
un pozo también cortado al centro de la roseta (fig. 45-3).
El pozo central se llena con el espécimen de prueba y los
circundantes en la roseta con un antisuero de especificidad
diferente. El gel se incuba en una atmósfera húmeda por
varias horas. Las proteínas en el pozo central y aquellas de
la roseta se difunden en el gel. Si el espécimen contiene una
proteína para la cual se obtiene uno de los antisueros,
un precipitado comienza a formarse; este precipitado es in-
soluble a concentraciones de “equivalencia”. Los geles se
pueden lavar, secar y teñir para que se archiven. Usando
este método, la presencia de varias proteínas puede detectar-
se simultáneamente en el espécimen de prueba. Como otra
alternativa, varias muestras de la prueba se analizan para
detectar la presencia de una proteína específica colocando
un antisuero específico en el pozo central y una muestra
diferente de la prueba en cada uno de los circundantes. Las
placas de “Ouchterlony” están disponibles en el comercio,
por ejemplo, para identificar el isotipo y la subclase que
representa una paraproteína en una muestra sérica.
442 CAP. 45 ENSAYOS PROTEICOS
Figura 45-3 Inmunodifusión de Ouchterlony mostrando el pa-
trón clásico de la “roseta” de pozos cortados en el gel de agarosa.
Un anticuerpo (generado en un animal como el conejo o la oveja)
fue puesto en el pozo central y las muestras del suero en los po-
zos satélites circundantes. El suero en el pozo superior contuvo
bien la proteína de interés. Las moléculas del anticuerpo se han
difundido radialmente a través del gel y donde encontraron a la
proteína que difundía desde el pozo inferior. Las moléculas pro-
teicas (antígeno) han sido unidas por moléculas del anticuerpo,
produciendo un precipitado visible e insoluble.
Inmunoelectroforesis de contracorriente
La electroforesis de contracorriente es similar, en princi-
pio, a la inmunodifusión, pero el antígeno y el anticuerpo
son electroforizados uno hacia el otro en el gel (fig. 45-4).
El uso de la electroforesis en lugar de la difusión asegura
que los resultados se obtengan más rápido. Se recomien-
da utilizar la inmunoelectroforesis a contracorriente como
un método de tamizaje inicial rápido (p. ej., para detectar
anticuerpos para antígenos nucleares extraíbles) y los re-
sultados positivos se confirman por otros métodos, como la
inmunodifusión de Ouchterlony.
Inmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis cualitativa (descrita originalmen-
te por Grabar y Williams) comienza con la electroforesis en
acetato de celulosa, agar o agarosa. Un canal se corta en la
membrana o en el gel, adyacente al paso de la electrofore-
sis. Después de la electroforesis, el antisuero se coloca en
el canal y la membrana/gel se incuba en una atmósfera hú-
meda por varias horas. Durante este tiempo, las proteínas
Figura 45-4 Electroforesis a contracorriente. Este ejemplo es un
equipo comercial diseñado para detectar autoanticuerpos. El an-
tígeno “blanco” está en las secciones cuadradas a la izquierda
(cátodo) y el suero del paciente se aplica en el ánodo (lado dere-
cho de la figura). Bajo influencia de una corriente eléctrica, el an-
tígeno y las moléculas de inmunoglobulina del paciente emigran
uno hacia el otro. Un inmunoprecipitado, teñido con un colorante
proteico, indica la presencia de autoanticuerpos para el antígeno.
separadas por electroforesis y las moléculas del anticuerpo
a partir del canal difunden a través del medio de soporte. Si
los anticuerpos para las proteínas separadas están presen-
tes, se forma un inmunoprecipitado en el gel, que es inso-
luble a un punto de concentraciones “equivalentes”. Estos
precipitados son con frecuencia visibles en el gel “hidrata-
do”, sin teñir, sólo que la sensibilidad puede incrementarse
después de que el gel se lava, se fija y se tiñe (fig. 45-5).
Un antisuero que se obtiene para emplearse como suero
completo revela arcos precipitados que representan todas
las proteínas presentes para las cuales hay anticuerpos en el
antisuero. La ausencia de un arco de precipitación (cuando
se compara a un espécimen de referencia) indica una ca-
rencia de proteínas. La paraproteína monoclonal también
es evidente debido a los precipitados anormales formados
o pronunciados. La presencia o la identidad de una proteína
específica, como una paraproteína, puede confirmarse co-
 MÉTODOS CUANTITATIVOS
Figura 45-5 a) Diagrama que muestra el principio de la inmuno-
electroforesis cualitativa. La muestra del paciente se coloca en un
pozo cortado en el gel y las proteínas se separan por electrofore-
sis. Después de la electroforesis, el antisuero se pone en un canal
que corre paralelo a las proteínas separadas. El gel se deja en
una atmósfera húmeda para permitir que las proteínas separadas
y las moléculas del antisuero difundan una a otra. La presencia
de proteínas hacia las moléculas del anticuerpo son resultado de
un precipitado en forma de arco. b) Inmunoelectroforesis de dos
muestras de suero. Los dos pozos con aplicación de la muestra
están en el centro del gel; separados por un canal que contuvo el
antisuero de la oveja se incrementan contra las proteínas huma-
nas del suero. La electroforesis fue realizada con el cátodo a la
derecha. Los arcos de inmunoprecipitado en el suero de la parte
inferior muestran un patrón normal; aquellos para IgG, IgA e IgM
se marcan. Obsérvese la ausencia de estos inmunoprecipitados en
la muestra superior, esto indica que este paciente era deficiente
en las tres inmunoglobulinas.
locando un antisuero específico (p. ej., antisuero específico
para cadenas pesadas IgG, IgA o IgM humanas o para ca-
denas ligeras ␬ y ␭) en el canal.
Métodos cuantitativos
Inmunodifusión radial (fig. 45-6)
Este método también se conoce como “inmunodifusión
radial única” o “método de Mancini”. El agar o agarosa,
fundido en un amortiguador conveniente, se deja enfriar al-
rededor de 55°C y el antisuero precipitante específico para
la proteína que se va a medir se añade en la concentración
apropiada. El gel que contiene antisuero se vierte sobre una
443
Figura 45-6 Inmunodifusión radial sencilla. Este ejemplo mues-
tra un gel de agarosa en el cual se disuelva un antisuero para IgG2
humana. Las muestras de suero humano fueron puestas en po-
zos que se cortaron en el gel. La placa fue incubada para permi-
tir que las proteínas en las muestras difundieran a través del gel.
Las moléculas IgG2 fueron ligadas por anticuerpos para IgG2,
que produjo anillos visibles del precipitado insoluble. El área
de un anillo del precipitado es proporcional a la concentración de
IgG2 en la muestra. Obsérvese la ausencia de anillos en algunas
muestras, demostrando la deficiencia en IgG2.
placa o plato de cristal o plástico y se deja enfriar, después
de lo cual solidifica el gel. Los pozos se cortan en el gel y
cada uno de éstos se llena con varios microlitros de suero
de prueba. Una serie de pozos, cada uno lleno con suero de
referencia (o solución de referencia) contiene concentra-
ciones conocidas de la proteína con la que se va ensayar. La
placa se deja en una atmósfera húmeda para permitir que
las proteínas dentro de las muestras y de las soluciones de
la referencia difundan en el gel, que contiene antisuero cir-
cundante. Cuando las moléculas proteicas que están en el
ensayo difunden en el gel forman precipitados con las mo-
léculas del antisuero. Estos precipitados son parcialmente
solubles siempre que la concentración del antígeno (proteí-
na) sea superior a la del antisuero. Así, algunas moléculas
proteicas continúan difundiendo radialmente desde el pozo
hasta que la concentración del antígeno es “equivalente” a
la de los anticuerpos. En este punto un anillo de precipitado
insoluble se forma alrededor del pozo de la muestra. El área
(y por tanto el diámetro) del anillo es directamente propor-
cional a la concentración de la proteína en la muestra de la
prueba. Por supuesto, siempre que la concentración del an-
tisuero en el gel y las concentraciones de la proteína en la
muestra estén dentro de los límites apropiados y el proceso
de la difusión se ha dejado correr hasta la terminación, el
área del anillo inmunoprecipitado es linealmente propor-
cional a la concentración de la proteína. Ésta requiere que
el sistema de la prueba sea titulado por experimentación.
También significa que es posible que las placas necesiten un
444 CAP. 45 ENSAYOS PROTEICOS
tiempo considerable (quizás varios días) para la difusión y la
formación del precipitado al dejar que la corrida se comple-
te. Estos contratiempos pueden ser inoportunos y demasiado
lentos para algunos laboratorios con trabajo de grandes volú-
menes de muestras, pero las placas de inmunodifusión radial
están ahora disponibles en sus formas comerciales para la
medición de proteínas clínicamente importantes, incluyendo
isotipos, subclases y cadenas ligeras de inmunoglobulinas.
Estas placas comerciales se producen dentro de tales tole-
rancias para obtener resultados exactos y precisos antes de
que la difusión haya corrido completa (método de Fahey y
McKelvey), aportando resultados en sólo algunas horas. De
hecho, las concentraciones del antisuero se incorporan con
tanta exactitud que, con una pérdida pequeña y normalmente
irrelevante de exactitud, las concentraciones de la proteína
pueden ser interpoladas, a partir de los diámetros del anillo,
a las curvas estándares de referencia suministradas con el
equipo, sin usar soluciones estándares de referencia. El lími-
te de la sensibilidad de un ensayo por difusión radial depen-
de en gran parte de la calidad del antisuero pero está por lo
general en el orden de alrededor de 5 mg/L. Algunas placas
desarrolladas para el comercio pueden medir proteínas tan
bajas como 0.2 mg/L.
Turbidimetría y nefelometría
Los métodos cuantitativos descritos antes confían en la for-
mación de complejos insolubles proteína-anticuerpo que
pueden visualizarse por el ojo en medios con soporte de gel.
Si el precipitado se forma con una proteína y un anticuerpo
a concentraciones bajas en un medio líquido, un precipi-
tado más fino se forma en la suspensión. Esta propiedad
puede utilizarse para medir la concentración de la proteína.
La presencia de un precipitado impedirá que un haz de luz
atraviese la suspensión (turbidimetría). De manera alterna,
la luz dispersada por la suspensión puede detectarse en un
ángulo hacia la luz incidente (fig. 45-7). Este método se
llama nefelometría. La cantidad del inmunoprecipitado, a
una concentración constante del anticuerpo, aumentará en
proporción con la concentración de la proteína, hasta que
todo el anticuerpo se ha ligado al antígeno. La medición
de la dispersión de la luz debe, por consiguiente, hacerse
en condiciones de exceso del anticuerpo; se hace como un
“punto final” o por un analizador de la velocidad que mida
el aumento en la dispersión como las formas del precipita-
do. Es claro que este acercamiento, a diferencia incluso de
métodos más “sencillos” como la inmunodifusión radial,
requiere aparatos especializados pero ofrece un grado de
automatización y un procesamiento alto de los especíme-
nes. Algunos laboratorios usan analizadores centrífugos en
los cuales los reactivos son mezclados durante la centrifu-
gación, reduciendo el tiempo del ensayo. El límite de sen-
Fuente de luz Partículas
dispersas Detector de
turbidez
Cubeta
Nefelómetro
Principio de la nefelometría/turbidimetría
Figura 45-7 Esquema simplificado que muestra los principios
de la turbidimetría y de la nefelometría (véase el texto para una
explicación).
sibilidad de esta metodología, como en la mayor parte de
los inmunoensayos, depende del sistema específico y, sobre
todo, de la calidad de antisuero, que debe ser policlonal. En
un buen sistema, el límite es alrededor de 10 mg/L, pero
puede mejorarse a casi dos órdenes de magnitud usando
nefelometría “reforzada con partículas”, cuando los anti-
cuerpos se ligan a las perlas diminutas del poliestireno. Los
reactivos para la turbidimetría y la nefelometría de proteí-
nas clínicamente importantes, como isotipos y subclases de
inmunoglobulina, están disponibles en el comercio.
Ensayos de inmunoabsorbencia ligados a enzimas
Los ensayos de inmunoabsorbencia ligados a enzimas
(ELISA), también llamados inmunoensayos enzimáticos
(EIA), representan un principio versátil y sensible para la
medición de la proteína, que ha reemplazado en gran par-
te a los radioinmunoensayos. Pueden medir proteínas por
debajo de concentraciones cercanas a 1 µg/L. Son ensa-
yos convenientes que se emplean si la proteína de interés
está presente en una concentración baja. Estos ensayos se
realizan en placas de plástico con 96 pozos y el manejo
del reactivo se hace normalmente por medio de pipetas de
multicanal. ELISA es conveniente para la automatización
o semiautomatización y, por tanto, incluso para la proteína
que se mide en una concentración alta, haciendo necesaria
la dilución de la muestra; si una gran cantidad de muestras
está procesando esta técnica puede ser más conveniente
que otros métodos más simples, como la inmunodifusión
radial. Muchos laboratorios construyen sus propios siste-
mas internos de ELISA, pero los equipos en el comercio
están disponibles para una amplia gama de aplicaciones,
 MÉTODOS CUANTITATIVOS 445

(a ) (b )
Conjugado Conjugado
enzima-anticuerpo enzima-anticuerpo

Antígeno blanco
Anticuerpo blanco

Anticuerpo inmovilizado
Antígeno

(c ) (d )

Muestra de
suero que
contiene la
IgG de oveja proteína de
Anticuerpo anticonejo conjugado
interés incubada
Anticuerpo humano enzimáticamente El anticuerpo de conejo
animal conjugado ligado a proteína con anticuerpo
contra el antígeno de conejo
enzimáticamente no puede hacerlo a la
proteína sobre la placa para la proteína
Anticuerpo de conejo
gado al antígeno sobre
la placa
Antígeno Antígeno

Figura 45-8 a) ELISA indirecto. La figura muestra el principio de esta técnica para la detección de anticuerpos específicos. b) ELISA
directo de emparedado para detectar un antígeno específico en una muestra. c) ELISA competitivo para detectar o medir un anticuerpo
específico para un antígeno conocido. El método confía en un anticuerpo (conjugado enzimáticamente), que se obtiene de un animal como
el conejo o la oveja, que reconoce el mismo antígeno como el anticuerpo “blanco” que se está midiendo. El espécimen se mezcla con el
anticuerpo conjugado que compite para ligar al antígeno utilizado sobre la placa de ELISA. d) ELISA competitivo para detectar o para
medir una proteína (antígeno). La muestra que se prueba se incuba con un anticuerpo producido para el antígeno de interés (en este caso
un anticuerpo de conejo). El anticuerpo de conejo se liga al antígeno blanco en la muestra, que evita a aquellas moléculas del anticuerpo
al unirse posteriormente al pozo con ELISA cubierto con el antígeno. Cualquier anticuerpo de conejo que no se una al antígeno en la
preincubación es capaz de unirse al pozo ELISA y se le detecta con la adición de un anticuerpo conjugado enzimáticamente para IgG
de conejo (en este caso, IgG de oveja anticonejo). La cantidad de producto enzima-sustrato medido será inversamente proporcional a la
cantidad de proteína blanco en la muestra original.

incluyendo ensayos para medir proteínas séricas impor-
tantes, citocinas, antígenos microbianos (p. ej., Chlamydia
trachomatis, antígenos del virus de hepatitis B), anticuer-
pos de IgE para alergenos y anticuerpos para patógenos.
Los diferentes sistemas de ensayo varían en detalles
pero los principios esenciales siguen siendo similares. Las
formas más simples son “ELISA indirectos” para detectar
anticuerpos específicos y “ELISA directos de empareda-
do” para detectar los antígenos.
ELISA indirecto para la detección del anticuerpo (fig.
45-8a) se basa en la microtitulación de pozos de la placa
cubiertos con un antígeno blanco apropiado (p. ej., proteí-
na de un patógeno). Las muestras que se prueban se aplican
a los pozos, seguidas por un anticuerpo conjugado enzimá-
ticamente para la inmunoglobulina humana. La enzima es
por lo común la peroxidasa de rábano (HRP) o la fosfatasa
alcalina. La elección de la inmunoglobulina antihumana
permitirá la detección de todos los isotipos (usando anti-
suero que se obtiene contra las inmunoglobulinas humanas
IgG, IgA e IgM), o de un isotipo específico (p. ej., anticuer-
pos IgE para alergenos). Después de un lavado adicional
para eliminar el anticuerpo conjugado no ligado, un sus-
trato conveniente se agrega a los pozos. Un producto colo-
reado se detecta usando un lector de ELISA que recolecta
a la longitud de onda apropiada (450 nm para HRP; 492
nm para la fosfatasa alcalina), la muestra del anticuerpo
blanco en el espécimen original. Estos ensayos pueden ser
cuantitativos.
Para ELISA directo de emparedado para detectar antí-
genos (fig. 45-8b), los pozos de microplacas de 96 pozos
(también se pueden conseguir como tiras de ocho pozos)
se cubren con un anticuerpo para la proteína que se de-
tecta o mide. Éste no necesita ser un anticuerpo precipi-
tante, por lo tanto, los anticuerpos monoclonales se usan
con frecuencia. Cada pozo se llena con una muestra de la
prueba o bien con una gama de soluciones de referencia
de concentración conocida. Los pozos se incuban por un
tiempo apropiado (cerca de una hora), después de lo cual
446 CAP. 45 ENSAYOS PROTEICOS

se lavan para retirar el material que no es capturado por el cubre el pozo.

anticuerpo en la superficie del pozo. Los pozos entonces Existen muchas permutaciones sobre estos estilos bá-
se llenan de una solución de otro anticuerpo para la proteí- sicos de ELISA y algunas se describen en la lista de Lectu-
na que se mide. Es claro que si el anticuerpo primario fue ras complementarias, al final de este capítulo.
monoclonal, el mismo anticuerpo monoclonal no puede
ser eficaz en este paso porque la proteína blanco podría
tener un antígeno determinante (epitopo) reconocido por Conclusión
el anticuerpo. Es aquí donde es necesaria una cierta ex-
perimentación, para identificar un segundo anticuerpo que
Los laboratorios que trabajan de manera rutinaria grandes
reconozca a la proteína después de que la haya captura-
volúmenes de muestras para inmunología tienen a su dispo-
do el antígeno primario inmovilizado sobre los pozos de
sición una gama de métodos para el análisis de la proteína
la placa. Este segundo anticuerpo está conjugado con la
de dónde elegir. Los métodos empleados se determinan a
enzima. La placa se incuba otra vez para permitir que el
través de consideraciones incluyendo la naturaleza de los
segundo anticuerpo conjugado enzimáticamente se una con
especímenes, las identidades de las proteínas que son medi-
la proteína capturada. La placa se lava de nuevo y el sus-
das y sus concentraciones en los especímenes. También, la
trato para la enzima conjugante se agrega a los pozos. El
cantidad de especímenes procesados de rutina determinan
sustrato produce un producto de reacción soluble y colo-
si los sistemas automatizados necesitan emplearse. Muchos
reado. Puesto que la cantidad de anticuerpo conjugado de
de los métodos usados en la actualidad han cambiado sólo
forma enzimática que se une es proporcional a la cantidad
en detalles desde que las proteínas específicas comenzaron
de proteína capturada por el anticuerpo primario, resulta
a identificarse y medirse, y algunos de ellos es probable que
que la cantidad del producto de la reacción enzimática es
sigan empleándose por mucho tiempo más. Otros, como
proporcional a la concentración de la proteína en la mues-
ELISA, representan tecnologías más nuevas que desplazan
tra original. La cantidad del producto de reacción se mide
a aquellas con desventajas técnicas o prácticas, como los
usando un lector de placas ELISA, el cual pasa la luz a
radioinmunoensayos. Hay muchos progresos en la caracte-
través de cada pozo a una longitud de onda que absorbe el
rización de la proteína, en especial en el campo del análisis
producto de reacción y, para la cuantificación, los resulta-
de datos, como para los proteómicos. Cómo y cuándo, los
dos se interpolan a partir de aquellos que se obtienen con
laboratorios que trabajan grandes volúmenes de muestras
las soluciones de referencia.
de “proteínas” lleguen a adoptar métodos nuevos se tendrá
Otro tipo de ELISA es competitivo. Un ejemplo se
que esperar para descubrirlo.
muestra en la figura 45-8c. Esta muestra ELISA de com-
petición se emplea para la detección de anticuerpos especí-
ficos. Los pozos se cubren con el antígeno que se reconoce
Reconocimientos
con la molécula del anticuerpo de interés. Las muestras del
paciente se agregan a los pozos junto con las moléculas del
Debo agradecer a Roger Drew de la Binding Site Ltd., por algu-
anticuerpo generado en animales experimentales, con es-
nas de las figuras aquí publicadas.
pecificidad para el mismo antígeno, como aquella recono-
cida por el anticuerpo que es ensayado. Habrá competencia
para unir al antígeno. Entre más moléculas del anticuerpo
estén en la muestra del paciente, menor es la unión de los
Lecturas adicionales
anticuerpos conjugados. La figura 45-8d muestra el razo-
namiento para un ELISA competitivo para la detección o la Chapel H, Haeney M. Essentials of Clinical Immunology, 3rd
edn. 1993: Blackwell Scientific, Oxford.
medición de un antígeno. En este caso, los pozos están cu-
Crowther JR. The ELISA Guidebook. Methods in Molecular Bio-
biertos con el antígeno de interés. La muestra del paciente logy Series, vol 149. 2002: Humana, Totowa, NJ.
se preincuba con, o se añade, junto con un anticuerpo con- Rose NR, Hamilton RG, Detrick B. Manual of Clinical Laboratory
jugado enzimáticamente al antígeno. Cualquier antígeno Immunology, 6th edn. 2002: ASM Press, Washington, DC.
en la muestra ocupa sitios de unión con el antígeno sobre Sheehan C. Clinical Immunology. Principles and Laboratory
el anticuerpo disminuyendo su unión con el antígeno que Diagnosis, 2nd edn. 1997: Lippincott, Philadelphia, PA.
 46
Ensayos del complemento
J. North y K Whaley
Introducción
El complemento es un sistema de las proteínas del suero
y de los receptores celulares que tiene varias funciones, la
mayor parte de las cuales ayuda al huésped a prevenir o lu-
char contra la infección. Descrito originalmente como una
sustancia sensible al calor que podría, junto con el anti-
cuerpo específico, lisar ciertas bacterias, ahora se sabe que
las proteínas del complemento actúan por medio de dos
rutas principales. La activación de estas rutas conduce a la
deposición de una opsonina potente en la superficie de los
microorganismos, además de producir una respuesta infla-
matoria que libera factores vasoactivos y quimiotácticos.
Otros componentes pueden dañar las superficies celulares,
pero aun otro grupo controla la activación espontánea y po-
tencialmente dañina de estas rutas.
Los niveles de las proteínas del complemento pueden
ensayarse por varios métodos, y es también posible deter-
minar la actividad funcional de la mayor parte de los com-
ponentes. Para apreciar de modo completo las condiciones
requeridas para estos ensayos, es importante entender el
proceso que ocurre. Por consiguiente, una vista general
breve del complemento se describe en la sección siguiente,
con muchos detalles que se encuentran en las secciones in-
dividuales del ensayo.
La ruta clásica
La primera ruta que se describe aquí se denomina la “ruta
clásica”, y los componentes en este sistema se prefijan con
“C“ y lo comprenden C1q, C1r, C1s, C4 y C2 (los números
son atribuidos al tiempo de definición de los componentes, no
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
a la secuencia de activación). La ruta clásica puede activarse
por IgG o IgM que se han ligado al antígeno. El C1q se liga
a ese anticuerpo y, una vez que está unido, se activa el C1r,
que a su vez activa el C1s. El C1s activado es una proteasa
cuyo sustrato es C4, que es cortada. El C4 cortado (C4b) liga
el C2 y el C1s entonces activa el C2 (para formar C2a) por
proteólisis limitada. El complejo activo C4b2a (ruta clásica
C3 convertasa) activa el C3, otra vez por proteólisis limitada.
Los iones calcio y magnesio se requieren para la activación
de la ruta clásica. El C3 activado (C3b) liga covalentemente
a las superficies y actúa como ligando de alta afinidad para
los receptores de C3b en los fagocitos.
Esta ruta se puede también activar con el C1q unido a
la proteína C-reactiva, una proteína de fase aguda, similar
en forma a la IgM, que se liga al carbohidrato en algunas
bacterias. La lecitina unida al carbohidrato manano (MBL)
es una proteína funcionalmente similar que se parece a C1q
por sí misma; y la MBL forma un complejo macromolecu-
lar con las proteasas serinas 1 y 2 relacionadas con MBL
(MASP1 y MASP2), que tiene muchas de las mismas pro-
piedades que C1r y C1s. El complejo MBL-MASP puede,
por tanto, activar la ruta clásica a través de C4 cuando se
liga a un carbohidrato conveniente, como la manosa, la N-
acetilglucosamina, la glucosa o la fucosa.
La ruta alterna
C3, el factor B, el factor D y la properdina son los compo-
nentes de la ruta alterna de activación del complemento. La
activación de esta ruta no descansa en alguno de los facto-
res específicos desencadenantes sino en un nivel constante
bajo de activación espontánea. Una proporción pequeña de
448 CAP. 46 ENSAYOS DEL COMPLEMENTO

Ruta clásica Ruta alterna

Patógeno + anticuerpo Carbohidrato manano en la Activador de superficie

superficie bacteriana

Ruta clásica
Convertasa C4

Ruta clásica Ruta alterna

Convertasa C5 Convertasa C5

Autoensamblaje

C5b C6 C7 C8 C9n
Complejo de ataque a membrana

Figura 46-1 La ruta clásica y la ruta alterna de la activación del complemento. Los componentes con actividad de proteasa se muestran
en verde, las colectinas en azul y las anafilotoxinas en rojo.

C3 circulante se hidroliza, y esta forma de C3 puede ligar
el factor B en presencia de los iones de magnesio. El factor
B ligado es cortado por el factor D para formar Ba y C3Bb;
éste puede activar más C3 para formar C3a y C3b. C3b
puede ligarse a las superficies y, una vez unido, liga más
factor B. El C3b ligado a la superficie de los microorganis-
mos es resistente a la actividad reguladora de los factores
H e I, de modo que se favorece la activación. Del mismo
modo que el factor B ligado al C3 circulante es cortado, el
factor B ligado a C3b sobre las superficies es cortado por el
factor D para dar C3bBb. Este complejo es estabilizado por
la properdina y tanto C3Bb como C3bBbP pueden cortar
más moléculas C3, amplificando así el proceso. Otra fun-
ción del complejo C3dBbP es que puede ligar y activar el
C5 (véase adelante).
Las dos rutas se muestran en la figura 46-1.
El complejo de ataque de membrana
Los componentes C5, C6, C7, C8 y C9 del complemento
forman la ruta terminal. C5 puede activarse con las enzimas
convertasas de la ruta clásica o de la ruta alterna (C4b2a y
C3bBbP, respectivamente). El C5 activado se liga a C6 y a
 ENSAYOS DE LOS NIVELES SÉRICOS DEL COMPLEMENTO
los componentes restantes; C7, C8 y C9, se ligan a su vez.
Seis moléculas de C9 ligan a este complejo y forman un
poro en la membrana de una célula en la que está presente.
Esto puede conducir a la lisis de la célula y es una pro-
piedad que se emplea en los ensayos hemolíticos descritos
más adelante.
Productos biológicamente activos de activación
del complemento
Una de las funciones principales del sistema del comple-
mento es depositar C3b en la superficie de los microorga-
nismos y, como se describe antes, esto puede ocurrir por
la ruta clásica o por la ruta alterna. El C3b presente en la
superficie de los microorganismos aumenta su captación de
fagocitos, como los neutrófilos, vía receptores para C3b, y
también estimula las células. La activación de la ruta clá-
sica por los complejos inmunitarios de anticuerpo y antí-
geno aumenta la solubilidad de tales complejos y ayuda
a su eliminación de la circulación por los receptores del
complemento en los eritrocitos.
Según se mencionó antes, los complejos de C5b-C9
pueden causar la lisis de los microorganismos por la in-
serción de los polímeros de C9 en la membrana celular.
La lisis de las células presentes puede ocurrir a menos que
sean protegidas por el receptor CR1 de C3, el factor ace-
lerador de la degradación (DAF), la proteína del cofactor
de la membrana (MCP) y el CD59, los cuales previenen la
polimerización de C9. La activación de C4, de C2, de C3,
del factor B y de C5 crea fragmentos relativamente peque-
ños que son liberados. Los dos más importantes son las
anafilotoxinas C3a y C5a, que son vasoactivas y liberan
la histamina de los mastocitos. C5a es también un agente
quimiotáctico poderoso que activa los neutrófilos y mono-
citos.
Control de la activación del complemento
La activación espontánea del complemento necesita con-
trolarse para prevenir una respuesta inflamatoria inne-
cesaria. La ruta clásica se regula por el inhibidor de las
proteínas C1 del suero (C1-inh), C4bp y el factor I y por
la proteína del cofactor de la membrana de las moléculas
de la superficie celular (MCP), el factor acelerador de la
degradación (DAF, CD55) y CR1. La ruta alterna se regula
por los factores H e I y la MCP, el DAF y el CR1. Todos
estos factores aceleran la degradación de una o más de las
proteínas o de los complejos activados del complemento, y
por tanto la activación del complemento ocurre sólo si los
estímulos activadores pueden generar bastantes productos
activos para superar los mecanismos inhibidores.
449
Ensayos de los niveles séricos del complemento
Preparación y almacenaje de la muestra
El almacenaje incorrecto de las muestras para el ensayo
del complemento produce niveles disminuidos, ya que al-
gunos componentes son extremadamente lábiles. Para los
ensayos de los componentes individuales en el suero, las
muestras de sangre deben llegar al laboratorio tan pronto
como sea posible después de la venopunción. Debe per-
mitir que la sangre se coagule a la temperatura ambiente
por 30 min, después se coloca la muestra sobre hielo por
una hora para que la retracción del coágulo ocurra antes de
separar el suero a una temperatura de 2 a 4°C. Las muestras
se alícuotan y almacenan a ⫺70°C tan rápido como sea
viable. Para su uso, las muestras se descongelan a 37°C,
después se colocan de inmediato en el hielo: al congelar
y deshielar repetidamente disminuyen la actividad hemo-
lítica de los componentes. La sangre colectada en EDTA
(que previene la activación adicional del complemento al
quelar el calcio y el magnesio y, por tanto, hace que las
muestras sean convenientes para los ensayos del producto
de activación) se guarda en hielo el tiempo más corto po-
sible antes de centrifugarse para producir el plasma escaso
de plaquetas que se almacena, en lo que se refiere al suero.
Las muestras del cultivo tisular se benefician de la adición
de los inhibidores de la proteinasa, como PMSF.
Ensayos inmunoquímicos
Estos ensayos utilizan anticuerpos específicos para los com-
ponentes individuales del complemento, están disponibles en
formas comerciales y pueden utilizarse en los ensayos ne-
felométricos, ELISA o de inmunodifusión. La elección del
anticuerpo es crítica, ya que los anticuerpos policlonales pue-
den reconocer los productos de desintegración del compo-
nente bajo investigación y el valor resultante que se obtiene
puede no reflejar el nivel de la proteína funcional presente.
El tipo de sistema del ensayo que se emplee depende
del número por realizar, del nivel de sensibilidad requerido,
del nivel del analito y de la calidad del anticuerpo disponible.
Por ejemplo, la nefelometría se utiliza en los laboratorios
clínicos rutinarios de inmunología para medir C3, C4, C1-
inh y C1q en las muestras de pacientes donde los niveles
son de 50 µg/ml o más. Para los estudios del cultivo celular,
sin embargo, los niveles pueden ser tan bajos como 1 ng/ml
y el ELISA, aunque es más laborioso y requiere más tiem-
po, es más práctico. Las técnicas de inmunodifusión radial
y gel rocket, aunque consumen tiempo y no son especial-
mente sensibles, son relativamente simples y pueden em-
plearse para identificar los productos de degradación, por
ejemplo, la inmunoelectroforesis rocket de doble difusión
450 CAP. 46 ENSAYOS DEL COMPLEMENTO
para la detección de C3d, y para las formas anormales de
los componentes del complemento, por ejemplo, la inmu-
nodifusión Ouchterlony del suero humano normal (NHS) y
del suero deficiente de C8 frente al anti-C8 pueden revelar
las líneas de identidad parcial que sugieren la deficiencia
de la cadena C8␤. Los amortiguadores intermediarios em-
pleados, que se utilizan por lo general en estos tipos de
ensayo, son los óptimos para el anticuerpo de unión y solu-
ción salina amortiguada con fosfato (PBS).
Ensayos hemolíticos del complemento
Ensayos CH5O
La lisis de los eritrocitos de la sangre por el complemento
ocurrirá si el MAC está montado en la membrana celular y
se insertan los polímeros de C9. Los ensayos dependen de
la presencia de todos los componentes necesarios y de las
condiciones apropiadas para la activación del complemen-
to. El más simple de estos ensayos es el CH50 (fig. 46-2),
un procedimiento cuantitativo que depende de una muestra
Volumen sérico (μl).
Figura 46-2 Trazo log-log de y/1 ⫺ y frente al volumen del
suero diluido en un ensayo CH50. En el punto de 50% de hemó-
lisis, y(1 ⫺ y) ⫽ 1 y el volumen del suero diluido resultante se
muestra en la línea vertical. y ⫽ proporción de las células lisadas.
Redibujada de Whaley (1985), con permiso de Elsevier.
que contiene todos los componentes clásicos y terminales
del complemento, y de los componentes que son funcional-
mente activos.
El ensayo se realiza en presencia de los iones calcio y
magnesio (requeridos para la activación de la ruta clásica)
e iniciando la ruta con la presencia de la IgM sobre la su-
perficie de los eritrocitos de la sangre de ovejas (EA).
Un ensayo similar para la ruta alterna, el APH50, utiliza
los eritrocitos del conejo, que proporcionan una superfi-
cie para la unión del C3bBb. La adición de EDTA, para la
quelación de los iones de calcio pero no los de magnesio,
previene cualquier activación concomitante de la ruta clási-
ca mientras permite la activación de la ruta clásica.
Estos ensayos necesitan controlarse con muestras cono-
cidas que contienen todos los componentes, por ejemplo,
el NHS fresco (control positivo), y por el amortiguador
solo (control negativo) para medir la lisis espontánea de los
eritrocitos. La cuantificación del ensayo puede realizarse
comparando la cantidad de hemólisis (medida por la densi-
dad óptica del sobrenadante celular, que es proporcional a
la cantidad de hemoglobina liberada) con un NHS normal
conocido en un método de un tubo, o diluyendo toda la
muestra de prueba para obtener un rango del porcentaje de
hemólisis. Usando la ecuación de von Krogh, que describe
la curva que se obtiene trazando el porcentaje de lisis con-
tra la dilución de la muestra, se calcula la dilución de la
muestra requerida para obtener el 50% de hemólisis y, des-
pués de tomar en cuenta la dilución inicial de la muestra,
este valor se traduce a unidades/ml de CH50. La unidad de
CH50 que se obtiene depende de la cantidad y la naturale-
za del anticuerpo utilizado para sensibilizar las células, la
concentración y fragilidad del eritrocito, la fuerza iónica,
la concentración del catión divalente y el pH del amorti-
guador, el tiempo de reacción y la temperatura.
Los ensayos CH50 y APH50 se utilizan para determi-
nar si un paciente es o no genéticamente deficiente en un
componente del complemento. Un valor cero en un ensayo
CH50, pero no en APH50, indica una falta del C1, C4 o de
C2, mientras que para un resultado normal de CH50 y un
APH50 de cero, una deficiencia de properdina o el factor
D pueden estar presentes (la deficiencia del factor B no se
ha descrito). La ausencia de lisis en ambos ensayos indi-
ca la carencia de C3, C5, C6, C7 o C8. Los niveles bajos
de lisis pueden ocurrir por la deficiencia de C9. Los valo-
res bajos cerca de cero sugieren que el nivel de uno o más
componentes del complemento está disminuido, debido a
la consunción en un proceso de enfermedad, como el lupus
eritematoso sistémico, o pueden indicar un estado de defi-
ciencia heterocigota (aunque los niveles del complemento
pueden ser variables en estos individuos, ya que muchos
componentes son proteínas de fase aguda).
Ensayos hemolíticos para los componentes individuales
usando sueros deficientes del complemento
Los ensayos por la presencia y la actividad funcional de los
componentes individuales se pueden realizar usando el eri-
trocito sensibilizado y un suero deficiente en el componente
 ENSAYOS DE LOS NIVELES SÉRICOS DEL COMPLEMENTO 451

elegido. Las diluciones seriales de una muestra de prueba

se agregan y la lisis del eritrocito sensibilizado ocurre sólo
si el componente que se pretende verificar está presente y es
funcional. Otros componentes están presentes en exceso,
así que la lisis es proporcional a la cantidad del compo-
nente de prueba. Los sueros deficientes pueden obtenerse
en presentaciones comerciales y también prepararse en el
laboratorio, si los ensayos se realizan regularmente. Tales
ensayos son de sensibilidad más baja que los descritos más
adelante y no son convenientes para los componentes regu-
ladores (C1-inh, factores H e I, properdina).

1:160⫻104 1:40⫻104 1:20x104 1:10⫻104 1:5⫻104

Ensayos hemolíticos para los componentes individuales Dilución del suero

usando el eritrocito presensibilizado
Figura 46-3 El número de moléculas funcionales por célula (Z)
Los eritrocitos pueden presensibilizarse con los primeros se traza contra la dilución del suero en una titulación hemolítica
componentes de la ruta hasta llegar al que está bajo prue- típica de un componente individual del complemento. La concen-
tración del componente en este caso está dada por y/x ⫻ 50 000.
ba. Agregando una muestra que contiene un componente de
Redibujada de Whaley (1985), con permiso de Elsevier.
investigación, este componente pueden activarlo o ligarlo a
aquellos componentes ya presentes. La adición de los com-
ponentes restantes da lugar a la lisis si el componente de C4 se ensaya usando EAC1 agregando diluciones de la
prueba está presente y es funcional. Si se asegura que el muestra de prueba, C2 del conejillo de Indias y Crat-EDTA
resto de los componentes está en exceso, el grado de lisis en lo que se refiere a C1, mientras se mide la actividad C2
es proporcional a la cantidad del componente de prueba. usando EAC14. En este caso, el Tmáx para las células (tiem-
Los componentes funcionalmente puros pueden preparar- po para la formación máxima de C4b2a) debe conocerse.
se en el laboratorio, pero la mayor parte están disponibles El Tmáx varía de lote a lote del EAC14 porque depende de
en presentación comercial. Los eritrocitos sensibilizados y la cantidad de C4b presente en las células. Para ensayar la
presensibilizados que se emplean con más frecuencia son actividad de C3, es necesario formar EAC142. El complejo
EAC1, EAC4 y EAC14. Los EAC1 se preparan agregando C4b2a en estas células es más inestable que la mayor parte,
C1 (p. ej., a partir de suero del cerdo de Guinea precipitado por tanto, los EAC14oxy 2 son preparados para proporcionar
con 5 mM de CaCl) al eritrocito sensibilizado en un amor- la actividad hemolítica incrementada del C2 (fig. 46-4).
tiguador de fuerza iónica baja que contenga calcio y mag- EAC14 forma el punto de arranque de los ensayos fun-
nesio. La adición de suero humano en presencia de EDTA
produce la unión de C4 y C2, y la incubación subsiguiente máx
a 37°C causa la degradación de C1 y C2 desde las células,
dejando EAC4. Las células EAC14 se preparan agregando
más C1, otra vez en presencia de calcio y magnesio.
Las células EAC4 se utilizan para ensayar la actividad de
C1 agregando diluciones de la muestra de prueba seguida
por C2 del conejillo de Indias. La hemólisis se logra agre-
gando los componentes restantes, en forma de suero de rata
que contiene EDTA (Crat-EDTA). La concentración de las
moléculas eficaces del componente bajo prueba se mide tra-
zando el valor Z [⫺ln(1 ⫺ % de lisis)] contra la dilución del
componente bajo prueba (fig. 46-3). El trazo de línea recta
que se obtiene resulta de la ‘Teoría de un golpe’, en que una
sola molécula eficaz del complemento (C1-C9) resulta en Tiempo de incubación (min)
la lisis celular. Una unidad de complemento se toma como
aquella que proporciona 63% de lisis en un ensayo para Figura 46-4 Trazo del número de sitios hemolíticos (Z) contra
aquel componente. Si un trazo de línea recta no se obtiene, el tiempo de incubación a 30°C en un ensayo de Tmáx. Tmáx está
entonces la concentración de uno o más componentes bajo indicado por la flecha. Redibujada de Whaley (1985), con el per-
prueba es limitada. miso de Elsevier.
452 CAP. 46 ENSAYOS DEL COMPLEMENTO
cionales de los componentes de la ruta alterna. El C2 y
C3 son agregados a la forma EAC1423, con la eliminación
subsiguiente de C1 y C2 con la incubación en el amortigua-
dor EDTA. El EAC43b resultante forma una ruta alterna,
la C3 convertasa, si se agrega el factor B, el factor D y la
properdina. La hemólisis se logra agregando Crat-EDTA.
La actividad del factor B, del D o de la properdina se mide
omitiendo el componente puro respectivo y sustituyéndolo
con las diluciones de la muestra de prueba aunque este mé-
todo no es conveniente para ensayar el factor D sérico, sólo
las preparaciones puras. Los componentes terminales se
ensayan agregando C3 y los componentes terminales ele-
vados para llegar al que está bajo prueba para el EAC14oxy
2. El EAC1-8, utilizado para medir la actividad de C9, sin
embargo, experimenta lisis espontánea, así que debe em-
plearse tan pronto como esté preparado.
Otros ensayos de la función del complemento
La medición de la actividad de la ruta clásica es posible con
equipos comerciales. Algunos de éstos se basan en ELISA,
y el complemento sérico es activado por los complejos in-
munitarios presentes en la celdilla. Midiendo la cantidad
de un neoantígeno del componente terminal, normalmente
C9 generado, se valora la actividad. Un sistema automáti-
co emplea liposomas que contienen una enzima (G6PDH),
que se libera cuando el anticuerpo reacciona con el antíge-
no en el liposoma, sólo cuando la ruta clásica entera está
presente. La reacción de la enzima con un sustrato en la
mezcla del reactivo produce un cambio del color propor-
cional a la actividad de la ruta clásica. Los autores no son
conscientes de cualquier método automático para APH50.
La MBL puede ensayarse funcionalmente cubriendo los
eritrocitos de ovejas con carbohidratos manano y realizan-
do el resto del ensayo en lo que respecta a un CH50. Se ha
descrito un ensayo funcional alternativo que mide la capa-
cidad de la lectina de unión a mananos (MBL) para activar
el C4. El manano es cubierto en una placa de ELISA y
se mide la cantidad de C4c generada del suero agregado,
una alta concentración de sal en el amortiguador previene
la activación de la ruta clásica.
Ensayos funcionales de las proteínas de control
del complemento
La actividad del inhibidor C1 puede ensayarse con los
equipos comerciales que utilizan la capacidad del inhibi-
dor C1 para inhibir un C1s análogo en una reacción co-
lorimétrica. La actividad del inhibidor C1 puede también
medirse examinando la capacidad de la muestra de prueba
para inhibir un nivel dado de C1 exógeno adicionado al eri-
trocito sensibilizado. Si al suero se le examina entonces C1
primero tiene que ser eliminado, por ejemplo, precipitando
todo el C1 usando el amortiguador de fosfato. El inhibidor
C1 puede permitirse ligar a C1, o en la fase fluida antes de
agregar a EAC4 con C2 o en EAC14, antes de la adición
del C2. Para los ensayos hemolíticos del componente inhi-
bidor, una reacción “solitaria” que no contiene inhibidor se
corre en paralelo. La actividad inhibidora de la muestra de
prueba se expresa en unidades Z’ y se asume que la inhibi-
ción de la lisis sigue la misma teoría “de un golpe”, como
la lisis. Se toma I como la proporción de la lisis de C1 que
z
se inhibe y, por tanto, I ⫽ 1 ⫺ e⫺ . Por lo tanto Z’ ⫽ ln(1
⫺ I) o:
y en la muestra de prueba
Z’ ⫽ ln
y en solitario
Cuando Z en el tubo solitario está entre 0.5 y 1.5, Z’ varía
de forma lineal con la dilución del inhibidor C1. En cuanto
al cálculo de Z, Z’ se calcula de la gráfica de la dilución del
suero contra Z’, tomando en cuenta la dilución inicial.
Los niveles del factor H pueden ensayarse midiendo la
capacidad del suero para acelerar la degradación de la C3
convertasa. EAC4b3bBbP son preparados agregando pro-
perdina, factor B y factor D a EAC4b3b; la cantidad de ac-
tividad hemolítica que permanece después de degradarse la
C3 convertasa se compara con un tubo solitario. La actividad
del factor I puede ensayarse incubando la muestra de prueba
con el factor H agregado a EAC43 y adicionando los factores
B y D, y examinar para la actividad hemolítica residual.
Detección de los productos de activación del complemento
Varias proteínas del complemento sérico son de fase agu-
da, por lo que durante la consunción del complemento,
que puede ocurrir en algunos tipos de infección bacteria-
na o enfermedades del complejo inmunitario, los niveles
séricos pueden permanecer normales. El volumen incre-
mentado del complemento puede determinarse al medir
los productos de activación del complemento, usando los
anticuerpos que distinguen los productos de activación a
partir de la molécula nativa. Los equipos comerciales están
disponibles pero los ensayos en el local para los productos
de activación se establecen de forma fácil, con la condición
de que los anticuerpos apropiados se utilicen. Las pruebas
ELISA para C3a, C4a y C5a se establecen, a condición de
que los estándares puedan obtenerse, pero la utilidad clí-
nica de estos ensayos es limitada. De más ayuda para los
clínicos son los ensayos para C1s-C1-inh, C3bBbP o C5b-
C9, incrementados, niveles que indican la activación de la
ruta clásica, alterna o terminal, respectivamente.
Los últimos ensayos utilizan un anticuerpo contra un
 LECTURAS ADICIONALES
componente, por ejemplo, C1s, para ligar el complejo a
una placa de ELISA y a un anticuerpo contra otro compo-
nente del complejo, por ejemplo, C1-inh, para detectar el
complejo.
Detección de los receptores del complemento
Los anticuerpos para los receptores del complemento están
disponibles en formas comerciales y se utilizan en la cito-
metría de flujo para detectar la presencia de los receptores
en suspensiones celulares. Algunos anticuerpos son tam-
bién adecuados para la inmunohistoquímica de los cortes
de tejido o para la preparación del centrifugado de células
si se requiere la morfología celular.
453
Lecturas adicionales
Whaley K (ed.). Methods in Complement for Clinical Immunol-
ogists. 1985: Churchill Livingstone, Edinburgh. This text book
provides a comprehensive, detailed account of the majority
of complement assays, including the preparation of purified
components.
Dodds A, Sims R (eds). Complement. A Practical Approach.
1997: Oxford University Press, Oxford. This is an up to date
laboratory manual for all aspects of laboratory complement
work.
Phimster GM, Whaley K. Measurement of complement. In Clini-
cal Immunology. A Practical Approach, Gooi HG, Chapel H
(eds) (1990). Oxford University Press, Oxford. This chapter
provides guidance as to clinical indications for complement
assays as well as methodologies.
 47
Inmunología celular
Aarnoud Huissoon
Introducción
La inmunología celular es el estudio de las células del siste-
ma inmunitario. Estas pruebas normalmente se realizan en el
contexto de la investigación de posibles defectos del sistema
inmunitario, por ejemplo, en pacientes con infecciones recu-
rrentes o en infantes con insuficiencia en el crecimiento, en
quienes pueden sospecharse inmunodeficiencias innatas raras.
Por conveniencia, los leucocitos de la sangre periférica
se evalúan con regularidad, pero también pueden usarse cé-
lulas de otras fuentes, como ganglios linfáticos y biopsias
tisulares (por lo general en el marco de la investigación).
Linfocitos y neutrófilos se estudian con más frecuencia,
pero otros tipos de células, como los basófilos, también sue-
len analizarse en algunas circunstancias.
Para evaluar las células del sistema inmunitario, puede
requerirse la información con respecto a las cantidades de
células presentes, su fenotipo y sus funciones. Una amplia
gama de herramientas está disponible para estos análisis, y
muchas técnicas están surgiendo en el campo clínico ruti-
nario de las aplicaciones de la investigación. La inmuno-
logía celular es, por tanto, una ciencia en plena evolución.
Inversamente, varias pruebas en uso permanecen en gran
parte sin cambios por décadas. Éstas han demostrado ser
robustas y confiables en la aplicación clínica, y las técnicas
más nuevas son lentas para reemplazarlas.
Pruebas cuantitativas y cualitativas
En el nivel más simple, la cantidad real de linfocitos y neu-
trófilos circulantes proporciona información útil sobre el
sistema inmunitario. Éstos se encuentran fácilmente dispo-
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
nibles a partir de la cuenta diferencial automatizada de las
células blancas. La población linfocítica se divide en célu-
las T, B y células asesinas naturales (NK), las cuales a su
vez se dividen en subgrupos. Se han descrito alteraciones
y deficiencias que afectaban prácticamente a todas estas
poblaciones, y el análisis del subconjunto y del fenotipo de
linfocito es una herramienta valiosa del diagnóstico.
Los subgrupos de linfocitos se miden marcándolos con
anticuerpos monoclonales. Se ha desarrollado una amplia
variedad de anticuerpos que identifica una gama creciente de
subpoblaciones de linfocitos. Algunos de los anticuerpos
más comunes que se emplean para disecar a esas subpobla-
ciones se listan en el cuadro 47-1.
Antes, los subgrupos de linfocitos se enumeraban ma-
nualmente contando las células marcadas con anticuer-
pos fluorescentes bajo el microscopio. Ahora el citómetro de
flujo proporciona una herramienta más precisa para exami-
nar una gran cantidad de marcadores linfocíticos con gran
detalle.
Citometría de flujo
En un citómetro de flujo, las células individuales se condu-
cen en una corriente fina de paso fluido rápido a través de
un rayo láser. Los fotomultiplicadores detectan la disper-
sión de la luz láser por la célula y miden la luz emitida por
cualquier marcador fluorescente que se haya agregado a la
célula (fig. 47-1). A partir de esta información, el tamaño y
la granularidad de la célula, así como el nivel de expresión
de la superficie celular o de los antígenos citoplásmicos
que se han marcado con anticuerpos fluorescentes, pueden
medirse. Millares de células por minuto se analizan de esta
456 CAP. 47 INMUNOLOGÍA CELULAR

Cuadro 47-1 Marcadores para el subgrupo de linfocito más usados

Subgrupos principales Otros subgrupos Otros marcadores

Células T CD3⫹ Células T auxiliares Célula T virgen Antígenos de activación
CD4⫹ CD45RA⫹ HLA-DR, CD69,CD25
Células T citotóxicas Células T efectoras/ Moléculas
CD8⫹ memoria CD45RO⫹ coestimuladoras
CD28, CD134 (OX40)
Linfocitos CD45+ Células NK
CD16/CD56⫹
(CD3⫺)
Células B Célula B virgen Células B-1 Subgrupos y linfoma de la
CD19⫹ o IgD⫹/CD27⫺ CD5⫹ célula B
CD2⫹ Células B de memoria Células B-2 IgM, IgG, ␬/␭
IgD⫺ /CD27⫹ CD5⫺ cadenas ligeras Ig, CD23

cuantitativo puede derivarse a partir de métodos de plata-

Células en fluido
envolvente
Fuente de
luz láser
PMT 2
PMT 1
Dispersión
lateral de luz (SS)
Dispersión frontal
de luz (FS)
Figura 47-1 Presentación simplificada de un citómetro de flu-
jo. Las células pasan individualmente a través de un rayo láser.
Para cada célula, la luz dispersada se mide con sensores de luz
delanteros y laterales. Los anticuerpos fluorescentes en la célula
son excitados por la luz láser y emiten luz a longitudes de onda
diferentes, la cual se mide con los fotomultiplicadores (PMT). En
citómetros de flujo más grandes, dos láseres y varios fotomulti-
plicadores, cada uno midiendo la luz emitida de una longitud de
onda diferente, permiten examinar numerosas moléculas celulares
diferentes u otras propiedades simultáneamente.
manera, para que una cantidad grande de datos con res-
pecto a las poblaciones celulares pueda recopilarse muy
rápido.
Linfocitos, monocitos y granulocitos se distinguen por
sus propiedades de la dispersión de la luz, solos o en com-
binación con la expresión de CD45 (fig. 47-2a). Los anti-
cuerpos fluorescentes pueden entonces diferenciarse entre
las diversas poblaciones de linfocitos (fig. 47-2b).
Es necesario conocer no sólo las proporciones de los
subgrupos de linfocitos presentes, sino también las canti-
dades absolutas de cada subgrupo en la muestra original.
Adecuados rangos de referencia, relativos a la edad, están
disponibles para los subgrupos principales. Este resultado
forma, ya sea dual o bien simple. En el primer método la
cuenta absoluta del linfocito se obtiene de una cuenta dife-
rencial del leucocito por citometría de flujo y de la cuenta
total del leucocito a partir de un analizador estándar de he-
matología. Un método de plataforma simple puede ser más
exacto, en especial cuando hay una proporción muy baja
de la población de interés (p. ej., células T CD4+ en el sín-
drome de inmunodeficiencia adquirida, SIDA). La cuan-
tificación por plataforma simple se logra agregando una
cantidad conocida de perlas a un volumen determinado de
sangre al principio de la prueba. Las perlas y los linfocitos
marcados con anticuerpo se analizan simultáneamente con
el citómetro de flujo, y las cuentas absolutas del subgrupo
de linfocitos pueden calcularse. Un acercamiento alterna-
tivo se obtiene contando los linfocitos en un volumen fijo
de sangre pasado a través del analizador, pero éste es de-
pendiente de la confiabilidad de los fluídicos del citómetro
de flujo. Los métodos de tinción y lisis del anticuerpo en
sangre entera (en lugar de la tinción de los leucocitos se-
parados) deben utilizarse para los análisis cuantitativos del
linfocito.
Aplicaciones del análisis del subgrupo de linfocitos
Monitoreo de la infección por VIH/SIDA
Ésta es la indicación más común para el requerimiento de
los subgrupos de linfocitos. Los resultados cuantitativos
exactos son esenciales. Típicamente, las cantidades de la
célula auxiliar T CD4+ son bajas, y el cociente de células
T CD4+ a las CD8+ se invierte (está sobre 1.5:1 en adultos
sanos). Sin embargo, no pueden utilizarse para diagnosti-
car la infección por VIH, puesto que los subgrupos de la
 PRUEBAS CUANTITATIVAS Y CUALITATIVAS 457

Granulocitos

Monocitos

Linfocitos

DISPERSIÓN FRONTAL
Núm de células

Figura 47-2 a) Identificación de poblaciones de leucocitos a través de la dispersión de la luz y de la expresión de CD45. Cada punto
representa los datos recolectados de una célula. Los linfocitos tienen dispersión frontal moderada (un índice del tamaño), la disper-
sión lateral baja (SS, un índice de la complejidad o granularidad celular) y expresión CD45 alta. b) Expresión de CD3 y CD4 sobre la
población de linfocitos. Las células se han marcado con anticuerpos CD3 conjugados con fluoresceína, detectados sobre PMT1, y anti-
cuerpos CD4 conjugados con ficoeritrina, detectados sobre PMT2. Después de seleccionar la población del linfocito, la expresión de CD3
y CD4 puede verse sola o como histogramas, o bien combinada en un gráfico de punto. El gráfico de punto aporta información adicional,
demostrando que las células CD4⫹ son un subgrupo de células CD3⫹.

célula T son normales en un individuo infectado por VIH,
y existen también muchas otras causas de perturbaciones
de los subgrupos de linfocitos, por ejemplo, estrés, trata-
miento con esteroides, infección intercurrente o variación
diurna normal. Una vez que la infección por VIH se diag-
nostique con pruebas serológicas o de la biología molecu-
lar, las cuentas CD4 (conjuntamente con las mediciones de
la carga vírica medidas con PCR) son esenciales en el mo-
nitoreo de la enfermedad. Se utilizan para indicar el nivel
de supresión inmunitario, y es cuando el tratamiento con
agentes antirretrovíricos y antimicrobianos profilácticos
debe iniciarse. El desempeño del monitoreo de la célula T
CD4+ para el VIH en el Reino Unido está sujeto al control
de calidad externo por NEQAS.
Investigación de inmunodeficiencia
Muchas enfermedades primarias de inmunodeficiencia es-
tán asociadas con anormalidades de los subgrupos de linfo-
citos. Algunos ejemplos se listan en el cuadro 47-2. Mien-
tras una cuenta total baja del linfocito es con frecuencia la
primera pista para el diagnóstico de inmunodeficiencia gra-
ve, la detección del patrón de la deficiencia puede ayudar
458 CAP. 47 INMUNOLOGÍA CELULAR

Cuadro 47-2 Ejemplos de algunos síndromes primarios de inmunodeficiencia con hallazgos característicos del laboratorio

Cantidades de Análisis de subgrupo

Diagnóstico Infecciones Inmunoglobulinas linfocitos de linfocito típico Estudios funcionales
Agammaglo- Bacterianas Bajas/ ausentes Normales Células B ausentes Proliferación normal
bulinemia unida para mitógenos
a X (de Bruton)
SCID unida a X Vírica, micótica Ausentes Bajas Células T y NK Proliferación ausente
y bacteriana ausentes para mitógenos
Deficiencia HLA Vírica, micótica Normales/bajas Normales Células CD4⫹ T Proliferación normal
clase II y bacteriana reducidas para mitógenos,
Expresión HLA-DR pero respuestas
ausente sobre antígeno-específicas
células B reducidas
Síndrome hiper- Bacteriana / IgM incrementada/ Normales CD154 ausente Proliferación normal
IgM unido a X protozoaria normal; IgG, IgA sobre células T para mitógenos pero
baja/ausente activadas respuestas antígeno-
específica reducida

al diagnóstico, por ejemplo, la ausencia de células T y B
con células NK preservadas puede sugerir una deficiencia
de RAG-1 o de RAG-2 (genes que están implicados en la
generación de los receptores del antígeno de las células T y
B). Normalmente se requieren estudios funcionales además
del análisis del subgrupo de linfocito en la investigación de
inmunodeficiencias congénitas graves (véase adelante).
En algunas enfermedades de inmunodeficiencia, los nú-
meros absolutos de poblaciones linfocíticas son normales,
pero anormalidades sutiles pueden detectarse con análisis
más detallados, por ejemplo, muchos pacientes con defi-
ciencia primaria de anticuerpos (deficiencia inmunitaria
variable común) tienen números completos normales de
células T, B y NK. Sin embargo, sus células B muestran
proporciones anormales de poblaciones vírgenes y de me-
moria, sugiriendo un defecto en la maduración de la célula
B periférica u homeostasis como la causa para que su falta
produzca un repertorio normal de anticuerpos. Las células
T de pacientes con síndrome hiper-IgM no pueden expresar
CD154 (antes llamado ligando CD40). CD154 no se ex-
presa normalmente en la inactividad de células T de sangre
periférica, y es necesario estimular primero las células T
in vitro y después medir la expresión de la molécula por
citometría de flujo.
El defecto en la adhesión leucocitaria (LAD) es causado
por la falla de los neutrófilos (y de otros leucocitos) para
expresar integrinas ␤2 (heterodímeros CD11-CD18). En
consecuencia, los neutrófilos del paciente no emigran de la
corriente sanguínea al sitio de infección, y las infecciones
graves recurrentes (con poco o nada de pus) se producen.
La curación de la herida también se deteriora. Esta condi-
ción puede diagnosticarse simplemente midiendo la expre-
sión neutrofílica de CD18 y CD11a, b y c por citometría
de flujo.
Diagnóstico de malignidades linfoides
La cuantificación y el análisis del fenotipo de los linfocitos
de la sangre periférica (o médula) son esenciales en el diag-
nóstico de las enfermedades linfoproliferativas de las células
B y T. La clonalidad de la célula B en estas condiciones se
detecta con frecuencia por la expresión anormal de la cadena
ligera de la inmunoglobulina sobre la superficie de la célu-
la B. Las células T no expresan marcadores clónicos sobre la
superficie celular, de modo que las malignidades se detecten
por la expresión anormal (pérdida o expresión aberrante) de
otros marcadores superficiales (p. ej., CD7, CD5, CD25).
Mientras que muchas de estas condiciones se caracterizan
por aumentos marcados en las cantidades linfocíticas de la
sangre periférica, algunas (en particular neoplasmas de la cé-
lula T) pueden ser clínicamente sutiles en su manifestación
y mantener una cuenta normal de linfocitos. En todos los
casos, el inmunofenotipo del linfocito tiene que interpretarse
dentro del contexto de otros hallazgos clínicos del paciente
y del fenotipo de las células por microscopia.
Otras condiciones inflamatorias e infecciones
Anormalidades de subgrupos y fenotipos del linfocito en
sangre periférica se han descrito en una gama amplia de
enfermedades infecciosas e inflamatorias. Sin embargo, es-
tas anormalidades es raro que tengan un diagnóstico útil, y
nunca específico.
 ESTUDIOS FUNCIONALES 459

Linfocitos a partir de sitios salvo de sangre (a )

y de médula ósea 100 000

Incorporación de timidina
De cuando en cuando es útil analizar linfocitos de otros
sitios, como del líquido cefalorraquídeo y del líquido de
lavado broncoalveolar. En el último caso, las poblaciones 10 000
linfocíticas predominantes pueden ayudar a distinguir di-
versas enfermedades intersticiales del pulmón. En el pri-
mero, el propósito principal consiste en excluir el linfoma 1 000
que involucra al sistema nervioso central.

Estudios funcionales 100

Blanco 1:80 1:40 1:20 1:10
Linfocitos T Dilución del mitógeno

En el curso de una inmunorrespuesta, las células T norma-

les exhiben varias funciones que pueden evaluarse in vitro. (b)
Éstas incluyen la proliferación, la sobrerregulación de an-
tígenos de la superficie celular, la producción de citocina y
la apoptosis.
Número de células

Proliferación

La medición de la proliferación del linfocito T es un méto-

do bien establecido que evalúa su competencia inmunitaria.
Antes, se usaron los cambios en la apariencia de las células
en la microscopia para evaluar la activación y respuesta de
la proliferación a varios estímulos, de ahí el término “trans-
formación linfocítica” que se aplica con frecuencia a esta
prueba. Durante varias décadas este proceso se ha cuan-
tificado con más exactitud midiendo la incorporación de
la timidina 3H radiomarcada en el DNA de células proli-
ferantes. La timidina titulada se agrega al cultivo celular
durante las últimas 16 h de un cultivo de 2 a 7 días, y las
células, entonces, se recolectan en un filtro del papel. La
cantidad de radiactividad incorporada, cuando se detecta
mediante conteo por centelleo, es proporcional a la repli-
cación del DNA que ocurre en las células proliferantes (fig.
47-3a). Ambos, la radiactividad incorporada absoluta (en
desintegraciones o cuentas por minuto, después de la co-
rrección de las cuentas originales) y el índice de estimula-
ción (cuentas de células estimuladas divididas entre cuentas
de células sin estimulación), deben reportarse.
También se han desarrollado métodos alternativos que
miden la proliferación del linfocito, aunque ninguno de és-
tos ha desplazado hasta ahora la incorporación de timidina
como la técnica estándar en los laboratorios clínicos. Éstos
incluyen la detección por flujo citométrico de la expresión
del antígeno de activación (p. ej., CD25, CD69, Ki67), la
incorporación de bromodeoxiuridina, o la dilución del co-
lorante intracelular, carboxifluoresceína diacetato succini-
Intensidad de CFSE
Figura 47-3 a) Proliferación linfocítica en respuesta a los mi-
tógenos PHA 250 ␮g/ml (䊏), PWM 100 ␮g/ml (䊉), y OKT3
1 ␮g/ml (䉬). La incorporación de la timidina 3H se indica en las
desintegraciones/minuto. Reproducida de Huissoon et al. (2002),
con el permiso de Blackwell Publishing Ltd. b) Histograma que
representa el principio de la dilución de CFSE para medir la pro-
liferación celular. Las células se cargan con CFSE al inicio del
procedimiento. Éste es un colorante citoplásmico que no interfiere
con la función celular. Las células se incuban con el mitógeno o
el antígeno por un número de días y la intensidad CFSE se ana-
liza con citometría de flujo. En la representación anterior, el pico
derecho describe las células que no han experimentado división
celular, y por tanto contiene la cantidad inicial completa de CFSE.
Con cada división celular la intensidad del colorante se reparte en
dos, de tal forma que cada ciclo de la división puede identificarse
como un nuevo pico a la izquierda de las células no proliferati-
vas. El bimarcaje de las células con los anticuerpos específicos
del linaje puede identificar qué tipos celulares ya respondieron al
estímulo y cuáles no.
460 CAP. 47 INMUNOLOGÍA CELULAR
midil éster (CFSE), por células T activadas y proliferantes
(fig. 47-3b). Estos métodos tienen la ventaja de no requerir
el uso y la medición de radioisótopos.
Las células T pueden estimularse para que proliferen en
respuesta a una variedad de estímulos, y éstos normalmente
se utilizan en una gama de concentraciones para mostrar una
dosis-respuesta (fig. 47-3a). La inducción del flujo de calcio
por ionomicina y un ionóforo del calcio estimula muchos
tipos de célula, y esta activación es totalmente independiente
de la célula normal que señala trayectorias. La fitohemaglu-
tinina, una lectina de la planta identificada primero por su
capacidad para aglutinar eritrocitos, y la concavalina A, esti-
mula todas las células T a través de varios receptores super-
ficiales. Infantes con inmunodeficiencia combinada grave
heredada (SCID) fallan en producir una respuesta para estos
mitógenos. El mitógeno de la fitolaca (pokeweed) estimula
ambas células T y B. Un acercamiento “más fisiológico” se
consigue imitando la ruta normal de la estimulación de la
célula T a través del receptor de la célula T. Esto puede lo-
grarse por el entrecruzamiento del receptor con los anticuer-
pos anti-CD3 (que activa todas las células T) o añadiendo
el antígeno al cultivo. Los antígenos son tomados por los
monocitos sanguíneos y los péptidos que estimulan la célula
T que se presentan a las células T en el contexto de las mo-
léculas MHC clase II. Tal proliferación antígeno-específica
activa sólo una proporción pequeña de células T de la sangre
periférica total (alrededor de 1 en 104), y de acuerdo con la
estimulación del mitógeno. Extraordinariamente, los pacien-
tes se detectan con la función de la célula T normal a grosso
modo pero con defectos sutiles en una comprobación más
detallada, por ejemplo, en candidiasis mucocutánea crónica,
las células T del paciente responden bien a todos los estímu-
los mitogénicos y antigénicos, excepto Candida. Este “agu-
jero” notable en el repertorio inmunitario es inexplicable.
Producción de citocina
La producción de citocina en respuesta a estímulos mitogé-
nicos y antigénicos también puede medirse. Debido a que
la producción de citocina es una función importante de las
células T, la detección de la producción defectuosa de la ci-
tocina por ciertos estímulos suele tener importancia clínica.
Las enfermedades causadas por la producción defectuosa
de citocina están ahora comenzando a ser descritas (p. ej.,
deficiencia de IL-12). La producción de citocina por la cé-
lula T se mide en el sobrenadante del cultivo por ELISA,
por la técnica de Elispot o por detección directa de citocinas
intracelulares en células T individuales con la tinción del
anticuerpo fluorescente. En el ensayo de Elispot, las células
T estimuladas se colocan en pozos para cultivo de plástico
de base plana que se han cubierto con anticuerpos contra
una citocina específica (p. ej., interferón-␥). Cualquier cito-
cina secretada por las células T está ligada por el anticuerpo
en el pozo. Después de un periodo de incubación, las célu-
las se lavan y la citocina ligada se detecta por un segundo
anticuerpo contra esa citocina. Ésta es visualizada por una
reacción enzima-sustrato cromogénica, y cada mancha en
el pozo representa una célula T secretora de citocina. La
detección intracelular de citocinas por citometría de flujo
es menos sensible que el método Elispot, pero permite la
caracterización adicional de células productoras individua-
les usando marcadores superficiales. Las células T son es-
timuladas por el antígeno o el mitógeno, y hacia el final
de la incubación, brefeldina A o monensina se agrega para
bloquear el transporte de citocina desde el retículo endo-
plásmico. Esto produce la acumulación de citocina intrace-
lular suficiente para ser detectada por marcaje directo del
anticuerpo. Las células entonces se marcan con anticuerpos
fluorescentes contra antígenos de superficie apropiados, por
ejemplo, CD3 y CD69, y la membrana celular se fija e im-
permeabiliza. Esto permite que la citocina intracelular sea
marcada con el anticuerpo específico (fig. 47-4).
CD69 PE
IFN-␥FITC
Figura 47-4 Expresión del interferón gamma (IFN-␥) en células
T estimuladas con enterotoxina estafilocócica B. CD69 (sobre el
eje vertical) identifica células T activadas, y cerca de 10% de éstas
se observa que expresan IFN-␥. Reproducida de Huissoon et al.
(2002), con el permiso de Blackwell Publishing Ltd.
Apoptosis
La apoptosis (muerte celular programada) es una función im-
portante de las células T, en la ontogenia del linfocito y como
parte de la involución de una inmunorrespuesta normal. Se
ha descrito el síndrome linfoproliferativo autoinmunitario
(ALPS) donde la capacidad de los linfocitos de experimen-
tar apoptosis está dañada. Con cada inmunorrespuesta la
proliferación de linfocitos no es equilibrada por una muerte
correspondiente de linfocitos cuando el estímulo contagioso
desaparece. Tales pacientes tienen inmunoglobulinas séri-
 ESTUDIOS FUNCIONALES
cas incrementadas, enfermedades autoinmunitarias con au-
toanticuerpos demostrables, ganglios linfáticos agrandados
y una cuenta alta de linfocito de sangre periférica con una
acumulación anormal de las células T CD4⫺/CD8⫺. Exis-
ten varias causas para este cuadro clínico, todas relacionadas
con defectos en la superficie celular o con mediadores in-
tracelulares indicadores de apoptosis. El tipo más común de
ALPS es causado por mutaciones en la proteína Fas (CD95).
Para detectar defectos en apoptosis mediada por Fas, las
células T del paciente primero se estimulan in vitro para
hacerlas susceptibles a la apoptosis mediada por Fas. Un
anticuerpo contra la molécula Fas se agrega al cultivo. En
individuos normales una proporción alta de células T sufre
apoptosis en respuesta a la unión de Fas en este ensayo. En
pacientes con ALPS esto está marcadamente dañado. La
apoptosis así inducida puede medirse por varias técnicas,
pero la más conveniente es la citometría de flujo. Las carac-
terísticas de las células apoptóticas, que pueden ser medidas,
incluyen la condensación nuclear (detectada por tinción con
yoduro de propidio), la unión de la anexina V a la fosfaditil
serina externalizada, fragmentación nucleosómica del DNA
(detectada por marcación fluorescente del extremo del nu-
cleótido terminal), o la activación de la caspasa usando Phi-
Phi Lux como sustrato fluorescente de la caspasa.
Pruebas in vivo
Las pruebas in vivo de la función célular T también son
posibles. La hipersensibilidad retardada (tipo IV de Gell y
Coombs) para recordar los antígenos es un buen indicador
de la competencia inmunitaria de la célula T. Estas pruebas
son baratas y rápidas, pero inconvenientes para usarse en
niños pequeños. Una cantidad pequeña del antígeno se in-
yecta en la dermis, y la reacción de enrojecimiento y de hin-
chazón después de 2 a 5 días indica una inmunorrespuesta
positiva a ese antígeno. Esta respuesta es mediada principal-
mente por las células T y por macrófagos. Se suprime en la
desnutrición, infección por VIH y sarcoidosis, y por cortico-
esteroides u otra terapia inmunosupresiva. Sin embargo, se
realiza rutinariamente sólo mediante comprobación por con-
tacto e inmunidad para la tuberculosis (prueba de Heaf o de
Mantoux). La interpretación de una prueba negativa es difícil
si la exposición anterior o estado de la vacunación BCG no se
conoce. Otros antígenos ubicuos, como de paperas, Candida
y toxoide de tétanos, también pueden obtener tales respues-
tas, pero no se emplean en la práctica clínica rutinaria.
Células asesinas naturales
La citotoxicidad es una función de las células T CD8+ y
de las células NK. La citotoxicidad de la célula T CD8+
461
es antígeno específica y no se mide en la práctica clínica
rutinaria. La citotoxicidad de la célula NK puede determi-
narse midiendo la lisis de la línea celular K562. Las células
K562 carecen de expresión HLA clase I, de tal forma que
son un blanco natural para las células NK. Las células se
cargan con 51cromo intracelular radiomarcado y se coincu-
ban con los linfocitos del paciente (que contienen células
NK efectoras). La lisis citotóxica de las células blanco es
identificada por la liberación del cromo en el medio de cul-
tivo. Es también posible evaluar la muerte de las células
K562 por citometría de flujo. Las células blanco tienen que
ser marcadas con un colorante lipofílico fluorescente antes
de la incubación con leucocitos del paciente, de modo que
puedan distinguirse de los linfocitos del paciente. La muer-
te citotóxica es identificada por su permeabilidad al yoduro
de propidio, que es excluido por las células viables. Con
cualquier método, la muerte debe determinarse sobre un
rango de proporciones blanco: célula efectora. Los defec-
tos de la muerte de NK se observan en inmunodeficiencias
raras asociadas con albinismo parcial (p. ej., síndromes de
Chédiak-Higashi y de Griscelli) y en síndromes hemofago-
cíticos familiares.
Linfocitos B
La función de la célula B es determinada con más facilidad
midiendo las inmunoglobulinas y anticuerpos séricos del
paciente contra agentes infecciosos específicos o vacunas,
o ambas. Si se encuentran niveles bajos del anticuerpo, la
respuesta a la vacunación puede aprobarse, lo cual es un
indicador global excelente de la función de la célula B. La
proliferación de la célula B (y T) se estimula con el mitó-
geno de fitolaca pokeweed, pero esto no da información
sobre la producción de inmunoglobulinas. Esto puede ser
probado con un ensayo de la placa inversa, donde las célu-
las B estimulantes se cubren con agarosa que contiene eri-
trocitos que se unen con la inmunoglobulina. Se adiciona el
complemento y las inmunoglobulinas unidas a eritrocitos
fijan el complemento e inducen hemólisis. Así, cada célula
productora de inmunoglobulinas puede identificarse por la
placa circundante de hemólisis. Este ensayo consume tiem-
po y ahora es raro que se realice, puesto que aporta poca
información adicional que no se obtiene a partir de pruebas
con anticuerpos séricos.
Neutrófilos
Los neutrófilos son células de breve duración que engullen
y destruyen activamente organismos. El defecto más co-
mún del neutrófilo es la reducida cantidad de estas células.
Esto puede ser congénito (p. ej., síndrome de Swachmann
462 CAP. 47 INMUNOLOGÍA CELULAR
o el de Kostmann), pero con frecuencia se adquiere des-
pués de la insuficiencia de la médula (p. ej., causada por
las drogas o neoplasmas). Los defectos funcionales de los
neutrófilos son relativamente raros, pero pueden investigar-
se rápido in vitro.
Para eliminar un organismo invasor, los neutrófilos deben
emigrar primero desde la circulación al tejido. Esto implica
la capacidad de responder a los estímulos quimiotácticos
y de adherirse al endotelio vascular. Pruebas de adhesión
neutrofílica y de migración quimiotáctica están disponi-
bles. La adhesión a materiales como lana de vidrio, placas
de cultivo de plástico y células endoteliales cultivadas es
posible medirlas. Sin embargo, los defectos detectados por
tales pruebas se deben a síndromes por defecto en la ad-
hesión leucocitaria y son diagnosticados con más facilidad
midiendo la expresión de la integrina leucocítica por cito-
metría de flujo (véase antes). La quimiotaxis de neutrófilos
se mide por la observación microscópica del movimiento
del neutrófilo hacia estimuladores como caseína y el pépti-
do F-met-leu-phe. Esto se realiza empleando una cámara de
Boyden, donde los neutrófilos son separados del estímulo
quimiotáctico por un filtro microporo, y el frente principal
de los neutrófilos que migran a través del filtro se mide.
Alternativamente, una suspensión del neutrófilo y los esti-
muladores quimiotácticos se colocan en pozos adyacentes
cortados en gel de agarosa, y el movimiento de neutrófi-
los en la agarosa hacia el estimulador también se mide. Los
desórdenes de la migración del neutrófilo se han descrito
en estados de deficiencia inmunitaria primaria, incluyendo
el síndrome hiper-IgE y el síndrome de Chédiak-Higashi,
así como en algunas otras enfermedades. Sin embargo, las
anormalidades no son diagnósticas o consistentes.
Después de emigrar al sitio de infección, los neutrófilos
eliminan sus organismos blanco por fagocitosis y destruc-
ción intracelular. Ambas funciones pueden probarse usando
Candida como el organismo blanco. Las esporas cultivadas
de Candida se incuban con neutrófilos aislados y el suero
donador normal (el cual opsoniza a Candida). Se agrega al
cultivo uridina marcada, y ésta se incorpora sólo por Can-
dida extracelular viable. Los cultivos neutrófilo/Candida se
recolectan de los filtros y la uridina 3H incorporada se mide
con un contador beta. Cuentas altas (comparadas con los
neutrófilos del control normal) indican fagocitosis neutro-
fílica dañada. Si se asume que la fagocitosis es normal, la
destrucción intracelular de Candida puede medirse lisando
los neutrófilos y evaluando la viabilidad de Candida por in-
corporación de 3H-uridina o por la exclusión del azul de
metileno. Staphylococcus aureus es un blanco alternativo
para los ensayos de la destrucción neutrofílica. En este caso,
la destrucción se mide por chapado del sobrenadante de
neutrófilos lisados en el medio de crecimiento y contando
las colonias bacterianas producidas. Un ensayo por flujo ci-
tométrico que mide la fagocitosis de Escherichia coli mar-
cada con fluoresceína opsonizada también se ha descrito.
En gran medida, la causa más común del defecto en
la destrucción intracelular neutrofílica es la enfermedad
granulomatosa crónica. A pesar de su nombre algo inútil,
es un desorden de inmunodeficiencia primaria causado por
la deficiencia de una de las enzimas de la cadena NADPH
oxidasa, responsable de la generación de superóxidos y
peróxidos microbicidas. Estos productos de la “explosión
respiratoria” se liberan dentro del fagolisosoma neutrofí-
lico y destruyen organismos fagocitados. La prueba clá-
sica para la detención de la integridad de esta función es
la prueba de reducción del nitroazul de tetrazolio (NBT).
El NBT es un colorante amarillo soluble que se adiciona a
la sangre entera. Los neutrófilos se estimulan con acetato
forbol miristato (PMA), y la reducción resultante del NBT
por un producto azul insoluble puede observarse micros-
cópicamente; los neutrófilos normales contienen gránulos
azules. La incapacidad de los neutrófilos para reducir el
NBT (por tanto, aparecen amarillos) indica un diagnóstico
de la enfermedad granulomatosa crónica. Existen otras téc-
nicas para medir la explosión respiratoria neutrofílica. La
emisión de luz por sustratos quimioluminogénicos, como
luminol y lucigenina, activados por la explosión respira-
toria neutrofílica, puede medirse con un luminómetro. Un
método de flujo citométrico simple basado en la oxidación
de la dihidrorrodamina está ganando amplia aceptación,
pues es muy elevada su sensibilidad y detecta con facilidad
portadores de genes defectuosos (fig. 47-5).
Basófilos
Los basófilos ligan anticuerpos IgE vía sus receptores Fc␧RI.
El entrecruzamiento de este IgE ligado por alergenos produ-
ce la activación del basófilo, con la inducción de la expresión
de CD63 y la liberación de la histamina y de otros productos.
Esto forma la base de novedosos medios de diagnóstico de
la alergia. Para muchos alergenos, la prueba de piel punzada
y la determinación de IgE alergénico específico en suero son
apoyos útiles para el diagnóstico de la alergia. Sin embargo,
la comprobación por punción de la piel y la determinación
de IgE alergénico específico en suero son útiles para el diag-
nóstico de la alergia. Sin embargo, las pruebas en piel no
siempre son posibles, y los ensayos in vitro para IgE espe-
cífico no están disponibles para todos los posibles alergenos
(en especial cuando el alergeno sospechoso es un fármaco).
Por tanto, un medio alternativo para detectar una respuesta
alérgica in vitro es agregar el alergeno sospechoso a la san-
gre del paciente, y medir tanto la liberación de la histamina
en el supernadante como la expresión de CD63 en basófilos
activados. Estos ensayos están disponibles en el comercio,
 EL FUTURO DE LA INMUNOLOGÍA CELULAR 463

Fluorescencia FL1

Figura 47-5 Medición de la explosión respiratoria por la oxidación de la dihidrorrodamina. Los neutrófilos en sangre entera son esti-
mulados por E. coli (B) o por PMA (C), y se agrega dihidrorrodamina (DHR). La explosión oxidativa convierte DHR a rodamina, con
un aumento resultante en la fluorescencia medida en FL1 comparado con los neutrófilos sin estimular (A). Los neutrófilos de pacientes
con enfermedad granulomatosa crónica no oxidan la DHR, y el cambio en la fluorescencia de la población no se observa. Los portadores
sanos de genes defectuosos de la ruta NADPH oxidasa muestran generalmente neutrófilos normales y anormales, produciendo dos picos
de fluorescencia.

pero todavía no se han validado con amplitud en la práctica y eficiencia en el trabajo para asegurar calidad. El enlace
clínica. cercano con el personal clínico es también esencial para en-
tender la importancia de las anormalidades observadas.

El futuro de la inmunología celular

Éste es un campo que continúa ampliándose indudablemen-
te. Un número creciente de técnicas aparecen a través de
las aplicaciones de la investigación al laboratorio clínico
rutinario. Las aplicaciones del citómetro de flujo continúan
aumentando, por ejemplo, los métodos están ahora disponi-
bles para combinar las mediciones mediante flujo citomé-
trico convencional con la biología molecular in situ, y los
nuevos reactivos sin anticuerpos aumentan el alcance de las
propiedades celulares que pueden evaluarse por este mé-
todo eficaz. Los ensayos celulares funcionales derivan en
particular de los recientes avances de los procesos básicos
de la inmunología y de la enfermedad. Como en todos los
métodos de diagnóstico de laboratorio, estas pruebas deben
evaluarse cuidadosamente y controlarse de forma apropiada,
pero la naturaleza de los ensayos funcionales los hace difíci-
les de estandarizar. La interpretación de los ensayos funcio-
nales también está saturada de dificultades, y los laboratorios
que ofrecen tales ensayos deben tener suficiente experiencia
Lecturas adicionales
Rose NR, Conway de Macario E, Folds JD et al. (eds). Manual
of Clinical Laboratory Immunology, 5th edn. 1997: American
Society for Microbiology, Washington.
Baugarth N, Roederer M. A practical approach to multicolour
flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods
2000; 243:77-97.
Brando B, Barnett D, Janossy G et al. Cytofluorometric methods
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ropean Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry
2000; 42: 327-346.
United Kingdom National External Quality Assessment Service
(UKNEQAS) immune monitoring scheme. 2003: http://www.
ukneqas.org.uk/Directory/LEUCO/immmon.htm
Comans-Bitter WM, de Groot R, van de Beemd R et al. Immu-
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1997; 130: 388-393.
Primary Immunodeficiency Diseases-Report of an IUIS Scientific
Group. Clin Exp Immunol 1999; 118 (SI): 1-28.
 48
Enfermedades del complejo inmunitario
y crioglobulinas
Siraj A Misbah
Introducción
Los complejos inmunitarios (CI) se forman cada vez que el
anticuerpo encuentra el antígeno. Éste es un proceso fisio-
lógico dinámico que permite que los antígenos exógenos
potencialmente dañinos sean depurados por el sistema fago-
cítico mononuclear del huésped (MPS). La falla para depu-
rar los complejos con éxito puede conducir al depósito del
complejo inmunitario en las membranas basales del capilar
del plexo glomerular, dérmico, sinovial y coroideo, donde
desencadenan una respuesta inflamatoria. La inflamación in-
ducida por los complejos inmunitarios depende de la capaci-
dad de los complejos para activar el complemento (determi-
nada por el isotipo de inmunoglobulina), con la generación
consiguiente de los mediadores proinflamatorios potentes
(C5a). El C5a es un quimiotáctico poderoso que atrae los
leucocitos y monocitos polimorfonucleares circulantes hacia
el sitio de depósito del complejo inmunitario, sirviendo para
amplificar el daño tisular. El sitio de depósito del complejo
inmunitario depende en parte de su tamaño, como se ejem-
plifica en el riñón, donde los complejos inmunitarios peque-
ños logran pasar a través de la membrana basal glomerular
pero los complejos grandes son incapaces de hacerlo y se
acumulan entre el endotelio y la membrana basal.
Varios mecanismos aseguran que el depósito del complejo
inmunitario no incida en la salud. Éstos incluyen: a) fagoci-
tosis del CI por el MPS, el tamaño del complejo inmunitario
es un factor crítico en este sentido, puesto que el MPS sólo es
capaz de depurar los complejos pequeños; b) integridad de
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
la ruta del complemento, las proteínas del sistema del com-
plemento juegan un papel vital porque mantienen el IC en la
solución cubriendo los complejos con C3b (opsonización).
Esto previene la formación de enrejados del complejo inmu-
nitario grande y de la precipitación inmunitaria; además, el
CI cubierto con C3b interactúa con el receptor de C3b (CR1,
CD35) en las células rojas circulantes, que actúan como un
transportador eficiente de los complejos inmunitarios hacia
el MPS en el hígado y el bazo (fig. 48-1). Dado el papel vital
de las proteínas del complemento en la depuración del CI,
no es sorprendente que los pacientes con deficiencia primaria
del complemento (en especial de los primeros componen-
tes del complemento C1, C4, C2) tengan una incidencia alta
de la enfermedad del complejo inmunitario.
Otros factores que influyen en el depósito del complejo
inmunitario incluyen a las propiedades fisicoquímicas del
antígeno y del anticuerpo, como carga eléctrica, valencia,
avidez de la interacción antígeno-anticuerpo y el isotipo
de inmunoglobulina, por ejemplo, el CI que contiene antí-
genos catiónicos se liga ligeramente a la membrana basal
glomerular aniónica, causando lesión tisular.
Aunque los complejos inmunitarios circulantes ocurren
en una gran cantidad de enfermedades (cuadro 48-1), en
la mayoría de los casos estos complejos son un hallazgo
tipo epifenómeno o incidental. Este capítulo se limita a
aquellas enfermedades donde hay suficiente evidencia para
apoyar un papel patogénico de los complejos inmunitarios:
enfermedad del suero, lupus eritematoso sistémico (SLE) y
crioglobulinemia mixta.
466 CAP. 48 ENFERMEDADES DEL COMPLEJO INMUNITARIO Y CRIOGLOBULINAS

Receptor Fc

Figura 48-1 Transporte de los complejos inmunitarios por los eritrocitos hacia los fagocitos mononucleares en el hígado y bazo.

Cuadro 48-1 Desórdenes relacionados con los complejos Ensayos para los complejos inmunitarios
inmunitarios circulantes circulantes
Cerca de 30 ensayos para la detección de los complejos
Inmunológicos Lupus eritematoso sistémico inmunitarios circulantes fueron descritos en la década de
Artritis reumatoide
1970 con la expectativa (posteriormente insatisfecha) de
Crioglobulinemia mixta
que podrían ser útiles en el diagnóstico clínico y el manejo de la
Síndrome de Felty
Espondilitis anquilosante enfermedad del complejo inmunitario. Estos ensayos fue-
Esclerodermia ron divididos ampliamente en métodos físicos diseñados
Enfermedad del suero para distinguir entre la inmunoglobulina monomérica y los
Infecciones complejos inmunitarios, y los métodos biológicos depen-
Bacterianas Staphylococcus aureus, dientes de la interacción de los receptores celulares de la
Pseudomonas aeruginosa, superficie o del complemento con los complejos inmunita-
Streptococcus sp. rios (cuadro 48-2).
Micobacterianas M. tuberculosis Los problemas inherentes con los métodos físicos fue-
Parasitarias Tripanosomiasis, oncocercosis ron ejemplificados con el ensayo de precipitación con po-
Malignidad Todas las formas
lietileno-glicol (PEG). Además de precipitar los complejos
Fisiológicos Individuos normales saludables
inmunitarios, el PEG, incluso en concentraciones bajas,
Embarazo
también precipita una variedad de proteínas séricas, inclu-
yendo IgG, que causa dificultades importantes en la inter-
pretación de los resultados. Los métodos biológicos para
la detección de los complejos inmunitarios basados en el
Independientemente de la causa subyacente, las enfer- reconocimiento de los complejos en los sistemas humoral
medades del complejo inmunitario comparten varias carac- o del receptor celular también probaron ser poco fiables. El
terísticas comunes de importancia clínica: a) participación ensayo en células Raji, que utiliza una línea celular linfo-
multisistema debido al depósito de los complejos en los ca- blastoide derivada de un paciente con linfoma de Burkitt,
pilares del plexo del riñón, de la piel, sinovial y coroideo; se empleó de manera extensa en la década de 1970. Puesto
b) hipocomplementemia durante los periodos de la enfer- que el ensayo se basa en la capacidad de las células linfo-
medad activa; c) la reducción en los niveles del complejo blastoides (que poseen receptores superficiales para C1q,
inmunitario circulante por terapia (drogas, plasmaféresis) C3b, C3d, pero ninguna inmunoglobulina superficial) de
conduce a la mejoría en la actividad de la enfermedad. ligar los complejos inmunitarios séricos que también han
 ENFERMEDAD SÉRICA
Cuadro 48-2 Ensayos del complejo inmunitario
Métodos físicos (ensayos que dependen de las
propiedades físico-químicas del complejo)
Métodos biológicos (ensayos que dependen de)
i) Reacción con las antiglobulinas (sujeta a la
interferencia por los factores reumatoides endógenos)
ii) Interacciones complemento-proteína
iii) Receptores celulares de superficie
*Ensayos que se han encontrado analíticamente aceptables por el grupo de trabajo de WHO/IUS.
ligado el complemento, un índice inaceptablemente alto de
positivos falsos se encontró en los pacientes con anticuerpos
antilinfocitos, como en el SLE. Aunque un grupo de trabajo
conjunto de la Organización Mundial de la Salud y la Unión
Internacional de Sociedades Inmunológicas (IUIS) en 1981
encontró cuatro ensayos analíticamente aceptables, ningu-
no ha soportado la evaluación crítica de su utilidad clínica
por su sensibilidad muy variable, especificidad y valor pre-
dictivo escaso. Además, la incapacidad de la mayor parte
de los ensayos para detectar el antígeno específico den-
tro de los complejos inmunitarios es una desventaja signi-
ficativa. El grupo de trabajo conjunto WHO/IUIS concluyó
que la detección de los complejos inmunitarios circulan-
tes no es esencial en ninguna enfermedad humana y, más
importante, que la demostración de los complejos inmuni-
tarios circulantes no es específica para la enfermedad del
complejo inmunitario. En consecuencia, la mayor parte
de los laboratorios clínicos de inmunología han abandonado
los ensayos del complejo inmunitario y hasta la fecha no
hay evidencia que sugiera que los ensayos del comple-
jo inmunitario deban reintroducirse en la práctica clínica de
rutina. En aquellos casos donde se sospecha la enfermedad
del complejo inmunitario, la demostración de depósitos de
inmunoglobulina y del complemento en una biopsia de los
órganos afectados (p. ej., piel, riñón) se toma como evidencia
implícita de la presencia de depósitos del complejo inmuni-
tario. Los ensayos de los complejos inmunitarios circulantes
son un sustituto pobre para el examen inmunohistológico
directo y la enfermedad del complejo inmunitario no debe,
bajo ninguna circunstancia, diagnosticarse principalmente
sobre la demostración de complejos en el suero.
Enfermedad sérica
La enfermedad del suero es un buen modelo para explicar
las enfermedades del complejo inmunitario. Von Pirquet en
467
Precipitación con polietilen-glicol
Crioprecipitación
Ultracentrifugación analítica
Ensayo policlonal del factor reumatoide
Ensayo monoclonal del factor reumatoide*
125C1q fijador*
Ensayo dependiente de la conglutinina (una proteína bovina que
liga los complejos inmunitarios)*
Radioinmunoensayo en células Raji*
1908 delineó la enfermedad del suero como una entidad
distinta en los niños con inmunizaciones repetidas con el
suero antidiftérico derivado de caballos. La enfermedad
del suero se manifestó de manera clínica como urticaria,
fiebre, linfadenopatía, artralgia y proteinuria 8 a 12 días
después de la inyección del suero del caballo. El periodo
latente de 8 a 12 días reflejó el tiempo necesario para los
pacientes para producir los anticuerpos contra las proteínas
del caballo. En una concentración suficiente de los comple-
jos del anticuerpo con el antígeno circulante, la carga resul-
tante del complejo inmunitario abruma los mecanismos de
control del cuerpo, conduciendo al depósito del complejo
inmunitario y a hipocomplementemia. La mejora clínica
depende de la depuración de los complejos circulantes, que
ocurre de manera espontánea en muchos pacientes después
de dos a tres semanas; una minoría puede requerir trata-
miento con esteroides para acelerar la recuperación.
Más recientemente, la enfermedad del suero se ha estu-
diado de forma extensa en pacientes con anemia aplásica
que reciben globulina antitimocito de caballo (ATG). El
síndrome clínico descrito en estos pacientes es casi idén-
tico a aquel descrito por von Pirquet, con altos niveles de
complejos inmunitarios circulantes e hipocomplemen-
temia que coinciden con la incidencia de erupción en la
piel y de artralgia. Los estudios inmunofluorescentes de la piel
de una biopsia revelan depósitos abundantes de inmunog-
lobulina y de C3 en las paredes de los vasos sanguíneos
pequeños.
Con la declinación en el uso de la ATG, las reacciones
de hipersensibilidad al fármaco son en la actualidad la causa
más común de la enfermedad del suero. Un amplio rango de
fármacos puede actuar como haptenos y ligar a las proteínas
del plasma con el subsiguiente complejo fármaco-proteína
que desencadena una respuesta inmunitaria, por ejemplo,
penicilina, sulfamidas y tiouracilos. La enfermedad del sue-
ro inducida por fármacos es normalmente autolimitante,
condicionada a que el agente causante se retire.
468 CAP. 48 ENFERMEDADES DEL COMPLEJO INMUNITARIO Y CRIOGLOBULINAS
Investigación
El diagnóstico de la enfermedad del suero es evidente por
la característica presentación clínica en un paciente con el
antecedente de ingestión del fármaco. Los desafíos del fár-
maco no se requieren de manera normal y no deben reali-
zarse de rutina. El papel de la investigación del laboratorio
es limitado; si bien las mediciones del complejo inmunita-
rio es probable que muestren altos niveles en la circulación,
esto se realiza o se requiere raras veces. Durante la etapa
aguda de la enfermedad, la hipocomplementemia marcada
(C3, C4 reducidos) es una característica y proporciona un
indicador útil del depósito sistémico del complejo inmuni-
tario. Las biopsias del tejido pueden requerirse en los casos
de incertidumbre diagnóstica y muestran el depósito de in-
munoglobulina y de C3 en la inmunofluorescencia directa
del tejido cutáneo y renal.
Lupus eritematoso sistémico
El lupus eritematoso sistémico (SLE) es un desorden hu-
mano común del complejo inmunitario con una prevalencia
de 200 casos por cada 100 000 en el Reino Unido. En su
forma más florida, el SLE afecta la piel, los riñones, las ar-
ticulaciones y el sistema nervioso central, aunque muchos
Figura 48-2 Inmunofluorescencia de biopsias renales y de la
piel en un paciente con SLE. a) Depósitos glomerulares de IgA
en una distribución membranosa. b) Depósitos glomerulares de
C1q en una distribución membranosa. c) Depósitos granulares
de IgG en la unión dermoepidérmica (banda de lupus). Corte-
sía del Dr. W. Merchant, Leeds General Infirmary. a) y b), cor-
tesía del Dr. P. Harnden, Leeds General Infirmary.
pacientes pueden tener sólo un órgano implicado al princi-
pio de la presentación. Los pacientes que se presentan con
enfermedad neurológica predominante plantean problemas
de diagnóstico difíciles, los cuales se tratan después en este
capítulo. Mucho del daño que causa el lupus en el órgano
se liga directamente al depósito extenso de los complejos
inmunitarios que ocurre en la piel, los riñones y el plexo
coroideo. Como en la enfermedad del suero, la inmunofluo-
rescencia de las biopsias de piel y renales muestra depósitos
de inmunoglobulina y de complemento (fig. 48-2), mientras
los complejos inmunitarios circulantes se encuentran en una
proporción elevada de pacientes con enfermedad activa. De
acuerdo con el papel clave del sistema del complemento en
el procesamiento de los complejos inmunitarios, un rango
de alteraciones del complemento se observa en los pacien-
tes con SLE (se resume en el cuadro 48-3).
Investigación de los pacientes con sospecha
de lupus eritematoso sistémico
El SLE se relaciona con una multitud de anormalidades
de laboratorio, incluyendo hipergammaglobulinemia po-
liclonal, leucopenia, hipocomplementemia y una plétora
de autoanticuerpos en la sangre. Mientras el aumento po-
liclonal en las inmunoglobulinas del suero es un marcador
 LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO
Cuadro 48-3 Alteraciones del sistema del complemento
en el SLE
Primarias La deficiencia total de los primeros compo-
nentes del complemento C1q, C1r-1s, C4, C2
relacionada con la alta incidencia del SLE
La deficiencia parcial de C4 con uno a dos
alelos nulos de C4 se observa en cerca de
15% de los pacientes con SLE
Secundarias La expresión reducida de CR1 es una carac-
terística del SLE avanzado
La actividad incrementada de la ruta clásica y
alternativa se refleja como
hipocomplementemia (TC3, TC4)
Los anticuerpos para C1q se relacionan con
enfermedad grave, en particular
glomerulonefritis
no específico de la activación del sistema inmunitario, se
produce una velocidad de sedimentación globular (ESR)
elevada que actúa como una pista de diagnóstico útil cuan-
do se combina con una proteína C-reactiva (CRP) normal.
Aunque la incapacidad para montar una respuesta de la
proteína de fase aguda ante la enfermedad activa se le reco-
noce de manera extensa como una característica del SLE,
ésta no es invariable. Los pacientes con serositis activa,
sinovitis crónica e infección bacteriana concomitante son
una excepción en este dictamen.
Autoanticuerpos como marcadores de enfermedad
La presencia de anticuerpos circulantes para los antígenos nu-
cleares es el sello característico del lupus activo. Los párrafos
subsiguientes resumen los principios y la utilidad clínica de
los ensayos que se emplean para detectar estos anticuerpos.
Anticuerpos antinucleares (ANA)
En la práctica clínica, la detección de anticuerpos antinu-
cleares (ANA), según lo demostrado por inmunofluorescen-
cia indirecta, es el único signo más útil para el diagnóstico
del SLE. Los ANA son detectados al sobreponer células del
tejido de roedor o del cultivo tisular derivado de una línea
celular epitelial humana (HEp-2) con el suero de prueba,
seguido por un segundo anticuerpo, IgG antihumano con-
jugado con fluoresceína. Usando el tejido del roedor, cerca
de 95% de los pacientes con enfermedad activa sin tratar
tienen un alto título de ANA (> 1 en 80). Las células HEp-2
exhiben un grado incluso más alto de sensibilidad, con un
aproximado de 98 a 99% de positividad en los pacientes con
enfermedad sin tratar. Las recientes directrices autorizadas
469
Cuadro 48-4 Causas de ANA positiva
Enfermedad del tejido conectivo
SLE
Síndrome de Sjögren
Polimiositis
Artritis reumatoide
Vasculitis
Enfermedades del hígado
Hepatitis activa crónica autoinmunitaria
Cirrosis biliar primaria
Enfermedad del hígado alcohólica
Fármacos
Infección
Malignidad
Individuos sanos
del Colegio Americano de Reumatología, el Colegio de Pa-
tólogos Americanos, la Sociedad de Inmunología Clínica y
los Institutos Nacionales de Salud recomiendan el uso de las
células HEp-2 como el mejor sustrato para el tamizaje de
ANA (Kavanaugh y cols.). Con el uso generalizado de las
células HEp-2, la existencia del lupus ANA negativo como
una entidad de diagnóstico se ha puesto en duda (Cross y
cols.). Contrariamente, la probabilidad del SLE sin tratar en
un paciente con ANA negativo en células HEp-2 es del or-
den <1%. Un resultado positivo de ANA, sin embargo, no es
específico para el SLE, puesto que ocurre en una variedad
de otras enfermedades (cuadro 48-4).
Varios patrones distintivos de ANA se reconocen en las
células HEp-2: homogéneo, nucleolar, moteado, periféri-
co y centromérico (fig. 48-3). Excepto el anticuerpo del
centrómero, que es un marcador específico del síndrome
CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, disfunción
esofágica, esclerodactilia, telangiectasia) y de la esclero-
dermia, ninguno de los otros patrones de ANA es un in-
dicador confiable de la especificidad antigénica. En vista
de esto y a la incidencia de ANA en muchos otros estados
de enfermedad, es esencial caracterizar un ANA positivo
adicional en términos de su especificidad antigénica. En el
SLE, un ANA positivo por inmunofluorescencia indirecta
refleja la presencia de anticuerpos para los antígenos nuclea-
res como DNA, histonas y un grupo de antígenos nucleares
extractables (ENA), conocidos individualmente como Ro,
La, Sm y U1-RNP (uridina proteína ribonuclear).
Anticuerpos para los antígenos nucleares extractables (ENA)
Ro, La y Sm fueron nombrados así después de los pacien-
tes en quienes éstos fueron primero caracterizados: Robert,
470 CAP. 48 ENFERMEDADES DEL COMPLEJO INMUNITARIO Y CRIOGLOBULINAS
Lane y Smith. Junto con U1-RNP (uridina proteína ribonu-
clear), estas proteínas son responsables de empalmar y pro-
cesar el mRNA. En contraste con los ANA, los anticuerpos
para los ENA son específicos para el lupus y los desórde-
nes relacionados y son, por tanto, útiles en el diagnóstico.
Además, los anticuerpos individuales tienden a correlacio-
narse con ciertas manifestaciones clínicas; el anti-Ro ocu-
rre en el lupus y el síndrome de Sjögren y se correlaciona
con enfermedad cutánea. Es importante reconocer que los
anticuerpos anti-Ro pueden surgir en ausencia de ANA. El
perfil ANA negativo, Ro positivo ocurre en una minoría de
pacientes con lupus (<1% en las células HEp-2 como sus-
trato); en sustrato de tejido del roedor, sin embargo, esta
figura se eleva hasta 5%, puesto que el antígeno Ro tiene
Figura 48-3 Patrones de tinción de los anticuerpos antinu-
cleares (ANA) en las células HEp-2. a) Homogéneo. b) Mo-
teado. c) Nucleolar. d) Periférico. e) Centromérico (nótese el
aspecto de puntos finos múltiples, representando la tinción de
los cinetocoros de 23 pares de cromosomas). Cortesía del señor
K. Taylor, Leeds General Infirmary.
una representación pobre en el tejido del roedor. En 5 a
25% de embarazadas con lupus, los anticuerpos anti-Ro
cruzan la placenta para causar lupus cutáneo transitorio en
el recién nacido; más grave resulta que uno a tres bebés
nacidos de madres anti-Ro positivas desarrollan el bloqueo
cardiaco congénito permanente, requiriendo la inserción de
marcapasos. Mientras los anticuerpos anti-Ro ocurren en
aislamiento en cerca de 30% de los pacientes con lupus,
son acompañados por los anticuerpos anti-La en 15% de
los casos. En la última situación los pacientes tienen meno-
res probabilidades de padecer enfermedad renal.
Además de las correlaciones clínicas discutidas antes, el
perfil ANA negativo anti-Ro positivo también actúa como
un marcador para la deficiencia primaria del complemento
 LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO
subyacente que afecta los primeros componentes del com-
plemento. Los estudios de los pacientes con deficiencias ho-
mocigotas de C4 y C2 revelan positividad anti-Ro en cerca
de 50 a 70% de los casos. Aunque el mecanismo exacto res-
ponsable de la asociación del SLE con la deficiencia prima-
ria del complemento no se ha establecido, la existencia de
una jerarquía de la gravedad de la enfermedad, en cuanto al
componente faltante del complemento, está bien documen-
tada; la gravedad de la enfermedad es mayor en pacientes
con deficiencia de C1q, seguida de cerca por la deficiencia
total de C4. La gravedad de la enfermedad en pacientes con
deficiencia de C2 es comparable a la observada en pacientes
con las rutas del complemento intactas.
Los anticuerpos anti-Sm tienen una especificidad alta
para el lupus, pero su prevalencia varía con el origen étnico
del paciente; 30% de pacientes afrocaribeños son anti-Sm
positivo, en contraste con el 10% de caucásicos. En vista de
las secuencias compartidas de péptidos entre Sm y U1-RNP,
los anticuerpos para Sm y U1-RNP tienden a surgir juntos.
La presencia de anticuerpos anti-U1-RNP en aislamiento
se pensó para identificar a un grupo de pacientes con sín-
dromes de traslape del lupus, con características adiciona-
les de polimiositis y esclerodermia. Colegas y estudiosos
introdujeron el término “enfermedad mixta del tejido conec-
tivo” (MCTD) para caracterizar a estos pacientes, a quienes
se consideró tenían un pronóstico mejor en vista del riesgo
más bajo de enfermedad renal y neurológica. El seguimiento
a largo plazo de la cohorte original ha cuestionado la exis-
Ánodo
Dirección del movimiento
de los anticuerpos
Suero positivo de los
pacientes
Suero negativo de los
pacientes
Línea de precipitación del complejo
inmunitario específico
Figura 48-4 Inmunoelectroforesis de contracorriente. Reproducida de Chapel y cols. (1999) con el consentimiento de Blackwell
Scientific.
471
tencia de la MCTD como una entidad benigna distinta, pues-
to que muchos de los pacientes han desarrollado, después,
enfermedad renal y neurológica.
Métodos de detección
Ensayos de inmunoprecipitación Los anticuerpos para
los ENA se pueden detectar por varios métodos. Inicial-
mente, muchos laboratorios utilizan la inmunoelectrofore-
sis de contracorriente (CIE) o el método de doble difusión
de Ouchterlony para demostrar la presencia de los anticuer-
pos. La CIE se realiza en geles de agar, permitiendo que el
anticuerpo y el antígeno emigren en direcciones opuestas
para encontrarse en el centro del portaobjetos, donde la
inmunoprecipitación ocurre al pH apropiado (fig. 48-4).
La técnica de doble difusión de Ouchterlony también se
basa en la inmunoprecipitación; el antígeno se coloca en
la celdilla del centro de un portaobjetos de agar, mientras
que los sueros de control y del paciente se colocan en los
pozos que rodean el pozo central. Después de 24 a 48 h
de incubación, las líneas de precipitación se forman, deno-
tando la presencia de una reacción antígeno-anticuerpo. La
identidad del precipitado se establece por la comparación
de las líneas de precipitación producidas por el suero de
referencia previamente caracterizado. Tanto la CIE como
la difusión doble son técnicas cualitativas adecuadas para
detectar altas concentraciones de anticuerpos específicos
Cátodo
Dirección del movimiento Antígeno
de los antígenos
Antígeno
472 CAP. 48 ENFERMEDADES DEL COMPLEJO INMUNITARIO Y CRIOGLOBULINAS

(0.1 a 1.0 µg/ml). De vez en cuando, los resultados de las

pruebas de doble difusión pueden ser difíciles de interpre-
tar. Los resultados negativos falsos pueden ocurrir si la
concentración del antígeno no se ajusta para producir una
zona de equivalencia con la concentración del anticuerpo
en el suero del paciente, y las líneas múltiples de precipita-
ción de especificidad desconocida pueden interferir con la
identificación de los anticuerpos clínicos significativos. En
contraste con la difusión doble, la CIE exhibe relativamen-
te mayor sensibilidad, velocidad y capacidad de manejar
más muestras. Sin embargo, es técnicamente demandante
y los resultados son menos equívocos.

Inmunoensayos enzimáticos En los últimos años, los in-

munoensayos en emparedado se han desarrollado para de-
tectar los anticuerpos para los ENA. El método implica la
adición del suero del paciente que contiene el anticuerpo a
los pozos de la placa de microtitulación cubiertos con ENA
purificado o recombinante individual. Los anticuerpos liga-
dos al antígeno se detectan por la adición de un anticuerpo
policlonal o monoclonal de inmunoglobulina antihumana
conjugado con una enzima o una molécula luminiscente. La
concentración del anticuerpo en el suero del paciente está
directamente relacionada con la intensidad del producto co- Marcadores
loreado o fluorescente. Los inmunoensayos enzimáticos son (MW en kDa)
más sensibles (sensibilidad analítica de 1 a 10 ng/ml) que la
CIE o la difusión doble. Por tanto, los resultados positivos
falsos pueden ocurrir en sueros hipergammaglobulinémicos
como resultado de la unión no específica incrementada.

Inmunotransferencia Un método adicional para la detec-

ción de los anticuerpos para los ENA es la técnica cualita-
tiva de inmunotransferencia (Western blot) (fig. 48-5). Los
antígenos de un extracto nuclear son separados de acuerdo
al peso molecular por electroforesis con dodecil sulfato de
sodio (SDS-PAGE). Los antígenos separados entonces se
transfieren (blotting) al papel de nitrocelulosa, que se corta
en tiras simples y se incuba con el suero del paciente (las
tiras comerciales precubiertas con antígenos individuales
están también disponibles en presentación comercial). Los
anticuerpos ligados se detectan incubando las tiras con una
inmunoglobulina antihumana marcada enzimáticamente.
En un ejercicio reciente de control de calidad realizado por
la Fundación de la Artritis y los Centros para el Control de
Enfermedades, de Estados Unidos, la inmunotransferencia
se empleó para reanalizar las especificidades anti-ENA en
los sueros de referencia caracterizados previamente por in-
munofluorescencia y difusión doble (Smolen y cols.). Los
resultados de la inmunotransferencia estaban en gran medi-
da de acuerdo con la difusión doble, aunque las diferencias
en laboratorios individuales se observaron en referencia al
reporte de las bandas sin especificar adicionales. Esto es un
fenómeno reconocido con la inmunotransferencia debido a
Tinción
frontal
Figura 48-5 Perfiles clásicos de los anticuerpos para los antíge-
nos nucleares extractables en la inmunotransferencia. Modificada
con permiso de Biodiagnostics Ltd. SS-A y SS-B son términos
alternativos para los anticuerpos anti-Ro, La, respectivamente.
P1 y P2 se refieren a las subunidades individuales de Ro. Los
anticuerpos adicionales incluidos son anti-Scl 70 (marcador para
la esclerodermia), anti-Jo1 (marcador de polimiositis con el anti-
PCNA de la enfermedad intersticial del pulmón (antígeno nuclear
celular proliferante; visto en 2 a 10% de los casos de SLE).
las diferencias menores en las técnicas empleadas por los
laboratorios individuales. La inmunotransferencia no se
emplea en la actualidad de rutina en los laboratorios clí-
nicos de inmunología. En vista de su especificidad, tiende
a reservarse para la investigación de muestras de pacientes
 LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO
que producen resultados discrepantes por los ensayos están-
dares. En aquellos pacientes raros con convincente eviden-
cia clínica de lupus o de desórdenes de traslape de lupus, en
quienes los ensayos convencionales no pueden detectar los
anticuerpos para el DNA y los ENA, la inmunotransferencia
ofrece el potencial de detectar los anticuerpos para los antí-
genos previamente no caracterizados.
Anticuerpos para el DNA de doble cadena (anti-dsDNA)
Los anticuerpos dirigidos contra el DNA de doble cadena
(anti-dsDNA) juegan un papel importante en la patogenia
del daño al órgano en el SLE, en particular en el riñón.
Los complejos de los anticuerpos dsDNA e IgG anti-DNA
se han demostrado en los eluidos de biopsias renales. De
acuerdo con este hallazgo, los niveles de anticuerpos anti-
dsDNA tienden a correlacionarse bien con la actividad total
de la enfermedad en el SLE. En la mayoría de los pacien-
tes, un aumento en los niveles de anti-dsDNA en el suero
es predictivo de un recrudecimiento de la enfermedad. Una
caída ocasional en los niveles previamente elevados de los
anti-dsDNA puede presagiar nefritis del lupus, un probable
reflejo del depósito del complejo inmunitario en el riñón.
Mientras los anticuerpos para dsDNA tienen una especifi-
cidad alta para el SLE, y ocurren en 75 a 95% de los pacien-
tes con enfermedad sin tratar, los anticuerpos para el DNA
de una sola cadena (ssDNA) no específicos surgen en una
variedad de otros desórdenes (artritis reumatoide, hepatitis
activa crónica, ancianos sanos) además del lupus.
Métodos de detección
De los muchos métodos disponibles para detectar los anti-
dsDNA, la mayor parte de los laboratorios clínicos de in-
munología utiliza uno de los siguientes tres ensayos.
Ensayo de Farr El ensayo emplea dsDNA radiomarcado
(125I es el radioisótopo más utilizado) como antígeno. Incu-
bando el suero de prueba que contiene el anti-dsDNA con
125I-dsDNA se conduce a la formación de los complejos in-
munitarios, que se precipitan usando una solución saturada
de sulfato de amonio. La cantidad de anti-dsDNA es directa-
mente proporcional a la cantidad de radiactividad en el pre-
cipitado. La concentración de anti-dsDNA en las muestras
de prueba se deriva midiendo la cantidad de DNA marcado
con 125I en la presencia de un suero estándar de referencia
que contiene cantidades conocidas de anticuerpo. Un suero
estándar de la WHO designado Wo/80 está disponible para
la estandarización del ensayo. Puesto que el sulfato de amo-
nio interrumpe los complejos inmunitarios que contienen an-
ticuerpos de avidez más baja, el ensayo de Farr detecta los
anticuerpos de avidez alta que se correlacionan bien con la
473
presencia de lupus grave relacionado con enfermedad renal.
El ensayo de Farr, sin embargo, no detecta los anticuerpos
anti-dsDNA de baja avidez, que existen en pacientes con lu-
pus relativamente ligero.
ELISA Un número de ensayos comerciales ELISA
que utilizan dsDNA purificado (recombinante o a partir de
extracto del timo de becerro) está disponible para la detec-
ción de los anticuerpos DNA. Puesto que el dsDNA no se
liga directamente a los pozos plásticos, la mayor parte de
los ensayos utilizan DNA acomplejado para poli-l-lisina
o protamina para cubrir las placas de microtitulación. En
contraste con el análisis de Farr, los ensayos ELISA detec-
tan los anticuerpos DNA de avidez baja y alta. Por tanto,
el ensayo ELISA exhibe un grado más alto de sensibilidad
para los propósitos de diagnóstico que el ensayo de Farr;
sin embargo, su especificidad relativamente más baja ge-
nera un número significativo de resultados falsos positivos
del anticuerpo del DNA en pacientes sin lupus, por ejem-
plo, infecciones, enfermedad crónica del hígado.
Inmunofluorescencia indirecta utilizando Crithidia lu-
ciliae Puesto que la mitocondria grande (cinetoplasto)
del hemoflagelado Crithidia luciliae se compone casi por
completo de DNA de doble cadena, los estudios de inmu-
nofluorescencia indirecta utilizan Crithidia como el antí-
geno que exhibe un alto grado de sensibilidad y especificidad
para la detección de los anticuerpos anti-DNA en el lupus.
Los portaobjetos comerciales que contienen C. luciliae fija
se incuban con el suero de prueba apropiadamente, seguido
por la adición del anticuerpo inmunoglobulina antihumano
conjugado con fluoresceína. Las muestras que producen la
fluorescencia confinada al cinetoplasto se consideran posi-
tivas (fig. 48-6). Las muestras ocasionales pueden producir
fluorescencia nuclear también, pero esto se debe pasar por
alto, puesto que el núcleo contiene muchos otros antígenos
además del DNA. Aunque algunos laboratoristas han expre-
sado preocupación, pues el cinetoplasto puede contener his-
tonas (las proteínas básicas que ligan DNA) que conduzcan
a resultados positivos falsos en el suero positivo del anticuer-
po antihistona, esto no se ha confirmado. En la mayor parte
de los casos donde es una preocupación la contaminación
con histonas, es posible realizar inmunofluorescencia en los
portaobjetos con Crithidia pretratada con ácido clorhídrico,
un procedimiento que elimina las histonas. En vista de las
dificultades relacionadas con la estandarización de los en-
sayos inmunofluorescentes, el ensayo con Crithidia es poco
fiable para el análisis serial de los niveles del anticuerpo.
¿Cuál ensayo anti-DNA elegir?
El ensayo ideal debe ser lo suficiente sensible y específico
para el diagnóstico del lupus y reflejar, además, la actividad
474 CAP. 48 ENFERMEDADES DEL COMPLEJO INMUNITARIO Y CRIOGLOBULINAS
Núcleo
Flagelo
Cinetoplasto
Figura 48-6 a) Fluorescencia confinada al cinetoplasto de C. lu-
ciliae usando suero que contiene niveles altos de anticuerpos an-
tiDNA de un paciente con SLE activo. b) Representación diagra-
mática de la anatomía de C. luciliae. Reproducido de Rose y cols.
(1992) con permiso de la American Society for Microbiology.
de la enfermedad confiablemente. Los tres ensayos descritos
(cuadro 48-5) satisfacen el primer criterio, con sensibilidades
>90% en pacientes con enfermedad activa. Con respecto a es-
pecificidad, los ensayos con Crithidia y el de Farr (especifici-
dad >90%) son superiores a ELISA. Los ensayos ELISA, en
virtud de su propensión para detectar anticuerpos de avidez
baja, producen resultados falsos positivos del anticuerpo del
DNA en una minoría significativa de pacientes sin lupus. A
pesar de esta desventaja, los ensayos ELISA se utilizan cada
vez más en práctica clínica en vista de su alta sensibilidad,
Cuadro 48-5 Comparación de los tres ensayos anti-dsDNA muy utilizados en el SLE
Sensibilidad
Especificidad
Detección de los anticuerpos de avidez alta
Detección de los anticuerpos de avidez baja
Capacidad para identificar los isotipos del anticuerpo individuales (IgG, IgA, IgM)
Conveniencia para la monitorización de la enfermedad activa
facilidad de la automatización, capacidad para cuantificar re-
sultados de manera confiable (útil para la monitorización en
serie) y ausencia de radioisótopos en el ensayo.
El ensayo de Farr es adecuado para la monitorización
de la enfermedad y puede, en la práctica, superar al ELI-
SA en predecir el desarrollo de la enfermedad recrudecida,
implicando particularmente al riñón. En un estudio holan-
dés aleatorio reciente, los pacientes con un incremento de
25% en los niveles de anti-dsDNA que reciben aumentos
preventivos en el tratamiento inmunosupresivo tenían una
disminución significativa en las recaídas comparada con el
grupo control, a quienes se trataron en forma convencional
(Bootsma y cols.). Una proporción pequeña de pacientes
con lupus puede recaer sin acompañarse de un incremento
en los anticuerpos del DNA; del mismo modo, una minoría
de pacientes puede ser clínicamente estable o asintomático
a pesar de la presencia de niveles persistentemente eleva-
dos del anticuerpo por los tres ensayos.
Lupus y el síndrome antifosfolípido
Los anticuerpos para los fosfolípidos (APA) actúan como
marcadores de trombosis (en un tercio de los pacientes con
Cuadro 48-6 Criterios para el diagnóstico del síndrome
del anticuerpo antifosfolípido*
Clínicos Trombosis venosa o arterial, o ambas
Pérdida fetal recurrente
Trombocitopenia persistente
Laboratorio Elevación persistente del anticuerpo IgG o
IgM, o ambos, de la cardiolipina (␤2GPI-
dependiente)†
Anticoagulante del lupus
*Al menos un criterio de laboratorio y uno clínico deben estar presen-
tes; las pruebas de laboratorio deben ser positivas en al menos dos oca-
siones en un lapso de más de tres meses separados.
†La medición del anticuerpo de la cardiolipina puede sustituirse pronto
por la medición directa de los anticuerpos para ␤2GPI.
Farr Crithidia ELISA
Alta Alta Alta
Alta Alta Moderada
+++ ++ ++
+ ++ +++
No Sí Sí
Sí No Sí
 LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO
Figura 48-7 a) Oclusión de la rama arterial retiniana en un pacien-
te con SLE y con el síndrome antifosfolípidos; el defecto es más
pronunciado en el angiograma de sustracción mostrado en (b).
lupus). El término “síndrome antifosfolípido” (APS) fue for-
jado para delinear a aquellos pacientes con trombosis y nive-
les elevados de los anticuerpos del fosfolípido (cuadro 48-6).
En contraste con otros estados trombofílicos, que resultan en
trombosis venosa predominante, los pacientes con el APS
pueden desarrollar trombosis tanto en los vasos arteriales
como en los venosos. Las manifestaciones clínicas depen-
den de qué órgano se vuelve isquémico (fig. 48-7). Los APA
pueden detectarse por ELISA o por la prolongación de los
ensayos de coagulación dependientes de fosfolípidos (tiem-
po de tromboplastina parcial activado, APTT). Los APA de-
tectados por ELISA utilizando cardiolipina, un fosfolípido
ácido, como antígeno pueden no actuar siempre como un
marcador verdadero de trombosis, puesto que muchos po-
475
sitivos falsos se han detectado en pacientes con infección
(bacteriana, viral, protozoaria), terapia con fármacos y otras
enfermedades del tejido conectivo. El positivo falso históri-
co VDRL se debe a la presencia de APA dirigida contra la
cardiolipina presente en el reactivo de VDRL. La incapaci-
dad de los ensayos actuales de ELISA para distinguir entre
la trombosis relacionada y la que no lo está con los APA
condujo a dificultades para interpretar el significado clínico
de los niveles elevados de APA. La distinción es importante,
puesto que los pacientes con trombosis relacionada con APA
requieren terapia intensiva anticoagulante a largo plazo, tal
vez de por vida. La evidencia reciente sugiere que la trombo-
sis relacionada con APA está dirigida, en gran parte, contra
la ␤2 glucoproteína I (␤2GPI, un cofactor de proteína sérico
que liga fosfolípidos) más bien que los fosfolípidos per se.
Dos fuentes de ␤2GPI se encuentran en los ensayos actuales:
las muestras de prueba de suero humano y suero bovino uti-
lizadas para bloquear las placas de ELISA. Se piensa que la
interacción de la cardiolipina inmovilizada con ␤2GPI altera
su conformación, volviéndola inmunogénica. En vista de
la incapacidad de los ensayos ELISA convencionales para
distinguir entre la trombosis relacionada y la que no lo está
con los APA, hay mucho interés en los ensayos que utilizan
␤2GPI purificada como antígeno. Aunque su presencia no
se incluye en la actualidad en los criterios de diagnóstico
para el síndrome antifosfolípido, los anticuerpos anti-␤2GPI
son predictores más fuertes de trombosis que los anticuerpos
para la cardiolipina convencionales detectados por ELISA.
Los APA que interfieren con los ensayos de coagula-
ción dependientes de fosfolípidos reconocen un complejo
fosfolípido-protrombina (se les denomina anticoagulantes
del lupus [LAC], en reconocimiento de su incidencia en pa-
cientes con lupus). El término LAC es una denominación
impropia, puesto que se relaciona con la trombosis in vivo
más bien que con la hemorragia. La presencia de los LAC
se sospecha en un APTT prolongado que no se corrige con
la adición de plasma normal, sugiriendo así la presencia
de un inhibidor. Puesto que la demostración de los anti-
cuerpos para los LAC indica el desarreglo funcional de la
coagulación, estos anticuerpos se correlacionan más estre-
chamente con la trombosis que los APA demostrados por
ELISA. La mayoría de los pacientes con lupus es seguro
que tengan LAC, además de anticuerpos de la cardiolipina
(70%), aunque en una minoría se encuentren anticuerpos
de la cardiolipina o de los LAC (15% en cada categoría).
Lupus eritematoso sistémico neuropsiquiátrico (NPSLE)
El papel de la investigación de laboratorio
La implicación neurológica en el SLE es un problema im-
portante que afecta hasta dos tercios de pacientes en algún
476 CAP. 48 ENFERMEDADES DEL COMPLEJO INMUNITARIO Y CRIOGLOBULINAS
punto de su enfermedad. Mientras cerca de 20% de estos
pacientes continúa en esta condición sobre un segundo pla-
no de la enfermedad sistémica activa, en la mayor parte de
los casos es pasiva o sólo ligeramente activa. El médico
enfrentado con un paciente con SLE y características neu-
rológicas tiene que realizar la distinción importante entre
la enfermedad neurológica debida al lupus (primario), la in-
fección oportunista como una causa secundaria y la psicosis
esteroide, puesto que la mayoría están en terapia inmunosu-
presiva en el momento de la presentación. Un rango diverso
de presentaciones clínicas se observa (cuadro 48-7), refle-
jando mecanismos patogénicos subyacentes múltiples. Por
Cuadro 48-7 Manifestaciones neuropsiquiátricas del SLE
Síndrome cerebral orgánico (deterioro cognitivo, psicosis*)
Ataques
Neuropatía craneal
Neuropatía periférica Orden decreciente
Accidente cerebrovascular de frecuencia
Desorden en el movimiento
Mielitis transversal
*Puede ser inducida por esteroides.
lo menos tres hipótesis se han propuesto para explicar las
diversas presentaciones clínicas: anticuerpos antineurona-
les, trombosis relacionada con anticuerpos de fosfolípidos,
enfermedad conducida por la citocina.
Es lamentable que ninguno de los marcadores actuales
disponibles de laboratorio del SLE sea suficientemente es-
pecífico para el diagnóstico del lupus neurológico prima-
rio. Varios estudios han mostrado que las anormalidades en
los niveles de anti-DNA y del complemento (C3, C4) en el
suero o en el líquido cefalorraquídeo (LCR) no discrimi-
nan entre la enfermedad neurológica y la no neurológica en
el SLE. El entusiasmo inicial por los anticuerpos dirigidos
contra las neuronas (anticuerpos linfocitotóxicos, que reac-
cionan con el tejido cerebral y los anticuerpos directamente
señalados contra los antígenos neuronales) como los mar-
cadores específicos para el lupus neurológico fue abatido
por los estudios que demostraban su presencia en los pa-
cientes con lupus sin implicación neurológica. Las recien-
tes pretensiones de que los anticuerpos dirigidos contra las
proteínas ribosómicas P son marcadores específicos de la
psicosis del lupus han sido refutadas por su demostración
en 50% de los pacientes con SLE sin psicosis.
El examen del LCR es obligatorio en todos los pacientes
con SLE neuropsiquiátrico para permitir que los casos de
infección que se hacen pasar por NPSLE se diagnostiquen.
En un estudio prospectivo reciente de la implicación neu-
rológica en el SLE, la infección (criptocócica, tuberculosis
y meningitis piógena) era la causa subyacente en cerca de
50% de los casos. La presencia de bandas oligoclonales ex-
clusivamente en el LCR favorece al NPSLE pero puede tam-
bién ocurrir con la infección. En la ausencia de un marcador
específico de laboratorio, el diagnóstico del NPSLE sigue
dependiendo mucho de la perspicacia clínica tradicional.
Valoración de actividad de la enfermedad en el SLE
La medición exacta de la actividad de la enfermedad es cru-
cial para el manejo correcto del SLE. Varios índices de la
actividad de la enfermedad se han ideado para simplificar
esta tarea y asegurar uniformidad en los estudios clínicos.
Cuatro sistemas bien validados y en uso en la actualidad son
el índice de actividad de la enfermedad del SLE (SLEDAI),
medición de la actividad del lupus sistémico (SLAM), la
escala del Grupo de Actividad del Lupus de las Islas Bri-
tánicas (BILAG) y el índice de actividad del lupus (LAI).
Junto con la valoración clínica, los marcadores serológicos
de la actividad de la enfermedad son una ayuda importante
para el médico al determinar la necesidad de terapia inmu-
nosupresiva en el SLE.
La enfermedad activa se acompaña en la mayoría de los
pacientes por un incremento en los niveles séricos de anti-
DNA y una caída en los niveles del complemento (C3, C4).
En algunos pacientes, sin embargo, las mediciones del com-
plemento no reflejan la actividad de la enfermedad. Puesto
que C3 actúa como reactivo de fase aguda, un incremento en
la concentración secundaria a la inflamación o a la infección
enmascara la consunción debida al SLE activo. Los niveles
séricos del C3 son normales en cerca de 50% de los pacien-
tes con enfermedad activa, mientras las mediciones de C4
son de valor limitado en pacientes con alelos nulos de C4.
En consecuencia, varios estudios han valorado el papel de
los productos de degradación del complemento (C3d, C4d,
C5b-9) como marcadores de la actividad de la enfermedad.
En general, los productos de degradación del complemen-
to son marcadores más sensibles de la enfermedad activa (60
a 80% de sensibilidad) que las mediciones convencionales de
C3 y C4. Su carencia relativa de especificidad (45 a 80%
de especificidad), sin embargo, ha impedido su adopción ex-
tensa en la práctica clínica. En ausencia del marcador seroló-
gico ideal de la actividad de la enfermedad en el SLE, el uso
de los niveles del anticuerpo anti-DNA en serie junto con el
complemento (C3 o C4, y/o los productos de degradación) y
CRP representan el perfil más útil de laboratorio para valorar
la actividad de la enfermedad (cuadro 48-8).
El lugar de los ensayos de adhesión de la molécula en la
valoración de rutina de la actividad de la enfermedad en el
lupus está en la actualidad bajo investigación. Los estudios
preliminares sugieren que los niveles séricos de VCAM-1
 CRIOGLOBULINEMIA 477

Cuadro 48-8 Cambios en los anticuerpos anti-DNA, C3, C4 y CRP en relación con la actividad de la enfermedad en el SLE

anti-DNA C3 C4 CRP
Enfermedad activa c T T N o sl c
Enfermedad inactiva N o sl c N N N
Infección bacteriana concomitante N o sl c N, c o T N, c o T c
N = normal; sl = ligero.

(molécula de adhesión de la célula vascular) están marca-
dos con niveles elevados en la nefritis del lupus y parecen
relacionarse con la actividad de la enfermedad; los niveles
de E-selectina y de ICAM-I (molécula de adhesión interce-
lular) son inútiles. Si la medición de VCAM-1 es superior
a los marcadores serológicos existentes de la actividad, de-
pende de los méritos de los estudios prospectivos futuros.
III se componen de una mezcla de IgG e IgM policlonales y
constituyen el 50% restante. Mientras la mayor parte de las
crioglobulinas tienden a precipitarse a temperaturas debajo
de 10°C, en ocasiones una crioglobulina termolábil puede
precipitarse en la jeringuilla utilizada para la venopunción
si no se ha precalentado a 37°C. Las razones exactas de la
crioprecipitación de las inmunoglobulinas no se conoce.

Crioglobulinemia Etiología

Introducción La crioglobulinemia se relaciona en la mayor parte de los

El término “crioglobulinemia” se utiliza para denotar la
presencia de crioglobulinas en la sangre. Las crioglobu-
linas son inmunoglobulinas que se precipitan de manera
reversible en el frío (4°C), y se redisuelven a temperaturas
más altas (37°C). Tres tipos de crioglobulinas se reconocen
según su inmunoglobulina de composición y enfermeda-
des relacionadas (cuadro 48-9). Las crioglobulinas tipo I
se componen de inmunoglobulina monoclonal (IgG o IgM)
y constituyen cerca de 25% de todas las crioglobulinas. Las
crioglobulinas tipo II, que se componen de una mezcla de
IgG monoclonal con actividad de factor reumatoide e IgM
policlonal, constituyen otro 25%. Las crioglobulinas tipo
casos con un desorden subyacente bajo la forma de para-
proteinemia maligna, linfoma, enfermedad autoinmunita-
ria o infección. La crioglobulinemia tipo I se asocia con
paraproteinemia, sólo en una minoría de pacientes que no
pueden mostrar evidencia de enfermedad linfoproliferati-
va subyacente en la presentación. En la crioglobulinemia
mixta (tipos II y III), la investigación clínica detallada no
puede descubrir la enfermedad autoinmunitaria o la infec-
ción relacionada en hasta un tercio de pacientes. Estos pa-
cientes fueron catalogados originalmente como poseedores
de crioglobulinemia esencial idiopática o mixta. Desde
1992, los estudios de Italia, EUA, Francia y Suiza han pro-
porcionado evidencia convincente de que 60 a 80% de los

Cuadro 48-9 Clasificación de las crioglobulinas

Composición Enfermedades relacionadas

Tipo I Inmunoglobulina monoclonal, normalmente IgM o IgG Macroglobulinemia de Waldenström
Mieloma, enfermedad linfoproliferativa
Tipo II IgM monoclonal factor reumatoide más IgG policlonal Infecciones
• Virales (hepatitis C, hepatitis B, VIH, Epstein-Barr)
• Bacterianas (endocarditis)
• Espiroquetales (sífilis, enfermedad de Lyme)
• Parasitarias (paludismo)
• Fúngicas (coccidioidomicosis)
• “Idiopáticas” (crioglobulinemia mixta esencial)
Tipo III Factor IgM policlonal reumatoide más IgG policlonal* Autoinmunitario
• SLE, artritis reumatoide, síndrome de Sjögren “idiopático”
• Crioglobulinemia mixta esencial
*Las cantidades traza de las crioglobulinas tipo III pueden encontrarse en algunos individuos normales.
478 CAP. 48 ENFERMEDADES DEL COMPLEJO INMUNITARIO Y CRIOGLOBULINAS

pacientes con crioglobulinemia tipos II y III tiene infección Características clínicas

subyacente de hepatitis C. Aunque algunos pacientes con
crioglobulinemia mixta exhiben características de la enfer-
medad linfoproliferativa, como poblaciones monoclonales
de la célula B en la médula ósea y rearreglo del gen de la
inmunoglobulina en clones de los linfocitos de la sangre
periférica, el linfoma ostensible es raro.
La inmunopatogenia de la crioglobulinemia está mal en-
tendida. Un amplio rango de complejos primarios antíge-
no-anticuerpo se ha detectado en los crioprecipitados de las
crioglobulinas tipos II y III, además del complejo del factor
reumatoide y de la IgG. Esto llevó a la visión de que la
formación de crioglobulinas mixtas es el resultado final de
una secuencia de eventos conducida por una respuesta del
anticuerpo a los agentes infecciosos o a los antígenos endó-
genos, como en el SLE.
Las manifestaciones clínicas de la crioglobulinemia se de-
ben a una combinación de la obstrucción vascular y del
depósito del complejo inmunitario. Las crioglobulinas del ti-
po I pueden ocurrir en cualquier sexo y causar principal-
mente hiperviscosidad y obstrucción vascular. En contraste,
las crioglobulinas mixtas (tipos II y III) afectan a las mu-
jeres en particular y se presentan con características clí-
nicas diversas, por el depósito de complejos inmunitarios
crioprecipitables en los vasos sanguíneos, causando vascu-
litis sistémica que afecta la piel, el riñón y articulaciones.
Las biopsias de piel de la erupción purpúrica característica
observadas en tales pacientes muestran vasculitis leucoci-
toclástica con depósito de inmunoglobulina y del comple-
mento. La implicación renal debido a la glomerulonefritis

Figura 48-8 Manifestaciones clínicas y de laboratorio de la crioglobulinemia mixta en un paciente con hepatitis C. a) La erupción púrpura
característica en miembros más bajos; la flecha indica un área púrpura palpable. Reproducida de Shakil y Bisceglie (1994), con permiso. b)
Suero almacenado mostrando el crioprecipitado después de 24 h de incubación a 4°C (derecha), redisolución por el calentamiento a 37°C
(izquierda). c) Electroforesis de la zona del suero colectado a 37°C que muestra el crioprecipitado redisuelto como una banda discreta en
la región gamma, que en la inmunofijación muestra estar compuesta de IgM monoclonal e IgG policlonal. Observe la ausencia de la banda
gamma en la electroforesis de la zona de la muestra colectada a temperatura ambiente (TA) del mismo paciente. d) Biopsia renal mostrando
depósitos glomerulares eosinófilos de crioglobulina (seudotrombina) en el examen de H&E de rutina (izquierda) que corresponde a los depó-
sitos gruesos (derecha) de IgG sobre inmunofluorescencia. Reproducida de Graham (Arthrit Rehum 1992;35:1107), con permiso.
 CRIOGLOBULINEMIA
membranoproliferativa con depósito de la inmunoglobulina
y del complemento ocurre en 50% de todos los pacientes
con crioglobulinemia mixta. Las características histológi-
cas distintivas de la glomerulonefritis crioglobulinémica
incluyen la infiltración monocítica glomerular marcada,
los depósitos eosinófilos rojo Congo negativos amorfos
en los capilares y una membrana basal glomerular doble
contorneada ocurren por una interposición de los mono-
citos. La presencia de estas características en la biopsia
renal en un paciente con la, así llamada, glomerulonefritis
“idiopática” debe estimular una investigación para las crio-
globulinas. La función hepática deteriorada con un amplio
espectro de anormalidad histológica, que comprende desde
la hepatitis persistente crónica hasta la cirrosis, ocurre en
70% de pacientes y es de interés en vista de la asociación
fuerte de la infección de hepatitis C y de la crioglobuline-
mia mixta (fig. 48-8).
Investigación de laboratorio de la supuesta
crioglobulinemia
Procesamiento de la muestra
La razón más común del fracaso para demostrar la existen-
cia de crioglobulinas circulantes es la colección y el proce-
samiento incorrectos de la muestra. La atención meticulosa
Figura 48-9 Pasos en la detección de las crioglobulinas en el laboratorio.
479
en la colección de las muestras sanguíneas es esencial. La
sangre debe colectarse en un tubo sencillo sin anticoagu-
lante y sumergirse en un frasco que contenga agua a 37°C,
seguido por el traslado inmediato al laboratorio. El fallo
para colectar las muestras a 37°C permite a las crioglobuli-
nas precipitarse con el coágulo de sangre y, por tanto, que
escape a la detección. La figura 48-9 ilustra los pasos en la
detección de las crioglobulinas en el laboratorio.
Otras características del laboratorio que sugieren
la presencia de crioglobulinas
Los indicadores útiles de la presencia de crioglobulinas
mixtas son la depleción marcada de los primeros compo-
nentes del complemento del suero (C4, C1q) por la activa-
ción de la ruta clásica de los complejos inmunitarios. La
combinación de un suero bajo de C4 y del factor reuma-
toide IgG es un rasgo característico de la crioglobulinemia
mixta, que ocurre en más de 90% de los pacientes. Es una
regla general útil que los pacientes con un inexplicable C4
bajo del suero y enfermedad renal o de la piel deben ser
investigados para la crioglobulinemia.
Las crioglobulinas interfieren con las mediciones in-
munoquímicas de rutina de las inmunoglobulinas séricas y
llevan a niveles artificiales bajos; pueden también interferir
con los análisis de rutina del conteo sanguíneo total por los
480 CAP. 48 ENFERMEDADES DEL COMPLEJO INMUNITARIO Y CRIOGLOBULINAS
contadores automatizados celulares y conducir a leucocito-
sis y trombocitosis falsas. La colección y el análisis de las
muestras a 37°C evitan estos problemas.
Además de caracterizar la crioglobulina, todos los pa-
cientes se investigan para un desencadenante subyacente.
En el caso de la crioglobulinemia tipo I, las investigaciones
apropiadas para la enfermedad linfoproliferativa deben ins-
tituirse. A los pacientes con crioglobulinemia mixta se les
practica serología de la hepatitis, incluyendo la PCR para
evaluar el RNA de la hepatitis C, para seleccionar aquellos
que se benefician de terapia con interferón alfa. La investiga-
ción de rutina para otros desencadenantes infecciosos (endo-
carditis, sífilis, enfermedad de Lyme, paludismo, VIH), se-
gún se informa, relacionados con la crioglobulinemia mixta
no se justifica en ausencia de evidencias para lo contrario.
Lecturas adicionales
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 49
Tipificación de HLA
Mark Hathaway
Introducción
El trasplante ahora es una terapia médica aceptada para re-
emplazar órganos enfermos. Sin embargo, la respuesta del
sistema inmunitario del huésped al órgano trasplantado es
un obstáculo permanente importante para obtener un re-
sultado exitoso. Los trasplantes de órgano son destruidos
por una inmunorrespuesta adaptable, principalmente por
linfocitos T hacia los antígenos ajenos presentes sobre la
superficie del tejido injertado. De los diversos antígenos
donadores presentes en un tejido aloinjertado que pueden
potencialmente obtener una inmunorrespuesta, los antíge-
nos que activan el complejo principal de histocompatibili-
dad (MHC) son los más importantes.
Cuando el donador y el receptor son dispares de MHC,
una respuesta inmunitaria se inicia y se dirige contra una
molécula o moléculas MHC no propias en el tejido injer-
tado. Aunque otros sistemas del antígeno pueden invocar
una inmunorrespuesta dirigida al aloinjerto, los antígenos
MHC conocidos como antígenos leucocitarios humanos, o
HLA para abreviar, son los más inmunógenos. Esto suce-
de por la habilidad que poseen para unirse directamente al
receptor del antígeno de la célula T, ligando el proceso del
antígeno normal que se requiere para estimular respuestas
de la célula T; y a la frecuencia alta de células T circulantes
en poblaciones periféricas con la especificidad del receptor
para MHC ajenos.
Puesto que las diferencias en antígenos MHC provocan
tal rechazo vigoroso de aloinjertos, una cantidad conside-
rable de trabajo se dirige hacia la compatibilidad MHC
donador:receptor. Definiendo la especificidad HLA, en un
esfuerzo por minimizar el rechazo, a través de la compa-
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
tibilidad MHC donante:receptor es un proceso conocido
como tipificación HLA.
Estructura y función de HLA
Los genes HLA del MHC humano consisten de múltiples
sitios clases I, II y III presentes en el brazo corto del cro-
mosoma 6. Ellos comprenden cerca de 4 ⫻ 106 pares bási-
cos, que contienen por lo menos 50 genes.
Las proteínas HLA clase I consisten en una cadena alfa
(␣) que tiene tres subunidades, cada una se asemeja a un
dominio tipo inmunoglobulina (Ig). Cuando se expresan
sobre la superficie de la célula, las moléculas HLA clase
I están unidas en forma no covalente al péptido ␤-2-mi-
croglobulina (␤-2M), que se codifica en un cromosoma
separado. Existen actualmente tres genes de cadena ␣ bien
definidos, designados HLA-A, HLA-B y HLA-C. HLA-
A y HLA-B representan los productos principales de la
clase I y sirven como blancos para las inmunorrespuestas
mediadas por anticuerpos o por células contra tejido tras-
plantado. Su expresión es diferencial, dependiendo del tipo
de célula, con células de linaje linfoide con la expresión
más alta y los hepatocitos y los eritrocitos con el conteni-
do más bajo. La expresión puede alterarse por mediadores
inflamatorios como citocinas y esto es en particular impor-
tante en el trasplante, puesto que la sobrerregulación puede
promover inmunogenicidad del aloinjerto, o aumentar su
susceptibilidad a una inmunorrespuesta preexistente.
Las proteínas HLA clase II difieren de las de la región
clase I en términos de estructura, función y distribución.
Consisten de dos cadenas, ␣ y ␤, y se expresan sobre la
482 CAP. 49 TIPIFICACIÓN DE HLA
superficie celular como heterodímeros ␣␤. Los genes HLA
clase II con cadenas ␣ y ␤ se designan HLA-DP, HLA-DQ
y HLA-DR, ambas cadenas se codifican dentro la región
clase-II y con dos subunidades que parecen dominios de
Ig. Los grupos del gen HLA-DR contienen uno extra con
cadena ␤, cuyo producto puede aparearse con cualquier ca-
dena ␣ DR. Por consiguiente, tres grupos de genes clase II
pueden dar lugar a cuatro tipos de moléculas clase II. La
distribución de proteínas clase II está restringida de ma-
nera principal a los linfocitos B y las células profesionales
presentadoras de antígenos (APC), aunque la expresión en
otras células es inducible después de la activación. La fun-
ción de las moléculas clase II se considera tradicionalmen-
te en términos de su habilidad para estimular las respuestas
de la célula T auxiliadora o helper; sin embargo, la más re-
ciente evidencia muestra respuestas citotóxicas importan-
tes de anticuerpos y de la célula T efectora dirigidas contra
determinantes de la clase II.
También se codifican dentro del MHC dos genes TAP.
Éstos se encuentran en la región clase II, estrechamente
asociados con dos genes que codifican las proteínas de bajo
peso molecular del proteosoma. Los genes de la región clase
III codifican, entre otras cosas, los componentes C4 (C4a y
C4b), C2 y el factor B, del complemento junto con aquellos
para la citocina que son factor de necrosis tumoral (TNF␣ y
␤), la enzima 21-hidroxilasa, que sintetiza esteroides, y dos
proteínas de choque térmico, Hsp 70 1 y Hsp 70 2.
Genética del complejo principal
de histocompatibilidad (MHC)
Los genes codificantes para HLA cadenas ␣ clase I y ca-
denas ␣ y ␤ clase II se unen dentro del MHC. Aunque los
genes que codifican para cada cadena se encuentran en re-
giones separadas, varios genes que codificaban por cada
cadena se han identificado dentro de cada región. Porque
los genes HLA están en proximidad estrecha uno al otro, la
recombinación genética es rara. Por lo tanto, la mayoría de
los descendientes hereda un grupo intacto de los alelos pa-
rentales, uno de cada padre. Tales grupos de genes unidos
se conocen como haplotipos. Ciertos alelos, en particular
los haplotipos, se forman con mayor o menor frecuencia, lo
que podría esperarse si los alelos están en equilibrio gené-
tico. Tal fenómeno se conoce como desequilibrio de liga-
miento y puede reflejar el origen reciente de algunos alelos,
orígenes geográficos y patrones de crianza raciales.
Los productos de los genes HLA clase I y clase II son
codominantes expresados y, por tanto, los individuos hete-
rocigotos deben expresar dos especificidades distintas de
HLA para cada sitio (uno materno, otro paterno). Además,
debido a que hay tres genes para HLA clase I y cuatro posi-
bles grupos para la clase II, se esperaría que cada individuo
exprese tres diferentes MHC clase I y cuatro proteínas dife-
rentes clase II. El número expresado es de hecho mucho más
alto, debido a la naturaleza polimórfica extrema de los genes
clases I y II; incluso, más de 70 alelos en el mismo sitio
genético se han identificado para algunas proteínas clase I.
Por esta razón, la probabilidad de genes HLA en dos indivi-
duos diferentes que codifican el mismo alelo es demasiado
pequeña. Porque las proteínas HLA son muy inmunógenas,
es necesario conseguir en el trasplante la compatibilidad más
estrecha posible entre el aloinjerto y el receptor, reduciendo
al mínimo el riesgo de pérdida del injerto por rechazo. El
proceso técnico de la identificación de la proteína HLA en
un individuo se conoce como tipificación HLA.
La mecánica de tipificación HLA
Tipificación serológica
A través del tiempo, la reacción mixta del linfocito (MLR)
se utilizó para detectar la variabilidad de HLA. En esta téc-
nica, las células de un receptor potencial se cocultivan con
las células “estimuladoras” de origen donante que se han
irradiado de modo que no puedan responder. Las células T
del receptor se estimulan para que proliferen y se diferen-
cien en respuesta a los antígenos HLA dispares, general-
mente como un resultado del reconocimiento de la célula T
CD4+ de los antígenos HLA clase II y de reconocimiento
de los antígenos clase I por células T CD8+. Así, los recep-
tores “compatibles” pueden identificarse rápido con base
en su “insensibilidad”. Aunque esta técnica se correlaciona
bien con el rechazo, es demasiado sensible y refleja de ma-
nera cercana la propia respuesta de rechazo; su aplicación
en el escenario clínico es limitada o de ningún valor, puesto
que requiere 5 a 10 días para obtener resultados y es incó-
moda, costosa y técnicamente difícil de realizar.
Hasta hace poco, el método “tradicional” que se usaba
para distinguir individuos HLA no idénticos empleó anti-
cuerpos. Los antígenos de los sitios HLA-A y B fueron los
primeros que se definieron de este modo, usando aloan-
tisueros que se obtienen de los sujetos inmunizados por
transfusiones sanguíneas, embarazo o rechazo del aloinjer-
to renal. Usando esta técnica, llamada ensayo de microci-
totoxicidad, linfocitos T de la sangre periférica (antígenos
HLA clase I) y linfocitos B (HLA-DR, -DQ) de receptores
potenciales del injerto de tipo HLA desconocido se incuban
con el antisuero que contiene el anticuerpo HLA de espe-
cificidad caracterizada. Estas células entonces se exponen
al complemento. Si el anticuerpo reacciona con proteínas
HLA expresadas en la superficie celular, el complemento
es activado y las células son destruidas, lisis mediada por
el complemento. En ausencia de la reacción, ninguna lisis
 TIPIFICACIÓN MOLECULAR
ocurre. La destrucción se visualiza en general usando un
combinado de bromuro de etidio/naranja de acridina que
colorea las células viables de verde y las células muertas de
rojo. La destrucción se analiza semicuantitativamente de-
terminando el porcentaje de células muertas en cada pozo.
Así, donde la lisis ocurre, la especificidad del anticuerpo
identifica qué proteínas HLA se expresan.
Diferentes tipos de error son posibles con la tipificación
serológica. La falla para identificar un antígeno raro o de
reacción cruzada es un problema frecuente. Esto sucede
principalmente porque el antisuero pertinente no se utiliza
o no está disponible. El desequilibrio de ligamiento, los
orígenes geográficos y los patrones de casamiento racia-
les también son factores que contribuyen. Por otra parte,
algunos antígenos se expresan en una frecuencia más baja
o nula en ciertas poblaciones. Tales errores ocurren con
más probabilidad en laboratorios que usan cantidades li-
mitadas de antisuero. Además, la mala interpretación de
las reacciones del antisuero produce errores. El antisuero
puede contener más de un anticuerpo, cada uno con espe-
cificidades de HLA que difieren, e incluso los anticuerpos
HLA monoespecíficos con frecuencia reaccionan en forma
cruzada con otros antígenos HLA. Además, la tipificación
HLA de antígenos DR que usa la serología es, en parti-
cular, susceptible a la mala interpretación, puesto que los
linfocitos B presentan más reacciones cruzadas con una
amplia gama de antígenos DR y son más susceptibles a la
lisis no específica mediada por el complemento y producen
resultados “falsos positivos”. Las variaciones técnicas tam-
bién explican un 15 a 30% del error entre los laboratorios
en la tipificación serológica. La variación en la actividad
del complemento entre los lotes y la calidad del antisuero
son los factores contribuyentes principales.
La serología es un método rápido para la tipificación
HLA; sin embargo, los reactivos que se emplean no son
bastante específicos para determinar la identidad estruc-
tural precisa de las moléculas MHC en individuos gené-
ticamente no idénticos. Esto puede alcanzarse sólo por el
análisis directo de los genes MHC.
Tipificación molecular
Polimorfismo de la longitud de los fragmentos
de restricción (RFLP)
La clonación y el mapeo moleculares intensos de la región
clase II del MHC recientemente se consiguieron. El análi-
sis extenso de la organización de las secuencias específicas
del gen, usando una técnica que se conoce como Southern
blotting, revela la existencia de polimorfismos en los si-
tios de reconocimiento de un grupo de enzimas llamadas
endonucleasas de restricción. Estos polimorfismos en si-
483
tios de restricción o corte son, en la mayor parte de los
casos, específicos de cada alelo. Por tanto, el mapeo y la
aclaración de los patrones del polimorfismo en la longitud
del fragmento de restricción (RFLP) asociados con alelos
HLA deben facilitar la identificación del alelo en cualquier
individuo. La viabilidad de la tipificación HLA mediante
detección de RFLP usando sondas de DNA la sugirieron
primero Wake y cols. (1982), quienes reportaron polimor-
fismos en la región HLA-DR usando la longitud comple-
ta de un cDNA de DR␤1. La tipificación RFLP de alelos
HLA-DR y HLA-DQ usando sondas de cDNA de longitud
completa para DR␤, DQ␣ y DQ␤ se utilizan mucho desde
entonces en un esfuerzo por definir con exactitud la rela-
ción entre RFLP y las especificidades HLA clase II defini-
das serológica o celularmente.
El análisis RFLP se realiza sobre muestras de DNA ge-
nómico que por lo común se obtienen de leucocitos con
“cubierta brillante”. El DNA de longitud completa se ex-
trae vía digestión de los leucocitos con dodecil sulfato de
sodio (SDS)/proteinasa K y se sujeta a la digestión por res-
tricción usando una endonucleasa de restricción Taq-1 o
MSP-1. El resultado de la restricción entonces se separa
por electroforesis en gel de agarosa al 2% y se transfiere a
una membrana de nitrocelulosa, usando Southern blotting.
Los patrones del fragmento de restricción se visualizan por
hibridación de la banda con sondas de cDNA radiomarca-
das en forma correcta, que entonces se exponen a una placa
de rayos-X. Los patrones de la señal de hibridación que se
generan son entonces comparados con tablas de tamaño de
referencia para permitir la identificación de especificidades
HLA-DR y HLA-DQ que difieren.
Las cualidades de esta técnica son que las muestras múlti-
ples (>30) pueden procesarse en forma simultánea. También,
las especificidades alélicas DR␤, DQ␣ y DQ␤ es posible
identificarlas a partir de una sola muestra, puesto que los re-
sultados de la restricción pueden transferirse e hibridarse con
un cDNA específico del gen HLA (p. ej., DR␤) y la “copia”
se despega por medio de lavados y se hibrida con un cDNA
de la especificidad HLA diferente (p. ej., DQ␣ o DQ␤).
Sus desventajas son que RFLP requiere el manejo muy cuida-
doso de la muestra y de la extracción del DNA. El DNA debe
ser de longitud completa, sin degradación parcial, puesto que
ésta puede alterar radicalmente el patrón de restricción, crean-
do un bandeo incorrecto. Además, no puede utilizarse en cir-
cunstancias de un trasplante clínico de donadores cadavéricos
tipo HLA por los contratiempos inherentes, ya que es posible
que se requieran hasta tres semanas para obtener los resulta-
dos. Por otra parte, los patrones del bandeo del fragmento de
restricción son de una complejidad elevada y la hibridación
cruzada de secuencias compartidas de las sondas de cDNA
significa que esta técnica requiere experiencia considerable
en la interpretación. Sin embargo, el último problema puede
484 CAP. 49 TIPIFICACIÓN DE HLA
evitarse usando sondas de cDNA de región corta, o específicas
del exón. En términos técnicos, el análisis RFLP no identifica
directamente las secuencias del DNA polimórfico en la re-
gión codificante para antígenos HLA, sino en sitios de restric-
ción relacionados de manera importante con ellas. Además,
confía en el desequilibrio de ligamiento entre los alelos HLA-
DR y HLA-DQ para diferenciar entre ciertos alelos HLA-DR
que muestren patrones RFLP similares, por ejemplo, DR3
(DQ2) de DR6 (DQ6) y DR7 (DQ2) de DR9 (DQ9). Tal
ejercicio necesita gran precaución al analizar poblaciones no
caucásicas, puesto que las asociaciones particulares de HLA-
DR-DQ no son siempre iguales. Una evidencia más reciente
muestra, desde entonces, que tales asociaciones no son siem-
pre verdades en algunas poblaciones caucásicas.
Reacción en cadena de la polimerasa
En la actualidad, el método más conveniente para identi-
ficar los alelos MHC emplea una técnica conocida como
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Éste es un mé-
todo rápido de secuencias particulares del DNA genómi-
co que se amplifican de manera selectiva. Para amplificar
regiones específicas de DNA, como un exón polimórfico
de un gen MHC particular, cebadores —oligonucleótidos
sintéticos—, complementarios a la secuencia de DNA que
flanquean la región de interés, tienen que sintetizarse. El
DNA genómico, que se extrae en un procedimiento idénti-
co a aquel para el análisis RFLP, entonces se desnaturaliza
a temperatura alta en presencia de concentraciones exce-
sivas de dos oligonucleótidos sintéticos. El enfriamiento
permite que las hebras de DNA se unan nuevamente for-
mando la cadena doble, de tal manera que ambos cebado-
res se unan a su secuencia complementaria sobre el DNA
genómico. La enzima DNA polimerasa termoestable (Taq
polimerasa), que se obtiene de la bacteria Thermus aquati-
cus, agregada a la reacción, ahora alarga al cebador, usando
DNA genómico entre los dos cebadores como su plantilla.
El DNA replicado es entonces desnaturalizado en hebras
simples por la temperatura alta y la mezcla se enfría para
facilitar nuevos ciclos de templado y replicación. El primer
producto de la extensión es incierto en longitud, pero todos
los ciclos subsecuentes crean productos de la longitud de-
finida porque la plantilla termina en el primer cebador. Los
ciclos entonces se repiten hasta que suficiente DNA está
disponible para la secuenciación.
Una vez asociado el DNA con un alelo particular de-
finido por la secuencia, se pueden construir sondas del
oligonucleótido a partir de regiones donde se presentan
diferencias. Este oligonucleótido específico de la secuen-
cia (SSO) o sondas de oligonucleótido específico de alelo
(ASO) pueden entonces hibridizarse para el DNA blanco
específico amplificado por PCR Southern blotting, usan-
do una técnica llamada PCR-SSO/PCR-ASO. Tales téc-
nicas son rápidas, económicas y una manera sensible de
definir la estructura del gen MHC. Sin embargo, las técnicas
de tipificación PCR-SSO/ASO requieren la preparación de
transferencias múltiples y de sondas marcadas, por lo me-
nos una sonda para cada alelo en cada sitio. La tipificación
RFLP, en cambio, requiere a lo sumo dos transferencias y
tres sondas. Los contratiempos al emplear PCR-SSO/ASO
son similares a DNA-RFLP pero la preparación del DNA
blanco es más rápida (5 a 6 h comparadas con las 24 h); la
transferencia y el sondeo requieren un tiempo similar. Así,
como en RFLP, esta técnica sólo se emplea en aplicaciones
clínicas no urgentes y, por tanto, no pueden usarse en do-
nantes cadavéricos tipo HLA.
La tipificación HLA por técnicas moleculares ha revolu-
cionado por la introducción reciente de un método múltiple
del cebador específico de secuencia basado en la PCR (PCR-
SSP). La clonación molecular intensiva de los genes HLA
clases I y II facilita la construcción de una serie completa de
SSP. PCR-SSP mantiene la especificidad alélica de cada par
de cebadores, tanto por el rigor de las condiciones de la re-
acción PCR como por el diseño de los cebadores del oligo-
nucleótido, que explotan la capacidad de la Taq polimerasa
de amplificar secuencias del DNA blanco que son desiguales
a la secuencia del cebador. En reacciones donde la comple-
mentariedad entre el DNA y el cebador está completa, la
eficiencia de la amplificación es 100% y el DNA blanco se
replica. Cuando hay uno o más pares de bases desiguales en-
tre el DNA blanco y el extremo 3´ del cebador, la eficiencia
de la amplificación es 0% y no hay productos sintetizados.
Este sistema para la tipificación HLA clase I y clase II utiliza
192 reacciones de PCR para definir genes HLA-A, HLA-B,
HLA-C, DR␤1, DR␤3, DR␤4, DR␤5 y DQ␤1. Los produc-
tos de reacción se separan electroforéticamente, usando gel
de agarosa al 1% que contiene bromuro de etidio, y se visua-
lizan sobre un transiluminador de luz UV.
Completos, los tipos HLA pueden identificarse en una
fotografía polaroid, por tanto, a este proceso se le ha llama-
do “fototipificación”. Esta técnica tiene sensibilidad mayor
o igual que la serología, sin problemas de reacción cruzada,
y con ella puede distinguirse la mayor parte de las combina-
ciones alélicas heterocigotas. Tiene la ventaja sobre DNA-
RFLP y técnicas de tipificación basadas sobre PCR-SSO/
ASO en que no se requiere transferencia y sondeo y es por
tanto más barata y más rápida de realizar. Por otra parte, la
tipificación HLA, de sangre completa a los resultados, puede
obtenerse en 3 horas, haciendo esta técnica comparable a la
serología y conveniente para la tipificación HLA de donantes
cadavéricos. De hecho, PCR-SSP ahora reemplaza a técni-
cas serológicas en muchos laboratorios de comprobación de
la histocompatibilidad. Otra ventaja de DNA-RFLP es que
 TIPIFICACIÓN MOLECULAR
la PCR-SSP no confía en el DNA de longitud completa para
producir resultados, por tanto, las muestras parcialmente de-
gradadas pueden utilizarse.
La tipificación con base en el DNA vía amplificación por
PCR ahora es un procedimiento común de laboratorio. La
tipificación HLA requiere un segundo análisis para identifi-
car los alelos amplificados. Según lo detallado antes, varios
tipos de ensayos pueden utilizarse para efectuar esto, pero
recientemente se desarrollaron nuevos equipos de tipifica-
ción SSO que utilizan un sistema multiplex homogéneo,
de modo que todos los SSO se analizan simultáneamente
y por tanto el ensayo completo se realiza en un tubo con
la adición de un reactivo. PCR-SSP utiliza concentraciones
equimolares de cebadores directos e inversos, así se produ-
cen productos de doble hebra. Sin embargo, si un cebador
está en exceso, productos de una hebra (así como de doble
hebra) surgen en el agotamiento del cebador limitante. Una
vez desnaturalizados, ambos pueden hibridizar sondas SSO.
El desarrollo más reciente une sondas SSO biotiniladas a
microesferas que pueden entonces analizarse usando un
fluoroanalizador. Cada microesfera tiene una marca única
que puede distinguirse con el analizador, y cada una lleva un
diferente SSO biotinilado, por tanto una mezcla de la sonda
se distingue en virtud de su asociación con una microesfera
particular. La unión de la sonda se visualiza usando estrep-
tavidina-PE. La señal relativa de cada sonda se utiliza para
asignar positividad y negatividad con DNA amplificado.
Esto proveía la información requerida para asignar un feno-
tipo HLA y tenía la ventaja de no requerir productos quími-
cos peligrosos. Sin embargo, ésta y otras técnicas basadas
en PCR no están desprovistas de problemas. La desviación
de los protocolos definidos de PCR, DNA de mala calidad
(en términos de pureza) y las máquinas inadecuadas de PCR
pueden producir fallas individuales de PCR que dan lugar
a la asignación incorrecta o errónea del antígeno. Además,
la experiencia molecular de alto nivel de estas técnicas, no
menos exigente que en la serología, requiere entrenamiento
y experiencia considerables para realizarse correctamente.
Tipificación basada en la secuenciación
Las técnicas de secuenciación del DNA se desarrollaron
originalmente en la década de 1970, pero ahora han avan-
zado lo suficiente para considerarse métodos rápidos, eco-
nómicos y sencillos para la tipificación HLA. Dos técnicas
básicas han surgido: la técnica de degradación química
desarrollada por Maxim y Gilbert (1977), y el método en-
zimático, por Sanger y cols. (1977). Varios informes que
detallaban datos de la secuencia HLA clase I y los de la
clase II se publicaron a mediados de la década de 1980.
Sin embargo, en aquel momento, el grado del polimorfis-
485
mo de HLA, junto con las técnicas laboriosas requeridas
para amplificar regiones del DNA, significó que la secuen-
ciación no podría considerarse realista para la tipificación
del tejido. Esta consideración se invierte rápido después de
la introducción de métodos basados en la PCR de amplifi-
cación del DNA. Los acercamientos iniciales utilizaron el
RNA con éxito para secuenciar los alelos clases 1 y 2, que
son simples y rápidos de aislar, y simplificaron la amplifi-
cación de las regiones cortas del exón requeridas. Su des-
ventaja al principio era el requerimiento de material viable
para el aislamiento del RNA. Además, el RNA es inestable,
haciendo la extracción, en particular del material de archi-
vo, notoriamente difícil. Al mismo tiempo, las técnicas de
tipificación por secuenciación basadas en el DNA también
se desarrollaron (éstas se emplean en la actualidad en la
mayor parte de los laboratorios que tipifican tejido).
El método más popular para la secuenciación del DNA
es la técnica de la terminación de cadena mediada por di-
deoxi, la cual a su vez se desarrolla a partir de una técnica
original desarrollada en 1975. De manera breve, esta técni-
ca implica la amplificación de la región que se secuencia,
que entonces se desnaturaliza para producir DNA de cade-
na sencilla (ssDNA). Un cebador que secuencia es entonces
templado para el ssDNA y la cadena del DNA se extiende
en dirección 5’ a 3’. La extensión termina si un dideoxinu-
cleótido 2’3’ se incorpora en lugar de uno convencional. Se
establecen cuatro reacciones, cada una con uno de cuatro
nucleótidos dideoxi así como los cuatro deoxinucleótidos.
Asimismo, cuatro grupos separados de fragmentos de ca-
dena terminada se producen. Estos fragmentos permanecen
complementarios al ssDNA que ha actuado como planti-
lla y, calentando o usando un agente desnaturalizante, los
fragmentos de cadena terminada se pueden liberar de la
plantilla y separarse empleando electroforesis de alta reso-
lución en gel desnaturalizante. La secuencia del DNA ori-
ginal entonces se deduce comparando la posición relativa
de los productos en los cuatro carriles del gel.
Aunque el método básico permanece inalterado, se han
hecho varias mejoras que elevan la velocidad, simplicidad y
confiabilidad de secuenciación del DNA. Éstas incluyen el
uso de fragmentos de PCR, como plantillas, que contribu-
yen con un método rápido para obtener cantidades grandes
de material de la plantilla y el uso de un cebador biotinilado,
lo cual significa que el producto PCR marcado con bioti-
na puede extraerse rápidamente usando perlas magnéticas
marcadas con estreptavidina. Las mejoras en enzimas que
se emplean para la secuenciación también contribuyen. La
enzima T7 DNA polimerasa se prefiere ahora sobre la po-
limerasa del fragmento Klenow porque incorpora bases de
DNA en la cadena que se extiende a una tasa más uniforme.
La DNA polimerasa derivada de Thermus aquaticus se le
diseña para que sea más termoestable, que a su vez crea más
486 CAP. 49 TIPIFICACIÓN DE HLA
productos. Los nucleótidos radiomarcados se reemplazan
cada vez más por métodos de marcaje fluorescente como un
medio de detectar productos secuenciales. Además, el uso
de colorantes de cuatro colores significa que los productos
pueden correrse en un solo carril del gel. Uniendo cada co-
lorante para separar ddNTPS significa también que las reac-
ciones pueden llevarse a cabo en un solo tubo. También está
disponible una gama amplia de secuenciadores automáticos
que detectan productos marcados con fluorescencia después
de electroforesis con gel en lámina o capilar vertical. Es
más, todas estas máquinas transfieren datos directos a una
computadora desviando la necesidad de un análisis manual
de datos brutos, ya que los datos se convierten de manera
automática en información de la secuencia.
Como con la mayor parte de las técnicas, la secuenciación
no está libre de problemas. Las combinaciones ambiguas del
alelo son el problema más grande. Esto sucede en todos los
sitios y ocurre cuando dos alelos producen una secuencia he-
terocigota que es idéntica a la secuencia de par de alelos dife-
rente. Pueden existir también problemas con PCR y el diseño
del cebador secuenciador. Se pensaba que la secuenciación
sostenía una ventaja sobre la otra tipificación de DNA, en tan-
to que detecta los alelos previamente no identificados. Esto es
verdad a menos que el nuevo alelo contenga polimorfismos
en las posiciones correspondientes al extremo 3’ de la PCR o
cebadores secuenciadores. Además, la tipificación basada en
la secuencia debe secuenciar el gen completo bajo estudio,
ya que con secuencias más cortas, mayores son las oportuni-
dades de que los nuevos polimorfismos sean errados. El uso
de cebadores múltiples para PCR y para la secuenciación
puede dar lugar a una amplificación o secuenciación prefe-
rencial de un alelo particular. Esto conduce a una asignación
incorrecta de homocigosidad. Las técnicas de tipificación con
base en la secuenciación requieren aún intenso trabajo y equi-
po y reactivos costosos. Este es probablemente el obstáculo
más grande para su adopción como técnica de línea primaria
para los laboratorios de HLA. Por otra parte, aunque la tipifi-
cación con base en la secuenciación aporta una tipificación de
resolución muy alta, no hay hasta ahora evidencia que sugiera
que el tal emparejamiento HLA de alta resolución sea impor-
tante en el trasplante del órgano sólido. Para el trasplante de
médula ósea, sin embargo, el cuadro es diferente, con eviden-
cia clara que el emparejamiento afecta el resultado.
Resumen
Las glucoproteínas de la superficie celular del MHC juegan
un papel central en la inmunología del trasplante. El MHC
se determina originalmente como la barrera principal para
el trasplante debido a la fuerte respuesta de rechazo de los
linfocitos T hacia los antígenos MHC presentes sobre el te-
jido injertado. Las proteínas HLA del MHC humano están
entre las más polimórficas conocidas, por consiguiente la
probabilidad de dos individuos sin relación que expresen
los mismos alelos HLA es muy pequeña. Puesto que el
reconocimiento del antígeno de la célula T está profunda-
mente influido por polimorfismo MHC, las proteínas HLA
de donadores del trasplante y los receptores potenciales de-
ben identificarse y la posible compatibilidad más estrecha
se localiza para minimizar el riesgo de pérdida del injerto
por rechazo. La técnica de identificación del HLA, llamada
“tipificación de tejido”, se usa en medicina clínica para la
compatibilidad del donador con el receptor en programas de
trasplante cadavérico, pero también es posible usarla para
estudiar el papel del MHC en la determinación de la suscep-
tibilidad hacia condiciones alérgicas y autoinmunitarias.
La genotipificación del MHC en humanos se realizó
originalmente por la reacción linfocítica mixta y después
por la serología. Debido a contratiempos metodológicos
inherentes, esos métodos se reemplazaron por técnicas que
analizan el nivel de la expresión genética. Los genes -DR
y -DQ de la región MHC clase II son los primeros en tipi-
ficarse para HLA por DNA-RFLP. Esta técnica se reem-
plazó, en gran parte, por métodos con base en la PCR más
rápidos. La clonación y el mapeo moleculares del MHC
condujeron al desarrollo reciente de una nueva técnica ba-
sada en la PCR que tipifica los antígenos de las regiones
clases I y II. Al emplear esta técnica, la genotipificación
del HLA puede realizarse en una sola muestra usando PCR
múltiple y un solo gel, con resultados que se obtienen a
partir de una fotografía polaroid. Este sistema sustituye,
o está sustituyendo, a todos los anteriores procedimientos
serológicos/moleculares con base en la tipificación HLA,
en la mayor parte de laboratorios de pruebas de histocom-
patibilidad. Las técnicas con base en la secuencia del DNA
aportan un método de tipificación de alta resolución muy
empleado en situaciones de trasplante de médula ósea.
 SECCIÓN 9
PATOLOGÍA MOLECULAR

KWWSERRNVPHGLFRVRUJ
 50
Microdisección por láser y captura de tejido
Orla Sheils, Paul Smyth, Esther O’Regan, Stephen Finn,
Richard Flavin y John O’Leary
Los recientes avances en tecnologías moleculares han re-
volucionado los estudios genómicos, transcriptómicos y
proteómicos. Sin embargo, un inconveniente potencial
serio en la aplicación de estas tecnologías es la heteroge-
neidad inherente de tejidos resecados quirúrgicamente.
Resultados erróneos pueden generarse, causando distor-
sión en los análisis subsiguientes a menos que el material
de entrada esté libre de poblaciones celulares excedentes
para los requerimientos. La microdisección por láser de los
cortes de tejido y de las preparaciones citológicas es un
valioso recurso en sentido ascendente para facilitar la ob-
tención de poblaciones celulares y superar la barrera de la
complejidad del tejido. Puede acoplarse con una variedad
de tecnologías moleculares en sentido descendente para
generar resultados válidos y significativos.
La microdisección por láser y captura de tejido (LCM)
es una técnica que se desarrolló originalmente en el Insti-
tuto Nacional de Cáncer. Desde sus inicios sufrió varias
modificaciones, en la actualidad se dispone de una gama de
instrumentos, los cuales se clasifican en dos categorías,
dependiendo del tipo de láser empleado (infrarrojo [IR] o
ultravioleta [UV]).
La LCM puede aplicarse a una variedad de preparacio-
nes tisulares, desde secciones congeladas hasta secciones
fijadas e incluidas en parafina o preparaciones citológicas.
La tinción de rutina usando hematoxilina y eosina o azul
de toluidina se utiliza, por lo general, para ayudar en la
identificación morfológica del tipo celular de interés y para
facilitar el recorrido alrededor de una sección tisular. Sin
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
embargo, las tinciones histoquímicas, inmunohistoquími-
cas o inmunofluorescentes pueden utilizarse también para
permitir la selección de células, según las características
fenotípicas y funcionales. Dependiendo del material de ini-
cio y de los requerimientos de los protocolos en sentido
descendente seleccionados, el DNA, mRNA o la proteína
pueden extraerse y analizarse con éxito. De esta manera
la identificación de los biomarcadores celulares específicos
de la enfermedad o de blancos terapéuticos potenciales se
logra con exactitud.
Esta tecnología es útil en la investigación de cáncer. Una
barrera importante para los investigadores de cáncer yace
en la dificultad de caracterizar los cambios moleculares que
se producen durante la progresión del cáncer, donde las cé-
lulas premalignas progresan para formar un tumor maligno.
La identificación de proteínas de expresión baja o de sobre-
expresión durante la progresión del tumor que pueden ayu-
dar en la detección temprana del cáncer es obstaculizada
por la subpoblación celular pequeña en la cual estas proteí-
nas existen. La microdisección por captura láser permite a
los investigadores comparar células normales con células
enfermas aislando subpoblaciones distintas a partir de sec-
ciones de tejido teñidos.
LCM-PixCell® y AutoPix® de Arcturus
La LCM facilita el incremento de la sensibilidad y de la
exactitud de los ensayos moleculares iniciando con mues-
490 CAP. 50 MICRODISECCIÓN POR LÁSER Y CAPTURA DE TEJIDO
tras de tipo celular homogéneo y de estructuras multice-
lulares aisladas a partir de muestras tisulares o citológicas
completas. Este acercamiento único a la microdisección,
desarrollado en 1996 en los Institutos Nacionales de Salud
(EUA) y disponible exclusivamente de la compañía Arc-
turus, asegura que las moléculas biológicas, como RNA y
DNA, permanezcan indemnes durante el proceso de micro-
disección. El análisis molecular en sentido descendente de
estas moléculas produjo resultados exactos y seguros que
condujeron a más de 300 publicaciones revisadas a fondo
por investigadores independientes.
La LCM tiene gran flexibilidad respecto a preparaciones
tisulares y con fijación celular. Extrae células con eficacia a
partir de secciones tisulares incluidas en parafina, congela-
das y preparadas usando una amplia variedad de colorantes
diferentes, de superficies de laminilla y de protocolos.
Con base en la adhesión de las células seleccionadas a
una membrana termoplástica, la LCM utiliza un láser in-
frarrojo de baja potencia para fundir la membrana sobre las
células de interés. La parte microscópica del instrumento
PixCell II LCM utiliza una palanca de control para dirigir
su mecanismo. Los “conos” especiales (fig. 50-1) se car-
Figura 50-1 Fotomicrografía electrónica de barrido de un cono
de CapSure LCM con una sola célula capturada con láser sobre el
frotis termoplástico. Cortesía de Arcturus.
gan dentro del montaje, a través del cual el láser se enfoca
sobre las células de interés. Estos conos, cubiertos con una
película termoplástica, son colocados sobre el corte del te-
jido o sobre la muestra citológica. El cono se suspende en
un brazo de transporte mecánico y se coloca sobre el área
deseada de la sección deshidratada del tejido bajo presión
estándar. Después de la selección visual de las células de-
seadas, guiada por un haz de posicionamiento, la activa-
ción del láser conduce a la fusión focal de la membrana de
etileno acetato de vinilo (EVA). La formación de una pro-
tuberancia fina del plástico fundido, que tiende un puente
sobre el hueco entre el capuchón y el tejido y se adhiere a
la célula blanco, significa que cuando el capuchón se le-
vanta, las células seleccionadas siguen unidas y se captu-
ran por análisis adicional. El polímero resolidifica dentro
de milisegundos y forma un compuesto con el tejido. Los
impulsos del láser, por lo general 0.5 a 5.0 ms de duración,
pueden repetirse múltiples veces a través de la superficie
entera del capuchón, que permite el aislamiento rápido de
una gran cantidad de células. Los fragmentos tisulares se-
leccionados se recoleccionan por la elevación simple del
capuchón, el cual entonces se transfiere a un tubo para mi-
crocentrifugado que contiene soluciones amortiguadoras
requeridas para el aislamiento de las moléculas de interés.
El diámetro mínimo del rayo láser del microscopio LCM
es actualmente de 7.5 µm, el máximo de 30 µm. Después de
este procedimiento, las biomoléculas se extraen de las cé-
lulas usando ácido nucleico propietario o genérico o equi-
po de extracción de la proteína.
El proceso de captura celular es directo y fácil de realizar
y existe una gama de productos optimizados para las aplica-
ciones específicas en sentido descendente. El Sistema PixCell
II LCM (fig. 50-2) no utiliza radiación UV pulsada u otras
técnicas indirectas de captura, una característica que, los fa-
Figura 50-2 Instrumento PixCell II de Arcturus.
bricantes afirman, reduce la pérdida potencial de la muestra o
la introducción de cargas electrostáticas que hacen la muestra
difícil de manejar. La energía baja del láser IR también evita
efectos fotoquímicos potencialmente perjudiciales.
Existe un sitio de trabajo que archiva la imagen opcional
disponible con el Sistema de PixCell II LCM. Este dispo-
sitivo provee una interfase de uso fácil para la grabación y
almacenaje, tanto de las imágenes pre como de las posmi-
crodiseccionadas con anotaciones opcionales del usuario.
Un avance reciente en el repertorio de Arcturus, dentro
de la tecnología LCM, es el sistema automático AutoPix®
LCM. La ventaja principal de este instrumento (fig. 50-3)
sobre el PixCell II es que toda la parte y los mecanismos
ópticos, cámaras fotográficas, filtros y objetivos están total-
mente controlados por computadora. Esto permite que áreas
dentro de numerosos campos del panorama sean visualiza-
das, seleccionadas, y capturadas en forma simultánea. Ade-
más, la célula y los algoritmos del reconocimiento de la
LCM-PIXCELL® Y AUTOPIX® DE ARCTURUS 491

Figura 50-3 Instrumento AutoPix de Arcturus.

Figura 50-4 Pasos involucrados en LCM.

Figura 50-5 Principio básico de LCM de Arcturus.

492 CAP. 50 MICRODISECCIÓN POR LÁSER Y CAPTURA DE TEJIDO
Figura 50-6 Dibujo animado que representa cómo un rayo láser se
enfoca a través de una película para disecar células individuales.
característica incorporados permiten al usuario programar
el software para localizar y enfocar células o regiones espe-
cíficas de interés en varias muestras. El sistema (figs. 50-4,
50-5 y 50-6) también tiene la capacidad de agrupar células
o regiones microdiseccionadas, a partir de muestras múl-
tiples, en una sesión facilitando la recolección de material
microdiseccionado.
Microdisección con microrrayo láser
Otra tecnología avanzada disponible en el comercio de la
microdisección láser está disponible bajo la forma de micro-
disección con microrrayo láser (LMM; PALM-Mikrolaser
Technologic, Bernried, Alemania). El principio primordial
que distingue entre LCM y LMM es la elección del láser. El
sistema PALM utiliza un láser UV con un enfoque muy alto
para cortar o eliminar células seleccionadas por ablación de
estructuras circundantes.
El micro-rayo PALM (fig. 50-7) es un microscopio
innovador diseñado para el aislamiento y recolección de
tejido, células u organelos biológicos no contaminados,
que se cortan directamente de secciones histológicas o de
cultivos celulares para el análisis en sentido descendente,
típicamente para RNA o contenido proteínico (fig. 50-8).
Un láser UV-A pulsado de nitrógeno a 337 nm se acopla a
Figura 50-8 Fotografías que muestran cómo la LPC se logra a partir de células en un filtro hasta cuando las células son recoleccionadas.
Figura 50-7 Instrumento para microdisección con microrrayo
PALM.
la trayectoria epifluorescente o de campo brillante del mi-
croscopio y se programa para trazar cualquier patrón cor-
tante deseado antes de transferir especímenes, ya sea como
fragmentos a partir de portaobjetos histológicos normales,
células intactas en portaobjetos revestidos con membranas
especiales, o como células vivas en placas de cultivo re-
vestidas con membranas, directamente dentro de un tubo
Eppendorf para el análisis adicional.
Varias aplicaciones adicionales están disponibles con el
sistema PALM®. Éste utiliza un láser UV pulsado con ca-
lidad de un haz alto, que se interconecta dentro del micros-
copio y se enfoca a través de un objetivo a un tamaño del
punto del haz <1 µm de diámetro. Puede usarse la densidad
del fotón muy alta en el enfoque del láser estrecho para
separar o para eliminar estructuras biológicas por ablación,
permitiendo realizar microcirugía sobre células y molécu-
las o para el micropreparado de células únicas y de partículas
subcelulares. El microrrayo es capaz de disecar filamentos
citoplasmáticos, flagelos o colas del espermatozoide. Ade-
más, puede realizarse microinyección inducida por láser,
por ejemplo, en el área nuclear de células vivas, causando
transporte de material dentro de la célula sin herramientas
mecánicas o vectores virales.
 LEICA AS LMD
Los láseres de los sistemas MicroLaser de PALM® se in-
terconectan dentro de un microscopio de investigación vía
trayectoria epifluorescente. Un objetivo de abertura numé-
rica alta enfoca los láseres sobre el plano del objeto, lo que
produce tamaños del punto <1 µm de diámetro. El sistema
está equipado de una parte motorizada del microscopio,
controlada por computadora o de un micromanipulador, o
ambos (PALM® RoboStage y PALM® CapMover). Los sis-
temas se enfrían con aire, la base se opera con interruptor y
se controlan por el ratón de la computadora. Todos los sis-
temas pueden equiparse con fluorescencia y con el software
avanzado de Metafer P para el reconocimiento del patrón.
Leica AS LMD
El Leica AS LMD (fig. 50-9) es otro sistema que ofrece
microdisección exacta por láser de células o de grupos de
Figura 50-9 Instrumento Leica AS para microdisección por láser.
células dentro de preparaciones para PCR, RT-PCR y pro-
teómicos. Este sistema es una plataforma de microdisección
de “tercera generación”. Fue desarrollado combinando la
arquitectura del microscopio vertical automático, el con-
trol óptico tridimensional del rayo láser para disección y
del área disecada, el muestreo sin contacto del tejido y el
manejo motorizado posdisección.
La LCM continúa en desarrollo y se extiende como una
técnica con avances en la instrumentación y en el control
computarizado de la función básica. Técnicas unicelulares
más precisas crean y se acoplan con protocolos o equipo de
extracción por proveedores de aplicaciones en sentido des-
cendente. En un tiempo relativamente corto, la LCM se ha
afianzado como una herramienta inestimable para la ob-
tención de poblaciones celulares puras a partir de material
493
biológico, y es un componente invaluable de protocolos
basados en el tejido dentro de las áreas genómicas funcio-
nales, proteómicas y genómicas.
Lecturas adicionales
Banks RE, Dunn MJ, Forbes MA et al. The potential use of laser
capture microdissection to selectively obtain distinct popu-
lations of cells for proteomic analysis-preliminary findings.
Electrophoresis 1999; 20: 689-700.
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dissection: molecular analysis of tissue. Science 1997; 278:
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Schutze K, Lahr G. Identification of expressed genes by laser me-
diated manipulation of single cells. Nature Biotechnol 1998;
16: 737-742.
(b)
 51
Análisis del gen por reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) en tiempo real
Cara M Martin, Orla Sheils y John O’Leary
Introducción
El análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la po-
limerasa en tiempo real es una modificación de la técnica
original de PCR, que implica la detección y la medición
confiables de los productos generados durante cada ciclo
de la reacción en cadena de la polimerasa. La técnica con-
fía en la detección de productos específicos de PCR, con
base en el uso de una sonda marcada con fluorescencia y
diseñada para hibridar dentro de la secuencia blanco del
producto de PCR. Durante el ciclo de PCR, la detección
de la señal fluorescente, que se incrementa, es proporcional
a la acumulación de los productos de la amplificación. Por
tanto, la medición de la fluorescencia en una muestra parti-
cular emite una señal que se asocia específicamente con el
blanco amplificado y se relaciona en forma cuantitativa con
la cantidad de producto de PCR.
La PCR en tiempo real se puede realizar usando una
variedad de tecnologías, incluyendo los ensayos con la 5’
nucleasa, iniciadores de horquilla, sondas Scorpion, co-
lorantes intercalantes, por ejemplo, verde SYBR y FRET
(tecnología de la transferencia de energía por resonancia li-
bre), y empleando sistemas de hibridación por doble sonda
(faro molecular). En este capítulo, se discuten los ensayos
de la 5’ nucleasa conocida como TaqMan® de reacción en
cadena de la polimerasa, y sus aplicaciones para el uso en la-
boratorios de patología.
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
Química de la reacción en cadena
de la polimerasa en tiempo real
Colorantes de unión a DNA, SYBR green (verde)
La base de los métodos de detección de secuencia no espe-
cífica es el uso de colorantes intercalantes, como el verde
SYBR o el bromuro de etidio (fig. 51-1a). El colorante li-
bre exhibe poca fluorescencia en solución, pero durante la
etapa de extensión de PCR las cantidades crecientes del
colorante intercalado se unen al DNA naciente de doble
hebra. La incorporación del verde SYBR dentro de una
reacción de PCR permite la detección de la acumulación
del producto monitoreando el aumento en la emisión de
fluorescencia en tiempo real. Éste proporciona mayor
flexibilidad eliminando la necesidad de sondas fluores-
centes específicas del blanco; sin embargo, es importante
observar que los iniciadores que se emplean determinan
la especificidad total de la reacción. Además, debido a la
presencia de cualquier DNA de doble hebra es capaz de ge-
nerar fluorescencia, la especificidad del ensayo es similar a
la PCR convencional, y los problemas pueden encontrarse
con la unión del colorante a la amplificación no específica
y a dímeros del cebador. La especificidad se mejora gene-
rando una curva de disociación para detectar la amplifica-
ción no específica (Ririe y cols., 1997). El análisis de la
curva de disociación se realiza después de una PCR ter-
496 CAP. 51 ANÁLISIS DEL GEN POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN TIEMPO REAL
Figura 51-1 a) El colorante intercalante verde SYBR se une al DNA de doble cadena. b) Disociación (curva del punto de fusión),
mostrando dímeros del iniciador y el amplicón de PCR en un ensayo con verde SYBR.
minada. Esto se logra elevando lentamente la temperatura
de la reacción de PCR de 65 a 95°C (sobre la tempera-
tura de fusión del fragmento amplificado) mientras que
continuamente se recolectan los datos de la fluorescencia.
Cuando la temperatura aumenta, el producto de PCR se
desnaturaliza, creando un pico de fusión característico a
temperatura de fusión del amplicón, que es distinguible de
artefactos de la amplificación que se funden a temperaturas
más bajas (fig. 51-1b).
Faros moleculares y sondas de hibridación
En este sistema, se emplean dos sondas de hibridación. Una
sonda lleva una molécula donadora de fluoresceína en su ex-
tremo 3’, cuyo espectro de emisión se traslapa con una son-
da receptora sobre el extremo 5’ de una segunda sonda. En
solución, los dos colorantes están separados. Sin embargo,
después de la etapa de desnaturalización ellos se hibridan
con la secuencia del blanco durante la complementariedad,
y adoptan una configuración cabeza-cola. Esto conduce a
las dos moléculas fluorescentes a una proximidad estrecha,
y el fragmento de la fluoresceína puede transferir su energía
a la segunda. La energía de la luz emitida por la segunda
molécula se evalúa y registra, y el aumento en los niveles
de fluorescencia corresponde con la cantidad de DNA sin-
tetizada durante la reacción de PCR. Una ventaja adicio-
nal de este sistema lo aportan las sondas no hidrolizadas,
permitiendo la posibilidad de generar curvas de los puntos
de fusión. Éstas pueden utilizarse para vigilar la eficiencia de
la amplificación.
Sondas de hidrólisis
El ensayo TaqMan® utiliza la actividad de la exonucleasa 5’-
3’ de Taq o de la rTth DNA polimerasa para hidrolizar una
sonda de hibridación unida al fragmento amplificado blanco
(Lyamichev y cols., 1993; Holland y cols., 1991; Lawyer y
cols., 1989). En este sistema, tres oligonucleótidos se re-
quieren para unirse al blanco. Dos iniciadores específicos
de la plantilla definen los puntos finales del amplicón y se
emplean como primer nivel de la especificidad. Otro nivel
de la especificidad se alcanza con la inclusión de una sonda
específica, que une internamente a los puntos definidos por
los iniciadores. Las características de la sonda TaqMan® in-
cluyen una molécula reportera fluorescente en el extremo 5’,
cuya emisión es extinguida por una segunda molécula en el
extremo 3’. La proximidad espacial de la sonda reportera a
la sonda extintora en una sonda intacta asegura que ninguna
fluorescencia neta se detecte. La liberación de fluorescencia
ocurre sólo si la amplificación específica del blanco ocurre,
evitando la necesidad de confirmar el fragmento amplifica-
do o amplicón después de la amplificación.
Química de la TaqMan de PCR (ensayo
de la 5’ nucleasa)
La tecnología TaqMan es una técnica cuantitativa de PCR
en tiempo real, basada en el ensayo de la 5’ nucleasa des-
crita primero por Holland y cols. (1991). La técnica emplea
sondas fluorescentes diseñadas para hibridar dentro de la
secuencia del blanco y, en la fase de templado/extensión de
PCR, para generar una señal que se acumule durante PCR
al completarse un ciclo en proporción con la cantidad de la
plantilla, antes de la iniciación de PCR (Orlando y cols.,
1998; Gibson y cols., 1996).
La base para este sistema consiste en medir continuamen-
te los productos de PCR cuando se acumulan, usando una
sonda oligonucleótida fluorogénica específica doblemente
marcada llamada sonda TaqMan (Livak y cols., 1995; Lee
 QUÍMICA DE LA TAQMAN DE PCR (ENSAYO DE LA 5’ NUCLEASA)
y cols., 1993). La sonda TaqMan se compone de un oli-
gonucleótido corto (~ 20 a 25 bases) marcada con dos co-
lorantes diferentes, un colorante extintor o quencher en 3’,
un colorante reportero en 5’, y un fosfato bloqueador en 3’
para prevenir la extensión de la sonda durante la PCR (Li-
vak y cols., 1995). El colorante reportero fluorescente, por
ejemplo, FAM (6-carboxifluoresceína), VIC® o JOE (2,7-
dimetil-4,5,-dicloro-6-carboxifluoresceína) está covalen-
temente ligado al extremo 5’ de la sonda oligonucleótida.
TET (tetracloro-6-carboxifluoresceína) y HEX (hexaclo-
ro-6-carboxifluoresceína) pueden también utilizarse como
colorantes reporteros fluorescentes en este sistema. Cada
uno de estos reporteros se extingue por TAMRA (6-car-
boxi-tetrametil-rodamina) (el colorante extintor), un extin-
tor o quencher no fluorescente que está unido por un LAN
(nucleótido modificado del brazo ligador) al extremo 3’ de
la sonda. La sonda está químicamente fosforilada en su ex-
tremo 3’, lo cual previene la extensión de la sonda durante
las aplicaciones de PCR. La secuencia de la sonda oligo-
nucleótida es homóloga a una región interna presente en el
producto de PCR. Cuando la sonda está intacta (alineada),
la transferencia de energía del tipo Förster ocurre entre los
497
dos fluoróforos y ocasiona la supresión de la fluorescencia
del reportero (Gibson y cols., 1996; Livak y cols., 1995).
El ensayo TaqMan utiliza tanto la Taq como la Tth po-
limerasa, aisladas a partir de Thermus aquaticus y Ther-
mus thermophilus, respectivamente, pero cualquier enzima
con actividad 5’ nucleasa puede utilizarse. Durante la am-
plificación, la sonda no extensible es incidida por la activi-
dad de la 5’ exonucleasa de la Taq o Tth DNA polimerasa,
de tal modo que libera al reportero a partir del extintor o
quencher oligonucleótido y produce un aumento en la in-
tensidad fluorescente de la emisión del reportero. Esto se
monitorea en tiempo real durante la fase exponencial de la
amplificación de PCR, usando el Sistema Detector de Se-
cuencias 7 700 (Applied Biosystems, Lincoln Centre Drive,
Foster City, CA 94404, USA). La incisión elimina la sonda
de la hebra blanco, permitiendo que la extensión del ini-
ciador continúe hasta el extremo de la hebra plantilla. Una
apreciación global del proceso se ilustra en la figura 51-2.
Las moléculas adicionales del colorante reportero son in-
cididas desde sus sondas respectivas con cada ciclo, lo que
conduce a un aumento en la intensidad de la fluorescencia
proporcional a la cantidad de amplicón que se produce. La
Figura 51-2 Esquema de TaqMan PCR usando una sonda
interna marcada con un reportero y una secuencia del extintor.
Los iniciadores y la sonda de TaqMan templan al DNA des-
naturalizado. Durante la polimerización la sonda es incidida,
liberando el colorante reportero del colorante extintor, produ-
ciendo un aumento en la señal fluorescente que es proporcio-
nal a la cantidad de producto de PCR que se ha acumulado.
498 CAP. 51 ANÁLISIS DEL GEN POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN TIEMPO REAL
actividad exonucleasa de la Taq polimerasa actúa sólo si
la sonda fluorogénica es templada al blanco, puesto que la
actividad es específica de la doble hebra, por tanto la enzima
no puede hidrolizar la sonda cuando está libre en la solución
y ninguna fluorescencia del reportero se detecta.
Puesto que la polimerasa sólo incide en la sonda mien-
tras ésta permanece hibridada a su hebra complementaria,
las condiciones de temperatura de la extensión de PCR
deben ajustarse para asegurar la unión de la sonda. El sis-
tema de TaqMan utiliza un paso combinado de templado y
de polimerización de 60 a 62°C para asegurar que la sonda
permanezca hibridada durante la amplificación. La mayor
parte de las sondas tienen una temperatura de fusión (Tm) de
alrededor de 10°C, o por lo menos de 5°C más arriba que la
de los iniciadores de PCR (Livak y cols., 1995), ya que la
unión de la sonda TaqMan con los iniciadores es crucial para
el éxito del proceso. Sin ella, se forman productos de PCR
sin la generación de fluorescencia y, por tanto, no es posible
una detección. Esto asegura que la sonda permanezca uni-
da a su blanco durante la etapa de la extensión del iniciador
y también garantiza la máxima actividad 5’-3’ exonucleasa
de las Taq y Tth DNA polimerasas.
Sondas TaqMan de unión al surco
menor del DNA
Recientemente, se han desarrollado sondas fluorogénicas
TaqMan de unión al surco menor (MGB) que mejoran la
sensibilidad de un ensayo TaqMan. MGB (antibióticos na-
turales y moléculas sintéticas) pueden entrar en el surco
menor de la hélice que forma el DNA de doble hebra y
estabilizar los DNA dúplex, aumentando la discriminación
del apareamiento mal hecho cuando se une a una sonda
oligonucleótida. Las sondas fluorogénicas TaqMan MGB
tienen varias características que las hacen superiores a las
sondas fluorogénicas tradicionales. Una MGB se une a los
extremos 3’, 5’ o a un nucleótido interno del oligonucleó-
tido. Las sondas MGB se unen con más firmeza a su com-
plemento, lo que eleva la temperatura de fusión (Tm) de
las sondas y permite un diseño más flexible del análisis.
Los estudios demuestran que la introducción de una MGB
sobre una sonda 12-mer con una Tm de 20°C aumenta su
Tm a 65°C. Esta Tm es equivalente a la Tm de una sonda
27-mer sin una MGB (Kutyavin y cols., 2000). Se reco-
mienda que la Tm de la sonda sea >10°C más alta que la Tm
del cebador, de manera que la introducción de una MGB
contribuya significativamente al diseño del ensayo, permi-
tiendo el uso de una gama más amplia de iniciadores. El
uso de una MGB permite que sondas más cortas se em-
pleen y se mejore la discriminación del apareamiento mal
hecho. Los oligonucleótidos MGB muestran una diferencia
incrementada entre la Tm de oligonucleótidos de una sola
base con apareamientos bien hechos y la de oligonucleóti-
dos con apareamientos mal hechos, por tanto, aumenta el
poder discriminatorio de los ensayos por hibridación.
Otra característica de las sondas MGB es la fluorescen-
cia baja del fondo y, por consiguiente, un cociente con ma-
yor señal:ruido. La fluorescencia del fondo de las sondas
intactas MGB aumenta levemente con la longitud de la son-
da, pero permanece varias veces más baja en comparación
con las sondas sin MGB. Las sondas MGB estabilizan enla-
ces A-T más que los enlaces G-C en un DNA dúplex. Esto
reduce la influencia de la secuencia del blanco sobre Tm
(Kutyavin y cols., 2000). Se ha encontrado también que esa
discriminación del apareamiento mal hecho se mejora cuan-
do se coloca bajo MGB. Típicamente, un conjugado oligo-
nucleótido-MGB se diseña de tal forma que MGB reside en
el extremo 3’ de un oligonucleótido que contiene una región
rica en A-T con cerca de 6 a 7 bases. Se observó que los
apareamientos mal hechos posicionados dentro de la región
vinculada a MGB se diferencian mejor, mostrando una dife-
rencia incrementada de la energía libre entre apareamientos
correctos y apareamientos mal hechos para los diversos pa-
res apareados incorrectamente bajo MGB (Kutyavin y cols.,
2000; Orlando y cols., 1998; Gibson y cols., 1996).
Iniciador TaqMan y diseño de la sonda
La especificidad y la sensibilidad de un ensayo TaqMan
PCR se determinan con la elección del iniciador y de las
secuencias de la sonda. Los biosistemas aplicados desarro-
llan un programa software específico conocido como Pri-
mer Express, el cual puede utilizarse para diseñar ensayos
óptimos TaqMan PCR. La longitud óptima para los inicia-
dores TaqMan PCR es de 15 a 20 bases con un contenido
G/C del 30 al 80%, donde los últimos cinco nucleótidos en
el extremo 3’ contienen no más de dos residuos de G y C.
La Tm de los iniciadores directos e inversos debe ser de 58
a 60°C y no diferir en más de 1 a 2°C. Los amplicones PCR
más cortos tienden a amplificar con más eficiencia que los
amplicones más largos y aumentan la sensibilidad del en-
sayo. En general, la longitud óptima para los amplicones
TaqMan PCR es de 50 a 150 bp, aunque amplicones más
grandes se han amplificado con éxito.
Las sondas TaqMan se diseñan normalmente con una
Tm por lo menos 10°C más alta que la de los iniciadores
PCR. Esto asegura que la sonda se hibridiza antes que los
iniciadores y sigue hibridándose durante la etapa de tem-
plado. Las sondas TaqMan pueden tener 13 a 30 bases
de longitud, con un contenido G/C del 50%. Las sondas
TaqMan deben diseñarse tan cerca como sea posible, sin
el traslape o conteniendo complementariedad con cual-
quiera de los iniciadores. Además, las sondas TaqMan no
deben contener una G en el extremo 5’, pues una G adya-
 DETECCIÓN DEL AMPLICÓN 499

1.3

1.25

1.2

1.15

1.1
Delta Rn

1.05

0.95

0.9
900
0.85

0.8
300
900
[inverso], nM
300
[directo], nM 50

0.8-0.85 0.85-0.9 0.9-0.95 0.95-1 1-1.05 1.05-1.1 1.1-1.15 1.15-1.2 1.2-1.25 1.25-1.3

Figura 51-3 Optimización del iniciador TaqMan PCR. Los valores 䉭Rn se reducen cuando las concentraciones del iniciador están
disminuidas.

cente al colorante reportero extingue la fluorescencia in-
cluso después de la incisión. El uso de las sondas MGB
TaqMan, como se discute antes, reduce mucho la longitud
de la sonda mientras mantienen la Tm requerida.
Idealmente, la optimización del iniciador y de la sonda
deben realizarse para determinar dónde ocurre la fase expo-
nencial, y de la meseta de PCR en cualquier ensayo particu-
lar (fig. 51-3). Los iniciadores se utilizan en el rango de 50 a
200 nM, mientras la sonda está en el rango de 100 nM.
Para los blancos del gen del RNA, los ensayos Taq-
Man RT PCR deben diseñarse idealmente a través del lí-
mite intrón-exón para reducir al mínimo resultados falsos
positivos que se presentan a partir de la amplificación de
DNA genómico contaminante. Además, la amplificación
de RNA/cDNA en presencia de Mn2+ minimiza problemas
que pueden causarse por la amplificación de fragmentos de
DNA unido nuevamente (Bauer y cols., 1997).
Detección del amplicón
El procedimiento TaqMan es aplicable a la medición del
punto final y a la detección de la amplificación por PCR
en tiempo real. El aumento en fluorescencia puede detec-
tarse si se emplea un espectrofotómetro de luminescencia,
como los termocicladores de la compañía Applied Biosys-
tems 7900 y 7000, que utilizan una lámpara de halógeno de
tungsteno y un sistema de cámara fotográfica CCD, o los
7700, que usan un formato de escaneo por láser para detec-
tar incrementos en la fluorescencia en puntos definidos del
tiempo dentro del protocolo para los ciclos. Estos detec-
tores de la secuencia del DNA se pueden también utilizar
para tecnologías con el verde SYBR, con sondas Scorpion
y faros moleculares con pocas modificaciones.
Detección del punto final TaqMan
La detección del punto final se realiza después de que
TaqMan PCR se ha completado y los datos son recolecta-
dos (es decir en el ciclo 35, 40, etc.). Para la detección del
punto final, el incremento en la fluorescencia se compara
a la fluorescencia de un “control sin plantilla de DNA” y
las fluctuaciones de la fluorescencia interferentes son nor-
malizadas. Esto se consigue dividiendo la intensidad de
la emisión del colorante reportero entre la intensidad de la
emisión del colorante extintor o quencher para definir un
cociente conocido como RQ (reportero: extintor o quen-
500 CAP. 51 ANÁLISIS DEL GEN POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN TIEMPO REAL
cher) para cada reacción. La diferencia entre el RQ de la
muestra (RQ+) y el RQ del control sin plantilla (RQ–) es
definido como el ⌬RQ e indica la magnitud confiable de la
señal generada durante la PCR.
Detección por TaqMan en tiempo real
Durante TaqMan PCR en tiempo real, el valor de la fluores-
cencia que se mide durante cada ciclo de PCR representa la
cantidad de producto amplificado en ese ciclo. El sistema
de detección de la secuencia ABI 7700 recopila la emisión
fluorescente a 500 a 600 nm en cada uno de los 96 pozos
del termociclador, una vez cada pocos segundos. Un láser
dirigido a través de los cables de fibra óptica excita los colo-
rantes fluorescentes adentro del tubo. Estos cables entonces
llevan las emisiones fluorescentes de nuevo a una cámara
fotográfica CCD, donde se detectan de acuerdo a sus longi-
tudes de onda individuales. Un valor llamado ⌬Rn se calcu-
la para cada muestra restando la señal del reportero, antes
de PCR, de la señal normalizada del reportero. El software
también calcula un ciclo umbral (Ct), un ciclo en el cual un
aumento estadístico significativo en el producto de PCR se
detecta primero. El Ct es la base de todos los análisis cuan-
titativos en tiempo real (Higuchi y cols., 1993).
Cuantificación absoluta
La cuantificación absoluta de TaqMan PCR se realiza em-
pleando estándares de concentración conocida y de com-
posición similar al amplicón blanco. El DNA plásmido y el
RNA transcrito in vitro por lo general se usan como están-
dares absolutos para los ensayos TaqMan. Para la medición
de los niveles de la expresión del mRNA, un estándar del
DNA no es la opción óptima; el cRNA (RNA copia) o el
RNA de concentración conocida es preferible, pues expli-
ca la eficacia de la reacción de transcripción inversa. Los
estándares del RNA copia pueden generarse amplificando
una secuencia levemente más grande que el amplicón por
TaqMan® PCR, usando un grupo de iniciadores externos.
El amplicón puede después clonarse dentro de un vector
conveniente y transcribirse dentro del cRNA. Las curvas
estándares se generan amplificando las diluciones seriales
del estándar en el ensayo TaqMan PCR. Las muestras de
la prueba entonces se trazan a lo largo de la curva estándar
para determinar la cantidad de blanco en la muestra.
Cuantificación relativa
La cuantificación relativa se emplea por lo general para eva-
luar cuantitativamente las diferencias en las secuencias del
blanco entre diversas muestras. El objetivo de un experimen-
to cuantitativo relativo de TaqMan es determinar el cociente
de una molécula de mRNA o de DNA del blanco a una mo-
lécula diferente del blanco o a sí mismo bajo condiciones
diferentes. El resultado puede entonces divulgarse como di-
ferencia doblada, relativa a una muestra del calibrador. Hay
dos métodos para calcular la cuantificación relativa de la ex-
presión del gen blanco: el método de la curva estándar, y el
método Ct comparativo (Applied Biosystems, 1997).
Método de la curva estándar
Para el método de la curva estándar, se generan curvas es-
tándares para los ensayos del blanco y del control endógeno.
Para cada muestra de la prueba, la cantidad del blanco y la
cantidad del control se determinan a partir de la curva están-
dar apropiada. Entonces la cantidad del blanco es dividida
entre la cantidad del control endógeno para obtener un valor
normalizado del blanco. Para calcular los niveles relativos de
la expresión, los valores normalizados del blanco se dividen
entre los valores del blanco normalizados por calibrador.
Método Ct comparativo
Para el método Ct comparativo, los valores relativos de la
cuantificación se calculan a partir de los valores del ciclo
umbral (Ct) generados durante la PCR. El valor Ct es el
ciclo al cual un aumento estadístico significativo en el pro-
ducto de PCR se detecta primero. El método Ct compa-
rativo para la cuantificación relativa calcula la expresión
relativa del gen usando la siguiente ecuación:
Cantidad relativa ⫽ 2–⌬⌬Ct
La ⌬Ct se calcula normalizando el Ct de la muestra del
blanco con el Ct del control endógeno (Ct blanco⫺Ct con-
trol endógeno). La ⌬⌬Ct, entonces se calcula restando la
⌬Ct media de la muestra del calibrador menos la ⌬Ct media
correspondiente, para la muestra del blanco. Los niveles
relativos de la expresión del gen blanco entonces se ex-
presan como un cambio doblado relativo a la muestra del
calibrador (Livak y cols., 2001). La cuantificación relativa
usando el método Ct comparativo depende de las eficien-
cias similares de la amplificación PCR para el blanco y
para los genes del control endógeno (Livak y cols., 2001;
Giulietti y cols., 2001).
Genes housekeeping
Un aspecto importante del diseño experimental cuantitativo
de PCR es la elección de un gen de referencia o housekeep-
 APLICACIONES DE TAQMAN PCR EN PATOLOGÍA
ing apropiado. Los genes del control endógeno pueden en-
sayarse por separado o junto con el blanco desconocido y
calcularse su cociente final. La amplificación simultánea
del blanco y del gen del control endógeno reduce al mí-
nimo los errores que se presentan debido a la estimación
inexacta de la concentración total del ácido nucleico y de
la calidad en muestras individuales.
Un control endógeno ideal del gen de referencia debe ex-
presarse a un nivel constante entre diferentes tipos de tejido
e individuos y no ser afectado por el tratamiento experimen-
tal. Además, la expresión del gen housekeeping puede ser
muy alta comparada con aquella del blanco desconocido y,
en tal situación, la eficacia de la amplificación entre los dos
blancos puede diferir en forma considerable. Para la cuanti-
ficación exacta en las reacciones que amplifican más de un
blanco en el mismo tubo, es importante que no compitan las
dos reacciones. Esto puede evitarse limitando la concentra-
ción de los iniciadores usados en PCR, que es dependiente
de la abundancia relativa de los diversos blancos.
Normalmente se usan tres genes como controles en-
dógenos para los estudios de la expresión del mRNA.
Éstos incluyen los mRNA específicos para genes house-
keeping ␤-actina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
(GAPDH), y RNA ribosómico (rRNA). El mRNA de ␤-
actina se expresa abundantemente en la mayor parte de los
tipos de célula y codifica una proteína ubicua del citoes-
queleto. Sin embargo, es importante observar que la pre-
sencia de seudogenes puede interferir con los resultados
cuantitativos (Mutimer y cols., 1998).
El RNA ribosómico (rRNA) constituye 85 a 90% del
RNA celular total y se expresa en todos los tejidos. El
gen housekeeping del rRNA 18S ha demostrado ser re-
lativamente estable en tejidos humanos bajo condiciones
experimentales variables (Schmittgen y cols., 2000). Sin
embargo, el rRNA no puede utilizarse como gen de refe-
rencia al cuantificar blancos que se han enriquecido para
el mRNA, pues el rRNA se pierde durante la purificación
del mRNA.
El mRNA de la GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato des-
hidrogenasa) también se expresa en todos los tejidos y se
usa como control endógeno para los ensayos cuantitativos
de PCR. Sin embargo, existe cierta evidencia que los ni-
veles de la expresión de GAPDH varían durante el cultivo
celular in vitro (Hamalainen y cols., 2001) y entre indivi-
duos (Bustin y cols., 1999), acentuando la importancia de
la validación cuidadosa de los genes del control endógeno
para la cuantificación comparativa.
Aplicaciones de TaqMan PCR en patología
Las potenciales de aplicación para la tecnología TaqMan
en el diagnóstico médico son enormes. El ensayo Taq-
501
Man se ha utilizado con éxito para detectar y cuantificar
varios patógenos y el análisis transcripcional de varios
blancos del mRNA. Se ha detectado y cuantificado pre-
viamente RNA del virus del sarampión en biopsias intesti-
nales frescas congeladas e incluidas en parafina del tejido
de niños con una nueva variante de la enfermedad intes-
tinal inflamatoria, usando la tecnología TaqMan RT PCR
(Uhlmann y cols., 2002; Martin y cols., 2002). El grupo
del autor también ha utilizado con éxito la tecnología de
TaqMan para detectar y tipificar subtipos del virus del pa-
piloma humano (HPV) en biopsias del tejido cervicales
y preparaciones citológicas basadas en ThinPrep líquida
(Murphy y cols., 2003). Similarmente, el grupo ha utili-
zado esta tecnología para estudiar células fetales en la cir-
culación materna en embarazos normales y complicados
(Turner y cols., 2003; Byrne y cols., 2003).
Discriminación alélica y ensayos TaqMan
para el genotipo de SNP
Aparte de la detección y cuantificación de los blancos es-
pecíficos del DNA y del RNA, la tecnología TaqMan PCR
que usa sondas MGB y el ensayo 5’ nucleasa pueden uti-
lizarse para los ensayos de discriminación genotipificante
y alélica de SNP (polimorfismo de un solo nucleótido). En
un sistema de dos alelos, la tecnología utiliza una aproxi-
mación de sonda dual con dos diferentes colorantes repor-
teros fluorescentes, a saber FAM y VIC (Livak, 1999; Lee y
cols., 1993), con los que se diseñan dos sondas, una especí-
fica para cada alelo o polimorfismo. Los ensayos de discri-
minación alélica se realizan bajo condiciones competitivas,
con la competición entre las sondas específicas silvestres y
mutantes que se producen en cada ciclo de PCR, pero en
particular más en las primeras rondas de PCR. Las seña-
les fluorescentes a partir de sondas FAM y VIC se gene-
ran sólo en presencia de la secuencia complementaria del
blanco (fig. 51-4). La fluorescencia del punto final se mide
sobre los detectores de secuencia ABI (7900 HT, 7000, y
los 7700). Los datos entonces se analizan usando el pa-
quete del software integrado, suministrado por Applied
Biosystems, que permite la discriminación entre genotipos
homocigotos y heterocigotos (fig. 51-5).
Assays on demand® (banco de secuencias
para ensayos TaqMan)
Applied Biosystems colocó un nuevo servicio, que permi-
te el acceso de usuarios de TaqMan PCR a una base de
datos del genoma, recientemente publicada, y de Celera
Corporation. Los Assays on demand® están disponibles
para ensayos del DNA y del RNA y consisten de grupos
502 CAP. 51 ANÁLISIS DEL GEN POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN TIEMPO REAL

Figura 51-4 Representación esquemática de la discriminación alélica TaqMan PCR que usa el sistema de sondas TaqMan de dos
colores.

Figura 51-5 El ensayo de la discriminación alélica se realiza sobre el detector de secuencia ABI 7000. El software integrado permite
la discriminación de alelos diferentes y se basa en el nivel de fluorescencia detectado.

Figura 51-6 Placa TaqMan de microvolumen de 384 pozos de
alto rendimiento. Esta placa puede cargarse de forma usual con
productos para la expresión del gen Assays on Demand (Bancos
de secuencia)® validados.
de iniciadores y sondas TaqMan diseñados para todos
los genes de secuencia conocida. Más de 19 000 ensayos
en humanos específicos del gen y más de 9 500 ensayos
en ratones específicos del gen están disponibles para que
los seleccionen los clientes; pueden obtenerse del sitio Web
de Applied Biosystems.
Placas TaqMan de volúmenes pequeños
Los avances recientes en la química de TaqMan incluyen el
lanzamiento de una versión de 384 pozos de la plataforma
para el análisis de la expresión del gen de alto rendimien-
Muestra
Calibrador
Muestra 2
Muestra 1
IL-1
Alfa
Figura 51-7 Análisis de la expresión del gen de citocina.
APLICACIONES DE TAQMAN PCR EN PATOLOGÍA 503
to. La placa de volumen pequeño de 384 pozos (fig. 51-6)
se diseña con la configuración habitual en serie, usando
productos de expresión del gen Assays on demand (ban-
co de secuencias)™ validados y el sistema del detector de
secuencia 7900 HT. Estas placas son capaces de evaluar la
expresión del gen de 12 a 384 blancos en hasta ocho mues-
tras de cDNA en una sola corrida de PCR, dependiendo de
la configuración de la placa.
Otra aplicación de esta tecnología es la placa TaqMan
de volumen pequeño con citocina humana para perfilar la
expresión del gen de ésta, usando el método Ct compara-
tivo de cuantificación relativa. La placa TaqMan con cito-
cina humana (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)
consiste de un consumible de 96 pozos divididos en 24 gru-
pos de copias, un grupo para cada análisis de la citocina. La
placa evalúa una sola muestra del cDNA generada del RNA
total humano en un experimento RT-PCR de dos etapas.
Este ensayo mide las siguientes 24 citocinas: TNF-␣,
TNF-␤, IFN-␥, TGF-␤, LT-␤, IL-1␣, IL-1␤, IL-2, IL-3,
IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12p35, IL-12p40,
IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, G-CSF, GM-CSF y M-CSF.
Cada pozo contiene sondas e iniciadores TaqMan MGB
marcados con FAM liofilizadas para un mRNA de la ci-
tocina humana. Un grupo de iniciadores y sondas TaqMan
MGB marcados con VIC para el control endógeno del RNA
ribosómico 18S fue utilizado para los ensayos múltiples.
Los ensayos para la cuantificación del RNA sobre la pla-
ca con citocina se realizan dentro una reacción en cadena
1000
Cuantificación relativa de la muestra
1000
100
10
a caibrar
0.1
0.01
0.001
0.0001
TNF-
IFNg
IL-15 ALFA
IL-12p40
IL-12p35
IL-10
IL-8
IL-5
IL-4 Blanco, expresión de citocinas
IL-2
IL-1
Beta
504 CAP. 51 ANÁLISIS DEL GEN POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN TIEMPO REAL
con la polimerasa de la transcriptasa inversa (RT-PCR). En
el primer paso, el cDNA es transcrito inversamente del RNA
total, usando hexámeros al azar y la transcriptasa inversa
MultiScribe®. El segundo paso incluye la amplificación del
producto de cDNA, usando la polimerasa TaqMan Universal
mastermix y AmpliTaq Gold DNA. Los 96 pozos de la placa
se llenan simultáneamente con una mezcla de cDNA y del
TaqMan Universal mastermix, a través de un puerto vía de
un sistema de canal. El volumen de la reacción de cada pozo
es 1 µl y el volumen total requerido para llenar la placa es
250 µl. La cantidad relativa de citocinas específicas en una
muestra individual se compara después con una muestra
apropiada del calibrador y se calcula usando el método com-
parativo o para la cuantificación relativa (fig. 51-7).
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 52
Reacción en cadena de la polimerasa en la célula
John O’Leary, Cara M Martin y Orla Sheils
Introducción
En años recientes numerosos estudios han descrito técnicas
”híbridas” que acoplan la PCR con la hibridación in situ
(Herrington y cols., 1992; Haase y cols., 1990; Bagasra y
cols., 1992, 1993, 1994; Boshoff y cols., 1995; O’Leary
y cols., 1994a, 1994b, 1995, 1996, 1998). Las técnicas no
fueron aceptadas al principio por problemas tecnológicos
encontrados durante la amplificación de la secuencia de-
seada del ácido nucleico.
Las tecnologías de amplificación in situ se han exten-
dido para incluir un número de modificaciones de la téc-
nica inicialmente descrita de la PCR in situ, para incluir
PRINS (marcaje cebado in situ), PRINS cíclico, PCR
del PNA in situ (PCR del ácido péptido nucleico), PCR del
PNA in situ, inmuno-PCR in situ, PCR TaqMan in situ y
la amplificación específica de alelo. Otras tecnologías de
amplificación en la célula, como la amplificación base del
ácido nucleico (NASBA), pueden también utilizarse. Éstas
emplean tecnología de RNA polimerasas T3 y T7 y son
metodologías isotérmicas de replicación para la amplifica-
ción del RNA en las células y cortes del tejido.
Visión general de la metodología
Todas las técnicas de PCR en la célula intentan crear amplico-
nes de DNA/cDNA de doble cadena o de una cadena dentro
de la célula, que se pueden detectar directamente o después de
un paso de hibridación in situ (IS). Debe alcanzarse un equili-
brio fino entre la digestión adecuada de las proteínas celulares
(que permite el acceso de los reactivos de amplificación) y
el mantenimiento de la localización del producto amplifica-
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
do dentro del compartimiento celular y la preservación de la
morfología tisular/celular.
Los cambios térmicos cíclicos específicos suceden en el
nivel individual celular, parecido a lo que ocurre en la fase
de solución de la PCR. El primer paso implica la desnatura-
lización del DNA de doble cadena (dsDNA) a la forma de
una sola cadena (ssDNA), si se está amplificando un DNA
definido. Para la amplificación específica de RNA, la plan-
tilla del RNA ya es de una sola cadena y la transcripción
reversa se lleva a cabo para crear una plantilla del cDNA.
Segundo, los iniciadores se unen flanqueando los ex-
tremos de la secuencia objetivo deseada y una enzima ter-
moestable (DNA polimerasa Taq o fragmento Klenow) se
utiliza para extender o para ligar, usando la DNA ligasa,
una reacción en cadena in situ de la ligasa (IS-LCR), los
iniciadores correctamente colocados. Las Taq polimera-
sas específicas ahora se diseñan para el uso en los análisis
de la PCR en la célula, incluyendo la polimerasa IS-Taq,
que tiene una concentración más alta y una mayor unidad
de actividad de polimerasa. Las rondas subsecuentes del
termociclado aumentan el número de copias de la secuen-
cia blanco, en una reacción de amplificación de ácido nu-
cleico. Un aumento exponencial en la cantidad de producto
amplificado nunca se logra en las reacciones de amplifi-
cación en la célula, por la amplificación lineal que ocu-
rre en la mayor parte de las situaciones. Esto ocurre por
la ineficacia relativa de las técnicas, debido a los proble-
mas de accesibilidad de los reactivos de amplificación para
la secuencia deseada del ácido nucleico y a lo compacto
del compartimiento nuclear celular (conteniendo dsDNA
ssDNA pre-mRNA y las proteínas histonas).
Una vez que se crea el amplicón (conjunto de fragmen-
tos amplificados), la detección debe llevarse a cabo. Si se
506 CAP. 52 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA EN LA CÉLULA
utiliza un iniciador o nucleótido marcado, entonces el am-
plicón es marcado y puede demostrarse directamente por
técnicas inmunocitoquímicas. Por lo general, sin embargo,
el nucleótido marcado y el iniciador marcado directamente
se han abandonado en gran parte, debido a la generación no
específica de la señal y a la incorporación no específica del
marcador dentro del amplicón de la PCR.
Una alternativa es un paso de hibridación IS (usando
una oligosonda de cadena sencilla o una sonda genómica
de doble cadena) que se lleva a cabo después de la amplifi-
cación, apegándose a las reglas generales de la hibridación
IS estándar y aplicando las condiciones de lavado astrin-
gente después de la hibridación.
Tecnologías de PCR celular: definiciones
Varias técnicas (figs. 52-1 y 52-2) se han descrito en la lite-
ratura, incluyendo las siguientes:
Figura 52-2 Hibridación in situ y detección PCR-IS del HPV
en una biopsia cervical. a) IS, detección inmunocitoquímica de
un solo paso, sensibilidad 20 a 30 genomas/células. b) IS,
detección de tres pasos, sensibilidad 10 a 20 genomas/célula.
c) PCR-IS con la detección de tres pasos, sensibilidad 1 ge-
noma/célula.
• PCR in situ del DNA (IS-PCR). Amplificación por PCR
de las secuencias del DNA celular en las muestras de
tejido usando un nucleótido marcado (p. ej., dUTP)
dentro de la mezcla de la reacción de PCR. El producto
marcado se identifica, usando técnicas estándar de de-
tección tal y como en la hibridación in situ convencional
o en la inmunocitoquímica. No se recomienda el uso de
esta tecnología.
• Iniciador marcado manejado en la amplificación in situ
(LPDISA). Amplificación de las secuencias de DNA
usando un iniciador marcado dentro de la mezcla de la
reacción PCR. El producto marcado entonces se detecta
tal y como en la IS-PCR del DNA. No se recomienda el
uso de esta tecnología.
• Hibridación in situ PCR (PCR-IS). Amplificación por
PCR de las secuencias celulares del DNA en las mues-
tras de tejido, seguida por la detección con hibridación
in situ del producto amplificado, usando una sonda in-
Figura 52-1 Representación esquemática de la PCR
en célula, indicando los pasos críticos implicados en
el proceso desde la adhesión de la célula/tejido al
permeabilizado y fijación para la amplificación PCR
hasta la detección del amplicón.
 TECNOLOGÍAS DE PCR CELULAR: DEFINICIONES
terna marcada o genómica. Los marcadores utilizados
pueden ser isotópicos (p. ej., 32P, 35S) o no isotópicos (p.
ej., biotina, digoxigenina, fluoresceína).
• PCR transcriptasa reversa in situ (RT in situ PCR). Es la
amplificación de las secuencias del mRNA en las mues-
tras de células y tejidos, creando primero una plantilla de
DNA copia (cDNA) usando la transcriptasa reversa (RT)
y entonces se amplifica la plantilla de DNA recién creada
tal y como en la IS-PCR del DNA. Esta técnica de nuevo
tiene problemas inherentes con la incorporación no espe-
cífica del marcador, y no debería utilizarse para el análisis
de las plantillas de RNA en las células y cortes de tejido.
• PCR transcriptasa reversa hibridación in situ (RT PCR-
IS): Es la amplificación de las secuencias del RNA en
las muestra de células y tejidos creando una plantilla de
cDNA con la transcriptasa reversa (RT). El cDNA, crea-
do entonces se amplifica y el amplicón se hibrida con un
oligonucleótido interno, como en la PCR-IS (fig. 52-3).
• PRINS (amplificación in situ) y PRINS cíclica. Es la
amplificación de secuencias genéticas específicas en ex-
tensiones del cromosoma en metafase o núcleos interfá-
sicos, usando un iniciador para generar un producto de
una sola cadena de la PCR. Si muchos ciclos de ampli-
ficación se utilizan, entonces la técnica se llama PRINS
cíclica (Gosden y cols., 1991).
• PCR del PNA in situ (IS-PNA-PCR) y PCR-PNA-IS. IS-
PNA-PCR se refiere a la amplificación de los DNA blanco
Figura 52-3 Detección por PCR-IS RT del receptor 2 de la dopa-
mina (DRD 2) en las células epiteliales ováricas del hámster (trans-
fectantes) y análisis en gel y Southern blot del amplicón creado.
507
usando una molécula imitadora del DNA, el ácido péptido
nucleico (PNA). El PNA es una molécula simple, compues-
ta de unidades repetidas de N-(2-aminoetil)-glicina ligadas
por enlaces amida. Las bases purinas (A y G) y pirimidi-
nas (C y T) se unen a la columna vertebral por enlaces
carbonil metileno. El PNA cuando se utiliza como un inicia-
dor no es alargado por la DNA polimerasa Taq y, por tanto,
puede utilizarse en los ensayos de exclusión del iniciador,
que permite la discriminación de las mutaciones puntuales
y el haplotipo directo de la célula individual. La segunda
reacción, que emplea el PNA, es la PCR-PNA-IS; aquí,
una sonda de 15 a 20 nucleótidos de PNA se utiliza para el
paso de hibridación in situ después de la amplificación. Los
PNA tienen Tm más altas (temperaturas de fusión o mel-
ting) que las sondas oligo de DNA y las mutaciones pun-
tuales simples en un dúplex PNA-DNA bajan la Tm cerca de
15°C con respecto al dúplex correspondiente DNA-DNA
mal complementado (De-Mesmaeker y cols., 1995).
• PCR IS-TaqMan. Es la amplificación de las secuencias
de DNA usando un par de iniciadores convencionales
como en la PCR estándar. Sin embargo, una sonda Taq
Man interna se agrega a la mezcla de amplificación. Se
coloca una molécula fluorescente reportera (FAM, HEX,
etc.) en el extremo 5’ de la sonda y otra en el extremo 3’,
una molécula extintor o quencher (otra vez fluorescente,
normalmente TAMRA). Una vez que la sonda está en
línea e intacta, la proximidad de la molécula extintor
a la molécula reportera no permite ninguna fluorescen-
cia de la molécula reportera. Las DNA polimerasas Taq
poseen dos características importantes para la reacción:
a) desplazamiento de una hebra de la horquilla Y, que
permite que la DNA polimerasa Taq despegue una sola
hebra en la configuración Y; y b) actividad endonucleasa
5’-3’, que causa el corte del brazo de unión que une la
molécula reportera al extremo 5’ de la sonda TaqMan
(fig. 52-4), de tal modo que produce fluorescencia sólo
si ha ocurrido la amplificación específica (fig. 52-5)
(Lawyer y cols., 1989; Holland y cols., 1991).
• Amplificación específica del alelo in situ (IS-ASA). Esta
técnica utiliza el sistema de amplificación refractaria de
la mutación (ARMS) de PCR, que tiene la capacidad
de detectar polimorfismos puntuales en las secuencias
del DNA humano, usando pares de bases artificialmente
creadas y mal apareadas en el extremo 3’ de los inicia-
dores de la PCR. Si el polimorfismo se acopla al de la
secuencia del iniciador, la amplificación de esa secuen-
cia ocurrirá preferentemente.
• Inmuno-PCR in situ. Los inmunoensayos in situ no
permiten la detección de pocas moléculas blanco ac-
cesibles con la PCR in situ. La inmuno-PCR in situ es
una reacción en la cual el marcador de DNA se liga a
508 CAP. 52 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA EN LA CÉLULA
Figura 52-4 Análisis de la PCR TaqMan de tiempo casi real del
HHV 8 en una efusión de la línea celular BC-3 del linfoma. Ob-
serve la disminución de la fluorescencia después de 25 ciclos, de-
bido a la liberación de las sondas extintor y del reportero en el es-
pacio del volumen limitado del núcleo en la línea celular BC-3.
Figura 52-5 Análisis de la PCR RT del RET/PTC-1 en una línea celular inmortalizada humana de la tiroides. La transcripción quimérica
RET/PTC-1 se ve al máximo en la frontera luminal de la célula. a) Canal FITC que muestra transcritos; b) contratinción DAPI.
las moléculas blanco a través de un puente anticuerpo-
biotina-avidina y es amplificado por PCR in situ. Las
secuencias amplificadas de DNA se detectan in situ
por hibridación. Los autores afirman que la técnica
puede ser la única disponible para detectar cantidades
diminutas de macromoléculas biológicas tales como
proteínas, carbohidratos y lípidos en las células intac-
tas o en los cortes del tejido (Cao y cols., 2000).
Amplificación del DNA en la célula
Equipo
Existen varios instrumentos para realizar PCR en la célula,
comprendiendo desde un termociclador estándar (usando
modificaciones), de hornos termocíclicos y termociclado-
res específicamente diseñados (Applied Biosystems Gene
Amp in situ PCR system 1000; Hybaid Omnigene/Om-
nislide y el termociclador MJB para portaobjetos) pueden
usarse en la amplificación del DNA y RNA en la célula.
Si se emplea un termociclador estándar, entonces debe
crearse una cámara de amplificación para el portaobjetos.
Ésta puede hacerse de aluminio (un recipiente de papel
de aluminio). Este recipiente que contiene el portaobjetos
se coloca en el termociclador, se cubre con aceite mineral
y después se envuelve totalmente. Sin embargo, la opti-
mización de la conducción térmica nunca se alcanza en su
totalidad. El “lapso térmico”, es decir, las diferencias en
temperatura entre la cara del bloque, el portaobjetos de
cristal y la mezcla de reacción de la PCR en cada paso
de temperatura del ciclo de la reacción son frecuentes
(O’Leary y cols., 1994b). Este problema se supera con
el uso de máquinas de amplificación in situ con diseños
específicos que ofrecen curvas de calibración incorpora-
das de la temperatura del portaobjetos con mayor control
termodinámico.
Material inicial
En 1990, Haase y cols., describieron la PCR in situ en célu-
las sencillas fijas intactas, suspendidas en el amortiguador
de la reacción de la PCR. Después de la amplificación, las
células se centrifugaron sobre los portaobjetos de cristal y
el producto amplificado se detectó utilizando la hibrida-
ción in situ (Haase y cols., 1990). Al inicio algunos inves-
tigadores utilizaron pedazos de portaobjetos de cristal (con
las células de preparaciones citocentrifugadas) en tubos
Eppendorf estándares, incubados directamente en el amor-
tiguador de la reacción PCR (Spann y cols., 1991). Más
 AMPLIFICACIÓN DEL DNA EN LA CÉLULA
recientemente, se han utilizado técnicas que usan tejidos y
células unidas al portaobjetos del microscopio (Bobroski
y cols., 1995; Cheng y Nuovo, 1994).
Para IS-PCR, PCR-IS, IS-LCR, IS-PNA PCR e IS-Taq-
Man PCR, las células y los tejidos fijos, incluyendo el ma-
terial en parafina, se pueden utilizar para la amplificación.
Los mejores resultados se obtienen con células y tejidos
recién fijados, aunque se ha logrado la amplificación acer-
tada con material almacenado (hasta 40 años).
Las extensiones del cromosoma fijo en metafase y los
núcleos interfásicos se pueden utilizar para la detección de
regiones subcromosómicas específicas, usando PRINS y
PRINS cíclica (Gosden y cols., 1991). Para un citoesquele-
to celular rígido debe crearse en un microambiente adecua-
do que permita el acceso de los reactivos de amplificación
con fuga mínima del producto amplificado. Los resultados
satisfactorios se obtienen con los tejidos fijados en 1 a 4%
de paraformaldehído, el formaldehído amortiguado neutral
(NBF) y 10% formalina (12 a 24 h para biopsia/tejido sóli-
do; 10 a 30 min para las preparaciones citológicas) (Nuovo
y cols., 1993; O’Leary y cols., 1994b). Resultados menos
constantes se obtienen con tejidos fijados en etanol y ácido
acético (Nuovo y cols., 1993).
La fijación celular con fijadores de formaldehído tiene
considerables desventajas. Los grupos aldehído reaccionan
con el DNA y las proteínas de las histonas para formar entre-
cruzamientos DNA-DNA y proteína DNA-histona. La fija-
ción del formaldehído también “corta” la plantilla del DNA
(rompimientos aleatorios en el dsDNA), la cual puede no
concluir el inicio (es decir, los extremos no se traslapan).
Estos cortes pueden actuar después como sitios potenciales
de cebado para la DNA polimerasa Taq, conduciendo a la
incorporación y elongación de los nucleótidos marcados y
no marcados (es decir, dATP, etc.) análogo a la marcación in
situ del extremo terminal del DNA en la apoptosis. Este pro-
ceso ocurre a temperatura ambiente y conduce a resultados
falsos con la IS-PCR del DNA. Ésta es la razón predominan-
te por la que la PCR del DNA y del RNA en la célula (sin un
paso de hibridación) se ha abandonado en gran parte.
Puesto que los ciclos repetidos de calentamiento y enfria-
miento se utilizan durante la amplificación in situ, las células
y los tejidos deben unirse adecuadamente a un soporte sólido
(normalmente cristal), de modo que no ocurra la separación.
Los portaobjetos de cristal se tratan previamente con agen-
tes de recubrimiento para asegurar la adhesión máxima de
la sección; los más utilizados son aminopropil-trietoxisilano
(APES), solución de Denhardt y el pegamento de Elmer.
Permeabilización celular y tisular
Las células deben digerirse y permeabilizarse adecua-
damente para facilitar el acceso de los reactivos. Esto se
509
puede alcanzar por el tratamiento con proteinasa (p. ej.,
proteinasa K, pepsina o tripsina) o hidrólisis ligera ácida, o
ambas (0.01 a 0.1 N HCl). Los tiempos de digestión y las
concentraciones máximas de proteasa tienen que optimi-
zarse debidamente para cada preparación tejido/citológica
utilizada.
Los tiempos largos de digestión comprometen inevitable-
mente la morfología celular. Los tiempos de digestión cortos
producen la disociación incompleta de los entrecruzamien-
tos proteína histona-DNA, que pueden obstaculizar en última
instancia el avance de la DNA polimerasa Taq a lo largo de
plantillas nativas del DNA. La hidrólisis ácida actúa, proba-
blemente, llevando a tales entrecruzamientos a la disociación
completa. Alternativamente, la irradiación de microondas de
las células y los cortes de tejido pueden utilizarse para ex-
poner las plantillas del ácido nucleico. Los pulsos cortos de
irradiación de microondas (con o sin proteólisis) usando un
amortiguador de citrato, análogo a la recuperación del antí-
geno de la inmunohistoquímica, permiten el acceso de los
reactivos de amplificación a la secuencia objetivo deseada y,
además, facilitan la posamplificación inmunohistoquímica.
Después de esto (si se utiliza un método de marcación no
isotópico), un paso de bloqueo debe emplearse, dependiendo
del método que se utilice para la detección después de la am-
plificación del producto, por ejemplo, sistemas de detección
con peroxidasa o fosfatasa alcalina. En el primero, la peroxi-
dasa endógena se extingue por la incubación en una solución
de 3% H2O2 con azida de sodio, mientras el ácido acético
glacial al 20% bloquea la fosfatasa alcalina intestinal.
Protocolos de la amplificación del DNA
Una amplificación acertada se logra con: a) la optimización
cuidadosa de los parámetros cíclicos; b) el diseño apropia-
do de los pares de iniciadores (tomando en cuenta su Tm, es
decir, la temperatura de fusión específica, su capacidad para
formar dímeros del iniciador y estructuras que se pliegan so-
bre sí mismas), y c) la optimización de las concentraciones de
Mg2+ necesarias para conducir la reacción de amplificación.
Debido al secuestro de reactivo (véase adelante), concen-
traciones más altas de los reactivos de amplificación se re-
quieren durante la amplificación in situ que para las técnicas
convencionales solución-fase, incluyendo los iniciadores,
los dNTP y Mg2+. Las concentraciones de Mg, en particu-
lar, tienen que optimizarse cuidadosamente, con la amplifi-
cación satisfactoria en la mayor parte de las aplicaciones a
2.5 a 5.5 mM. Los volúmenes del reactivo de amplificación
normal varían dependiendo del área de superficie de la pre-
paración celular/sección de tejido que se emplee. Esto es
importante, ya que la amplificación desigual puede ocurrir
sobre la superficie del portaobjetos debido a las variaciones
del volumen consiguientes al fracaso de la amplificación lo-
510 CAP. 52 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA EN LA CÉLULA
calizada. Cuando se usa el sistema Gene Amp in situ PCR
1000, se utilizan volúmenes de 25 a 50 µl.
La desnaturalización inicial del DNA puede alcanzar-
se antes de la amplificación, ya sea durante la permeabi-
lización celular o después del proceso de fijación. Como
alternativa, puede realizarse al principio del protocolo de
amplificación mismo. La desnaturalización se alcanza
usando calor, calor/formamida o álcali (Bagasra y cols.,
1994). Además, la mayoría de los investigadores aboga por
el uso del “Hot Start” de la PCR (inicio de los ciclos de
PCR a alta temperatura) para reducir el cebado incorrecto y
la oligomerización del iniciador y Nuovo (1994) sugiere la
adición de la proteína de unión a la cadena sencilla (SSB)
derivada de E. coli. El modo exacto de la acción de esta
proteína es desconocido pero funciona en la replicación y
la reparación del DNA previniendo el cebado incorrecto
y la oligomerización del iniciador.
La optimización de los parámetros cíclicos debe realizarse
en cada ensayo particular. La mayor parte de los protocolos
emplea 25 a 30 rondas de amplificación, excepcionalmente
llega a los 50 ciclos. Algunos investigadores realizan dos
rondas sucesivas de 30 ciclos con la adición de reactivos nue-
vos, incluyendo a los iniciadores y la DNA polimerasa entre
cada ronda; una modificación de esto es la PCR “nested o
nidada”, donde se agregan los iniciadores internos, “anida-
dos” dentro del amplicón producido durante la primera ron-
da. Sin embargo, esto no se recomienda para uso rutinario.
La selección del iniciador ha evolucionado a partir de
dos estrategias básicas: un par del iniciador o múltiples
combinaciones de par del iniciador, con o sin colas comple-
mentarias. Los pares múltiples del iniciador se diseñan para
generar productos que abarcan más e incluso se pueden
traslapar, con la ventaja obvia de la localización de los am-
plicones y de la difusión mínima del producto. Sin embar-
go, si el PCR-hot start se emplea, el par único de iniciadores
es suficiente para asegurar la amplificación acertada.
Astringencia del lavado, posamplificación
y fijación del amplicón
La posfijación con 4% de paraformaldehído o etanol, o
ambos, puede emplearse para mantener la localización del
producto amplificado. Si uno está realizando PCR-IS, un
oligonucleótido o una sonda genómica se aplica en esta eta-
pa. Sólo se alcanza la especificidad máxima usando sondas
que hibridan las secuencias internas del producto ampli-
ficado. Las sondas genómicas no se restringen a estas se-
cuencias y parecen proporcionar resultados comparables.
Después de la amplificación in situ, la mayor parte de los
protocolos incluyen un paso de lavado posamplificación,
usando cloruro de sodio, citrato de sodio (SSC), formamida
y variando las temperaturas de lavado, para eliminar el pro-
ducto extracelular difundido, que puede permitir la tinción
no específica y la generación de resultados positivos falsos.
La “astringencia” del lavado se define por el conjunto de
condiciones empleadas (es decir, concentración del SSC,
del porcentaje de formamida utilizado y la temperatura del
lavado). El investigador intenta alcanzar unas “condicio-
nes” del lavado donde el cociente señal: el ruido de fondo
es máximo; sin embargo, las condiciones de astringencia
del lavado poshibridación se derivan empíricamente.
Detección de los amplicones
Los marcadores no isotópicos (p. ej., biotina, digoxigenina,
fluoresceína) son muy utilizados, y cuando se emplean junto
con la técnica de detección inmunohistoquímica “sándwich”,
parecen aportar grados similares de sensibilidad de detec-
ción a la de los marcadores isotópicos. Éstos pueden variar
en sistemas de detección de un solo paso hasta los de cinco
pasos, en cuanto a la inmunohistoquímica convencional. El
producto se visualiza finalmente por una reacción de color
(p. ej., cromógenos NBT/BCIP o AEC) o por fluorescencia.
Nuovo ha descrito en el funcionamiento de la inmuno-
histoquímica convencional posamplificación que la ventaja
obvia es la colocalización del producto con la célula de
interés, por ejemplo, la célula endotelial o el macrófago.
Sin embargo, los intentos para reproducir esto por varios
grupos, incluyendo los propios autores, han sido decepcio-
nantes y es probable que la mayor parte de los epítopos no
resistan completar un ciclo térmico repetitivo.
Reacción de amplificación, controles
y detección en el tejido para uso en
ensayos de PCR DNA en la célula
La PCR paralela en fase líquida debe incluir los siguientes
controles: la omisión de iniciadores y/o DNA polimerasa
Taq, iniciadores y/o sondas inaplicables, los controles ne-
gativos conocidos y genes de control de referencia. El nú-
mero de los controles realizados depende de la cantidad de
tejido/células disponibles para la reacción.
Los controles siguientes se requieren en PCR-IS: a) el
gen de control de referencia de la PCR-IS, por ejemplo,
␤-globina, ␤-actina, etc.; b) la digestión con la DNasa de
los tejidos/células blanco; c) la digestión con RNasa de los
tejidos/células blanco; d) iniciadores con la sonda control;
e) iniciadores control con la sonda objetivo; f) iniciadores
control con la sonda control; g) iniciadores del gen de con-
trol de referencia con la sonda blanco; h) sólo un inicia-
dor blanco (PCR en la célula asimétrica); i) sólo dos ini-
ciadores blanco; j) sin Taq polimerasa; k) sin iniciadores;
 PROBLEMAS DE LA AMPLIFICACIÓN POR PCR EN LA CÉLULA
l) omitir el paso de la transcriptasa reversa en RT IS-PCR
o RT PCR-IS; m) controles de la hibridación in situ para
PCR-IS y RT PCR-IS, y n) controles de detección para los
sistemas inmunohistoquímicos de detección.
Los genes de control de referencia, incluyendo el uso de
una copia del gen mamífero, como PDH, son importantes
para valorar el grado de amplificación en la preparación de
la sección de tejido/sección de la célula. Al amplificar los
DNA blanco, la adición de DNAasas debería suprimir la
señal. Si no ocurre esto, la señal pudo haber resultado de
la amplificación falsa, o puede representar alternativamen-
te cualquier RNA/cDNA. El pretratamiento con RNAasa
es obligatorio en la valoración de los RNA blanco (PCR
transcriptasa reversa [RT] in situ) y debe incluirse en la
amplificación de las plantillas del DNA para minimizar las
señales positivas falsas que se originan del RNA celular.
Nuestro grupo ha encontrado que la combinación de RNA-
asa A y T1 proporciona resultados superiores.
El uso de un par de iniciadores del gen de control de
referencia junto con la sonda específica blanco valora el
grado de “capacidad de pegado” de la secuencia de la son-
da blanco y de la creación de un resultado positivo falso.
La adición de un iniciador en la mezcla de amplificación
genera una “PCR asimétrica”, con una reducción cuantita-
tiva en la cantidad de producto sintetizado. Los iniciadores
inaplicables con la sonda inaplicable no deben generar una
señal. La especificidad del componente de hibridación in
situ de la PCR-IS se valora empleando una sonda inaplica-
ble con iniciadores blanco específicos.
El papel de la dimerización iniciador-iniciador y la oli-
gomerización del iniciador en la generación de señales po-
sitivas falsas se valora excluyendo la DNA polimerasa Taq,
mientras la contribución de la elongación no específica del
DNA fragmentado en cortes de tejido se examina con la
exclusión de los iniciadores. Lo último es un control extre-
madamente importante para IS-PCR.
En la valoración de la RT-IS PCR, la omisión del paso de
la transcriptasa reversa es importante. Como en la hibrida-
ción in situ de rutina, los controles de hibridación y los con-
troles de detección son esenciales para excluir los resultados
falsos positivo/negativo debido a la falla del paso de IS o a la
tinción aberrante de los tejidos por el sistema de detección.
Amplificación del RNA en la célula
Preparación de las células y del tejido
Las técnicas que se diseñan específicamente para la ampli-
ficación de los RNA blanco son RT IS-PCR y RT PCR-IS.
En general, los RNA blanco son más fáciles de amplifi-
car que los DNA blanco, por el número elevado de copias
de inicio del blanco. Una vez que las células o los tejidos
511
se remueven del cuerpo, la degradación del RNA comienza
casi de manera instantánea. Las RNasas se encuentran pre-
sentes en el ambiente, los dedos, los guantes y en las áreas
superiores tipo terrazas; sólo por mencionar algunas de sus
muchas fuentes. Las soluciones del fijador contienen RNasas
específicas que degradan el RNA, y el tejido en proceso, otra
vez contaminado por RNasas, minimiza la cantidad de RNA
blanco que puede amplificarse.
Debe crearse un ambiente libre de RNasa al iniciar la prepa-
ración. Para la preservación óptima del RNA en los cortes del
tejido, la fijación inmediata en soluciones libres de RNasa debe
llevarse a cabo. Deben utilizarse alcohol, ácido acético:alcohol
y fijadores con formaldehído amortiguado neutro preparados
en agua esterilizada tratada con DEPC (dietilpirocarbonato).
Todos los protocolos para detectar el ácido nucleico deben em-
plear otra vez, en lo posible, las condiciones libres de RNasa.
Metodología y química de la amplificación
Al iniciar, se crea una plantilla de cDNA usando una enzima
transcriptasa reversa, por lo general se utiliza la enzima trans-
criptasa reversa del virus de la leucemia del ratón Moloney
(MMLV), seguido por la amplificación de la plantilla recién
sintetizada del cDNA. Un paso de hibridación in situ posam-
plificación puede emplearse (RT PCR-IS), en cuanto a la DNA
PCR-IS. Estas técnicas emplean dos pasos, es decir, la trans-
cripción reversa y después la amplificación. El grupo de traba-
jo del autor ha descrito una metodología de un paso usando la
enzima rTth DNA polimerasa que evita la necesidad de dividir
la reacción. La rTth polimerasa posee actividad tanto de trans-
criptasa inversa como de DNA polimerasa.
Controles para la amplificación in situ del RNA
Son los mismos controles que se utilizan en la amplificación in
situ del DNA. La omisión del paso de la transcriptasa inversa
rinde, obviamente, un resultado débil o negativo. La digestión
con DNAasa paralela debe llevarse a cabo en todos los ensayos
del RNA en la célula, en particular en la etapa de optimiza-
ción.
Problemas de la amplificación
por PCR en la célula
Muchos grupos han encontrado problemas con la PCR in situ
(O’Leary y cols., 1995, 1996a, 1996b; Teo y Shannak, 1995).
Los factores importantes incluyen la naturaleza del material de
inicio, condiciones de la fijación y la naturaleza conformacio-
nal del blanco que se va a amplificar. La PCR del DNA en la
célula in situ está llena de dificultades, especialmente con
512 CAP. 52 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA EN LA CÉLULA
el material embebido en parafina, donde la incorporación
no específica de secuencias del nucleótido puede ocurrir en
presencia de la DNA polimerasa Taq, y es opinión del autor
que esta tecnología no debe utilizarse.
La PCR-IS parece más específica, en especial si se
emplea una modificación tipo “Hot Start” o, de manera al-
ternativa, si se utilizan diferentes pares del iniciador simul-
táneamente. Los protocolos de la PCR-IS, en general, son
más sensibles pero, en contraste con la PCR en solución, es
menos eficiente, sólo con la evidente amplificación lineal. El
grado de amplificación es difícil de valorar. Nuovo y cols.
(1991, 1992, 1993, 1994, 1995) reportan un aumento de 200
a 300 veces en el producto, en contraste con Embretson y co-
legas (1993), que estiman sólo un aumento de 10 a 30 veces.
La experiencia del autor tiende a apoyar al segundo autor.
La limitación principal con la DNA IS-PCR, como se
menciona antes, es la incorporación no específica de nucleó-
tidos por medio de la DNA Taq polimerasa en sitios del DNA
fragmentado. Ésta es ciclo-dependiente y DNA polimerasa-
dependiente y puede ocurrir en ausencia de iniciadores y/o
con una modificación del tipo ”Hot Start”. Por tanto, el uso
rutinario de la PCR in situ del DNA no es aún factible, debi-
do al riesgo de generar señales falsas. Gosden y cols. (1991)
reportan en trabajos previos con cromosomas el uso de méto-
dos para unir la cadena de DNA, para eliminar la incorpora-
ción falsa durante la PCR in situ del DNA. El pretratamiento
con dideoxi de obstrucción también se ha documentado para
eliminar la incorporación no específica, pero éste no es siem-
pre acertado. Nuestro grupo ha utilizado la “superdesnatura-
lización” de la hebra, es decir, donde el dsDNA se desnatu-
raliza a temperaturas altas. El DNA entonces se mantiene en
un estado desnaturalizado por un periodo extendido (5 a 10
min) pero, otra vez, esto produce resultados inconstantes.
Secuestro de reactivos en el procedimiento
Concentraciones elevadas de reactivos se requieren para que
se logre la amplificación acertada (del orden de 2 a 5 veces).
Esto se debe al secuestro de reactivo, ya que los reactivos
se adhieren a los cubreobjetos o a los materiales de recu-
brimiento utilizados. Además, los reactivos pueden también
intercalarse con residuos del fijador que permanecen en los
tejidos. El pretratamiento de los portaobjetos con 0.1 a 1% de
albúmina sérica bovina (BSA) permite una reducción en la
concentración del reactivo, que puede funcionar al bloquear
este secuestro (O’Leary y cols., 1995).
Difusión y contradifusión del amplicón
La difusión del producto de amplificación (amplicón) desde
el sitio de la síntesis, que puede ocurrir como un resultado
del permeabilizado o el corte y exposición del citoplasma
y núcleo de la célula, o ambos, se encuentra en ensayos
de la PCR en la célula. Un acercamiento se logra al re-
ducir el número de ciclos. Otra estrategia que se emplea
con frecuencia es fijar de manera posterior los portaobjetos
en etanol o paraformaldehído, para ayudar a mantener la
localización del producto amplificado. Los acercamientos
alternativos incluyen la fijación de la sección del tejido con
agarosa o la incorporación de nucleótidos biotina sustitui-
dos, o ambos (análogos a PCR in situ). Esta última modifi-
cación permite la generación de productos más evidentes,
menos probables de difundir.
Amplificación desigual/amplificación incompleta
En la amplificación desigual es frecuente que se localice
30 a 80% de células que contienen la secuencia blanco de
interés tiñéndose en cualquier momento. Hay muchas ra-
zones para esto, incluyendo la digestión no uniforme con
variaciones en la permeabilidad de la célula, que falla para
disociar por completo los entrecruzamientos DNA-proteí-
na histona, y el corte de la célula. Este último factor es una
consecuencia inevitable del corte por micrótomo donde se
crean “semiesferas” de la célula. Como resultado, el con-
tenido nuclear se expone, dando lugar a dos posibilidades:
a) la secuencia blanco deseada puede no estar presente; b)
la secuencia blanco puede estar presente pero el producto
pudo haber difundido hacia fuera.
Cuadro 52-1 Usos en la célula de las tecnologías de PCR
en patología celular
Virus DNA y RNA
HIV 1, 2
HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, etc.
HBV, HCV
CMV
Sarampión
HHV 6, 7 y 8
DNA del HSV
LGV (linfogranuloma venéreo)
Oncogenes, genes supresores de tumor y marcadores de
malignidad
Mutaciones p53
Mutaciones ras (H-Ki, N-ras)
Rearreglos de gen (t11; 22, t11; 14)
Mapeo del cromosoma (PRINS y PRINS que completan un
ciclo)
Rearreglos del receptor de la célula T
Metaloproteinasas y sus inhibidores
Expresión del factor EGF
Óxido nítrico sintasa
 TRABAJO FUTURO CON LOS ENSAYOS BASADOS EN LA PCR EN LA CÉLULA
Trabajo futuro con los ensayos
basados en la PCR en la célula
Los desarrollos recientes de la PCR TaqMan en la célula
permiten que los investigadores cuantifiquen directo las
transcripciones dentro de las muestras de células y tejidos.
La capacidad de utilizar sistemas de detección a dos colo-
res permite la identificación simultánea de un gen house-
keeping y de un gen problema.
La PCR TaqMan celular muestra la cinética clásica de
la sonda TaqMan, con quenching o extinción de la fluores-
cencia visible después de determinado número de ciclos.
Esto se debe al espacio de volumen limitado del citoplas-
ma/núcleo y a la proximidad de las secuencias de las son-
das extintor y del reportero en exceso molar en el “estado
libre”, que sigue a la hidrólisis de la sonda.
El descubrimiento de la PCR TaqMan en la célula debe,
en teoría, hacer posible que se introduzcan matrices de
TaqMan para el análisis cuantitativo directo. Esto ofrece una
mayor ventaja sobre las plataformas de la matriz de hibri-
dación del SNP y del cDNA convencionales, y permite, por
primera vez, la cuantificación de los genes de loci genéticos
múltiples simultáneamente. El cuadro 52-1 lista el uso actual
de los análisis de la célula con PCR en la patología celular.
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 53
Análisis de SNP de alta densidad y de arreglos de cDNA
Orla Sheils, Cara M Martin, Paul Smyth, Jon Sherlock, Stephen Finn,
Esther O’Regan, Steve Picton y John O’Leary
Introducción
Cincuenta años después del descubrimiento de la doble hé-
lice del DNA, la secuencia de referencia para el Homo sa-
piens fue presentada (Venter y cols., 2001; Lander y cols.,
2001; Consorcio IHGS, 2001). El esfuerzo internacional
de secuenciar 3 mil millones de letras de DNA dentro el
genoma humano ha llevado a una apasionante nueva era
genómica. Los microarreglos de DNA aportan un adjunto
importante en la explotación de un territorio genómico des-
conocido, en particular en el área de la expresión del gen.
Existe una amplia creencia en que los millares de genes
y sus productos (es decir RNA y proteínas) en un organis-
mo viviente dado funcionan de una manera complicada y
orquestada, razonamiento que aloja el potencial para una
variedad de modalidades diagnósticas y terapéuticas. Los
métodos tradicionales en la biología molecular trabajan por
lo general sobre la base de “un gen dentro de un experimen-
to”, lo que significa que el rendimiento del procesamiento
es muy limitado y el “cuadro completo” de la función del
gen es difícil obtenerlo.
En los últimos años, una nueva tecnología, llamada mi-
croarreglo de DNA, ha cautivado el interés creciente entre
los biólogos. Esta tecnología abarca ensayos que generan
simultáneamente datos pertenecientes a los niveles de ex-
presión de muchos miles de genes. Esta facilidad represen-
ta un aumento enorme en el rendimiento del procesamiento
(Elkins y Chu, 1999; Lockhart y Winzeler, 2000; Schena y
cols., 1995).
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
Un ordenamiento es un arreglo de muestras. Provee un
medio para el emparejamiento de muestras conocidas y des-
conocidas de DNA, de acuerdo a reglas de apareamiento de
bases, y para la automatización del proceso en la identifica-
ción de las muestras desconocidas. Microarreglos de DNA,
o chips de DNA, se fabrican con robótica de alta velocidad,
sobre un microarreglo/sustrato sólido, para lo cual se utili-
zan sondas con identidad conocida para determinar la unión
complementaria, y para permitir masivamente los estudios
en paralelo de la expresión y descubrimiento del gen. Las
dimensiones espaciales de una muestra típica en microarre-
glos son menores a 200 µm de diámetro, y contienen nor-
malmente miles de espacios.
El mercado de los microarreglos ha crecido con rapidez
alarmante en los últimos años. Como el precio de esta tec-
nología ha declinado, se presenta una tendencia a cambiar
opciones caseras de Hágalo Usted Mismo (por sus siglas
en inglés DIY) por la gama creciente de dispositivos co-
merciales actuales disponibles.
Tecnología Affymetrix GeneChip
Se sintetizan matrices de oligonucleótidos de Affymetrix
usando un proceso que combina la fotolitografía y una quími-
ca combinatoria (Pease y cols., 1994). Las matrices se com-
ponen de un fragmento de cuarzo, que se hidroxila de manera
natural. Un grupo de máscaras fotolitográficas se manufactura
permitiendo la adición secuencial de nucleótidos específicos
516 CAP. 53 ANÁLISIS DE SNP DE ALTA DENSIDAD Y DE ARREGLOS DE cDNA

pos de sondas se localizan dentro de 600 bp de secuencia as-

Luz
(desprotección)
Máscara
Agua
25-mer
Repetir
GeneChip®
Microarreglo
Figura 53-1 Affymetrix utiliza una combinación de fotolitogra-
fía y de química combinatoria para fabricar microarreglos Gene-
Chip. Imagen suministrada por cortesía de Affymetrix©.
para ubicaciones particulares sobre el chip. Cuando la luz
ultravioleta se dirige sobre la máscara en el primer paso de la
síntesis, los grupos de enlace expuestos se desprotegen y es-
tán disponibles para el acoplamiento nucleotídico. La única
solución tipo nucleótido es entonces lavada sobre la superfi-
cie del fragmento de cuarzo y se une a los grupos de enlace
activados. En el siguiente paso, otra máscara se coloca sobre
el fragmento de cuarzo para otra ronda de desprotección y
acoplamiento. El proceso se repite secuencialmente hasta que
las sondas alcanzan su longitud completa, como se ilustra
en la figura 53-1.
Los genes individuales se representan sobre el GeneChip
usando una serie (típicamente 11-20) de oligonucleótidos
25-mer diferentes con “apareamiento perfecto”. El grupo
HG-U133 contiene 11 pares de sondas por grupo. Los gru-
cendente desde el sitio poli-A, pues esta porción del mRNA
se convierte más eficazmente dentro del blanco marcado.
Se seleccionan las sondas con base en su complementarie-
dad con el gen seleccionado o con la marca de secuencia
expresada (EST), individualidad (singularidad específica)
relativa con otros genes relacionados y sus características
de hibridación previstas. Para cada grupo de sondas oli-
gonucleótidas con apareamiento perfecto (PM), un grupo
pareado de sondas con apareamiento incorrecto (MM) está
también presente sobre el microarreglo. La secuencia oligo-
nucleótida que se emplea para las sondas MM es idéntica a
la de la sonda PM pero con una sola sustitución nucleotídica
en la posición central. La señal de hibridación específica se
determina restando la señal de la fluorescencia de las sondas
MM menos la de la fluorescencia de las sondas PM, y se
promedia sobre todos los pares de sondas que representan
un gen particular. Esta señal de la fluorescencia promedio
es una medida de la cantidad de transcripción.
El algoritmo de detección del software Affymetrix usa
intensidades del par sonda para generar un valor p de la
detección y determinar un actual/ausente para cada gen
individual. Cada par sonda en un grupo de sonda tiene
un valor de discriminación, que se calcula para cada par
sonda y se compara a un umbral predefinido, Tau. El va-
lor de discriminación es una propiedad básica de un par
sonda que describe su capacidad para detectar su blanco
previsto. Mide la diferencia de la intensidad específica del
blanco del par sonda (PM-MM) relativa a su intensidad de
hibridación total. Los pares sonda con valores más altos
que Tau optan por la presencia de transcripción. Los pares
sonda con valores más bajos que Tau optan por la ausencia
de transcripción. Un valor p también se genera cuando se
refleja la confianza en la llamada detección. Esta estrate-

cRNA marcado
RNA total cDNA con biotina
Transcripción Transcripción
inversa in vitro

GeneChip Fragmentación
Expresión
Microarreglo

cRNA
Hibridación fragmentado
marcado con biotina

Lavar y Escanear y
Figura 53-2 Diagrama esquemático del procedimiento para teñir cuantificar
el análisis de la expresión del gen usando GeneChips de Affy-
metrix. La imagen aparece por cortesía de Affymetrix©.
 SISTEMA DE EXPRESIÓN CON MICROARREGLO DE APPLIED BIOSYSTEMS
gia permite alta sensibilidad a concentraciones bajas del
blanco y preserva la capacidad para discriminar entre las
secuencias con relaciones muy estrechas.
En contraste con las matrices de cDNA, que utilizan una
aproximación por hibridación de dos colores en la cual el
blanco marcado y el control se hibridizan para el mismo
microarreglo, cada GeneChip de Affymetrix se diseña para
analizar una sola muestra de RNA (fig. 53-2). El mRNA se
convierte a cDNA de doble hebra mediante transcripción
inversa, usando un cebador oligo d(T) diseñado para con-
tener un sitio promotor T7 RNA. Los nucleótidos marca-
dos con biotina son incorporados directamente al blanco del
cRNA por transcripción in vitro con una T7 polimerasa.
El cRNA marcado se corta en fragmentos <200 bp y se hi-
bridiza para GeneChip. La señal fluorescente se obtiene des-
pués de teñir el GeneChip con estreptavidina-ficoeritrina.
Perfil de SNP y matrices de DNA
Las enfermedades genéticas complejas requieren muchos
miles de marcadores y centenares de muestras para pro-
porcionar suficiente poder para identificar regiones del ge-
noma y genes responsables de un fenotipo mensurable. Se
ha estimado que los polimorfismos de un solo nucleótido
(SNP) ocurren en promedio cada 1 000 bases en el genoma
humano. Estos polimorfismos tienen gran potencial para
utilizarse como marcadores genéticos en muchas aplica-
ciones, incluyendo ligamiento, asociación y pérdida de he-
terocigosidad en el cáncer.
La genotipificación por SNP actual implica el uso de
iniciadores específicos del sitio, una práctica que potencial-
mente aumenta el costo y limita el número de marcadores
del SNP que pueden ensayarse en un solo experimento. Sin
embargo, Affymetrix ha lanzado GeneChip® Mapping 10
K Array. Este sistema puede ensayar más de 10 000 SNP
en un solo experimento escalable que no se basa sobre la
PCR específica del sitio (Mei y cols., 2000; Sellick y cols.,
2003). La compañía propone lanzar una serie de dos se-
cuencias (Centurion) en un futuro próximo para analizar
más de 100 000 SNP por muestra, permitiendo estudios
completos de la asociación del genoma.
GeneChip® Mapping 10 K Array, y microarreglos subse-
cuentes de Centurion, confían en el ensayo del muestreo del
genoma completo (WGSA). Este esquema es una aproxi-
mación genérica para la reducción de la complejidad del
genoma completo y permitir la hibridación eficaz a un mi-
croarreglo que contiene más de 10 000 SNP (Cutler y cols.,
2001). El ensayo trabaja en cuatro pasos simples: digestión
por restricción del DNA genómico; unión de un adaptador
específico; amplificación con un cebador de PCR, y frag-
mentación del DNA, seguido por el marcaje y la hibridación
para el microarreglo (Kennedy y cols., 2003).
517
Para las matrices Centurion, la etapa de amplificación
por PCR usa la enzima Pfx para amplificar fragmentos de
500 a 2 000 bp reduciendo la complejidad del genoma a un
total cercano a 300 Mb. Esta reducción de la complejidad
permite la genotipificación exacta por hibridación del alelo
específico para más de 50 000 SNP en cada microarreglo,
con requerimientos de entrada del ensayo de sólo 250 ng de
DNA humano por microarreglo, o 500 ng por serie.
Sistema de expresión con microarreglo
de Applied Biosystems
El sistema de expresión con microarreglo de Applied Bio-
systems se basa en un diseño de microarreglo que repre-
senta el genoma humano completo, utiliza datos actuales
de transcripción y confía totalmente en anotaciones del gen
que han sido validadas por expertos en salud humana. Cada
sonda es parte de una base de datos correlativa que incluye
tanto la información de Celera Genomics como aquellas
del dominio público. Combinado con químicos quimio-
luminiscentes especialmente desarrollados, este sistema
completo aporta mayor sensibilidad de sonda y de detec-
ción que las generaciones anteriores de sistemas de mi-
croarreglo. Además, la información de la anotación para
todos los 31 097 genes humanos que se representan so-
bre el microarreglo se incluye en la base de datos Oracle®
que se proporciona con el sistema 1700. Los fabricantes
sugieren que el resultado sea un sistema completo capaz
del análisis rápido y exacto de los datos del microarreglo
para la investigación de la expresión génica. Los experi-
mentos “continuos” de microarreglos pueden lograrse por
unión con ensayos cuantitativos de PCR TaqMan® basados
en sondas para tiempo real, que permiten la validación de
datos del microarreglo, la cuantificación absoluta de la
producción de transcripción y la investigación de eventos
alternativos que se traslapan.
El sistema expresión con microarreglo de Applied Bio-
systems (figs. 53-3 a 53-6) consiste de un analizador (ana-
lizador quimioluminiscente 1700 de Applied Biosystems)
que puede registrar microarreglos bajo quimioluminiscen-
cia, para examinar y medir la expresión génica a niveles
muy bajos y en fluorescencia, para localizar características
puntuales del cuadriculado automático. Diseñado para in-
corporar una cámara fotográfica CCD avanzada, el sistema
1700 registra precisamente la señal quimioluminiscente
que se produce cuando las transcripciones marcadas se
hibridan para un microarreglo. Además, el sistema 1700
registra el microarreglo en un modo fluorescente y lo re-
presenta cuadriculado, normaliza e identifica característi-
cas con exactitud para localizarlas con precisión, incluso
en ausencia de productos con expresión génica que se unen
a sondas del microarreglo.
518 CAP. 53 ANÁLISIS DE SNP DE ALTA DENSIDAD Y DE ARREGLOS DE cDNA

Figura 53-3 Representación a color de la formación y

disposición del cuadriculado 1700 de Applied Biosystems.
䉱 ⫽ señales fluorescentes (usadas para el cuadriculado y la
cuantificación); ⵧ ⫽ control; ⫹ ⫽ sonda/blanco.

Figura 53-4 Área magnificada de un microarre-

glo 1700, mostrando la escala cuantitativa quimio-
luminiscente (flecha).

Figura 53-6 Microarreglos de Applied Biosystems sellados den-

Figura 53-5 Sistema Microarreglo 1700 de Applied Biosystems. tro de un contenedor de plástico desechable.
 ILUMINA, “MICROARREGLO DE ORDENAMIENTOS”
El sistema expresión con microarreglo de Applied
Biosystems utiliza los datos genómicos más recientes, combi-
nados con químicas sensibles de detección, para proporcionar
un análisis comprensivo de la expresión génica. Una variedad
de equipos complementarios está disponible e incluye:
• Equipo de etiquetas RT quimioluminiscentes, que con-
vierte el mRNA de las células en cDNA marcado con
digoxigenina.
• Equipo de etiquetas RT-IVT quimioluminiscentes, que
convierte el mRNA de las células en cRNA marcado con
digoxigenina, mientras entra el RNA simultáneamente y
amplificando linealmente. El cDNA o el cRNA marcado
con digoxigenina resultante se hibrida específicamente
para el microarreglo Applied Biosystems.
• Equipo de detección quimioluminiscente, que se utiliza
para visualizar las características que tiene el cDNA o el
cRNA marcado con digoxigenina acoplada a sondas nu-
cleotídicas. La visualización se logra incubando el mi-
croarreglo con un conjugado antidigoxigenina-fosfatasa
alcalina. La fosfatasa alcalina hidroliza un sustrato qui-
mioluminiscente y emite la luz a una longitud de onda
de ~ 458 nm. La intensidad de la señal es proporcional
al nivel del mRNA expresado en las células.
Los fabricantes afirman que las señales quimioluminiscen-
tes que se producen sobre el microarreglo proporcionan
una sensibilidad más alta y una mayor gama dinámica que
los microarreglos fluorescentes convencionales anteriores,
y además sugieren que puedan obtenerse datos de alta cali-
dad con el sistema expresión con microarreglo de Applied
Biosystems a partir de material inicial tan escaso como 100
ng del RNA total.
Los microarreglos para investigar el genoma humano
de Applied Biosystems se diseñan usando datos públicos
y de Celera para todos los genes conocidos (31 097). Es-
tos microarreglos contienen oligonucleótidos con un diá-
metro característico <180 µm y un espacio >45 µm (borde
a borde) entre cada característica. Los oligonucleótidos se
diseñan para evaluar transcripciones de cada gen del geno-
ma humano. Las sondas oligonucleotídicas se sintetizan en
Applied Biosystems y se diseñan para asegurar la especi-
ficidad máxima. Antes de la fabricación del microarreglo,
todas las sondas se analizan con un análisis por espectro-
metría de masas para el control de calidad. Los microarre-
glos de Applied Biosystems se sellan dentro de un cartucho
preensamblado, que contiene un puerto cargante que pueda
ser resellado fácilmente después de que se hayan agregado
las muestras del cDNA o del cRNA marcado. Cuando la
hibridación finaliza, el cartucho se desmonta y se desecha.
Los microarreglos entonces se procesan en lotes y se lavan
las sondas hibridadas.
519
La base de datos Oracle para la anotación del blanco
(expresión génica), que es parte del sistema expresión con
microarreglo de Applied Biosystems, contiene datos re-
cientes de información génica esenciales para todos los la-
boratorios contratados para estudios de expresión génica
en la actualidad y provee el acceso para el almacenaje y
consulta completos para todos los datos experimentales. La
base de datos incluye, por ejemplo, las siglas del gen, los
nombres del gen, las referencias cruzadas para la identifi-
cación del gen, las ontologías públicas (GO) y de Celera
(Panther®) del gen, y otra información relevante. Además,
los fabricantes prometen poner al día la información con los
datos más recientes sobre transcripciones dirigidas por mi-
croarreglos.
Illumina, “microarreglo de ordenamientos”®
Las matrices de expresión ofrecidas por la compañía Illumi-
na son una manera fundamental de matrices: el autoensam-
blaje aleatorio de perlas dentro de sustratos de micropozos
estandarizados. Éstas utilizan los avances tecnológicos en
fibra óptica y las industrias con sistema microelectrome-
cánico (MEMS) para construir los sustratos que contienen
múltiples miles de pozos en sus superficies (fig. 53-7).
Figura 53-7 Diseño de una sonda Illumina e inmovilización de
la perla. Imagen cortesía de illumina.com
El almacenaje cuantitativo de las perlas que se colectan
se autoensamblan dentro de sustratos grabados en micro-
pozos para producir una plataforma del microarreglo de
alta densidad. Dos formatos de microarreglo de matrices
diferentes, el microarreglo de ordenamientos de Sentrix®,
y BeadChip de Sentrix®, están actualmente disponibles.
El microarreglo de ordenamientos utiliza paquetes fi-
broópticos que contienen casi 50 000 filamentos individuales
de fibras conductoras de luz que están químicamente grabadas
para crear un pozo de 3 µm en el extremo de cada filamento.
Los paquetes del microarreglo se agrupan en una configura-
ción de 96 matrices que se emparejan en el pozo espaciando
las placas de microtitulación estándares. Este formato único
permite que los usuarios conduzcan experimentos simples y
rápidamente sobre 96 matrices de forma simultánea. Por otra
parte, la plataforma puede incorporarse de manera fácil en
rutinas automáticas empleando equipo robótico estándar, que
minimiza los errores, trabajo y requerimientos de recursos.
520 CAP. 53 ANÁLISIS DE SNP DE ALTA DENSIDAD Y DE ARREGLOS DE cDNA

Extracto de mRNA Extracto de mRNA

Transcripción
inversa
para cDNA

Marca verde Marca roja

Mezcla

Normal Enfermedad

Oligos marcados sobre el cristal

Oligos sintetizados sobre el cristal Desnaturalizar
Productos cDNA-PCR
Hibridar

Figura 53-8 Perfil de la expresión génica usando microarreglos.

El formato BeadChip es una plataforma de tamaño es-

pecífico sobre un portaobjetos que permite el procesamien-
to de ocho muestras a la vez y puede examinarse en un
escáner de láser estándar.
Independientemente del formato del microarreglo, cada
perla contiene cientos de miles de sondas oligonucleotí-
dicas unidas en forma covalente. Hasta 1 500 tipos úni-
cos de perla que contienen secuencias diferentes de sonda
se representan en cada microarreglo, con un promedio de
30 veces de redundancia de cada tipo de perla. Después del
ensamble de la perla, un procedimiento basado en hibrida-
ción se utiliza para descifrar el microarreglo, determinán-
dose qué tipo de perla reside en cada pozo. Este proceso
final valida el funcionamiento de cada tipo de perla.

Microarreglos de DNA de doble color (fig. 53-8) Figura 53-9 Diseño de la sonda MWG.

Con esta tecnología, cantidades pequeñas de sondas se ti-
ñen sobre una laminilla de cristal usando una impresora
robótica. Las sondas pueden consistir en cDNA, oligonu-
cleótidos o productos PCR, cada una complementaria de
un gen específico. El protocolo para el marcaje e hibrida-
ción del blanco para microarreglos es diferente al usado en
la tecnología GeneChip de Affymetrix. Para comparar la
abundancia relativa de cada gen en dos muestras diferen-
tes de RNA, se realiza un experimento de hibridación de
dos colores. El RNA total se extrae de las dos muestras, se
marcan empleando dos fluoróforos diferentes. Los repor-
teros fluorescentes se seleccionan con espectros sin trasla-
pe, Cy3 (emisión verde a 540 nm) y Cy5 (emisión roja a
650 nm). Estas marcas fluorescentes pueden incorporarse
directamente por transcripción inversa con un cebador oli-
go-dT en presencia de los nucleótidos fluorescentes Cy3-
dUTP, o Cy5-dUTP, o en forma indirecta en una etapa de
amplificación del T7 RNA. El cDNA o el cRNA marcado
de la muestra de la prueba y de la referencia se mezclan,
los colorantes que no se incorporan se eliminan y la mezcla
se hibridiza para el microarreglo. El cociente Cy3:Cy5 se
determina y alterna la abundancia relativa de esa secuencia
específica en las dos muestras.
Microarreglos de MWG (fig. 53-9)
Los microarreglos MWG se marcan con grupos de oligonu-
cleótidos diseñados a partir de la base de datos CodeSeq®.
La base de datos CodeSeq® es una base de datos MWG
 REFERENCIAS
relacionada con proteínas no redundantes derivada de las
secuencias públicas para cada gen; las secuencias redun-
dantes y parciales se eliminan para cada transcripción. Los
genes y las transcripciones específicas en las secuencias se
representan por oligonucleótidos de 50-bases específicos,
que son apareados en contenido GC y TM y están libres de
estructuras secundarias.
Manejo de datos y análisis secundario
Las cantidades extensas de datos que emanan de investi-
gaciones con microarreglos aplicados al genoma humano
pueden ser impresionantes, pero sin la interpretación que
todo esto contiene, es una masa de datos. La función del
gen es uno de los elementos clave que los investigadores
desean extraer de experimentos con microarreglos, y una
variedad de herramientas analíticas secundarias está dispo-
nible con este fin.
Quizás debido a la novedad relativa de la tecnología del
microarreglo, o el paso acelerado al cual la tecnología
se está expandiendo, la presentación del análisis secunda-
rio de datos sufre de carencia de estandarización. Los estu-
dios de expresión con microarreglos son capaces de produ-
cir cantidades inmensas de datos del transcriptoma. Tales
datos pueden generar incursiones en la función y la inte-
racción del gen en las diversas rutas metabólicas (Young,
2000; Lockhart y Winzeler, 2000) pero sólo si se persigue
una aproximación estandarizada para la presentación de los
datos (Simon y cols., 2002; Barrett y Kawasaki, 2003).
Los datos de la expresión del gen son complicados por
su naturaleza. Deben analizarse en el contexto de una serie
de parámetros, tales como el tipo de microarreglo que se
usa, la naturaleza del material biológico que se examina,
los protocolos empleados con la muestra de RNA y la natu-
raleza del calibrador elegido. Este último factor es particu-
larmente importante, dado que los microarreglos actuales
no miden ni cuantifican la expresión per se; más bien se
calculan cambios relativos o dobleces comparados con una
muestra del calibrador. La carencia de estandarización en-
tre los genes de referencia o controles usados es una de las
fuentes más importantes de confusión al intentar comparar
los datos generados por diferentes fuentes. Diversas pla-
taformas del microarreglo y el diseño experimental tam-
bién contribuyen con datos no estandarizados, produciendo
comparaciones directas difíciles o imposibles.
Brazma y cols. (2001, 2002) recientemente propusieron
un sistema con objeto de estandarizar los datos del microarre-
glo. Estos autores aspiraron a definir la información míni-
ma que debe reportarse para asegurar la interpretación de
los resultados generados, así como su potencial validación
independiente. Su sistema lleva las siglas MIAME (infor-
mación mínima sobre un experimento con microarreglo).
521
Con el sistema MIAME, los datos y las anotaciones de un
experimento con microarreglos necesitan conformarse con
las siguientes restricciones: “la información registrada so-
bre cada experimento debe ser suficiente para interpretar el
experimento y con bastantes detalles para permitir compa-
raciones con experimentos similares y la replicación”, y “la
información debe estructurarse de una manera que permita
la consulta útil y el análisis y extracción de los datos automá-
ticamente”. Otro principio que sostiene MIAME es la con-
cesión de que el área se desarrolla rápido. Sugiere que los
estándares simplemente requieren la descripción de da-
tos con detalle y anotaciones suficientes para facilitar que
las partes interesadas entiendan cómo se alcanzaron las
conclusiones. El programa detalla los componentes varia-
bles esenciales de un experimento con microarreglo e indica
los puntos que necesitan incluirse en cualquier manuscrito
que se refiera a esta área. Por último, el sistema reconoce
el uso de la tecnología con microarreglo para propósitos
diferentes al análisis de la expresión (p. ej., perfilamiento
de SNP) y otras versiones de los sistemas se planean para
acomodar este aspecto.
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522 CAP. 53 ANÁLISIS DE SNP DE ALTA DENSIDAD Y DE ARREGLOS DE cDNA

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 54
Análisis por microarreglo de la hibridación
genómica comparativa de los tejidos humanos
Esther O’Regan, Paul Smyth, Stephen Finn, Cara M Martin, Orla Sheils y John O’Leary
Antecedentes de hibridación genómica
comparativa (CGH) y de su microarreglo
Históricamente, el análisis citogenético de tumores sólidos
ha resultado difícil, y aunque hay muchas técnicas que se
usan en la detección de cambios genéticos implicados en tu-
mores sólidos, todas tienen sus limitaciones. La citometría
de imagen, que se utiliza para detectar clones aneuploides, no
es muy sensible para detectar cambios genéticos pequeños,
mientras la cariotipificación presenta sus propias dificul-
tades, es muy especializada, consume tiempo y requiere
cultivos tisulares de tumores sólidos, los cuales pueden ser
inestables. Los estudios de pérdida de heterocigosidad y de
hibridación in situ fluorescente (FISH) proveen información
muy detallada sobre uno o una cantidad pequeña de genes
o regiones cromosómicas específicas a la vez; sin embargo,
impide una apreciación global del genoma entero.
En 1992, Kallioniemi y cols. desarrollaron un método ci-
togenético molecular, la hibridación genómica comparativa
capaz de detectar y mapear la variación relativa de la canti-
dad de la copia de la secuencia de DNA a través del genoma
completo en un solo experimento. Esta técnica revoluciona-
ria, que utiliza una cantidad pequeña de DNA, permite que
se investigue el genoma completo y se detecten pérdidas y
ganancias en todos los cromosomas de modo simultáneo, sin
la necesidad de cultivos celulares (Hermsen y cols. 1996).
El grupo de Kallioniemi en la Universidad de Califor-
nia, San Francisco, usó inicialmente CGH para detectar
aberraciones cromosómicas novedosas en 11 variedades de
células cancerígenas, y desde entonces la literatura sobre el
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
uso de esta técnica para detectar alteraciones genéticas está
en crecimiento y desarrollo muy rápido (Forozan y cols.,
2000). La ventaja de esta técnica es su capacidad de tami-
zaje genómico amplio, que requiere menos tiempo y traba-
jo que la FISH convencional. Las aplicaciones de CGH en
la investigación del cáncer incluyen el tamizaje de tumores
para aberraciones genéticas, y el análisis de los perfiles
de alteración genética dentro de tumores para ampliar la
comprensión de la progresión y el pronóstico del tumor.
Aunque es una poderosa herramienta en el diagnóstico y
la investigación, CGH tiene la limitación de emplear cro-
mosomas metafásicos en estado condensado para la visua-
lización, haciendo difícil distinguir las señales traslapadas
de genes en estrecha proximidad uno al otro, dificultando
la localización precisa de una secuencia de interés. La re-
solución para detectar la pérdida del número de copias es
mayor o igual a 10 MB, y para las ganancias del número de
copias, es no menos de 2 MB. Otra dificultad que se pre-
senta en CGH es la necesidad de personal técnico experi-
mentado con entrenamiento en citogenética, con capacidad
de identificar y determinar sitios de cambios en el número
de copias.
En 1995, Schena y cols. desarrollaron el microarreglo,
en el cual los clones de cDNA de blancos con hibridación
específica del gen de plantas se usaron para medir de mane-
ra cuantitativa la expresión de los genes correspondientes
de la planta. El éxito de esta herramienta científica novedo-
sa condujo al uso de los microarreglos para el análisis del
genoma humano, permitiendo colocar una representación
completa de éste sobre una sola laminilla. Los microarre-
524 CAP. 54 ANÁLISIS POR MICROARREGLO DE LA HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARATIVA DE LOS TEJIDOS HUMANOS
glos o “chips”, como se conocen, son arreglos ordenados
de muestras individuales de ácido nucleico, que se inmo-
vilizan bajo la forma de rejilla sobre una superficie sóli-
da como el cristal, cromo, silicio, etc. (Maughan y cols.,
2001). El análisis con microarreglos ahora es una tecno-
logía elemental que permite el análisis de la variación de
la secuencia del DNA, de la expresión génica, niveles pro-
teicos, tejidos y las células en un formato paralelo extenso
(Stears y cols., 2003). Desde el desarrollo de los microarre-
glos, las limitaciones reconocidas de CGH convencional se
han superado al acoplarlas a la tecnología del microarreglo.
En vez de usar cromosomas metafásicos, la CGH se aplica
a secuencias genómicas del DNA unido a las laminillas.
Este sistema aumenta de forma significativa la resolución
para detectar regiones de desequilibrio, y también evita que
se requieran citogenetistas experimentados.
Apreciación global de la hibridación
genómica comparativa
La CGH implica el uso de DNA específico de la enferme-
dad o del tumor marcado con un fluorocromo verde, mez-
clado (1:1) con DNA normal (diploide) marcado con un
fluorocromo rojo. Esta mezcla se hibrida para preparacio-
nes humanas metafásicas normales sobre una laminilla de
cristal. Los fragmentos de DNA marcados compiten por la
hibridación hacia su sitio de origen, en la extensión metafá-
sica de los cromosomas; la hibridación del DNA del tumor
se representa con fluorescencia verde, mientras la del DNA
normal, con fluorescencia roja. Las cantidades relativas
del tumor y del DNA de referencia unidas a cualquier sitio
dado son dependientes de la abundancia relativa de esas
secuencias en las dos muestras de DNA. El cociente de
la fluorescencia verde:roja resultante es la representación
cuantitativa de la pérdida o ganancia del material genético.
En resumen, la ganancia en el número de copias del gen
(amplificación) produce un cociente verde:rojo elevado, y
la pérdida del número de copias (disminución) en un sitio
específico produce un cociente verde:rojo reducido.
Las laminillas metafásicas normales se preparan a partir
de cultivos linfocíticos de sangre periférica estimulados con
fitohemaglutinina de un humano con un cariotipo normal.
Las células se aprisionan dentro de la mitosis, se tratan con
KCl hipotónico, se fijan en metanol o ácido acético y se
montan sobre laminillas, prestando atención para reducir al
mínimo el número de cromosomas traslapados. Para prepa-
raciones de alta calidad debe existir poco citoplasma, para
mantener los niveles del fondo a un mínimo; los cromo-
somas son oscuros cuando se observan bajo un microscopio
de contraste de fases; y también deben tener una longitud
adecuada (cerca de 400 a 500 bandas) (Kahru y cols., 1997).
Por supuesto, como alternativa a este trabajo consumidor
de tiempo, existen laminillas con cromosomas en metafase
completamente preparadas disponibles en el comercio.
Ventajas
La CGH permite detectar y mapear incrementos y decre-
mentos en el número de copias de la secuencia de DNA en
cualquier lugar del genoma, aportando información sobre
la frecuencia total de ganancias y pérdidas; cualquier grupo
de éstas cambia las subregiones cromosómicas, y el tamaño
y el número de las regiones afectadas en cualquier mues-
tra dada del tumor. La capacidad para investigar el genoma
completo en un experimento es la ventaja distintiva que po-
see sobre los estudios de pérdida alélica, que se dirigen sólo
a un sitio a la vez. La CGH no requiere preparación de ex-
tensiones metafásicas de las células que se analizan, lo cual
puede resultar muy difícil en el análisis de bandeo de tumo-
res sólidos, así la CGH es ideal para el uso en el análisis de
tumores sólidos, sobre todo desde que se mejoró la técnica
de extracción de DNA; y la amplificación de PCR universal
permite la adquisición de producciones más altas de DNA a
partir de casi cualquier clase de espécimen clínico, incluso
de tejido fijado en formalina e incluido en parafina.
Como ninguna sonda específica o conocimiento previo
de alteraciones genómicas son requeridos, la CGH es muy
conveniente para la identificación y mapeo de las aberracio-
nes desconocidas, las cuales han conducido a localizaciones
de genes muy importantes (Mertens y cols., 1997).
Limitaciones
La CGH ha demostrado ser una herramienta crítica; sin em-
bargo, tiene un número de limitaciones. Primero, sólo pue-
de detectar ganancia y pérdida de copias. No puede detectar
cambios cromosómicos estructurales que no impliquen ga-
nancia o pérdida de copias, por ejemplo, translocaciones o
inversiones equilibradas. Es, por tanto, más conveniente en
el análisis de tumores epiteliales, en los cuales el tipo prin-
cipal de inestabilidad genética es el desequilibrio cromosó-
mico, mientras que no es tan útil en análisis hematológico
o del tumor mesenquimatoso. En segundo lugar, porque el
DNA blanco dentro del cromosoma está supercompactado,
el tamaño mínimo de la aberración de DNA que puede de-
tectarse presenta un problema, es decir, la resolución es 10
Mb para la pérdida, y porque este nivel de la detectabilidad
es una función del tamaño de la aberración y del número
de copias excesivas, la resolución de la ganancia es 2 Mb.
Estas limitaciones evitan la localización precisa de secuen-
cias de interés. Debe también observarse que en el análi-
sis del tumor sólido es difícil detectar cambios pequeños
del número de copias debido a la contaminación de células
 MICROARREGLOS
del tumor con células normales. El aislamiento de las po-
blaciones celulares puras por microdisección se recomienda
para reducir la contaminación, y, de esta forma, aumentar la
sensibilidad de la detección.
También, debido a un número alto de secuencias repe-
titivas en las regiones cromosómicas 1p32, 16p y 19p, el
análisis de estas regiones puede ser inestable (Weiss y cols.,
1999). Finalmente, los patrones de tinción no homogénea
o granular pueden surgir de preparaciones del DNA de la
muestra contaminada con altas cantidades de proteína o de
fragmentos marcados que son demasiado cortos o largos.
Aplicaciones clínicas
Las aplicaciones de la CGH abarcan desde la genética
del cáncer al diagnóstico prenatal. En el cáncer, las dele-
ciones y amplificaciones contribuyen a alteraciones en la
expresión de genes y oncogenes supresores del tumor. La
alteración extensa del número de copias de DNA, que tie-
ne un efecto directo sobre los patrones de expresión del
gen global, apoya la teoría de que existe un grado alto de
expresión dependiente del número de copias en tumores
sólidos. Los estudios sobre cáncer de mama y cáncer renal,
entre otros, han demostrado que el número de aberraciones
puede relacionarse con tasas de supervivencia total y con
resultados de los pacientes; por tanto, el nivel de inestabi-
lidad genética puede ser un indicador útil del pronóstico
(Isola y cols., 1995; Moch y cols., 1996). La CGH es un
método de tamizaje sensible para la detección y el mapeo
de estos genes críticos asociados con el cáncer; también se
le utiliza para identificar los patrones persistentes de las al-
teraciones genéticas de clonas comunes que se encuentran
en muchos tumores, por ejemplo, pérdida en el cromosoma
13 y ganancia de 8q (Mertens y cols., 1997).
Las anormalidades de desarrollo, por ejemplo, síndro-
mes de Down, Prader-Willi y cri-du-chat, resultantes de la
ganancia o pérdida de una copia de un cromosoma o una
región cromosómica y, aunque la citogenética convencio-
nal se utiliza para identificar aberraciones cromosómicas
en estos desórdenes, una CGH tiene el valor adicional de
permitir la detección de material extragenético desconoci-
do o de aberraciones desequilibradas que pueden conducir
a la identificación de regiones y genes novedosos respon-
sables del fenotipo de los pacientes.
Microarreglos
El desarrollo del microarreglo en 1992 por Schena y cols.
ha revolucionado la aproximación a la investigación bio-
lógica y, desde 1992, se ha convertido muy rápido en una
herramienta estándar en muchos laboratorios de investiga-
525
ción genómica, con amplias aplicaciones en áreas inclu-
yendo las de tamizaje genético, proteómicas, de valoración
de la seguridad y de diagnóstico (Stears y cols., 2003; So-
linas-Toldo y cols., 1997).
En los últimos años se introdujo la principal CGH fun-
damentada sobre microarreglos (Pinkel y cols., 1998) y
refinado (Mantripragada y cols., 2003). En esta técnica,
los cromosomas metafásicos de la técnica CGH clásica se
reemplazan por un microarreglo de alta densidad de clones
genómicos en la forma de cromosomas artificiales bacte-
rianos (BAC), cromosomas artificiales de levadura (YAC)
o cósmidos sobre una superficie sólida. Esta combinación
novedosa de la CGH sobre un chip ha evadido algunas de
las limitaciones de la CGH convencional.
Primero, debido a la carencia de resolución espacial de
la CGH convencional la resolución permanece al nivel del
bandeo cromosómico. Sin embargo, combinando CGH y
la tecnología del microarreglo; esta limitación se supera,
mejorando la resolución y permitiendo la identificación de
desequilibrios genómicos que no se observan al usar CGH
convencional (Mantripragada y cols., 2003). Sin embargo,
es importante anotar que la resolución se determina por el
tamaño de la inserción del DNA clonado y, por tanto, esto
puede variar desde 100 KB hasta 40 MB.
La capacidad para el análisis simultáneo de centenares
de lugares genómicos mejora mucho la precisión de los da-
tos y reduce el costo cuando se compara con métodos se-
riales. Los microarreglos de CGH aportan una plataforma
para la detección de la aberración que tiene sensibilidad
mejorada, resolución mejorada, mejor reproducibilidad y
un rendimiento de procesamiento más alto.
Un microarreglo es un arreglo ordenado de muestras y
tiene dimensiones del punto que son por lo general meno-
res de 200 µm de diámetro. Pueden encargarse (Phimister,
1999) o emplearse los tipos disponibles en el comercio.
El microarreglo se fabrica con robótica de alta velocidad
sobre una superficie que debe permitir la unión estable de
los elementos del microarreglo y minimizar las señales
del fondo. La instrumentación para el microarreglo y la
proyección de imagen pueden ensamblarse en el local o
comprarse entre diversos vendedores.
En la figura 54-1 la plataforma microarreglo 300 de
Vysis Genosensor® utiliza la química de unión única que
permite insertar 287 clones grandes como cromosomas ar-
tificiales bacterianos (BAC) y cromosomas P1-artificiales
(PAC) para que sean teñidos sobre una superficie chapa-
da con cromo. Tres puntos representan cada clon y com-
prenden oncogenes conocidos, genes supresores del tumor,
áreas conocidas con pérdida de heterocigosidad, microdis-
minuciones comunes, subtelómeros y clones de marcador.
La resolución depende del tamaño del clon y puede variar
entre 100 kb y 40 Mb.
526 CAP. 54 ANÁLISIS POR MICROARREGLO DE LA HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARATIVA DE LOS TEJIDOS HUMANOS

Figura 54-1 Salida del informe final del sistema matriz 300 de Genosensor®.
 MICROARREGLOS
El Spectral Genomics SpectralChip® se basa en un
acoplador químico propietario único de los fragmentos de
DNA en las superficies de cristal sin tratar, eliminando la
unión no específica de las sondas en las superficies carga-
das positivamente. Esto reduce el ruido y la fluorescencia
de fondo. El equipo del microarreglo de SpectralChip in-
cluye dos matrices con 1 003 clones BAC sin traslape que
se extienden sobre al genoma en intervalos cercanos a 3
Mb y se tiñen por duplicado. Con esto se obtiene una reso-
lución mayor de 3 Mb.
Es importante observar cierta discrepancia en la nomen-
clatura literaria respecto a los términos “sonda” y “blanco”.
Se siguen las recomendaciones de Phimister y cols., en que
“sonda” se refiere al ácido nucleico unido a la secuencia
conocida, mientras que “blanco” implica la muestra libre
del ácido nucleico que se trata de identificar (Emmert-
Buck y cols. 1996).
Material iniciador
Al aislar DNA para el análisis de la CGH es imprescindible
que el DNA sea de alta calidad. El DNA de tumores sólidos
debe obtenerse de tejido fresco o congelado, así se evita
la degradación extensiva; sin embargo, la adquisición del
tejido en estos estados no siempre es factible.
El DNA que se extrae de tejido fijado en formalina e
incluido en parafina se entrecruza y consiste de DNA con
elevada fragmentación, convirtiéndolo en subóptimo para
el marcaje. Para reducir al mínimo la degradación, un pe-
riodo de fijación en formalina menor a 24 h es recomen-
dable, y preferible el uso de formalina amortiguada con
un pH neutro. La dilución del DNA tumoral por DNA del
estroma “normal/contaminante” circundante puede condu-
cir a cambios en el cociente de DNA tumoral entre DNA
normal, produciendo fallas para detectar aberraciones cro-
mosómicas.
Para minimizar el problema de la heterogeneidad en los
tejidos de tumores sólidos, es importante obtener una pobla-
ción pura de las células tumorales previo a la extracción del
DNA. Lo anterior se logra por medio de la microdisección
de la muestra, ya sea de manera manual o mediante la técni-
ca de microdisección con láser y captura (LCM).
Con el sistema 2 Arcturus PixCell®, un láser infrarrojo
no perjudicial funde un polímero con temperatura de fu-
sión baja sobre las células elegidas, permitiendo que las
células se adhieran, aislando las poblaciones celulares de
interés identificadas por medios morfológicos (Telenius y
cols., 1992).
Sin embargo, el uso de esta herramienta valiosa para
obtener DNA tumoral puro tiene algunas limitaciones. La
técnica consume tiempo, requiere la captura láser de las
células a partir de secciones múltiples para recoleccionar
527
suficiente número de células que permitan el aislamiento
adecuado del DNA.
La mayor parte de los estudios de la CGH involucran el
uso de los equipos de extracción de DNA disponibles en
el comercio, de aislamiento de DNA basados en colum-
nas de afinidad, y extracciones fenol/cloroformo. Al usar
muestras fijadas en formalina e incluidas en parafina como
material de inicio, las modificaciones tendrán que reali-
zarse para protocolos de extracción genéricos. Debido al
entrecruzamiento extenso, es aconsejable un periodo de
incubación prolongado de hasta tres días en la solución
de lisis celular y la adición repetida de proteinasa K duran-
te este periodo (Weiss y cols., 1999).
Para un experimento con microarreglo de CGH, se requie-
ren de 0.1 a 0.5 µg de DNA. Esto puede ser difícil de obtener,
sobre todo a partir de muestras pequeñas de tejido fijado en
formalina e incluido en parafina. Para mejorar la producción,
se puede amplificar el genoma completo de manera no espe-
cífica. La reacción en cadena de la polimerasa preparada de
oligonucleótido degenerado (DOP-PCR; Speicher y cols.,
1993; Kuukasjarvi y cols., 1997) es una técnica completa de
amplificación del genoma eficiente y confiable.
Este tipo de PCR emplea un oligonucleótido que con-
tiene iniciadores degenerados. El procedimiento de la am-
plificación se divide en dos pasos. La primera parte im-
plica cinco ciclos de PCR realizados a temperaturas bajas
de templado (32ºC), que permiten la unión frecuente del
iniciador DOP. Esto genera un depósito de secuencias de
DNA a partir de sitios uniformes dispersos dentro de un ge-
noma dado. El segundo paso tiene una temperatura de tem-
plado más rigurosa de 62ºC para 35 ciclos, ocasionando un
inicio más específico. El resultado de este procedimiento
de dos etapas es la amplificación exponencial de todas las
secuencias que se han sintetizado en el primer paso, pro-
duciendo una cantidad grande de DNA. Varios grupos que
ya han publicado sus investigaciones alteraron de alguna
manera el protocolo DOP-PCR original, en un esfuerzo
para mejorar la producción de DNA y la confiabilidad del
método (Huang y cols. 2000).
Para probar el funcionamiento del método, se puede
usar como control positivo una mezcla de DNA que se ex-
trae a partir de líneas celulares tumorales. Vysis usa CoSH,
una mezcla de las siguientes variedades de células: COLO
320 HSR (adenocarcinoma colónico), 35%; SJSA-1 (os-
teosarcoma), 40%, y BT-474 (carcinoma de mama), 25%,
con ganancias y pérdidas conocidas del número de copias
en sitios específicos.
Marcaje e hibridación del DNA
Para obtener hibridación uniforme, intensa en los mi-
croarreglos, el tamaño del fragmento de la sonda del DNA
528 CAP. 54 ANÁLISIS POR MICROARREGLO DE LA HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARATIVA DE LOS TEJIDOS HUMANOS
Figura 54-2 Visualización de la micromatriz que
muestra una disminución de 9p2l.3 (MTAP) (roja) y
una amplificación de 17q2l (BRCA1) (verde).
debe ser de 200 a 400 bases, y esto se logra con un marcado
aleatorio del DNA y recolectando esta longitud óptima de
fragmento. En el método de marcaje directo recomendado
por Vysis y Spectral Genomics, los fluoróforos Cy3 y Cy5
se unen de manera directa al DNA de la muestra y al DNA
genómico de referencia completo respectivamente.
Los DNA se mezclan y se cohibridan en una micromatriz
en presencia del DNA Cot-1 humano sin marcar. El DNA
Cot-1 es DNA placentario de 50 a 100 pares de bases de
longitud, que se enriquece para las secuencias repetidas del
DNA, y su función es bloquear la unión del DNA marcado a
las regiones centroméricas y heterocromáticas, que contie-
nen secuencias de repetición polimórficas elevadas. El blo-
queo de estas regiones previene su inclusión en el análisis,
permitiendo la amplitud óptima del cociente rojo:verde.
Después de la hibridación de 2 a 4 días a 37ºC en una
incubadora húmeda, los chips se lavan para eliminar cual-
quier sonda sin hibridar. Después se aplica 4,6 diamidino-
2-fenilindol (matriz DAPI) como contratinción.
El tiempo de captura y almacenaje de la imagen para
cada laminilla es cercano a una hora. Un sistema de pro-
yección de imagen fluorescente captura una imagen del
chip hibridado en planos de tres colores: Cy3, Cy5 y
azul DAPI. La matriz 300 de Vysis Genosensor® utiliza
una cámara fotográfica CCD y una fuente de ilumina-
ción de xenón de 175 W para capturar tres imágenes de
cada microarreglo, específica para la contratinción DAPI
(azul), para el DNA de la prueba (verde) y para el DNA
de referencia (rojo). La imagen azul se emplea para iden-
tificar y localizar los puntos del blanco en la rejilla. Una
vez identificados, los puntos pueden analizarse de manera
cuantitativa con el software especializado, que integra las
intensidades fluorescentes verdes y rojas, restando el fondo
local, y se calcula el cociente de la intensidad de la prueba
entre la intensidad de la referencia (T:R) para cada punto
(triplicar los puntos para cada gen del blanco). En la figura
54-2, por supuesto, los cocientes T:R promediados tienen
Disminución de 9p21.3 (MATP)
Amplificación de
17q21 BRCA1
que normalizarse respecto al punto de control o a un grupo
de puntos. El sistema Vysis también detecta los puntos que
parecen normales y divide todos los cocientes T:R entre el
cociente T:R de los blancos “normales”.
Como la representación sobre microarreglos, en parti-
cular arreglos de expresión, se incrementa en densidad, el
almacenaje de los datos y la bioinformática se convierten
en una recolección más desafiante e impecable; el análisis
y los métodos de interpretación son de suprema importan-
cia si se previenen los datos dañados que pudieran conducir
a conclusiones incorrectas. En un esfuerzo para evitar este
suceso, la estadística y la bioinformática se están convir-
tiendo rápido en los componentes más prominentes en el
entrenamiento de biólogos moleculares.
Conclusión
Hay un cambio en la biología molecular desde el desarro-
llo de la tecnología del microarreglo, y el acoplamiento de
esta tecnología con la hibridación genómica comparati-
va ha surgido como herramienta poderosa, permitiendo la
evaluación de múltiples blancos en una sola prueba con
la capacidad de detectar cambios en la copia única. Esta
técnica inestimable ha acelerado la detección de genes no-
vedosos que pueden desempeñar un papel en la patogénesis
de tumores y en el desarrollo del control de la enfermedad
con perfil genómico.
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 55
Secuenciación de ácidos desoxirribonucleicos
Cara M Martin, Steven J Picton, Orla Sheils y John O’Leary
Introducción
La identificación del ácido desoxirribonucleico (DNA) quí-
mico a mediados de la década de 1940 por Avery, MacLeod
y McCarty mostró por primera vez que el DNA es el mate-
rial de la herencia, la tan llamada sustancia de la vida. Este
solo descubrimiento puso el fundamento para permitir a la
ciencia el establecimiento de la genética molecular, de la te-
rapia de genes, del asesoramiento genético y de la manipu-
lación de la expresión genética in vitro. Ha aportado la base
para las técnicas que ahora conducen al escándalo de los
periódicos sensacionalistas inspirados por la publicación de
las últimas aplicaciones de las técnicas del DNA recombi-
nante, como la clonación de la oveja Dolly en el Instituto
Roslin, Edimburgo, en Escocia, y facilitado el esfuerzo in-
ternacional para secuenciar los 3 mil millones de bases del
DNA en el genoma humano, a principios de esta década.
James Watson y Francis Crick en 1953 desentrañan y pu-
blican la estructura tridimensional de la molécula del DNA
de doble cadena. El resto es historia. Desde que la identidad
y la estructura de la molécula responsable del cambio here-
dado se descubrieron, se ha establecido el lenguaje del códi-
go genético, con las cuatro bases, adenina (A), citosina (C),
guanina (G) y timina (T). El flujo de esta información desde
la secuencia base del DNA a las proteínas ahora está elucida-
do y clarificado más allá de cualquier duda científica.
De los acontecimientos clave críticos para el nacimiento
y la maduración exitosa de la biología molecular aplicada, el
descubrimiento de los métodos para determinar la secuencia
base individual de los ácidos nucleicos debe figurar entre los
más importantes. La tecnología de secuenciación se utiliza
en la actualidad a través de un número diverso de discipli-
nas, comprendiendo desde la ciencia médica y forense hasta
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
la genética de población, la filogenética y la genética de la
conservación. Ya que es una era de genómicos comparati-
vos, de descubrimiento de fármacos, y de tamizaje genético,
la demanda para las tecnologías de alto rendimiento de se-
cuenciación es mayor que nunca. La capacidad para deter-
minar rápidamente secuencias del DNA ha revolucionado la
ciencia de la genética molecular. Las secuencias del DNA se
obtienen de diversas fuentes, y los depósitos o bancos de in-
formación son extensos, como las bases de datos de EMBL,
DDBJ y GenBank, que existen como reservas internacionales
de las secuencias del ácido nucleico. Estos bancos de datos
sirven como una biblioteca del ácido nucleico a la cual los
científicos tienen acceso electrónico para estudiar la evolu-
ción, las mutaciones, la filogenia y aplicar, en última instan-
cia, la información de la secuencia para la caracterización de
sistemas biológicos completos. El propósito de este capítulo
es reseñar esta tecnología de secuenciación y sus aplicacio-
nes, particularmente en el Proyecto del Genoma Humano.
Historia de la secuenciación del ácido
desoxirribonucleico
Los intentos iniciales en las técnicas de secuenciación fue-
ron realizados sobre plantillas cortas de tRNA por el grupo
de Robert Holley a mediados de la década de 1960. Este
método implicó digerir el RNA con RNasas de secuencia
específica y separar los ribonucleótidos resultantes por cro-
matografía de intercambio iónico. A principios de la déca-
da de 1970 la secuenciación del DNA rutinaria se convirtió
en una realidad con el descubrimiento y el aislamiento de
las enzimas de restricción del DNA, esencialmente tije-
ras moleculares que cortan hasta plantillas complejas del
532 CAP. 55 SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS DESOXIRRIBONUCLEICOS

genoma, y las DNA polimerasas que permitieron que los das a partir de un solo conjunto de reacciones. El uso de
fragmentos de la plantilla se copiaran in vitro. Estas en- este método se redujo en estos últimos años, en gran par-
zimas hicieron posible que fragmentos pequeños de DNA te debido a las mejoras enormes en los acercamientos de
se aislaran de secuencias mucho más grandes y después se secuenciación enzimática, incluyendo la automatización y
utilizaran como plantillas para la síntesis in vitro de nuevo las DNA polimerasas hechas a la medida. No obstante, este
DNA marcado o etiquetado. acercamiento continúa desempeñando un papel crucial en
En 1980 a tres científicos se les concedió el premio Nobel muchos laboratorios y se utiliza para establecer las secuen-
en química por el desarrollo independiente de dos métodos cias del oligonucleótido, y en la disección funcional de las
de secuenciación del DNA. Éstos son Maxam & Gilbert, señales del control transcripcional (Carey & Small, 2000).
que desarrollaron un método químico de secuenciación del
DNA, y Fred Sanger, quien describió un método enzimático
para la secuenciación del DNA. Ambas técnicas, y las modi- El método dideoxi de secuenciación del DNA
ficaciones de ellas, son la espina dorsal de la mayor parte de
las tecnologías de secuenciación actuales, con predominio El método Sanger (Sanger y cols., 1977) o de terminación de
del método de terminación de cadena dideoxi (Sanger). cadena de secuenciación del DNA es el acercamiento utili-
zado en las principales iniciativas del genoma. El principio
de este método es simple; un fragmento aislado de DNA o
Secuenciación química del ácido el plásmido entero, el cósmido o el producto de PCR es des-
desoxirribonucleico naturalizado a su forma de una sola cadena por el calor o
la alcalinización. Un cebador oligonucleótido sintético corto
Uno de los métodos más tempranos para determinar la se-
se une a su secuencia complementaria, codificada en una de
cuencia nucleotídica de una sección de DNA aislada fue la
las plantillas de una sola cadena. El extremo 3’ del dúplex
secuenciación química de la hebra del DNA, referida con
cebador/plantilla entonces se utiliza como el sitio de inicia-
más frecuencia como la técnica Maxam-Gilbert, que se pu-
ción para la acción de la DNA polimerasa y una cadena de
blicó en 1977 (Maxam y Gilbert, 1977). En este método,
DNA complementaria se sintetiza usando dNTP como pre-
un fragmento aislado de DNA se radiomarca en un extremo
y después se degrada parcialmente sometiendo la plantilla
marcada a una serie de reacciones de división específica de
la base. Estas reacciones de división generan cinco poblacio-
nes de moléculas radiomarcadas que se extienden desde un
punto común (el término radiomarcado) hasta el sitio de la
división química. Las condiciones se diseñan de tal manera
que, en promedio, sólo una base blanco en cada molécula se
modifica dentro de una hebra de DNA dada, y estas reaccio-
nes se llevan a cabo en dos etapas: a) las bases específicas
o los tipos de bases experimentan modificación química, y
b) la base modificada se remueve de su azúcar y los enlaces
fosfodiéster 5’ y 3’ de la base modificada se cortan. Cinco
modificaciones químicas diferentes ocurren en los tubos de
reacción separados, que dividen el DNA en las bases espe-
cíficas. Después de cada una de las reacciones químicas es-
pecíficas, la plantilla en el tubo se trata con piperidina, que
divide los enlaces fosfodiéster adyacentes al DNA dañado.
El conjunto resultante de las moléculas marcadas del
extremo, cuyas longitudes pueden comprender de uno
hasta varios cientos de nucleótidos, pueden utilizarse para Figura 55-1 Química de la secuenciación Sanger o de termi-
nación de cadena que emplea iniciadores marcados con colorante
identificar la posición de las bases individuales proporcio-
fluorescente. Cuatro diferentes iniciadores marcados con coloran-
nando una “escalera” de fragmentos que varían de tamaño te (terminación A, C, G y T) se utilizan en cuatro reacciones sepa-
uno del otro por una sola base. Estos fragmentos se separan radas de extensión y de terminación. En el final de las reacciones,
por electroforesis en un gel de poliacrilamida, y la secuen- los contenidos de los cuatro tubos se reúnen y se cargan sobre
cia se lee de una autorradiografía del gel de secuenciación. un carril de un gel de poliacrilamida. La escalera de productos
El rango de este método Maxam-Gilbert es menor que el marcados con colorante se separa por electroforesis y se detecta
del método Sanger, con 600 pb de la secuencia, genera- en tiempo real.
 EL MÉTODO DIDEOXI DE SECUENCIACIÓN DEL DNA
Figura 55-2 Química de la secuenciación Sanger o de terminación
de cadena que emplea terminadores dideoxi marcados con colo-
rante. Los terminadores dideoxi, con cada uno de los cuatro ddNTP
posibles que se marquen con un colorante fluorescente diferente, se
incorporan con una polimerasa durante la fase de extensión de la
reacción de secuenciación. La escalera de productos marcados con
colorante se separa por electroforesis y se detecta en tiempo real.
cursores. La química de la terminación de cadena se utili-
za junto con los cebadores oligonucleótidos marcados (fig.
55-1) o por la incorporación de nucleótidos marcados durante
la reacción de extensión (fig. 55-2). En la secuenciación con
cebadores con colorante, cuatro reacciones de secuenciación
separadas se realizan por cada muestra (cada reacción con-
tiene un cebador marcado con colorante). Este método está
bien adaptado para los proyectos de secuenciación que uti-
lizan cebadores universales; sin embargo, aquellos que em-
plean cebadores personalizados llegan a ser más engorrosos
y costosos, ya que cada cebador debe modificarse en cuatro
reacciones separadas de marcaje con colorante.
En el acercamiento de la secuenciación de terminación de
cadena estándar, se requieren cuatro reacciones de síntesis
separadas. Cada una de las reacciones individuales contiene
una cantidad pequeña de uno de los cuatro 2’,3’ dideoxinu-
cleótido trifosfato (ddNTP), que difiere de los deoxinucleó-
tidos por tener un átomo de hidrógeno unido en vez de un
grupo OH (fig. 55-3). Cuando la hebra de DNA creciente
sintetizada incorpora un ddNTP específico, la reacción de
elongación se termina, puesto que el ddNTP carece del gru-
Figura 55-3 Estructuras químicas de los dideoxinucleótidos y de
los deoxinucleótidos. El reemplazo del grupo hidroxilo por un hi-
drógeno evita que los dideoxinucleótidos experimenten extensión
adicional de la cadena durante la síntesis del DNA.
533
po 3’-hidroxilo requerido por la polimerasa para formar un
enlace fosfodiéster con el siguiente dNTP. Por el control cui-
dadoso del cociente de ddNTP a dNTP en cada una de las
cuatro reacciones, una alcanza una incorporación aleatoria,
pero baja, de cada uno de los ddNTP en las hebras crecientes
del DNA y crea una matriz de fragmentos con un extremo
5’ común, definido por el cebador, pero terminando en cada
posición posible donde el ddNTP específico puede haberse
incorporado. La longitud promedio de tales cadenas puede
manipularse alterando los cocientes ddNTP:dNTP para ase-
gurar que todos los productos puedan resolverse fácilmente
por electroforesis en gel de poliacrilamida o capilar.
Realizando las cuatro reacciones individuales, con cada
uno de los ddNTP presentes, y después resolviendo las cua-
tro reacciones, A-, C-, G- y T-terminaciones, una al lado de
la otra en un gel de resolución o por electroforesis capilar,
se produce otra vez la escalera característica de fragmen-
tos que permite que la secuencia se lea. Las estrategias
de marcaje comunes incluyen la incorporación de dNTP
fluorescentes o radiomarcados, seguidos por electroforesis
capilar, autorradiografía o detección quimioluminiscente
de los productos terminados. Se han logrado avances im-
portantes en esta técnica, y se debe, en gran parte, a las me-
joras en la química del fluoróforo. Es posible ahora marcar
cada ddNTP, con diferentes colorantes, que permiten que la
reacción de secuenciación se lleve a cabo con un cebador
en un solo tubo, ahorrando tiempo y costo considerables.
Hay actualmente dos tipos de terminadores de colorante
disponibles, uno incorpora los colorantes diclororrodamina
(dRhodamine Terminator, Applied Biosystems) y el otro,
BigDyes (BigDye terminator, Applied Biosystems).
Las primeras reacciones químicas de secuenciación em-
plearon polimerasas como el fragmento Klenow de la DNA
polimerasa I, o la DNA polimerasa derivada del bacteriófago
T7 o sus variantes. En épocas más recientes las polimerasas
termoestables, como la DNA polimerasa AmpliTaq y sus va-
riantes, se explotan para llevar a cabo la química de la termi-
nación de cadena por la unión de la terminación de cadena
y del proceso de PCR. Tal acercamiento se llama secuen-
ciación de ciclo (fig. 55-4). El enganchamiento de la PCR
al método dideoxi en la secuenciación de ciclo (Carothers
y cols., 1989) mejoró mucho la sensibilidad de la secuen-
ciación. La secuenciación de ciclo es, de diversas maneras,
similar a la reacción de secuenciación estándar del DNA.
Comienza con una mezcla de reacción de secuenciación es-
tándar del amortiguador, de la plantilla, del cebador, de los
dNTP y de los ddNTP. Una DNA polimerasa termoestable
sustituye a la polimerasa estándar. Esta mezcla se somete a
las rondas normales de los pasos de desnaturalización, de
alineamiento y extensión de una reacción de amplificación.
A diferencia de una amplificación normal del DNA, que uti-
liza dos cebadores para amplificar en forma exponencial la
534 CAP. 55 SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS DESOXIRRIBONUCLEICOS

Figura 55-4 Secuenciación de ciclo de la terminación de cadena. En una combinación del método Sanger, terminación de cadena,
y del proceso de PCR, el DNA original sirve como una plantilla para una reacción lineal de la PCR. En cada una de las 25 rondas del
ciclo de PCR, una escalera de fragmentos terminados marcados con colorante se produce a partir de las plantillas. Después del paso de
extensión, la desnaturalización subsiguiente entonces permite que las mismas moléculas de DNA sirvan otra vez como una plantilla para
la producción de más productos marcados con colorante.

plantilla, la secuenciación de ciclo utiliza un cebador sólo
para amplificar de manera lineal los productos de extensión.
Debido al ciclado repetido de la reacción, menos plantilla se
requiere para la secuenciación de ciclo que para los méto-
dos dideoxi más viejos. Además, desnaturalizando la planti-
lla de cadena doble antes de cada paso de alineamiento del
iniciador durante la ronda de temperatura cíclica, se elimina
la necesidad de preparar plantillas de una sola cadena para la
secuenciación del DNA. Las plantillas de doble cadena tie-
nen la ventaja de permitir la secuenciación de ambas hebras
de DNA. Este acercamiento de secuenciación es también
mucho más favorable a la automatización que los acerca-
mientos de secuenciación tradicionales.
Secuenciación automatizada
El rendimiento de la tecnología de secuenciación era el
principal paso limitante de la velocidad en los proyectos de
secuenciación a gran escala, como el Proyecto del Genoma
Humano. El avance más significativo en las tecnologías de
secuenciación del DNA es la automatización de la técnica.
Esto parte de tres áreas principales, como se menciona an-
tes: las mejoras en las químicas del fluoróforo, el descu-
brimiento de cada vez más polimerasas termoestables y el
desarrollo de la técnica de PCR. Al principio de la secuen-
ciación de los ácidos nucleicos, sólo existían los marcadores
radioisotópicos como el único método para la detección de
los fragmentos; estos fragmentos marcados se separaban por
geles de acrilamida y las bandas isotópicas se visualizaban
después de la autorradiografía. Cuatro reacciones, A, C, G y
T, se requerían por cada plantilla y las reacciones se cargaban
en carriles adyacentes en el gel. Después de la separación
y de la autorradiografía, la secuencia se determinaba por la
“lectura” del patrón de banda desde el fondo hasta la parte
superior de la autorradiografía, representando los fragmentos
de la longitud cada vez mayor hasta que el poder de resolu-
ción del gel llega a ser el limitante. El requisito para utilizar
cuatro carriles para cada reacción de la plantilla se convertía
en una limitación importante en el número de las muestras
que podían procesarse simultáneamente en un gel, y los altos
niveles adicionales requeridos de la plantilla. La lectura ma-
nual de las autorradiografías, como en los días de la preau-
tomatización dieron testimonio de que era un muy largo y
tedioso trabajo. La lectura manual es también muy propensa
al error humano, tanto en la interpretación de los datos sobre
la película de rayos X como en los errores en la transcripción
de la secuencia sobre la autorradiografía para la secuencia en
una pieza de papel o mecanografiado directamente sobre una
computadora. En muchos casos las películas de radiografía
resultantes las leyeron dos personas para hacer la verifica-
ción, y la secuencia del DNA fue requerida y comparada des-
de las reacciones realizadas en ambas hebras del DNA, dando
tanto la secuencia con sentido hacia adelante como la cadena
reversa para la comparación.
Los métodos automáticos actuales son capaces de gene-
rar hasta 2 millones de bases al día, comparado con un máxi-
mo de 300 a 500 bases/día por electroforesis manual en gel
 SECUENCIACIÓN AUTOMATIZADA 535

de poliacrilamida (PAGE). La química de secuenciación, en
particular la metodología Sanger por terminación de cadena,
ha llegado a ser más importante porque los requisitos de la
plantilla del DNA para las reacciones son menos demandan-
tes. El desarrollo vital para la automatización del proceso de
secuenciación surgió del uso de los colorantes fluorescentes
reporteros como moléculas para la detección de la escalera
de secuenciación. Junto con la excitación láser de los colo-
rantes, cuando emigran a través del gel, y la detección óp-
tica directa de los fragmentos fluorescentes en tiempo real,
la automatización completa de la adquisición de datos llegó
a ser posible.
En este marco surgen dos estrategias principales de auto-
matización para la separación de los fragmentos del DNA;
la electroforesis en gel fino y la capilar en gel. La primera
generación de secuenciadores automáticos consistió de ge-
les de poliacrilamida verticales largos corridos en un tan-
que de electroforesis con sistemas fluorescentes integrados
de detección. Los fragmentos marcados fluorescentemente
son excitados por un rayo láser, que pasa a través de una
ventana estrecha en el fondo del gel de secuenciación. Los
datos fluorescentes entonces se colectan y una imagen vir-
tual del gel se construye (fig. 55-5). Los tiempos de separa-
ción en la electroforesis en gel pueden reducirse de manera
significativa si se utilizan voltajes más altos y los geles ul-
trafinos se emplean como un medio de separación.
La segunda, y en la actualidad la estrategia más utiliza-
da, que sustituye la secuenciación basada en gel, utiliza tu-
bos capilares finos llenos de polímero líquido. Los capilares
de paredes delgadas de diámetros y de longitudes variantes
permiten la separación rápida de los fragmentos del DNA
marcados, reduciendo los periodos de separación hasta por
un factor de 25 cuando se comparan con las técnicas elec-
troforéticas estándar en gel. Los secuenciadores capilares
automáticos funcionan de la siguiente manera: un conduc-
tor automático de jeringuilla llena lentamente el capilar con
polímero, la bandeja automatizada de la muestra que con-
tiene reacciones de secuenciación mueve el capilar que está
sumergido en una muestra específica en la bandeja, y una
alícuota pequeña de la reacción de secuenciación se aspira
dentro del capilar. Una corriente entonces se aplica hasta
que todos los fragmentos del DNA se resuelven y pasan por
la ventana óptica del extremo del capilar. Un láser excita
los fragmentos marcados fluorescentemente y una cámara

Figura 55-5 Imagen virtual de un gel de secuenciación. Esta imagen electrónica representa la escalera de secuenciación fluorescente
de plantillas múltiples que fueron cargadas y separadas de manera simultánea en un instrumento de un carril, con cuatro colorantes.
536 CAP. 55 SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS DESOXIRRIBONUCLEICOS

Figura 55-6 Electroferograma generado sobre un secuenciador capilar del DNA automatizado. Las cuatro bases del DNA están codi-
ficadas con color, con picos que representan cada base. C, azul; A, verde; G, negro; y T, rojo.

CCD colecta los datos de la fluorescencia para su análisis

subsiguiente (fig. 55-6). Entre las muestras, el capilar se re-
llena con polímero fresco antes de continuar el proceso para
la reacción de secuenciación siguiente.
Los secuenciadores capilares tienen un mayor rendi-
miento que los de gel plano y eliminan los pasos tediosos
de la preparación y carga de gel. Los primeros secuencia-
dores capilares comerciales llegaron a estar disponibles a
principios del año 2000. Un secuenciador actual tiene 96
capilares, que funcionan en paralelo para el análisis de se-
cuencia de alto rendimiento. Este sistema es capaz de ana-
lizar hasta 2 millones de bp del DNA en 24 horas.

Proyecto del Genoma Humano

Los avances principales en la tecnología de secuenciación en
la última década generaron la terminación exitosa del Pro-
yecto del Genoma Humano (HGP) en 2003, dos años antes
de lo programado. Este proyecto representa uno de los prin-
cipales logros en la historia de la ciencia. El esfuerzo inter-
nacional comenzó formalmente en 1990 con 3 mil millones
de dólares, esfuerzo de 15 años, para secuenciar 3 mil millo-
nes de pares de bases en el genoma humano. Es considerada
por muchos una de las empresas científicas más ambiciosas
de todos los tiempos, incluso se compara con el aterrizaje
sobre la Luna. En el 2001, antes de lo programado, el primer
proyecto del funcionamiento del genoma humano se publicó
en ediciones especiales de Science (Venter y cols., 2001) y
Nature (Lander y cols., 2001). Desde entonces, los investi-
gadores trabajan para convertir este proyecto de la secuencia
en una terminada, o una con menos de un error por cada 10
000 bases y una contigüidad alta.
El acercamiento de la secuenciación que tomó el Con-
sorcio HGP fue adoptar un método de secuenciación “ba-
sado en mapeo” o “escopetazo jerárquico” (fig. 55-7). En
este acercamiento, el DNA genómico se fragmenta en
Figura 55-7 Acercamiento de la secuenciación de escopetazo
jerárquico adoptada por el Consorcio HGP.
segmentos con gran traslape cercanos a 150 Mb y se in-
sertan en un tipo especial de vector, llamado cromosoma
artificial bacteriano (BAC). Esto se logró por la digestión
parcial con enzimas de restricción, con sitios comunes de
reconocimiento. Los vectores de BAC que se producen se
transforman dentro de E. coli para crear una biblioteca o
(almacén) de BAC. Los clones del BAC individuales son
completamente digeridos, usando enzimas adicionales de
la restricción, para producir un patrón o una marca digital
única. Las inserciones del BAC se aíslan y mapean pos-
teriormente para determinar el orden de cada fragmento
clonado. Una vez mapeados, los clones del BAC indivi-
duales se fragmentan de forma aleatoria en más pequeños
(~ 2 000 bp de largo), que a su vez se clonaron dentro de un
vector del plásmido (clon de escopetazo) y secuenciados
sobre ambas hebras. Usando programas de computadora
avanzados, estas secuencias se alinean de tal forma que las
 ÁREAS QUE AVANZAN EN LA SECUENCIACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Figura 55-8 Acercamiento de la secuenciación por escopetazo
del genoma completo adoptada por Celera Genomics.
idénticas se traslapan, y los fragmentos contiguos se en-
samblan en la secuencia terminada, después de que cada
hebra se ha secuenciado por lo menos cuatro veces.
La estrategia desarrollada por Celera Genomics, quien
inicia su búsqueda mucho antes que el Consorcio HGP, se
conoce como secuenciación de escopetazo completo del ge-
noma (fig. 55-8). Ésta involucra el corte aleatorio del DNA
genómico en fragmentos pequeños (2 000 a 10 000 bp de
largo), los cuales se clonan directo en los plásmidos y fue-
ron secuenciados al azar sobre ambas hebras, eliminando la
etapa del BAC utilizada por el acercamiento HGP. El desa-
fío con este acercamiento fue el ensamblaje de las secuen-
cias. Celera puso en servicio superordenadores capaces de
manejar más de 80 terabytes de datos y de realizar quinien-
tos mil millones de comparaciones secuenciales requeridas
para el ensamblaje inicial. Las ventajas para Celera fue que
ya tenía acceso a datos de la secuencia HGP, que aportaron
la secuencia de referencia para trabajar con ella.
La información que se tiene a partir de la secuencia del
genoma humano es enorme y algo de la más relevante se
menciona enseguida. El genoma es más heterogéneo muy
lejos de lo que se buscaba al principio, y el número total
de genes humanos es menor de lo que se esperaba, con un
consenso actual cercano a 30 000 genes.
Áreas que avanzan en la secuenciación
de los ácidos nucleicos
La importancia de la secuencia humana del genoma no pue-
de exagerarse; sin embargo, el genoma humano representa
sólo una fuente de información que se requiere para aclarar
mecanismos biológicos complejos. La comprensión de los
genomas de otros organismos debe desempeñar un papel
enorme en el entendimiento de los genes que causan enfer-
537
medades, sus mecanismos reguladores y la fisiopatología de
las enfermedades. La secuenciación reciente del genoma del
ratón, el modelo animal más importante de la enfermedad
humana, también representa un logro significativo en el área
genómica. En un futuro próximo, la secuenciación a gran
escala continuará desempeñando un papel enorme facilitan-
do el progreso de la comprensión de los científicos en los
procesos patológicos. También se están realizando esfuerzos
para la resecuenciación de los genomas. Al respecto, se re-
quieren niveles más altos de automatización, que permitan
a los investigadores realizar la preparación de la muestra, la
secuenciación y el análisis de datos en la misma plataforma.
Aparte del requerimiento de sistemas muy automatizados,
otras aproximaciones secuenciales que actualmente están en
práctica como métodos alternativos de separación y detec-
ción incluyen la espectrometría de masas de tiempo de vuelo
con desorción/ionización por láser asistida por microarreglos
(MALDI-TOF-MS) y la secuenciación por hibridación o la
que está basada sobre el chip. Los avances en estas áreas sir-
ven para reducir el costo de la secuenciación y para permitir
que los investigadores centren sus esfuerzos de secuenciación
en las regiones funcionales más importantes del genoma.
La secuenciación por MALDI-TOF-MS es un método
para la separación de los fragmentos de DNA que se gene-
ran al usar la técnica de Sanger. Los fragmentos de DNA se
mezclan con una matriz portadora, como el ácido 3-hidroxi-
picolínico (Wu y cols., 1993), y se pintan sobre la superfi-
cie de desorción del blanco (una placa de acero inoxidable).
Después de que el material orgánico pequeño cristaliza, la
placa se coloca dentro de un espectrómetro de masas para el
análisis. Un láser desorbe y ioniza los fragmentos de DNA,
mientras la aceleración en un espectrómetro de masas permi-
te la determinación de la longitud del fragmento mediante la
detección del tiempo de vuelo. Las ventajas al usar este tipo
de técnica incluyen mayor velocidad de secuenciación y la
secuenciación de fragmentos más cortos de DNA. También
es una técnica de libre marcación, así que el costo es consi-
derablemente más bajo que el de las tecnologías de secuen-
ciación existentes. Con el descubrimiento rápido de genes
nuevos y de mutaciones relacionadas con la enfermedad, la
espectrometría de masas podría ser una herramienta valiosa
y económica para aplicaciones de resecuenciación para com-
plementar las tecnologías de secuenciación existentes.
La otra estrategia que está surgiendo es la secuenciación
por hibridación o la secuenciación basada en el chip. Ésta
puede realizarse inmovilizando varios miles de fragmentos
cortos de DNA de secuencias conocidas (oligonucleótidos)
en una superficie de cristal o de silicón en sitios definidos.
El DNA blanco cuya secuencia será determinada se marca
fluorescentemente y después se hibrida en el chip. La se-
cuencia del blanco se deduce a partir del subconjunto de
sondas oligonucleotídicas que se han unido al DNA blanco.
538 CAP. 55 SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS DESOXIRRIBONUCLEICOS
Uno de los contratiempos principales con este acercamien-
to para la generación de un chip secuenciador universal es
que el número total de variantes combinatorias para un oli-
gonucleótido 15 bp de longitud requerido para representar
el genoma entero es demasiado grande para colocarse so-
bre un solo chip de DNA, el cual en la actualidad es capaz
de sostener cerca de 400 000 oligonucleótidos (Fedrigo y
cols., 2004). No obstante, este acercamiento puede ser útil
para resecuenciar experimentos o para secuenciar genes in-
dividuales con puntos mutantes recientes.
Para concluir, los avances en tecnologías de secuencia-
ción y análisis del DNA, a través de la automatización y la
integración con otras tecnologías relacionadas, continuarán
revolucionando la investigación biológica.
Referencias
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terminator inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 5463-
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Fedrigo O, Naylor G. A gene-specific DNA sequencing chip for
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Lecturas adicionales
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New York.
Tabor S, Richardson CC. DNA sequence analysis with a modified
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1987; 84: 4767-4771.
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in automated DNA sequence analysis. Nature (Lond) 1986;
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quencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleoti-
des. Science 1987; 238: 336-341.
Ansorge W, Sproat B, Stegemann J et al. Automated DNA se-
quencing: ultrasensitive detection of fluorescent bands during
electrophoresis. Nucleic Acids Res 1987; 15: 4593-4602.
Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. DNA sequen-
cing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct se-
quencing of polymerase chain reaction-amplified DNA. Proc
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Adams MD, Fields C, Venter JC (eds). Automated DNA Sequen-
cing and Analysis. 1994: Academic Press, London.
Howe CJ, Ward ES (eds). Nucleic Acids Sequencing 1992: IRL
Press, Oxford.
 Índice alfabético
A policlonales, 40-1 cromatografía en capa fina, 430
antitrombina III, 340 cromatografía líquida de alta
absorción de la luz, 395-7 aplicaciones, 48-54 resolución, 433
actividad del agua, 132 aspiración, 97 metabolismo bacteriano, 138
adenovirus, 185 astrovirus, 185 células
Affymetrix GeneChips, 515-17 AutoPix™, 490 asesinas naturales, 461
aglutinación avidez del anticuerpo, 202 blancas, 249, 268-70
látex, 199 avidina-biotina, 38-9 desgastadas, 96
partículas, 199 exfoliadas, 95-6
agregación plaquetaria inducida por la multinucleadas gigantes, 175
ristocetina, 283-4 B plasmáticas, 261
alanina aminotransferasa, 419-20 citología
aminoácidos, cromatografía, 430, 432 bacilos, 141 automatización, 119
amplificación ácido alcohol-resistentes, 23 basada en líquido, 99, 101-3, 118
16S rRNA, 155 aerobios gramnegativos, 142-3 citodiagnóstico, 104-5
basada en la secuencia del ácido grampositivos, 141 citomorfología, 105-12
nucleico, 218-19 BacT/Alert, 146, 149 colorantes, 103-4
mediada por transcripción, 218 bacteriología concentración celular, 99
por desplazamiento de la cadena, colorantes, 23, 125-8 exactitud y limitaciones, 112-13
219 cultivo, 129-34 fijación, 99
señal de la tiramina, 39 identificación, 135-44 tipos de espécimen, 95-8
anaerobios, 143-4 métodos moleculares, 136, 139-40, citometría de flujo
análisis 151-7 hematología, 303-7
endonucleasa de restricción, 286-7 microscopia, 123-8, 135 immunología celular, 231-2, 455-6
gen por TaqMan PCR, 495-504 pruebas automatizadas, 145-50 plaquetas, 292-3, 307
secuencia, 531-8 bandeo proliferación, 87
automatizado, 534-5 con quinacrina, (Q) 347-8 citoplasma
factor de von Willebrand, 286-7 DA-DAPI, 350 citología, 107-9
hibridación basada en el chip, Giemsa (G), 346-7 tinción, 24-5
537 heterocromatina constitutiva (C), clasificación de Lancefield, 138
MALDI-TOF-MS, 537 348-9 clonalidad, 308-9
método dideoxi, 532-4 replicación, 350-2 Clostridium spp.,141
químico, 532 reverso (R), 348 cobalamina, 313-17
tipificación HLA, 485-6 basófilos, 249, 462 cociente
virología, 220 bioterrorismo, 187-8 internacional normalizado, 334-5
analizadores de cuidado crítico, 392-3 probabilidad, 370
anemia cocos
C
de células falciformes, 326 gramnegativos, 141
hemolíticas, 255, 257 grampositivos ,140-1
cambios maligos relacionados, 78-9
leucoeritroblásticas, 258 colorantes, 18-19, 230
cáncer
megaloblásticas, 254-5 amiloideos, 24
citogenética, 360-2, 525
por deficiencia de hierro, 257 fluorescentes, 18-19
pecho, clasificación, 77
anticuerpos captura híbrida, 219 para elastina, 22
de inclusión, 175 carbohidrato para fibrina, 24
monoclonales, 40-1 colorantes, 22-3 para lípidos, 24

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker,
© 2005 John Wiley & Sons, Ltd.
540 ÍNDICE ALFABÉTICO

colorantes (continuación) deficiencia eritrocitos, 247-9

Romanowsky, 20, 247 de G6PD, 328 cuerpos de inclusión, 278
van Gieson, 21 piruvato cinasa, 328 mediciones, 265-8
complejos inmunes densitometría, 73-4 eritroleucemia, 257
agentes ligadores, 163 descalcificación, 7 eritropoyesis, 254
antígeno-específicos, 162-3 desórdenes linfoproliferativos esferocitosis, hereditaria, 327
ataque a membrana, 448-9 crónicos, 305-7 espectrofluorímetros, 401
ensayos, 465-7 detectores electroquímicos, 390 espectrofotómetros, 395-7
principales de histocompatibilidad Dextrostix®, 419 espectrometría
(MHC), 481, 482 dicromato de potasio, 6 absorción atómica, 406, 407-11
complemento, 447-53 diferencias críticas, 369 atómica analítica, 405-15
APH50, 450 difracción electrónica, 59 emisión atómica 406, 411-12
CH50, 450 DNA de cadena ramificada 219 fluorescencia atómica, 406, 412
ensayos masas, 140
especímenes, 449 masas inorgánicas, 407, 412-13
fijación, 160, 199-200 E espiroquetas, 24
hemolíticos, 450-2 esputo, 127
inmunoquímicos, 449-50 efecto citopático, 179, 193-4 estados
productos de activación, 449, 452-3 efecto de gancho por dosis alta, 380 aplásicos, 257
proteínas de control, 452 electrodos hipoplásicos, 257
comprobación en el punto de cuidado, amperométricos, 388-9 estafilococos, 141
392-3 dióxido de carbono (pCO2), 390-1 esteroides, 434
concentración celular, 99 ion-selectivos, 381-94 estreptococos, 141
congelar-fracturar/congelar-grabado, 59 lactato, 391 exploración cervical, 77-8, 113-19
control anticoagulante, 334-5 oxígeno (pO2), 388, 389
Corynebacteria spp., 141 urea, 391 F
creatina cinasa, 436 electroforesis, 274-5, 434-6, 440-1
creatinina capilar, 436 factor de von Willebrand, 281-7
electrodo, 392 elementos traza, 413-14 fármacos adictivos, 422-3, 430, 432-3,
reactivos secos, 420 élite de Mastascan, 139, 147-8 434
crioglobulinemia, 477-80 elución, 300 fenotipo de la cromatina, 78-9
cromatografía, 163-4, 429 enfermedad feocromocitoma, 432
capa fina, 429-30 falciforme, 327 ferritina, 318, 320
gas, 433-4 HbC, 327 fibrinógeno, 338-9
líquida de alta resolución, 227-8, HbSC, 327 fibrinólisis, 340
431-3 hemolítica del recién nacido, 330 fijación en alcohol, 6-7
microcolumna, 275-7 Hirschsprung, 33 fluorescencia, 241, 399-401
cromosoma residual mínima, 309-10 rayos X, 407, 412
bandeo y análisis, 345-55 sérica, 467-8 fluorímetros, 400-1
Filadelfia, 308 ensayo folato, 313-17
pintura, 358-9 5⬘nucleasa, 496-8 formaldehído, 6
cuenta mitótica, 83-4 APH50, 450 fosfatasa alcalina, 38
cultivo CH50, 450 fotómetros, 395-7
bacteriología, 129-34 citotóxico, 2 31 fototipificación, 484
micología, 235-6 Crithidia, 473 frotis, 99
parasitología, 241-2 D-dímero, 339 vaginales, 128
virología, 191-6 factor, 339-40
Farr, 473, 474
enterococos, 141 G
D enzimas, 27-34, 137-8
eosinófilos, 25, 249 glucosa
datos bioquímicos, 365-71 epidemiología, 156 electrodos, 389-90
 ÍNDICE ALFABÉTICO 541

glucómetros, 392 Köhler, 63 Leica AS LMD, 493

reactivos secos, 419 impregnación con plata, 21 leucemia
glutaraldehído, 6 índice linfoblástica aguda, 261, 305
gonadotropina coriónica humana, actividad mitótica, 83-4 linfocítica crónica, 262
421-2 marcado con timidina, 86-7 mieloide aguda, 258-9, 304-5
gránulos marcaje por bromodeoxiuridina, mieloide crónica, 259
celulares de Paneth, 25 86-7 leyes
células mastoides, 24-5 infección animal, 242 Beer, 396-7
grosor del melanoma, 76 inhibición de la hemaglutinación, 198 Lambert, 397
inmunoabsorbente ligado a enzimas límites de acción, 369
(ELISA) linfocitos, 249, 261
H anticuerpos, 161-2 B, 461
complejos inmunitarios antígeno- subgrupos, 456-9
hemaglutinación, 198 específicos, 163 T, 459-61
hemaníticos, 313-22 dsDNA, 473-4 linfomas, 262
hematoxilina procesadores automatizados, 207-8, líquido cefalorraquídeo, 124
alumbre, 19 209 Listeria monocytogenes, 141
fosfotúngstica ácida (PTAH), 19, 21 proteína, 444-6 luminiscencia, 399-403
hierro, 19 virología, 200-1 luminómetros, 401 -2
hemoglobina inmunodeficiencia, 457-8 lupus eritematoso sistémico, 468-77
cromatografía líquida de alta inmunodifusión radial, 440, 443-4 anticuerpo antinuclear, 469
resolución, 227-8, 433 inmunoelectroforesis, 442-3 anti-dsDNA, 473-4
electroforesis, 436 contracorriente, 442 antígenos nucleares extractables,
inestable, 278 inmunoensayos, 373-80 469-72
medición, 265 competitivos/no competitivos, 373 índices de actividad de la enfermedad,
hemoglobinopatías, 273-9, 310 control de calidad, 378-9 476
hemólisis, 323-32 en línea, 202 neuropsiquiátrico, 475-6
inmunitaria, 328-30 homogéneos, 376 síndrome antifosfolípido, 474-5
hemostasis, 333-41 marcadores, 375-6
hepatitis, 186 métodos de separación, 376-7
hibridación, 358 miniaturización, 377 M
cromosoma Filadelfia, 308 inmunoflourescencia, 126, 177-8, 202
genómica comparada, 523-9 inmunohistoquímica, 35-42 malignidades linfoides, 458
in situ fluorescente (FISH), 354-5, cuantitativa, 79-80 manejo del tejido, 47-8
357-62 proliferación, 85-6 marcadores de la coagulación, 340
oligonucleótido específico del alelo, sistemas reporteros, 37-9 Matriz de Matrices™ de Illumina, 519
287 inmunología celular, 231-2, 455-63 matriz de Vysis GenosensorTM, 525,
sondas, 357-8 inmunométrico, 373-4 527-8
hierro, 317-21 inmunotransferencia, 227, 472 mediciones
hiperplasia/carcinoma endometrial, 77 intervalos de referencia, 367-9 espaciales nucleares, 74-5
histoquímica ultraestructural, 58 isoelectroenfoque, 275 HbF, 277
hongos, 24, 233-8 isoenzimas, 436 interactivas auxiliadas por
hueso computadora, 70
biopsia, 76 médula ósea, 249-51
descalcificación, 7 K megacariocitos, 260-1
secciones sin descalcificar, 14 megacariopoyesis, 258
Koch, R., 129 membranas ion-selectivas, 385-6
metacromasia, 18
I métodos
L cuantitativos, 69-81
iluminación diazo, 30-1
campo brillante, 63 LCM de Arcturus, 489-91 moleculares
542 ÍNDICE ALFABÉTICO

métodos, moleculares (continuación) electrónica de barrido, 54-5, 182 pigmentos, 23

amplificación, 152-3, 213-20 fluorescente, 63-4, 123 PixCell™, 490
bacteriología, 136, 139-40, 151-7 inmunoelectrónica, 57-8 plaquetas, 249, 260-1, 289-93
hematología, 307-10 microtomía, 11-13 adhesión, 291
hemoglobinopatías, 278-9, 310 mielomas, 262 agregación, 291-2
parasitología, 243 mielopoyesis, 258 anticuerpos, 291
tipificación HEA, 483-6 minerales, 413-14 citometría de flujo, 292-3, 307
virología, 213-23 monitoreo conteo, 270-1, 290-1
Ouchterlony, 440, 441 HIV, 456-7 liberación, 292
micobacterias, 149-50 SIDA, 456-7 PFA-100, 292
micología, 24, 233-8 monocitos, 249 polarografía, 388-9
microanálisis de rayos X, 59 muestras policitemia, 257
microangiopatías, 330-2 bioquímicas, 366-7 polietilenglicol, 163
microarreglos histopatológicas, 3-15 polimorfismo en la longitud del
Affymetrix GeneChips, 515-17 fijación, 5-6 fragmento de restricción, 483-4
bacteriología, 155 inclusión, 9 porfirinas, 432
doble color, 520 procesamiento del tejido, 7-1 1 portaobjetos digital, 80-1
hibridación genómica comparativa, recepción y manejo, 4-5 potasio, 420-1
525-8 sistemas de control, 4 principios, 44-8
matriz de MatricesTM de IIlumina, músculo priones, 225-8
519 biopsia, 76-7 procesador de manejo líquido, 207
matriz de Vysis GenosensorTM, 525, colorantes, 21-2 proliferación, 83-92, 231, 459-60
527-8 enzimas, 31-3 proteínas
MWG, 520 C, 340
perfil de SNP, 517 electroforesis, 435-6, 440-1
sistema expresión con matriz de N ensayos, 439-46
Applied Biosystems, 517-19 ensayos de síntesis, 230
sistema MIAME, 521 nefelometría, 397-9, 444 metabolismo bacteriano, 138
SpectralChip™, 525-6 neuroblastoma, 432 S, 340
microbiología cuántica, 134 neutralización, 200 protoporfirina zinc, 318-19, 320-1
micrococos, 141 neutrófilos, 249, 461-2 proyección de imagen digital, 70-2
microdisección norovirus, 185-6 Proyecto del Genoma Humano, 536-7
microrrayo láser, 492-3 pruebas
por láser y captura, 489-93 aglutinación, 160
microfotografía, 66 O aglutinación con partícula de
microorganismos gelatina, 199
colorantes, 23-4 orina anticuerpos, 135-6, 159-62, 297-
microscopia electrónica, 51 microscopia, 124-5 300
microrrayo PALM, 492-3 tamizaje automatizado, 148-9 anticuerpos fluorescentes, 161
microscopia urinálisis, 422-3 antígenos, 135-6, 138, 162
campo oscuro, 65, 125 virus, 187 catalasa, 137
confocal, 66 oro-plata, 38 coagulasa, 138
contraste de fase, 65 Coombs directa, 328
contraste diferencial de Elek, 139
interferencia de Nomarski, 66 P embarazo, 421 -2
de luz, 61-7 estabilidad al isopropanol, 278
bacteriología, 123-8, 135 parasitología, 239-44 indirecta de antiglobulina, 298
hongos, 234-5 parvovirus BI9, 186 inestabilidad al calor, 278
parasitología, 239-40 PCR en la célula, 505-13 optocina, 138
polarizada, 65-6 perfil del polimorfismo de un solo oxidasa, 137-8
virología, 175-80 nucleótido, 517 precipitación, 160
electrónica, 43-60 peroxidasa del rábano, 37-8 respiración, 164
 ÍNDICE ALFABÉTICO 543

sensibilidad, 168-9 frotis, 247 textura, 73-4

susceptibilidad, 138, 146-8, 149-50, morfología, 247-9 tiempo
228-31 servicio de transfusión hospitalario, parcial tromboplastina activada,
ureasa, 138 295-301 335, 337
pus, 127-8 sistemas de cultivo, 145-6 protrombina, 333-5
transfusión incompatible, 330 reptilasa, 338
cortes histológicos, 14-15, 48, 181-2 sangrado, 291
Q cera de parafina, 13 trombina, 337-8
de macrobloques, 13 tinciones, 17-25, 103-4, 125-8, 181,
química del reactivo seco, 417-27 secciones congeladas, 13-14 247
quimioluminiscencia, 401-3 secuenciación de DNA, véase análisis Gram, 125
quimioterapia antimicrobiana secuencial hematoxilina, 19-20
control, 165-71 segmentación automática de la hematoxilina y eosina (H&E),
resistencia, 155-6 imagen, 72-3 20
sensibilidad al metronidazol, 138 Ziehl-Neelsen, 23, 126
Sensititre ARIS, 147 tipificación, 156
R serología “H” , 138
fúngica, 237-8 HLA, 481-6
radioinmunoensayos, 162, 202 parasitología, 243 “O”, 138
rangos normales, 367-9 tipificación HLA, 482-3 tira de Fuji®, 419
reacción virus, 197-205 tricromos, 21
ácido peryódico de Schiff (PAS), 22 serotonina, 432 trombocitopenia, 260
en cadena de la ligasa, 219-20 síndromes trombocitosis, 261
en cadena de la polimerasa, (PCR) antifosfolípidos, 474-5 tromboelastograma, 293
automatización, 217 mielodisplásicos, 257, 260 troponina T, 422
clonalidad de la célula B, 308-9 sistemas turbidimetría 397-9, 444
en célula, 505-13 API, 139
hemoglobinopatías, 278-9 BACTEC, 146, 147, 149-50
identificación bacteriana, 136 expresión con matriz de Applied U
TaqMan, 495-504 Biosystems, 517-19
tiempo real, 216-17, 495-6 MIAME, 521 UF*100, 149
tipificación HLA, 44-5 Phoenix, 139, 147 unión VWF/FVIII, 284-5
virología, 213-17 rhesus, 296
electroquímica, 386, 388-9 Vitek, 139, 147
receptor de transferrina, 318, 319, 321 síntesis de DNA, 230 V
reducción de placa, 228-30 solubilidad falciforme, 275
reestructuración del gen receptor de la SpectralChip™, 525-6 valores
célula, T 309 susceptibilidad antivírica, 228-31 blanco, 369
región organizadora nucleolar, 84-5, corte, 369
349-50 VDRL, 199
reporteros fluorescentes, 37 T virología, 181-9
resistencia antibiótica, 166 colorantes, 23-4
rotavirus, 185 talasemias, 274, 327 crecimiento del virus, 193-6
técnicas cultivo, 191-6
especializadas, 54-9 diagnóstico rápido, 176-7
S fijación, 5-6, 99 inmunidad mediada por la célula,
Mancini, 440, 443-4 231-2
sales de tetrazolio, 31 Maxam-Gilbert, 532 métodos moleculares, 213-23
sangre Sanger, 532-4 microscopia de luz, 175-80
agrupamiento, 295-7 separación, 429-36 microscopia electrónica,
compatibilidad cruzada, 300 terminación de cadena, 532-4 181-9
contadores celulares, 265-71 tetróxido de osmio, 6 muestras, 176
544 ÍNDICE ALFABÉTICO

virología (continuación) W
pruebas automatizadas, 207-12
serología, 197-205 western blot, 202
susceptibilidad antivírica,
228-31
virus que emergen nuevamente, X
188
viruela, 187-8 xenodiagnóstico, 242-3
vitamina B12, 313-17