Curso de Validación de métodos

analíticos cuantitativos y
cualitativos

Fernando Luna Vera, Ph.D.

Noviembre 19, 20 y 21 de 2014
Objetivo General

Profundizar en los requisitos técnicos de la norma ISO

17025 para acreditación de laboratorios y en los
procesos de validación de métodos cuatitativos y
cualitativos de análisis químico.

Objetivos específicos (sesión 2)

A. Entender cuales parámetro deben ser evaluados en una validación

completa de un método cuantitativo y el significado de cada uno.
B. Aprender cómo evaluar los parámetros de una validación completa de
un método cuantitativo usando herramientas estadísticas básicas.
C. Aprender a interpretar los resultados de una validación completa.
“ La validación es la confirmación, a
través del exámen y el aporte de
evidencias objetivas de que se “
cumplen los requisitos particulares
para un uso específico previsto.

Norma ISO 17025:2005

Evidencia objetiva = Medir

 Propuesta:
Adoptar rol de auditor.
1. Comparar los requisitos de validación de la
UNOC con el procedimiento de validación de
INML.

2. Evaluar objetivamente los informes de

validación de cada uno de los métodos
escogidos.

3. Sugerir mejoras a los informes de validación y

detectar oportunidades de mejora.
 Productos

Informe de revisión sobre el informe de

validación, el cual debe incluir mejoras al
procedimiento de validación establecido
en el INML.
Para medir tengo
En métodos que establecer
cuantitativos se creaprimero que señal
un escala: la
escala que se creará
Vs Concentración de en efecto
analito. Enme mide lo que
métodos
deseo medir.la identidad del analito es aún de mayor
cualitativos
importancia

Entonces el primer paso es estar seguro que la

señal obtenida corresponde con el analito a
investigar.
1. Selectividad

“ Es la habilidad para determinar inequivocamente

el analíto en presencia de componentes que se
“
esperan estén presentes, tales como impurezas,
productos de degradación y componentes de la
matriz.
1.1 Análisis de identidad
Objetivo: Verificar que se produce una señal específica debido al
analíto sin interferencias. Se debe utilizar un patrón certificado que
contenga el analíto de interés aislado.

Cromatrografía: Pico característico a un Tr específico.

Espectro MS
 Espectro Infrarojo

Espectrocopía IR: Comparación de absorciones características con librerías.

1.1 Análisis de identidad

Luego que ha probado que puede medir

inequivocamente el analito de interés usando un
patrón (Esto es básicamente verificación del
instrumento), realice las misma mediciones usando
muestras de patrón que contengan interferencias
conocidas y observe variaciones en la señal analítica.
METODOS CUALITATIVOS
Análisis de interferencias.

En presencia de
interferencias. Solo un
pico? o pico donde
coeluyen otras
sustancias?

Realice confirmación con

un segundo método
(Espectrocopía de
masas, o varíe polaridad
de columna)
Realice pruebas con todos los posibles interferentes,
pero sin la sustancia de interés. Realice análisis de
coincidencia de picos en MS e FTIR.

VN
Selectividad:
VN + FP

CONSTRUYA EN EXCEL UNA PLANTILLA PARA EVALUAR SELECTIVIDAD.

METODOS CUANTITATIVOS
¿Cuales son las señales
características de los
mensurables (analitos)
correspondientes al
método escogido?

¿Cómo se realiza el
proceso de verificación de
la coincidencia de
señales?
 Análisis de interferencias.

Evalúe las señales

producidas por el muestras Muestra X1 X2 X3
del analito fortificado con 1 0.0710 0.0656 0.7322
las posibles interferencias a
dos niveles de
2 0.0693 0.0796 0.0861
concentracíon (X2, X3,) y 3 0.0719 0.0830 0.0842
compárelas con la señal del 4 0.0714 0.0766 0.0823
analito sin interferentes 5 0.0643 0.0787 0.0668
(X1). Los niveles de
fortificación deben
Cómo se analizan estos datos?
corresponder con las
concentraciones esperadas
en la matriz.
Análisis de resultados de prueba de interferencias.

• Cada serie de datos producirá un promedio (media)

Muestra X1 X2 X3
1 0.0710 0.0656 0.0732
2 0.0693 0.0796 0.0861
3 0.0719 0.0830 0.0842
4 0.0714 0.0766 0.0823
5 0.0643 0.0787 0.0668
Promedio 0.0696 0.0767 0.0785
Análisis de resultados de prueba de interferencias.

• Cada serie de datos tiene asociada una desviación estándar

Muestra X1 X2 X3
1 0.0710 0.0656 0.0732
2 0.0693 0.0796 0.0861
3 0.0719 0.0830 0.0842
4 0.0714 0.0766 0.0823
5 0.0643 0.0787 0.0668
Promedio 0.0696 0.0767 0.0785
S 0.0031 0.00662 0.00823
Análisis de resultados de prueba de interferencias.

Cuando se calculan medias y desviaciones estándar,

estamos asumiendo que los datos están normalmente
distribuídos. Que las variaciones son de tipo aleatorio y no
debido a sesgos provenientes de equipos o analístas.
Análisis de resultados de prueba de interferencias.

Se tiene el promedio (media) de los tratamientos con y sin

interferencias. Cómo sabemos si las diferencias entre los
promedios son significativos ( o no) y que las interferencias si
influyen en la medición?
Muestra X1 X2 X3
1 0.0710 0.0656 0.0732
2 0.0693 0.0796 0.0861
3 0.0719 0.0830 0.0842
4 0.0714 0.0766 0.0823
5 0.0643 0.0787 0.0668
Promedio 0.0696 0.0767 0.0785
S 0.0031 0.00662 0.00823

Se debe realizar una “prueba de significancia”

Análisis de resultados de prueba de interferencias.

Prueba de significancia. T-student

Para que se usa? Esta prueba se usa para comparar los

promedios de dos grupos de datos y determinar si entre estos
paramámetros la diferencia es significativa. Nota: Este es solo
uno de sus usos, existen más.

Cómo se usa? Usando los datos experimentales se calcula

el valor “t”. Este valor se compara luego con un “valor crítico”
obtenido de una tabla de t-student para un determinado
porcentaje de confiabilidad (95%, α = 0.05). Determinando si t
experimental es mayor o menor que t crítico se toma una
desición.
Análisis de resultados de prueba de interferencias.

Prueba de significancia. T-student

Cómo se calcula? Usando la fórmula.

Promedios

Desviación
estándar
combinada
Análisis de resultados de prueba de interferencias.

Prueba de significancia. T-student

Cómo se usan los resultados? Se comprueba la veracidad
de una hipótesis experimental llamada “hipótesis alternativa”
(H1) con respecto a la hipótesis nula “no hay diferencia”(Ho)
comparando tcritico Vs tcal.

Ho = Las medias son iguales H1 = Las medias no son iguales

t cal < t crítico t cal > t crítico

Análisis de resultados de prueba de interferencias.
Prueba de significancia. T-student
Muestra X1 X2 X3
1 0.0710 0.0656 0.0732
2 0.0693 0.0796 0.0861
3 0.0719 0.0830 0.0842
4 0.0714 0.0766 0.0823
5 0.0643 0.0787 0.0668
Promedio 0.0696 0.0767 0.0785
S 0.0031 0.00662 0.00823

X1 X2
Media 0.0695868 0.0767
Varianza 9.63098E-06 0.00004383
Observaciones 5 5 Valor absoluto de t
Diferencia hipotética de las medias 0 es menor que t
Grados de libertad 6 crítico. ACEPTAMOS
Estadístico t -2.175362107 H1, luego promedios
P(T<=t) una cola 0.036261819 X1 y X2 SON
Valor crítico de t (una cola) 1.943180274 iguales.
P(T<=t) dos colas 0.072523638
Valor crítico de t (dos colas) 2.446911846
Efecto de interferencias.
Muestra X1 X2 X3 A través de prueba t-
1 0.0710 0.0656 0.0732 student se concluye que
2 0.0693 0.0796 0.0861 las interferencias a los
3 0.0719 0.0830 0.0842 niveles de concentración
4 0.0714 0.0766 0.0823
usados, SI influyen y que
5 0.0643 0.0787 0.0668
los
Promedio 0.0696 0.0767 0.0785
promedios no son iguales.
S 0.0031 0.00662 0.00823

Que hacer?
• Derivatización de
analito.
Usar química para eliminar
• Uso de agentes
interferencias si la quelantantes.
cuantificación es dificil. Ejm: • Extracciones
inhibición de la señal. selectivas
( SPE, Extracción
líquido-líquido)
Revise el método que
ha escogido. Existe
alguna interferencia
declarada?

Se han realizado
pruebas para
determinar el efecto
de posibles
interferencias?
Efecto de interferencias.

Que hacer?

Las interferencias están en la matriz. Evalúe si puede

cuantificar el analito estando la matriz presente. “Efecto
de Matriz”

A. Pendientes son iguales

(calibraciones con
materiales de referencia en
solvente puro y con matriz).
Interferencias no afectan la
sensibilidad.
Efecto de interferencias.

Que hacer?

Las interferencias están en la matriz. Evalúe si puede

cuantificar el analito estando la matriz presente. “Efecto
de Matriz”

A. Pendientes son iguales

(calibraciones con
materiales de referencia en
solvente puro y con matriz).
Interferencias no afectan la
sensibilidad.

Con pendientes iguales, ud

podrá usar método de Adición
estándar para cuantificar el
analito.
Efecto de interferencias.
Que hacer?
1.2.1 Las interferencias están en la matriz. Evalúe si
puede cuantificar el analito estando la matriz presente.
“Efecto de Matriz”
B. Pendientes NO son iguales.
Existe disminución en la
sensibilidad. (calibraciones con
materiales de referencia en
solvente puro y con matriz).

Con pendientes desiguales, ud

podrá usar método cuantificar
siempre y cuando la sensibilidad
no afecte el LD necesario.
 Guía Rápida - Selectividad

The Fitness for Porpouse of Analytical Methods, Eurachem Guide, LGC, Teddington, 1998.
2.0 Rango lineal y de trabajo.

“ Es la habilidad del método para obtener

“
resultados
proporcionales
del ensayo que son
a la concentración de
analito.
Existe algún criterio para
la linealidad en métodos
Cualitativos?
METODOS CUANTITATIVOS.
2.0 Rango Lineal y de trabajo.
Objetivo: Determinar el rango de concentraciones en las que el
método será usado y verificar que en dicho rango exista una
correlación lineal entre Señal Vs Concentración.

• Tenga en cuenta que se refiere al rango donde se harán las mediciones finales, no
a la concetración original de la muestra. (DILUCIONES).

Que significa linealidad? Modelo matemático que relaciona Y con X

de la forma:
2.0 Rango Lineal y de trabajo.

m = dX/dY
m, la pendiente,
expresa Cuanto
varía la señal
instrumental
cuando varía
una unidad de
concentración.
Es decir “m” es
la sensibilidad
del método
2.0 Rango Lineal y de trabajo.
2.0 Rango Lineal y de trabajo

Cómo verificar que existe una correlación lineal entre señal Vs

concentración ?

A. Realice mediciones
Concentración (ppm) Area de pico (UA)
de blancos cada uno
0 234
fortificados con una
0.1 56203
concentración 0.2 114235
diferente de Estándard 0.3 173601
certificado del analito 0.4 227168
de interés (Si no existe 0.5 284578
efecto de matriz). Si 0.6 341000
existe efecnto de 0.7 412067
matriz, use el blanco 0.8 444546
foritficado con X 0.9 499890
cantidad de matriz + 1.0 549899
estándares.
¿Cómo se determinan los
rangos de la curva de
calibración?

¿Por qué esos rangos y no

otros?

¿ Cómo se asegura que las

concentraciones de las
muestras analizadas
rutinariamente se encuentren
en el rango lineal estudiado?
2.0 Rango Lineal y de trabajo

Cómo verificar que existe una correlación lineal entre señal Vs

concentración ?

B. Con los datos obtenidos (señal Vs concentración) realice un

“análisis de mínimos cuadrados”
Análisis de resultados de prueba de linealidad.

Regresión por mínimos cuadrados

Análisis de resultados de prueba de linealidad.

Regresión por mínimos cuadrados

Análisis de resultados de prueba de linealidad.

Regresión por mínimos cuadrados: La regresión producirá

los valores de pendiente (b), intercepto (a) y r de la función
lineal que será la ecuación de trabajo.
Análisis de resultados de prueba de linealidad.

Regresión por mínimos cuadrados: La regresión producirá

también desviaciones estándar asociadas a la pendiente y el
intercepto, las cuales se usarán para determinar rangos de
confianza de cada parámetro.

Desviación Estándar Desviación Estándar Desviación Estándar

Pendiente residuales. Intercepto.
Análisis de resultados de prueba de linealidad.

Concentración (ppm) Area de pico (UA) Cómo usar Microsoft

0 234 Excel para realizar el
0.1 56203 análisis de mínimos
0.2 114235 cuadrados ?
0.3 173601
0.4 227168
0.5 284578
0.6 341000
0.7 412067
0.8 444546
0.9 499890
1.0 549899
¿ En el análisis de la
linealidad se ha estimado
los errores asociados con
cada uno de los
parámetros ajustados
(pendiente, punto de corte
con eje Y) ?
Análisis de resultados de prueba de linealidad.

Cómo saber si los linealidad es correcta luego de ajuste

por mínimos cuadrados?

• r >= 0.999
• Visualmente existe una línea recta.
• Existe homocedasticidad en la distribución de los
resíduos (la varianza de los resíduos es constrante a
todas las concentraciones).
 Guía Rápida – Rango lineal y de trabajo.

The Fitness for Porpouse of Analytical Methods, Eurachem Guide, LGC, Teddington, 1998.
3.1 Límite de detección

“ La menor concentración del analito en

una muestra que puede detectarse pero
no necesariamente cuantificarse bajo las
conficiones establecidad en la prueba.
“
Guía técnica sobre trazabilidad e incertidumbre CENAM, revisión 1,
2008

“ Es el mínimo contenido que puede

medirse con una certeza
“
estadísticamente razonable.

The Fitness for Porpouse of Analytical Methods, Eurachem Guide, LGC,

Teddington, 1998.
3.1 Límite de detección

Que significa?

Determinar los límites del ruido de la señal de fondo para saber la

cantidad mínima distinguible de analito que produce una señal
dicernible de dicho ruido
3.1 Límite de detección

Que significa?
3.1 Límite de detección

Objetivo: Determinar la mínima cantidad (concentración)

que el método puede reportar como “presente” con un
certeza estadística.

Importancia: Tener herramientas de juicio para evitar

Falsos positivos: declarar la presencia de un analito,

cuando en realiad está ausente. Error tipo I o tipo a.

Falsos negativos: declarar la ausencia de un analito

cuando en realidad está presente. Error tipo II o tipo b.

Existe un valor límite (mínimo) que corresponda a legislaciones el cual deba

ser medido?
MÉTODOS CUALITATIVOS.
MÉTODOS CUANTITATIVOS.
3.1 Límite de detección
Cómo estimo el Límite de detección (LD) ?

Mida 10 blancos de muestra 1 vez cada uno. Estime la

desviación estándar de los blancos. Use la definición y
datos de linealidad para obtener concentración a partir de
la señal media y desviación del bl.
Ensayo Area de pico (UA)
1 234
2 256
3 278
4 222
5 230
6 245 La media y la desviación estándar
7 219 del
8 210 Blanco dependen de la matriz del
9 274 blanco. EL LIMITE DE DETECCION
DEPENDE DE LA MATRIZ.
10 267
¿Está claramente
especificado cómo
determinar el límite de
detección para cada
análisis?

¿ Se hace referencia a la
evaluación de diversas
matrices para la
determinación de LD?
3.1 Límite de cuantificación.

“ La menor concentración del analito en una

muestra que puede ser determinada con
niveles aceptables de reproducibilidad,
precisión y exactitud
“
The Fitness for Porpouse of Analytical Methods, Eurachem Guide, LGC, Teddington,
1998.
3.1 Límite de cuantificación.

Se usa la mísma definición de límite de detección pero factor K cambia de valor

Yq = Y bl + kSbl
Y bl = Media de las mediciones del blanco
k = Factor numérico de acuerdo al nivel de confianza deseado
S bl = Desviación estándar de las mediciones del blanco

CV = S/ X (media) * 100
4.0 Sensibilidad.

“ Es el cambio en la respuesta de un
instrumento de medición dividido
por el correspondiente cambio del
estimulo (señal de entrada)
“
The Fitness for Porpouse of Analytical Methods, Eurachem Guide, LGC, Teddington,
1998.
4.0 Sensibilidad.

Importante establecer
diversas sensibilidades
para distintos rangos de
concentración.

Métodos más sensibles

son menos susceptibles
a variaciones (errores)
debidos a pequeñas
variaciones de la señal

Cómo se determina?
(ya se evaluó en el
proceso de validación)
METODO CUALITATIVO
5.0 Exactitud.

“
“ Es la expresión de la cercanía de un
resultado a un valor verdadero

ISO 3534-1

Objetivo: Deteminar la exactitud probable de los resultados estimando la

influencia de efectos sistemáticos y aleatorios .
5.0 Exactitud.
5.0 Exactitud.
5.1 Precisión

Precisión = Repetibilidad + Reproducibilidad

5.1.1 Repetibilidad

“ Habilidad de un instrumento de medida para

proveer resultados similares para
aplicaciones repetidas de la misma medida
bajo las mismas condiciones de medición.
“
Libro naranja IUPAC
5.1.1 Repetibilidad

Se realizan pruebas bajo condiciones de

repetibilidad:

Único analísta, un solo día, en un único

instrumento, puede ser en diferentes horas
del día.
METODO CUALITATIVO
METODO CUANTITATIVO

Cómo la evalúo? Al menos dos series de 10 blancos, cada

serie fortificada a un nivel de concentración diferente a partir de un
material de referencia. Determine la desviación estándar de cada
serie y exprésela en concentración. Determine el % CV.
0.2 ppm 0.8 ppm
Ensayo Area de pico (UA) Area de pico (UA)
1 114235 444546
2 123458 442689
3 111479 465057
4 128124 438975
5 116405 418778
6 121890 489089
7 124366 419775
8 117222 437957
9 112749 497875
10 115330 420804
5.1.1 Repetibilidad
Criterios de aceptación: CVh % /2 dentro de los límites
5.1.1 Repetibilidad

Criterios derivado de la prueba de repetibilidad: límite

de repetibilidad (r).

Sirve para establecer la diferencia máxima entre dos mediciones en

condiciones de repetibilidad

= Desviación estándar en
condiciones de repetibilidad
= t student , 95% de confianza,
valor 1.96
5.1.2 Reproducibilidad

“ Presición en condiciones donde los

resultados de los ensayos son obtenidos
con el mismo método con diferentes
operarios usando diferentes equipos. ISO
“
3534
5.1.2 Reproducibilidad
Se realizan pruebas bajo condiciones de
reproducibilidad:
Diferentes analístas, días diferentes, en diferentes
instrumentos, usando calibraciones independientes.
Cómo la evalúo? Al menos dos series de 10 blancos, cada serie
fortificada a un nivel de concentración diferente a partir de un
material de referencia. Haga el análisis de cada serie durante días
diferentes, variando analístas y equipo de medición de forma que
se produzcan 10 experimentos diferentes. Determine el promedio
de cada experimento. Determine la desviación estándar de los 10
experimentos. Determine el % CV.

0.2 ppm 0.8 ppm

Experimento Analista Día Instrumento Area de pico promedio (UA) Area de pico promedio (UA)
1 A 1 A 134235 454546
2 B 1 A 153458 432689
3 A 2 B 101479 465057
4 B 2 B 128124 438975
5 A 3 A 116405 448778
6 B 4 A 141890 489089
7 A 5 B 114366 419775
8 B 6 B 157222 457957
9 A 7 A 112749 497875
10 B 8 B 115330 420804
 5.1.2 Reproducibilidad
Criterios de aceptación: 2CVh % /3 dentro de los límites
¿ Existe un diseño
experimental en el que se
especifiquen las
condiciones de
repetibilidad y
reproducibilidad?

¿Es evidente qué variables

y en qué niveles se usaron?

¿Se establecen criterios de

aceptación?
5.0 Exactitud.
5.2 Veracidad
METODO CUALITATIVO
Sesgo
Sesgo
Recuperación
Recuperación