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1
RESUMEN
Para obtener un extracto antioxidante a partir de semillas de vid se utilizó una ex-
tracción con agua a 90ºC, durante 4 horas. La relación sólido- líquido empleada fue
de 1g de semillas enteras por 10 ml de solvente. El extracto obtenido presentaba una
concentración de 12,587 mg de fenoles totales por gramo de semillas de uva extrac-
tadas y un poder reductor de 1,290 unidades.
El deshidratado del extracto por medio del lecho de espuma permitió conservar el
poder reductor del mismo, no ocurrió lo mismo en el deshidratado por liofilizado,
donde se produjo un deterioro del poder reductor.
2
Para un mismo contenido de fenoles totales agregado al jugo de manzanas, el ex-
tracto líquido sin concentrar produjo un 28,4% de inhibición de la oxidación, mientras
que el de extracto líquido concentrado produjo un 51,5 % de inhibición de la oxida-
ción del jugo de manzanas.
3
Summary
The purpose of this study was to obtain a natural antioxidant extract from grape
seeds (Vitis vinifera L.), for food use.
Different solvents were compared for the extraction of phenolic compounds from
grape seeds, in order to obtain extracts with the maximum concentration of active
compounds, with the least degradation of antioxidant activity. Total phenolic concen-
tration in grape seeds extracts was determined using the Folin-Ciocalteu method. The
reducing power of grape seed extracts was determined using the method of Oyaizu.
Once the most appropriate solvent was selected, the extraction kinetics was ana-
lyzed in order to optimize the extraction time.
The grape seed extract was vacuum concentrated and its reducing power was
measured using the method of Oyaizu.
Both the single strength and concentrated grape seed extracts were added to ap-
ple juice. The degree of juice oxidation was assess using the Özoglu’s method.
The concentrated grape seeds extract was foam-mat and freeze dried. In both
products, the effect of the drying process on reducing power was verified.
Finally, the antioxidant activity of the concentrated grape seeds extract was com-
pared in relation to commercial antioxidants such as ascorbic acid and sulfur dioxide.
These products were added to apple juice, and the degree of juice oxidation was
measured with the Oyaizu’s method.
Statistical analysis of the data was done by one way variance (ANOVA). When
ANOVA was not appropriated for data analysis, Kruskal–Wallis test was employed. All
the statistical analyses were performed using Statgraphics plus ®4.0 software.
In order to obtain an antioxidant extract from grape seeds, water at 90ºC for 4
hours was used. The solid-liquid relation was 1 g seeds per 10 ml solvent. The con-
centration in the extract was 12,587 mg total phenol/g grape seed extracted, with a
reducing power of 1,290 units.
As a result of the extraction kinetics analysis, the extraction time was reduced
from 4 to 3 hours.
The extract was vacuum concentrated at 60ºC. The concentration process in-
creased the reducing power in the concentrated extract, as compared with the single
strength grape seeds extract. This was verified by measuring apple juice oxidation.
Total phenol concentration increased 29,57 fold, while reducing power increased
37,39 fold.
The foam mat dried extract maintained the reducing power of the original extract,
while the freeze dried extract presented loss of reducing power.
For the same concentration of total phenols added to the apple juice, the single
strength grape seeds extract produced a 28,4 % inhibition of oxidation. On the other
hand, the concentrated grape seeds extract inhibited apple juice oxidation in 51,5 %.
4
Concentrated grape seeds extract added to apple juice as antioxidant, inhibited
juice oxidation in 31,51 % in a 24 hour period. It presented a better antioxidant be-
havior than ascorbic acid, which only inhibited oxidation in 2,6 %. However, under
the same operating conditions, sulfur dioxide is better antioxidant, as it inhibited ap-
ple juice oxidation in 97,40 %.
5
AGRADECIMIENTOS
6
INDICE GENERAL
Resumen…………………………………………………………………………………………………………………. 2
Summary………………………………………………………………………………………………………………… 4
Agradecimientos…………..……………………………………………………………..…………………………. 6
Indice de capítulos…………………………………………………………………………………………………. 7
CAPÍTULO 1: CONSIDERACIONES GENERALES (ESTADO DEL ARTE)……….…… ….. 11
1.1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………………….……….. 12
1.1.1. Los compuestos fenólicos en las plantas……………………………………………………. 12
1.1.2. Estructuras de los compuestos fenólicos……………………………………………………. 12
1.1.3. Actividad biológica de los compuestos fenólicos………………………………..…….. 13
1.1.3.1. Actividad antioxidante de los fenoles de los alimentos…………………………. 15
1.1.3.2. Actividad biológica de los compuestos fenólicos de uvas y vinos…………. 18
1.1.3.3. Los compuestos fenólicos en las semillas de uva…………………………………… 21
1.1.3.4. Los efectos biológicos de extractos de semillas de uva…………………………. 23
1.1.3.4.1. In vitro………………………………………………………………………………………………….. 23
1.1.3.4.1.1. Actividad antioxidante………………………………………………………………………. 23
1.1.3.4.1.2. Actividad antirradicales libres………………………………………………………….. 23
1.1.3.4.1.3. Otras Actividades………………………………………………………………………….…. 24
1.1.3.4.2. In vivo………………………………………………………………………………………………..… 24
1.1.3.4.2.1. Actividades antioxidantes……………………………………………………………….… 24
1.1.3.4.2.2. Actividad de captura de radicales libres………………………………………….. 25
1.1.3.4.2.3. Otras Actividades………………………………………………………………………………. 25
1.1.3.5. Los efectos antioxidantes de los extractos de semillas de uva en
alimentos……………………………………………………………………………………………………………….. 28
1.1.3.6. La toxicidad y digestibilidad del extracto de semillas de uva………………… 28
1.1.4. Los procesos de extracción y los distintos solventes………………………………… 28
1.1.4.1. Procesos de obtención de extractos de semillas de vid para evaluar
su poder antioxidante……………………………………………………………………………………………. 29
1.1.4.2. Procesos de obtención de extractos de otros vegetales con poder
antioxidante………………………………………………………………………………………………………….. 30
1.1.5. Las distintas formas de medir la concentración en polifenoles…………………. 31
1.1.6. Las distintas formas de medir la capacidad antioxidante………………………….. 32
1.1.7. Relación actividad antioxidante-poder reductor…………………………………………. 33
1.1.8. Relación concentración fenólica, actividad antioxidante y poder reductor… 34
1.2. PLANTEO DEL PROBLEMA………………………………………………………………………………… 36
1.3. HIPÓTESIS……………………………………………………………………………………………………….. 36
1.3.1. Hipótesis General…………………………………………………………………………………………… 36
1.3.2. Hipótesis Particulares………………………………..…………………………………………………… 36
1.4. OBJETIVOS…………………………………………………………………………………………………………. 36
1.4.1. Objetivo General…………………………………………………………………………………………….. 36
1.4.2. Objetivos Particulares…………………………………………………………………………………….. 37
7
2.4.4. Efecto de lípidos en la determinación de polifenoles………………………………….. 44
2.4.5. Selección del solvente según su capacidad extractiva………………………………… 44
2.4.6. Determinación del poder reductor de los extractos……………………………………. 46
2.5. Conclusiones…………………………………………………………………………………………………….. 48
8
8.1. Conclusiones generales…………………………………………………………………………………….. 80
8.2. Aporte de la tesis………………………………………………………………………………………………. 80
8.3. Futuras líneas de investigación……………………………………………………………………….. 81
Capítulo 9: BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………………….………………. 82
Indice de Figuras
Figura 1. Fenol……………................................................................................ 12
Figura 2. Estructura básica de los flavonoides................................................. 12
Figura 3. Taninos........................................................................................ 13
Figura 4. Catequina y epicatequina................................................................ 22
Figura 5. Epicatequin galato…………………………………………………............................... 23
Figura 6. Curva de calibración para el método Folin Ciocalteu
de determinación de Fenoles Totales…………………………………………………………....……..… 42
Figura 7. Curva de calibración para el micrométodo Folin Ciocalteu
de determinación de Fenoles Totales……………………………………………………..……………….. 43
Figura 8. Comparación entre diferentes solventes. Fenoles totales
Extractados……………………………………………………………………………………………………….….…… 45
Figura 9. Comparación entre diferentes solventes. Poder reductor……………………….. 46
Figura 10. Cinética de extracción de Fenoles Totales. Tratamiento a 90ºC
y 60ºC ………………………………………………………………………………………………………….…..………. 52
Figura 11. Cinética de extracción de Fenoles Totales. Tratamiento a 90ºC
y 60ºC. Ajuste de líneas de tendencia………………………………………………………………………. 53
Figura 12. Velocidad de extracción de compuestos fenólicos a 90ºC
y a 60ºC …………………………………………………………………………………………………….…..…………. 55
Figura 13. Regresión lineal entre concentración fenólica y poder reductor.
para una temperatura de 60ºC, tiempo de tratamiento: 120 minutos………………..... 57
Figura 14. Regresión lineal entre concentración fenólica y poder reductor
para una temperatura de 60ºC, tiempo de tratamiento: 140 a 300 minutos………… 58
Figura 15. Regresión lineal entre concentración fenólica y poder reductor
para una temperatura de 90ºC……………………………………………………………………….…....... 60
Indice de Tablas
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Tabla 7. Cinética de extracción de compuestos fenólicos con agua a 90ºC y
a 60ºC……………………………………………………………………………………………………………………….. 51
Tabla 8. Velocidad de extracción para los tratamientos a 90ºC y a 60ºC…………….. 54
Tabla 9. Poder reductor de los compuestos fenólicos durante la extracción con
agua a 90ºC y a 60ºC…………………………………………………………………………….……………….. 55
Tabla 10. Cinética de extracción de compuestos fenólicos con agua a 60ºC y
poder reductor de los extractos obtenidos……………………………………………….………….... 56
Tabla 11. Cinética de extracción de compuestos fenólicos con agua a 60ºC y
poder reductor de los extractos obtenidos, durante 120 minutos de extrac-
ción…….…………………………………………………………………………………………………………………… 56
Tabla 12. Cinética de extracción de compuestos fenólicos con agua a 60ºC y
poder reductor de los extractos obtenidos, entre 140 y 300 minutos de extrac-
ción….…………………………………………………………………………………………………………………….. 58
Tabla 13. Fenoles totales y Poder reductor en los extractos concentrados y
sin concentrar………………………………………………………………………………………………….…… 62
Tabla 14. Medianas de las relaciones entre extracto concentrado y sin concen-
trar……….………………………………………………………………………………………………………………… 63
Tabla 15. Actividad antioxidante del extracto de semillas en jugo de manza-
nas………….……………………………………………………………………………………………………………… 67
Tabla 16. Inhibición de la oxidación del jugo de manzanas. Efecto del extracto
concentrado líquido y del extracto concentrado secado en lecho de espu-
ma………………............................................................................................ 71
Tabla 17. Inhibición de la oxidación del jugo de manzanas. Efecto del extracto
concentrado líquido y del extracto liofilizado……………………………………………………….. 72
Tabla 18. Inhibición de la oxidación del jugo de manzanas. Comparación entre el
extracto de semillas de vid y otros antioxidantes comerciales…………………….…….. 76
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CAPÍTULO 1:
CONSIDERACIONES GENERALES (ESTADO DEL ARTE)
11
1.1. INTRODUCCIÓN
Las plantas vasculares sintetizan una gran cantidad de moléculas orgánicas, como
consecuencia de su metabolismo secundario.
Los fenoles están asociados al color, las características sensoriales (sabor, astrin-
gencia, dureza), las características nutritivas y las propiedades antioxidantes de los
alimentos de origen vegetal. La característica antioxidante de los fenoles se debe a la
reactividad del grupo fenol (Robbins, 2003; Kähkönen et al, 2001).
Figura 1. Fenol
Los flavonoides son los polifenoles que poseen al menos 2 subunidades fenólicas;
los compuestos que tienen 3 o más subunidades fenólicas se denominan taninos
Robbins, 2003).
12
pirano. Estos compuestos poseen actividad antioxidante y capacidad para capturar
radicales libres (Vinson et al, 1995).
La actividad antioxidante de los distintos grupos de compuestos depende de la es-
tructura individual y del número de oxidrilos sustituyentes, así como del peso mole-
cular. En los flavonoides, esta característica se asocia con la presencia en la molécula
de grupos orto dihidroxi en el anillo B, un doble enlace entre el C2 y C3 en conjunto
con la posición 4-oxo en el anillo C, y grupos 3-5 hidroxi, y la función 4 – oxo en los
anillos A y C (Velioglu et al,1998).
Los taninos o polifenoles políméricos tienen mayor actividad antioxidante que los
fenoles monoméricos simples (Hagerman et al, 1998).
Los flavonoides, en particular, exhiben una amplia gama de efectos biológicos, in-
cluyendo actividad antibacteriana, antiviral, antinflamatoria, antialérgica, antioxidan-
te, antitrombótica y vasodilatadora (Yen et al, 1993; Siddhuraju y Becker, 2003).
13
Existe evidencia epidemiológica acerca de los beneficios para la salud del consumo
abundante de frutas y verduras en la dieta.
Las hierbas utilizadas para realzar y complementar los sabores de los alimentos
son fuentes de compuestos fenólicos; el consumo de hierbas está asociado con una
baja incidencia de cáncer y baja mortalidad por esta misma enfermedad (Wei-Zheng
and Wang, 2001).
14
1.1.3.1. Actividad antioxidante de los fenoles de los alimentos
Las frutas, especialmente las agrupadas en lengua inglesa bajo el nombre de be-
rries -Vaccinium myrtillus (arándanos), Ribes nigrum (cassis ó corintos negros), Ribes
grossularia (uvaespina ó grosella), Rubus idaeus (frambuesa), Ribes rubrum (corintos
rojos) y Fragaria ananassa (frutilla)- son una fuente importante de antioxidantes en la
dieta. En estas frutas se encuentran presentes derivados de los ácidos hidroxicinámi-
cos e hidroxibenzoicos, antocianos, flavonoles, catequinas y taninos (hidrolizables y
condensados). Muchos de estos compuestos exhiben una variedad de efectos biológi-
cos, incluyendo actividad antioxidante, antimicrobiana, antinflamatoria y acciones va-
sodilatadoras. Los extractos de las frutas antes mencionadas resultaron altamente
antioxidantes, inhibieron la formación de hidroperóxidos en metil linoleato y la oxida-
ción de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y de los liposomas. También tienen
capacidad para capturar especies reactivas del oxígeno generadas químicamente
(Kähkönen et al, 2001).
Las frutas en general, y en particular, las frutas pequeñas ó berries, contienen una
amplia gama de flavonoides y ácidos fenólicos que muestran actividad antioxidante.
Los principales subgrupos en berries y frutas son los antocianos, proantocianidinas,
flavonoles y catequinas. Los estudios sobre la actividad antioxidante han sido enfoca-
dos principalmente en uvas, en las cuales se ha verificado que inhiben la oxidación de
las lipoproteínas de baja densidad humanas (LDL) en un nivel comparable con el del
vino. El extracto de frutillas frescas ha actuado como un antioxidante 5 veces más
activo que el trolox, en un sistema artificial que genera peroxilo. Los extractos de
blackberries, corintos rojos y negros, blueberries, frambuesas negras y rojas poseen
una alta actividad como captores de radicales superóxido. Los ácidos hidroxinámicos
típicamente presentes en las frutas han demostrado inhibir la oxidación en las LDL in
vitro. Los extractos fenólicos de berries (blackberries, frambuesas, cerezas, bluebe-
rries, y frutillas) inhiben la oxidación de las LDL humanas y la oxidación de los lipo-
somas (Kähkönen et al, 1999).
15
menta con el incremento de los sustituyentes del tipo orto dihidroxi. El epigalocate-
quin-galato tiene 4 de estos grupos, y es el compuesto que mayor actividad presen-
ta.Las propiedades antioxidantes y antimutagénicas del extracto de té varían con la
intensidad de la fermentación del té durante el proceso de manufactura. Durante la
fermentación, los flavonoles de las hojas verdes del té, principalmente catequinas y
sus ésteres gálicos, sufren una polimerización oxidativa catalizada por la polifenoloxi-
dasa, que vuelve negras las hojas. El contenido inicial de catequina, se convierte en
tearubingenina y teaflavinas, que dan al té negro su característica astringencia. El té
verde contiene 30 a 42% de catequinas sobre la masa total seca, mientras que el té
negro contiene 3 al 10% y el té Oolong, semifermentado, contiene 8 al 20% de cate-
quina. Los extractos de té verde tienen fuerte acción antioxidante, debida a los com-
puestos activos catequina, epigalocatequin-galato, epicatequin-galato, epigalocatequi-
na y epicatequina. El extracto crudo de té verde tiene mayor actividad antioxidante
que una mezcla de catequina reconstituida. La actividad antioxidante de estas cate-
quinas ha sido demostrada en aceites calentados, en emulsiones de β caroteno/ lino-
leato, en ensayos de actividad de captura de radicales con iniciadores de radicales, en
tests de captura de superóxido, en oxidaciones aceleradas por el calor y suministro de
oxígeno, y en reacciones catalizadas por enzimas. Las propiedades antioxidantes pa-
recen explicar la acción antimutagénica.El té verde no fermentado tiene un poder an-
tioxidante superior al del té negro fermentado (Roedig-Penman and Gordon, 1997;
Vinson et al, 1995; Gow-Chin Yen and Hui-Yin Chen, 1995; Benzie and Szeto, 1999).
Los granos de cacao no fermentados son ricos en polifenoles, los cuales compren-
den 12 al 18% del peso seco total del grano entero. Los polifenoles presentes son ca-
tequinas, procianidinas y antocianidinas.Luego de la fermentación y el secado, los fla-
vonoides sufren una variedad de reacciones de oxidación y polimerización que origi-
nan taninos. Los fenoles del cacao tienen propiedades antioxidantes in vitro. El café
verde tiene alto contenido de polifenoles, entre ellos el ácido ferúlico y cafeico, cuya
actividad antioxidante ha sido demostrada in vitro e in vivo. El grado de tostado dis-
minuye la concentración en polifenoles. El café descafeínado no presenta diferencias
con el café sin descafeinar respecto de su poder antioxidante.La protección contra la
oxidación de las LDL no se debe a un solo compuesto, sino que es el resultado de la
acción de varios compuestos fenólicos. La composición química de las bebidas varía
grandemente: consiste en epicatequinas en el té verde, epicatequinas y taninos en el
té negro, catequinas, procianidinas y antocianinas en el cacao, y en el café hay ácido
clorogénico, ácido cafeico y melanoidinas.Café, cacao y té contienen polifenoles con
altas actividades antioxidantes (Ricchelle et al, 2001).
En hierbas aromáticas tales como Salvia, tomillo, Ginkgo biloba, menta, artemisia,
aloe, valeriana, ciboulette, diente de león, dill, lavanda, hinojo, orégano, mejorana,
melisa, perejil, romero, albahaca, laurel, sauco, coriandro, perejil, azafrán, diente de
león, manzanilla, tilo, tomillo, y vinca se estudió el poder antioxidante y la composi-
ción polifenólica. Cada hierba tiene una composición fenólica diferente, y el poder an-
tioxidante de cada uno de estos compuestos también es diferente. La actividad anti-
oxidante de los flavonoides se incrementa con el Nº de grupos hidroxilo sustituyentes
del anillo B, específicamente en el C-3’.Existe una correlación lineal positiva entre el
contenido fenólico y la capacidad antioxidante de las hierbas, en consecuencia, las
hierbas son una buena fuente potencial de antioxidantes naturales. Romero y tomillo
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presentaron mayor concentración polifenólica y mayor poder antioxidante (Proestos et
al, 2005).
Las semillas y cáscaras de trigo sarraceno, lino, semillas y cáscaras de girasol, raí-
ces de ginseng, raíces y flores de Echinacea, papas de carne blanca y púrpura, arán-
danos, cerezas, pieles de cebolla morada, raíces y aceite de rábano picante y trigo
fueron estudiadas en cuanto a su actividad antioxidante. Se encontró correlación di-
recta entre concentración fenólica y actividad antioxidante (Velioglu et al, 1998).
Moringa oleifera es un árbol nativo del NO de la India, se cultiva como cerco ver-
de. Sus frutos verdes se consumen como una verdura, se comen también las flores y
las hojas jóvenes. Una pasta de hojas se emplea como emplasto para heridas. El ex-
tracto metabólico ha demostrado tener actividad antiúlcera gástrica en ratas. El jugo
de hojas frescas posee acción antibacteriana contra Micrococcus pyogenes var. Au-
reus, Escherichia coli y Bacillus subtilis. En un ensayo en ratas alimentadas con una
dieta alta en grasas adicionada de jugo fresco de Moringa oleifera, se observó un des-
censo del nivel de colesterol en el suero, en el hígado y en el riñón. Tradicionalmente,
el ghee o manteca clarificada de leche de vaca o búfala se ha preparado con hojas de
Moringa, lo cual retarda el deterioro oxidativo del ghee, por actuar como antioxidante
natural.El poder reductor o antioxidante de los extractos de Moringa aumenta con el
aumento de concentración de polifenoles de estos extractos. Los flavonoides están
entre los más potentes antioxidantes de las plantas debido a que poseen uno ó más
de los siguientes componentes estructurales que están involucrados en la actividad
antiradical o antioxidante: un grupo orto-difenol en el anillo B, un doble enlace conju-
gado en 2-3, con una función oxo en el C4 y grupos hidroxilo en las posiciones 3 y 5
(Siddhuraju and Becker, 2003).
Los extractos crudos de frutas, hierbas, verduras, cereales y otros materiales ve-
getales ricos en fenoles están generando interés en la industria de los alimentos debi-
do a que retardan la degradación oxidativa de los lípidos, y por lo tanto mejoran la
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calidad y el valor nutricional de los alimentos. La importancia de los constituyentes
antioxidantes de los materiales vegetales en el mantenimiento de la salud y la protec-
ción contra la enfermedad coronaria y el cáncer aumenta el interés de los elaborado-
res de alimentos y de los consumidores. La tendencia se encamina hacia la prepara-
ción de alimentos con valores específicos para la salud (Käkhönen et al, 1999).
Si bien el vino ha sido consumido por el hombre desde la antigüedad, sólo a fines
de la década del 70 surge la relación entre el consumo moderado de vino y la conser-
vación de la salud. En 1978, Genevois analizó los resultados de encuestas de la Orga-
nización Mundial de la Salud (OMS) sobre las causas de mortalidad en 23 países euro-
peos y notó que el infarto de miocardio era una de las causas principales de muerte
para los hombres entre 55 y 64 años. Esta tasa de mortalidad variaba en los distintos
países, de modo que los 23 países se podían agrupar en tres clases: los países vitivi-
nícolas, Europa central y Europa del norte. Los países vitivinícolas presentaban la
tasa de mortalidad debida a infarto de miocardio más baja, luego se ubicaba Europa
central y, finalmente con la tasa más elevada, Europa del norte. En 1979, St-Léger
realizó una encuesta en 18 países desarrollados sobre los factores asociados a la mor-
talidad cardíaca, considerando unos 16 parámetros, entre ellos el consumo de vinos.
Encontró una asociación negativa entre la tasa de mortalidad por infarto de miocardio
y el consumo habitual de vino. En Francia e Italia la tasa de mortalidad fue 3 a 5 ve-
ces más baja que en Escocia e Irlanda. Los países como Bélgica ó Alemania, que con-
sumen vino, pero también cerveza y destilados, se ubicaron entre los extremos. Esto
permitió concluir que el efecto protector del vino ante el infarto de miocardio proviene
de algún constituyente diferente del alcohol. En 1982, Masquelier atribuyó los efectos
benéficos de los vinos a los procianidoles (taninos) y catequinas (Bourzeix et al,
1986).
Finalmente, Frankel estableció en 1993 en estudios in vitro, que el vino tinto in-
hibe la oxidación, catalizada por el cobre, de las lipoproteínas humanas de baja den-
sidad (LDL). Los compuestos fenólicos del vino tinto son los responsables de la acción
antioxidante, y por lo tanto del efecto protector ante la enfermedad cardiovascular
(Frankel et al, 1993).
Kanner, en 1994, estudió tres variedades de uvas y dos vinos actuando como
antioxidantes en la peroxidación de lípidos (LDL humana) in vitro ante la presencia de
catalizadores biológicos tales como mioglobina, citocromo C, ascorbato de hierro y
18
iones Cu+2(como catalizador inorgánico). Se estableció que el vino tinto inhibía la oxi-
dación en forma más eficiente que el tocoferol. Los componentes polifenólicos del
vino tinto son los responsables de la “paradoja francesa”, por medio de la prevención
de la oxidación de las LDL (Kanner et al, 1994).
Las propiedades antioxidantes del vino tinto reducen la capacidad de oxidación del
suero de la sangre y la oxidabilidad de las LDL, así como inhiben el pasaje de monoci-
tos (un tipo de leucocitos o glob. Blancos) de la sangre dentro de la pared arterial,
retardando el inicio de la aterosclerosis (Estruch, 2000).
lación fue compuesto por procianidina B4 y ácido cafeico. La menor correlación estuvo
dada por los antocianos. Esto demuestra que los fenoles contenidos en el vino en dife-
rentes concentraciones son activos en la actividad antioxidante. Al ensayar 54 vinos
franceses se concluye que la mayor capacidad antioxidante se encuentra en los vinos
tintos en la variedad Pinot noir; en los vinos blancos, Chardonnay elaborado con ma-
ceración, llega a valores semejantes a los vinos tintos. Los vinos dulces de la variedad
semillón tienen mayor poder antioxidante que los vinos secos. La ingesta de catequina
es 6 veces mayor al consumir vinos Pinot noir que al consumir vinos variedad Char-
donnay elaborados del modo clásico (Landrault et al, 2001).
19
fenólicos para retardar la aparición de tumores cancerosos. Las mayores actividades
de inhibición relativa de la oxidación de las LDL se deben a los vinos tintos provenien-
tes de maceraciones largas (Teissedre et al, 1996).
20
Se verifica que a mayor concentración de fenoles totales, mayor es la actividad
antioxidante (Baderschneider et al, 1999).
El vino tinto es una buena fuente de polifenoles y puede contener de 1000 a 4000
mg/L de estos compuestos. Las propiedades antioxidantes de los vinos tintos han si-
do correlacionadas con su contenido en flavanoles, antocianos y ácido tánico, pero
estas propiedades se correlacionan mejor con los fenoles totales que con los com-
puestos individuales. El contenido de flavanoles totales (flavanoles monoméricos: ca-
tequina y epicatequina y poliméricos: proantocianidinas) está fuertemente relacionado
con las propiedades antioxidantes de los vinos y con la captura de radicales libres
hidroxilo (Anis Arnous et al, 2001).
Los compuestos fenólicos de los vinos pueden dividirse en dos categorías: los no
flavonoides (comprenden los hidroxibenzoatos y los hidroxicinamatos) y los flavonoi-
des, que incluyen los flavonoles (quercetina, miricetina), los flavan 3 oles (catequina y
epicatequina), los polímeros de la catequina o procianidinas, y los antocianos. Colecti-
vamente, son 20 veces más abundantes en vinos tintos que en vinos blancos. En este
estudio se obtuvo una correlación positiva entre el potencial antioxidante total del vino
y el ácido gálico, la catequina y la epicatequina, así como los polifenoles totales (Mi-
nussi et al, 2003).
21
Entre los compuestos fenólicos presentes en las semillas de uva se incluyen varios
flavonoides, tales como flavan-3-ol monoméricos: (+) catequina, (-) epicatequina) y
epicatequin-3- o galato, dímeros, trímeros, tetrámeros y polímeros de hasta 15-16
unidades (procianidinas poliméricas) y ácidos fenólicos (gálico y elágíco). Pueden exis-
tir también pequeñas cantidades de galocatequinas. Los polifenoles procianidínicos
son los oligómeros de las unidades flavan -3-oles, especialmente catequina y epicate-
quina. Las procianidinas dímeras son las más simples y tienen uniones de tipo C4 – C8
entre los monómeros. Los dímeros procianidínicos más comunes son B1, B2, B3 y B4.
Estos están seguidos de los isómeros con uniones C4 – C6, tales como B5, B6, B7 y B8. B
(Castillo et al, 2000; Yusuf Yilmaz and Toledo, 2004). Todas las procianidinas aciladas
encontradas en semillas de uva son ésteres del ácido gálico. En las semillas de uva
también existen cantidades substanciales de procianidinas altamente polimerizadas;
más del 55% de las procianidinas en semillas de uva consisten en polímeros de más
de 5 unidades (Saito et al, 1998; Koga et al, 1999; Kennedy et al, 2000; Jayapra-
kasha et al ,2001; Yusuf Yilmaz et al, 2004).
En general, las semillas de las variedades tintas tienen más compuestos fenólicos
que las semillas de las variedades blancas (Fuleki and Ricardo da Silva, 1997).
22
1.1.3.4. Los efectos biológicos de extractos de semillas de uva
Los extractos de semillas de uva poseen una variedad de efectos biológicos, algu-
nos comprobados in vitro y otros in vivo, algunos en animales y otros verificados en
seres humanos.
1.1.3.4.1. In vitro
Los compuestos fenólicos capturan las especies reactivas del oxígeno, tales como
radicales anión superóxido y radicales lípidos peroxi (de Freitas et al, 1998).Las pro-
cianidinas tienen actividad de captura de radicales libres (Yamakoshi et al, 1999; Koga
et al, 1999) y de oxígeno singulete (Bagchi D. et al, 2000).
vas como captores del radical oxígeno. Los dímeros son más activos que los monóme-
ros. La presencia de esterificaciones con el ácido gálico en los monómeros incrementa
la capacidad de captura de radicales oxígeno (Ricardo Da Silva et al, 1991).
23
1.1.3.4.1.3. Otras Actividades:
Las procianidinas de semillas de Vitis vinifera son valoradas como agentes tera-
peúticos en el tratamiento de desórdenes vasculares, tales como la inestabilidad del
colágeno en la pared arterial, la localización arterial de la formación de la histamina y
la oxidación del colesterol. Poseen actividad antiinflamatoria y antihipertensiva (Cas-
tillo et al. 2000). Además estabilizan el colágeno de la pared de las arterias, inhiben la
formación localizada de la histamina en las arterias y aceleran la remoción del coleste-
rol. (Fuleki et al, 1997). Por otra parte, las procianidinas inhiben la agregación de las
plaquetas (Saito et al, 1998).
1.1.3.4.2. In vivo
24
No todos los compuestos fenólicos de las semillas tienen la misma actividad anti-
oxidante. Las procianidinas se consideran antioxidantes superiores a los monómeros.
Los extractos de semillas tienen mayor capacidad antioxidante que los extractos de
hollejos. La capacidad antioxidante del GSPE se debe a la presencia de pigmentos
poliméricos (procianidinas dímeras, trímeras y oligómeras) sumados a los monóme-
ros. Las semillas y los hollejos obtenidos como subproductos de fermentación son
buenas fuentes de antioxidantes, aún después de haber sido sometidos a un proceso
de secado con aire caliente (Yilmaz Y. R. Toledo, 2004).
25
a la mucosa estomacal debido a que capturan los radicales libres derivados del oxíge-
no o los de tipo peróxido generados.Las procianidinas presentan actividad antiúlcera
(debido a que se unen fuertemente a las proteínas) y también poseen actividad anti-
oxidante (Saito et al, 1998).
El extracto de semillas de vid induce la expresión del factor de crecimiento del en-
dotelio vascular en los keratinocytos (células de la epidermis), y esto estimula la an-
giogénesis (crecimiento de nuevos vasos sanguíneos) en las heridas en curación (Yil-
maz, Y. y R. Toledo, 2006).
Otros estudios han probado que el ES presenta actividad contra el cáncer de ma-
ma y de piel (actuando sobre la apoptosis o muerte programada de las células) (Yil-
maz, Y. y R. Toledo, 2004).
Se verificó en conejos una reducción de las tasas de infarto de miocardio por me-
dio de una suplementación de la alimentación con extracto de semillas de vid. La adi-
ción de 1% en peso de ES a la dieta redujo la aterosclerosis de la aorta sin influenciar
los perfiles de lípidos del suero en conejos (Yilmaz, Y. y R. Toledo, 2006).
26
Las proantocianidinas exhiben actividades vasodilatadoras, antiinflamatorias y
cardioprotectoras; el extracto de semillas de vid demostró actividad protectora contra
la enfermedad cardiovascular y el infarto de miocardio en ratas (Bagchi, D. et al
2000).
Los rayos X causan un alto grado de generación de radicales hidroxilo por rotura
hemolítica del agua del cuerpo o por H2O2 endógeno, formado por la reducción del
anión superóxido. El radical hidroxilo es el más citotóxico de los descriptos, con una
vida media estimada de 10-9 segundos. En los pequeños roedores sometidos a los
efectos de rayos X en todo el cuerpo, el GSE inyectado o ingerido previamente a la
exposición a los rayos X, presenta un efecto protector ante los daños causados por la
irradiación. El efecto radioprotector y, en consecuencia, la actividad anticlastogénica o
antimutagénica de los distintos tratamientos empleados se establece de acuerdo al
incremento de eritrocitos policromáticos micronucleados (MnPCE) en animales des-
pués de la irradiación (Castillo et al, 2000; Fuleki et al, 1997; Saito et al, 1998).
27
Existen antecedentes sobre el empleo de procianidinas de semillas de vid como
antioxidante en distintos productos alimentarios, tales como carne de vaca, carne de
pavo, pescado azul y aceites de algas.
El extracto de semillas de uva ha sido empleado para prolongar la vida útil del
pescado azul (Trachurus trachurus). Los análisis sensoriales revelaron que los testigos
pierden su calidad sensorial de frescura al tercer día de conservación a 4ºC; los pane-
listas identificaron claramente el olor a rancio. El pescado suplementado con prociani-
dinas conservó el olor a pescado fresco durante 7 días en las muestras tratadas con
una dosis de 50 ppm, y durante 10 días en los tratamientos con 100 ppm (Medina et
al, 2006).
28
ción sólido – líquido. Se han analizado las condiciones de extracción en semillas de vid
y en otros productos vegetales con características antioxidantes encontradas en la
bibliografía.
Darné y Madero Tamargo, 1979, trabajaron con semillas secas, luego las liofiliza-
ron a - 45ºC. Las semillas liofilizadas fueron molidas. La extracción se realizó em-
pleando un gramo de polvo, al cual le fue adicionado 10 ml de etanol y 10 ml de agua
destilada. El líquido obtenido en esta primera extracción fue tratado con 20 ml de clo-
roformo. La mezcla se centrifugó a 5000 rpm por 10 minutos y se separaron dos fa-
ses: la fase superior contiene agua, etanol, glúcidos y compuestos fenólicos. La fase
inferior contiene cloroformo, lípidos y pigmentos. No se define la temperatura de tra-
tamiento.
Saito et al., 1998, emplearon dos extractos de semillas: GSE I fue obtenido ex-
tractando las semillas con etanol al 20% (no se informa acerca de la temperatura y
tiempo de extracción); GSE II fue obtenido con agua, efectuando previamente un la-
vado de 2 horas a 60ºC y luego una extracción de 2 horas a 90ºC.
Yamaguchi et al, 1999, emplearon como extractante una solución con 20% de
etanol y 80% agua. No mencionan tiempo ni temperatura a la que se realizó la ex-
tracción.
Kennedy et al, 2000, emplearon como extractante una mezcla de dos partes de
acetona y una parte de agua, a 20ºC, por 24 horas.
29
Wren et al, 2002, realizaron la extracción a partir de semillas secas, empleando
como solvente el agua a 82ºC, durante 40 minutos.
Yilmaz y Toledo, 2004, trataron el polvo de semillas de uva con hexano para des-
grasar. El polvo fue mezclado con metanol al 70% en agua, una parte de polvo y 10
partes de solvente. La mezcla fue sonicada por 15 minutos y agitada a temperatura
ambiente por 30 minutos. Luego fue centrifugada a 4ºC a 26000 g. El extracto fue
concentrado al vacío. Yilmaz y Toledo, 2006, trabajaron de manera semejante: las
semillas fueron secadas y reducidas a polvo. La relación peso de semillas a volumen
de solvente fue de 1:10. La mezcla fue sonicada por 15 minutos, luego fue agitada
por 30 minutos a temperatura ambiente y centrifugada a 5000g por 20 minutos a
4ºC. Como solventes se emplearon etanol, metanol y acetona. Etanol al 50, 60 ó
70% en agua extrajo 28 mg de equivalentes de ácido gálico por gramo de polvo de
semillas; 60 a 70% de metanol en agua lograron un extracto de 30 mg GAE/g de se-
millas; acetona al 50% mostró una extracción de 40 mg GAE/g.
Ali Yildirim et al, 2000, emplearon flores de tilo (Tilia argentea), hojas de salvia
(Salvia triloba L.) y té negro. La extracción se realizó con agua a 100º C, con agita-
ción durante 30 minutos. La relación sólido- líquido fue 15 g de muestra seca: 300 ml
de agua.
Siddhuraju, 2002 et al, estudiaron una leguminosa poco conocida llamada co-
munmente Indian Laburnum (Cassia fistula L.). Los extractos se realizaron a partir de
corteza, hojas, flores y frutos. El material fue liofilizado y molido. Las extracciones
fueron realizadas con metanol al 90% en un extractor soxhlet durante 16 horas en el
caso de corteza, flores y frutos. En los extractos de hojas se trabajó con etanol al
90% durante 12 horas. No se menciona la temperatura de trabajo.
30
agua, metanol 80%, etanol 70% durante 3 horas, no se define la temperatura de
trabajo.
Saito et al, 1998, determinaron flavanoles totales por medio del método de la vai-
nillina, empleando la (+) catequina como referencia. El contenido de flavanos mono-
méricos se determinó por HPLC.
Kennedy et al, 2000, determinaron flavan-3-oles por medio de HPLC en fase re-
versa,y procianidinas por HPLC en fase normal.
Castillo et al, 2000, determinaron ácido gálico, (+) catequina, (-) epicatequina,y
procianidinas dímeras, trímeras y tetrámeras por medio de HPLC.
Jayaprakasha et al, 2003, determinaron Fenoles totales por medio de Folin Ciocal-
teu; y procianidinas por medio de HPLC.
Yilmaz y Toledo, 2006, determinaron fenoles totales por medio de Folin Ciocalteu y
absorbancia a 280nm, con espectrofotómetro UV.
Velioglu et al, 1998, determinaron fenoles totales por medio de Folin Ciocalteu.
Kähkönen et al, 2001, determinaron fenoles totales por medio de Folin Ciocalteu,
y los perfiles fenólicos fueron determinados por medio de HPLC.
Siddhuraju et al, 2002, determinaron fenoles totales por medio de Folin Ciocalteu.
Siddhuraju y Becker, 2003, determinaron fenoles totales por medio de Folin Cio-
calteu y flavonoides por medio de HPLC.
31
Zaporozhets et al, 2004, determinaron flavonoides totales empleando el método
espectrofotométrico basado en la formación de complejos con Aluminio III.
Castillo et al, 2000, midieron la capacidad antioxidante por medio del método de
Miller que se basa en la capacidad de diferentes sustancias para capturar el catión ra-
dical ABTS●+ (2,2’ –azinobis- 3-etil benzotiazolina-6- ácido sulfónico, sal diamonio),
comparado con un antioxidante conocido, tal como Trolox.
Velioglu et al, 1998, midieron la capacidad antioxidante por medio del método de
la decoloración del β caroteno modificado por Marco.
Ali Yildirim et al, 2000, midieron la actividad antioxidante por medio del método
del tiocianato, y el poder reductor por el método de Yen y Chen.
32
Yen et al, 2000, midieron la actividad antioxidante sobre un sistema de ácido lino-
leico, formado por la muestra, una solución de emulsión de ácido linoleico y buffer
fosfato. La mezcla de reacción fue incubada a 37ºC en la oscuridad,y el grado de oxi-
dación fue medido por el método del tiocianato (empleando etanol, tiocianato de
amonio, la muestra y cloruro ferroso). La mezcla fue homogeneizada y el valor de pe-
róxidos fue determinado por lectura a 500 nm. El porcentaje de inhibición de la pe-
roxidación del ácido linoleico fue calculado como (%) = [1 – (absorbancia de la mues-
tra a 500 nm)/ (absorbancia del control a 500 nm)] x 100. También se determinó el
poder reductor del extracto.
Yen et al (2000) citan la asociación existente entre poder reductor y actividad an-
tioxidante. Estos autores comprobaron que el poder reductor del anthrone y la alizari-
na (son polifenoles del tipo de las antraquinonas) aumentó con un aumento en la con-
centración. Determinaron que el gran poder reductor del anthrone y la alizarina se
correlaciona bien con su marcada acción antioxidante, indicando que su poder reduc-
tor contribuye a su actividad antioxidante.
Yen y Chen (1995) trabajaron en distintos tipos de té: verde (no fermentado),
semifermentado y fermentado (negro). Concluyeron que los extractos de té presenta-
ban fuerte actividad antimutagénica, actividad antioxidante, poder reductor y capaci-
dad de capturar radicales libres y oxígeno. En el té semifermentado (Oolong) se pre-
sentó la mayor actividad antimutagénica, actividad antioxidante, poder reductor y ca-
pacidad de capturar radicales libres y oxígeno, respecto del té verde y el fermentado.
33
el poder reductor de un compuesto depende de la capacidad de transferir electrones
del propio compuesto; por lo tanto, el poder reductor de un compuesto puede servir
como un indicador significativo de su potencial actividad antioxidante (Yildirim et al,
2001).
Zheng y Wang (2001) comprobaron que los flavonoides, que contienen múltiples
grupos hidroxilo, tienen mayor actividad antioxidante contra los grupos peroxilo, que
los ácidos fenólicos. También establecieron una correlación lineal positiva entre el con-
tenido fenólico y la capacidad antioxidante de distintas hierbas culinarias y medicina-
les.
34
tando una correlación estadísticamente significativa(r =0,99) entre los compuestos
fenólicos totales y el poder reducto. También establecieron correlaciones estadística-
mente significativas entre el contenido de fenoles totales y la capacidad de capturar
radicales libres por DPPH, así como entre el poder reductor y capacidad de capturar
radicales libres por DPPH. Finalmente, su conclusión fue: dado que a medida que el
contenido de fenoles totales aumenta, el poder reductor aumenta; que el poder reduc-
tor de un compuesto depende de la capacidad de transferir electrones del propio com-
puesto; por lo tanto, el poder reductor de un compuesto puede servir como un indica-
dor significativo de su potencial actividad antioxidante (Yildirim et al, 2001).
Alma et al, 2003, trabajando sobre aceites esenciales de Origanum syriacum, de-
terminaron que el poder reductor del aceite esencial de hojas de orégano aumentó a
medida que la concentración de aceite empleada fue mayor. La actividad antioxidante,
el poder reductor y la capacidad de capturar radicales dependieron de la concentra-
ción del aceite esencial, o sea del contenido de compuestos fenólicos presentes en el
aceite esencial. Estos autores concluyeron que el poder reductor y la capacidad de
capturar radicales de una sustancia pueden ser indicadores de su actividad antioxi-
dante.
Distintos autores han determinado que existe una correlación lineal positiva entre
el contenido de fenoles totales y el poder reductor. Este hecho ha sido observado en
distintos productos vegetales, como extractos de hierbas (Zheng y Wang, 2001); en
té, se ha verificado que el poder antioxidante se correlaciona fuertemente con el con-
tenido de fenoles totales (Benzie y Szeto, 1999). En vainas de maní se ha verificado
también que la actividad antioxidante aumenta a medida que aumenta el contenido
fenólico de los extractos (Yen et al, 1993). Asimismo, en vinos, se ha comprobado que
la capacidad antioxidante es directamente proporcional a la concentración fenólica de
los mismos (Fuhrman et al, 2001). Si bien, otros autores sostienen que la actividad
antioxidante de un extracto no puede predecirse en base a su concentración fenólica
(Kähkönen et al, 1999).
Al comparar los resultados de los distintos autores, debe considerarse que la efi-
ciencia de los antioxidantes depende fuertemente de las condiciones de oxidación y
del sustrato oxidable presente. Kähkönen et al, 1999, trabajaron empleando el méto-
do del metil linoleato, mientras que Siddhuraju et al (2003) empleó el método del
tiocianato y además utilizó la oxidación de liposomas, midiendo sustancias reactivas
del ácido tiobarbitúrico (TBARS). Yen y Chen (1995), Yen et al (2000), Yildirim et al
(2000), emplearon el método del tiocianato. Zheng y Wang (2001) emplearon para
determinar la actividad antioxidante el método de la capacidad de absorber radicales
oxígeno (ORAC). Benzie y Szeto (1999), desarrollaron un método para medir la capa-
cidad de reducir el hierro férrico del plasma (FRAP test) como medida del poder anti-
oxidante. Fuhrman et al (2001) emplearon la capacidad de capturar radicales libres
35
empleando el análisis de 1,1 difenil 2 picrilhidracilo (DPPH) y la oxidación de las LDL
(Lipoproteínas de baja densidad) humanas como medida de la capacidad antioxidante.
Existen experiencias sobre la actividad biológica in vivo e in vitro del extracto de semi-
llas de uva. Como así también estudios sobre el uso de extracto de semillas de uva
como antioxidante en alimentos de origen animal. Sin embargo, no existen antece-
dentes sobre el uso del extracto de semillas de uva como antioxidante en alimentos
de origen vegetal.
Puesto que los compuestos responsables de la actividad biológica de las uvas y los
vinos son los polifenoles, y dado que el 63% de los fenoles totales de las variedades
tintas se encuentran en las semillas, se seleccionó como objeto de estudio la semilla
de la vid.
Las semillas de vid son un subproducto de la elaboración de vino tinto, cuyo destino
final suele ser la obtención de aceite ó bien su derivación, junto con los orujos, al pro-
ceso de extracción de ácido tartárico y destilación para la obtención de alcohol etílico.
Por todo lo expuesto, se propone investigar la factibilidad de obtener un extracto de
semillas de vid con características antioxidantes, y evaluar su empleo como antioxi-
dante en la elaboración de alimentos de origen vegetal.
1.3. HIPÓTESIS
1.4. OBJETIVOS
36
Obtener un extracto de semillas de vid de elevada actividad antioxidante, para su
aplicación en productos alimentarios de origen vegetal.
37
CAPÍTULO 2:
OBTENCIÓN DE UN EXTRACTO DE SEMILLAS DE UVA
38
2.1. Hipótesis
2.2. Objetivos
Las semillas fueron obtenidas al momento de realizar el descube de los vinos tin-
tos, por lo tanto, fueron sometidas a los procesos de maceración y fermentación alco-
hólica, en forma previa a su utilización.
A partir de esta población, se extrajeron al azar las diferentes muestras, sobre las
que se realizó la extracción. Cada ensayo se realizó por cuadruplicado; esto es, se ex-
trajeron 4 muestras para cada solvente estudiado.
Con el objeto de economizar drogas y así poder realizar un mayor número de de-
terminaciones, se adaptó un micrométodo. Para ello se compararon los datos de feno-
les totales obtenidos por el método original, con el mismo método empleando la cuar-
ta parte de todos los reactivos. El método se detalla en al Apéndice.
39
muestras de extractos desgrasadas y sin desgrasar. El proceso de remoción de las
sustancias liposolubles se realizó empleando n-hexano; la proporción empleada fue de
2,5 ml de n-hexano cada 5 ml de extracto acuoso de semillas (Castillo et al, 2000).
Los ensayos se hicieron por cuadruplicado, empleando tubos de vidrio con tapa, de 10
ml de capacidad.
40
En la Tabla Nº 1 se presentan los valores de Densidad Óptica a 765 nm corres-
pondientes a las distintas concentraciones de ácido gálico, las mediciones se realiza-
ron por cuadruplicado. Cada valor representa la media aritmética de 4 repeticiones.
41
Curva de calibración para el método Folin Ciocalteu
(X 1000)
1
0,6
0,4
0,2
0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5
DO 765 nm
42
Como resultado del mencionado análisis se obtuvo la siguiente curva de ajuste:
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5
DO 765 nm
Figura 7. Curva de calibración para el micrométodo Folin Ciocalteu de determinación
de fenoles totales. La concentración se expresa en mg/L de ácido gálico.
43
El análisis de la varianza indicó que no existen diferencias significativas (Prueba de
Tukey, para un nivel de confianza del 95%) entre el análisis de Polifenoles totales por
medio del reactivo de Folin Ciocalteu en forma de macrométodo, respecto del mismo
método, empleando micro volúmenes. Por lo tanto, pueden emplearse en forma indis-
tinta el macro o el micro método Folin Ciocalteu. Esto permite emplear menor volu-
men de reactivo, resultando más económico el análisis, lo que permite mayor número
de repeticiones.
44
En la tabla Nº 5 se presentan los resultados de este ensayo.
16
14
materia seca)
12
10
8
6
4
2
0
Agua a 90ºC Metanol 70% Acetona 75% Etanol 20% 30ºC
30ºC 30ºC
Tratamientos
45
tes que mayores extracciones lograron fueron el agua y la acetona, se prefiere el em-
pleo de agua como extractante por ser más económico, y porque su uso futuro será
como aditivo para alimentos. Si el solvente seleccionado fuese acetona, debería elimi-
narse posteriormente del extracto.
Una vez obtenidos los extractos provenientes de los distintos tratamientos de ex-
tracción, y conocida su concentración fenólica, se procedió a determinar el poder re-
ductor de los extractos. El poder reductor es un indicio de la capacidad antioxidante
del extracto (Yildirim et al, 2001; Alma et al, 2003).
Poder reductor
Tratamientos(1) (DO 700 nm)(2)
Agua a 90ºC 1,290 a(3)± 0,015
Metanol 70% a 30ºC 0,818 b ± 0,053.
Acetona 75% a 30ºC 1,399 a ± 0,019 .
Etanol 20% a 30ºC 0,584 c ± 0,034.
(1)
Tiempo de tratamiento 4 horas
(2)
Cada valor representa la media de 4 repeticiones ± la desviación típica
(3)
Letras distintas indican diferencias entre las medianas en la prueba de
Kruskal-Wallis
1,6
1,4
Poder reductor
(DO 700 nm)
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Agua a 90ºC Metanol 70% Acetona 75% Etanol 20%
30ºC 30ºC 30ºC
Tratamientos
Figura 9. Comparación entre diferentes solventes. Poder reductor (DO 700 nm)
46
El método analítico empleado determina polifenoles totales, pero no es capaz de
discriminar dentro de este gran grupo de compuestos. Para una misma concentración
de fenoles totales, pueden existir distintas concentraciones de ácidos cinámicos y ben-
zoicos, antocianos, catequinas, taninos y flavanoides. Cada uno de estos grupos fenó-
licos se comporta en forma diferente respecto a su poder reductor. Landrault et al
(2001), establecieron una relación entre la capacidad antioxidante (determinada por
el método Randox, que se basa en la producción de un radical coloreado a partir del
2,2’ azino-di-3 etil- benzotiazoline sulfonato ATBS) y el contenido de fenoles totales
en vinos, con un coeficiente de correlación r = 0,959. La concentración de los com-
puestos fenólicos en forma individual también fue correlacionada con la actividad anti-
oxidante. El coeficiente de correlación más alto que encontraron estos autores fue
r=0,83, para el ácido gálico; procianidina B3 r=0,73; epicatequina + catequina
r=0,705; epicatequina r= 0,67; catequina r=0,66; ácido caftárico r=0,64; procianidi-
na B1 y B2 r = 0,63 – 0,61; procianidina B4 y ácido cafeico r= 0,36-0,35 y antocianos
B
r=< 0,30. Frankel et al, 1995, estudiaron la actividad antioxidante de los vinos sobre
la inhibición de la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad humanas. Estos au-
tores encontraron que la actividad antioxidante se correlaciona con el contenido de
polifenoles totales en el vino r= 0,94; en cuanto a los fenoles individuales, ácido gáli-
co (r= 0,92), catequina (r= 0,76), miricetina (r= 0,70), quercetina (r= 0,68), ácido
cafeico (r= 0,63), rutina(r= 0,50), epicatequina(r= 0,45), cianidina(r= 0,43), y mal-
vidina 3 glucósido(r= 0,38). Fuhrman et al (2001), sostienen que los distintos polife-
noles poseen diferentes capacidades antioxidantes, las cuales están relacionadas con
sus estructuras químicas.
Por lo tanto, para una misma concentración de fenoles totales, pueden obtenerse
diferentes valores de poder reductor en un extracto, dependiendo de cuáles grupos
fenólicos se han extraído. Esta situación puede observarse cuando se comparan los
extractos obtenidos empleando como solventes agua y acetona. El agua extrae mayor
cantidad de polifenoles totales que la acetona, pero el poder reductor del extracto lo-
grado con acetona es mayor que el poder reductor del extracto acuoso.
Por tal motivo, el tratamiento más adecuado para el objetivo buscado es el agua a
90ºC. Se verifica la relación que existe entre poder reductor y concentración de poli-
fenoles (Yen et al, 1993; Yen et al, 2000; Benzie y Szeto, 1999; Yildirim et al, 2000;
Yildirim et al, 2001; Alma et al, 2003). Los extractos que presentaron menor concen-
tración fenólica, también registraron bajos poderes reductores, mientras que los tra-
tamientos que generaron extractos más concentrados en fenoles totales, presentaron
mayor poder reductor.
47
Analizando los resultados experimentales obtenidos, se observa que los métodos
de extracción de fenoles de las semillas afectan significativamente tanto la concentra-
ción fenólica, como el poder antioxidante o reductor del extracto. Esto coincide con lo
observado por otros autores en diferentes materiales vegetales. Ki Won Lee et al
(2003) trabajando sobre polvo de cacao, lograron extractos de compuestos fenólicos
más concentrados empleando como solvente al metanol, que empleando agua como
extractante. Kähkönen et al (2001), utilizaron diferentes solventes con manzanas y
bayas. Estos autores encontraron que la extracción de fenoles empleando solución
acuosa de acetona es superior a la lograda por la solución acuosa de metanol. Los ex-
tractos de bayas y manzanas empleando mezclas de acetona-agua y de metanol-agua
como solventes muestran alta actividad antioxidante, pero los extractos de bayas ob-
tenidos empleando solamente agua, eran también antioxidantes muy activos, a pesar
de su menor contenido en fenoles totales. Cabe mencionar que ellos emplearon agua
a temperatura ambiente 20ºC y a temperatura de ebullición. Kähkönen et al (2001)
explican esta situación considerando la actividad enzimática de la polifenoloxidasa.
Sostienen que la actividad de hidroxilación de la polifenoloxidasa probablemente per-
dura durante la extracción con agua a 20ºC, lo cual puede reducir el contenido fenóli-
co en el extracto. El tratamiento de extracción con agua a ebullición es mucho más
drástico para muchos fenoles lábiles, pero la temperatura inactiva las enzimas, y por
lo tanto genera extractos altamente activos como antioxidantes. Los resultados en los
extractos de bayas y manzanas producidos empleando agua caliente demuestran que
es posible preparar extractos muy activos, con altos contenidos fenólicos sin el em-
pleo de solventes orgánicos, los cuáles pueden ser problemáticos en las industrias de
los alimentos y de los medicamentos.
Los datos de extracción conseguidos en este ensayo también son coincidentes con
los de otros investigadores, en cuanto al escaso efecto del alcohol etílico sobre la ex-
tracción de los compuestos fenólicos de las semillas, así como también al efecto de las
mayores temperaturas en la mayor intensidad de extracción (Oszmianski et al.,
1986). Experimentando con polvo de semillas de Vitis rotundifolia, cv Muscadinea,
Yilmaz et al (2006) encontraron que la extracción de fenoles con una mezcla acuosa
de 50 o 75% de acetona fue superior a la extracción realizada con mezclas acuosas de
etanol al 60% ó metanol al 70%.
2.5. Conclusiones
48
El Agua a 90ºC es el solvente que proporcionó una mayor extracción de polifeno-
les, por lo tanto se empleará para la obtención compuestos fenólicos a partir de semi-
llas de vid.
Si bien durante 4 horas de extracción, el agua a 90ºC produjo una mayor extrac-
ción de fenoles que la acetona al 75% a 30ºC, el poder reductor de ambos extractos
no presentó diferencias estadísticamente significativas. Esto permitiría concluir que no
todos los fenoles extractados con el agua a 90ºC presentan poder reductor.
49
CAPÍTULO 3:
CINÉTICA DE EXTRACCIÓN DE FENOLES TOTALES A DISTINTAS
TEMPERATURAS.
SELECCIÓN DEL TIEMPO ÓPTIMO DE TRATAMIENTO
50
3.1. Hipótesis
3.2. Objetivos
51
En la Figura 10 se representa la cinética de extracción de fenoles a 60ºC y
90ºC
14
12
Fenoles totales (mg/g)
10
0
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo (minutos)
Fenoles totales extraídos a 60ºC mg/g Fenoles totales extraídos a 90ºC mg/g
Las cantidades extraídas en el tiempo de 300 minutos son: 13,012 mg/g de ma-
teria seca para el tratamiento a 90ºC y 2,615 mg/g de materia seca para el trata-
miento a 60ºC, lo que representa sólo un 20,09% de la concentración lograda con el
tratamiento a 90ºC.
Los resultados obtenidos indican que una mayor temperatura favorece una ma-
yor extracción fenólica. Otros autores obtuvieron resultados análogos. Oszmianski
et al, en 1986, trabajó con maceraciones de semillas de vid en soluciones acuosas
52
ácidas. Se trató de asimilar las condiciones de trabajo a las de una vinificación in-
dustrial, por eso las temperaturas empleadas fueron 20ºC y 35ºC. La extracción
fenólica fue más intensa a 35ºC que a 20ºC.
14
12
Fenoles totales (mg/g)
2
10 y = -0,0001x + 0,0597x + 3,8257
2
R = 0,9739
8
6
2
y = -5E-06x + 0,0086x + 0,4774
4 2
R = 0,9942
2
0
0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo (minutos)
Fenoles totales extraídos a 60ºC mg/g Fenoles totales extraídos a 90ºC mg/g
Polinómica (Fenoles totales extraídos a 90ºC mg/g) Polinómica (Fenoles totales extraídos a 60ºC mg/g)
R2= 0,9739
53
Donde:
Y = mg de fenoles totales/ g de materia seca
X = tiempo de extracción en minutos
Si se aplica derivada respecto del tiempo se obtiene la velocidad, que está dada
por la siguiente ecuación:
R2= 0,9942
Si se aplica derivada respecto del tiempo se obtiene la velocidad, que estará da-
da por la siguiente ecuación:
54
En la Figura 12, se grafican las velocidades a 60ºC y a 90ºC.
0,06
0,05
0,04
Velocidad
0,03
0,02
0,01
0
-0,01 0 50 100 150 200 250 300 350
Tiempo
55
Analizando el poder reductor de los extractos obtenidos a 60ºC y a 90ºC, se ob-
servan dos comportamientos diferentes: En la extracción a 60ºC, el máximo poder
reductor se obtiene a los 120 minutos de tratamiento. A partir de este punto el po-
der reductor disminuye, si bien la concentración fenólica sigue aumentando. En la
extracción a 90ºC, el poder reductor aumenta en forma continua a medida que au-
menta la concentración fenólica.
Tabla Nº 10. Cinética de extracción de compuestos fenólicos con agua a 60ºC y po-
der reductor de los extractos obtenidos
En la tabla Nº11 se presentan los datos de fenoles totales y poder reductor fran-
cionados para los primeros 120 minutos de extracción con agua a 60ºC.
Tabla Nº 11. Cinética de extracción de compuestos fenólicos con agua a 60ºC y po-
der reductor de los extractos obtenidos, durante 120 minutos de extracción.
56
En la figura 13 se grafican los datos de la tabla Nº 11, y se presenta la función
que vincula las variables fenoles totales y poder reductor para los 120 minutos de
extracción a 60ºC.
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 0,5 1 1,5
Fenoles totales mg/g
Figura 13. Regresión lineal entre concentración fenólica y poder reductor para una
temperatura de extracción de 60ºC, tiempo de tratamiento 120 minutos.
Para los primeros 120 minutos de extracción a 60ºC se obtuvo la siguiente ecua-
ción:
Y = 0,4935 + 0,2804 X
R2= 0,9335
Donde:
Y = Poder reductor (DO 700 nm)
X = Fenoles totales (mg / g de materia seca)
57
Tabla Nº 12. Cinética de extracción de compuestos fenólicos con agua a 60ºC y po-
der reductor de los extractos obtenidos, para los tiempos de extracción entre 140 y
300 minutos.
1
Poder reductor
(DO 700 nm)
0,8
0,6
0,4
y = -0,5072x + 1,6642
0,2
R2 = 0,9074
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Fenoles totales mg/g
Figura 14. Regresión lineal entre concentración fenólica y poder reductor para una
temperatura de extracción de 60ºC, tiempo de tratamiento: 140 minutos a 300 mi-
nutos.
Para tiempo de extracción entre 140 y 300 minutos de extracción a 60ºC se ob-
tuvo la siguiente ecuación:
Y = 1,6642 - 0,5072 X
R2= 0,9074
Donde:
Y = Poder reductor (DO 700 nm)
X = Fenoles totales (mg / g de materia seca)
58
En este segundo periodo de extracción, se puede explicar en un 90% la variabi-
lidad del poder reductor a través de la concentración fenólica. A medida que aumen-
ta la concentración fenólica, disminuye el poder reductor. La pendiente de la curva
es negativa. Puede suponerse que coexisten dos fenómenos: si bien la concentra-
ción de fenoles sigue aumentando en forma leve pero sostenida, se está producien-
do simultáneamente una modificación química de los fenoles extraídos, que se refle-
jada en una pérdida del poder reductor.
Los datos obtenidos en la cinética a 90ºC (fenoles totales y poder reductor, Ta-
blas Nº7 y Nº9) fueron sometidos a un análisis estadístico de regresión simple li-
59
neal, con el objeto de obtener la ecuación que vincula las dos variables. Esta función
se grafica en la figura 15.
2 y = 0,1415x + 0,0568
Poder reductor (DO 700 nm)
R2 = 1
1,5
0,5
0
0 2 4 6 8 10 12 14
Fenoles Totales (mg/g MS)
Figura 15. Regresión lineal entre concentración fenólica y poder reductor para una
temperatura de extracción de 90ºC
3.5. Conclusiones
Es posible reducir el tiempo de tratamiento, pero no es conveniente reducir la
temperatura de tratamiento.
En base a los resultados obtenidos, se decide seleccionar como temperatura de
extracción 90ºC, empleando como solvente el agua. Se establece como tiempo de
tratamiento 3 horas, ya que el incremento en la extracción de fenoles no es signifi-
cativo luego de este lapso de tiempo. Se establece una relación directa entre la
concentración fenólica y el poder reductor.
60
CAPÍTULO 4:
CONCENTRACIÓN DEL EXTRACTO
61
4.1. Hipótesis
El extracto obtenido conserva sus características antioxidantes después de ser
sometido a un proceso de concentración al vacío.
4.2. Objetivos
Los datos fueron procesados por medio del análisis de la varianza, con el pro-
grama Statgraphics plus 4.0®.Si los datos siguen una distribución normal y existe
homogeneidad de varianzas, se aplicará el análisis de la varianza; si los datos no
responden a una distribución normal ó las varianzas no son homogéneas, se aplica-
rá estadística no paramétrica utilizando la prueba de Kruskal – Wallis.
Tabla Nº 13. Fenoles totales (mg/L de extracto) y poder reductor (DO a 700 nm) en los
extractos sin concentrar y concentrado
(1)
Cada valor representa la media de 4 repeticiones ± la desviación standard
(2)
Los valores seguidos por letras diferentes son estadísticamente diferentes
62
consecuencia, se aplicó la prueba de Kruskal- Wallis, que es no paramétrica y com-
para las medianas de los tratamientos en lugar de las medias (cómo lo hace el aná-
lisis de la varianza).
Tabla Nº 14: Medianas de las relaciones entre extracto concentrado y extracto sin
concentrar
(1)
Cada valor representa la mediana de 4 repeticiones
(2)
Los valores seguidos por letras diferentes son estadísticamente diferentes
Una explicación para este fenómeno puede encontrarse en los trabajos de Ar-
nous et al, 2001; Yamaguchi et al, 1999; Saito et al, 1998 y Rice-Evans et al, 1995.
Según Arnous et al, 2001, la actividad antioxidante (reductora) de los proantocia-
nidinas depende del largo de la cadena de oligómeros; los monómeros y los dímeros
63
inhiben la oxidación de las LDL(lipoproteínas de baja densidad) de forma más efi-
ciente que los hexámeros, mientras que la inhibición del anión superóxido tiende a
incrementarse a medida que el grado de polimerización aumenta.
Saito et al, 1998, verificaron que el monómero (+) catequina no inhibe la for-
mación de úlceras, pero los oligómeros de más de tres unidades de (+) catequina
presentan una fuerte actividad de protección ante la agresión a la mucosa estoma-
cal. La capacidad de inhibir la formación de úlceras se ha ensayado en ratas provo-
cando las lesiones con solución de ClH / Etanol.
4.5. Conclusiones
64
CAPÍTULO 5:
EMPLEO DEL EXTRACTO DE SEMILLAS EN UN SISTEMA REAL SUJETO A
OXIDACIÓN
65
5.1. Hipótesis
5.2. Objetivos
5.3. Introducción
66
Al jugo de manzanas obtenido se le hizo una lectura de densidad óptica a 420
nm en forma inmediata, de modo de conocer el color inicial del jugo, antes del de-
sarrollo de la oxidación.
Los tratamientos efectuados fueron tres: testigo (jugo de manzanas sin agrega-
dos), extracto no concentrado y extracto concentrado.
Las dosis de fenoles totales contenidas en el extracto a emplear se selecciona-
ron en base a ensayos previos. La dosis de extracto a emplear se determinó por vo-
lumen; se decidió agregar 20 mL de extracto no concentrado a 80 mL de jugo, o
sea un 20% de extracto no concentrado. Dado que el extracto contenía 1143,2 mg
de fenoles totales por litro de extracto, en 20 mL de extracto, había 22,86 mg de
fenoles totales. El extracto concentrado tenía una concentración de 36370,7 mg de
fenoles totales por litro. Por lo tanto, 22,86 mg de fenoles totales se encuentran en
0,6286 mL (aprox. 629µL). El extracto concentrado fue reconstituido con agua des-
tilada al volumen empleado de extracto sin concentrar (20 mL). Al testigo (ó trata-
miento sin antioxidante) le fueron agregados 20 ml de agua.
Los datos fueron procesados por medio del análisis de la varianza, con el pro-
grama Statgraphics plus 4.0®
Inhibición (%) = [(Δ A 420 nm testigo - Δ A 420 nm tratamiento) X 100] / Δ A 420 nm testigo
Donde Δ A 420 nm = diferencia entre lectura final e inicial
67
Inhibición (%) = {[(3,977 – 1,659) – (3,486 – 1,659)] X 100} / (3,977 –
1,659)
Inhibición (%) = 28,4 %
Estos autores han demostrado que la velocidad del consumo de oxígeno del jugo
de manzanas no se correlaciona con la actividad de la polifenoloxidasa del mismo.
La velocidad de reacción decrece más rápido que la concentración del sustrato fenó-
lico. Estas observaciones llevaron a demostrar que la PPO es inhibida por las procia-
nidinas naturales del jugo y oxidadas, así como por los productos de la oxidación del
ácido cafeoilquínico y de la (-) epicatequina. El porcentaje de inhibición de la PPO
aumenta con el peso molecular de las procianidinas (Le Bourvellec et al, 2004).
La PPO es inhibida por las procianidinas del jugo de manzanas, y esta inhibición
es mayor a medida que el polímero de catequina es más grande. Por lo tanto, al
agregar el extracto de semillas se están agregando más procianidinas (si bien son
de distinto origen vegetal), por tanto se está actuando sobre la PPO. Por otra parte,
el extracto concentrado contendría polímeros de mayor peso molecular que el ex-
tracto no concentrado. Por ello, la inhibición de la oxidación debida al extracto líqui-
do sin concentrar es de un 28,4%, mientras que la inhibición de la oxidación del ju-
go de manzanas debida al extracto líquido concentrado es de un 51,5 %, para una
misma concentración de fenoles totales adicionados.
5.6. Conclusiones
68
CAPÍTULO 6:
PROCESAMIENTO DEL EXTRACTO CONCENTRADO: SECADO EN LECHO DE
ESPUMA Y LIOFILIZADO
69
6.1. Hipótesis
El extracto obtenido conserva sus características antioxidantes después de ser
sometido a un proceso de secado en lecho de espuma.
6.2. Objetivos
Para realizar este ensayo se realizó una concentración más intensa del extracto
de modo de obtener 186.254,6 mg /L de fenoles totales.
70
densidad óptica a 420 nm (ver Apéndice). El tiempo de tratamiento fue 24 horas, a
20ºC de temperatura.
6.3.2. Liofilización
Los datos fueron procesados por medio del análisis de la varianza, con el pro-
grama Statgraphics plus 4.0®
Este ensayo se realizó sobre jugo fresco de manzanas. El color inicial del jugo de
manzanas recién obtenido fue 1,26.
En la tabla Nº 16 se presentan los datos obtenidos en este ensayo.
Tabla N º16. Inhibición de la oxidación del jugo de manzanas. Efecto del extracto
concentrado líquido y el extracto secado en lecho de espuma.
71
Se calculó la inhibición de la oxidación, de acuerdo a la siguiente fórmula:
Inhibición (%) = [(Δ A 420 nm testigo - Δ A 420 nm tratamiento) X 100] / Δ A 420 nm testigo
Donde Δ A 420 nm = diferencia entre lectura final e inicial
Este ensayo se realizó sobre jugo fresco de manzanas. El color inicial del jugo de
manzanas recién obtenido fue 1,587.
En la tabla Nº 17 se presentan los datos obtenidos en este ensayo.
Tabla Nº 17. Inhibición de la oxidación del jugo de manzanas. Efecto del extracto
concentrado líquido y del extracto liofilizado
Inhibición (%) = [(Δ A 420 nm testigo -ΔA 420 nm tratamiento) X 100] / Δ A 420 nm testigo
Inhibición (%) = [(Δ A 420 nm testigo -ΔA 420 nm Extracto líquido cc) X 100] / Δ A 420 nm testigo
72
Inhibición (%) = {[(4,208 – 1,587) – (3,396 – 1,587)] X 100} / (4,208 –
1,587)
Inhibición (%) = 30,98 %
Inhibición (%) = [(Δ A 420 nm testigo -ΔA 420 nm Ext. liofilizado) X 100] / ΔA 420 nm testigo
73
nivel de lípidos peroxidados fue mayor en el producto liofilizado que en el deshidra-
tado a baja temperatura y vacío.
6.5. Conclusiones
74
CAPÍTULO 7:
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO
LÍQUIDO CONCENTRADO DE SEMILLAS DE VID.
INHIBICIÓN DE LA OXIDACIÓN DEL JUGO DE MANZANAS EN COMPARA-
CIÓN CON ANTIOXIDANTES COMERCIALES.
75
7.1. Hipótesis
7.2. Objetivos
76
No fue posible usar el análisis de la varianza, debido a que no se cumple el su-
puesto que obliga a la homogeneidad de varianzas de los distintos tratamientos, los
datos no responden a una distribución normal, y por lo tanto, no es correcto em-
plear el análisis de la Varianza.
Inhibición (%) = [(Δ A 420 nm testigo -ΔA 420 nm tratamiento) X 100] / Δ A 420 nm testigo
77
favorece especialmente al tratamiento con dióxido de azufre. Esta actividad decolo-
rante del producto agregado como antioxidante ha sido observad también por Özo-
glu y Bayindirli (2002), empleando L- Cisteína. Pero debe agregarse que, si bien el
dióxido de azufre y sus derivados son compuestos altamente efectivos para prevenir
el pardeamiento, pueden ser negativos para la salud humana, especialmente en las
personas asmáticas (Mi Soon Jang et al, 2002).
El ácido ascórbico solo produce una inhibición de la oxidación del 2,60%, no pre-
sentando diferencias estadísticamente significativas con el testigo. El ácido ascórbi-
co ha sido superado por el extracto de semillas de vid en cuanto a su comporta-
miento antioxidante. Esto coincide con los trabajos de Siddhuraju et al (2003),
quienes encontraron que el extracto fenólico de hojas de Moringa oleifera Lam in-
hibió la peroxidación en un sistema de ácido linoleico de forma más eficaz que el
ácido ascórbico. Esto puede deberse a que, dependiendo de las condiciones, el ácido
ascórbico puede actuar como antioxidante o prooxidante. También puede ocurrir
que el efecto del ácido ascórbico es temporario, ya que en dosis de 1,8 mM (1,8 mM
por litro de solución, en consecuencia 0,18 mM por 100 ml de muestra) el efecto
dura alrededor de 4 horas, según Özoglu et al (2002). En este ensayo, el tiempo de
tratamiento fue de 24 horas.
7.5. Conclusiones
78
CAPÍTULO 8:
CONCLUSIONES GENERALES.
FUTURAS LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN
79
8.1. Conclusiones generales
Este trabajo es el primer estudio sobre las semillas de la vid que se realiza en
Argentina, que comprende su composición fenólica y sus posibilidades como origen
de agentes antioxidantes.
80
Debe agregarse que, como producto de esta tesis, se ha iniciado el trámite P -
070104751, con fecha 26/10/07 ante el INPI (Instituto Nacional de la Propiedad In-
dustrial) para la obtención de la patente de invención correspondiente.
A partir del conocimiento originado en esta tesis, quedan abiertas diferentes op-
ciones de investigación.
Con respecto a las actividades biológicas del extracto, debe evaluarse la presen-
cia de actividad antimicrobiana del extracto, ante diferentes grupos bacterianos y
virales de interés. También es posible explorar los efectos terapéuticos en el ser
humano de este extracto, ya sea desde un punto de vista general, empleándolo co-
mo suplemento dietario, o bien desde un punto de vista específico, como enjuague
bucal ó bien como crema cicatrizante.
81
CAPÍTULO 9: BIBLIOGRAFÍA
82
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CAPÍTULO 10: APÉNDICE
91
10.1. MÉTODO FOLIN CIOCALTEU
Los compuestos fenólicos del vino son oxidados por el reactivo de Folin- Ciocal-
teu. Este reactivo contiene una mezcla de ácido fosfo-túngstico (H3PW12O40) y el
ácido fosfomolíbdico (H3PMo12O40),que se reduce por oxidación de los fenoles del
vino, originando óxidos de tungsteno (W8O23) y de molibdeno (Mo8O23), de color
azul.
Material
Matraz aforado de 100 ml.
Espectrofotómetro (765nm)
Cubeta de vidrio de 1 cm de recorrido óptico.
Pipetas de 1, 5, 20 y 50 mL.
Reactivos
El color final del reactivo debe ser amarillo. No debe haber tonos verdes. Para
reoxidar soluciones envejecidas de reactivo de Folin Ciocalteu, que tenga color azul,
verde o naranja, se agregan algunas gotas de bromo, y se lleva a ebullición bajo
campana.
Modo de trabajo
a. Vino blanco
92
Se agita el matraz para homogeneizar, se espera 30 min para estabilizar la re-
acción y se mide la absorbancia a 765 nm con una cubeta de 1 cm de paso óptico,
frente a un blanco preparado con agua destilada.
b. Vino tinto
Se debe trabajar igual que en el caso del vino blanco, pero diluyendo la muestra
5 veces con agua destilada.
Cálculos
a) Vino blanco
Índice de Folin-Ciocalteu = A765 x 20
b) Vino tinto
Índice de Folin-Ciocalteu = A765 x 100
Los valores más habituales del índice Folin-Ciocalteu para vino blanco son 3-5,
5-10 para rosados y de 20-50 para tintos.
Para expresar los fenoles totales en mg/L de ácido gálico debe construirse una
curva de calibración empleando concentraciones crecientes de ácido gálico, y luego
debe obtenerse la ecuación de regresión, que vincule concentraciones y densidades
ópticas.
Notas suplementarias:
1. Este método no es específico y mide el número de –OH (Grupos fenólicos po-
tencialmente oxidables) presentes en la muestra. Diferentes taninos darán diferen-
tes respuestas. Los valores obtenidos se expresan en GAE, equivalentes en ácido
gálico, si la curva de calibración se ha realizado con esta substancia.
2. El reactivo de Folin Ciocalteu usa sulfato de litio, para reducir los problemas
de precipitación del reactivo. Las sales de litio son más solubles que las de otros
cationes.
4. Los azúcares reductores son capaces de reducir las moléculas en medio alca-
lino. Puede aplicarse un factor de corrección, en el caso de tenores de azúcares re-
ductores entre 1, 0 y 2,5 g/100 mL, se divide el contenido de fenoles totales por
1,03. Si los azúcares reductores están entre 2,5 y 10g /100 mL, el contenido de fe-
noles totales debe ser dividido por 1,06. No se necesita corrección en el caso de vi-
nos secos.
93
Zoecklein, B. et al.(1994) Wine analysis and production. Chapman & Hall, New
York. pp 455-458
94
10.2. MICROMÉTODO FOLIN CIOCALTEU
Los compuestos fenólicos del vino son oxidados por el reactivo de Folin- Ciocal-
teu. Este reactivo contiene una mezcla de ácido fosfo-túngstico (H3PW12O40) y el
ácido fosfomolíbdico (H3PMo12O40),que se reduce por oxidación de los fenoles del
vino, originando óxidos de tungsteno (W8O23) y de molibdeno (Mo8O23), de color
azul.
Material
Reactivos
El color final del reactivo debe ser amarillo. No debe haber tonos verdes. Para
reoxidar soluciones envejecidas de reactivo de Folin Ciocalteu, que tenga color azul,
verde o naranja, se agregan algunas gotas de bromo, y se lleva a ebullición bajo
campana.
Modo de trabajo
95
Se agita el matraz para homogeneizar, se espera 30 min para estabilizar la re-
acción y se mide la absorbancia a 765 nm con una cubeta de 1 cm de paso óptico,
frente a un blanco preparado con agua destilada.
Curva de Calibración
96
10.3. PODER REDUCTOR: MÉTODO DE OYAIZU
97
10.4. DETERMINACIÓN DEL COLOR DEL JUGO DE MANZANAS.ESTIMACIÓN
DEL GRADO DE OXIDACIÓN. MÉTODO DE ÖZOGLU
Inhibición (%) = [(Δ A 420 nm testigo -ΔA 420 nm tratamiento) X 100] / Δ A 420 nm testigo
98
DETERMINACIÓN DE LA DENSIDAD DEL EXTRACTO
MÉTODO DEL PICNÓMETRO
D = 1,059
99
CÁLCULO DE LA DOSIS DEL EXTRACTO SECADO EN LECHO DE ESPUMA A
EMPLEAR EN ENSAYO COMPARATIVO ENTRE EXTRACTO LÍQUIDO CONCEN-
TRADO Y EXTRACTO SECADO EN LECHO DE ESPUMA.
25 g de agua destilada
2,5 g de ovoalbúmina
0,5 g de carboximetilcelulosa
0,5 g de (PO4)2 Ca3
10,59 g de extracto concentrado de semillas de uva
D =P/V
En consecuencia: P = D x V
P = 1,059 g/ml x 10 ml
P = 10,59 g
100