LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA E INMUNOLOGÍA 2013

Práctico Nº6
Identificación de Hongos

Introducción

Los hongos suelen definirse como organismos eucariontes sin clorofila y por lo tanto
heterótrofos, uni o multicelulares, de nutrición absortiva, con paredes celulares que está
compuesta fundamentalmente por polisacáridos y por diversas proteínas. Los polisacáridos
más importantes son la quitina (polímero de n-acetil glucosamina), el manano (polímero de
manosa) y
el glucano (polímero de glucosa). La mayoría de los hongos conocidos vive sobre materia
orgánica muerta y por ende su principal rol ecológico es la degradación o descomposición
de estos sustratos. Los hongos se aprovechan directamente como alimento (por ejemplo los
champiñones) e indirectamente en la elaboración de cerveza, vino y pan (Saccharomyces
cerevisiae o especies relacionadas con ésta). Además de la producción de alimentos, los
mohos producen ácido cítrico (Aspergillus niger), la penicilina (Penicillium notatu y
Penicillium chrysogenum). Existen otros antibióticos producidos por mohos estos son las
cefalosporinas, griseofulvina, ácido fusídico.

Los hongos presentan básicamente dos tipos

de morfologías: una multicelular
denominada filamentosa y otra unicelular
denominada levaduriforme. Los hongos
filamentosos (miceliares o mohos),
representan el crecimiento más típico de los
hongos microscópicos. En medios de cultivo
sólidos y también sobre cualquier superficie
en la que se desarrollen, por ejemplo frutas u otros alimentos, producen colonias
algodonosas o pulverulentas que son muy características.

Fisiológicamente los hongos se adaptan a condiciones más severas que las bacterias.
Por ejemplo, los mohos se desarrollan en sustratos con concentraciones de azúcar que las
bacterias no pueden tolerar ya que, los hongos no son tan sensibles a la presión osmótica
elevada. Los hongos toleran y se desarrollan en concentraciones de acidez elevadas,
soportan escalas de pH entre 2 a 9 pero el pH óptimo es 5.6. Aunque necesitan humedad
para su desarrollo y pueden obtener agua de la atmósfera y del medio, los hongos
pueden vivir en ambientes deshidratados que serán inhibitorios para la mayor parte de las
bacterias.

Casi todos los hongos son estrictamente aerobios, pero su crecimiento se aumenta por la
presencia de oxígeno (las levaduras son facultativas y los mohos u hongos filamentosos
son estrictamente aerobios, con algunas excepciones); se desarrollan en condiciones de
temperatura muy variadas pero entre 22-30ºC es la temperatura óptima. La glucosa es una
fuente de carbono muy aprovechada por muchos hongos; otros azúcares como, sacarosa y
maltosa y muchos carbohidratos más complejos como almidón y celulosa son utilizados
por muchas especies.

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El nitrógeno inorgánico es aprovechado por algunas especies en forma de amonio o

nitratos; otras especies necesitan sustratos con Nitrógeno orgánico que, frecuentemente se
proporciona a los medios artificiales en forma de peptona.

La mayoría de los hongos presentan reproducción sexual y asexual. En algunas especies

coexisten las dos formas de reproducción, denominándose holomorfo. El holomorfo, tiene
a la vez una forma de multiplicación asexuada, conocida como anamorfo o mitospórico (o
estado imperfecto), y una sexuada, conocida como teleomorfo o meospórico (o estado
perfecto). Es relativamente común que un mismo hongo tenga dos nombres, el del estado
anamorfo y el del estado teleomorfo, ya que suelen haberse descubierto y nombrado de
forma independiente.

En un grupo importante de hongos solamente se conoce la reproducción asexual, bien

porque no se conocen las condiciones adecuadas para que se desarrolle la forma sexual o
porque ésta se ha perdido a lo largo de la evolución. La reproducción asexuada, puede
ocurrir por propagación vegetativa a partir de fragmentación de las hifas, ya que cada
fragmento puede producir una nueva colonia, o por l a formación de esporas. Las esporas
asexuales generalmente se producen en hifas especializadas y se denominan de diferente
forma según su morfología. Los Zygomycota producen esporangiosporas en el interior de
una estructura en forma de saco denominada esporangio. Los Ascomycota y, en menor
grado, los Basidiomycota, producen esporas asexuales denominadas conidios que se
desarrollan a partir de una estructura denominada conidióforo. Según su tamaño se
diferencian en macroconidios y microconidios. Existen distintos tipos de esporas
asexuales:

Clamidosporas: esporas esféricas u ovoides

de pared gruesa que se forman dentro de las
hifas somáticas. Son más resistentes al calor y
a la desecación que las otras esporas
asexuales.

Conidiosporas: Son esporas delgadas que

se encuentran en grupos o solas sobre hifas
especializadas llamadas conidióforos.
Algunos autores llaman conidiosporas a
todas las esporas asexuales.

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Esporangiosporas: Son
esporas que se forman
dentro de una estructura en
forma de saco denominada
esporangio. La hifa que
porta el esporangio se
denomina esporangióforo.

Astrosporas u Oidio: Son esporas de paredes delgadas que se forman por

fragmentación de las hifas.

Blastosporas: Son esporas que se forman por gemación.

Las esporas sexuales se producen tras la fusión de los núcleos de dos hifas sexualmente
compatibles o de dos levaduras y posterior meiosis. De este proceso de reproducción sexual
resultan las esporas sexuales, las cuales son usualmente más resistentes al calor que las
esporas asexuales, pero sin llegar a tener la extremada resistencia al calor que presentan las
endosporas bacterianas y presentan latencia, es decir ellas sólo germinan cuando son
activadas ya sea por un calentamiento suave o por ciertas sustancias químicas. La
morfología de las esporas sexuales es muy variada y tiene gran interés para la identificación
fúngica, ya que presentan diferencias características. Los hongos del Phylum
Basidiomycota producen basidiosporas
en el exterior de una estructura
denominada basidio, los Ascomycota
producen ascosporas en el interior de
una estructura en forma de saco
denominada asco y los Zygomycota
producen zigosporas.

Existen varios tipos de esporas

sexuales:
Zygosporas: Son esporas grandes de
pared gruesa que resultan de la fusión
de 2 gametos similares.

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Ascosporas: Se producen en una estructura en forma de saco, llamada asca, después de la

unión de 2 núcleos. Las ascosporas se forman frecuentemente por procesos de cariogamia
de dos núcleos distintos; generalmente se forman ocho ascosporas, aunque pueden
formarse de dos o cuatro. A su vez, las ascas pueden estar incluidas o no dentro de un
ascocarpo.

De acuerdo a la forma en la cual se desarrolla el ascocarpo y el cual es utilizado como

carácter taxonómico de identificación, se definen:

Los apotecios, son cuerpos fructíferos con forma de copa, normalmente de colores
marrones claros, se pueden producir a partir de la germinación de esclerocios o del
mismo material vegetal invadido por el hongo. Algunos alcanzan más de un centímetro
de diámetro y dentro de él, se encuentran las ascas conteniendo ascosporas.

Los cleistotecios, son cuerpos fructíferos con forma esférica y que no poseen abertura
para la salida de las ascosporas, por lo tanto deben romperse para que estas se liberen.
Generalmente se producen sobre el tejido vegetal colonizado por el hongo. A simple vista
pueden observarse como puntos negros.

Los peritecios, son cuerpos fructíferos con forma de

pera y con una abertura para la salida de las
ascosporas. Generalmente se producen sobre el tejido
vegetal colonizado por el hongo y a simple vista pueden
observarse como puntos negros.

Basidiosporas: Resultan de la unión de 2 núcleos sobre

una estructura especializada en forma de maza conocida
como basidio. Generalmente hay 4 por basidio.
.
Si bien la estructura microscópica es decisiva para la clasificación,
para el micólogo experimentado las características visibles son muy
importantes debido a que, a simple vista, el aspecto de las colonias
es a veces tan característico que le permite identificar enseguida el
tipo de hongo. Sin embargo, es indispensable para la clasificación
final determinar las peculiaridades del hongo al nivel microscópico
que presentan estos microorganismos.

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Al microscopio óptico, los hongos filamentosos presentan unas estructuras tubulares,

formadas por múltiples células, que se denominan hifas. En los hongos filamentosos, las
hifas son tabicadas y presentan septos que delimitan las diferentes células. Sin embargo, los
hongos del Phylum Zygomycota presentan hifas que carecen de septos y se denominan
cenocíticas o sifonadas.

El mejor método para el estudio microscópico es el MICROCULTIVO que permite

observar cuidadosamente y a intervalos las estructuras microscópicas intactas, mientras que
en la técnica de desprender una porción del cultivo se altera muy seriamente la arquitectura
microscópica tanto que a veces es imposible reconocer el hongo.

Objetivo:

• Identificar una especie de hongo filamentoso

Procedimiento:

• Observación macroscópica de mohos:

Determinar:
- tamaño de la colonia, diámetro
- textura, lanosa, flocosa, granulosa, etc
- color, escala de colores
- presencia de surcos
- exudado
- producción de pigmento, etc...

• Observación con lupa estereoscópica:

- Describir las características del micelio aéreo

• Observación microscópica de mohos:

Algunos caracteres microscópicos del micelio fúngico:

- Micelio tabicado, hifas septadas, ramificadas, formando una maraña. Observamos la

periferia de la misma para encontrar conidias (macro y microconidias) o bien algunas
estructurasn morfológicamante interesantes para el diagnóstico micológico.
- Conidias: Microconidias, son unicelulares, pequeñas, redondas, ovales o piriformes.
Presentan dos tipos de disposición: a lo largo de la hifa (tipo acladium) en forma de
racimos. Unas veces son sesiles, otras nacen sobre cortos esterigmas. Las
macroconidias, son multicelulares, grandes, con tabiques transversales. Existen diversos
tipos: fusiformes, en raquetas y en lápiz o maza. A su vez pueden tener las paredes
gruesas o finas, ser lisas o rugosas, aisladas o en racimos.
- Estructuras morfológicas especiales: Casi todas variantes de tamaño y forma de las
hifas septadas:
o Espirales: hifa fina enrollada en espiral.

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o Hifa en raqueta: ensanchamiento oval de una porción media o terminal de una

hifa.
o Cuerpos nodulares: filamentos engrosados formando nudos sobre si mismo.
o Hifa peptinada: pequeñas prolongaciones en un solo lado de la hifa, que adopta
así forma de peine.
o Hifa retrógrada: hifa que nace en sentido contrario, en ángulo agudo, al resto de
las ramificaciones.
• Empleo de claves para la identificación de los hongos filamentosos más comunes.

Hongos levaduriformes

Las levaduras son filogenéticamente un grupo diverso de hongos; sus formas teleomorfas
(sexuales) se distribuyen en dos clases principales; Ascomicotina y Basidiomicotina, su
denominación “levadura” describe el predominio unicelular de estos organismos que en su
división celular vegetativa se realiza por gemación ó por fisión.
Las levaduras poseen numerosas aplicaciones en la biotecnología tradicional y moderna, ya
que participan en procesos de producción de alimentos, proteínas de organismos
unicelulares, productos con valor añadido y en las últimas décadas se han incorporado a la
industria biotecnológica como hospederos para la producción de proteínas de eucariontes.
A pesar de las ventajas que poseen, algunos géneros son causantes de micosis en el hombre
y, en algunos casos, son patógenos oportunistas asociados a enfermedades como el VIH.
También son causantes del deterioro de alimentos frescos y elaborados para el consumo
humano. Por estas razones se hace imprescindible la identificación exacta de las levaduras
de interés industrial, clínico y ambiental.
La identificación taxonómica de las levaduras puede ser realizada tomando en cuenta
diferentes criterios que complementan su diagnóstico específico:
• el morfológico
• el bioquímico
• el fisiológico
Para la identificación de levaduras, en los últimos años se han desarrollado nuevas técnicas
diagnósticas, independientes del cultivo, con la intención de mejorar la sensibilidad y
reducir el tiempo necesario para obtener su resultado:
• el inmunológico. (Detección de antígenos o anticuerpos )
• el genético

El interés general de su clasificación e identificación se relaciona con una necesidad de

enfrentar un tratamiento adecuado en las infecciones de aquellas formas patógenas ó
comprender la interacción de las especies en la naturaleza, ó la selección conveniente en
la producción de alimentos y en las fermentaciones industriales por sus diversas
capacidades metabólicas

Aspectos Morfológicos.

Observación Macroscópica : Toma en cuenta las características que desarrollan las

colonias de levadura que crecen en diferentes medios, siendo su mejor medio de cultivo y
aislamiento el Agar Sabaouraud. y/ó harina de Maíz .

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Aspectos Microscópicos
La separación de las levaduras en género y ocasionalmente en especie,
se realiza corrientemente a través de la apariencia microscópica por el
reconocimiento de las los estado vegetativos y sexuales. Definiendo en
estos sentidos; forma celular, gemación, hifas, blastoconidias,
clamidosporas, artrosporas y ascosporas.
La observación se efectúa alrededor de 400 – 500X en microscopía de luz y en
inmersión cuando es necesario distinguir ornamentación de ascosporas.

Pruebas Bioquímicas
Se utilizan en conjunto con los aspectos macroscópicos y microscópicos en el análisis de
taxa mas ó menos cercanas relativas a la fermentación y asimilación de una variada fuente
de carbono.
Las levaduras varían genéricamente en su capacidad de fermentar azúcares, medida como
la producción de CO2, utilizando generalmente: D-glucosa, D-galactosa, sacarosa, maltosa,
lactosa, rafinosa y trehalosa
Las pruebas de asimilación de azúcares y otros compuestos carbonados y nitrogenados
miden el crecimiento en condiciones aeróbicas, en forma comparativa. La asimilación de
nutrientes en forma separada sobre un medio sintético base se denomina Auxonograma
donde se apreciará el crecimiento selectivo de una levadura en la cercanía de este sustrato
dispuesto sobre filtros de papel absorbente, o en pocillos de agar.

Sistemas semi automáticos y automáticos

Corresponde a diferentes métodos de asimilación de nutrientes
comercializados, que en conjunto simplifican y reunen un conjunto de
pruebas para una rápida identificación.
Actualmente existen en el mercado sistemas estandarizados de
identificación (kits) para conocer el perfil bioquímico de las levaduras.
Estos kits permiten una identificación más rápida de las levaduras
aisladas que los métodos clásicos de asimilación y fermentación. La
ventaja más importante es que estos sistemas proporcionan una
identificación que surge de una base de datos sobre miles de biotipos de
levaduras, que incluyen diversas variaciones y patrones de utilización de substratos

Métodos genéticos
Estos métodos se basan esencialmente en el análisis directo del ADN de la levadura; las
diferencias entre las propiedades de este DNA se denominan polimorfismo, el cual hace
posible su distinción. El mayor reto al identificar cepas de levadura recae en la necesidad de
diferenciar grupos y especies que taxonómicamente están muy próximas, pero que tienen
propiedades muy diferentes en lo que respecta a sus aptitudes fermentativas y
organolépticas Estas técnicas se basan en la caracterización e identificación de especies
utilizando marcadores moleculares, normalmente de ADN, de cada especie o cepa.
-. Secuenciación de genes ribosomales: Los genes ribosomales presentan una secuencia
bastante conservada a nivel de género y especie en los organismos Eucariotas, por lo que se
trata de análisis genéticos muy útiles para establecer relaciones filogenéticas. La técnica
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consiste en amplificar estas regiones conservadas por PCR (Polymerase Chain Reaction) y
posteriormente secuenciar los fragmentos amplificados. Esta técnica también permite
diferenciar especies.
-. Análisis de perfiles de restricción de ADNr (RFLP): Esta técnica (Restriction
Fragment Length Polymorphisms) consiste en el análisis de perfiles de restricción mediante
la comparación de los patrones de restricción de diferentes regiones de la zona ribosomal.
Ésta técnica es muy utilizada para la identificación de especies de interés biotecnológico y
en estudios ecológicos y de dinámica poblacional.
-. PCR: Las dos cadenas de ADN se separan y consiste en amplificar una región del
genoma por PCR (Polymerase Chain Reaction) y posteriormente estos fragmentos
amplificados se someten a una electroforesis en gel de poliacrilamida. Los fragmentos se
separan según su tamaño. Esta técnica se emplea en la caracterización e identificación de
levaduras y bacterias vínicas, también en estudios de biodiversidad.
-. FISH: Se basa en la utilización de unas sondas de ADN o ARN marcados y un
fluorocromo (Fluorescente In Situ Hybridization), que son capaces de hibridarse por tener
ácidos nucleicos complementarios. Posteriormente a la hibridación, se observan las células
marcadas al microscopio de fluorescencia. Es una técnica muy interesante, ya que permite
diferenciar especies dentro de una misma muestra, utilizando sondas específicas y
diferentes fluorocromos. Permite una buena exactitud en la diferenciación de especies,
siendo útil para estudios de diversidad poblacional y detección de levaduras en diferentes
muestras

Objetivo:

• Conocer los métodos convencionales para la identificación de especies de levaduras

Procedimiento práctico

1.- Auxonograma:

a) Asimilación de azúcares:
Realice una suspensión del cultivo de levadura incubada durante
24 hasta 72 horas en Agar Sabouraud, en 5 ml de agua destilada,
a una concentración equivalente al 4-5 del Mc Farland

Siembre por difusión 1 ml de la suspensión en Agar Base

Nitrógeno fundido en placa Petri y homogenice

Deje solidificar a temperatura ambiente y disponga 4 discos de papel filtro con los
diferentes azúcares que se le proporcionarán en cada placa. Incube a 30°C por 24
horas

b) Asimilación de Nitrato:
Realice una suspensión similar al punto anterior a una densidad similar al Mc
Farland N° 1

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Siembre por difusión 0,1 ml de la suspensión en Agar Base Carbono fundido en

placa Petri homogenice y deje solidificar

Disponga en el centro de la mitad de la placa algunos cristales de KNO3 y una gota

de agua peptonada al 1% tal como se le indicará.
Incube por 48 a 96 horas a 30°C

2.- Fermentación de azúcares :

Inocule la cepa de levadura en caldo glucosado con indicador de pH y producción

de CO2
Incube a 28°C por 10 a 14 días. Observe a las 48 – 72 horas la producción de gas

3.- Producción de ureasa

Siembre en estría en Agar urea
Incube por 48 horas

4.- Morfología:

Siembre por agotamiento sobre Agar Corn Meal

Disponga 3 cubre-objetos desengrasados y estériles en la superficie en forma
equidistante
Incube por 48 horas a 28°C
Observe directamente al microscopio
Distinga las estructuras que caracterizan la morfología de su cepa

5.- Identifique su género y especie utilizando las claves que se le proporcionaran.

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