Endotelialitis vascular pulmonar, trombosis y

angiogénesis en Covid-19.

• Maximilian Ackermann, MD,

• Stijn E. Verleden, Ph.D.,
• Mark Kuehnel, Ph.D.,
• Axel Haverich, MD,
• Tobias Welte, MD,
• Florian Laenger, MD,
• Arno Vanstapel, Ph.D.,
• Christopher Werlein, MD,
• Helge Stark, Ph.D.,
• Dr. Alexandar Tzankov,
• William W. Li, MD,
• Vincent W. Li, MD,

Resumen

ANTECEDENTES
La insuficiencia respiratoria progresiva es la causa principal de muerte en la
pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (Covid-19). A pesar del interés
generalizado en la fisiopatología de la enfermedad, se sabe relativamente poco
sobre los cambios morfológicos y moleculares asociados en el pulmón periférico de
los pacientes que mueren por Covid-19.

MÉTODOS
Examinamos 7 pulmones obtenidos durante la autopsia de pacientes que murieron
de Covid-19 y los comparamos con 7 pulmones obtenidos durante la autopsia de
pacientes que murieron de síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA)
secundario a la infección por influenza A (H1N1) y 10 de la misma edad, pulmones
de control no infectados. Los pulmones se estudiaron con el uso de análisis
inmunohistoquímicos de siete colores, imágenes tomográficas microcomputadas,
microscopía electrónica de barrido, moldeo por corrosión y medición directa
multiplexada de la expresión génica.

RESULTADOS
En los pacientes que fallecieron por insuficiencia respiratoria asociada con Covid-
19 o con influenza, el patrón histológico en el pulmón periférico fue daño alveolar
difuso con infiltración perivascular de células T. Los pulmones de pacientes con
Covid-19 también mostraron características vasculares distintivas, que consisten en
lesiones endoteliales severas asociadas con la presencia de virus intracelular y
membranas celulares alteradas. El análisis histológico de los vasos pulmonares en
pacientes con Covid-19 mostró trombosis generalizada con microangiopatía. Los
microtrombos capilares alveolares fueron 9 veces más prevalentes en pacientes con
Covid-19 que en pacientes con influenza (P <0.001). En los pulmones de pacientes
con Covid-19, la cantidad de crecimiento de nuevos vasos, predominantemente a
través de un mecanismo de angiogénesis intususceptiva, fue de 2.

CONCLUSIONES
En nuestra pequeña serie, la angiogénesis vascular distinguió la patobiología
pulmonar de Covid-19 de la de la infección por virus de la gripe igualmente grave. La
universalidad y las implicaciones clínicas de nuestras observaciones requieren más
investigación para definir. (Financiado por los Institutos Nacionales de Salud y
otros).
La infección por coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-
2) en humanos se asocia con un amplio espectro de síndromes respiratorios
clínicos, que van desde síntomas leves de las vías respiratorias superiores hasta
neumonía viral progresiva potencialmente mortal. 1,2 Clínicamente, los pacientes
con enfermedad grave por coronavirus 2019 (Covid-19) tienen dificultad para
respirar e hipoxemia progresiva y, a menudo, reciben asistencia ventilatoria
mecánica. Radiográficamente, las opacidades de vidrio esmerilado del pulmón
periférico en la tomografía computarizada (TC) del tórax cumplen los criterios de
Berlín para el síndrome de dificultad respiratoria aguda
(SDRA). 3,4 Histológicamente, el sello distintivo de la fase temprana del SDRA es el
daño alveolar difuso con edema, hemorragia y depósito de fibrina intraalveolar,
como lo describen Katzenstein et al. 5 5El daño alveolar difuso es un hallazgo
inespecífico, ya que puede tener causas no infecciosas o infecciosas, incluido el
coronavirus del síndrome respiratorio del Medio Oriente (MERS-CoV), 6 SARS-
CoV, 7 SARS-CoV-2, 8-10 y virus de la influenza. 11
Entre las características distintivas de Covid-19 están los cambios vasculares
asociados con la enfermedad. Con respecto al daño alveolar difuso en
la infección por SARS-CoV 7 y SARS-CoV-2, 8,12 se ha observado anecdóticamente
la formación de trombos de fibrina, pero no se ha estudiado
sistemáticamente. Clínicamente, muchos pacientes tienen niveles elevados
de dímero D , así como cambios cutáneos en sus extremidades que sugieren
microangiopatía trombótica. 13 La coagulación intravascular difusa y la trombosis de
los vasos grandes se han relacionado con la falla orgánica multisistémica. 14-16Los

cambios vasculares pulmonares periféricos están menos caracterizados; sin

embargo, la vasculopatía en las redes de intercambio de gases, dependiendo de su
efecto sobre la combinación de ventilación y perfusión que resulte, podría contribuir
potencialmente a la hipoxemia y los efectos de la postura (p. ej., posicionamiento
prono) en la oxigenación. 17
A pesar de la experiencia previa con SARS-CoV 18 y la experiencia temprana con
SARS-CoV-2, los cambios morfológicos y moleculares asociados con estas
infecciones en el pulmón periférico no están bien documentados. Aquí, examinamos
las características morfológicas y moleculares de los pulmones obtenidos durante
la autopsia de pacientes que murieron de Covid-19, en comparación con los de los
pulmones de pacientes que murieron de influenza y pulmones de control no
infectados de edad.

Métodos

SELECCIÓN DE PACIENTES Y FLUJO DE TRABAJO

Analizamos muestras de autopsia pulmonar de siete pacientes que murieron por
insuficiencia respiratoria causada por la infección por SARS-CoV-2 y los
comparamos con los pulmones de siete pacientes que murieron por neumonía
causada por el virus de la influenza A subtipo H1N1 (A [H1N1]), una cepa asociada
con las pandemias de gripe de 1918 y 2009. Los pulmones de pacientes con
influenza fueron tejidos archivados de la pandemia de 2009 y fueron elegidos para
la mejor coincidencia posible con respecto a la edad, el sexo y la gravedad de la
enfermedad entre las autopsias realizadas en la Escuela de Medicina de
Hannover. Diez pulmones que habían sido donados pero no utilizados para el
trasplante sirvieron como muestras de control no infectadas. El grupo Covid-19
consistió en pulmones de dos pacientes femeninos y cinco masculinos con edades
promedio (± DE) de 68 ± 9.2 años y 80 ± 11.5 años, respectivamente (los datos
clínicos se proporcionan en la Tabla S1A en elApéndice complementario ,
disponible con el texto completo de este artículo en NEJM.org). El grupo de
influenza consistió en pulmones de dos pacientes femeninos y cinco masculinos con
edades promedio de 62.5 ± 4.9 años y 55.4 ± 10.9 años, respectivamente. Cinco de
los pulmones no infectados eran de donantes femeninos (edad media, 68,2 ± 6,9
años), y cinco de donantes masculinos (edad media, 79,2 ± 3,3 años) (los datos
clínicos se proporcionan en la Tabla S1B). El estudio fue aprobado y realizado de
acuerdo con los requisitos de los comités de ética de la Escuela de Medicina de
Hannover y la Universidad de Lovaina. No hubo apoyo comercial para este estudio.

Todos los pulmones se analizaron exhaustivamente con el uso de microCT, análisis

inmunohistoquímico multiplexado y histopatológico, microscopía electrónica de
transmisión y exploración, moldeo por corrosión y análisis directo de expresión
génica multiplexada, como se describe en detalle en la sección Métodos
del Apéndice complementario .

ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Todas las comparaciones de variables numéricas (incluidas las del análisis de
expresión génica) se realizaron con las tasas de error de la familia de la prueba t de
Student debido a la multiplicidad establecida en 0.05 con el uso del método
Benjamini-Hochberg para controlar las tasas de descubrimiento falso. Los valores
originales de P se informan solo para las pruebas que cumplen los criterios de tasas
de descubrimiento falsas. Todos los intervalos de confianza también se han
calculado sobre la base de la distribución t. Se proporcionan detalles adicionales en
la sección Métodos del Apéndice complementario .

Resultados

EXAMEN BRUTO
El peso medio (± EE) de los pulmones de pacientes con neumonía por influenza
comprobada fue significativamente mayor que el de pacientes con Covid-19
comprobado (2404 ± 560 g frente a 1681 ± 49 g; P = 0,04). El peso medio de los
pulmones de control no infectados (1045 ± 91 g) fue significativamente menor que
los del grupo de influenza (P = 0.003) y el grupo Covid-19 (P <0.001).

INFLAMACIÓN ANGIOCÉNTRICA
Figura 1.Inflamación linfocítica en un pulmón de un paciente que murió de Covid-
19.
Todas las muestras de pulmón del grupo Covid-19 tuvieron daño alveolar difuso con
necrosis de células de revestimiento alveolar, hiperplasia de neumocitos tipo 2 y
deposición lineal de fibrina intraalveolar ( Figura 1 ). En cuatro de siete casos, los
cambios fueron focales, con solo edema intersticial leve. Los tres casos restantes
tenían depósitos de fibrina homogéneos y edema intersticial marcado con
organización intraalveolar temprana. Las muestras en el grupo de influenza tuvieron
daño alveolar difuso florido con edema intersticial masivo y deposición extensa de
fibrina en todos los casos. Además, tres especímenes en el grupo de influenza
tuvieron organización focal e inflamación reabsorbente (Fig. S2). Estos cambios se
reflejaron en el peso mucho más alto de los pulmones de pacientes con influenza.

El análisis inmunohistoquímico de la expresión de la enzima convertidora de

angiotensina 2 (ACE2), medido como recuentos relativos medios (± DE) de células
positivas para ACE2 por campo de visión, en pulmones de control no infectados
mostró escasa expresión de ACE2 en células epiteliales alveolares (0.053 ± 0.03) y
células endoteliales capilares (0.066 ± 0.03). En pulmones de pacientes con Covid-
19 y pulmones de pacientes con influenza, los recuentos relativos de células
positivas para ACE2 por campo de visión fueron 0.25 ± 0.14 y 0.35 ± 0.15,
respectivamente, para células epiteliales alveolares y 0.49 ± 0.28 y 0.55 ± 0.11 ,
respectivamente, para células endoteliales. Además, los linfocitos ACE2 positivos
no se observaron en el tejido perivascular o en los alvéolos de los pulmones de
control, sino que estaban presentes en los pulmones en el grupo Covid-19 y el grupo
de influenza (recuentos relativos de 0.22 ± 0.18 y 0.15 ± 0.09, respectivamente) .

En los pulmones de pacientes con Covid-19 y pacientes con influenza, se

encontraron números medios (± DE) similares de células T CD3 positivas dentro de
un radio de 200 μm de paredes de vasos precapilares y poscapilares en 20 campos
de examen por paciente (26,2 ± 13.1 para Covid-19 y 14.8 ± 10.8 para
influenza). Con el mismo tamaño de campo utilizado para el examen, las células T
CD4 positivas fueron más numerosas en los pulmones de pacientes con Covid-19
que en los pulmones de pacientes con influenza (13.6 ± 6.0 vs. 5.8 ± 2.5, P = 0.04),
mientras que CD8- las células T positivas fueron menos numerosas (5,3 ± 4,3 frente
a 11,6 ± 4,9, P = 0,008). Los neutrófilos (CD15 positivos) fueron significativamente
menos numerosos adyacentes al revestimiento epitelial alveolar en el grupo Covid-
19 que en el grupo de influenza (0.4 ± 0.5 vs. 4.8 ± 5.2, P = 0.002).

Un análisis multiplexado de la expresión génica relacionada con la inflamación que

examinó 249 genes del nCounter Inflammation Panel (NanoString Technologies)
reveló similitudes y diferencias entre los especímenes en el grupo Covid-19 y los
del grupo de la gripe. Un total de 79 genes relacionados con la inflamación estaban
regulados diferencialmente solo en muestras de pacientes con Covid-19, mientras
que 2 genes estaban regulados diferencialmente solo en muestras de pacientes con
influenza; Se encontró un patrón de expresión compartida para 7 genes (Fig. S1).

TROMBOSIS Y MICROANGIOPATÍA
Figura 2.

Microtrombos en el septo interalveolar de un pulmón de un paciente que murió de

Covid-19.
La vasculatura pulmonar de los pulmones en el grupo Covid-19 y el grupo de
influenza se analizaron con hematoxilina-eosina, tricromo y tinción
inmunohistoquímica (como se describe en la sección Métodos del Apéndice
complementario ). El análisis de los vasos precapilares mostró que en cuatro de los
siete pulmones de pacientes con Covid-19 y cuatro de los siete pulmones de
pacientes con influenza, los trombos estaban constantemente presentes en las
arterias pulmonares con un diámetro de 1 mm a 2 mm, sin luz completa obstrucción
(Figs. S3 y S5). Se pudieron observar trombos de fibrina de los capilares alveolares
en todos los pulmones de ambos grupos de pacientes ( Figura 2) Los microtrombos
capilares alveolares fueron 9 veces más prevalentes en pacientes con Covid-19 que
en pacientes con influenza (número medio [± DE] de trombos distintos por
centímetro cuadrado del área de la luz vascular, 159 ± 73 y 16 ± 16,
respectivamente; P = 0,002 ) Los trombos intravasculares en las vénulas
poscapilares de menos de 1 mm de diámetro se observaron en números más bajos
en los pulmones de pacientes con Covid-19 que en los de pacientes con influenza
(12 ± 14 frente a 35 ± 16, P = 0.02). Dos pulmones en el grupo Covid-19 tenían
participación de todos los segmentos de la vasculatura, en comparación con cuatro
de los pulmones en el grupo de influenza; en tres de los pulmones en el grupo Covid-
19 y tres de los pulmones en el grupo de influenza, se encontraron trombos
combinados capilares y venosos sin trombos arteriales.

Los hallazgos histológicos fueron respaldados por microCT tridimensional de las

muestras pulmonares: los pulmones de pacientes con Covid-19 y de pacientes con
influenza mostraron oclusiones casi totales de vasos precapilares y poscapilares.
ANGIOGÉNESIS
Figura 3. Alteraciones microvasculares en los pulmones de pacientes que murieron
de Covid-19.
Examinamos la arquitectura microvascular de los pulmones de pacientes con Covid-
19, pulmones de pacientes con influenza y pulmones de control no infectados con
el uso de microscopía electrónica de barrido y fundición de corrosión
microvascular. Los pulmones en el grupo Covid-19 tenían una vascularización
distorsionada con capilares estructuralmente deformados ( Figura 3 ). Los capilares
alargados en los pulmones de pacientes con Covid-19 mostraron cambios
repentinos en el calibre y la presencia de pilares intususceptivos dentro de los
capilares ( Figura 3C ). La microscopía electrónica de transmisión del endotelio
Covid-19 mostró daño ultraestructural al endotelio, así como la presencia de SARS-
CoV-2 intracelular ( Figura 3D ). El virus también podría identificarse en el espacio
extracelular.
Figura 4.Densidad numérica de las características de la angiogénesis intramuscular
y de brote en los pulmones de pacientes que murieron de Covid-19 o Influenza A
(H1N1).
En los pulmones de pacientes con Covid-19, la densidad de las características
angiogénicas intususceptivas (media [± SE], 60.7 ± 11.8 características por campo)
fue significativamente mayor que en los pulmones de pacientes con influenza (22.5
± 6.9) o en el control no infectado pulmones (2.1 ± 0.6) (P <0.001 para ambas
comparaciones) ( Figura 4A ). La densidad de las características de la angiogénesis
de brotación convencional también fue mayor en el grupo Covid-19 que en el grupo
de la gripe ( Figura 4B ). Cuando se trazó el recuento de características
angiogénicas pulmonares en función de la duración de la estancia hospitalaria, se
encontró que el grado de angiogénesis intususceptiva aumenta significativamente
con el aumento de la duración de la hospitalización (P <0.001) ( Figura 4C) Por el
contrario, los pulmones de pacientes con influenza tuvieron menos angiogénesis
intususceptiva y no aumentaron con el tiempo ( Figura 4C ). Se observó un patrón
similar para la angiogénesis en crecimiento ( Figura 4D ).

Figura 5.Análisis de expresión relativa de genes asociados a angiogénesis en

pulmones de pacientes que murieron de Covid-19 o Influenza A (H1N1).
Un análisis multiplexado de la expresión génica relacionada con la angiogénesis
que examinó 323 genes del Panel de Progresión PanCancer de nCounter
(NanoString Technologies) reveló diferencias entre las muestras de pacientes con
Covid-19 y las de pacientes con influenza. Un total de 69 genes relacionados con la
angiogénesis fueron regulados diferencialmente solo en el grupo Covid-19, en
comparación con 26 genes regulados diferencialmente solo en el grupo de
influenza; 45 genes habían compartido cambios en la expresión ( Figura 5 ).

Discusión

En este estudio, examinamos las características morfológicas y moleculares de

siete pulmones obtenidos durante la autopsia de pacientes que murieron por
infección por SARS-CoV-2. Los pulmones de estos pacientes se compararon con
los obtenidos durante la autopsia de pacientes que habían muerto de SDRA
secundario a infección por influenza A (H1N1) y de controles no infectados. Los
pulmones de los pacientes con Covid-19 y los pacientes con influenza compartieron
un patrón morfológico común de daño alveolar difuso y linfocitos perivasculares
infiltrantes. Había tres características angiocéntricas distintivas de Covid-19. La
primera característica fue la lesión endotelial severa asociada con el virus SARS-
CoV-2 intracelular y las membranas celulares endoteliales alteradas. Segundo,12,19
En tercer lugar, los pulmones de pacientes con Covid-19 tuvieron un crecimiento
significativo de vasos nuevos a través de un mecanismo de angiogénesis
intususceptiva. Aunque nuestra muestra era pequeña, las características
vasculares que identificamos son consistentes con la presencia de características
patobiológicas vasculares pulmonares distintivas en algunos casos de Covid-19.
Nuestro hallazgo de angiogénesis intususceptiva mejorada en los pulmones de
pacientes con Covid-19 en comparación con los pulmones de pacientes con
influenza fue inesperado. El crecimiento de nuevos vasos puede ocurrir por
brotación convencional o angiogénesis intususceptiva (sin brote). El rasgo
característico de la angiogénesis intususceptiva es la presencia de un pilar o poste
que atraviesa la luz del vaso. 20 Típicamente referido como un pilar intususceptivo,
esta estructura intravascular revestida de endotelio no se ve por microscopía óptica,
pero es fácilmente identificable por moldeo por corrosión y microscopía electrónica
de barrido. 21Aunque la hipoxia tisular fue probablemente una característica común
en los pulmones de ambos grupos de pacientes, especulamos que el mayor grado
de endotelialitis y trombosis en los pulmones de los pacientes con Covid-19 puede
contribuir a la frecuencia relativa de brote y angiogénesis intususceptiva observada
en estos pacientes La relación de estos hallazgos con el curso clínico de Covid-19
requiere más investigación para dilucidar.
Una limitación importante de nuestro estudio es que la muestra era
pequeña; estudiamos solo 7 pacientes entre las más de 320,000 personas que
murieron a causa de Covid-19, y los datos de la autopsia también representan
información estática. Sobre la base de los datos disponibles, no podemos
reconstruir el momento de la muerte en el contexto de un proceso de enfermedad
en evolución. Además, podría haber otros factores que explican las diferencias que
observamos entre pacientes con Covid-19 y aquellos con influenza. Por ejemplo,
ninguno de los pacientes en nuestro estudio que murieron por Covid-19 habían sido
tratados con ventilación mecánica estándar, mientras que cinco de los siete
pacientes que murieron por influenza habían recibido ventilación controlada por
presión. Del mismo modo, es posible que las diferencias en la angiogénesis
intususceptiva detectable puedan deberse a los diferentes ciclos temporales de
Covid-19 y la gripe.22 Sin embargo, nuestro análisis sugiere que esta posibilidad es
improbable, particularmente porque el grado de angiogénesis intususceptiva en los
pacientes con Covid-19 aumentó significativamente con el aumento de la duración
de la hospitalización, mientras que en los pacientes con influenza se mantuvo
estable en un nivel significativamente más bajo. Además, hemos demostrado que
la angiogénesis intususceptiva es el mecanismo angiogénico predominante incluso
en las últimas etapas de la lesión pulmonar crónica. 21

ACE2 es una proteína de membrana integral que parece ser el receptor de la célula
huésped para el SARS-CoV-2. 23,24 Nuestros datos mostraron un número
significativamente mayor de células ACE2 positivas en los pulmones de pacientes
con Covid-19 y de pacientes con influenza que en aquellos de controles no
infectados. Encontramos un mayor número de células endoteliales ACE2 positivas
y cambios significativos en la morfología endotelial, un hallazgo consistente con un
papel central de las células endoteliales en la fase vascular de Covid-19. Las células
endoteliales en las muestras de pacientes con Covid-19 mostraron alteración de las
uniones intercelulares, hinchazón celular y una pérdida de contacto con la
membrana basal. La presencia del virus SARS-CoV-2 dentro de las células
endoteliales, un hallazgo consistente con otros estudios 25. sugiere que los efectos
virales directos y la inflamación perivascular pueden contribuir a la lesión endotelial.
Reportamos la presencia de angiogénesis intususceptiva pulmonar y otras
características vasculares pulmonares en los pulmones de siete pacientes que
murieron por Covid-19. Se necesita trabajo adicional para relacionar nuestros
hallazgos con el curso clínico en estos pacientes. Para ayudar a otros en su
investigación, nuestro conjunto completo de datos está disponible en la plataforma
Vivli ( https://vivli.org/. se abre en una pestaña nueva) y se puede solicitar con el
siguiente identificador de objeto digital: https://doi.org/10.25934/00005576. se abre
en una pestaña nueva.

Con el apoyo de subvenciones (HL94567 y HL134229, a los Drs. Ackermann y

Mentzer) del Institutos Nacionales de Salud, una subvención del Centro de
Investigación Botnar para la Salud Infantil (al Dr. Tzankov), un Consejo Europeo de
Investigación Consolidator Grant (XHale) (771883, al Dr. Jonigk), y una beca
(KFO311, al Dr. Jonigk) de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Proyecto Z2).

Los formularios de divulgación proporcionados por los autores están disponibles

con el texto completo de este artículo en NEJM.org.

Este artículo fue publicado el 21 de mayo de 2020 en NEJM.org.

Agradecemos a Kerstin Bahr, Jan Hinrich Braesen, Peter Braubach, Emily Brouwer,
Annette Mueller Brechlin, Regina Engelhardt, Jasmin Haslbauer, Anne Hoefer,
Nicole Kroenke, Thomas Menter, Mahtab Taleb Naghsh, Christina Petzold, Vincent
Schmidt y Pauline Tittmann. ; Peter Boor del registro alemán Covid-19; y Lynnette
Sholl, Hans Kreipe, Hans Michael Kvasnicka y Jean Connors por sus útiles
comentarios. El Dr. Jonigk agradece a Anita Swiatlak por su continuo apoyo.

Referencias:
Ver artículo en inglés
https://www.nejm.org/doi/pdf/10.1056/NEJMoa2015432?articleTools=true