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Secuenciación Automática de ADN

El documento describe métodos clásicos y automatizados para la secuenciación de ADN. Los métodos clásicos incluyen marcar moléculas con radiactividad o fluorescencia, separar cadenas de ADN marcadas por tamaño usando métodos químicos o enzimáticos. Los métodos automatizados usan cuatro reacciones separadas con cebadores y terminadores de cadena fluorescentes diferentes o una sola reacción con cada terminador marcado de forma distinta. Los secuenciadores automáticos analizan las muestras una por una

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Secuenciación Automática de ADN

El documento describe métodos clásicos y automatizados para la secuenciación de ADN. Los métodos clásicos incluyen marcar moléculas con radiactividad o fluorescencia, separar cadenas de ADN marcadas por tamaño usando métodos químicos o enzimáticos. Los métodos automatizados usan cuatro reacciones separadas con cebadores y terminadores de cadena fluorescentes diferentes o una sola reacción con cada terminador marcado de forma distinta. Los secuenciadores automáticos analizan las muestras una por una

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MÉTODOS CLÁSICOS DE SECUENCIACIÓN

• Marcado: Es necesario marcar las moléculas a secuenciar radiactiva o


fluorescentemente

• Separación: Cada protocolo genera una serie de cadenas sencillas de


ADN marcadas cuyos tamaños se diferencian en una única base.

Para obtener estas cadenas se emplean dos procedimientos:

• Método químico de Maxam y Gilbert

• Método enzimático de Sanger


SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA EMPLEANDO
EL METODO ENZIMÁTICO

SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA EMPLEANDO EL METODO ENZIMÁTICO


• Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las
cuales se añade el oligonucleótido o cebador marcado con una sonda
fluorescente distinta y un ddNTP diferente en cada una de ellas.

SECUENCIACIÓN EMPLEANDO TERMINADORES FLUORESCENTES


• Se realiza una única reacción de secuencia en presencia de los cuatro
ddNTPs, cada uno de ellos marcados con una sonda fluorescente
distinta.
SECUENCIADORES AUTOMÁTICOS
SECUENCIADORES AUTOMÁTICOS SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA EN
CAPILARES GELES DESNATURALIZANTES DE
ACRILAMIDA/BISACRILAMIDA

• Existen instrumentos de • Se realiza polimerizando un gel


electroforesis capilar que de acrilamida/bisacrilamida entre
proporcionan una alternativa clara al dos cristales montados
sistema basado en geles de
adecuadamente sobre el cassette
acrilamida/bisacrilamida donde este
que sirve de soporte para los
soporte ha sido sustituido por un
polímero que se inyecta de forma mismos y que posteriormente se
automática en un capilar antes de acoplará en el secuenciador
cargar la muestra de secuenciación; automático para proceder a la
las muestras se van analizando una carga de la muestras
a una.
MODO OPERATIVO: PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
SECUENCIACIÓN CON TERMINADORES FLUORESCENTES

• Introducir en un tubo de PCR la muestra de ADN de doble cadena, el primer a


utilizar y la mezcla de reacción
• Programar la reacción de PCR (multiplicación del ADN) sometiendo la mezcla
anterior a 25 ciclos de las siguientes características: 30s a 94ºC
(desnaturalización), 15s a 45ºC (anillamiento) y 4min. a 60ºC (elongación).
• Enfriar el tubo a 4ºC
• Purificar el resultado de la reacción de secuencia de PCR, en una solución de
etanol y cloruro magnésico: dejar precipitar la mezcla, centrifugar y eliminar por
aspiración el etanol.
• Resuspender el resultado de la reacción de PCR en un pequeño volumen de
formamida: azul de dextrano. Desnaturalizar la muestra calentándola durnte 2
min. a 90ºC. Enfriar en hielo.
• Cargar los fragmentos de ADN fluorescentes en el gel de secuencia.

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