Balsas lipídicas en la activación de linfocitos.
propiedades biofísicas: (i) los esfingolípidos tienen
RESUMEN
La existencia de microdominios de membrana ricos en
esfingolípidos y colesterol llamadas ”balsas lipídicas”,
al igual que su función en la biología de linfocitos ha
sido debatido ampliamente durante años recientes.
Microdominios de la membrana plasmática parecen
estar involucrados principalmente en la iniciación y
propagación de la cascada de transducción de señales
asociados con activación de linfocitos. En esta revisión,
se discute la literatura reciente sugiriendo que,
durante la activación de linfocitos y quimiotaxis, las
balsas lipídicas actúan como plataformas para
compartimentalizar la señalización y facilitar ciertas
interacciones proteína-proteína.
1. El modelo de balsas lipídicas.
Las membranas biológicas están compuestas de
lípidos y proteínas asociadas por interacciones no-
covalentes. Las moléculas lipídicas están organizadas
en una bicapa fluida debido a fuerzas hidrofóbicas,
para minimizar el contacto con agua. Este principio
también aplica a la inserción de proteínas
transmembranales en la bicapa: siendo proteínas que
organizadas con sus superficies hidrofóbicas están
escondidos entre lípidos. En membranas biológicas,
las dos capas de la bicapa presentan diferente
composición lipídica, la superficie externa contiene
esfingolípidos, glicoesfingolípidos y fosfolípidos como
fosfatidilcolina, mientras que la capa interna está
constituida principalmente por fosfolípidos, como
fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina. El modelo de
mosaico fluido ha sido retomado recientemente e
investigadores han propuesto de los lípidos no están
distribuidos aleatoriamente en la bicapa, pero
aglomerados para formar dominios, llamadas
“balsas”, cuya composición y estado físico difieren del
promedio de la bicapa.
El modelo de “balsas lipídicas” sugiere que fuerzas de
atracción entre esfingolípidos y colesterol median la
formación de conglomerados de lípidos en un
ambiente de glicerolfosfolípidos insaturados. Los
fosfolípidos y esfingolípidos tienen distintas
más cadenas más largas saturadas de ácidos grasos y
exhiben una cohesión lateral más fuerte que
glicerolfosfolípidos; y (ii) las cadenas alquilo de
esfingolípidos interaccionan preferentemente con
colesterol con respecto a cadenas insaturadas típicas
de fosfolípidos. Por lo tanto, estos lípidos se
comportan en una manera diferente cuando forman
una monocapa, con esfingolípidos mostrando una
tendencia a formar fases distintas “líquido-
ordenadas” dispersas en la “líquido-desordenada”
matriz formada por fosfolípidos.
Operacionalmente, las balsas han sido definidas como
“dominios de membrana resistente a detergentes”
(detergent-resistant membrane domains en inglés, o
DRM), debido a que son insolubles en extracción fría
con detergente y flotan hacia arriba de un gradiente
de densidad como una porción de membrana
separable. Los DRM no representan balsas lipídicas en
células vivas, pero pueden reflejar agregación de
balsas “in vivo” pequeñas/transitorias, a pesar de que
el uso de protocolos de extracción no estandarizados
generan mayor preocupación sobre el método. Sin
embargo, el hecho que ciertas proteínas son
insolubles en detergente, así presente en los DRM,
probablemente reflejan su afinidad por dominios de
balsas. Proteínas unidas a glicosilfosfatidilinositol (GPI-
linked proteins en inglés), al igual que proteínas
aciladas, son concentradas en balsas y usadas como
“marcadores” para microdominios en la superficie
interna o externa de la bicapa, respectivamente.
La dependencia a colesterol también es usada
ampliamente para definir funcionalmente las balsas.
Así, la depleción de colesterol por drogas como metil-
β-ciclodextrina (MβCD), puede representar otra
herramienta para estudiar las propiedades y funciones
de balsas lipídicas. Sin embargo, la depleción de
colesterol altera el potencial de membrana
plasmática, el citoesqueleto de actina y la movilidad
lateral de proteínas de membrana, indicando que este
tratamiento tiene efectos secundarios pleiotrópicos
que deben ser considerados rigurosamente durante
experimentos.
El tamaño de los microdominios en membranas de células
vivas en reposo aun no sigue sin determinar. En condiciones
de reposo, las balsas lipídicas son estructuras muy pequeñas
y dinámicas; pueden estar formándose y dispersándose
continuamente, y no pueden ser aisladas en un estado
nativo o observadas en células vivas no perturbadas.
Aparecen muy pequeñas para….
2. Balsas lipídicas y señalamiento de células T.
La activación de linfocitos T es desencadenada cuando el
receptor de células T (TCR) reconoce antígenos asociados
con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad
(MHC) expresados en la superficie de células presentadores
de antígenos (APCs por sus siglas en inglés). Los eventos
proximales de señalamiento de TCR incluyen la activación
de la familia-Src de cinasas/quinasas Lck y Fyn, fosforilación
de motivos de activación basada en tirosina
inmunorreceptor (ITAMs por su siglas en inglés) en las
cadenas CD3 asociadas con TCR, y activación de la proteína
zeta-asociada 70 (ZAP-70) y tirosina cinasas Syk. Dos
sustratos conocidos de ZAP-70 son la molécula adaptadora
para el enlazador de activación de células T (LAT) y SLP-76.
La fosforilación de LAT y residuos de tirosina SLP-76 resultan
en reclutamiento de otras proteínas involucradas en la
activación de las vías de Ras y calcio, llevando a la
proliferación de células T, diferenciación terminal hacia
células efectoras y ejecución de función efectora.
Estudios recientas indican que TCR activados y sus
compañeros de señalización están organizados
espacialmente en complejos supramoleculares de
señalamiento y que esta organización espacial desempeña
un rol central en la iniciación, modulación y probablemente
terminación de la señalización. Elementos clave en la
organización para complejos de señalización TCR
supramoleculares parecen ser balsas lipídicas.
Varias proteínas aciladas involucradas en fases tempranas
de señalización TCR, como Lck y Fyn, la proteína adaptadora
LAT, fosfoproteína asociada con dominios ricos en
glicoesfingolípidos (PAG) o proteína activadora de Csk (Cbp)
y molécula interctuadora con Lck (LIME) residen
constituitivamente en los DRM. El enfoque a dominios de
balsas es crucial para la función de estas proteínas, como se
muestra por el hecho de que mutantes e Lck o LAT que no
están aciladas y no se ubican en la membrana plasmática
son incapaces de señalar apropiadamente. En adición, se ha
propuesto que, en membranas plasmáticas de linfocitos, las
cinasas Lck y Fyn exhiben una actividad óptima en
microdominios de balsas, pero encuentran condiciones
inhibitorias en áreas rodeadas por membrana sin balsas.
Mientras evidencia de la presencia de correceptores de CD4
y CD8 en los DRM han sido proveídas, no está claro si ya sea
los TCR residen constitutivamente en dominios de balsas.
Aunque pre-TCR parecen ser presentes constitutivamente
en los DRM y su presencia en balsas puede ser suficiente
para elicitar señales necesarias para proceder con el
desarrollo de células T, la mayoría de la información indica
que en células maduras en reposo, los TCR son excluidos de
los DRM y que la unión de antígenos, o entrecruzamiento
de antígenos, es requerido para inducir un número
significante de TCR para asociarse con balsas. En contraste,
usando un protocolo en particular para extraer DRM, ha
demostrado que una pequeña porción de TCR, en conjunto
con sus compañeros de señalización, puede ser preasociado
con dominios de membrana lipídica en células en reposo.
Sin embargo, todos los estudios recientes basados en FRET
o SPT no detectaron la presencia de balsas
grandes/estables, capaces de asignar el “señalosoma” de
TCR en células vírgenes.
El reclutamiento de TCR entrecruzadas en balsas es
independiente de eventos de señalación, pero
probablemente como consecuencia de conglomeración de
balsas en la membrana plasmática. En efecto, TCR es
reclutado masivamente en balsas lipídicas incluso sobre
entrecruzamiento del “residente de balsa” gangliósido
GM1, sin activación de células T detectable. Así, la simple
presencia de TCR en balsas, donde puede encontrarse con
cinasas de la familia Src y otras moléculas involucradas en la
señalización de TCR, no es suficiente para inducir activación
de TCR. ¿Será la presencia de TCR en balsas un prerrequisito
a la activación de TCR?
Hay evidencia clara de que la composición de proteínas
asociadas con balsas cambia después de la estimulación de
células T, sugiriendo que las balsas son, en efecto, las
plataformas para la señalización de TCR. En desacuerdo con
moléculas residentes de balsa (Lck, CD4, CD8, LAT,
PAG/Cbp), la asociación con dominios de membrana con
varias otras proteínas depende estrictamente con
activación de TCR. Así, sobre estimulación de TCR, muchas
proteínas señaladoras se vuelven concentradas en balsas,
incluyendo ZAP-70, la fosfolipasa Cγ (PLCγ), el factor de
intercambio Vav, la proteína cinasa Cθ (PKCθ) y la proteína
cinasa B (PKB). Aunque presente constitutivamente en
dominios de balsas, Lck cambia su interacción con
microdominios de membrana dependiente en activación de
TCR. Ha sido demostrado que la cinasa es presenta en balsas
en una estructura cercana/inactiva y que LAT es esencial en
mantener esta conformación. Interesantemente, sobre
activación fisiológica de células T, la forma activa de Lck es
acumulado en los DRM, sugiriendo que la “señalosoma” de
TCR es organizada en balsas lipídicas. En contraste, después
de la estimulación de células T por anticuerpos anti-CD3, Lck
activa al igual que proteínas tirosina-fosforiladas aparecen
principalmente en la fracción pesada, por ejemplo en la
membrana convencional no balsas.
Por lo tanto, usando depleción de colesterol por MβCD
para perturbar la organización de balsas, hemos
demostrado que la vía de señalización de TCR inducida
por anticuerpo anti-CD3, al menos en sus fases iniciales,
es independiente de microdominios basados en colesterol.
En contraste, los eventos tempranos siguiendo activación
fisiológica por APCs está compartimentalizada en los DR y
son inhibidas por la extracción de colesterol. En conjunto,
estos resultados sugieren que, durante estimulación de
células T, balsas pueden ser requeridas para la señal de
transducción asociada con moléculas coestimuladoras de
células T.
La activación productiva de células T requiere el
reconocimiento de complejos peptídicos MHC por TCR y
señales accesorias generadas por otras moléculas de
membrana celular. El cebado de células T es influenciado
fuertemente por señales entregadas por la molécula
coestimulatoria CD28, permitiendo células T vírgenes a
responder a niveles más bajos de TCR activados.
Fue propuesto que la amplificación de señalamiento TCR
inducido por CD28 está basado en balsas. El compromiso de
CD28 ciertamente promueve la distribución activa de
microdominios lipídicos ricos en GM1 al sitio de contacto
TCR, generando un entorno en el cual las señales son
protegidas y amplificadas. En consecuencia, es probable
que las balsas lipídicas son importantes en sostener y
modular, más que iniciar, cascadas de señalización TCR y
podría ser considerado como sitios de encuentro donde
interacciones proteína-proteína son facilitadas, mientras
otras son prevenidas.
3. Balsas lipídicas y señalamiento de células B.
El receptor de antígenos de células B (BCR) es una
inmunoglobulina de membrana enlazadora de antígenos
asociada con el heterodímero Igα/Igβ, el cual contiene
ITAMs en su dominio citoplásmico y media la transducción
de señales. Sobre entrecruzamiento de BCR por antígenos
multivalentes, los ITAMS se fosforilan por la familia de
cinasas Scr Lyn, proveyendo un sitio de unión para la cinasa
contenedora de dominio SH2 Syk, y así activando las
cascadas de señalización llevando a la transcripción de una
variedad de genes controlando la activación de células B.
Después del entrecruzamiento de antígenos, BCR es
internalizado y el antígeno llevado a los compartimentos
que contienen MHC clase II.
Como para los linfocitos T, las balsas lipídicas parecen estar
involucradas en la iniciación y regulación de células B. En
consecuencia, mientras el BCR es excluido de los DRM en
células en reposo, es reclutado en balsas después de la
ligadura por un proceso independiente de señalización. Lyn
es presente constitutivamente en DDRM, mientras muchas
otras proteínas de señalamiento como, Syk, Vav, SHIP, y
PLCγ, son reclutados en estos dominios solo después de la
activación de BCR. Una proteína adaptadora descubierta
recientemente, enlazadora para la activación de célula B
(LAB), similarmente a LAT, reside en balsas lipídicas y es
fosforilada sobre la activación de BCR.
La importancia en balsas lipídicas en la activación de células
B ha sido demostrado por diferentes metodologías
experimentales. Aparte de los resultados obtenidos usando
fármacos extractores de colesterol, es claro que los
marcadores de balsas co-localizan con el BCR activado,
también sucede igual con las proteínas tirosina fosforiladas.
Es más, por un enfoque microscópico, se ha mostrado que,
durante la estimulación de células B, la balsas lipídicas se
mueven lateralmente en la superficie de estas células y se
incorporan en regiones grandes.
Similarmente con lo que se observa con células T, la co-
estimulación de células B parece trabajar a través de
microdominios lipídicos. Así, durante la estimulación de
células B, el complejo de co-receptores CD19-CD21
transloca junto con el BCR en microdominios lipídicos y
mejora el señalamiento de células B al prolongar la
residencia de BCR en balsas antes de su internalización.
El propósito de balsas lipídicas en la internalización de BCR
sigue siendo controversial. Se ha demostrado que, después
de la ligación de BCR, el BCR y el gangliósido GM1 fueron co-
internalizados y co-localizados en el compartimento
cargador de MHC clase II, sugiriendo que las balsas median
la elección como blanco de antígenos a moléculas MHC
clase II. Una investigación reciente, ha mostrado evidencia
indicando que las balsas lipídicas no representan un
trayecto mayor para la internalización de superficie celular
de complejos Ag-BCR, siendo entregado, para
procesamiento de antígenos subsecuente, a quimiotáxicas
compartimento endocíticos distintos de aquellos ricos en
marcadores de balsas lipídicas.
4. Balsas lipídicas y presentación de antígenos.
Las balsas lipídicas también han sido implicados en la
presentación de antígenos con MHC clase II. Linfocitos T
CD4+ son activados por complejos moleculares específicos,
formado por pépticos antigénicos y moléculas MHC clase II,
en APCs profesionales. En APCs, los complejos péptido-
MHC, específicos para un TCR de célula T, son muy pocos y
probablemente representa una pequeña fracción del fondo
de complejos péptido-MHC. Fue reportado que las balsas
concentran complejos específicos péptido-MHC clase II y
que este enriquecimiento en microdominios puede ser
importante para la activación de células T. Así el
tratamiento de células T con MβCD inhíbela activación de
células T por concentraciones bajas de antígeno,
probablemente al afectar la formación T:B.
Desafortunadamente, el tratamiento con MβCD
puede generar efectos secundarios relevantes para
determinar el destino de la interacción T:B y, por otra
mano, considerando que el tiempo de vida corta de
balsa lipídicas en condiciones de reposo, es difícil
imaginar cómo estos dominios pueden concentrar
complejos péptido-MHC específicos. Es posible que,
una vez comprometido por el TCR, complejos péptido-
MHC pueden ser reclutados hacia (o pueden generar)
balsas estables y que esta asociación puede ser
importante para la activación de células T.
Complejos péptido-MHC también son incorporadas hacia
otro tipo de dominio de membrana, por ejemplo,
microdominios compuestos por CD9, CD63, CD81 o CD82,
diferente a balsas lipídicas clásicas.
5. Balsas lipídicas y quimiotaxis de linfocitos.
Los linfocitos son capaces de detectar gradientes
quimioatractivos extracelulares y responder con cambios
asimétricos en morfología celular y movilidad. Con el fin de
lograr movimiento dirigido (polarización) y migrar
(quimiotaxis), las células deben adquirir y mantener una
forma espacial y funcional con un lado anterior definido y
posterior. La polarización celular y quimiotaxi depende del
señalamiento de siete receptores transmembrana
acoplados a proteínas Gi heterotriméricas (GPCR). Sobre
ligación, los GPCR activan varias cascadas de señalamiento
llevando expresión génica, polarización y migración. Células
pueden responder a gradientes
quimioatrayentes muy bajos; con tan poco como 2-5% de
diferencia en la concentración del quimioatrayente entre la
parte anterior y posterior de la célula. Varios estudios han
demostrado que la estimulación direccional de células
resultan en una translocación rápida de proteínas
conteniendo una subclase de dominios de homología de
pleckstrina (PH) (PKB) que preferentemente enlazan los
productos de fosfadilinositol 3-cinasa (PI-3K) PI (3, 4,
5)P3/PI(3,4)P2. Estas proteínas exhiben una localización
muy restringida al extremo dirigente de células
quimiotáxicas, indicando que las células son capaces de
amplificar un gradiente bajo extracelular de moléculas
señaladoras de quimiotaxis para mediar movimientos
direcionales.
Durante polarización linfocítica y quimiotaxis, subtipos de
balsas se incorporan y reorganizan para crear asimetrías en
la membrana plasmática, llevando a la acumulación
preferencial de balsas con extremo dirigente, ricos en GM3
y receptores de quimiocinas, al frente de la célula y de las
balsas de urópodos, ricos en GM1 y moléculas de adhesión,
en el extremo posterior. La segregación de balsas ocurre
poco después de la estimulación por citocinas, persiste
durante quimiotaxis y depende de la integridad del
citoesqueleto de actina.
Los receptores de quimiocinas y proteínas G
heterotriméricas particionan en dominios de balsas, y fue
sugerido que la afinidad preferencial de receptores de
quimiocinas para las balsas dirigentes determina la
acumulación de receptores en el extremo dirigente al igual
que señalamiento restringido en este sitio de la célula. En
efecto, la modificación de receptores de quimiocinas para
impedir la asociación con microdominios lipídicos inhibe la
redistribución asimétrica de células polarizadas y su
señalamiento. Las balsas en conciencia instrumentan la
redistribución y señalamiento quimiotáxico en células
migrantes.
6. Conclusiones.
Aunque el debate sobre el modelo de balsas sigue abierto y
la existencia de microdominios lipídicos de membrana
plasmática aún no ha sido probada, las balsas lipídicas han
sido implicadas en muchas funciones linfocíticas.
Resultados recientes, obteniendo aproximaciones técnicas
altamente informativas, sugieren que linfocitos en reposo
pueden estarse formando y disolviendo continuamente y
que las moléculas señaladores que prefieren balsas residen
solamente en balsas. Sin embargo, la estimulación
linfocítica (por anticuerpos, antígenos, quimiocinas, etc.)
puede inducir estabilización de pequeñas y pasajeras balsas
y generación de microdominios grandes y estables ricos en
moléculas señalizadoras específicas. De esta forma, la
presencia en la membrana plasmática de distintos dominios
lipídicos pueden representar una estrategia para
compartimentalizar funciones celulares específicas al
ensamblar o separar receptores y componentes
señalizadores.