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Apuntes Tecnicas de Separacion Cromatografica PDF
Apuntes Tecnicas de Separacion Cromatografica PDF
1. Introducción
Tsvet empacó material adsorbente en una columna de vidrio vertical (de unos cuantos
centímetros de diámetro). Posteriormente, por dicha columna vertical vertió una
disolución que contenía la mezcla de pigmentos provenientes de las hojas molidas de
una planta. Pasados unos minutos, el material empacado en la columna había
adquirido una coloración diferente por segmentos. Es decir, se había logrado la
separación de los pigmentos naturales de la planta. En cada segmento de color
definido había un pigmento diferente.
Como su nombre indica las técnicas de separación sirven para separar componentes de
una muestra.
Es importante notar que, en general, las técnicas de separación sólo sirven para eso,
separar, y que no nos dan ninguna otra información acerca de la naturaleza de los
componentes separados, de ahí que en la mayoría de los casos estas técnicas o métodos
de separación vayan acompañados de otros métodos de análisis (composicional y/o de
grupos) con el fin de identificar y en algunos casos cuantificar los componentes de la
muestra separados.
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Existen al menos tres puntos importantes de incidencia de la cromatografía en la
Ciencia y Tecnología de Materiales:
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Muestra
NO SI
¿Hay que solubilizarla?
NO
¿Es soluble? Digestión
NO ¿Descompone NO ¿Forma NO Otros
¿Es volátil?
térmicamente? plasma? métodos SI
SI
SI SI SI
SI
GAS DISOLUCIÓN
NO NO
a) Cromatografía
b) Fase estacionaria
Es una de las dos fases que forman un sistema cromatográfico. Puede ser un sólido, un
gel o un líquido. Si es un líquido, puede estar distribuido en un sólido, el cual puede o
no contribuir al proceso de separación. El líquido puede también estar químicamente
unido al sólido (fase ligada) o inmovilizado sobre él (fase inmovilizada).
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desarrollo inicial de la cromatografía líquida se usó el término "fase líquida" para
referirse a la fase móvil, frente a la "fase sólida", es decir, la estacionaria. Debido a esta
ambigüedad, se desaconseja utilizar el término "fase liquida". Si se debe expresar el
estado físico de la fase estacionaria, se propone el uso de adjetivos, tales como fase
estacionaria líquida, fase estacionaria sólida, fase ligada sólida o fase inmovilizada
sólida.
c) Fase ligada
Una fase estacionaria que está unida de forma covalente a las partículas de soporte o a la
pared interior de la columna (lugar donde se produce la separación).
d) Fase inmovilizada
Una fase estacionaria que está inmovilizada sobre las partículas del soporte o sobre la
pared interior de la columna, por ejemplo por polimerización in situ (entrecruzamiento
químico) tras un recubrimiento.
e) Fase móvil
Fluido que se filtra a través o a lo largo del lecho estacionario, en una dirección
definida. Puede ser un líquido (cromatografía cíquida, LC), un gas (cromatografía de
gases, GC) o un fluido supercrítico (cromatografía con fluido supercrítico). En la
cromatografía de gases se puede usar la expresión gas portador para la fase móvil. En
la cromatografía de elución se usa también para la fase móvil la expresión eluyente.
f) Eluir
g) Efluente
h) Muestra
i) Componentes de la Muestra
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j) Soluto
k) Disolvente
l) Zona
m) Cromatograma
n) Cromatografiar
o) Cromatógrafo
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3.1.2. Cromatografía de Reparto
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fases es su límite de exclusión que se define como la masa molecular a partir de la cual
los compuestos pasarán a través del lecho estacionario sin experimentar retención.
Moléculas pequeñas
Moléculas grandes
Pared de columna
cromatográfica
Disolvente
Figura 2.1.- Esquema del proceso de separación por cromatografía de exclusión por
tamaños.
La cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre matrices que tienen una carga
neta (positiva en el esquema de la Figura2.2). La carga de la matriz de la columna así
como la carga de las moléculas dependerá del pH del disolvente y de su fuerza iónica
(proporcional a la concentración de iones). En unas condiciones determinadas serán
retenidas en la columna las moléculas o especies que tengan una carga complementaria
a la de la matriz del gel (las moléculas cargadas negativamente serán retenidas por una
matriz cargada positivamente), siendo eluidas las restantes. Para eluir las moléculas
retenidas se puede variar la carga iónica del disolvente o su pH de forma que se alcance
el punto isoeléctrico de la moléculas o especies de interés o el de la matriz,
neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las moléculas en la columna.
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Especies positivas
+ + -
- + Especies negativas
- +
+ - +
+ - Partículas sólidas (matriz)
Flujo del disolvente
cargada positivamente
- + -
+ + - Pared de columna
- - - cromatográfica
- + + +
- Disolvente
- - +
+
+ -
+ -
-
- + +
Figura 2.2. Esquema del proceso de separación por cromatografía de intercambio
iónico.
Cromatografía
Fase Móvil
Figura 2.3.- Análisis por desarrollo. Esquema de sistema para hacer cromatografía en
capa fina.
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3.2.2. Análisis por elución (Cromatografía de elución)
Procedimiento en el que la fase móvil pasa de forma continua a través o a lo largo del
lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una
pequeña cantidad en un tiempo breve. Esta técnica presenta la desventaja de que los
componentes con retenciones muy altas pueden no ser observados.
Muestra Fase Móvil
Sorbente Cromatograma
Placa Porosa
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Fase Móvil
Con la muestra A+B+C
A+B+
C
A+B
Placa Porosa
Efluente
Figura 2.5.-
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3.4.1. Técnicas cromatográficas
Procedimiento de elución en el que la fase estacionaria es más polar que la fase móvil.
Este término se usa en cromatografía líquida para resaltar el contraste con la
cromatografía con fase invertida.
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Procedimiento en el que la composición de la fase móvil permanece constante a lo largo
del proceso de elución.
En la Figura 2.6 se muestran los parámetros de retención para el caso de una única
banda cromatográfica. Se observa que el tiempo de retención de la banda puede
dividirse en dos partes: i) el tiempo muerto, tM; ii) y el tiempo transcurrido a partir de
este momento hasta la aparición del máximo de la banda, tR’.
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Figura 2.6. Cromatograma de un componente y parámetros más característicos (Figura
tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.:
"Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993).
t'R t R − t M
K'= = (2.1)
tM tM
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Figura 2.7. Parámetros característicos de un pico cromatográfico (Figura tomada de:
ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introducción
a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993).
3.6.3. Eficacia
2
t
n= R
σ
(2.2)
Así, el número de platos teóricos de una columna puede calcularse utilizando la anchura
de uno de sus picos, normalmente el último que pueda medirse directamente sobre el
cromatograma (Figuras 2.7 y 2.8) utilizando las expresiones:
2
t
n = 16 R (2.3)
Wb
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2
t
n = 5.545 R (2.4)
Wh
L
h= (2.5)
n
“Es de destacar que al considerar la eficacia, solamente se han tenido en cuenta los
efectos propios de la columna, aunque existen otros parámetros del sistema (anchura de
banda inicial, velocidad de la fase móvil, etc.) que contribuyen al ensanchamiento de las
bandas cromatográficas. De esta manera, no siempre la baja eficacia de un sistema
cromatográfico es atribuible a la columna, sino a otros factores que será preciso
optimizar”
Hasta el momento, únicamente se ha considerado el caso en que existe una sola banda
cromatográfica; sin embargo, el objeto de la cromatografía es separar mezclas de varios
componentes y es de suma importancia considerar la separación entre ellos. Debe
recordarse siempre que, independientemente del número de componentes que pueda
tener la mezcla, el problema de separación de todos ellos queda siempre reducido al de
las dos bandas adyacentes más difíciles de separar. La separación entre dos bandas
cromatográficas (Figura 2.8) puede estudiarse en función de dos parámetros:
t 'R 2
α= (2.6)
t ' R1
- La resolución, Rs, definida como el cociente de la distancia entre los centros de las
dos bandas y el valor medio de la anchura de las mismas.
2∆t
Rs =
Wb1 + Wb 2 (2.7)
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Figura 2.8.- Cromatograma de dos bandas y parámetros para su resolución. (Figura
tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.:
"Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993).
Los lechos cromatográficos utilizados para columnas, son generalmente de un solo uso
y se preparan en el propio laboratorio. La Figura 2.9 muestra un esquema de una
columna de gravedad. El recipiente es normalmente un tubo de vidrio provisto de algún
tipo de llave para regular el flujo de la fase móvil. Es muy importante que la fase
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estacionaria esté distribuida de forma homogénea, sin fracturas ni burbujas de aire,
siendo también fundamental que los extremos de la columna sean planos para evitar
eluciones simultáneas de más de una fracción, especialmente si la capacidad de
separación de la columna no es muy grande. El método más recomendable de llenado
consiste en añadir al tubo, una vez colocado en posición vertical, una pasta formada con
la fase estacionaria y un disolvente de menor actividad que la fase móvil a utilizar,
dejando salir el disolvente sobrante a medida que la fase estacionaria va sedimentando.
Figura 2.9.- Esquema de una columna de gravedad (Figura tomada de: ALBELLA,
J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introducción a la ciencia
de materiales". C.S.I.C., 1993).
Las columnas de gravedad operan normalmente por elución, y el control del contenido
de la fase eluida se realiza en la práctica recogiendo un gran número de pequeñas
fracciones que se analizan por medio de alguna otra técnica, normalmente cromatografía
de capa fina.
Aquí se utiliza un lecho abierto formado por una capa fina de fase estacionaria
soportada sobre una superficie plana. La elución se consigue por el movimiento capilar
ascendente de la fase móvil.
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Las fases estacionarias utilizadas normalmente para cromatografía en capa fina son,
alúmina o gel de sílice para cromatografía de adsorción y, celulosa para cromatografía
de adsorción o de reparto.
En la cromatografía en capa fina, se utiliza normalmente el análisis por desarrollo. El
proceso se lleva a cabo en recipientes cerrados, por ascensión del disolvente, debiendo
colocarse en el interior del recipiente cubriendo una de sus paredes una capa de papel de
filtro impregnado en la fase móvil (disolvente) para conseguir una atmósfera saturada en
ella. Una vez desarrollada la placa, la visualización de los cromatogramas se realiza,
caso de no tratarse de compuestos coloreados, mediante iluminación con luz
ultravioleta, si la fase estacionaria lleva un indicador de fluorescencia, o bien mediante
pulverizado de la placa con reveladores de carácter general (yodo, ácido sulfúrico, etc.)
si se quieren visualizar únicamente compuestos de un tipo determinado.
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Figura 2.10.- Determinación de Rf y Rx en cromatografía en capa fina (Figura tomada
de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.:
"Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993).
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Figura 2.11.- Esquema de un sistema cromatográfico Gas-Líquido. Componentes
básicos (Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y
SERRATOSA, J.M.: "Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993).
i) Gas portador
He, Ar, N2, CO2, H2. La elección del gas está con frecuencia determinada por el tipo de
detector que se utilice. Los caudales se controlan mediante un regulador de presión de
dos niveles colocado en el cilindro de gas y algún tipo de regulador de presión o
regulador de flujo instalado en el cromatógrafo. Los caudales pueden determinarse
mediante un rotámetro en la cabeza de la columna y un medidor de pompas de jabón al
final de la columna.
El método más común de inyección de muestra implica el uso de una microjeringa para
inyectar una muestra líquida o gaseosa a través de un diafragma o “septum” de goma de
silicona, en una cámara de vaporización instantánea situada en la cabeza de la columna.
Las muestras sólidas se introducen como disoluciones o, alternativamente, en viales
cerrados herméticamente de paredes delgadas que pueden colocarse junto a la cabeza de
la columna y ser perforados o aplastados desde el exterior.
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Figura 2.12.- Mejora de un cromatograma por programación de temperatura en
columna (Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.; MIRANDA, T. y
SERRATOSA, J.M.: "Introducción a la ciencia de materiales". C.S.I.C., 1993).
En general, la resolución óptima se asocia con una menor temperatura; sin embargo, la
consecuencia de una reducción de temperatura es un aumento en el tiempo de elución y
por tanto, del tiempo que se necesita para completar el análisis. Las Figuras 2.12a y
2.12b ilustran este principio.
iv) Detectores
- Adecuada sensibilidad
- Buena estabilidad y reproducibilidad
- Una respuesta lineal para los componentes que se extienda a varios órdenes de
magnitud
- Intervalo térmico de trabajo (25 – 400)ºC
- Un tiempo de respuesta corto que lo haga independiente del caudal
- Alta fiabilidad y manejo sencillo
- Respuesta semejante para todos los componentes
- No destructivo
-
a) DETECTOR DE IONIZACIÓN DE LLAMA
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En un quemador, el efluente de la columna se mezcla con hidrógeno y con aire para
luego encenderse eléctricamente. La mayoría de los compuestos orgánicos cuando se
pirolizan a la temperatura de una llama de hidrógeno/aire, producen iones y electrones
que pueden conducir la electricidad a través de la llama. Entre el extremo del quemador
y un electrodo colector situado por encima de la llama, se aplica una diferencia de
potencial de unos pocos cientos de voltios y para la medición de la corriente que resulta
se utiliza un amplificador operacional de alta impedancia.
Se basa en los cambios de la conductividad térmica del gas portador ocasionados por la
presencia de las moléculas del componente a analizar. El sensor consiste en un elemento
calentado eléctricamente cuya temperatura, a una potencia eléctrica constante, depende
de la conductividad térmica del gas circundante. El elemento calentado puede ser un
hilo fino de platino, oro o wolframio, o también, un termistor semiconductor. La
resistencia del hilo o del termistor da una medida de la conductividad térmica del gas.
Este detector posee las siguientes características:
- Simple
- Amplio rango dinámico lineal (~ 105)
- Respuesta universal (especies orgánicas e inorgánicas)
- Carácter no destructivo
- Sensibilidad relativamente baja (~ 10-8 g de soluto/ml de gas portador)
c) DETECTOR TERMOIÓNICO
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platino o titanio). Un e- del emisor provoca la ionización del gas portador (con
frecuencia N2) y la producción de una ráfaga de e-. De este proceso de ionización, en
ausencia de especies orgánicas, resulta una corriente constante entre un par de
electrodos. Sin embargo, la corriente disminuye en presencia de moléculas orgánicas
que tiendan a capturar electrones.
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La Figura 2.13 pone de manifiesto que los distintos procedimientos que utilizan la
cromatografía de líquidos tienden a ser complementarios por lo que a sus campos de
aplicación se refiere. Así, para solutos con masas moleculares superiores a 10000, a
menudo se utiliza la cromatografía de exclusión, aunque ahora también es posible tratar
estos compuestos con cromatografía de reparto de fase inversa. Para especies iónicas de
baja masa molecular, se utiliza con frecuencia la cromatografía de intercambio iónico.
Los métodos de reparto se aplican a las especies polares pero no iónicas. Además, este
procedimiento se utiliza muchas veces para la separación de los integrantes de una serie
homóloga. La cromatografía de adsorción se elige con frecuencia para separar especies
no polares, isómeros estructurales y grupos de compuestos como, por ejemplo, los
hidrocarburos alifáticos de los alcoholes alifáticos.
Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de introducirlos en el
recipiente, consiste en filtrarlos mediante vacío a través de un filtro de poro muy
pequeño. Este tratamiento elimina los gases además de la materia en suspensión.
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Figura 2.14.- Esquema de los componentes fundamentales de un cromatógrafo de
líquidos de alta resolución (Figura tomada de: ALBELLA, J.M.; CINTAS, A.M.;
MIRANDA, T. y SERRATOSA, J.M.: "Introducción a la ciencia de materiales".
C.S.I.C., 1993).
v) Precolumnas
vi) Termostatos
vii) Detectores
Los detectores en cromatografía de líquidos son de dos tipos: a) los basados en una
propiedad de la disolución responden a una propiedad de la fase móvil, tal como el
índice de refracción, la constante dieléctrica o la densidad que se modifica por la
presencia de los analitos y b) los detectores basados en una propiedad del soluto
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responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia en el UV-VIS, la
fluorescencia, o la intensidad de dispersión que no son propias de la fase móvil.
8.- Bibliografía
2. H.H. Willard, L.L. Merritt Jr.,J.A. Dean, F.A. Settle Jr., “Métodos
Instrumentales de análisis”, Grupo Editorial Iberoamericana S.A. de C.V.,
México (1991).
4. Liquid chromatography column theory Scott, Raymond P.W. John Wiley &
Sons (1992).
Cromatografía de gases
http://www.uib.es/depart/dqu/dquo/pau/Cromatograf%92a/chrom10/chrom/GC/concept/
main.htm
http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.htm
http://ciencias.ucv.cl/micro/croma/cro1.htm
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