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BACTERIOLOGÍA MÉDICA HUMANA

LABORATORIO. 2 (2020)

Aislamiento e Identificación de Enterobacterias

1. Introducción

Este grupo está compuesto por bacilos Gram negativos, muchos de ellos capsulados, que se encuentran
ampliamente distribuidos en la naturaleza; forman parte de la flora normal del tracto intestinal del hombre y de los
animales. Son el grupo bacteriano que se aíslan con mayor frecuencia de los especímenes clínicos y esta
conformado por varias familias que fueron vistas en la parte teórica de este curso.

Se encuentran involucrados en un gran número de infecciones del hombre, como infecciones de heridas, neumonía,
septicemia, infecciones urinarias, síndromes diarreicos, etc. Su importancia como patógenos ha aumentado debido
al amplio uso de los antibióticos, la quimioterapia y los demás tratamientos inmunosupresores y a la capacidad que
tienen para adquirir y transmitir factores de resistencia antibiótica.

Los pacientes inmunosuprimidos o debilitados tienen mayor susceptibilidad a sufrir infecciones hospitalarias por
estas bacterias, debido a que ellas colonizan el medio ambiente hospitalario y los instrumentos de procedimientos
invasivos como cateterización, broncoscopia, colposcopia, etc.

En el agar sangre de cordero las colonias de las enterobacterias son mucosas o lisas, grisáceas y la mayoría
presentan sus bordes enteros. La hemólisis puede no estar presente, sin que constituya una característica de
identificación. En agar EMB ( Agar Eosina, Azul de Metileno ) y en Agar MacConkey , las colonias pueden ser
pigmentadas de un color violeta a rojo respectivamente, lo cual depende de la capacidad de cada microorganism de
fermentar la lactosa. Siendo los fermentadores los que desarrollan el color más oscuro y las no fermentadoras de la
lactosa las que se observan incoloras o de color rosado claro . Esta característica permite hacer una diferenciación
presuntiva inicial entre las enterobacterias que pueden hidrolizar este disacárido, las llamadas “lactosa positivas”,
y las que no pueden hacerlo; llamadas “lactosa negativas”; que son transparentes o de un color rosado muy pálido,
como ya se mencionó.

La diferenciación de las enterobacterias se basa principalmente en la determinación de sus enzimas. La presencia

de estas enzimas pueden ser identificadas utilizando medios de cultivo de prueba, que contienen los sustratos
específicos para ellas e indicadores que pueden detectar su utilización, por la presencia de compuestos
intermediarios o finales de su metabolismo. Vale la pena destacar dentro de las enterobacterias, las colonias de
Proteus sp, que presentan alrededor un crecimiento a manera de velo, que difunde por el medio de cultivo, esto es
conocido como el fenómeno de swarming.

La mayoría de las bacterias de este grupo presentan las siguientes características:

- Fermentan glucosa.
- No poseen enzima citocromo oxidasa (Con excepción de Plesiomonas)
- Reducen nitratos a nitritos

Para llegar a la identificación microbiológica , generalmente se emplea primariamente el siguiente flujo grama :
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Bacilos Gram
Negativos

Fermenta la glucosa

Si No

Oxidasa Oxidasa
Oxidasa positiva Oxidasa negativa Positiva negativa

Peudomonas Acinetobacter ( cocos)

Vibrio
Enterobacterias Bulkolderia Stenotrophomonas
Aeromonas
Shewanella
Plesiomonas
Campylobacter
Figura 1: Flujograma de identificación de Bacilos Gram negativos más frecuentes. (Autoría: Andrey Payán González)

2. Procedimiento:

Observe los tipos de colonias de enterobacterias que se pueden encontrar en creciendo en las placas de agar
sangre y en MacConkey según la explicación el profesor

Describa la morfología de las colonias que le correspondieron : tamaño, aspecto, bordes, propiedades hemolíticas,
producción de pigmentos, fermentación de lactosa, etc. Para esto, consulte el documento “Procedimientos
paratécnicos”, en el apartado: “Términos Empleados Para La Descripción De Las Colonias”.

Para al identificación de las enzimas presentes en cada microorganismo se emplea una batería de pruebas
bioquímicas compuesta por los medios de prueba: Citrato, Malonato, LIA, MIO, Urea, TSI, y DNAsa. Para abordar
su interpretación, se recomienda que se revisen las guías de pruebas bioquímicas del semestre anterior.

Interprete los resultados de las pruebas que le correspondieron, anótelos e identifique la bacteria que ha
procesado; para esto, emplee la tabla de identificación de enterobacterias que está en el grupo de la WEB según lo
explicado por el profesor.

Calcule de probabilidad en bases de datos o grado de confianza en la Identificación (ver Anexo 1). Correlacione su
bacteria identificada con el caso clínico asignado e interprete el antibiograma correspondiente guiándose por las
normas del CLSI. Tiene una semana para entregar ese informe.

3. Ampliación del tema:

Nota: Estas preguntas deben ser resueltas en el informe de del caso clínico que le correpondió

1. ¿Qué sustancias inhibidoras poseen los medios que ha utilizado en esta práctica y cuál es su función específica?
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2. Aunque para la identificación enterobacterias las pruebas deben ser leídas en unos tiempos máximos indicados
en las tablas, existen pruebas bioquímicas que, para otras bacterias de metabolismo lento, deben ser
leídas en unos tiempos específicos antes de ser consideradas definitivamente como negativas. Consulte
de una fuente bibliográfica válida, los periodos de incubación máximos para las siguientes pruebas
bioquímicas:

a) Citrato
b) Malonato
c) Hidrólisis de la urea
d) OF
e) Hidrólisis de gelatina

Por favor, cite cada vez la fuente consultada, empleándolas normas Vancouver de citación
3. ¿Para qué se utiliza la prueba de Voges-Poskauer y cuál es su fundamento?
4. ¿En qué consiste la prueba de ONPG?
5. Mencione cuatro métodos o sistemas para identificación de Enterobacterias, diferentes a los macrométodos que
ha realizado en esta práctica.

4. Bibliografía

1. Manual of BBL: Products and Laboratory procedures 6th ed.,Cockeysville, Maryland 1988.
2. Manual de medios de cultivo Merck. E Merck, Darmstadt: Barcelona 1990 y 1994. 3a ed. Panamericana. B.Aires,
1991.
3. MacFaddin, Jean F. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. - 3ed. Editorial
Médica Panamericana, 2003.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. Bailey and Scott. Diagnóstico Microbiológico. 11a edi. Editorial Médica
Panamericana. Buenos Aires, 2004..
5. Koneman, E.W. y otros. Diagnóstico Microbiológico. la Edición. Texto y Atlas a color. Editorial Médica
Panamericana. Buenos Aires, 1999.
6 Manual of Clinical Microbiology 12th edit . Carrol KC. et all. ASM Press. EEUU.. 2019
7. Clinical microbiology procedures handbook, (4ed.),.Leber AL..ASM press. EEUU. 2016.
8. The OXOID MANUAL. Bridson E. Y. 9th Edition. 2006.(recurso en línea) Consultado en :
http://www.analisisavanzados.com/modules/mod_tecdata/manuales/oxoid-manual-9th-edition.pdf
http://www.clinicord.com/wp-content/uploads/descargas/manual_oxoid.pdf.
9. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, Sixteenth Informational Supplement. (M100-S16).
Clinical and Laboratory Standards Institute, 2019
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ANEXO 1

1.1. Cálculo de Probabilidad en Bases de Datos o Grado de Confianza en la Identificación

Para entender los siguientes cálculos debe recurrir a la “Tabla de Identificación de Enterobacteriaceas”. A
continuación se muestran dos formas de hacer los cálculos de probabilidad

1.1.1 Forma 1

Prueba Bioquímica Aislado Concordancia con los datos en la

problema tabla
E. coli Enterobacte Serratia Probabilidad de que sea el
r marcescen germen
aerogenes s
TSI A/A 0,95 0,95 0,95 Se divide el número uno entre el
producto de la multiplicación de
las concordancias
GAS POSITIV 0,95 1 0,55
O
H2S NEGATI 0,99 1 1 E. coli: 1 / 0,0000883=11325
VO

CITRATO POSITIV 0,01 0,95 0,98 E. aerogenes: 1 / 0,0411971= 24

O

UREA NEGATI 0,99 0,98 0,85 S. marcescens: 1 /

VO 0,0079471=126

MOVILIDAD POSITIV 0,95 0,97 0,97 Orden de probabilidad:

A
LISINA K/K 0,9 0,98 0,99 1: E aerogenes 1:24

ORNITINA K/K 0,65 0,98 0,99 2. S. marcescens 1:126

INDOL NEGATI 0,02 1 0,99 3. E. coli: 1:11325

VO

MALONATO NEGATI 1 0,05 0,97 El número más bajo es la

VO respuesta
DNAsa 25 ºC NEGATI 1 1 0,02
VO
Frecuencia de 0,000088 0,0411971 0,0079471 Quiere decir que la posibilidad
ocurrencia de cada 3 de que sea E. aerogenes es de
una 1 en 24 veces que se de esta
combinación

Adaptado de Bailey & Scott Diagnóstico Microbiológico. (11ª ED.):BETTY A. FORBES, DANIEL F. SAHM, ALICE S. WEISSFELD,
EDITORIAL MÉDICA PANAMERICANA, 2004 Pag 167-168
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1.1.2. Forma 2

Prueba Bioquímica Aislado Concordancia con los datos en la

problema tabla
E. coli Enterobacte Serratia Probabilidad de que sea el
r marcescen germen de entre los tres
aerogenes s probados.
TSI A/A 0,95 0,95 0,95 Cada frecuencia se divide por la
suma de todas las frecuencias y
luego se multiplica por 100 para
dar el % de identificación
GAS POSITIV 0,95 1 0,55
O
H2S NEGATI 0,99 1 1 E. coli: (0,0000883/ 0,0492325)x
VO 100= 0,1%

CITRATO POSITIV 0,01 0,95 0,98 E. aerogenes: (0,0411971/

O 0,0492325)x 100= 83,6 %

UREA NEGATI 0,99 0,98 0,85 S. marcescens: (0,0079471//

VO 0,0492325)x 100= 16,1 %

MOVILIDAD POSITIV 0,95 0,97 0,97 El número más alto es la

A respuesta
LISINA K/K 0,9 0,98 0,99 Orden de probabilidad:
ORNITINA K/K 0,65 0,98 0,99 1: E aerogenes 83.6%
INDOL NEGATI 0,02 1 0,99 2. S. marcescens 16.1 %
VO
MALONATO NEGATI 1 0,05 0,97 3. E. coli: 0.1%
VO
DNAsa 25 ºC NEGATI 1 1 0,02
VO
Frecuencia de 0,000088 0,0411971 0,0079471 Quiere decir que la probabilidad
ocurrencia de cada 3 de que la bacteria aislada sea
una E. aerogenes es de 83.6%
Suma de las 3 0,0492325
frecuencias

Tomado de Koneman, E.W. et al. Diagnóstico Microbiológico Texto y Atlas color. 5a ed. Editorial Médica
Panamericana. Buenos Aires, 1999.Capit 4, pag 237

Nota: Para el manejo de la “Tabla Para la identificación de las Enterobacterias Más Comunes” (en un archivo aparte)
tenga en cuenta dos principios:
1. Lo que aparece en la tabla siempre son porcentajes de positividad
2. Lo que yo anoto para hacer mis cálculos es el porcentaje de CONCORDANCIA con el dato que aparece
anotado
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Ejemplo :

Yo tengo en mis resultados: En la Tabla aparece: Entonces debo anotar :

A/A A/A 0,7
70%
A/A K/A 0,2
80%
Negativo 1% 0,99
Positivo 100% 1
Positivo 1% 0,01
Positivo 0% Se descarta la bacteria a la cual
pertenece esta prueba
Negativo 100% Se descarta la bacteria a la cual
pertenece esta prueba

1.2 Ejercicios de Identificación de Enterobacterias

Identifique las siguientes especies bacterianas utilizando la tabla de identificación de la familia Enterobacteriaceae
que usted aprendió a manejar en el laboratorio # 2.

Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3 Cepa 4 Cepa 5

TSI K/A A/A K/A A/A K/A
Gas + - + + +
H2S - - + - -
Citrato + - + + -
Urea + + - + +
Movilidad + - + + +
Lisina K/A K/A K/K K/K R/A
Ornitina K/K K/K K/K K/K K/K
Indol + + - - +
Malonato - - - + -
DNAsa 25 °C - - - - -
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ANEXO 2
Figura 1:

Principios Generales Aplicados a Muchos de los Medios

Diferenciales Basados en Cambios de pH
Reacción Actividad Reacción aparente.
Substrato (Notada por el indicador Algunos ejemplos
aeróbica o microbiana apropiado en el medio))
anaeróbica

Varios aminoácidos en O F y medios d e

Aeróbica desaminación alcalina
peptonas, extracto de fermentación, TSI, LIA y otros
levaduras, etc.. medios diferenciales

En cantidad cantidad relativamente O/F y medios d e

fermentación
relativamente grande de ácido fermentación, Mac Conkey,
Uno o más grande XLD , TSI
Azucares
específicos
En cantidad cantidad relativamente
fermentación XLD Agar, KIA, TSI
relativamente pequeña de ácido
pequeña.
Anaeróbica
Aminoácidos específicos en descarboxilac
alcalina XLD, MIO, LIA
cantidades relativamente ión
pequeñas

Reducción Color Negro

Tiosulfato con formación (no es una reacción XLD, Hecktoen, LIA, TSI
de H2S relacionada con el pH)

Modificado por Andrey Payán G. Tomado de: http://www.jlindquist.net/generalmicro/102diff.html Consultado el 01 -04-2008

Figura 2:
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ANEXO 3
Figura 3: Flujograma de identificación de Géneros de Bacilos Gram negativos más
frecuentes

Bacilos Gram
Negativos

Fermenta la glucosa

Si No

Oxidasa Oxidasa
Oxidasa positiva Oxidasa negativa Positiva negativa

Peudomonas Acinetobacter ( cocos)

Vibrio
Enterobacterias Bulkolderia Stenotrophomonas
Aeromonas
Shewanella
Plesiomonas
Campylobacter
 ANEXO 4
Figura 4: Morfología Típica en la coloración de Gram de diferentes géneros de Gram negativos

Tomado de: . García LS. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 3 th Edition. Asm Press. 2011.