CROMATOGRAFÍA

Cromatografía

Índice de técnicas

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Definición:

La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes que se han de

separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria, F.E.)
mientras que la otra (fase móvil, F.M.) se mueve en una dirección definida.

Otras definiciones (en la web): cromatograma, cromatografiar, cromatógrafo, fase ligada, fase
inmovilizada, eluir, efluente, muestra, componentes de la muestra, soluto, disolvente, zona.

Otros términos: columna, lecho cromatográfico, empaquetamiento... (véase la sección de

nomenclatura).

Hay 3 métodos principales de cromatografía: frontal, de desplazamiento y de elución. Sólo

consideraremos este último, que es el más habitual, al menos en Bioquímica y Biología Molecular.

Clasificación de las técnicas cromatográficas

1. De acuerdo con la forma del lecho cromatográfico:

1.1 Cromatografía plana

Se realiza sobre papel u otro material sólido. Suele llamarse “en capa fina” o “en capa delgada”
porque la fase estacionaria recubre un soporte plano y rígido.

Cromatografía ascendente en capa fina Disposiciones experimentales para realizar una

cromatografía en papel descendente (izqda.) y ascendente (dcha.).

Cromatografía ascendente en capa fina: colocación de una muestra (con 3 componentes),

desarrollo de la cromatografía y revelado del cromatograma.
Rf es el factor de retardo o retraso, que mide la movilidad relativa de cada componente con
respecto al máximo posible, la distancia recorrida por el frente de fase móvil.

Componente 1: Rf = a / D

Componente 2: Rf = b / D

Componente 3: Rf = c / D

1: aplicación de la muestra

2: se sumerge el extremo inferior en la fase móvil

3 a 5: la fase móvil asciende por capilaridad y se va produciendo la separación de los componentes

6: se marca el frente de avance del disolvente y se deja secar la placa

7: revelado de los componentes ya separados y medida de su avance

1.2 Cromatografía en columna

F.M. líquida, F.E. sólida: columnas de varios mm de diámetro y varios cm de longitud.

F.M. gas, F.E. sólida: columnas de unos 5 mm de diámetro y 1-20 m de longitud.

F.M. gas, F.E. líquida: columnas “capilares”, con menor diámetro y 30-100 m (incluso más) de
longitud.

Puede verse una animación del avance de las moléculas por la columna.

Funcionamiento de una columna, mostrando la carga de la muestra y diversos momentos a lo

largo de la elución:

Muestra depositada sobre el lecho cromatográfico

La muestra penetra en el lecho

Se añade fase móvil

Comienza la separación de los componentes de la muestra

Eluye el primer componente

Eluye el segundo componente

2. De acuerdo con el estado físico de las fases

fase móvil

líquida gaseosa

“cromatografía

líquida”“cromatografía

de gases”

fase

estacionaria sólida Cromatografía

líquido-sólido Cromatografía

gas-sólido

líquida Cromatografía

líquido-líquido Cromatografía

gas-líquido

2.1 Cromatografía de gases

Con fase móvil gaseosa.

Cromatografía gas-líquido

Cromatografía gas-sólido

2.2 Cromatografía líquida

Con fase móvil líquida.

Cromatografía líquido-líquido

Cromatografía líquido-sólido

2.2.1 HPLC
Cromatografía líquida de alta presión o de alta eficacia (cuando se emplean particulas de fase
estacionaria muy pequeñas y una presión de entrada relativamente alta).

[HPLC, de High Pressure Liquid Chromatography / High Performance Liquid Chromatography]

3. De acuerdo con el mecanismo de separación

Nota: Ésta es una clasificación conceptual; en la práctica, el mecanismo que rige la separación
puede ser mixto; p.ej., adsorción+reparto.

3.1 Cromatografía de adsorción

(atención: es adsorción, no absorción)

Diferente afinidad de adsorción de los componentes de la muestra sobre la superficie de un sólido

activo. La adsorción es la capacidad de las superficies para fijar moléculas.

La F.E. es siempre sólida. Ejemplos: alúmina, gel de sílice, carbón activo, fosfato cálcico,
hidroxiapatito...

3.2 Cromatografía de reparto

Diferente solubilidad de los componentes de la muestra en la fase estacionaria (caso de la

cromatografía de gases), o diferentes solubilidades de los componentes en las fases móvil y
estacionaria (caso de la cromatografía líquida).

Ejemplos: en cromatografía plana, la F.E. es el agua o disolvente asociados a la celulosa (papel) o al

soporte sólido que forma la capa fina; en columna, como F.E. se usan tierra de diatomeas, gel de
sílice, celulosa en polvo...

3.3 Cromatografía de intercambio iónico

Diferente afinidad de los componentes de la muestra para el intercambio de iones. ¿Qué significa
intercambio de iones? La F.E. posee carga eléctrica y por ello interacciona con los componentes de
la muestra que tienen carga opuesta.

Intercambio aniónico: F.E. con carga positiva, une aniones, bien los del disolvente (F.M.) o bien los
de la muestra (de ahí la palabra intercambio).
Intercambio catiónico: F.E. con carga negativa, une cationes, bien los del disolvente (F.M.) o bien
los de la muestra.

Ejemplos de grupos funcionales intercambiadores (unidos covalentemente a la F.E. sólida):

intercambiadores catiónicos intercambiadores aniónicos

carboxilato

sulfonato

fosforilo

carboximetilo (CM)

sulfopropilo (SP) dietilaminoetilo (DEAE)

dietil-(2-hidroxipropil)aminoetilo

polietilenimina

La F.E. suele llamarse “resina” (de intercambio iónico).

Puede verse una animación de una cromatografía de intercambio aniónico.

Las biomoléculas poseen frecuentemente varios grupos ionizables, de modo que su carga eléctrica
neta depende del pH del medio en el que se encuentran (es decir, la F.M.).

3.4 Cromatografía de exclusión

También se llama de exclusión molecular. Estrictamente, se basa en diferencias de tamaño, forma

o carga entre las moléculas de los distintos componentes de la muestra, pero lo más habitual es
aprovechar las diferencias de forma y tamaño. En este caso, se la llama también cromatografía de
exclusión por tamaño, de filtración en gel, de permeación en gel o de tamiz molecular.

Las moléculas más pequeñas pueden penetrar en los poros de las partículas que forman el gel
(fase estacionaria, relleno de la columna), por lo que tienen mayor recorrido y se retarda su
avance por la columna. Las moléculas de tamaño superior al de los poros sólo circulan por el
exterior de las partículas (se dice que son excluidas), por lo que avanzan más rápido y eluyen
antes.

BIBLIOGRAFÍA

http://biomodel.uah.es/tecnicas/crom/inicio.htm