UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPE

CARRERA DE BIOTECNOLOGIA

FORMATO PARA LA PRESENTACIÓN DE PROPUESTAS DE TRABAJO DE

INMUNOLOGIA

1. DATOS GENERALES
Nombre o Título del proyecto (Español):
Generación de un nanoanticuerpo derivado de llama (Lama glama) específico para la proteína de barra paraflagelar de
Tripanosoma cruzi.
Nombre o Título del proyecto (Inglés):
Generation of a llama derived nanoantibody (Lama glama) specific for the paraphlagelar rod protein of Trypanosoma
cruzi.

Nombre del Departamento/ Carrera: Programa de Postgrado:

Centro Responsable: Ingeniería en Biotecnología
Ciencias de la Vida y la Agricultura
/Laboratorio de Inmunología y
Virología

Línea de Investigación: Grupo de Investigación Asociado:

NANOTECNOLOGÍA Centro de Investigación para la Salud en América Latina (CISEAL)

Tipo de Investigación: Disciplina Científica: Objetivo Socio Económico:

Desarrollo Experimental Ciencias Médicas Salud

Objetivos del Plan de Desarrollo Nacional Toda una Vida.

Objetivos
Objetivo 1: Garantizar una vida digna con iguales oportunidades para todas las personas
Políticas
Art. 350: El sistema de educación superior tiene como finalidad la formación académica y profesional con visión científica
y humanista; la investigación científica y tecnológica; la innovación, promoción, desarrollo y difusión de los saberes y las
culturas; la construcción de soluciones para los problemas del país, en relación con los objetivos del régimen de desarrollo.
Art. 360: El sistema garantizará, a través de las instituciones que lo conforman, la promoción de la salud, prevención y
atención integral, familiar y comunitaria, con base en la atención primaria de salud; articulará los diferentes niveles de
atención; y promoverá la complementariedad con las medicinas ancestrales y alternativas

Área de Conocimiento:
 Inmunología
 Virología
 Bioinformática
 Microbiología
Monto
PLAZO DE EJECUCIÓN
Fecha de inicio Fecha de finalización
(05/08/2019) (13/03/2020)

PERSONAL RESPONSABLE DEL PROYECTO

CÉDULA DE NOMBRE DEPARTAMENTO/INSTITUCIÓN A

IDENTIDAD COMPLETO LA QUE PERTENECE TELÉFONO FIJO, CELULAR
FUNCIÓN FIRMAS
Y CORREO ELECTRÓNICO

Ciencias de la Vida y la
Agricultura/ Laboratorio de
Director del Marbel Torres Inmunología y Virología/ 098 392 9887
1802949154
Proyecto Arias PhD Universidad de las Fuerzas mmtorres@espe.edu.ec
Armadas ESPE
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INMUNOLOGIA

Ciencias de la Vida y la
Agricultura/ Laboratorio de
Asistente de Ligia Isabel Ayala 093 920 9015
1704992492 Inmunología y Virología/
Investigación Navarrete PhD liayala@espe.edu.ec
Universidad de las Fuerzas
Armadas ESPE
Ciencias de la Vida y la
Agricultura/ Laboratorio de
Asistente de Freddy Proaño
1709505125 Biotecnología Animal/ faproano@espe.edu.ec
Investigación PhD
Universidad de las Fuerzas
Armadas ESPE
Ciencias de la Vida y la
Asistente de Francisco Javier Agricultura/ Laboratorio de
1713443479 fjflores2@espe.edu.ec
Investigación Flores PhD Microbiología/ Universidad de las
Fuerzas Armadas ESPE

2. DIAGNÓSTICO Y PROBLEMA
2.1 Descripción de la situación actual del tema a investigar:
En el presente estudio se va a generar nanocuerpos que van a identificar y aislar una proteína específica de la barra
paraflagelar de Trypanosoma cruzi. Chagas es una enfermedad parasitaria producida por el protozoario Trypanosoma
cruzi y transmitida por insectos hematófagos, (triatomas de la familia REDUVIDAE, conocidos comúnmente como
chinchorros). La tasa de incidencia de Chagas en el Ecuador en el año 2012 fue de 0,53 por 100.000 habitantes
(MINISTERIO DE SALUD PÚBLICA, 2013).
La enfermedad de Chagas es uno de los problemas de salud pública de mayor presentación en América Latina, asociado
a factores socioeconómicos y socioculturales deficitarios que presentan sus habitantes, son algunos de los aspectos
que predisponen la presencia de enfermedad, la misma conlleva diferentes interacciones reservorio-parásito que la
convierte en un sistema complejo en la medida en que incluye al ser humano, el parásito, el vector y los mamíferos
silvestres en el marco de un ambiente biofísico, social, político y económico determinado (ORDÓÑEZ, 2012).
Cuando estas formas alcanzan un huésped vertebrado como el hombre, rápidamente invaden las células huésped y en
el citoplasma se convierten en amastigotes, los cuales se multiplican hasta llenar casi completamente la célula; en este
momento, los amastigotes se transforman en tripomastigotes muy móviles que rompen la célula y son liberados a la
sangre, desde donde pueden invadir otras células. Se espera que en la diferenciación del parásito cada estadio exprese
un patrón de proteínas específicas de fase, responsables de sus características morfológicas, bioquímicas y biológicas,
que pudieran jugar un papel importante en la capacidad infecciosa y la supervivencia dentro del ambiente hostil del
huésped vertebrado. La identificación de estas proteínas específicas permitiría un mejor entendimiento de los
mecanismos involucrados en la interacción entre el huésped y el parásito que, entre otros aspectos, podría facilitar la
identificación de potenciales blancos moleculares para el desarrollo de nuevos fármacos o el diseño de vacunas (Díaz,
11).

2.2 Identificación, descripción y diagnóstico del problema

Se calcula que en el mundo hay entre 6 y 7 millones de personas infectadas por Trypanosoma cruzi, responsable de la
enfermedad de Chagas, en su mayoría en América Latina. La infección se puede curar si el tratamiento se administra al
poco tiempo de producirse la infección, en la fase crónica de la enfermedad, un tratamiento antiparasitario puede
frenar o prevenir la progresión de la misma. La enfermedad de Chagas tiene dos fases claramente diferenciadas.
Inicialmente, la fase aguda dura unos dos meses después de contraerse la infección. Durante esta fase aguda circulan
por el torrente sanguíneo una gran cantidad de parásitos. Durante la fase crónica, los parásitos permanecen ocultos
principalmente en el músculo cardiaco y digestivo. La enfermedad de Chagas puede tratarse con benznidazol, y
también con nifurtimox, que matan al parásito. Ambos medicamentos son eficaces casi al 100% para curar la
enfermedad si se administran al comienzo de la infección en la etapa aguda, incluso en los casos de transmisión
congénita. Sin embargo, su eficacia disminuye a medida que transcurre más tiempo desde el inicio de la infección (OMS,
2019).
En el Ecuador, la enfermedad de Chagas es una de las enfermedades más prevalentes, alcanzando el 30%, afecta sobre
todo a las provincias de Loja, El Oro, Manabí y Guayas, Orellana y Sucumbíos. Su prevalencia nacional disminuyó de
0,15 por 100.000 habitantes en 2006 a 0,03 en 2010 (MINISTERIO DE SALUD PÚBLICA, 2013). Cinco especies de
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Triatominae se han implicado en la transmisión de T. cruzi a personas en Ecuador (Triatoma dimidiata, Rhodnius
ecuadoriensis, R. pictipes, R. robustus y Panstrongylus geniculatus) (Aguilar, 1999).
Como no existe una vacuna eficaz contra la tripanosomiasis, el tratamiento se limita a unos pocos medicamentos que
a su vez generan efectos secundarios graves y recientemente se han enfrentado a la resistencia a los mismos. La
detección temprana y el control es la única forma de prevenir los brotes. Por lo tanto, hay una necesidad de medidas
de diagnóstico sensibles y específicas.
Las técnicas parasitológicas y serológicas se utilizan actualmente para el diagnóstico de infecciones por tripanosomas,
pero están limitadas por su baja sensibilidad. Los anticuerpos que detectan pruebas serológicas como el ELISA indirecto,
las pruebas de inmunofluorescencia indirecta y la aglutinación con tarjeta también se utilizan, sin embargo, conducen
a un diagnóstico en gran parte presuntivo porque las infecciones activas no son verificables y no se pueden hacer
distinciones entre los casos curados y no curados. Además, la especificidad y la sensibilidad de estas pruebas requieren
una evaluación adicional.

2.3 Hipótesis
El nanocuerpo Nb derivado de llama se puede emplear como un marcador para la proteína de barrera flagelar (PFR),
identificando tripanosomas

3. OBJETIVOS DEL PROYECTO (Matriz de Marco Lógico)

Fin:
Generar nanocuerpos para
identificación de
Tripanosomas.
Indicador
➢ Identificación específica y asilamiento de proteínas.
➢ Tiene un menor costo a comparación de otras pruebas.
➢ Menor tamaño de los nanocuerpos a comparación de los anticuerpos
monoclonales.

Propósito (objetivo
general):

Generar nanocuerpos para ➢ Generar anticuerpo (Nb) altamente específico, para la identificación y aislamiento
la identificación y de proteínas específicas de T. cruzi.
aislamiento contra una
proteína paraflagelar de
Tripanosoma

Componente 1:

Generar anticuerpos a
partir de llamas
inmunizadas.
➢ Infectar ratones BALB/c para obtener lisados de parásitos totales.
Actividades: ➢ Recolección de 75 ml de sangre anticoagulante de llama inmunizada y aislamiento
1.1 Preparación de lisados de los linfocitos.
con diferentes cepas de
T.cruzi.
1.2 Inmunización de llamas.
1.3 Aislamiento de
linfocitos.
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Componente 2:

Obtener nanocuerpos y
seleccionar fragmentos de
anticuerpos específicos.

Actividades: ➢ Generación ADNc por RT-PCR a partir del ARNm extraído.

2.1 Realización de una RT- ➢ En el biopanning se recubrió las placas ELISA con 1 µg de T. cruzi.
PCR a partir del ARNm ➢ Determinación de la reactividad cruzada con los lisados T cruzi
extraído.
2.2 Realización de
biopanning.
2.3 Selección de
anticuerpos específicos.
Componente 3:

Expresar y purificar los

nanocuerpos.
➢ Utilización de nanocuerpos purificados, selección de Nb marcado para realizar los
Actividades: ensayos de inmunofloresencia.
3.1 Caracterizar por ➢ Comprobación fenotípica que la proteína Nb se dirija a PFR
ensayos de ➢ Extracción de flagelos a partir de parásitos T. cruzi para la espectrometría de masas.
inmunofloresencia
3.2 Obtener fenotipo de Nb
por Western Blot.
3.4 Identificar antígenos.

Detalle de entregables del proyecto

 Resina DE52
 Inhibidor Proteasa cOmplete™ (Roche
Bienes a usar en el  Enzimas de restricción Not I y PstI (Roche)
proyecto o  Fagos auxiliares M13K07
necesite adquirir  N-hidroxisuccinimida
 IgG anti-VHH policlonal de conejo
 Adyuvante Gerbu

Servicios o
 Guantes
insumos que
 Papel Toalla
necesite adquirir

4. METODOLOGÍA PARA LA INVESTIGACIÓN

 Declaración de Ética
Los animales deben ser tratados bajo las directrices bioéticas de animales para la experimentación científica
expuesto en el Art 6 de la Comisión Nacional de Bioética en Salud del Ecuador

 Preparación de antígeno tripanosoma, inmunización de llama (Lama glama) y aislamiento de

linfocitos.

Preparación de lisados de parásitos totales: infectar ratones BALB/c 6 hembras de 10 semanas de edad por vía
subcutánea con 5.000 parásitos de diferentes cepas T.cruzi. En el sexto día recoger la sangre usando DE52. Contar
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los parásitos con un microscopio óptico y lavar cuatro veces en PBS mediante centrifugación para eliminar las
proteínas del suero del ratón. Resuspender el sedimento a una tasa de 108 parásitos por mL de inhibidor de la
proteasa cOmplete™ (1 tableta/50 mL de PBS). Después de tres rondas de congelación y descongelación a -80 °C.
Preparar lisados de tripanosomas mediante sonicación tres veces durante 10 segundos cada uno. Centrifugar el
lisado a 14.000 rpm durante 30 minutos, recoger el sobrenadante y cuantificar utilizando el espectrofotómetro
Nanodrop ® N D-1000 (NanoDrop Technologies) y se almacenar a -20 ° C hasta su uso posterior.

Inmunización: Con 100 ug de cada uno de los tres lisados de T.cruzi ( TcV, TcI, Tc IV) se inmuniza una llama con
seis inyecciones subcutáneas a intervalos semanales. Añadir 500 µl de lisado a 500 µl de adyuvante Gerbu. Cuatro
días después del último refuerzo, recoger 75 ml de sangre anticoagulante de la alpaca y aislar linfocitos utilizando
Lymphoprep (Nycomed).

Aislamiento de linfocitos: Separar los linfocitos mediante centrifugación en gradiente durante 25 minutos a 2.000
rpm a temperatura ambiente. Lisar 5 x 107 linfocitos mediante la adición de 1 ml de Trizol en tubos de 5 mL (Conrat
& Lauwereys , 2001).

 Construcción de la biblioteca de Nb anti-tripanosoma y selección de fragmentos de anticuerpos

específicos (Biopanning)
El ARNm extraído del sedimento de Trizol se usa como plantilla para la RT-PCR y generar un primer ADNc de
cadena utilizando cebadores oligo-dT. Usar cDNA como plantilla para amplificar 2 productos diferentes utilizando
los cebadores específicos CALL001 y CALL002 que dan los fragmentos génicos que contienen VH y VHH de 900 y
600 pb, respectivamente. El producto de 600 pb se escinde en gel de agarosa al 1%, y se usa como plantilla para
una segunda PCR a través de cebadores anidados A4 cortos y 38 para amplificar el VHH. Secuencia de
aproximadamente 400 pb y restringida con enzimas de restricción Not I y PstI (Roche). Los fragmentos de PCR se
ligan en el vector (plásmido) pHEN4 y se transformaron en células E. coli TG1. La biblioteca de nanobody resultante
está superinfectada con fagos auxiliares M13K07 para la expresión de nanobodies en los fagos. El biopanning se
realizó como se describe (Conrat & Lauwereys , 2001) mediante el recubrimiento de placas ELISA con 1 µg de T.
cruzi por pocillo. Lograr el enriquecimiento de fagos mediante 3 rondas de selección in vitro. Eluir los fagos como
se describe (Conrat & Lauwereys , 2001). Infectar TG1 E.coli con los fagos eluidos e inocularen placas de LB-
ampicilina. Seleccionaron al azar cien colonias viables de cada ronda de selección y su VHH se expresó como se
describe (Conrat & Lauwereys , 2001). Los extractos periplásmicos (PE) se obtienen mediante choque osmótico.
El enriquecimiento de cada ronda de cribado se comprueba mediante un ELISA de fagos policlonales con
anticuerpos anti-M13-HRP. Cada PE de colonia de la ronda dos y tres se probó en PE-ELISA utilizando anticuerpos
anti-heamaglutinina de ratón (Baral et al., 2007)

 Western blotting
Para identificar la diana de Nb en los flagelos, realizar transferencias de Western en lisados totales como se
describe utilizando Nb sondeado con IgG anti-VHH policlonal de conejo y un anticuerpo de cabra anti-IgG de
conejo conjugado con peroxidasa. Para la confirmación fenotípica de que Nb se dirige a PFR1 / 2, realizar IFA e
inmunotransferencia en mutantes RNAi de la proteína PFR, PFR2 RNAi y KIF9B RNAi parásitos mutantes (procíclicos)
utilizando los mismos protocolos que los parásitos y lisados anteriores. Utilizar anticuerpos anti-ALBA como
controles de carga (Subota & Rotureau, 2011) .

 Identificación de antígenos por inmunoprecipitación de extractos de flagelos y espectrometría de

masas.
La extracción de flagelos se realiza en parásitos T. cruzi usando Triton X-100. Nb se inmoviliza covalentemente en
resina de agarosa seca activada con N-hidroxisuccinimida (NHS) durante la noche a 4 ° C. Después de apagar los
sitios sin unir con Tris-HCl 1,0 M a pH 7,4, añadir extractos de flagelos a temperatura ambiente durante 3 horas,
lavar con PBS, realizar una elución ácida con glicina-HCl 0,2 M, pH 2,5 según las instrucciones del fabricante. 1–3
µg de la proteína eluida se fragmenta mediante SDS-PAGE utilizando un gel de poliacrilamida prefabricado al
12,5%, luego teñir con 0,1% de Brilliant Blue R-250 commassie en metanol al 40% durante 1–2 minutos, seguido
de lavado con metanol al 50%. Las dos bandas resultantes se escindieron por separado para la espectrometría de
masas (Subota & Rotureau, 2011).
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 Análisis estadístico
Los datos de FACS se analizan con el software Flowjo y los datos de ELISA se traducen en representaciones gráficas
con el software Prism (GraphPad Prismv.4.0, GraphPad Software Inc. San Diego, CA). Los experimentos ELISA se
realizaron al menos tres veces con lisados recubiertos por triplicado. Los datos se presentan como valores medios
± SD. La prueba t de Student se utilizó para comparar medias. Si p> 0.05, las diferencias fueron consideradas
significativas. Se utilizan asteriscos para indicar los grados de significación (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001)
(Conrat & Lauwereys , 2001).

6. VIABILIDAD Y PLAN DE SOSTENIBILIDAD

Viabilidad Técnica:
 El presente proyecto reúne características, condiciones técnicas y operativas que aseguran el
cumplimiento de sus metas y objetivos.
 Las experiencias de técnicos y profesionales que actúan en este proyecto permite que el proyecto sea
viable.
 La obtención de cepas de Tripanosoma Cruzi se realizará mediante el apoyo del Centro de Investigación
para la Salud en América Latina (CISeAL).
 La inmunización de la llama se realizará en la Hacienda El Prado- Iasa I.
 Las técnicas presentadas en el proyecto: inmunoprecipitación, Western Blot, Elisa, Inmunoflorescencia son
ejecutables en los laboratorios de investigación de Inmunología y Virología de la Universidad de las Fuerzas
Armadas ESPE.
 La técnica de biopanning se realizará en los laboratorios de Microbiología de la Universidad de las Fuerzas
Armadas ESPE.
 La medición con el espectrofotómetro de masas se realizará en el Centro de Ciencia y Nanotecnología
(CENCINAT) en la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE.

Equipamiento Tecnológico Disponible

 Microscopio Óptico
 Microscopia Confocal
 Kit de Elisa
 Espectrofotómetro de Masas

7. RESULTADOS ESPERADOS

 Construcción de la biblioteca de Nb anti tripanosoma y selección de fragmentos específicos de nanobody

 Se espera que la PCR de colonias tenga aproximadamente el 80% de los clones con el tamaño de inserto
esperado (700 pb).
 Comprobar mediante ELISA la presencia de Nb
 Mediante IFA directo indicar que el objetivo Nb está localizado dentro del flagelo
 Confirmación de la reactividad de Nb utilizando mutantes de PFR proteína de la barra paraflagelar tripanosoma

8. BIBLIOGRAFÍA Y OTRA PRODUCCIÓN CIENTÍFICA CITADA

 Aguilar, M. (09 de 1999). Epidemiology of Chagas Disease in Ecuador. A Brief Review . Obtenido de
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0074-02761999000700076&script=sci_arttext

 Baral , T. N., Brombacher, P., & Magez, S. (2007). control de la infección por Trypanosoma evansi está mediado
por IgM y no requiere una respuesta inflamatoria de tipo I. . Diario de enfermedades infecciosas, 1513-1520.
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 Conrat , K., & Lauwereys , M. (2001). Los inhibidores de la β-lactamasa derivados de fragmentos de anticuerpos
de dominio único provocados en los camélidos. Agentes antimicrobianos y quimioterapia 45: ., 2807–2812.

 Díaz, M. L. (07 de 07 de 11). Expresión diferencial entre estadios de Trypanosoma cruzi I en el aislamiento de un
paciente con cardiomiopatía chagásica crónica de zona endémica de Santander, Colombia. Obtenido de
http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0120-41572011000400005

 MINISTERIO DE SALUD PÚBLICA. (05 de 2013). SISTEMA INTEGRADO DE VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA.

Obtenido de
https://aplicaciones.msp.gob.ec/salud/archivosdigitales/documentosDirecciones/dnn/archivos/manual_de_p
rocedimientos_sive-alerta.pdf

 Obishakin, E. (2014). Generation of a nanobody targeting the paraflagellar rod protein of trypanosomes.
Obtenido de https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4281110/

 OMS. (17 de 04 de 2019). La enfermedad de Chagas (tripanosomiasis americana). Obtenido de

https://www.who.int/es/news-room/fact-sheets/detail/chagas-disease-(american-trypanosomiasis)

 ORDÓÑEZ, C. J. (11 de 12 de 2012). DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS ANTI-TRYPANOZOMA

CRUZI EN CANINOS EN ZONAS ENDÉMICAS PARA ENFERMEDAD DE CHAGAS DE LA PROVINCIA DEL GUAYAS:
CANTON GENERAL VILLAMIL PLAYAS-POSORJA. Obtenido de
http://www.dspace.uce.edu.ec/bitstream/25000/1258/1/T-UCE-0014-24-G516.pdf

 Subota, I., & Rotureau, B. (2011). as proteínas ALBA se regulan en el estadio durante el desarrollo del
tripanosoma en la mosca tsetsé y participan en la diferenciación. Biología molecular de la célula, 2011.

9. FIRMAS DE RESPONSABILIDAD

Ciudad y Fecha:

_______________________________________________
___________________________________ Nombre del
C.I.