LIBROAMPAVE CONASA Captulo12

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CHAPTER: 12 Diagnóstico de resistencia a los antiparasitarios en rumiantes. En:

Tecnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud publica y
veterinaria. AMPAVE-CON...
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Maria Eugenia López-Arellano Jose Alberto Rosado-Aguilar

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Técnicas para el diagnóstico de parásitos con importancia en salud pública y veterinaria
Capítulo 12
DIAGNÓSTICO DE RESISTENCIA A LOS
ANTIPARASITARIOS EN RUMIANTES
Dr. Juan Felipe de Jesús Torres Acosta1
M. en C. Israel Chan Pérez1
Dra. María Eugenia López Arellano2
Dr. José Alberto Rosado Aguilar1
M. en C. Noé Soberanes Céspedes3
MVZ. Salvador Neri Orantes4
Dr. Miguel Ángel Alonso Díaz5
M. en C. Francisco Martínez Ibáñez4
Biol. Jorge Osorio Miranda4
Dr. Juan José Vargas Magaña6
M. en C. Lisandro Encalada Mena6
1
Campus de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, FMVZ-UADY 2Centro
Nacional de Investigaciones Disciplinarias en Parasitología Veterinaria,
INIFAP, 3Lapisa Salud Animal, 4Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y
Calidad Agroalimentaria, , 5Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión
en Ganadería Tropical, FMVZ-UNAM, 6Escuela Superior de Ciencias
Agropecuarias-UACAM.
CONTENIDO
12.1. Introducción
12.2. Pruebas para determinar la resistencia antihelmíntica
12.2.1. Diagnóstico de campo para determinar la resistencia de los nematodos
gastrointestinales a los antihelmínticos (prueba de reducción en el conteo de
huevos en heces)
12.2.2. Pruebas in vitro para el diagnóstico de la resistencia hacia los
antihelmínticos
12.2.2.1. Prueba de inhibición de la eclosión de huevos
12.2.2.2. Prueba de inhibición de la migración larval
12.3. Diagnóstico de laboratorio para determinar la resistencia de las garrapatas a
los ixodicidas
12.3.1. Prueba de paquete de larvas
12.3.2. Prueba de inmersión de larvas
12.3.3. Prueba de inmersión de larvas modificada (ivermectina)
12.3.4. Prueba de inmersión de adultas
12.4. Diagnóstico de resistencia a los insecticidas en las moscas Haematobia
irritans
~ 355 ~
12.1. INTRODUCCIÓN
Los animales domésticos y los humanos han coexistido y evolucionado en una

constante lucha contra los parásitos internos y externos. Estos parásitos pueden
afectan el bienestar y la salud de sus hospedadores e incluso pueden llegar a ocasionar
la muerte (Alonso-Díaz et al., 2014).
A partir de la segunda mitad del siglo XX la industria farmacéutica puso a disposición

del sector agropecuario numerosos desparasitantes que permitieron por primera vez
controlar de manera exitosa tanto a parásitos internos como externos. Aparecieron
gradualmente diferentes desparasitantes con elevada eficacia contra endoparásitos,
como los nematodos gastrointestinales (NGI) y ectoparásitos, como las garrapatas y las
moscas hematófagas de los rumiantes. La industria farmacéutica desarrolló moléculas
con mayor espectro de acción y de mayor persistencia en su eficacia. De ésta manera,
la industria farmacéutica veterinaria se lanzó a una carrera tecnológica que logró crear y
consolidar a estos productos antiparasitarios como la mejor opción de control. Esto ha
favorecido el paradigma actual del control de los parásitos de los rumiantes: depender
únicamente del uso frecuente de las drogas comerciales. Este paradigma se encuentra
firmemente consolidado entre los productores que reciben información técnica orientada
a fomentar el consumo de estos productos. Esto a pesar de que la industria
farmacéutica veterinaria ha hecho esfuerzos por promover el uso de racional de los
antiparasitarios, así como el uso de métodos alternativos de control para evitar el abuso
de los antiparasitarios (Soberanes, 2010a,b). Además, la mayoría de los planes de
estudio de las Facultades de Veterinaria y de Zootecnia fomentan al uso de drogas
como la única o principal manera de controlar a los parásitos de rumiantes (Torres-
Acosta et al., 2012a). Sin embargo, como ha ocurrido con otras herramientas de control
de plagas en la producción agropecuaria, los diferentes tipos de endo y ecto-parásitos
han desarrollado mecanismos que les permiten sobrevivir a las drogas comerciales,
fenómeno conocido como resistencia a los antiparasitarios (Coles et al., 2006). La
resistencia a los antiparasitarios se define como la habilidad que tiene los parásitos de
sobrevivir a una dosis de una droga que normalmente sería letal para la mayoría de los
individuos susceptibles de una misma especie. Esta resistencia es de carácter genético
y es heredable (Prichard et al., 1980).
Los primeros casos de resistencia a antiparasitarios comerciales se presentaron a

escasos años de que estos salieron al mercado (Drudge et al., 1957). Sin embargo, por
décadas se pensó que el problema de resistencia era un aspecto de tipo académico o
de investigación, y que no influiría en la eficacia de los productos a nivel de granja en el
corto o mediano plazo. Desde los inicios del siglo XXI se tenía evidencia contundente
que sugería que el uso irracional y constante de los antiparasitarios favorece la
selección de poblaciones de parásitos resistentes a los antiparasitarios. A nivel mundial
se han reportado casos de resistencia a diferentes moléculas de drogas comerciales en
NGI, garrapatas y moscas de los rumiantes (Rodríguez-Vivas et al., 2011b).
~ 356 ~
La existencia cada vez más común de parásitos resistentes a los antiparasitarios es

motivo de preocupación debido a que se expande a diversos sistemas de producción
animal (Demeler et al., 2009; Torres-Acosta et al., 2012a). En el caso de los NGI, se
creyó por muchos años que la resistencia antihelmíntica (RA) era un problema asociado
a las unidades de producción (UP) caprina y posteriormente se obtuvo información de
su gravedad en las UP ovina (Torres-Acosta et al., 2012b). Gradualmente se han
incrementado las notificaciones de RA en UP bovina y equina a nivel mundial
enfatizando la importancia de identificar la prevalencia de la RA en diferentes países y
sistemas de producción e implementar métodos de diagnóstico eficaces (Sangster,
1999; Anziani et al., 2000; FAO, 2003; Winterrowd et al., 2003; Soutello et al., 2007;
Demeler et al., 2009).
La resistencia a los antiparasitarios parece ser más severa en el caso de las

poblaciones de garrapatas. Existen numerosos reportes de UP a nivel mundial que
tienen poblaciones de garrapatas resistentes a muchas de las moléculas sintetizadas
para el control de garrapatas (acaricidas) (FAO, 1987; Li et al., 2004; Mendes et al.,
2011). La situación de la prevalencia de hatos con garrapatas resistentes a los
acaricidas ha sido ampliamente explorada en México y se sabe que es alarmante
(Soberanes et al., 2002; Rosado-Aguilar et al., 2008; Pérez-Cogollo et al., 2010;
Rodríguez-Vivas et al., 2011a; Fernández-Salas et al., 2012). Una ventaja en la
evaluación de los acaricidas con respecto a los antihelmínticos es que las garrapatas
son visibles en la superficie del animal y por lo tanto es más fácil verificar cuando el
producto es eficaz. Adicionalmente, se han diseñado diferentes pruebas in vitro que
permiten evaluar la resistencia de las garrapatas contra diferentes acaricidas en
condiciones de laboratorio (FAO, 1971; Robertson y Preisler, 1992; Kemp et al., 1998;
FAO, 1999; Kemp, 2000; Klafke et al., 2006).
A partir de 1984 se reportaron problemas ocasionados por infestaciones masivas con la

mosca del cuerno Haematobia irritans en ranchos de la región Noroeste de México. Estos
casos fueron controlados mediante mosquicidas formulados con Piretroides que se
comenzaron a comercializar en 1986. Sin embargo, a partir de 1990 los productores
reportaron fallas de control con los mosquicidas de esta familia química. A mediados de
1992 se confirmó la resistencia a los Piretroides en la mosca del cuerno H. irritans, pero
los resultados de las pruebas no fueron concluyentes para los Organofosforados.
Posteriormente en 1994 se demostró que la resistencia a los Piretroides estaba presente
en otras zonas ganaderas del Golfo de México y del Pacífico con una alta susceptibilidad a
los Organofosforados (Santamaría et al., 1995).
El incremento de la frecuencia de poblaciones resistentes de NGI, garrapatas y moscas

ha tenido fuerte impacto ambiental, económico y de salud a nivel mundial durante las
últimas tres décadas. Muchas UP de rumiantes corren el riesgo de desaparecer ante la
imposibilidad de controlar a los parásitos en los animales. Ante esto, organizaciones
internacionales como la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la
Agricultura (FAO por sus siglas en inglés) (FAO, 2003), la Asociación Mundial para
Avances en la Parasitología Veterinaria (WAAVP, por sus siglas en inglés) (Coles et al.,
~ 357 ~
1992, 2006) y otras entidades han organizado y apoyado diversas estrategias para
desarrollar pruebas de diagnóstico a nivel de campo y laboratorio para determinar la
resistencia contra los antiparasitarios en las poblaciones de parásitos que afectan a los
animales domésticos. Lo anterior enfatiza la importancia de conocer y aplicar medidas
de diagnóstico que permitan emitir recomendaciones dirigidas a disminuir la expansión
del fenómeno de resistencia a los antiparasitarios en helmintos y ectoparásitos en UP
de rumiantes. El presente capítulo tiene como objetivo describir las metodologías que
se emplean en el diagnóstico de resistencia a los antiparasitarios en rumiantes (NGI,
garrapatas y moscas hematófagas).
12.2. PRUEBAS PARA DETERMINAR LA RESISTENCIA

ANTIHELMÍNTICA
12.2.1. Diagnóstico de campo para determinar la resistencia de los nematodos

gastrointestinales a los antihelmínticos (Prueba de reducción en el conteo de
huevos en heces)
Fundamento
Los rumiantes en pastoreo consumen larvas infectantes (L3) de parásitos resistentes o

susceptibles que se encuentran en las praderas. Estos parásitos se establecen y
maduran sexualmente en el tracto gastrointestinal de los rumiantes, donde producen
huevos que son eliminados en las heces. Por lo tanto, si los animales en una UP
consumen larvas infectantes de parásitos susceptibles en la pradera, el uso de los
antihelmínticos comerciales provocará la muerte de las poblaciones de nematodos en
los animales tratados. Lo anterior se traduce en una disminución en la cantidad de
huevos de NGI excretados en las heces de los animales tratados, comparado con la
excreción de huevos de un grupo control no tratado. Por el contrario, si los rumiantes
consumen larvas infectantes resistentes a alguna(s) droga(s) en la pradera su presencia
en los animales tratados ocasionará una reducción, pero no en la magnitud establecida
por dicha droga (s) sobre la cuenta de huevos en heces, aun usando una dosis correcta
de un AH comercial correctamente elaborado. Por lo tanto, la eliminación de huevos
pos-tratamiento será igual a la del grupo control no tratado.
Toda prueba de diagnóstico de resistencia a los antiparasitarios se inicia con la

obtención de la información relacionada con el manejo del ganado en la UP a evaluar.
Es necesario preguntar acerca de dónde se compra el antiparasitario, verificar su fecha
de caducidad, el lote de producción, si cuenta con el registro de SAGARPA, personal
que aplica el producto, instrumento con que se aplica. Si se pesa a los animales para
calcular la dosis del antiparasitario, si se dieta a los animales por al menos 14 h, la
fecha de la última desparasitación y qué antiparasitario se usó en esa ocasión. También
es necesario saber qué antiparasitarios se han usado en el último año. La información
~ 358 ~
debe incluir todos los antiparasitarios usados en la UP. Lo anterior permitirá asociar
estos manejos con el resultado de la prueba de resistencia en la UP.
Materiales
 Antihelmínticos a probar; drogas comerciales de los tres grupos de amplio

espectro (Coles et al., 2006): (i) bencimidazoles (BZ), (ii) imidazotiazoles (IM),
(iii), lactonas macrocíclicas (LM), o alguna otra molécula que se produzca y se
encuentre comercialmente en el futuro en México (por ejemplo, el monepantel o
el derquantel). Se debe registrar la marca comercial, el lote del producto,
concentración, dosis y vía de administración.
 Báscula para el pesaje de los animales (de acuerdo al tamaño de los animales).
 Jeringas y agujas (acordes al volumen de droga que se utilizará).
 Bolsas nuevas de polietileno.
 Plumones indelebles (tinta negra).
 Libreta de registro.
 Nevera con refrigerantes.
 Cajas de Petri grandes (20 cm de diámetro) y medianas (10 cm de diámetro).
Dos de cada una por AH a evaluar.
 100 Porta objetos y cubre objetos por rancho.
 20 cámaras de McMaster.
 2 L de solución saturada (de azúcar o sal) (ver apéndice del Manual) por cada
grupo de antihelmíntico a evaluar.
 100 ml de solución de hidróxido de sodio al 0.1N
 Probeta de vidrio de 100 ml
 Tubos de plástico de 50 ml con tapa (Corning)
 Perlas de vidrio de 0.1 mm (Lab. Metrix)
Procedimiento
Esta prueba se realiza en tres etapas denominadas (a) pre-tratamiento, (b) tratamiento,
y (c) pos-tratamiento. La prueba debe ser realizada en una UP en donde no se haya
aplicado un tratamiento antihelmíntico al menos 60 días antes del estudio para
determinar la resistencia. Todos los animales incluidos en la prueba deben estar
identificados. En caso contrario, se debe identificar a los animales mediante aretes o
collares con algún código que ayude a identificar a los individuos y a los grupos
experimentales rápidamente y a distancia.
Etapa Pre-tratamiento (Día -1)

 Seleccionar animales que estén en pastoreo para garantizar que tengan infección
natural por NGI. Aunque es posible que la eliminación de huevos en heces sea más
evidentes en los animales jóvenes, se pueden utilizar lotes de animales adultos que
~ 359 ~
tengan una excreción de ≥100 huevos por gramo de heces (HPG) de nematodos
gastrointestinales del orden Strongylida en el caso de bovinos y ≥150 HPG para el
caso de ovinos y caprinos (Coles et al., 2006). Si el conteo es menor de 100 HPG es
necesario aplicar un método más sensible, como Stoll, Wisconsin y la técnica
modifica de McMaster. Así mismo, se deben utilizar animales pastoreando en los
mismos potreros donde se quiere determinar la presencia de NGI resistentes. Los
animales pueden ser de ambos sexos, con la condición de que compartan los
mismos potreros.
 El método de Stoll permite contabilizar la cantidad de huevos de NGI cuando la
excreción de huevos es menor a 100. La metodología requiere de 5 g de heces en
un volumen final (VF) de 75 ml de hidróxido de sodio al 0.1N. Se Agregan 50 perlas
de vidrio y se homogeniza la muestra hasta disolver. Se toma una alícuota de 0.15
ml de la suspensión y se coloca en un porta objetos con cubreobjetos. Realizar la
lectura y cuantificar el número de HPG (=n). El número total de HPG se realiza con
la siguiente fórmula: HPG = VF (75 ml) x n/vol de la alícuota (0.15 ml).
 Estos animales se registran en una libreta y se les toman muestras de heces
mediante el uso de bolsas de polietileno nuevas (al menos 5 g por animal). Las
muestras deben ser tomadas directamente del recto para evitar contaminación con
nematodos de vida libre. Las bolsas con heces se identifican con plumón indeleble
de acuerdo al código de identificación de cada animal. Inmediatamente después, las
muestras se almacenan en la nevera con refrigerante hasta su procesamiento en el
laboratorio. Es necesario mantenerlas a 4°C durante el transporte para evitar el
desarrollo de mórulas a larva o la eclosión de las larvas L1.
 En el laboratorio se utilizan 2-5 g de heces para el conteo de HPG para la técnica de
McMaster, con la ayuda de las cámaras de McMaster diseñadas especialmente para
determinar la carga de huevos por gramos de heces por diferencia de densidad con
la solución saturada de azúcar (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera, 2005) (ver capítulo
de coproparasitoscopía de este libro) y 2 g de heces de cada animal para elaborar
un coprocultivo por cada familia de AH que se quiere probar (grupos tratados), así
como un coprocultivo para el grupo control. Los coprocultivos se realizan en el
interior de las cajas de Petri de 10 cm de diámetro. Estas cajas se colocan en el
interior de las cajas de Petri de 20 cm de diámetro. Estas últimas deben contener
agua purificada hasta una marca de 0.5 cm de profundidad y se tapan. Se sugiere
mantener las cajas de cultivos en condiciones de laboratorio (25ºC y 80% de
humedad) durante siete días.
 El día ocho se recuperan las larvas de los coprocultivos de heces elaborados pre-
tratamiento mediante la técnica de Corticelli-Lai (Rodríguez-Vivas y Cob-Galera,
2005). Una vez cosechadas las larvas L3 se filtran con un tamiz de 80 micras para
eliminar el detritus fecal y se mantienen en el agua de la cosecha a 4ºC hasta la
identificación de los géneros. La identificación morfológica de los géneros de L3 se
realiza por cada grupo de animales utilizando claves de identificación morfométricas,
las larvas son colocadas en los portaobjetos, se cubren con los cubreobjetos y se
procede a la identificación (MAFF, 1986; Liébano, 2004; Van Wyk y Mayhew, 2013).
~ 360 ~
La evaluación de RA se realiza con un mínimo de dos grupos: (a) Grupo control, que no
recibe tratamiento antihelmíntico, y (b) Grupo tratado con la familia del antihelmíntico
seleccionado. Se podrá evaluar más de un grupo tratado, siempre y cuando se cuente
con el número suficiente de animales con las cargas de HPG adecuadas. Cada grupo
debe estar conformado por 10-15 animales. Por conveniencia, es necesario distribuir en
cada grupo, animales con similar eliminación de HPG.
Etapa de Tratamiento (Día 0)
La administración del antihelmíntico debe realizase siguiendo las recomendaciones del

fabricante (dosis, vía de administración, etc.). Sin embargo, en México algunas
etiquetas de productos comerciales no incluyen las dosis correctas de los
antihelmínticos para ovinos y caprinos, por lo que se incluyen las dosis correctas de los
principales antihelmínticos en el Cuadro 12.1. Los animales pueden ser pesados el día
anterior al tratamiento (siempre y cuando hayan sido pesados en ayunas por al menos
14 h). Los antihelmínticos administrados por vía oral deben aplicarse con previo dietado
de los animales por un mínimo de 14 h. En caso de tratamientos orales se deben utilizar
cánulas dosificadoras que permitan depositar el producto lo más atrás posible de la
lengua de los animales.
Etapa Pos-tratamiento
 Según el antihelmíntico utilizado en los grupos evaluados, se decide el tiempo que

debe transcurrir entre el día del tratamiento y el día correspondiente al segundo
muestreo de heces. La colecta de heces para los IM será de 5-7 días pos-
tratamiento, para los BZ de 8-10 días y para las LM de 14-17 días. Si se evalúan
mezclas tales como el Levamisol con algún BZ se deberá muestrear a los 10 días y
si se está evaluando cualquier familia con una LM se deberá muestrearse a los 14
días pos-tratamiento.
 Las heces colectadas de cada animal se procesan mediante la técnica de McMaster

usando al menos 2 g de heces de cada animal, se usa una cantidad semejante de
heces (2-5 g) para elaborar los coprocultivos pos-tratamiento de cada grupo de
animales, usando la misma metodología descrita en el pre-tratamiento.
~ 361 ~
Cuadro 12.1. Principales moléculas de antihelmínticos comerciales con sus tiempos de

eliminación en carne y leche, dosis correctas para bovinos, ovinos y caprinos, así como
las vías de aplicación. No se incluyen mezclas de antihelmínticos (Actualizado de
Torres-Acosta y Aguilar-Caballero, 2005).
Moléculas Dosis en Dosis en Dosis en Vía de Tiempo de Tiempo de

bovinos ovinos caprinos administración eliminación eliminación
(mg/kg) (mg/kg) (mg/kg) en carne en leche
Bencimidazoles
Tiabendazol 66-110 50 100 O 0 días 4 días
Albendazol 10 5 20 O,IR 14 días 7 días
Mebendazol 12.5 15 30 O 8 días N.A.
Fenbendazol 7.5 5 10 O,IR 16 días 5 días
Oxfendazol 5 5 10 O, IR 14 días 5 días
Ricobendazol 7.5 5 IM,SC 3 días
Febantel 7.5 5 10 O,IR* 8 días 4 días
Netobimin 7.5 7.5 15 O 10 días 3 días
Imidazotiazoles
Levamisol 8 7.5 12 O,SC 7 días 3 días
Morantel 10 6 10 O 30 días 0 días
Avermectina
/Milbemicina
Ivermectina 0.2 0.2 0.4 O, SC, T 21 días N.A.
Doramectina 0.2 0.2 0.2 SC 21 días N.A.
Doramectina 0.5 T 21 días N.A.
Moxidectina 0.2 0.2 0.4 O, SC 23 días N.A.
Moxidectina 0.5 T 21 días N.A.
Eprinomectina 0.5 0.5 0.5 T 0
O: Vía oral; IR: Vía intraruminal; IM: Vía intramuscular; SC: Vía subcutánea; T: Vía tópica (epicutánea)
sólo usada en bovinos; N.A.: No autorizado.
Interpretación de resultados
En la interpretación de los resultados se emplea la fórmula recomendada por la WAAVP
como a continuación se describe.
Porcentaje de reducción. Para éste cálculo se utiliza la media aritmética de los grupos
control (no tratado) y la del grupo tratado que corresponda:
Donde:
= Promedio de HPG del grupo tratado (pos-tratamiento)
= Promedio de HPG del grupo control no tratado (pos-tratamiento)
Intervalo de confianza del 95%. Para este cálculo se utiliza la media aritmética de cada
grupo.
~ 362 ~
Superior:
Inferior:
Para mayor facilidad existe un programa de Microsoft Excel© que permite realizar estos
cálculos automáticamente (RESO.exe©; CSIRO, 1993, Division Animal Health).
Figura 12.1. Hojas de cálculo del programa RESO.exe© (CSIRO, 1993, Division Animal
Health).
Criterios para la interpretación de resistencia

Los criterios para considerar una población de nematodos gastrointestinales del orden
strongylida resistente, susceptible o sospechoso a un antihelmíntico se mencionan a
continuación:
Resistente: Porcentaje de reducción del conteo de huevos es menor al 95% y el límite

inferior del intervalo de confianza 95% es menor de 90%.
Sospechoso: Solo uno de los dos criterios anteriores se cumple.
Susceptible: El porcentaje de reducción en el conteo de huevos es igual o mayor de

95% y el límite inferior del intervalo de confianza 95% es igual o mayor de 90%.
~ 363 ~
12.2.2. Pruebas in vitro para el diagnóstico de la resistencia hacia los

antihelmínticos
12.2.2.1. Prueba de inhibición de la eclosión de huevos
Fundamento
La prueba de inhibición de la eclosión de huevos (IEH) fue diseñada para el diagnóstico
in vitro de la resistencia a los BZ y se basa en la actividad ovicida que poseen estos
antihelmínticos. La prueba consiste en incubar los huevos de los NGI a diferentes
concentraciones de tiabendazol y determinar el porcentaje de inhibición en la eclosión.
Con esta prueba se puede calcular la dosis letal 50, 95 y/o 99 de una población
estudiada y compararla con una población susceptible de la misma especie (von
Samson-Himmelstjerna et al., 2009). Esta prueba ofrece la ventaja de evaluar una
población de NGI de manera rápida, en comparación con la prueba de reducción en el
conteo de huevos en heces. La prueba fue descrita por primera vez por Le Jambre en
(1976). Desde entonces esta prueba ha sido empleada para estudiar la resistencia a los
BZ en los NGI de los pequeños rumiantes (H. contortus) y equinos (cyathostominae)
(Campos et al., 1990; Coles et al., 1992, 2006). En 2009, se hizo un esfuerzo por
estandarizar esta prueba y homogenizar su ejecución entre los diversos laboratorios de
Europa (von Samson-Himmelstjerna et al., 2009). Con la experiencia que se ha
adquirido en la implementación de esta prueba en el laboratorio de parasitología de la
FMVZ-UADY, Yucatán, se presenta la versión detallada que incluye los aspectos más
importantes para garantizar una correcta realización de la prueba así como la obtención
de resultados confiables.
Materiales
 Bolsas de nylon nuevas.
 Marcador permanente.
 Guantes.
 Gasas.
 Tamiz de plástico.
 Embudo plástico.
 Mortero de porcelana.
 Matraz Erlenmeyer.
 Tubos plásticos de 15 ml con tapa rosca.
 Pipetas de vidrio (500 ml).
 Centrífuga de rotor basculante.
 Vortex.
 Gradilla para tubos de ensayos.
 Asa bacteriológica con aro de 0.8 cm de diámetro.
 Micropipeta de 10-100 µl y 100-1000 µl.
 Portaobjetos.
 Solución saturada de azúcar.
~ 364 ~
 Microscopio.
 Micropipeta de 1-5 ml.
 Tubos de 50 ml con tapa rosca.
 Placas de 24 pozos.
 Tiabenbazol (T8904 SIGMA©).
 Dimetilsulfóxido (D8418 SIGMA©).
 Incubadora con temperatura regulable.
 Solución de lugol.
 Cámaras de McMaster.
 Jeringas de insulina.
Procedimiento
Toma y manejo de heces para la recuperación de huevos de nematodos. Las heces se
colectan directamente del recto de los animales usando bolsas de plástico nuevas
(Figura 12.2A). Una vez colectadas se debe retirar el aire de la bolsa buscando eliminar
la mayor cantidad de oxígeno contenido en ella (Figura 12.2B y 12.2C). Las heces se
deben refrigerar a 4 ºC hasta su procesamiento, preferentemente dentro de las 3
primeras horas posteriores a la colecta. No se deben usar heces almacenadas más de
24 h ya que la refrigeración prolongada disminuye el porcentaje de eclosión de los
huevos.
Figura 12.2. Toma de muestra de heces para la separación de huevos de nematodos

gastrointestinales (A) y extracción de aire de las bolsas (B y C).
Recuperación de huevos y conteo de la cantidad de huevos recuperados. Se

recomienda realizar un conteo de huevos en heces mediante la técnica de McMaster
para estimar la cantidad de heces necesarias para obtener suficientes huevos de NGI
para realizar esta prueba. Las heces se colocan dentro de un tamiz de plástico
colocado sobre un mortero de porcelana. Se agregan 200 ml de agua purificada y se
maceran. La cantidad de heces necesarias puede variar según la cantidad de huevos
de NGI por gramo de heces. El agua mezclada con heces se filtra a través del tamiz.
Esta mezcla se filtra de nuevo empleando un embudo y gasa (4 capas) y la suspensión
se coloca en un matraz de 500 ml. Se levanta con cuidado la gasa y se exprime hasta
~ 365 ~
lograr filtrar toda el agua vertida. El líquido colectado es transferido a tubos de plástico
de 15 ml. Los tubos se centrifugan a 1500 rpm durante 5 min. Se elimina el
sobrenadante y se dejan los 3 ml de sedimento. El sedimento de los tubos se colecta y
se junta hasta llenar 3 ó 4 tubos para reducir el número de tubos. Una vez colectado el
sedimento en los tubos se centrifuga nuevamente a 1500 rpm durante 5 min. Se elimina
todo el sobrenadante hasta dejar el sedimento (donde se encuentran los huevos).
Después de eliminar el sobrenadante, se agrega a cada tubo una solución saturada de
azúcar (1.280 kg de azúcar en 1 L de agua) hasta llenarlos a 13 ml (dejando un espacio
con aire de 2 ml) y se colocan las tapas de los tubos. El sedimento es disuelto en la
solución saturada empleando un vortex. Una vez disuelto, los tubos son centrifugados
nuevamente a 1500 rpm durante 5 min. Se retiran las tapas de los tubos y con ayuda de
un asa bacteriológica se colecta la capa superficial de la solución y se transfiere a un
tubo de plástico con 10 ml de agua purificada. Se realizan al menos 10 pasajes en cada
tubo para recuperar la mayor cantidad de huevos posibles. En la Figura 12.3 se resume
el proceso de recuperación de huevos.
Figura 12.3. Procesamiento de las heces para recuperar huevos de nematodos

gastrointestinales de rumiantes (secuencia de izquierda a derecha y de arriba para
abajo).
Es fundamental que los huevos no hayan iniciado el proceso embrionario (Figura 12.4
A) debido a que este proceso provoca un cambio en la permeabilidad de las capas que
recubren los huevos impidiendo el paso del tiabendazol al interior del mismo,
bloqueando su efecto ovicida. Si los huevos se encuentran embrionados o se ha
desarrollado la larva L1 (Figura 12.4B y 12.4C, respectivamente) es necesario volver a
colectar heces y repetir la recuperación.
~ 366 ~
Figura 12.4. Huevos de Haemonchus contortus en diferentes fases de desarrollo: A)

huevos no embrionados, B) huevo embrionado, y C) huevo con larva L1.
Una vez que se han colectado los huevos en el tubo con agua purificada es necesario
estimar la concentración de huevos en la solución (huevos/ml). Se toman 12 gotas de
20 µl (c/u) y se colocan en portaobjetos para observar al microscopio (aumento 10X).
Es necesario homogenizar la solución después de cada 2 gotas tomadas. Se
contabilizan los huevos que se observen en cada gota y se registra. Se debe eliminar el
valor más alto y el más bajo y se promedian los 10 conteos restantes para conocer el
número promedio de huevos en 20 µl. Aplicando una regla de tres se calcula la cantidad
de huevos por ml.
Ejemplo:
Contamos los huevos presentes en las 12 gotas y eliminamos los valores extremos: 42,
34, 49, 40, 43, 38, 29, 45, 40, 43, 41, 37.
Promediamos los conteos restantes: 42+34+40+43+38+45+40+43+41+37= 403/10 =
40.3 = 40 huevos en 20 µl en promedio.
Si en 20 µl hay 40 huevos, entonces en 1000 µl (1 ml) ¿cuántos huevos hay?
= 1000 (40) / 20 = 2000 huevos por ml.
Dilución de la solución con huevos. En la prueba de IEH empleamos placas de 24

pozos y se emplea 24.5 ml de una solución con huevos a una concentración de 200
huevos por ml. Por cada placa requerimos un total de 4800 huevos (200 huevos x 24
pozos = 4800 huevos). Para realizar dicha dilución aplicamos la siguiente fórmula:
Vi (Ci) = Vf (Cf)
Dónde:
Vi = volumen inicial
Ci = concentración inicial
Vf = volumen final
Cf = concentración final.
Despejamos la fórmula de la siguiente manera: Vi = Vf (Cf) / Ci
Sustituimos las letras con los datos que disponemos: Ci: concentración inicial de la
solución con huevos colectados; Vf: volumen total de la suspensión que requerimos
para realizar una placa con 24 pozos; Cf: concentración de la suspensión de huevos
requerida para la prueba de IEH. Sustituyendo con los datos disponibles siguiendo el
ejemplo anterior de la recuperación de huevos obtenemos la siguiente fórmula: Vi =
24.5 (200) / 2000 = 2.45
~ 367 ~
El resultado de la fórmula en el ejemplo es 2.45, lo interpretamos de la siguiente

manera: Utilizaremos 2.45 ml de la suspensión de huevos que se ha colectado y
agregaremos agua purificada hasta completar los 24.5 ml que se requieren para la
prueba (2.45 + 22.05 ml de agua). Al final se obtiene 24.5 ml de una solución con una
concentración de 200 huevos por ml (aproximadamente).
Prueba de inhibición en la eclosión de huevos.

Para esta prueba se realizan soluciones madre y soluciones de trabajo con tiabendazol
grado reactivo diluido en dimetilsulfóxido (von Samson-Himmelstjerna et al., 2009).
Todas las soluciones se preparan en tubos plásticos de 15 ml con tapa rosca. Las
soluciones madre y soluciones de trabajo pueden almacenarse en congelación para ser
empleadas hasta por un máximo de 2 semanas. En el Cuadro 12.3 se describe cómo se
preparan las soluciones empleadas en esta prueba. Una vez lista la dilución de la
solución con huevos a la concentración requerida, y las soluciones de trabajo con
tiabendazol, realizamos lo siguiente:
En una placa de 24 pozos se colocarán 990 μl de agua purificada en cada pozo, más 10
μl de cada una de las soluciones de trabajo de tiabendazol (estándar) o 10 μl de DMSO
sin tiabendazol (control). Posteriormente, se agrega en todos los pozos 1000 μl de la
suspensión de huevos (concentración de 200 huevos / ml). Se emplean tres pozos por
cada una de las concentraciones evaluadas (Figura 12.5). Es importante que las
concentraciones empleadas permitan un rango de efecto de 0 a ˃90%. De ser
necesario se pueden incluir concentraciones extras (Cuadro 12.2).
Cuadro 12.2. Preparación de las soluciones de tiabendazol (TBZ) para realizar la

prueba de inhibición en la eclosión de huevos (von Samson-Himmelstjerna et al., 2009).
Solución Preparación Concentración CF*

Sol. A 50 mg de TBZ + 5 ml de DMSO 10 mg/ml
Sol. B 1 ml de sol. A + 9 ml de DMSO 1 mg/ml
ST 1 20 μl de sol. B + 9.98 ml de DMSO 2 μg/ml 0.01 E
ST 2 50 μl de sol. B + 9.95 ml de DMSO 5 μg/ml 0.025 S
ST 3 100 μl de sol. B + 9.9 ml de DMSO 10 μg/ml 0.05 T
ST 4 200 μl de sol. B + 9.8 ml de DMSO 20 μg/ml 0.1 Á
ST 5 400 μl de sol. B + 9.6 ml de DMSO 40 μg/ml 0.2 N
ST 6 600 μl de sol. B + 9.4 ml de DMSO 60 μg/ml 0.3 D
ST 7 1000 μl de sol. B + 9 ml de DMSO 100 μg/ml 0.5 A
R
ST 8 800 μl de sol. B + 4.2 ml de DMSO 160 μg/ml 0.8 E
ST 9 1000 μl de sol. B + 4 ml de DMSO 200 μg/ml 1 X
ST 10 300 μl de sol. A + 4.7 ml de DMSO 600 μg/ml 3 T
ST 11 500 μl de sol. A + 4.5 ml de DMSO 1000 μg/ml 5 R
ST 12 1000 μl de sol. A + 4 ml de DMSO 2000 μg/ml 10 A
S
ST solución de trabajo, DMSO dimetilsulfóxido, CF* concentración final en pozos (μg/ml)
~ 368 ~
Figura 12.5. Distribución de las concentraciones de tiabendazol (0.01-0.5) y controles

negativos (C-) en las placas de 24 pozos para realizar la prueba de inhibición de la
eclosión de huevos.
Las placas se incuban a 28°C durante 48 h. Para obtener mejores porcentajes de

eclosión, las placas se deben colocar lo más próximas a la platina de calentamiento de
la incubadora. Transcurrido el tiempo de incubación, se agregan dos gotas de una
solución de lugol (4 g de yoduro de sodio + 2 g de yodo en 100 ml de agua) para
detener el proceso de eclosión en los pozos. Se cuentan los huevos y larvas en cada
uno de los pozos con ayuda de cámaras de McMaster. En la Figura 12.6 se resume los
pasos principales de la prueba de inhibición en la eclosión de huevos.
Figura 12.6. Prueba de inhibición de la eclosión de huevos de nematodos

gastrointestinales de rumiantes (de izquierda a derecha y de arriba para abajo).
Conteo de huevos y larvas. Para los huevos y larvas de cada pozo se debe
homogenizar el contenido empleando una jeringa de insulina ya que los huevos y las
larvas se encuentran en el fondo. Se recupera el contenido del pozo con ayuda de la
jeringa de insulina y se llenan las cámaras de McMaster. Se emplean dos cámaras para
examinar el contenido de cada pozo. Las cámaras se observan al microscopio con el
aumento 10X. Se cuentan todos los huevos y larvas observados dentro de ambos
compartimientos de las cámaras. Debido a que el líquido tiene baja densidad, los
huevos y larvas sedimentan, por lo que es necesario enfocar el fondo de la cámara para
~ 369 ~
poder realizar la observación, quedando las líneas de la cámara fuera de foco. El uso
de la cámara facilita el conteo (Figura 12.7).
Figura 12.7. Área de conteo de huevos y larvas recuperados de los pozos incubados
con y sin tiabendazol empleando una cámara de McMaster. La observación se realiza
en el fondo de la cámara.
Criterios para la contabilización. Se contabilizan como larvas aquellas que ya se

encuentran libres o que han iniciado su salida del huevo. Los huevos larvados que
presentan la cubierta del huevo intacta se consideran como huevo. Los cascarones
vacios no se contabilizan (Figura 12.8).
Análisis de datos. Se calcula el porcentaje de inhibición en la eclosión de huevos en
cada concentración evaluada con la siguiente fórmula:
Inhibición en la eclosión = 100 - eclosión
Eclosión = [(larvas L1)/(huevos+larvas L1)] X 100
Existen huevos infértiles o dañados que no originan larvas, lo que implica que los
controles deben tener un mínimo de eclosión de 70%. Si esto no se cumple en cada
control se debe repetir la prueba. Las concentraciones letales 50, 95 y 99 (CL50,95,99) e
intervalos de confianza al 95% se calculan mediante un análisis probit usando el
programa Polo Plus © (LeOra Software, 2004).
~ 370 ~
Figura 12.8. Criterios para la contabilización de larvas y huevos en la prueba de

inhibición en la eclosión de huevos.
Si la población estudiada presenta una CL50 >0.1 µg, esta es considerada como
resistente (von Samson-Himmelstjerna et al., 2009). Se puede emplear como criterio
una CL95 >0.1 µg para detectar de forma temprana la presencia de NGI resistentes.
Para determinar el índice de resistencia (IR) se divide la CL50 o CL95 de la población
estudiada entre la CL50 o CL95 de una población susceptible conocida (aislado de
campo o laboratorio). El resultado indica cuantas veces es más resistente la población
estudiada respecto a una población susceptible.
12.2.2.2. Prueba de Inhibición de la migración larval
Fundamento
La prueba de inhibición de la migración larval (IML) forma parte de las pruebas

desarrolladas para diagnosticar la resistencia a las avermectinas (ivermectina) e
imidazotiazoles (levamisol) en las cuales se mide la capacidad paralizante de estos AH
sobre los NGI (parálisis, inhibición en la motilidad o migración en larvas o nematodos
adultos). La prueba de IML consiste en incubar larvas en diferentes concentraciones del
AH y determinar el porcentaje de inhibición que tienen estas drogas sobre la motilidad
de las larvas, en este caso midiendo la migración a través de tamices. Con esta prueba
se pueden calcular las concentraciones letales 50, 95 y 99 de una población estudiada
y compararla con una población susceptible de la misma especie. Demeler et al.
(2010a,b) han estandarizado esta prueba para determinar la resistencia a las LM y
levamisol en NGI que parasitan a los rumiantes (bovinos, ovinos o caprinos).
~ 371 ~
Materiales
 Gasas.
 Bolsas de nylon nuevas.
 Guantes.
 Recipientes de plástico grandes.
 Tamiz de plástico mediano.
 Cajas de Petri grandes (15 cm de diámetro).
 Incubadora con temperatura regulable.
 Atomizador de plástico.
 Marcadores permanentes.
 Servilletas.
 Embudos de plástico.
 Tubos de plástico de 15 ml.
 Manguera flexible.
 Probeta o soporte de madera de 40 cm de altura.
 Frascos de plástico de 500 ml.
 Micropipetas de 10-100 µl, 100-1000 µl y 1-5 ml.
 Portaobjetos.
 Microscopio.
 Placas de 24 pozos.
 Tamices de plástico con malla de 25 µm de apertura.
 Viales de plástico de 2.5 ml.
 Vortex.
 Gradilla para tubos de ensayos.
 Ivermectina (I8898 SIGMA©).
 Levamisol (L9756 SIGMA©).
 Dimetilsulfóxido (D8418 SIGMA©).
 Bacto agar.
 Solución de lugol.
 Cámaras de McMaster.
 Jeringas de insulina.
 Pinzas de disección.
Procedimiento
Obtención de larvas infectantes de NGI. Antes de realizar la prueba de inhibición en la

migración larval es necesario obtener un gran número de larvas infectantes a partir de
las heces de animales donadores. Existen varios métodos para realizar coprocultivos
para la obtención de larvas infectantes. Los diferentes métodos se basan en los mismos
principios: permitir que maduren y eclosionen los huevos de los NGI así como el
desarrollo de las larvas L1 y L2 hasta larvas infectantes (larvas L3). A continuación se
describe una metodología que ha mostrado buenos resultados en la obtención de larvas
cuando se emplean heces de ovinos y caprinos.
~ 372 ~
Toma y manejo de heces. Para facilitar la recolección de heces para la producción de L3

es recomendable que los animales se encuentren en jaulas elevadas con piso cribado y
que cuenten con una malla debajo del piso para facilita la colecta de heces. Esto ayuda
a obtener una mayor cantidad de heces y permite mantener la integridad de las
mismas. Las heces se colectan del piso o malla y se colocan en bolsas plásticas. Se
debe remover la mayor cantidad de materiales que puedan encontrase con las heces
(pasto, pelo, etc.). Debido a que las heces colectadas se encuentran expuestas al
ambiente, la contaminación con nematodos de vida libre y con larvas de insectos puede
complicar la producción de larvas por lo que deben ser lavadas antes de realizar los
coprocultivos.
Limpieza y cultivo de heces. Las heces son colocadas en un recipiente de plástico con
agua y se remueven los restos de pasto y pelo. Las larvas de insectos y demás detritus
sedimentan. Después las heces (pellets fecales) que flotan se recuperan con la mano y
se colocan en otro recipiente plástico. Se agregar agua corriente suavemente dentro del
recipiente plástico de tal manera las heces reciban directamente el chorro de agua. Las
heces se transfieren de nuevo a otro recipiente de plástico descartando el agua con
sedimento. Los recipientes se enjuagan antes de colocar las heces entre cada lavado.
Después de tres lavados, las heces son colocadas en un tamiz de plástico y se pasan
por última vez bajo un chorro de agua. Esto para reducir la posibilidad de que se
contaminen los coprocultivos con nematodos de vida libre. Después se deja escurrir las
heces para eliminar el exceso de agua. Las heces son colocadas dentro de cajas de
Petri grande (15 cm de diámetro). No es necesario macerar las heces en forma de
pellet. Esto ayuda a reducir la cantidad de detritus cuando se recuperan las larvas
infectantes. Las cajas de Petri son colocadas en incubadora a 28º C durante un periodo
de 4 a 7 días. Se ha observado que el tiempo de huevo a larva infectante varía según el
lugar de origen de las larvas (clima templado vs. clima tropical). Durante el tiempo de
incubación las heces deben humedecerse cada día o cuando se observen resecas. No
hay que excederse en la cantidad de agua. Es recomendable emplear un atomizador de
plástico para rociar el agua sobre las heces. En la Figura 12.9 se muestran los pasos
principales de este método para la obtención de larvas infectantes.
Figura 12.9. Procesamiento de las heces para la obtención de larvas infectantes de

nematodos gastrointestinales mediante coprocultivos (secuencia de izquierda a derecha
y de arriba para abajo).
~ 373 ~
Cosecha de larvas. Finalizado el tiempo de incubación, las larvas se recuperan

mediante un aparato de Baermann. El aparato se elabora uniendo un tubo de plástico al
extremo de un embudo plástico mediante una manguera flexible. Este aparato se
coloca en un soporte vertical (probeta o soporte de madera). Una vez vertical, se
agrega agua purificada hasta llenar la mitad del embudo. Para reducir la cantidad de
detritus (resto de heces y larvas muertas) se coloca en el embudo una servilleta que
actuarán de filtro. Se debe asegurar el contacto del papel con el agua y que se cubran
todas las paredes del embudo. Se coloca un pliegue cuadrado de gasa, acomodado a
la forma del embudo. Sobre la gasa se depositan las heces de los coprocultivos. La caja
de Petri se enjuaga y el líquido se deposita en el aparato, ya que las larvas pueden
permanecer en la tapa de la caja. Los extremos libres de la gasa se doblan hacia dentro
del embudo, cubriendo por completo las heces. Se agrega agua hasta cubrir por
completo las heces, se procura que el agua no se vierta fuera del embudo. Se deja
reposar durante 3 h, en este tiempo la mayoría de las larvas que se encuentran en las
heces migrarán a través de la servilleta y sedimentarán en el tubo (Figura 12.10).
Figura 12.10. Representación esquemática del aparato de Baermann para la

recuperación de larvas infectantes de nematodos gastrointestinales.
Transcurrido el tiempo, se retiran las gasas con las heces y se desmontan los tubos
unidos a los embudos. Cuando hay una cantidad elevada de larvas, se puede apreciar
un “botón” blanco en el fondo del tubo. Una vez retirados los tubos, se puede eliminar el
exceso de agua empleando una micropipeta de 1-5 ml. El sedimento de larvas se
coloca en un frasco de plástico con 300 ml de agua purificada.
Estimación de la cantidad de larvas recuperadas. Una vez que se han colectado las
larvas se estima la concentración de larvas en la solución (larvas/ml). Se toman 12
gotas de 20 µl (c/u) y se colocan en un portaobjetos para observar al microscopio
~ 374 ~
(aumento 10X). Es necesario homogenizar la solución después de tomadas 2 gotas. Se

contabilizan las larvas que se observen en cada gota y se registra. Se deben eliminar el
valor más alto y el más bajo y se promedian los 10 conteos restantes para conocer el
número promedio de larvas en 20 µl. Aplicando una regla de tres se calcula la cantidad
de larvas por ml.
Ejemplo: Contamos las larvas presentes en las 12 gotas y eliminamos los valores
extremos: 23, 27, 22, 29, 28, 38, 34, 27, 33, 24, 26, 30. Promediamos los conteos
restantes: 23+27+29+28+34+27+33+24+26+30 = 281/10 = 28.1 = 28 larvas por cada 20
µl en promedio. Si en 20 µl hay 28 larvas, entonces en 1000 µl (1 ml) El número de
larvas se determina con la fórmula: No. de larvas = 1000 µl * promedio de larvas (28) /
volumen de gota observada (20 µl) = 1400 larvas por ml.
Prueba de inhibición en la migración larval. Para esta prueba se prepara la solución

madre y soluciones de trabajo con IVM grado reactivo (I8898 SIGMA©) diluido en
dimetilsulfoxido (D8418 SIGMA©) como lo describen Demeler et al. (2010b). La
solución madre y soluciones de trabajo con levamisol (L9756 SIGMA©) se realizan con
agua (Demeler et al., 2010a). Las soluciones con IVM pueden almacenarse en
congelación para ser usadas en las pruebas hasta por 3 meses. Las soluciones con
levamisol deben prepararse y emplearse el mismo día de la prueba. Todas las
soluciones se preparan en viales de 2.5 ml. En el Cuadro 12.3 se describe cómo se
preparan las soluciones empleadas en esta prueba.
En dos placas de 24 pozos se colocará, en cada pozo, 1700 μl de agua purificada más
90 μl de cada una de las soluciones de trabajo (IVM o levamisol), 90 μl de solución
control sin antihelmíntico. Para el control positivo se emplean 90 μl de la solución A o 90
μl de lugol. Posteriormente, se agrega en todos los pozos 20 μl de una suspensión de
larvas a una concentración de 6000 larvas/ml. Se emplean tres pozos por cada una de
las concentraciones evaluadas (Figura 12.11).
Figura 12.11. Distribución de las concentraciones de ivermectina o levamisol (4 a 0.06),

controles negativos (C-) y controles positivos (C+) en las placas de 24 pozos para
realizar prueba de inhibición en la migración larval.
~ 375 ~
Cuadro 12.3 Preparación de las soluciones de ivermectina (IVM) y levamisol (LEV) para
realizar la prueba de inhibición en la migración larval (Demeler et al., 2010a,b).
Concentración
Concentración
Soluciones Preparación final en pozos
de la solución
M (μM/ml)
Sol. A(10-2M) 8.71 mg IVM/LEV* + 1 ml de DMSO/H2O 8.7 mg/ml -
C1 30μl Sol. A + 120 μl DMSO/H2O 2x10-3M -
C2 50 μl de Sol. A + 450 μl DMSO/H2O 10-3M -
-3
C3 200 μl de 10 M + 800 μl DMSO/H2O 2x10-4M -
C4 100μl de 10-3M + 900 μl DMSO/H2O 10-4M -
C5 20 μl de 10-3M + 980μl DMSO/H2O 2x10-5M -
C6 10 μl de 10-3M + 990 μl DMSO/H2O 10-5M -
-4
C7 20 μl de 10 M + 980 μl DMSO/H2O 2x10-6M -
C9 20 μl de 10-5M + 980 μl DMSO/H2O 2x10-7M -
ST 1 100 μl de C1 + 900 μl H2O - 10-5 (4)
ST 2 100 μl de C2 + 900 μl H2O - 5x10-6(2)
ST 3 100 μl de C3 + 900 μl H2O - 10-6 (1)
ST 4 100 μl de C4 + 900 μl H2O - 5x10-7 (0.8)
ST 5 100 μl de C5 + 900 μl H2O - 10-7 (0.6)
ST 6 100 μl de C6 + 900 μl H2O - 5x10-8 (0.4)
ST 7 100 μl de C7 + 900 μl H2O - 10-8 (0.2)
ST 8 100 μl de C8 + 900 μl H2O - 5x10-9 (0.1)
ST 9 100 μl de C9 + 900 μl H2O - 10-9 (0.08)
ST 10 100 μl de C10 + 900 μl H2O - 5x10-10 (0.06)
Control (-) IVM 100 μl de DMSO + 900 μl H2O - -
Control (-) LEV 100 μl de H2O + 900 μl H2O - -
Sol. solución, C concentración, ST solución de trabajo, DMSO dimetilsulfoxido, *Las primeras diluciones
de IVM (Sol. A y C1 a C10) se realizan con DMSO, en el caso de LEV todas las diluciones se realizarán
con H2O
Las placas son incubadas a 28ºC durante 24 h. Se prepara un segundo set de placas
de 24 pozos denominadas placas de migración. En cada pozo se colocan 400 µl de
Bacto agar al 1.5% y se deja enfriar. Siempre se preparan 2 placas de migración por
cada placa de incubación. Transcurridas las 24 h de incubación, el contenido de cada
pozo es transferido a tamices (malla de 25 μm) que se encuentran colocados en las
placas de migración. Las placas de migración son incubadas nuevamente a 28ºC
durante 24 h para que migren las larvas a través del tamiz. Una vez cumplidas las 24 h,
los tamices son removidos de los pozos (filas A y C) y colocados en pozos vacíos (filas
B y D) (Figura 12.12).
~ 376 ~
Figura 12.12. Distribución de las concentraciones de ivermectina en las placas de

migración así como de la localización de los tamices en su respectivo pozo de
migración. Detalle del tamiz empleado en esta prueba.
El interior de los tamices es enjuagado empleando 1 ml de agua y el contenido es

colocado dentro del pozo correspondiente. El contenido es mezclado y colocado dentro
de cámaras de McMaster para realizar el conteo de larvas. En la Figura 12.13 se
muestran los principales pasos para realizar la prueba de inhibición en la migración
larval.
Figura 12.13. Prueba de inhibición de migración larval de nematodos gastrointestinales

de rumiantes (secuencia de izquierda a derecha y de arriba para abajo).
Conteo de larvas. Se agrega una gota de una solución de lugol a cada pozo para
facilitar el conteo de las larvas. Se cuentan las larvas migradas (filas A y C) y no
migradas (filas B y C) en cada uno de los pozos empleando cámaras de McMaster. Las
cámaras se observan al microscopio con el aumento 10X (Figura 12.14).
~ 377 ~
Figura 12.14. Esquema del área de conteo de larvas recuperadas de los pozos de
migración empleando una cámara de McMaster.
Análisis de datos. Se calcula el porcentaje de migración larval (ML%) en cada

concentración con la siguiente fórmula (Demeler et al., 2010b):
ML% = (L3 en tamiz/L3 migradas + L3 en tamiz) X 100
Las concentraciones letales 50, 95 y/o 99 (CL50,95,99) e intervalos de confianza al 95%
se calculan empleando el programa para análisis Probit mediante el programa Polo Plus
© (LeOra Software, 2004).
Las concentraciones letales de las poblaciones estudiadas pueden ser comparadas con
aislamientos con susceptibilidad conocida aislados en campo o provenientes de
laboratorio. Para determinar el índice de resistencia (IR) se divide la CL50 o CL95 de la
población estudiada entre la CL50 o CL95 de una población con susceptibilidad conocida.
El resultado indica cuantas veces es más resistente la población estudiada respecto a
una población susceptible.
Cuadro 12.4. Concentraciones letales 50 (CL50) e intervalos de confianza al 95%

(IC95%) obtenidos en pruebas de inhibición de la migración larvaria con aislamientos de
nematodos gastrointestinales.
Aislamiento CL50 IC 95% Estatus

McMaster (H. contortus)* 914.4 nM 820.7-1019 nM IVM susceptible
CAVR (H. contortus)* 7679 nM 6872-8581 nM IVM resistente
Cooperia oncophora sus† 107 nM 98.4-116.7 nM IVM susceptible
Cooperia oncophora res† 886 nM 823.5-953.3nM IVM resistente
Cooperia oncophora sus† 452 nM 385-532 nM LEV susceptible
Cooperia oncophora res† 1270 nM 1070-1510 nM LEV resistente
Ostertagia ostertagi sus† 307.7 nM 282.8-334.9nM IVM
832 nM 710-975 nM LEV
*Ovino, †Bovino (tomado de Demeler et al., 2010a,b).
~ 378 ~
12.3 DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO PARA DETERMINAR LA

RESISTENCIA DE LAS GARRAPATAS A LOS IXODICIDAS
Recomendaciones para la colecta de garrapatas en campo y transporte al

laboratorio.
La FAO recomienda obtener material biológico (garrapatas Rhipicephalus microplus) de

alta calidad tanto para el trabajo en el campo como en el laboratorio (FAO, 1999). A
continuación se mencionan las principales recomendaciones:
 Número de garrapatas. Colectar el mayor número de garrapatas hembras repletas
(teleoginas) de ser posible (20–50) de al menos 10 a 15 animales de la UP bovina,
cuidando principalmente no lesionar el hipostoma de la garrapata al momento de
desprenderlas de los bovinos.
 Hora del muestreo. La mayor cantidad de teleoginas se obtienen en las horas
tempranas del día, antes de que los rayos solares incidan directamente sobre los
animales, ya que esto estimula el desprendimiento natural de las garrapatas. Antes
de la colecta de las garrapatas se debe evitar el arreo de los animales de los
potreros a los corrales, ya que el movimiento y el calor generado por los animales
estimula la caída de las teleoginas, se recomienda dejar a los animales a muestrear
en un corral durante la noche y realizar el muestreo por la mañana siguiente.
 Tiempo con relación al tratamiento ixodicida. Depende directamente del acaricida en
uso, su efecto residual, si tiene un efecto fuerte y rápido o si su efecto máximo es
retardado, así como la especie de garrapata que se desee colectar; la garrapata R.
microplus es de un solo hospedador, es decir, sus mudas de larva a ninfa y de ninfa a
adulta se realiza en el mismo hospedador. Durante los periodos de muda las
garrapatas son menos susceptibles a los acaricidas debido a la falta de capacidad de
penetrar la doble cutícula alrededor de estos estadios. Lo anterior indica que en las
garrapatas engurgitadas que se alimentaron 9 a 14 días después del tratamiento es
menos probable determinar una verdadera resistencia genética. Ante esto se
recomienda usar teleoginas colectadas entre el día 3 a 8 ó 14 a 17 pos-tratamiento
para realizar la prueba de resistencia. Si se usan LM es esencial colectar 3 días o más
después del tratamiento y si se usa fluazuron al menos 15 días después.
 Transporte de garrapatas. Se deben transportar en pequeñas cajas de Petri con
pequeños orificios en las tapas para permitir la circulación de aire. Si se transportan a
grandes distancias, las cajas de Petri deben de ser depositadas en una cámara
húmeda (se puede utilizar una caja de plástico) que contenga en la base un papel o
algodón ligeramente húmedo. Esto se realiza para formar un medio húmedo y obscuro
que permita la incubación de las teleoginas. Se debe evitar exponer las garrapatas a
la luz solar directa y a altas temperaturas.
Manejo de las teleoginas para la producción de larvas
Las teleoginas deben ser depositadas en cajas de Petri de plástico dentro de una cámara
húmeda (80-90% humedad), en completa oscuridad y a una temperatura controlada de 27
~ 379 ~
+2°C, con la finalidad de que las teleoginas efectúen la oviposición. Posteriormente, ya

que la oviposición concluye (dos semanas después), los huevos se colectan y se
depositan en viales de vidrio con tapón de algodón, y se someten a las mismas
condiciones de temperatura y humedad al que fueron expuestas las teleoginas para
esperar la eclosión (dos semanas más). Una vez que las larvas eclosionan, se espera a
que tengan una edad de siete a 14 días (5-6 semanas post-colecta), para ser sometidas al
diagnóstico de resistencia para Organofosforados, Piretroides y Amidinas (FAO, 2004). En
el caso de diagnóstico de resistencia a la IVM se utilizan larvas de 14 a 21 días de edad
(6-7 semanas post-colecta) (Klafke et al., 2006).
12.3.1. Prueba de paquete de larvas
Fundamento
Esta prueba fue descrita por Stone y Haydock (1962) y posteriormente modificada por la
FAO (1971), se usa ampliamente para la caracterización de cepas, detección y estudio de
fenómenos de resistencia a los ixodicidas en garrapatas y se reconoce de manera
internacional debido a su gran utilidad práctica. Esta prueba consiste en la exposición de
larvas de garrapatas R. microplus de 7 a 15 días de edad en papeles filtro impregnados
con una dosis discriminante (DD) o distintas concentraciones de algún químico
(Organofosforados y Piretroides), con el objeto de obtener porcentajes de mortalidad del
orden de 0 a 100 (Santamaría y Soberanes, 2001).
Materiales
Para la realización de ésta prueba se requiere de los siguientes materiales:
 Ixodicidas (garrapaticidas) de las siguientes familias: Organofosforados (clorfenvinfos,
clorpirifos coumafos, diazinon) y Piretroides sintéticos (cipermetrina, flumetrina,
deltametrina, ciflutrina, cialotrina) en grado técnico.
 Papel filtro tipo Whatman del No. 1 con dimensiones de 7.5 cm de largo x 8.5 cm de
ancho.
 Tricloroetileno (Tc) como diluyente (cancerígeno y volátil, se recomienda manejar con
precaución).
 Aceite de oliva (AO) como fijador.
 Área ventilada o con campana de extracción.
 Larvas de garrapatas R. microplus de 7-14 días de edad.
 Micropipetas y puntillas de 2-20 µl, 20-200 µl y 100-1000 µl.
 Lápiz.
 Papel aluminio.
 Vasos de precipitado de 100 ml.
 Agarra papeles tipo Bulldog del No. 200.
 Jeringas de 1 ml.
 Guantes de látex.
 Respirador facial de media cara con cartuchos y filtros contra pesticidas..
 Pinceles del No. 4.
~ 380 ~
Procedimiento
 Preparación de rectángulos de papel filtro. Para esta prueba se utilizan rectángulos
de 8.5 cm de ancho por 7.5 cm de largo de papel filtro. Los rectángulos de papel
filtro se doblan a la mitad a modo de que formen un sobre y con la ayuda de los
agarrapapeles se cierran los espacios laterales, quedando sólo el espacio superior
para permitir el llenado con las larvas de R. microplus; estos paquetes deben ser
identificados con lápiz con el nombre del rancho, nombre del producto químico y el
número de repetición (Figura 12.15).
 Preparación de diluciones. Para la realización de esta prueba se utilizan las DD de
cipermetrina (0.05%), flumetrina (0.01%), deltametrina (0.09%), coumafos (0.2%),
clorpirifos (0.5%), clorfenvinfos (0.2%) y diazinon (0.8%), (FAO, 1984; Mendes et al.,
2011) para detección de resistencia en Piretroides y Organofosforados, con tres
repeticiones por cada dilución incluyendo tres controles por población de garrapata a
evaluar. Como diluyente para todos los productos químicos se usa el Tc, y el AO se
utiliza como fijador en una proporción de 2:1, respectivamente. Con estos solventes
lo primero que debe hacerse es una solución madre derivada de la sustancia grado
técnico, es decir, diluirla a una concentración menor (puede ser de 1-10%) con la
cual podamos manejarla y preparar las DD o concentraciones más bajas de cada
ixodicida. Posterior a la preparación de la solución madre se prepara una solución
control. Ejemplo: si se quiere diagnosticar resistencia a un solo ixodicida, se requiere
preparar al menos 6 ml de Tc y AO (tomando en cuenta que son tres sobres para
controles y tres para tratados), para esto se toman 4 ml del Tc y 2 ml del AO para
obtener la proporción 2:1 de la solución control. En el vaso de precipitado de la
solución control se recomienda verter primero el AO y considerar 1 ml (solución
control) por papelito debido a la evaporación del Tc. Con base en el número de
ixodicidas o concentraciones que se quieran probar será el volumen a considerar de
la solución control. Posteriormente se preparan las DD de acuerdo al (los) ixodicida
(s) que se vaya (n) a evaluar. Todas las diluciones que sean preparadas en los
vasos de precipitado deben ser tapadas con papel aluminio para evitar la
evaporación rápida.

Figura 12.15. Preparación e identificación de paquetes de larvas de Rhipicephalus

microplus.
~ 381 ~
 Impregnación de papeles. Una vez preparadas las concentraciones primero se

impregnan los controles (únicamente Tc y AO) y se continúa con los tratados o las
DD de cada ixodicida. En caso de utilizarse más de una dilución o concentración por
ixodicida (para análisis Probit), se continúa con las concentraciones más bajas hasta
las más altas. Para impregnar los rectángulos de papel filtro se utilizan jeringas de
1ml de capacidad (1000 µl), aplicando 0.7 ml de la solución por cada rectángulo en
la cara posterior a la identificación e iniciando de arriba hacia abajo de lado a lado
(Figura 12.16). Se deberá tener mucho cuidado en no contaminar los controles y
hacer cambio de guantes por cada ixodicida usado. Posteriormente los rectángulos
se mantienen suspendidos (con pinzas) por 30 min aproximadamente en un hilo o
alambre para su secado (esto con la finalidad de que se evapore el Tc y sólo quede
el AO y el ixodicida en la superficie del papel), una vez secos pueden ser
almacenados (un mes máximo) envueltos en papel aluminio y en refrigeración hasta
su uso.
Figura 12.16. Impregnación de papeles con acaricidas.
 Llenado de paquetes. Cada prueba inicia con el llenado de los controles, siguiendo
con la dilución más baja hasta finalizar con la más alta (en caso que se utilicen
varias diluciones del mismo ixodicida). Para colocar las larvas se utiliza un pincel del
No. 4 con el que se toman de 80 a 100 larvas aproximadamente del borde del frasco
y se depositan en cada paquete (procurar cambiar de pincel por cada paquete para
evitar la contaminación del frasco de larvas), que posteriormente se sellan con los
agarrapapeles de metal (Bulldog del No. 200). Al concluir el llenado de los paquetes,
se colocan en una charola limpia y se introducen en la estufa de incubación a 27 ±
2ºC y con una humedad relativa del 85 al 90% permaneciendo por 24 h.
~ 382 ~
 Lectura de resultados. Se realiza 24 h posteriores al tratamiento, iniciando el conteo

de las larvas en los paquetes control. Se evalúa el criterio de mortalidad, donde se
considera que todas las larvas que puedan caminar o deslizarse se encuentran
vivas. El criterio de respuesta que se evalúa en la prueba es mortalidad.
Posteriormente se realizan los cálculos de los porcentajes de mortalidad, para la
cual se utiliza la siguiente fórmula:

% Mortalidad = larvas muertas x 100

larvas totales
Para calcular la mortalidad media:

Media del % de mortalidad = mortalidad 1 + mortalidad 2 + mortalidad 3
3
En el caso de las DD, si sobrevive alguna larva se considera resistente a los ixodicidas
que hayan sido evaluados. Sin embargo, el hecho que sobreviva una o más larvas no
quiere decir que el (los) producto(s) ya no pueda(n) utilizarse a nivel de campo. Se podría
utilizar de forma mesurada, es decir si obtuvimos mortalidad promedio del 80-99% podría
utilizarse por seis meses más, dejar de utilizarlo al menos por dos años y utilizar mientras
tanto otras familias de ixodicidas con rotación anual. Ahora si la mortalidad obtenida es
muy baja <60%), ese producto ya no podrá ser utilizado más, ya que la resistencia de R.
microplus hacia los Organofosforados y Piretroides está caracterizada genéticamente por
dominancia incompleta, por lo que es posible encontrar poblaciones de garrapatas
resistentes a estos ixodicidas años después de haberse dejado de usar (Kunz y Kemp,
1994; Fragoso y Soberanes, 2001; Rodríguez-Vivas et al., 2011a).
Por otra parte, si se utilizan varias diluciones de un mismo producto para obtener las
CL50 y CL99 por medio de la metodología Probit (Polo Plus ©; LeOra Software, 2004), se
pueden calcular los índices de resistencia al 50 ó 99% (IR50 e IR99) dividiendo las
concentraciones letales (CL50 y CL99) de la cepa evaluada entre la cepa de referencia
(FAO, 1987). Pudiéndose interpretar para el caso de Piretroides: IR <3 susceptible, IR
3-5 tolerante e IR >5 resistente. Si se obtiene IR resistente, este producto ya no debe
ser utilizado a nivel de campo (Beugnet y Chardonnet, 1995; Cabrera-Jiménez et al.,
2008).
~ 383 ~
12.3.2. Prueba de inmersión de larvas
Fundamentos
También conocida como prueba de Sandwich o de Shaw, esta prueba fue descrita por
Shaw (1966) y modificada por la FAO (1984). Consiste en la inmersión entre dos papeles
filtro de larvas de 7 a 14 días de edad en suspensiones del ixodicida, a partir de
concentrados emulsionables disponibles en el mercado, durante un período de 10
minutos, posteriormente se retiran y se colocan en un sobre de papel filtro, incubándose a
27 + 2oC con humedad ambiental del 80-90%, realizándose la lectura de los resultados a
la 72 h posteriores al tratamiento, el objetivo de esta prueba es similar al del paquete de
larvas.
Materiales
 Producto comercial con amitraz al 12.5%.
 Papel filtro tipo Whatman del No. 1 en forma redonda de un diámetro de 12.5 cm para
la inmersión.
 Papel filtro poro fino con dimensiones de 7.5 cm de largo x 8.5 cm de ancho para los
sobres.
 Vaso de precipitado de 200 ml.
 Micropipetas de 100 a 1000 µl.
 Cajas de Petri de vidrio de con un diámetro de 15 cm.
 Larvas de garrapatas Rhipicephalus microplus de 7-14 días de edad.
 Agua destilada o purificada.
 Agarrapapeles tipo Bulldog del No. 200.
 Lápiz.
 Pinceles del No. 4.
Procedimiento
 Preparación de rectángulos de papel filtro. Se preparan de la misma manera como
se menciona en la prueba de paquete de larvas, a diferencia que los rectángulos
son de papel filtro poro fino. Estos paquetes deben ser identificados con lápiz con
nombre del rancho, del producto químico y el número de repetición y también deben
utilizarse tres repeticiones de cada producto, incluyendo a los controles.
 Preparación de diluciones. Para iniciar se realiza la preparación de 100 ml de la
concentración, utilizando el producto comercial recomendado (ejemplo Taktic® al
12.5%). Se toma 0.16 ml del producto con una micropipeta y se deposita en un
matraz de 200 ml. Posteriormente se le agrega agua hasta alcanzar los 100 ml de la
mezcla y se agita para que la mezcla se vuelva homogénea. Una vez hecho esto,
se toma 1 ml de esta mezcla y se deposita en un vaso de precipitado de 200 ml y se
afora a 100 ml con agua; obteniéndose la DD, la cual es 0.0002% (Soberanis et al.,
2002). También se puede preparar mayor número de concentraciones ya sea por
arriba o por debajo de la DD utilizando un factor de dilución del 0.5. Ejemplo:
0.0002, 0.0001, 0.00005, etc.
~ 384 ~
 Inmersión de larvas. En una caja de Petri de vidrio de 15 cm de diámetro, se coloca

un papel filtro Whatman del No. 1 de 12.5 cm. Se toman 10 ml de la concentración
aprobar, iniciando con la solución testigo (agua) y continuando con las diferentes
concentraciones. El papel filtro se impregna con 3 ml de la concentración y con la
ayuda de un pincel del no.4, se colocan de 300-500 larvas aproximadamente que
son distribuidas en el papel. Una vez puestas las larvas se agregan otros 4 ml sobre
estas y se coloca un segundo papel filtro sobre las larvas impregnándose con los 3
ml restantes (Figura 12.17). El tiempo de inmersión es de 10 minutos iniciando a
partir de la colocación de las larvas en el papel filtro impregnado con la
concentración correspondiente.
 Llenado de paquetes. Cuando el período de inmersión ha concluido, los dos
papeles filtro conteniendo en su interior las larvas, son extraídos de la caja de Petri
y se colocan sobre papel toalla para absorber el exceso de solución. Se separan los
papeles filtro y una cantidad de 80 a 100 larvas son cuidadosamente extraídas con
ayuda de un pincel del No. 4 y colocadas en un sobre de papel filtro poro fino
sellándose los bordes (con los agarrapapeles) para evitar la fuga de las larvas. Una
vez los sobres sellados, se colocan en charolas y se introducen por 72 h en una
incubadora con temperatura de 27 +2oC y 80-90% de humedad relativa (Figura
12.18).
Figura 12.17. Inmersión de larvas de Rhipicephalus microplus entre papeles filtro

Whatman.
Figura 12.18. Incubación de paquetes de larvas de Rhipicephalus microplus por 72 hrs.
~ 385 ~
 Lectura de resultados. Trascurridas las 72 h de incubación, se realiza la lectura,

contabilizando el número de larvas vivas y muertas en los tratados y controles. Para
calcular el porcentaje de mortalidad se utiliza la misma fórmula que la prueba de
paquete de larvas (Santamaría y Soberanes, 2001).
NOTA: Cuando son pocas las muestras o se desea ahorrar material se pueden utilizar
todas las cantidades al 10%, es decir, utilizar como volumen total 10 ml (0.016 ml de
amitraz). Se pueden utilizar para la inmersión de las larvas cajas de Petri de 60 mm x 15
mm con papeles de diámetro menor y un volumen de inmersión de 3 ml en lugar de 10 ml.
La interpretación de resultados con respecto al amitraz es similar a la de la prueba de
paquete de larvas. Para esta prueba aunque se encuentren mortalidades bajas (<60%) o
IR altos, el producto puede utilizarse de nuevo después de al menos 2 años de suspender
su uso, esto es debido a que el amitraz presenta característica poligénica, es decir puede
presentar al menos tres efectos sobre las larvas de garrapatas, por lo cual la resistencia al
amitraz no es necesariamente un efecto genético sencillo. Estudios realizados con dos
cepas resistentes al amitraz (San Alfonso y Santa Luiza) revelaron que después de 5
generaciones de laboratorio sin exponerse al producto disminuyó considerablemente el IR
al amitraz (Soberanes et al., 2002; Li et al., 2004). A la fecha no se sabe exactamente los
mecanismos de acción posee el amitraz, por lo que se dificulta conocer el mecanismo por
el cual se produce la resistencia hacia este ixodicida.
~ 386 ~
12.3.3. Prueba de inmersión de larvas modificada (ivermectina)
Fundamento
Esta prueba fue descrita por Shaw (1966) y modificada por Klafke et al., 2006). Consiste
en la inmersión en viales eppendorf (1.5 ml) de larvas de 14 a 21 días de edad en
diluciones de iIVM (grado técnico), durante un período de 10 minutos, posteriormente se
retiran y se colocan en sobres de papel filtro, incubándose a 27 +2oC con humedad
ambiental del 80-90%. La lectura de los resultados se realiza 24 h posterior al tratamiento.
Esta prueba fue diseñada para obtener porcentajes de mortalidad a diferentes diluciones y
con ello poder determinar el grado de susceptibilidad o resistencia al analizar los
resultados con la metodología Probit y obtener los IR con base en las CL50 y CL99 de la
cepa evaluada con respecto a la cepa de referencia.
Materiales
 Ivermectina grado técnico 100% (Sigma-Aldrich, USA®).
 Triton X-100.
 Etanol puro.
 Papel filtro poro fino con dimensiones de 7.5 cm de largo x 8.5 cm de ancho para los
sobres.
 12 tubos de ensayo de 15 ml con tapa.
 Gradilla.
 Vortex.
 Micropipetas y puntillas de 2-20 µl, 20-200 µl y 100-1000 µl.
 12 tubos eppendorf de 1.5 ml.
 Larvas de garrapatas Rhipicephalus microplus de 14-21 días de edad.
 Agua destilada o purificada.
 Agarrapapeles tipo Bulldog del No. 200.
 Lápiz y plumones.
 Pinceles del No. 4.
Procedimiento
 Preparación de rectángulos de papel filtro. Se preparan de la misma manera como se
menciona en la prueba de inmersión de larvas.
 Preparación de diluciones. Se preparan las siguientes diluciones: (i) 5 ml de una
solución al 2% de Tritón X-100 en etanol absoluto (ET-TX2%). Ejemplo: 0.1 ml de
Tritón X-100 en 4.9 ml de etanol absoluto (conservar máximo una semana a 4°C), (ii)
en un vial de 1.5 ml, se prepara 1 ml de solución al 1% de IVM en etanol absoluto
(conservar máximo una semana a 4°C). En caso de ser necesario, hacer corrección
por el grado de pureza de la IVM liofilizada. Ejemplo: para 100% de pureza, si se
pesaran 0.0100 g de IVM, éstos se deben disolver en 1.0 ml de etanol-100%, (iii) En
un vaso de precipitado preparar 100 ml de una solución al 1% de ET-TX2% en agua
destilada. Ejemplo: disolver 1 ml de Et-TX2% (paso 1) en 99 ml de agua destilada
(conservar máximo una semana a 4°C). Esta solución se usará como diluyente para
~ 387 ~
la IVM previamente diluida en etanol, (iv) en un tubo de ensayo (15 ml), preparar 10
ml de la dosis máxima, la cual es IVM al 0.01% (o 100 ppm).
Transferir 7 ml
de sol. máxima
10 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Figura 12.19. Diluciones seriadas de ivermectina para el diagnóstico de resistencia de
Rhipicephalus microplus a este endectocida.
 Ejemplo: Agregar 0.1 ml de la solución previa de IVM (paso 2) a 9.9 ml del diluyente
obtenido en el paso 3, (v) realizar diluciones seriadas al 30% a partir de la dosis
máxima (0.01%) obtenida en el paso 4 hasta 0.00028%. Ejemplo: primero agregue
en 11 tubos de ensayo 3 ml de diluyente (paso 3). Las diluciones se hacen tomando
7 ml de un tubo, los cuales se agregan al tubo inmediatamente posterior, se
homogeniza (con el vortex), y se sacan otros 7 ml que pasarán al siguiente tubo y así
sucesivamente, de tal manera que en cada tubo deben quedar un remanente de 3 ml
(Figura 12.19). El diluyente se usará para los controles, (vi) con una micropipeta,
transferir 0.750 ml de cada solución a los viales de 1.5 ml.
 Inmersión de larvas. En cada vial, con la ayuda de un pincel, se pondrán unas 500
larvas aproximadamente para cada concentración, comenzando desde los controles
hasta la concentración máxima. Se dejan las larvas por 10 minutos teniendo la
precaución que permanezcan sumergidas para evitar el escape de las larvas.
 Llenado de paquetes. Después de los 10 minutos se elimina parte del líquido con
cuidado de no dejar caer las larvas y se transfiere, con un pincel del No. 4,
aproximadamente 100 larvas a los sobres formados con papel filtro y agarrapapeles
tipo Bulldog del No. 200. Se Incuban las larvas por 24 h a 27 +2°C y 80-90% de
humedad relativa en una incubadora.
 Lectura de resultados. Las larvas vivas y muertas deben ser contadas a las 24 h.
solo aquellas larvas capaces de caminar se considerarán vivas. Aquellas larvas que
solo mueven las patas pero no se desplazan se consideran muertas (Figura 12.20).
Con estos datos se obtendrán las mortalidades de acuerdo a las fórmulas
mencionadas anteriormente.
~ 388 ~
Figura 12.20. Conteo de larvas de Rhipicephalus microplus vivas y muertas en el

diagnóstico de resistencia de Rhipicephalus microplus a la ivermectina.
Para la interpretación de resultados con respecto a la IVM se requiere obtener los índices
de resistencia al 50 y 99% de las garrapatas de cada rancho. Para ello se utiliza una cepa
de referencia susceptible a este antihelmíntico. Sin embargo, hasta ahora a nivel nacional
no contamos con una cepa de referencia, por lo cual se utilizan los datos de CL50 y CL99
de la cepa Deutch (USDA, Cattle Fever Tick Research Laboratory, TX, USA) (Pérez-
Cogollo et al., 2010; Fernández-Salas et al., 2012). Se consideran resistentes las
poblaciones de garrapatas con CL50 y CL99 mayores que aquellas de la cepa susceptible
de referencia. La diferencia será considerada estadísticamente significativa cuando el
límite inferior de los intervalos de confianza del 95% (IC95%) de la población bajo estudio
sea mayor que el límite superior de los IC95% de la cepa susceptible de referencia, es decir
que sus IC95% no se traslapen. Para la determinación de susceptibilidad y resistencia de R.
microplus se utiliza la clasificación de Castro-Janer et al. (2011). El IR50≤1: susceptible;
IR50>1 a <2 resistencia incipiente; IR50>2 resistente.
~ 389 ~
12.3.4 Prueba de inmersión de adultas
Fundamentos
Esta prueba se basa en la prueba de inmersión de hembras repletas descrita por
Drummond et al. (1967), modificada por la FAO, (1999). La prueba consiste en sumergir
en diferentes concentraciones de ixodicidas a garrapatas adultas ingurgitadas por un
período de 1 ó 30 min, incubarlas a 27oC y 80-90% de humedad relativa por siete días y
posteriormente realizar la lectura de los resultados. Esta prueba presenta dos
modalidades: (i) la prueba biológica (realizada con la concentración comercial
recomendada del ixodicida), con el objetivo de determinar el porcentaje de mortalidad y la
inhibición de la oviposición en garrapatas adultas expuestas a un producto a la
concentración comercial recomendada, (ii) el bioensayo con concentraciones múltiples a
fin de realizar el análisis Probit (Santamaría y Soberanes, 2001).
Materiales
 Productos comerciales de las familias de Piretroides, Organofosforados y Amidinas
(amitraz).
 Garrapatas hembras adultas ingurgitadas.
 Agua.
 Vaso de precipitado de 200 ml.
 Agitadores de madera.
 Agitador magnético.
 Marcadores.
 Cajas de Petri.
 Cámaras de cultivo de 24 pozos.
 Cinta adhesiva (masking tape).
Procedimiento
 Colecta de garrapatas ingurgitadas. Si el ganado fue bañado con algún acaricida se
deberá esperar de cinco a ocho días para colectar las garrapatas. Si las garrapatas
que fueron colectadas no serán utilizadas inmediatamente podrán mantenerse a
temperaturas menores de 28°C y podrán ser utilizadas al día siguiente. Se deben
usar hembras completamente ingurgitadas limpias y en buenas condiciones. Para
ello se pueden lavar las hembras con hipoclorito al 0.05%, enjuagarlas y secarlas en
papel toalla. Posteriormente las hembras en buenas condiciones serán separadas
en grupos de 10 garrapatas de acuerdo al tamaño o incluso pudieran pesarse (200
+20 mg) para formar grupos uniformes (Rosado-Aguilar et al., 2010)
 Preparación de diluciones. Una vez formados los grupos se procederá a diluir los
ixodicidas a las DD recomendadas. Ejemplo 1. Bayticol® (Flumetrina emulsificable a
75 g/l). Para realizar la DD, adicionar 1 ml de Bayticol® en 9 ml de agua en un vaso de
10 ml y agitar. Tomar 1 ml de esta solución ponerla en un vaso de precipitado,
completar a 100 ml y agitar. Ejemplo 2. Taktic® (Amitraz emulsificable 125 g/l). Para
realizar la DD, se adicionan 2 ml de Taktic® en un vaso de precipitado, completar a
100 ml y agitar. Posteriormente se toman 20 ml de las soluciones preparadas y se
~ 390 ~
colocan en vasos de precipitado. En otro vaso se vierten 20 ml de agua que servirá

como control. Los vasos de ambos grupos deben ser identificados con marcadores.
 Inmersión de adultas. Una vez que se tengan los vasos con las soluciones se
sumergirán los grupos de 10 hembras, uno para el grupo tratado y otro grupo para el
control. El tiempo de inmersión puede ser de 1 min hasta 30 min. Si se utiliza 30 min
de inmersión, los vasos deberán ser agitados con la ayuda de un agitador y una platina
magnética. Después de los 30 min las garrapatas se extraen de la solución ixodicida
con ayuda de un colador y se les deposita en papel toalla para eliminar el exceso del
producto.
 Incubación de adultas. Las garrapatas ser colocan con cinta adhesiva en cajas de Petri
o cámaras de cultivo de 24 pozos colocándolas de manera individual. Las garrapatas
se incuban por 7 o hasta 15 días a 28 +2°C y humedad relativa 80% con la finalidad de
que las garrapatas ovipositen (Figura 12.21) (Cen-Aguilar et al., 1998). Las garrapatas
se observan todos los días con un estereoscopio y se registra la mortalidad y la
oviposición.
Figura 12.21. Registro de mortalidad y oviposición en adultas Rhipicephalus microplus.
 Lectura de resultados. La mortalidad se calcula con el número de garrapatas muertas

por grupo dividido entre el número total de garrapatas incubadas por grupo
(Santamaría y Soberanes, 2001). El día 15 se pesa la masa de huevos. Una vez que
se tengan todos los resultados se compararan los grupos tratados con el control para
determinar el porcentaje de inhibición de la oviposición (Rodríguez-Vivas y Cob-
Galera, 2005).
Se espera que las garrapatas del grupo control no mueran y que ovipositen. En el grupo
tratado si no mueren y además ovipositan se les considera resistentes, mientras que las
hembras que no ovipositen serán consideradas susceptibles.
El porcentaje de resistencia se calcula de la siguiente manera (Rodríguez-Vivas y Cob-
Galera, 2005):
Número de garrapatas tratadas que ovipositen (100)

Número de garrapatas control que ovipositen
~ 391 ~
El porcentaje de inhibición de la oviposición es calculado de la siguiente manera

(Rodríguez-Vivas y Cob, 2005):
PHGT - PhGT (100)
PHGC PhGC
PHGT: Peso de Hembras de grupo tratado

PHGC: Peso de Hembras de grupo control
PhGT: Peso de huevos de grupo tratado
PhGC: Peso de huevos de grupo control
12.4. DIAGNÓSTICO DE RESISTENCIA A LOS INSECTICIDAS EN LAS

MOSCAS HAEMATOBIA IRRITANS
Fundamentos
Consiste en la captura de moscas del cuerno adultas (H. irritans) directamente del
ganado bovino en el campo para su posterior exposición en papeles filtro impregnados
con distintas concentraciones de insecticidas Organofosforados y Piretroides (Sheppard
y Hinkle, 1986, 1987). Posterior al contacto se determinan los porcentajes de mortalidad
que son analizados mediante la metodología Probit utilizando el programa Polo Plus ©
(LeOra software, 2004). Finalmente, se determina el indice de resistencia (IR)
comparando la CL50 calculada de las poblaciones de campo con la CL50 de una cepa
“susceptible” (Santamaría, 1993).
Materiales
 Acetona 99% en grado reactivo.
 Alcohol etílico absoluto al 99°.
 Principios activos en grado técnico de los siguientes insecticidas (con su respectivo
certificado de pureza): permetrina, deltametrina, cipermetrina, clorfenvinfos,
diazinon.
 Micropipetas de 1000 µl.
 Campana de extracción de pesticidas.
 Balanza analítica.
 Vasos de precipitados de 10 y 20 ml.
 Probetas de 10 ml.
 Pipetas graduadas de 1 ml.
 Toallas absorbentes de papel.
 Espátulas de acero inoxidable de doble punta.
 Tijeras.
 Caja con ligas.
 Cronómetro.
~ 392 ~
 Cajas Petri de plástico desechables de 100 X 20 mm de diámetro (a cada caja se le

debe hacer un orificio de 1cm de diámetro en la tapa).
 Papel filtro Whatman del No. 1 de 9 cm de diámetro.
 Cinta Adhesiva (Masking tape) de 1 y ½ pulgada.
 Soportes universales de madera con alambre rígido del 12 ó 14.
 Bases de madera de 9 X 8 cm y 1 pulgada de grueso con clavos de 2½ pulgadas
(cada uno colocado a una distancia de 1 cm hacia adentro de cada esquina).
 Papel aluminio.
 Taladro con broca de 1 cm de diámetro.
 Broches marca “Baco” de 55 mm de largo.
 Red entomológica de 30 cm de diámetro.
 Contenedor cilíndrico de PVC de 20 cm de 1 litro de capacidad (en un extremo
sellado con tela mosquitera y el otro con una manga de tela resistente para sellarse
con una liga).
 Aspirador manual o eléctrico con filtro y en el otro extremo un tubo de plástico de 30
cm de largo.
Procedimiento
 Preparación de la concentración inicial. Para preparar la concentración inicial es
preciso determinar el valor porcentual, el volumen que se requiere y el porcentaje
de pureza del principio activo. La siguiente fórmula permite conocer la cantidad en
gramos a pesar para obtener la concentración en porcentaje del principio activo
deseado en el volumen elegido para la primera dilución.
C.I.D.= (C. en µg/cm2) (A)
Donde:
C.I.D. = Concentración Inicial Deseada
C. en µg/cm2 = Concentración en microgramos por centímetro cuadrado
A = Área del papel filtro (63.6 cm2)
Ejemplo:
Para preparar una solución de permetrina al 0.01 µg/cm2 en 20 ml de acetona, se
realiza el siguiente cálculo:
C.I.D. = (0.01 µg/cm2) (63.6 cm2) = 0.636 µg/ml
(0.636 µg/ml) (1 mg) / (1 mg) /1000 µg = 0.000636 mg/ml
Para calcular la cantidad en miligramos del principio activo en el volumen deseado de
20 ml, se realiza la siguiente operación:
0.000636 mg__________1 ml
X ___________20 ml
X = 0.01272 mg de permetrina
Cuando los principios activos no presentan una pureza del 100 % es necesario realizar
una corrección.
~ 393 ~
Ejemplo: Si la permetrina presenta un 93.4% de pureza la corrección se hará de la

siguiente forma: 93.4% (100) = 0.0136 mg se afora a 20 ml con acetona.
Una vez preparada la concentración inicial de permetrina al 0.01 µg/cm2 en la probeta
“A” se procede a preparar una serie de diluciones utilizando 0.5 de factor de dilución. Se
vierte de la probeta “A” a la probeta “B” el 50% del volumen. Por ejemplo, 10 ml de la
anterior, aforando a 20 ml con acetona, se tapa y se agita vigorosamente varias veces.
El paso de transferir y aforar de una probeta a la siguiente, se repite en todas hasta
completar un total de cinco diluciones a utilizar en la prueba. Para establecer el rango
de concentraciones a utilizar en cada principio activo se considera la preparación de
tres concentraciones arriba de la CL50 obtenida con la cepa susceptible de laboratorio y
dos abajo. Ejemplo:
Para el principio activo permetrina las concentraciones serán:
A= 0.01 µg/cm2
B= 0.005 µg/cm2
C= 0.0025 µg/cm2
La CL50 de la cepa susceptible (0.00194 µg/cm2) se ubica entre la
concentración C y D.
D= 0.00125 µg/cm2
E= 0.000625 µg/cm2
La acetona en grado reactivo se mantiene a temperatura ambiente. Los principios

activos y las concentraciones preparadas de estos se mantienen en refrigeración a 8
±2° C, con una caducidad a los tres meses posteriores a su preparación.
 Impregnación de papeles. Las diluciones se impregnan en los papeles filtro
Whatman No. 1 de 9 cm de diámetro, los cuales se identifican con los datos del
principio activo, concentración y número de repetición en la cinta adhesiva colocada
sobre el orificio de 1 cm de diámetro hecho en la tapa con ayuda de un taladro. Para
cada una de las cinco concentraciones se utilizan tres repeticiones incluyendo los
controles. Para la adecuada impregnación de los círculos de papel filtro con 1 ml de
cada dilución, estos se colocan sobre bases de madera con clavos. Este
procedimiento se inicia con los controles que solo se impregnan con acetona y
posteriormente se continúa de la concentración más baja a la más alta, para evitar
problemas de contaminación. Concluida la impregnación de los círculos de papel
filtro de las diferentes concentraciones y el control, se cuelgan con unos broches en
unos soportes de madera para dejarlos secar durante una hora y que permita la
evaporación de la acetona y la fijación del insecticida en la superficie del papel.
 Preparación de las cajas Petri. Trascurrida la hora de secado, se inicia la colocación
de los círculos controles y posteriormente los impregnados con las diluciones en las
cajas Petri desechables a las cuales previamente se les perforo en la tapa un orificio
de 1 cm de diámetro. El kit diagnóstico de cada uno de los principios activos consta
de 18 cajas Petri incluyendo al control, mismo que para su conservación hasta su
traslado y uso en el campo se envuelve en papel aluminio, separando las cajas con
los controles de los diferentes principios activos. Los kits para el diagnóstico de
resistencia permiten evaluar hasta cinco unidades de producción, después de los
cuales es necesario preparar nuevos materiales.
~ 394 ~
 Colecta de moscas en el campo. Las moscas H. irritans adultas se colectan

directamente de los bovinos. Se atrapan con una red entomológica (Figura 12.22).
Figura 12.22. Colecta de moscas hematófagas en un bovino a nivel de campo usando

una red entomológica
Posterior a su captura se colocan en un contenedor portátil de 1 litro de capacidad, el

cual en uno de sus extremos tiene una malla de tela mosquitera, para proporcionar
ventilación, y en la parte anterior una manga de tela, cerrada con una liga, para evitar el
escape de las moscas capturadas. Las moscas se transportan hasta el sitio donde se
lleva a cabo la prueba diagnóstica. Cada muestra se acompaña de una encuesta con
los datos de manejo y control de la mosca del cuerno que se realiza en cada rancho
debidamente detallado.
Una vez atrapadas suficientes moscas del cuerno para la realización del diagnóstico de
resistencia con los tres Piretroides (permetrina, deltametrina y cipermetrina) y los dos
Organofosforados (clorfenvinfos y diazinon), se busca un lugar adecuado para colocar
los kits diagnósticos y proceder a la extracción de moscas del contenedor portátil con
ayuda del aspirador manual o eléctrico. Se coloca un número aproximado de 20
moscas por caja Petri, iniciando con los círculos controles y los impregnados con los
diferentes principios activos y sus respectivas repeticiones (Figura 12.23).
Figura 12.23. Colocación de moscas en las cajas Petri para iniciar los bioensayos.
~ 395 ~
Concluido el llenado de las cajas de Petri se inicia la lectura de mortalidad de las

moscas a los 15 minutos. Se continúa con las lecturas con el mismo intervalo de tiempo
hasta completar una hora de lectura (Figura 12.24). Dependiendo del grado de
infestación de la mosca del cuerno en el rancho se realiza el diagnóstico con los tres
Piretroides y los dos Organofosforados. Si la cantidad de moscas no es suficiente, se
elige un principio activo que sirva para identificar la situación de susceptibilidad o
resistencia a cada una de las familias químicas.
Figura 12.24. Bioensayos para el diagnóstico de resistencia en moscas hematófagas

del ganado a los insecticidas. Las moscas se observan cada 15 minutos por 60
minutos.
Las lecturas tienen como criterio de respuesta la mortalidad o parálisis de las moscas.
Por ejemplo, todos los especímenes que puedan volar se consideran como vivos. Las
lecturas con intervalos de 15 minutos hasta completar 1 hora se anotan en un formato
indicando el número de moscas muertas en cada intervalo de tiempo y repetición
incluyendo controles y las diferentes diluciones del principio activo, al finalizar la hora de
lectura se obtiene el número total de moscas por cada caja de Petri control y tratada al
indicar en el formato el número de especímenes muertos y vivos.
Captura de datos:
El signo igual (=) se coloca para usar un texto de información y el asterisco (*) para
separar los diferentes tiempos.
Los datos se van insertando en el siguiente orden:

Concentración del principio activo, espacio, número total de moscas, espacio, número
total de moscas muertas. Se inicia con el control (concentración 0.0) y se continúa con
la concentración más alta a la más baja del principio activo a utilizar.
~ 396 ~
=Diagnóstico de resistencia a clorfenvinfos (Organofosforados)

=Rancho “La Esmeralda” Tecolutla, Veracruz.
= Marzo 24 de 2001
*TIME 15
0.0 62 0
0.04 59 10
0.02 60 8
0.01 64 2
0.005 57 1
0.0025 48 0
*TIME 30
0.0 62 0
0.04 59 15
0.02 60 10
0.01 64 4
0.005 57 2
0.0025 48 1
*TIME 45
0.00 62 0
0.04 59 30
0.02 60 21
0.01 64 12
0.005 57 9
0.0025 48 5
Este procedimiento se realiza hasta completar una hora (intervalos de 15 minutos TIME
15 a TIME 60)
Los datos obtenidos para cada principio activo se analizan en el programa estadístico
Polo Plus © (LeOra software, 2004), para determinar la concentración letal 50% (CL50),
que permite hacer las comparaciones con la CL50 de los diferentes principios activos
calculados en una cepa “susceptible” de laboratorio de la mosca H. irritans (Santamaría,
1993) para calcular el índice de resistencia (IR). El IR se estima dividiendo la CL50 de la
cepa de campo entre la CL50 de la susceptible (Cuadro 12.5) (Robertson y Preisler,
1992).
Cuadro 12.5. Concentraciones letales 50% (CL50) a los 60 minutos obtenidos con una
cepa de laboratorio “susceptible” de la mosca del cuerno Haematobia irritans.
Principio activo CL50

Diazinon 0.00129 µg/cm2
Clorfenvinfos 0.05219 µg/cm2
Deltametrina 0.000032 µg/cm2
Permetrina 0.00194 µg/cm2
Cipermetrina 0.0742 µg/cm2
Fuente: Santamaría (1993).
~ 397 ~
Si en el análisis Probit con el Organofosforado clorfenvinfos la muestra de campo
obtiene una CL50 = 0.17824 µg/cm2 esta se divide entre la CL50 = 0.05219 µg/cm2 de la
cepa “susceptible” de laboratorio obteniéndose un IR de 3.41, lo que significa que es
resistente a mosquicidas formulados con este principio activo. Cualquier muestra de
campo que obtenga un IR >1 se considera resistente al principio activo evaluado. Con
un IR <1 se considera que la población de moscas evaluada es susceptible.
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LIBROAMPAVE CONASA Captulo12

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CHAPTER: 12 Diagnóstico de resistencia a los antiparasitarios en rumiantes. En:

Chapter · May 2015

Felipe Torres-Acosta J.I. Chan-Pérez

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Maria Eugenia López-Arellano Jose Alberto Rosado-Aguilar

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Los animales domésticos y los humanos han coexistido y evolucionado en una

A partir de la segunda mitad del siglo XX la industria farmacéutica puso a disposición

Los primeros casos de resistencia a antiparasitarios comerciales se presentaron a

La existencia cada vez más común de parásitos resistentes a los antiparasitarios es

La resistencia a los antiparasitarios parece ser más severa en el caso de las

A partir de 1984 se reportaron problemas ocasionados por infestaciones masivas con la

El incremento de la frecuencia de poblaciones resistentes de NGI, garrapatas y moscas

12.2. PRUEBAS PARA DETERMINAR LA RESISTENCIA

12.2.1. Diagnóstico de campo para determinar la resistencia de los nematodos

Los rumiantes en pastoreo consumen larvas infectantes (L3) de parásitos resistentes o

Toda prueba de diagnóstico de resistencia a los antiparasitarios se inicia con la

 Antihelmínticos a probar; drogas comerciales de los tres grupos de amplio

Etapa Pre-tratamiento (Día -1)

Etapa de Tratamiento (Día 0)

La administración del antihelmíntico debe realizase siguiendo las recomendaciones del

 Según el antihelmíntico utilizado en los grupos evaluados, se decide el tiempo que

 Las heces colectadas de cada animal se procesan mediante la técnica de McMaster

Cuadro 12.1. Principales moléculas de antihelmínticos comerciales con sus tiempos de

Moléculas Dosis en Dosis en Dosis en Vía de Tiempo de Tiempo de

Criterios para la interpretación de resistencia

Resistente: Porcentaje de reducción del conteo de huevos es menor al 95% y el límite

Sospechoso: Solo uno de los dos criterios anteriores se cumple.

Susceptible: El porcentaje de reducción en el conteo de huevos es igual o mayor de

12.2.2. Pruebas in vitro para el diagnóstico de la resistencia hacia los

12.2.2.1. Prueba de inhibición de la eclosión de huevos

Figura 12.2. Toma de muestra de heces para la separación de huevos de nematodos

Recuperación de huevos y conteo de la cantidad de huevos recuperados. Se

Figura 12.3. Procesamiento de las heces para recuperar huevos de nematodos

Figura 12.4. Huevos de Haemonchus contortus en diferentes fases de desarrollo: A)

Dilución de la solución con huevos. En la prueba de IEH empleamos placas de 24

El resultado de la fórmula en el ejemplo es 2.45, lo interpretamos de la siguiente

Prueba de inhibición en la eclosión de huevos.

Cuadro 12.2. Preparación de las soluciones de tiabendazol (TBZ) para realizar la

Solución Preparación Concentración CF*

Figura 12.5. Distribución de las concentraciones de tiabendazol (0.01-0.5) y controles

Las placas se incuban a 28°C durante 48 h. Para obtener mejores porcentajes de

Figura 12.6. Prueba de inhibición de la eclosión de huevos de nematodos

Criterios para la contabilización. Se contabilizan como larvas aquellas que ya se

Figura 12.8. Criterios para la contabilización de larvas y huevos en la prueba de

12.2.2.2. Prueba de Inhibición de la migración larval

La prueba de inhibición de la migración larval (IML) forma parte de las pruebas

Obtención de larvas infectantes de NGI. Antes de realizar la prueba de inhibición en la

Toma y manejo de heces. Para facilitar la recolección de heces para la producción de L3

Figura 12.9. Procesamiento de las heces para la obtención de larvas infectantes de

Cosecha de larvas. Finalizado el tiempo de incubación, las larvas se recuperan

Figura 12.10. Representación esquemática del aparato de Baermann para la

(aumento 10X). Es necesario homogenizar la solución después de tomadas 2 gotas. Se

Prueba de inhibición en la migración larval. Para esta prueba se prepara la solución

Figura 12.11. Distribución de las concentraciones de ivermectina o levamisol (4 a 0.06),

Figura 12.12. Distribución de las concentraciones de ivermectina en las placas de

El interior de los tamices es enjuagado empleando 1 ml de agua y el contenido es

Figura 12.13. Prueba de inhibición de migración larval de nematodos gastrointestinales

Análisis de datos. Se calcula el porcentaje de migración larval (ML%) en cada

Cuadro 12.4. Concentraciones letales 50 (CL50) e intervalos de confianza al 95%

Aislamiento CL50 IC 95% Estatus