UNIVERSIDAD ANDRES BELLO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA VIDA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR BIOL035

GUÍA Nº 5: ORGANIZACIÓN
SUBCELULAR
 INTRODUCCIÓN

Las células aparecieron sobre la tierra hace 3,5 billones de años, probablemente debido a la
agregación espontánea de moléculas. Las primeras células eran relativamente simples y
pequeñas, similares a los organismos que actualmente conocemos como procariontes.
Luego aparecieron las células eucariontes, más grandes y de organización más compleja,
que hoy forman parte de animales y plantas (Fig. 1 y 2).

Por definición y a diferencia de las células procariontes, las células eucariontes poseen un
núcleo que contiene la mayoría del ADN envuelto en una membrana. Esto deja al material
genético en un compartimento separado del resto de los contenidos de la célula o
citoplasma, donde ocurren las reacciones metabólicas.

En el citoplasma se pueden distinguir varios organelos: cloroplastos, mitocondrias, retículo

endoplásmico, aparato de Golgi, ribosomas, peroxisomas, lisosomas, citoesqueleto, los
cuales cumplen funciones específicas dentro de la célula.

Fig. 1: Célula Eucarionte animal Fig. 2: Célula Eucarionte Vegetal

El Núcleo (Fig.3) es el organelo más grande de la célula y está separado del citoplasma por
una envoltura nuclear compuesta por dos membranas; estas membranas aparecen perforadas
por poros, a través de los cuales se lleva a cabo la comunicación con el citosol. El núcleo
contiene todo el ADN cromosomal, el que se encuentra empacado en las fibras de cromatina
por su asociación con proteínas denominadas histonas.

Fig. 3: Núcleo.
El Retículo Endoplásmico (R.E.) (Fig.4) corresponde a sacos, tubos y capas de membranas
que se extienden a través del citoplasma y que ocupan un amplio sector de la célula. La
membrana del Retículo endoplásmico es una continuación de la membrana nuclear. Se
especializa en la síntesis de lípidos y proteínas de membrana, así como también de
materiales que están destinados a ser exportados de la célula. El Retículo endoplásmico
rugoso (R.E.R.) está asociado a los ribosomas, que se unen en su parte externa y se
encargan de la síntesis de proteínas. El Retículo endoplásmico liso (R.E.L.) está constituido
por un sistema laberíntico de túbulos irregulares, ramificados que no contienen ribosomas y
se encarga del metabolismo de lípidos.

Fig. 4: Esquema del retículo endoplásmico y microfotografía.

Los Ribosomas (Fig.5) son grandes complejos de ARN y proteínas. Se componen de una
subunidad mayor y una subunidad menor que se ensamblan para formar un complejo que se
encarga de llevar a cabo el proceso de traducción en la síntesis de proteínas. Los ribosomas
procariontes y eucariontes son muy similares y pueden encontrarse tanto libres en el
citoplasma como unidos a membranas formando parte del retículo endoplásmico rugoso.

Fig. 5: Esquema del retículo endoplásmico con ribosomas y microfotografía.

Las Mitocondrias (Fig.6) son muy similares a las bacterias tanto en tamaño como en forma.
Poseen dos membranas una externa y otra interna, que dan lugar a dos compartimentos, el
espacio intermembrana y la matriz mitocondrial. Las Mitocondrias contienen su propio
ADN, sintetizan proteínas y pueden dividirse en dos, por lo que se cree que provienen de la
simbiosis de una célula eucarionte primitivo con un organismo procarionte. Este organelo es
responsable de los procesos de respiración celular y producción de energía.

Fig. 6: Mitocondria.

Los Cloroplastos (Fig.7), al igual que las mitocondrias, contienen su propio ADN y
también tendrían un origen simbiótico. Se encuentran sólo en los organismos capaces de
realizar fotosíntesis, como las algas verde-azules y lasplantas.

Los cloroplastos corresponden a plastidios que contienen clorofila y están rodeados de una
membrana doble. Los cloroplastos están compuestos por la envoltura, estroma y los
tilacoides.

Fig. 7: Cloroplasto.
El Aparato de Golgi (Fig.8) está constituido por cisternas discoidales aplanadas, paralelas
y superpuestas, formadas por membranas lipoprotéicas. Se encarga de la modificación,
destinación, y empaquetamiento de macromoléculas de secreción o que están destinadas a
otros organelos. Alrededor de él se encuentran numerosas vesículas pequeñas que transportan
sustancias entre el mismo organelo y los diferentes compartimentos de lacélula.

Fig.8 : Aparato de Golgi.

Los Lisosomas son vesículas membranosas que contienen enzimas hidrolíticas requeridas
para la digestión de moléculas al interior de la célula. De este modo, estas enzimas se
mantienen aisladas del resto de los componentes celulares evitando la degradación de
moléculas como proteínas y ácidos nucleicos.

Los Peroxisomas también corresponden a vesículas. En ellas se produce peróxido de

hidrógeno (H2O2) durante la oxidación de varios tipos de moléculas. Esta sustancia es
peligrosa y gracias a la existencia de los peroxisomas se mantiene aislada del resto de los
componentes de la célula.

El Citoesqueleto está constituido por filamentos de proteínas que forman un enrejado en el

citoplasma. Esta red de filamentos está formada por los microtúbulos, filamentos de actina
y filamentos intermedios. El citoesqueleto le da a la célula su forma y provee la base de sus
movimientos. Generalmente se organiza desde una región cercana al núcleo donde se
encuentran los centríolos y desde ahí se extiende al resto de lacélula.

La Membrana Plasmática (Fig.9) es la envoltura externa de la célula. Corresponde a una

bicapa continua de fosfolípidos de 4-5 nm de espesor, en la cual se encuentran embebidas
proteínas integrales y periféricas. Algunas de estas proteínas sirven como bombas y canales
para el transporte de moléculas hacia el interior de la célula, así como hacia el exterior de
ella.

Fig. 9: Membrana plasmática.

Aunque técnicas avanzadas como la Microscopía Electrónica permiten una visualización
detallada de la estructura de la célula, esto no es suficiente para definir la función de sus
componentes. Para esto, ha sido necesario aislar los organelos del resto de la célula para
realizar estudios bioquímicos que permitan determinar la función exacta de cada uno de ellos.

Objetivo General del laboratorio.

Comprender el fundamento de la técnica de fraccionamiento subcelular por medio del
rompimiento de la célula y la separación de los organelos mediante un campo gravitacional.

FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR

Así como un tejido puede ser separado en las células que lo constituyen, con las técnicas
adecuadas la célula puede separarse en los diferentes organelos y macromoléculas que la
componen. Una de las técnicas más utilizadas para tal propósito es el Fraccionamiento
Subcelular, que permite obtener componentes celulares aislados, en grandes cantidades y
con alto grado de pureza. Esta técnica fue desarrollada entre otros por Albert Claude y
Christian de Duve entre 1940 y 1950, y consiste en la separación de los componentes de la
célula basándose en su tamaño y densidad.

El primer paso a seguir en un fraccionamiento subcelular es la ruptura u homogenización de

la muestra. Esto se logra a través de diferentes procedimientos como sonicación (exposición
a sonidos de alta frecuencia), shock osmótico, o simplemente moliendo las células en
homogenizadores mecánicos.

En esta etapa se rompen muchas de las membranas de la célula, incluyendo la membrana

plasmática y el retículo endoplásmico, los que quedan formando pequeños fragmentos o
vesículas que dan origen a la fracción microsomal. El resto de los componentes celulares
(núcleo, mitocondrias, cloroplastos, aparato de Golgi, lisosomas y perixosomas)
permanecen intactos. Las partículas y vesículas así obtenidas conservan la mayor parte de sus
propiedades bioquímicas originales y permiten el estudio de la función de cada organelo
celular por separado.

La suspensión de células rotas obtenidas anteriormente es llamada “lisado” u

“homogenizado” y es la que se fracciona en la segunda etapa del proceso, la cual se realiza
a través de una serie de etapas sucesivas de centrifugación en las que los componentes de la
célula se separan en un campo gravitatorio.
Si dos componentes de distinta masa e igual tamaño y forma están en un mismo medio, el
cuerpo de mayor masa sedimentará (se irá al fondo) a mayor velocidad debido a su mayor
peso. El peso es el producto de la masa (m) y la fuerza de gravedad (g), por tanto si la
fuerza de gravedad se incrementa, la velocidad de sedimentación también aumentará.

Para aumentar el campo gravitatorio se usan las Centrífugas (Fig.10). Estos instrumentos
consisten en rotores con cavidades para los tubos, los que se hacen girar a diferentes
velocidades, de manera que a mayor velocidad el campo gravitacional obtenido es mayor.
Lo mismo ocurre a mayor distancia entre el tubo y el eje de giro del rotor. En otras palabras,
el campo gravitacional generado depende directamente del radio de giro y de la velocidad
de rotación.

Al término de una centrifugación se pueden distinguir en el tubo dos fases. En el fondo del
tubo se obtiene un sedimento o pellet y sobre él una parte líquida llamada sobrenadante.

Fig. 10: Esquema de una centrífuga.

Generalmente, la primera etapa de separación consiste en una centrifugación a baja velocidad

a la cual sedimentan sólo las células que permanecen enteras y las partículas subcelulares
más grandes; los núcleos. Así, el primer pellet obtenido corresponde a una fracción
enriquecida en núcleos y el sobrenadante contiene al resto de los componentes celulares en
suspensión.

El sobrenadante se somete a una segunda centrifugación que se realiza a velocidades

intermedias, en la que sedimentan mitocondrias, cloroplastos, lisosomas y peroxisomas. El
nuevo sobrenadante se re-centrifuga a alta velocidad obteniéndose un pellet enriquecido en
membrana plasmática y retículo endoplásmico (fracción microsomal). Una última
centrifugación del sobrenadante anterior a velocidades aún mayores permite sedimentar
finalmente los ribosomas, dejando en el sobrenadante sólo la porción soluble del
citoplasma, el citosol.
 Fig. 11. Esquema de un fraccionamiento subcelular típico.

Las fracciones que se obtienen por el procedimiento anterior son fracciones enriquecidas,
pero no totalmente puras de los diferentes organelos. Existen otras modalidades de
centrifugación en las que se utilizan medios de mayor densidad, que se obtienen con
soluciones de sacarosa, polímeros o proteína. Permiten realizar el proceso de separación en
gradientes de densidad, obteniendo organelos con mayor grado de pureza.

Generalmente el proceso de fraccionamiento celular se evalúa mediante el análisis de la

presencia de algunos componentes celulares en las diferentes fracciones obtenidas. Estas
moléculas son llamadas marcadores celulares. Por ejemplo, el ADN es un marcador de la
presencia de núcleos, las enzimas del ciclo de Krebs o de la cadena respiratoria son
marcadores de mitocondrias, y el proceso de fotosíntesis indica la presencia de cloroplastos.
De este modo, el análisis de la distribución de los diferentes marcadores en todas las
fracciones subcelulares obtenidas permite conocer la distribución y pureza relativa de los
distintos organelos, y el nivel y calidad de los componentes contaminantes de cada fracción.

La obtención de organelos celulares aislados permite entonces estudiar en forma

relativamente específica algunos procesos celulares que ocurren en compartimentos
particulares, aislándolos de las reacciones que ocurren en otros organelos. Por ejemplo, se
puede estudiar la síntesis de proteínas en ribosomas aislados o asociados a membranas, el
transporte de sustancias a través de la membrana plasmática, la fotosíntesis en cloroplastos,
el procesamiento de glicoproteínas en el aparato de Golgi, etc.
 ACTIVIDADES PRÁCTICAS

ACTIVIDAD Nº 1: Fraccionamiento subcelular

Fraccionamiento Subcelular de Hígado:

El Fraccionamiento Subcelular comprende dos etapas, una primera etapa de ruptura u

homogeneización y una segunda etapa de fraccionamiento propiamente tal. La etapa de
ruptura y homogenización de la muestra se realiza utilizando un homogenizador. Se debe
considerar que durante este procedimiento el tejido fresco a fraccionar se debe mantener en
una cantidad adecuada de solución tampón, la que permite conservar la integridad de los
organelos.

El fraccionamiento o separación de los distintos componentes celulares se realiza mediante

una serie de centrifugaciones sucesivas, las que sedimentan los diferentes organelos en un
campo gravitacional dependiendo de su densidad y tamaño.

Al centrifugar una muestra se obtienen dos fases claramente definida: el pellet que
corresponde al sedimento propiamente tal y el sobrenadante que corresponde a la fracción
líquida que permanece sobre el material sedimentado.

Los pellet obtenidos corresponden a los organelos que han sedimentado, éstos se resuspenden
y se guardan para el resto de los análisis bioquímicos, mientras que los sobrenadantes
se vuelven a centrifugar.

Todo el proceso se realiza en frío (4ºC) para evitar una posible degradación de las estructuras
celulares y así conservar intactas la mayor parte de las características funcionales
originales del organelo que se pretende aislar.

Procedimientos y observaciones

Sus profesores prepararan un homogenizado filtrado, el cual se obtendrá de la siguiente

manera:

A.1. Preparación y fraccionamiento de la muestra.

1. Muestra: hígado de pollo, lavado en tampón o buffer IBc frío veces para eliminar
restos de sangre.
2. Picar el hígado con bisturí y llevarlo a un vaso de precipitado de 500 mL puesto
sobre hielo. Adicionar buffer IBc frío hasta que el tejido se cubra y homogeneizar
utilizando el equipo ULTRA-TURRAX. En esta etapa de obtiene el
Homogeneizado Total (HT).
3. Filtrar el HT a través de una gasa posicionada sobre un embudo de vidrio. Recibir en
un vaso de precipitado de 200 mL y mantener en hielo.
4. El homogeneizado obtenido tras la filtración se denomina Homogeneizado Crudo
(HC).
A.2. Fraccionamiento

1. Se le entregará un tubo Falcon con 10 mL de HC.

2. Llenar 4 tubos Eppendorf de 2 mL con HC.
3. Escribir en la tapa de uno de los tubos “HC” y llevarlo al hielo.
4. Centrifugar los 3 tubos con HC restantes a 2000 RPM por 15 minutos, obteniéndose
en cada uno un sobrenadante (SN1) y un pellet (P1).
5. Colectar cuidadosamente el sobrenadante de uno de los tubos centrifugados y
traspasarlo a un nuevo tubo Eppendorf de 2 mL. Escribir en la tapa de éste “SN1” y
mantener en hielo.
6. Resuspender cuidadosamente el pellet puro obtenido con 600 uL de buffer IBc
Anotar en la tapa “P1” y llevar al hielo.
7. Transfiera todo el sobrenadante desde los dos tubos recién centrifugados restantes a
un solo tubo eppendorf limpio, teniendo cuidado de no perturbar el pellet.
8. Centrifugar el tubo a máxima velocidad (~13.000 RPM) por 20 minutos,
obteniéndose un sobrenadante (SN2) y un pellet (P2).
9. Colecte y traspase el sobrenadante obtenido a un tubo Eppendorf limpio y anote en la
tapa de éste “SN2”. Mantener en hielo.
10. Resuspender el pellet puro obtenido con 500 uL buffer IBc con ayuda de una
micropipeta. Anote en la tapa del tubo: “P2” y manténgalo en hielo.

Recordar:

A 4ºC se minimiza la activación de daño generado por fosfolipasas y proteasas.

A.2.1. Observación microscópica de las fracciones

1. En un portaobjetos limpio y seco coloque una gota de la suspensión de núcleos P1

obtenida anteriormente y que usted ha mantenido en hielo.
2. Coloque sobre ella un cubreobjetos y observe su preparación al microscopio usando
para ello el objetivo de 40X
3. Prepare una nueva muestra de núcleos como lo realizó anteriormente, pero antes de
colocar el cubreobjetos adicione una gota de azul de tripán sobre los núcleos.
Observe su muestra al microscópio con el objetivo 40X. ¿Qué observa?
4. Fotografíe los núcleos antes y después de la tinción. Cada fotografía deberá estar en
un círculo de 8cm de diámetro, indicando a un costado de éste, título de muestra; tipo
de muestra (temporal o permanente); tinción; aumento objetivo; aumento total y
observaciones. Anote los nombres de las estructuras identificadas
 A.2.2 Evaluación del fraccionamiento subcelular mediante marcadoresmoleculares.

Cada organelo contiene enzimas o moléculas que lo caracterizan, las que no se encuentran
en los otros compartimentos celulares y permiten identificarlos.

El ADN es la molécula marcadora de núcleos. Esta macromolécula puede ser identificada

mediante colorantes básicos que se unen a ella cuando se encuentra ionizada, como el azul
de tripán, azul de toluidina y azul B.

Las mitocondrias pueden ser identificadas por la actividad de la enzima Succinato

deshidrogenada (SDH) que cataliza la deshidrogenación estéreo específica de Succinato
a Fumarato durante el ciclo de Krebs, según la siguiente reacción:

SDH + Succinato -------------- > Fumarato + 2 H+ + 2 e-

Los protones y electrones liberados permiten seguir la reacción a través de la decoloración
del azul de metileno, que en su estado oxidado es azul y al reducirse se torna incoloro. Sin
embargo, el azul de metileno reducido puede fácilmente ser oxidado por el oxígeno del aire, y
recobrar su coloración azul intensa. Para evitar esto, se cubre el medio de reacción con aceite
mineral o vaselina líquida, lo que permite realizar la reacción en ausencia de oxígeno.

Procedimientos y observaciones

Detección de mitocondrias a través de reacción de SDH en las fracciones.

Separe 6 tubos Eppendorf, rotúlelos en forma adecuada y colóquelos en hielo de manera

que estén fríos.

Agregue a cada uno de los tubos las soluciones que correspondan en el orden que se indica según en el
siguiente esquema:

Nº Tubo Agua Azul Muestra Succinato Color Reacción

Metileno volumen 0,1 M (+) ó (-)
1 Control 400 uL 100 uL 400 uL 400 uL
2 HC 400 uL 100 uL 400 uL 400 uL
3 P1 400 uL 100 uL 400 uL 400 uL
4 SN1 400 uL 100 uL 400 uL 400 uL
5 P2 400 uL 100 uL 400 uL 400 uL
6 SN2 400 uL 100 uL 400 uL 400 uL

 Agite el contenido de cada tubo y agregue a cada uno de ellos 200 uL de aceite
mineral o vaselina líquida. Luego de agregar la vaselina, NO agite nuevamente el tubo.
 Coloque los tubos en un baño termorregulado a 37º C y observe si ocurre
decoloración en algunos de los tubos (5-10 min).
BIBLIOGRAFIA
Biología Celular y Molecular. De Robertis y de Robertis. 11 Ed., 2da impresión, 1998, Ed.
El Ateneo, Bs. Aires.

Biología Celular y Molecular. Lodish ycol. (2002) 4°Edición, Ed. Panamericana.

Elementos de Biología Celular y Genética. Parte 2: Estructura y Función Celulares.

Métodos de Estudio en Biología Celular. Fraccionamiento Subcelular. López, R.
1ª ed., 1985, Departamento de Biología Celular y Genética, Facultad de Medicina,
Universidad de Chile.

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