Código: M-CCBA-LB-08 Revisión: 01

Manual de colorantes y soluciones

Fecha de emisión: 19/04/10 Página: 1 de 16

CONTROL DE CAMBIOS Y MEJORAS

NIVEL DE SECCIÓN Y/O DESCRIPCIÓN DE LA MODIFICACIÓN Y FECHA DE

REVISIÓN PÁGINA MEJORA MODIFICACIÓN

01 1 Actualización de las firmas Octubre 2012

02

03

04

05

Elaboró Revisó Aprobó

QFB Ana María Sofía Rejón Magaña Coordinador de la Unidad de Coordinador de la Unidad de
Responsable del laboratorio Diagnóstico Diagnóstico
1.-OBJETIVO

Proporcionar la información necesaria para la preparación de colorantes y soluciones

utilizadas en el laboratorio de bacteriología.

2.- ALCANCE

Aplica a todo el personal del laboratorio de bacteriología.

3.- POLITICAS

Todos los colorantes y soluciones mencionados en este manual deben apegarse a las
instrucciones del mismo para su preparación.

2
 INDICE

Introducción …………………………………………………………...………………… 5

Cristal violeta …………………………………………………………..……………….. 5

Lugol ……………………………………………………………………...……………… 5

Alcohol acetona …………………………………………………………...……………. 5

Safranina …………………………………………………………………….………….. 6

Colorante wayson ………………………………………………………………………. 6

Azul de metileno alcalino (Tinción de Hansen) ………………………………….….. 6

Solución acuosa de safranina ……………………………………………………….... 6

Azul de Metileno Alcalino Loeffler ……………………………………………………. 7

Fucsina Fenicada (Tinción de Ziehl -Neelsen) ………………………………….…... 7

Alcohol Acido (Tinción de Ziehl-Neelsen) ………………………..………………...... 7

Verde Malaquita al 5 % (Tinción de esporas) ……………………………………….. 8

Safranina al 5 % (Tinción de espora) ………………………………………………… 8

Sulfato de cobre al 20 % (Tinción de cápsula) …………………………………….... 8

Fucsina básica (Tinción de cápsula) ……………………………………………….… 8

Fucsina fenicada (Tinción de Campylobacter)al 0.8 % ………………………..…… 8

Preparación de soluciones ……………………………………………………………. 9

Introducción …………………………………………………………………………...… 9

Indicador de rojo de metilo ………………………………...………………………….. 9

Soluciones, empleadas para la prueba (Reducción de nitratos) …………............. 9

Reactivo de kovac …………………………………………………………………….... 10

Reactivos empleados para la prueba de Voges Proskauer .................................. 10

3
Hidróxido de potasio (KOH) 40 % agente oxidante ……………………………….... 10

Peróxido de hidrógeno al 30% ……………………………………………………...… 11

Solución salina fisiológica 0.85 % …………………………………………………..... 11

Estandar sulfato de bario (para ANTIBIOGRAMAS) ……………………………….. 11

Preparación de HCl 0.1 N ……………………………………………………………... 11

Solución Verde Brillante al 0.1 % (Salmonella) ……………………………………... 12

Solución buffer fosfatos para alimentos (PBS) …………………………………..…. 12

Agua peptonada concentrada para salmonella en aves (APC) …………………… 12

Agua peptonada diluida para salmonella en carne molida ………………………… 12

Buffer fosfatos para salmonella en aves …………………………………………..… 12

Preparación de lugol para tetrathionate ……………………………………………… 13

Preparación del hipurato de sodio al 1 % ……………………………………………. 13

Solución de fosfatos para mantener remojados los electrodos …………………… 13

Solución buffer diluyente para bacteriológico de alimentos ……………………….. 13

Soluciones para ajustar pH de muestras ………………………………………….… 14

Referencias ……………………………………………………………………………... 15

4
 PREPARACION DE COLORANTES

INTRODUCCIÓN

Sólo algunos de los muchos compuestos orgánicos que actúan como colorantes se
usan para teñir microorganismos. Se trata de modificaciones de las primeras anilinas
obtenidas de productos del alquitrán, introducidas alrededor de 1880 por Koch, Weigert y
Ehrlich en las técnicas bacteriológicas.

Los colorantes se dividen en ácidos, básicos o neutros. En los colorantes ácidos,

como la eosina, el grupo iónico que imparte color a la (llamado cromóforo) tiene carga
negativa(es un anión) y al colorear forma una sal al combinarse con una base(NaOH).Los
colorantes básicos, como el azul de metileno, son tinturas en la que el ión que lleva al
color está cargado positivamente (un catión), que se combina con un ácido(HCL) para
formar la sal colorante. No todas las tinturas actúan mediante la formación de sales.

Los colorantes neutros como el de Giemsa, son compuestos en los que se mezclan
colorantes ácidos y básicos. Debido a la presencia de abundantes partículas(ribosomas)
que contienen ácido ribonucleico en todo el protoplasma de la célula bacteriana, las
tinturas básicas son las más útiles en bacteriología. Con estos colorantes, la mayoría de
las células bacterianas intactas se tiñen profunda y uniformemente, como los núcleos de
las células de vegetales y animales superiores.

CRISTAL VIOLETA

Cristal violeta (85%) 1 gr.

Etanol ( 95 %) 20 ml.
Oxalato de Amonio 0.8 gr.
Agua destilada 100 ml.

Almacenar en frasco ámbar.

LUGOL

Cristales de Iodo 1 gr.

Yoduro de potasio 2 gr.
Disolver completamente en 5 ml. de agua destilada, luego adicionar:

Agua destilada 240 ml.

Guardar en frasco ámbar.

ALCOHOL- ACETONA

Etanol 95 % 250 ml.

Acetona 250 ml.
SAFRANINA

5
 Safranina 2.5 gr.
Alcohol (95 %) 100.0 ml.

COLORANTE DE WAYSON

Solución " A "

Fucsina básica 0.2 gr.

Alcohol etílico absoluto 20.0 ml.
Azul de metileno 0.75 gr.
Disolver los colorantes en el alcohol.

Solución " B "

Fenol 10 gr.
Agua destilada 190 ml.

Solución para empleo.

1.- Echar la solución A en B lentamente.

2.- Dejar reposar durante 48 horas.
3.- Filtrar y guardar en fresco ámbar.

Nota: Este colorante ofrece mayor tinción después de 1 ó 2 años.

AZUL DE METILENO ALCALINO (TINCIÓN DE HANSEN)

Solución " A "

Azul de metileno 0.3 gr.

Agua destilada 100.0 ml.

Solución " B "

Hidróxido de potasio 0.04 gr.

Agua destilada 100.0 ml.

Mezclar 3 ml. de solución A + 10 ml. de solución B antes de usarla.

SOLUCIÓN ACUOSA DE SAFRANINA

Safranina 1 gr.
Agua destilada 100 ml.
AZUL DE METILENO ALCALINO DE LOEFFLER

6
Tinción de gránulos metacromáticos.

Solución " A "

Azul de metileno 0.3 gr.

Alcohol etílico (95 %) 30.0 ml.
Disolver completamente: se trata de una solución saturada.

Solución " B "

Hidróxido de potasio 0.01 gr.

Agua destilada 100.0 ml.
Para se empleo: Añadir la solución A en la solución B, agitando continuamente.
Filtrar antes de su empleo.

FUCSINA FENICADA (Tinción de Ziehl- Neelsen)

Fucsina básica 0.3 gr.

Alcohol etílico (95 %) 10.0 ml.
Fenol cristales 5.0 ml.
Agua destilada 95.0 ml.

ALCOHOL - ÁCIDO (Tinción de Ziehl- Neelsen)

Alcohol etílico (95 %) 97 ml.

HCL Q.P. 3 ml.

1.- Azul de metileno de Loeffler. (Tinción de Ziehl- Neelsen)

Azul de metileno 0.3 gr.

Alcohol ( 95 %) 30.0 ml.

2.- KOH 0.01 % (Tinción de Ziehl - Neelsen)

Hidróxido de potasio 0.01 gr.

Agua destilada 100.ml.
Mezclar 1 y 2 agitar continuamente.

Filtrar antes de su empleo.

VERDE MALAQUITA AL 5 % (TINCIÓN DE ESPORAS)

7
Verde malaquita 5 gr.
Agua destilada 100 ml.

SAFRANINA AL 5 % (TINCIÓN DE ESPORAS)

Safranina 5 gr.
Agua destilada 100 ml.

SULFATO DE COBRE AL 20 % (TINCIÓN DE CÁPSULA)

Sulfato de cobre 20 gr.

Agua destilada 100 ml.

FUCSINA BÁSICA (TINCIÓN DE CÁPSULA)

Fucsina básica 0.15 gr.

Agua destilada 100.0 ml.

FUCSINA FENICADA (TINCIÓN DE CAMPYLOBACTER) AL 0.8%

Fenol 2.5 ml
Alcohol 100% 5.0 ml
Fucsina Básica 0.8 gr.
Agua destilada 100 ml

PREPARACION DE SOLUCIONES

8
INTRODUCCIÓN

Las soluciones en química, son mezclas homogéneas de sustancias en iguales o

distintos estados de agregación. La concentración de una solución constituye una de
sus principales características. Bastantes propiedades de las soluciones dependen
exclusivamente de la concentración. Su estudio resulta de interés tanto para la física
como para la química. Algunos ejemplos de soluciones son: agua salada, oxígeno y
nitrógeno del aire, el gas carbónico en los refrescos y todas las propiedades: color,
sabor, densidad, punto de fusión y ebullición dependen de las cantidades que
pongamos de las diferentes sustancias.

La sustancia presente en mayor cantidad suele recibir el nombre de solvente, y a

la de menor cantidad se le llama soluto y es la sustancia disuelta.

INDICADOR DE ROJO DE METILO

1.- Disolver 0.1 gr. de rojo de metilo en 300 ml. de alcohol etílico al 95 %.
2.- Agregar 200 ml. de agua destilada a la mezcla alcohol-indicador.

Conservación: guardar el reactivo en un refrigerador 4°C mientras no se usa.

SOLUCIONES EMPLEADAS PARA LA PRUEBA REDUCCIÓN DE NITRATOS

Reactivo A
Dimetil alfa naftilamina al 0.6%:
250 ml de agua destilada
100 ml de ácido acético glacial
2.1 ml de dimetil alfa naftilamina
Mezclar en el orden que se mencionan.

Reactivo B
Ácido Sulfanílico al 0.8%:
250 ml de agua destilada
100 ml de ácido acético glacial
1.8 gr. de ácido sulfanílico.
Mezclar en el orden mencionado.
Zinc en polvo (reduce el nitrato a nitrito).

Guardar ambos reactivos en el refrigerador (4°C). Por lo general estos reactivos se

mantienen estables durante por lo menos tres meses. Sin embargo, periódicamente se
hará un control de calidad, desechándolos si dan una reacción negativa o débil con un
organismo conocido.

REACTIVO DE KOVAC

9
 Alcohol amílico o isoamílico (puede sustituirse por alcohol butílico)
150 ml.
p- dimetil- amino- benzaldehido 10 gr.
HCL (concentrado) 50 ml.

Preparación

Disolver el aldehído en el alcohol.

Agregar lentamente el ácido a la mezcla aldehído- alcohol. Guardar en el
refrigerador 4°C. Su estabilidad es variable, por lo tanto se hará todas las semanas un
control de calidad, desechando si muestra una reacción débil o negativa con un
organismo positivo conocido.

REACTIVOS EMPLEADOS PARA LA PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER

Alfa naftol 5 %, intensificador del color.

Alfa naftol (1- naftol) 5 gr.
Alcohol etílico (absoluto) 100 ml.

Preparación

Disolver el alfa naftol en menos de 100 ml. de alcohol etílico absoluto. Trasvasar la
solución a un frasco volumétrico de 100 ml. y agregar a alcohol etílico absoluto c.s.p.
100 ml.

HIDRÓXIDO DE POTASIO (KOH) 40 % AGENTE OXIDANTE

Hidróxido de potasio 40 gr.

Agua destilada 100 ml.

Preparación

Pesar rápidamente el KOH y disolverlo en menos de 100 ml. de agua destilada.

Este reactivo es muy higroscópico. Colocar el vaso en un bañó de agua fría circulante
para controlar la temperatura.

Enfriar y transvasar la solución de KOH a un frasco volumétrico de 100 ml.

agregando agua destilada c.s.p. 100 ml.

Guardar en un frasco para reactivos color ámbar. Rotular perfectamente. Los

reactivos deben ser controlados con cultivos positivos y negativos conocidos antes de su
empleo.
Guardar los reactivos en el refrigerador (4°C).
PERÓXIDO DE HIDRÓGENO AL 30 %

10
Conserve en un frasco ámbar, evitar la innecesaria exposición a la luz. Mantener a 4°C.

SOLUCIÓN SALINA FISIOLÓGICA 0.85 %

Cloruro de sodio (NaCL) 8.5 gr.

Agua destilada c.s.p. 1000 ml.

Disolver en agua destilada, aforar a 1000 ml. y filtrar con papel filtro Whatman No.
40 o equivalente. Esterilizar a 15 libras durante 15 minutos. Mantener en el refrigerador a
4°C.

STANDAR DE SULFATO DE BARIO (PARA ANTIBIOGRAMAS)

Prepare dicho estándar agregando 0.5 ml del Cloruro de Bario (BaCl2) 0.048 M
(1.175% P/V BaCl2 . 2H2O) a 99.5 ml de H2SO4 0.18 M (0.36) (1%). Mezcle agitando las
soluciones en una parrilla agitadora.

Verifique la densidad correcta del estándar usando un espectofotómetro. La

absorbancia a 625 nm debería ser 0.08-0.1 para el estándar 0.5 MacFarland.

Distribuir 5 ml dentro de tubos similares a los que se van a usar para preparar los
inóculos. Para evitar la evaporación mantenga sellado los tubos y almacenados a
temperatura ambiente al abrigo de la luz. Agite vigorosamente el estándar antes de su uso
para lograr una turbidez homogénea. Remplace o verifique la confiabilidad de los
estándares mensualmente.

PREPARACIÓN DE HCl 0.1 N

HCl 0.1 N. 3.46/ lit.

P.E. 1.192 = 37.23 gr de HCl

44.3 gr. -------- 100ml .

3.646 gr. -------- X X= 8.23 ml./lit. 4.15 ml./ 500 ml.

Titulación del HCL 0.1 N con - NaHCO3 Q.P.

Pesar 0.15, 0.20, 0.25 gr. NaHCO3
Añadir a cada porción 50 ml de H20 + III gotas de naranja de metilo; a esto dejarle
caer el HCL preparado.

Cálculos: NORMALIDAD= ___ Gr.______

Milieq.x Lit.
SOLUCIÓN VERDE BRILLANTE AL 0.1 % (SALMONELLA)

11
 Para inhibir otras bacterias Gram. (-) que no sean Salmonella.

Preparación
Verde Brillante 0.1 gr.
Agua destilada estéril 100.0 ml.
Conservar en frasco ámbar 4°C.

SOLUCIÓN BUFFER FOSFATOS PARA ALIMENTOS (PBS)

Na2HPO4 2.3 gr.

NaH2PO4 0.5 gr.
NaCl 9.0 gr.
Agua 1000 ml.
pH 7.2

Distribuir en tubos con 20 ml y esterilizar a 15°C por 15 min. Este PBS es utilizado
cuando se hacen diluciones para muestras de alimento.

AGUA PEPTONADA CONCENTRADA PARA SALMONELLA EN AVES(APC)

Peptona 10 gr.
NaCl 5 gr
Na2HPO4 3.5 gr.
KH2PO4 1.5 gr.
Agua Destilada 100 ml

Distribuir en frascos 2 ml, esterilizar a 15 lib. Por 15 min.

AGUA PEPTONADA DILUIDA PARA SALMONELLA EN CARNE MOLIDA

La misma fórmula pero para 1000 ml de agua destilada y distribuir 100 ml en

frascos con tapa de rosca. Esterilizar a 15 lib. Por 15 min.

BUFFER FOSFATOS PARA SALMONELLA EN AVES

Na2HPO4 2.3 gr.

NaH2PO4 0.5 gr
NaCl 9.0 gr.
Agua destilada 1000 ml
Distribuir 20 ml en tubos con tapa de rosca. Esterilizar 15 lib. Por 15 min.
PREPARACIÓN DE LUGOL PARA TETRATHIONATE

12
 Yodo 6.0 gr.
Yoduro de Potasio 5.0 gr.
Mezclar
Añadir Agua Destilada 20 ml.

PREPARACIÓN DEL HIPURATO DE SODIO AL 1%

Hipurato de sodio 1 gr.

Agua destilada estéril 97 ml

Disolver y repartir en volúmenes de 400 microlitros en tubos de rosca estériles.

Congelar a -20 °C.

SOLUCIÓN DE FOSFATOS PARA MANTENER REMOJADOS LOS ELECTRODOS

Solución A

NaH 2 PO4 2.78 gr.

Agua destilada 100 ml.

Solución B

Na2HPO4 . 7H2O 5.37 gr.

Agua destilada 100 ml.

Mezclar
A : 30.0 ml
B: 61 0 ML
pH 7.0-7.2

SOLUCIÓN BUFFER DILUYENTE PARA BACTERIOLÓGICO DE ALIMENTOS

KH2PO4 34 gr.
Agua destilada 1000 ml.

Diluir 1.25 en un litro de agua destilada pH 7.2

Distribuir 9 ml en tubos con tapa de rosca.

SOLUCIONES PARA AJUSTAR PH DE MUESTRAS.

13
 NaOH 1 M 4.0 gr. de NaOH en 100 ml de Agua Destilada

NaOH 3 M 12 gr. de NaOH en 100 ml de Agua Destilada

HCL 1M 8.3 ml de HCl en 100 ml de Agua Destilada

HCL 0.1M 0.83 ml de HCL en 100 ml de Agua Destilada

TABLA 1.1 Composición de estándar para turbidez Escala de McFarland.

____________________________________________________________________
Estándar de Cloruro de Bario Acido Sulfúrico Densidad
Turbidez No- diluido 1.175% (1%) aprox. De bacterias
Por ml.
____________________________________________________________________
0.5 0.5 ml 99.5 ml 1x 108
1 0.1 ml 9.9 ml 3x 108
2 0.2 ml 9.8 ml 6x 108
3 0.3 ml 9.7 ml 9x 108
4 0.4 ml 9.6 ml 12x 108
5 0.5 ml 9.5 ml 15x 108
6 0.6 ml 9.4 ml 18x 108
7 0.7 ml 9.3 ml 21x 108
8 0.8 ml 9.2 ml 24x 108
9 0.9 ml 9.1 ml 27x 108
10 1.0 ml 9.0 ml 30x 108
_____________________________________________________________________

REFERENCIAS

14
Alvarez M.C.I., Mendoza E.S.E.(1994). Manual básico de bacteriología. Facultad de
Estudios Superiores Cuatlitlán. UNAM.

Carmona O., Gomez M.J., Montes T. Marcano C. Marino F.(1997). Microbiología Médica ,
de Divo. 5º.Edición. McGraw-Hill Interamericana.

BRADSHAW J.L.(1973). Microbiología de Laboratorio. Primera edición

Editorial El Manual Moderno. México D.F. .

Branson D.(1974). Métodos en Bacteriología Clínica. Manual de Test y Procedimientos.

Primera edición. Editorial Médica Panamericana S.A. Buenos Aires Argentina.

Burdon K., Williams R.P.(1978). Microbiología. 4a.Edición. Publicaciones Culturales S.A.

México D.F.

Carter G.R.(1979). Diagnostic Procedure in Veterinary Bacteriology and Mycology. Third

Edition. Charles C. Thomas Publisher. Illinois U.S.A.

Carter G.R.(1985). Bacteriología y Micología Veterinaria; Aspectos esenciales. Editorial El

Manual Moderno S.A. México D.F..

Cowan S.T., Steel K.J.(1974). Manual para la Identificación de Bacterias de Importancia

Médica. Segunda Edición. Cia. Editorial Continental, S.A. de C.V., México.

Cowan S.T., Steel K.J. (1993). Manual para la Identificación de Bacterias de Importancia
Médica. Third Edition. Cambridge. University Press.

Cottral G.E. (1986). Manual de Métodos estandarizados en Microbiología Veterinaria.

Primera Edición en Español. Edición Científica. La Prensa Médica Mexicana S.A. México
D.F.

Cruz J.G.,Sainz M. J. E., Segura R.P.(1994). Manual de bacteriología clínica. Fac. de

Estudios Superiores Cuatitlán. UNAM.

Faddin J.F.(1980). Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia

Médica. Segunda Edición. Editorial Médica Panamericana S.A. Argentina.

Galas, M (2001).Manual de Procedimientos para la Determinación de Sensibilidad a los

Antimicrobianos. Curso Internacional de Entrenamiento sobre vigilancia de Salmonella y
Resistencia Antimicrobiana en Patógenos Transmitidos por Alimentos. Pag. 28.

Jang, S.S., Biberstein, E.L. and Hirsh, D.C.(1986). A Diagnostic Manual of Veterinary
Clinical Bacteriology and Mycology. Microbiological Diagnostic Laboratory at the
Veterinary Medical Teaching Hospital, University of California, Davis.

15
Ministry of Agriculture, Fisheries and Food. (1984). Manual of Veterinary Investigation.
Laboratory Techniques. Vol. 1 Third Edition. London: Her Majestyc' s Stationery Office.

Pérez M.J.A., Vázquez M.J.R., Rodríguez S.Ma.C., Miranda M.R.E., Romo G.A.L., Nader
G.E.(1983). Procedimientos de Laboratorio para Bacteriología y Micología Veterinarias.
Departamento de Bacteriología y Micología FMVZ. UNAM. México

Quin P.J., Carter M.E., Markey B. Carter G.R.(1994).Clinical Veterinary Microbiology.

Wolfe Publishing.

Thatcher F.S., Black, D.S.(1972). Análisis Microbiológico de los Alimentos. Editorial Acribia
Zaragoza. Madrid España.

Zaidi M, Zamora E. (2001). Manual de procedimientos para el Aislamiento e identificación

de Salmonella de Humanos y animales. Curso Internacional de Entrenamiento sobre
Vigilancia de Salmonella y Resistencia Antimicrobiana En Patógenos Transmitidos por
Alimentos.Mérida,Yucatàn,Mèxico del 2 al 12 de julio de 2001.

16