Bacteriologa de camarones

Dr. Bruno Gmez-Gil

Laboratorio de Bacteriologa
02/09/2005 1

Contenido
Vibriosis Toma de muestras Anlisis bacteriolgico de organismos Determinacin de susceptibilidad a antibiticos Tratamiento / antibiticos

02/09/2005

Bacteria
Organismo unicelular Procarionte Capz de replicarse autnomamente Varios tipos de alimentacin Se puede matar o al menos controlar con antibiticos
02/09/2005 3

Vibriosis
Definicin general:

Infeccin causada por bacterias del gnero Vibrio

Las infecciones por vibrios son quiz las enfermedades mas comunes en la camaronicultura, debido a que estas bacterias son habitantes naturales del ambiente estuarino-marino.
02/09/2005 4

Tipos de infecciones bacterianas

Lightner (1993) Puntos localizados en la cutcula, black-spot. Infecciones localizdas en el tracto digestivo, hepatopncreas o heridas Septicemia generalizadas (vibriosis, Syndrome Gaviota) Turnbull, et al. 1995 Vibriosis aguda localizada o sistmica. Vibriosis crnica localizada o sistmica.

02/09/2005

Vibriosis en la larvicultura
Vibrios luminiscentes: V. harveyi y V. splendidus. Larvas con colonizacin masiva en apndices y, al principio en el tracto digestivo anterior, posteriormente avanza hacia el resto del tracto. Bolitas blancas. Es comn encontrar las mismas especies en las tomas de agua de mar. Rpida resistencia a antibiticos.

02/09/2005

Necrosis en larvas y postlarvas

02/09/2005

Fotos: Lightner D.V. 1996 y Chanratchakool et al. 1995.Health management in shrimp ponds. 7

Bacteriosis en la regin oral de una postlarva

Fotos: SEMARNAP 1999. Atlas de enfermedades de peneidos. 02/09/2005 8

Enfermedad de las Bolitas

02/09/2005

Fotos: Marisol Morales, CIAD y SEMARNAP 1999. Atlas de enfermedades de peneidos. 9

Vibriosis en la engorda
Vibrios verdes en TCBS: V. parahaemolyticus, V. vulnificus y V. harveyi. Adems V. penaeicida. Nado errtico, en las orillas; letargia; anorexia; coloracin del HP alterada, colonizado por epibiontes; cromatforos expandidos (apndices rojos); melanizaciones. Altos niveles de bacterias en HL (>1000 cel/ml) y en HP (>1 milln/g); alto porcentaje de colonias verdes y/o verdes luminiscentes en agar TCBS. Necrosis multifocal, inflamacin hemoctica, formacin de ndulos en el rgano linfoide, corazn y branquias, etc. Ndulos con bacterias en su interior.
02/09/2005 10

Camarn manchado (black spot)

Foto: Lightner D.V. 1996. 02/09/2005 11

Astilla negra (black splinter)

Fotos: SEMARNAP 1999. Atlas de enfermedades de peneidos. 02/09/2005 12

Bacterias en el tejido

Fotos: Chanratchakool et al. 1995.Health management in shrimp ponds.. 02/09/2005 13

Ndulos hemocticos

Fotos: Marisol Morales, CIAD. 02/09/2005 14

Vibriosis
Ingestin Astilla negra Manchas en exoesqueleto

Vibrios en tejido interno

Muda (recuperacin) Muerte

02/09/2005

Septicemia
15

Vibriosis NO es presencia de bacterias en la hemolinfa y/o rganos internos del camarn.

02/09/2005

16

Tipos y especies de Vibrio potencialmente patgenas en agar TCBS

La forma y el color de las colonias NO sirve para identificacin Color de la colonia en TCBS
Verdes Verdes luminiscentes Amarillas Sin crecimiento en TCBS

Especie de Vibrio
V. vulnificus, V. parahaemolyticus V. harveyi (larvas), V. parahaemolyticus V. alginolyticus, V. parahaemolyticus (10%) V. peneicida.

02/09/2005

17

Especies de Vibrio
60

60
50 40

47 39 43 34

30 20

20
10 0

1983
02/09/2005

1991

1996

1998

2002

2003
18

Patogenicidad de Vibrio
un grupo de bacterias (aislados) que tienen caractersticas en comn y diferentes a otras cepas, pero pertenecientes a la misma especie por compartir caracteres en comn

NO hay especies patgenas! SI hay cepas patgenas Esta mediada por factores ambientales (salinidad, temperatura) Oportunistas y probablemente patgenos primarios (V. penaeicida)
02/09/2005 19

Contenido
Vibriosis Toma de muestras Anlisis bacteriolgico de organismos Determinacin de susceptibilidad a antibiticos Tratamiento / antibiticos

02/09/2005

20

Toma de Muestras para Anlisis Bacteriolgico de Camarones

02/09/2005

21

Muestreo
Definicin: Proceso de seleccionar un grupo de una poblacin. Los individuos de este grupo se examinan y los resultados son usados para estimar las caracteristicas de la poblacin que queremos trabajar.

02/09/2005

22

Tipos de muestreo
MONITOREO
Muestreo al azar Unica manera de obtener una muestra representativa de una poblacin. Tabla de Muestreo al Azar o bien, un Generador Automtico de Nmeros al Azar.

02/09/2005

23

Tipos de muestreo (cont.)

MUESTREO CON PROPOSITO
Diagnosticar a los animales. Se seleccionan animales que presenten sntomas de enfermedad, ya sea por comportamiento (no se mueven, no comen, estn en la superficie) o por su aspecto fsico (mala coloracin, apndices ausentes o incompletos, manchas etc).

Es importante llevar algunos animales considerados como sanos.

02/09/2005 24

Muestreo de organismos
Se deben enviar muestras de al menos 10 animales juveniles o adultos con seales claras de enfermedad y de preferencia igual nmero de animales sanos. Estos deben estar vivos al momento de tomar la muestra. Los animales deben ser enviados en una hielera con agua del estanque enfriada con hielo por afuera de la bolsa. En el caso de larvas y postlarvas, enviar al menos 50 organismos.

02/09/2005

25

02/09/2005

26

Contenido
Vibriosis Toma de muestras Anlisis bacteriolgico de organismos Determinacin de susceptibilidad a antibiticos Tratamiento / antibiticos

02/09/2005

27

Metodologa para el Anlisis Bacteriolgico de camarones penidos.

02/09/2005

28

Objetivo
Tomar e interpretar resultados de muestras de camarones para anlisis bacteriolgico.

Cuantificar la cantidad y el tipo de bacterias que se encuentran en la hemolinfa y en el hepatopncreas del camarn; o bin en las larvas y postlarvas.
2 1

02/09/2005

29

Toma de decisin
Observaciones en granja Vibriosis ? Anlisis bacteriolgico No Si

Anlisis de susceptibilidad a antibiticos

Tratamiento

02/09/2005

30

Opciones de anlisis
camarones juveniles y adultos

Monitoreo: pool de hemolinfa Diagnstico: analizar cinco camarones, hepatopncreas y hemolinfa de cada uno

02/09/2005

31

diferencias entre los mtodos

POOL HEMOLINFA cualitativo valores enmascarados rpido menos costoso monitoreo de la poblacin CONTEO INDIVIDUAL cuantitativo (UFC/ml o gr) valores reales lento ms costoso diagnstico

02/09/2005

32

Anlisis de larvas y postlarvas

Analizar individual o por lotes Se usan dos medio de cultivo, TCBS para vibrios y agar marino para hetertrofas totales. Cuantitativo
(UFC/larva o gr)

Rpido y no muy costoso

02/09/2005

33

Reportar
Reportar Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por ml, gr o larva. Anotar porcentaje de colonias verdes en agar TCBS. Indicar presencia de colonias luminiscentes (verdes luminiscentes, potencialmente patgenas). Anotar porcentaje de vibrios (slo si se sembr en agar marino y TCBS). Tiempo de coagulacin de la hemolinfa.

02/09/2005

34

Interpretacin de resultados de crecimiento bacteriano en agar TCBS (vibrios)

Juveniles y adultos
Tipos de UFCs Vib. Lum 100% Ver. >50% Ver. <50% Amarillas Hemolinfa >103 grave serio elevadoserio elevado <103 grave elevadoserio elevado elevado Hepatopncreas >105 grave serio <105 serio

elevadoserio elevado normalelevado normal - normal elevado

35

02/09/2005

Interpretacin de resultados de crecimiento bacteriano

Larvas y postlarvas
Tipos de UFCs en agar TCBS Vib. Lum 100% Ver. >50% Ver. <50% Amarillas UFC/PL >103 grave serio elevado / grave elevado <103 serio elevado / grave elevado normal / elevado

02/09/2005

36

Interpretacin de resultados de crecimiento bacteriano

Larvas y postlarvas

Agar Marino:
>105 severo 104-103: elevado <103: normal

10-20% de la muestra deben ser vibrios.

02/09/2005

37

Contenido
Vibriosis Toma de muestras Anlisis bacteriolgico de organismos Determinacin de susceptibilidad a antibiticos Tratamiento / antibiticos

02/09/2005

38

Determinacin de la Susceptibilidad de Cepas Bacterianas a Antibiticos

Estimar a que antibitico son sensibles las bacterias que probablemente sean responsables de la enfermedad
02/09/2005 39

Dos formas de estimar la susceptibilidad de bacterias a antibiticos:

Difusin en agar (antibiograma) y Dilucin en caldo (Concentracin Mnima Inhibitoria, CIM o MIC por sus siglas en ingls).

02/09/2005

40

Antibiograma
Mtodo de difusin en placa Formacin de halos de inhibicin que representan interaccin dinmica entre la difusin del antibitico y el crecimiento bacteriano Si se tienen estudios, nos dice si una cepa es resistente o sensible a un antibtico Rpido y econmico
Estos estudios slo se han realizado, en parte, para el Sarafloxacin (Sarafin) y se estn haciendo para florfenicol (Nuflor) y enrofloxacin.
02/09/2005 41

Antibiograma
MIC (?) Halo de Inhibicin (mm) Sensidisco

Crecimiento bacteriano

02/09/2005

42

Interpretacin de los dimetros de los halos de inhibicin. Medidas en milmetros. Estos lmites no son especficos para Vibrio, sino han sido tomados de bacterias patgenas de humanos y animales de granja.
Antibitico Concentracin Resistente Intermedio (mm) Sensible

Cloranfenicol Oxitetraciclina Florfenicol Enrofloxacin Sarafloxacin

30 30 30 5 10

12 14 16 15

13-17 15-18 17-20 16-20

18 19 21 21

02/09/2005

43

Clcul Clculo de Medicacin o de Medicacin

K = 100 / % x D / C
K = kilos de producto comercial por tonelada de alimento. % = Porcentaje del consumo sobre peso vivo. D = Dosis diaria de la droga en mg por Kg de premezcla. C = Cantidad de compuesto activo del antibitico en un Kg de medicamento (habiendo establecido que las bacterias a tratar son sensibles a ste antibitico).

02/09/2005

44

Dosis diaria de la mezcla

No se conocen los valores para los antibiticos usados, salvo Sarafloxacin. Diferentes cepas de Vibrio tienen diferentes MICs Las cepas cambian con el tiempo en su sensibilidad; aparecen cepas resistentes y es necesario aumentar la dosis.
02/09/2005 45

Concentracin Mnima Inhibitoria

La MIC nos permite seleccionar un antibitico a una concentracin efectiva a la cual las cepas probadas son inhibidas. Es un anlisis in vitro. Es rpido pero ms laborioso que el antibiograma Relativamente barato

02/09/2005

46

El tubo con 40.0 g/ml es la MIC para esa cepa bacteriana.

50

40

30

20

10

0 g/ml

sin crecimiento crecimiento positivo (turbios)

02/09/2005

47

Reporte
Reportar la MIC para cada antibitico y cepa. Indicar que antibitico es el recomendado. Presentar la concentracin a usar en el alimento balanceado (al menos 18-20 veces la MIC). Indicar el tiempo de tratamiento (5-10 das).

02/09/2005

48

Toma de decisin
Observaciones en granja Vibriosis ? Anlisis bacteriolgico

Anlisis de susceptibilidad a antibiticos

Tratamiento

02/09/2005

49

Contenido
Vibriosis Toma de muestras Anlisis bacteriolgico de organismos Determinacin de susceptibilidad a antibiticos Tratamiento / antibiticos

02/09/2005

50

Tratamiento
Cualquier tratamiento con alimento medicado debe incluir siempre un mejoramiento de la calidad del agua Slo usar antibiricos cuando sea esencial Siempre medicar previo anlisis bacteriolgico Usar antibiticos frescos de una fuente confiable Usar la dosis correcta por un tiempo adecuado (no menos de 5-7 das) Permitir un tiempo suficiente para su eliminacin (14 das antes de la cosecha)
02/09/2005 51

Tratamiento

(cont.)

Incluir el antibitico en el alimento Recubrir el alimento generalmente es prdida de dinero El agua marina degrada los medicamento rpidamente Slo los camarones sanos y poco enfermos comen

02/09/2005

52

Antibiticos ms comunes
Enrofloxacin, muy eficz contra vibrios. Florfenicol, eficz aunque recientemente se han observado cepas menos sensibles. Oxytetraciclina, slo para bacterias intracelulares. Sarafloxacin, presencia de cepas poco sensibles. Norfloxacin, nitrofuranos, etc. poco efectivos. Cloranfenicol, peligroso, daos a la salud.
NOTA: ningn antibitico esta aprobado por la FDA
02/09/2005 53

Sensibilidad de 100 cepas aisladas de camarones enfermos a 15 antibiticos.

57 52 47 Inhibition zone (mm) 42 37 32 27 22 17 12 7 OTC CB AK NF F CTX CRO ENO AM NET SXT GE CF PEF CL Mean Max Min

Mas efectivo

Antibiotic

02/09/2005

Roque, A. et al. 2001. In vitro susceptibilities of Vibrio isolates isolated from peneid shrimps in Northwestern Mexico to 15 antibiotics. Intl. J. Antimicrob. Agents.

54

Porcentaje de cepas aisladas de camarones enfermos sensibles a antibiticos.

100% 90% 80% Porcentaje de cepas 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% ENO* OTC* SXT* F* NET NF CRO CTX PEF GE CF AM CL CB AK Sensible Intermediate Resistent

Antibiotico

02/09/2005

Roque, A. et al. 2001. In vitro susceptibilities of Vibrio isolates isolated from peneid shrimps in Northwestern Mexico to 15 antibiotics. Intl. J. Antimicrob. Agents.

55

Promedio de MICs para cepas aisladas de camarones enfermos.

Concentraciones Mnimas Inhibitorias (g ml-1)* de 3 antibioticos a cepas de Vibrio aisladas de camarones enfermos. Antibiotico Promedio Max Min n Enrofloxacin 0.455 1.500 0.304 84 Florfenicol 1.817 8.000 0.250 101 Oxytetraciclina 300.981 1064.000 0.260 98

* equivalente a g/tonelada de alimento

Roque, A. et al. 2001. In vitro susceptibilities of Vibrio isolates isolated from peneid shrimps in Northwestern Mexico to 15 antibiotics. Intl. J. Antimicrob. Agents.

02/09/2005

56

Sensibilidad a 23 antibiticos
35
29.5

Halo de inhibicin promedio de vibrios (mm)

29.1 26.5 27.3 24.8 24.6 23.6 20.4 19.8 20.8 18.4 16.1 16.8 13.3 11.7 9.6 16.3 13.5 23.2 21.9 21.9 20.8 24.8 24.9 22.2

30 25 20 15 10 5 0

02/09/2005

(mm)

57

100%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

0%
FLORFENICOL ENROFLOXACIN 1 ENROFLOXACIN 2 OXYTETRACYCLINE AMIKACIN AMPICILLIN CARBENICILLIN CEPHALOTHIN CHLORAMPHENICOL CEFTRIAXONE CEFOTAXIME GENTAMICIN NETILMICIN NITROFURANTOIN NITROFURANTOIN 2 PEFLOXACIN

02/09/2005
%S %R % Inter
TRIMETHOPRIM SULFAMETHOXAZOLE TETRACYCLINE SARAFLOXACIN NORFLOXACIN FLUMEQUIN ERYTHROMYCIN FURAZOLIDONE

Porcentaje de sensibilidad

58

NALIDIXIC ACID

Gracias

02/09/2005

59